Isolamento di frazioni subcellulari di rene

Isolamento di frazioni subcellulari di reneMateriale di partenzaBuffer di omogenizzazione:20 mM Tris (pH=7.4),5 mM MgCl2, 5 mM NaH2PO4,1 mM EDTA,80 mM sucrose (Marples, D., et al., Am J Physiol, 1995. vol.269 p. C655-64)Inibitori delle proteasi: 2mM PMSF; 1ug/ul Leupeptina; ;1ug/ul PepstatinaMetodo1)Prelievo dell’organo ed omogeneizzazione. Lavorare tenendo lesoluzioni e i preparati in ghiaccio. Dopo il sacrificio, prelevare l’organo,sminuzzarlo finemente con bisturi e risospenderlo nel buffer diomogenizzazione (nel rapporto di 1:10 (peso/volume)).Omogeneizzare in Potter-Elvejem dando 10 colpi alla velocità di 500rpm.2) Eliminazione dei nuclei e delle cellule non rotte. Centrifugarel’omogenato a 800xg per 10 min a 4 °C. Recuperare il sovranatante etrasferirlo in altro tubo da centrifuga.3)Frazione a 6000xg (frazione arricchita in mitocondri).Centrifugare il sovranatante postnucleare della tappa 2 a 6000xg per10 min a 4 °C. Trasferire il risultante sovranatante in un altro tubo perl’isolamento della frazione a 6000xg. Risospendere il pellet nel bufferdi omogenizzazione addizionato di inibitori delle proteasi. Aliquotare econgelare a –80 °C.

4) Frazione a 17000xg (frazione arricchita in membraneplasmatiche). Centrifugare il sovranatante della fase 3 a 17000xgper 45 min a 4 °C. Trasferire il risultante sovranatante in un altrotubo per l’isolamento della frazione a 100.000xg. Risospendere ilpellet in opportuno volume nel buffer di omogenizzazioneaddizionato di inibitori delle proteasi. Aliquotare e congelare a –80°C.5) Isolamento della frazione a 100.000xg (frazione microsomiale).Centrifugare il sovranatante della fase 4 a 100.000xg per 1 h a 4 °C.Eliminare il sovranatante e risospendere il pellet in opportunovolume di buffer di omogenizzazione addizionato di inibitori delleproteasi. Aliquotare e congelare a -80 °C.

Biotinilazione di proteine di membranaMateriale di partenzaBuffer di biotinilazione:10 mM tri-ethanolamine (pH=8.9)2 mM CaCl 2125 mM NaClSoluzione di quenching:50 mM NH 4Cl in PBS-CM (PBS+ 1 mM MgCl 2, 0.1 mMCaCl 2)Lysis buffer:150 mM NaCl5 mM EDTA50 mM Tris (pH=7.5)1% Triton X-100High salt buffer:500 mM NaCl5 mM EDTA50 mM Tris (pH=7.5)0.1% Triton X-100Basic 2X Laemmli Buffer4% SDS20% glycerol0.004% bromphenol blue0.125 M Tris HCl

MetodoRimuovere il mezzo di coltura e lavare 2 volte le cellule con PBS-CM freddoAggiungere 1.0 ml di sulfo-NHS-SS-biotin (1.5 mg/ml di sulfo-NHS-SS-biotin in buffer di biotinilazione)Incubare la petri con le cellule e la biotina per 20 minuti sotto lentaagitazioneRimuovere la soluzione contenente la biotinaIncubare le cellule per 5 minuti con soluzione di quenching (1 mlper petri)Lavare le cellule 2 volte con PBS-CMLisare le cellule con 1ml di lysis buffer per 30 minuti sotto lentaagitazioneStaccare le cellule con lo scraper e recuperare il lisato in unaeppendorf da 1,5 mlCentrifugare per 20 min a 12,000xg

