黄文

白 果 活 性 蛋 白 的 分 离 、 纯化 、结 构 及 其 生 物 活 性研 究STUDIES ON SEPARATION,PURIFICATION ANDSTRUCTURE OF GINKGO SEED PROTEINAND ITS BIOLOGIC ACTIVITIES

研 究 的 目 的 与 意 义银 杏 是 我 国 特 有 的古 老 珍 贵 树 种 之 一 。国 内 外 对 银 杏 的 研 究主 要 集 中 在 银 杏 叶上 , 对 白 果 的 研 究 很少 , 特 别 是 对 白 果 蛋白 的 研 究 还 未 见 报道 。

研 究 目 的蛋 白 质 和 多 肽 的 研 究 是 分 子 生 物学 领 域 的 前 沿 , 本 文 利 用 现 代 分 离技 术 和 先 进 的 测 试 手 段 对 白 果 清 蛋白 进 行 分 离 、 纯 化 和 结 构 表 征 ; 研究 白 果 蛋 白 的 抗 氧 化 、 抗 衰 老 等 多种 生 物 活 性 。 为 白 果 活 性 蛋 白 的 开发 与 利 用 提 供 理 论 基 础 和 科 学 依据 。

研 究 的 主 要 内 容1. 原 料 的 形 态 特 征 和 化 学 成 分 研 究2. 白 果 活 性 蛋 白 的 提 取 分 离3.GAP 分 离 纯 化4.GAPⅡa 一 级 结 构 的 研 究5.GAPⅡa 分 子 构 象 的 表 征6. 白 果 蛋 白 生 物 活 性 的 研 究

第 一 部 分原 料 的 形 态 特 征 和 化 学 成 分 研 究☺ 不 同 地 区 白 果 的 形 态 特 征☺ 不 同 地 区 干 白 果 主 要 化 学 成 分 含 量☺ 白 果 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 分 析☺ 白 果 矿 物 质 和 微 量 元 素 测 定 及 其 分 布 研 究☺ 白 果 中 类 胡 萝 卜 素 的 提 取 、 分 离 和 鉴 定

不 同 地 区 白 果 主 要 化 学 成 分 含 量Comparison on chemical composition contents of dry ginkgo in different districtsitemdistrictSuizhou Anlu TaixingWater (%) 4.9 5.8 5.9Protein (%) 11.0 14.4 9.8Starch (%) 77.4 69.5 75.6Fat (%) 6.0 5.7 5.6Total acid (%) 0.46 0.53 0.52Polyhenol(ug/g)Free polyhenol(ug/g)3.70 2.23 2.110.67 0.45 0.24

白 果 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 分 析Table 3-3 The composition of amino acid in GP (%)Amino acid Content Amino acid ContentAsp 0.7 Leu 0.70Thr 0.39 Tyr 0.32Ser 0.45 Phe 0.36Glu 2.01 Lys 0.36Gly 0.29 His 0.20Ala 0.47 Arg 1.34Cys 0.08 Pro 0.57Val 0.48 Met 0.29Ile 0.4 Trp 0.11

白 果 矿 物 质 和 微 量 元 素 测 定 及 其 分 布 研 究The distribution of mineral elements in ginkgo(mg/100g)mineralsampleCa Mg Fe Cu Znpulp 7.89 14.45 1.892 0.025 0.357rind 175.7 71.44 15.85 - 78.76shell 57.35 11.64 3.80 0.255 17.34The distribution of mineral elements in composition contents of ginkgomineral(mg/100g)Ca Mg FesampleCu Znprotein 105.3 40.96 4.919 0.823 0.798fat - 85.91 11.41 - 3.97starch 3.77 0.769 1.97 0.023 0.536cellulose 40.86 7.3 9.59 1.098 5.137