Aggiungere a 17,5 ul di lisato 5 ul di laemli buffer e 2,5ul diDTT 1M (proteine totali da caricare sul gel)Aggiungere al restante lisato (circa 1 ml) 30 ul di biglieconiugate alla streptavidina; lasciare in rotazione per 2 ore a 4gradiLavare per due volte le biglie coniugate alla streptavidina conhigh salt buffer:-centrifugare a bassa velocità (1000xg) il lisato contenente lebiglie-streptavidina per 1 min-rimuovere il lisato lasciando il pellet di biglie sul fondo del tuboeppendorf-aggiungere 1 ml di high salt buffer-ripetere questa tappa per due volteLavare per due volte le biglie coniugate alla streptavidina conLysis bufferRimuovere completamente buffer di lisi lasciando il pellet dibiglie sul fondo del tubo eppendorfEluizionecon laemmlibuffer+SHproteinaSHAggiungere 30ul di laemmli bufferDenaturare a 37°C per 30 minutiAnalizzare i campioni per SDS-PAGE

Preparazione del gel di elettroforesiL’elettroforesi di proteine sul gel al 12% consente la separazione diproteine di peso molecolare compreso tra 20-100 kDa .Metodo-Pulire le placche di vetro con alcol-Segnare con un pennarello il livello di caricamento del gel di separazione-Preparare il gel di separazione come segue:Gel di separazione:Acrylamide/Bis (40/0.8%)3.6 mlAcqua5.4 ml1.5 M Tris (pH=8.8) 3 ml10% SDS 130 ul10% Ammon. persulphate 100ulTEMED5 ulDopo aver aggiunto il TEMED depositare il gel tra le due placche di vetroaggiungendo 80 ul di isopropanolo sul fronte del gel e lasciarpolimerizzare per 45 minutiGel di impaccamento (nel quale vengono formati i pozzetti e caricate le proteine)-800ul di Acrylamide/Bis (40/0.8%)- 1 ml 0.5 M Tris (pH=6.8)- 40 ul 10% SDS- 2.5 ml Acqua-add 35ul APS- 6,5 ul TEMED-Dopo aver rimosso i residui di isopropanolo, depositare il gel di impaccamento ealloggiare il pettine per la formazione dei pozzetti. Lasciare polimerizzare per 15min

Allestire la celletta di elettroforesi:-rimuovere delicatamente il pettine avendo cura di non danneggiare i pozzetti-porre il gel, tra le due placche di vetro, nella celletta di elettroforesi-riempire la celletta con il buffer di corsa elettroforetica contenente25mM Tris250mM glicina pH 8,30,1% SDSDepositare i campioni nei pozzetti e imporrecorrente fra anodo e catodo in modo daconsentire la corsa elettroforetica

Blotting delle proteineLa tecnica del blotting consente di esaminare ulteriormente le proteineseparate attraverso la tecnica dell’elettroforesiMateriale-quattro fogli di carta filtro whatman (7x9 cm)-membrana di Immobilon P (7x9 cm)-Buffer di trasferimento:25mM Tris250mM glicina pH 8,30,1% SDS20% etanoloMetodo1)Attivare la membrana di immobilon P in etanolo assoluto per 2 min2) Immergere i fogli di carta whatman, la membrana e il gel nel buffer ditrasferimento3) Allestire il sandwich come indicato nella figura:-Porre due fogli di carta whatman sull’anodo (+)-Adagiare la membrana di immobilon P avendo cura di non creare delle bolledi aria tra la carta e la membrana-Porre il gel sulla membrana-Adagiare delicatamente gli altri due fogli di carta whatman-Chiudere il circuito adagiando sul sandwich il catodo-Far passare corrente (20V per 45 min)

5) Tre lavaggi da 15 min con TBST6) L’ aggiunta di un substrato (BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato/nitroblue tetrazolio), che reagisce con la fosfatasi, provoca lacolorazione delle bande proteiche rilevate dagli anticorpi