白 果 中 类 胡 萝 卜 素 的 提 取 、 分 离 和 鉴 定…Rf=0.902Rf=0.72…………………………………………4●B ●3●2●Rf=0.610Rf=0.3011●A ●……●…………………………………sample standard图 3-3 白 果 提 取 液 的 薄 层 色 谱 图Fig3-3 TLC profiles carotenoids of solution from ginkgoA— 标 准 叶 黄 素 ,B— 标 准 β- 胡 萝 卜 素薄 层 色 谱 条 件 : 固 定 相 为 硅 胶 G, 展 开 剂 为 石 油 醚 – 丙 酮 (95:5,V/V)

第 一 部 分 小 结 通 过 比 较 不 同 地 区 白 果 的 成 分 和 特 性 , 选择 泰 兴 白 果 为 研 究 对 象 。 白 果 中 还 含 有 大 量 的 类 胡 萝 卜 素 。 白 果 中的 类 胡 萝 卜 素 以 叶 黄 质 类 为 主 , 其 次 是 β– 胡萝 卜 素 和 α– 胡 萝 卜 素 。

第 二 部 分白 果 活 性 蛋 白 的 分 离 提 取 白 果 中 各 蛋 白 质 组 分 分 析 白 果 蛋 白 各 组 分 抑 制 羟 基 自 由 基 活 性 比 较 白 果 清 蛋 白 提 取 的 研 究 盐 析 法 分 离 白 果 清 蛋 白 白 果 盐 溶 蛋 白 、 白 果 清 蛋 白 和 白 果 球 蛋 白 提 取 工艺 的 确 定 清 蛋 白 、 球 蛋 白 和 盐 溶 蛋 白 化 学 成 分 测 定 白 果 蛋 白 氨 基 酸 组 成 分 析

白 果 中 各 蛋 白 质 组 分 分 析%50403020100albumin globuline prolamin A-S-Pro C-Pro图 4-1. 白 果 蛋 白 各 组 分 分 布Fig4-1.The distribution of protein in ginkgo seedHydroxyl radical scavenging effect of GPSample albumin globuline Gliadinproteincontent(%)Alkali-solubleprotein75.21 82.08 11.95 44.1IR(%) 50.84 24.09 45.78 41.33活 性 测 定 所 用 样 品 浓 度 为 130ug/mL

盐 析 法 分 离 白 果 清 蛋 白90%struation degree65%struation degree55%struation degree50%struation degree45%sturation degree40%sturation degree30%sturation degree0 10 20 30 40 %Pig4-4.Precipitation of GP of saturatedammonlum sulphate通 过 对 白 果 蛋 白 盐 析 沉 淀 与 脱 盐 的 研 究 可 以 看 出 , 利 用 盐 析 和 脱 盐 两 个 步 骤 可以 达 到 除 去 杂 蛋 白 和 分 离 球 蛋 白 与 清 蛋 白 的 目 的 。 因 此 , 本 实 验 选 用 35% 饱 和 度的 盐 沉 淀 除 去 杂 蛋 白 , 再 用 90% 饱 和 度 的 盐 溶 液 进 行 盐 析 沉 淀 出 清 蛋 白 和 球 蛋白 。 加 蒸 馏 水 将 沉 淀 转 移 到 透 析 袋 对 蒸 馏 水 透 析 , 球 蛋 白 即 慢 慢 析 出 。 离 心 透 析液 并 分 别 冷 冻 干 燥 沉 淀 和 上 清 液 , 可 以 得 到 清 蛋 白 和 球 蛋 白 的 样 品 。

GAP、GGP 和 GSP 中 主 要 化 学 成 分 测 定Table4-11. The chemical component of GAP、GGP and GSP(%)Component protein polysaccharide Nucleic acidGAP 85.2 3.6 10.3GGP 96.3 2.4 1.9GSP 73.8 12.4 14.2

The composition of amino acid in ginkgo proteinAmino acid GSP GAP GGP Amino acid GSP GAP GGPAsp 8.37 10.74 10.59 Ile 3.35 2.67 4.88Thr 3.46 5.90 4.27 Leu 6.00 5.17 8.25Ser 3.17 5.78 3.95 Tyr 2.68 4.10 2.88Glu 13.25 11.17 18.29 Phe 2.81 3.81 3.12Gly 3.60 3.80 4.48 Lys 3.08 4.32 3.41Ala 4.11 4.80 5.13 His 1.24 1.23 1.63Cys 0.76 2.50 0.67 Arg 8.42 8.47 12.07Val 4.52 5.40 5.74 Pro 2.72 2.65 3.97Met 1.43 1.45 1.94 Trp 0.84 1.07 1.00

第 二 部 分 小 结* 白 果 蛋 白 中 以 清 蛋 白 和 球 蛋 白 为 主 。* 通 过 单 因 子 实 验 和 正 交 实 验 分 析 确 定 了 白 果 清 蛋白 的 最 佳 提 取 条 件* 确 定 了 白 果 清 蛋 白 样 品 的 制 备 工 艺 。

第 三 部 分GAP 分 离 纯 化 离 子 交 换 层 析 中 溶 液 pH 值 的 选 择 离 子 交 换 层 析 中 洗 脱 条 件 的 选 择 步 进 式 洗 脱 分 离 清 蛋 白 梯 度 式 洗 脱 分 离 清 蛋 白 步 进 式 结 合 梯 度 式 洗 脱 DEAE-Sephadex-A50 柱 层 析 纯 化 GAPⅡ SDS- 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 纯 度 鉴 定 GAPⅡa 样 品 的 物 理 化 学 性 质

步 进 式 结 合 梯 度 式 洗 脱 方 式 分 离 GAPSDS-PAGEABS0.70.60.5GAPⅡGAPⅠ0.40.30.20.100 100 200 300 400管 数 ( 支 )图 5-4.GAP 在 DEAE-Cellulose 的 分 离 图 谱9740066200427003100014400Separation of GAP by DEAE-CelluloseGAP层 析 柱 :3.0cm×45cm; 树 脂 平 衡 液 :0.05 mol/L 三 乙 醇 胺 缓 冲液 (pH8.0); 上 样 量 :200mg; 步 进 式 (1-167 管 )NaCl 洗 脱液 浓 度 :0.1mol/L, 梯 度 式 (168-300 管 )NaCl 线 性 梯 度 的 离 子强 度 :0.2-0.4 mol/L; 流 速 :0.2ml/ 分 钟 ; 分 级 :4ml/ 管 。GAPⅠGAPⅡ

DEAE-Sephadex-A50 柱 层 析 纯 化 GAPⅡABS0.90.80.70.60.50.40.30.20.10GAPⅡa0 50 100 150 200图 5-10.GAPⅡa 在 DEAE-Sephadex-A50柱 层 析 图DEAE-Sephadex-A50 Chromatography of GAPⅡ层 析 柱 :3.0cm×45cm; 树 脂 平 衡 液 :0.05 mol/L 三 乙 醇 胺 缓 冲 液(pH8.0); 梯 度 式 NaCl 线 性 梯 度 的 离 子 强 度 :0.2-0.4 mol/L; 流 速 :0.2ml/分 钟 ; 分 级 :4ml/ 管 。从 层 析 图 上 可 以 看 出 , 只 有 一 个 对 称 峰 ,呈 高 斯 分 布 , 说 明 其 为 色 谱 纯 。管 数

分 光 光 度 法 检 验 GAPⅡa 的 纯 度UV spectra of GAPⅡaA 280nm /A 260nm 比 值 大 于 1.75, 说 明 其 不 含 核酸 。

电 泳 鉴 定 GAPⅡa 的 纯 度14400Da常 规 -PAGESDS-PAGEGAPⅡa 在 常 规 电 泳 上 为 单 一 蛋 白 带 , 说 明 其 为 电 泳纯 。 拆 开 二 硫 键 , 在 SDS-PAGE 上 为 两 条 蛋 白 带 , 说 明其 为 分 子 量 接 近 的 两 条 肽 链 , 相 互 间 以 二 硫 键 连 接 组 成的 蛋 白 质 。

第 四 部 分GAPⅡa 一 级 结 构 研 究GAPⅡa 氨 基 酸 组 成GAPⅡa 分 子 量 测 定GAPⅡa 肽 质 量 指 纹 图 谱GAPⅡa 序 列 测 定β- 消 除 反 应 确 定 GAPⅡa 糖 肽 链的 连 接 方 式

GAPⅡa 分 子 量 测 定Fig 6-2. MALDI-TOF-MS of GAPⅡaGAPⅡa 精 确 分 子 量 =29248Da

GAPⅡa 氨 基 酸 组 成Table 6-1 The content of amino acid in GAPⅡaAmino content number Amino content numberacid (%)acid (%)Asp 14.82 37 Leu 5.27 12Thr 9.76 28 Tyr 4.41 8Ser 9.88 33 Phe 4.32 8Glu 11.28 25 Lys 4.04 8Gly 4.96 25 His 1.63 3Ala 4.71 19 Arg 2.79 5Cys 2.97 8 Pro 2.13 6Val 9.47 28 Met 2.36 5Ile 2.68 7 Trp 2.51 4由 于 测 定 了 精 确 分 子 量 , 结 合 其 氨 基 酸 组 成 , 便 可 算 出各 氨 基 酸 残 基 的 数 目 。

由 GAPⅡa 的 氨 基 酸 组 成 预 测 等 电 点和 消 光 系 数the titration curve of GAPⅡa理 论 pI=5.145ε=34920L/mol/cm当 GAPⅡa 的 浓 度为 1.0g/L 时 , 在280nm 处 的 吸 光 值为 0.813。

MALDI-TOF-MS 肽 质 量 酶 谱2471.521912.36Tryptic peptide of GAPⅡa-1 by MALDI-TOF-MS

MALDI-TOF-MS 肽 质 量 酶 谱2471.561912.38Tryptic peptide of GAPⅡa-2 by MALDI-TOF-MS

ESI-MS 肽 质 量 酶 谱Tryptic peptide of GAPⅡa-1 by ESI-MS(A)

Tryptic peptide of GAPⅡa-1 by ESI-MS(B)ESI-MS 肽 质 量 酶 谱1911.972471.05

ESI-MS 肽 质 量 酶 谱Tryptic peptide of GAPⅡa-1 by ESI-MS

ESI-MS/MS spectrum and analyzed amino acidsequence of peptide-2470 in GAPⅡa

GAPⅡa 鉴 定MALDI-TOF-MS 和 ESI-MS 的肽 质 量 指 纹 图 谱 及 肽 序 列 标 签 结合 用 于 蛋 白 质 数 据 库 搜 索 , 结 果证 明 GAPⅡa 为 一 未 知 蛋 白 质 。 由此 可 认 为 本 实 验 室 从 白 果 中 分离 、 鉴 定 出 了 一 种 新 的 植 物 蛋白 。

麝 香 草 酚 染 色 的SDS-PAGE 图GAPⅡa 糖 蛋 白 鉴 定化 学 成 分 分 析GAPⅡa 含 有1.18% 的 糖经 C.H.N 元 素 分 析 , 中 C 为45.5756%,N 为 12.9826%,H 为6.4271%。N 的 含 量 低 于 蛋 白 质 的 平均 含 N 量 (16%), 这 也 说 明GAPⅡa 是 一 种 复 合 蛋 白 质 , 含 有 糖基 。

GAPⅡa 与 糖 基 之 间 是 以 O- 糖 苷 键 方 式 相 联 的 。β- 消 除 反 应 确 定 GAPⅡa 糖肽 链 的 连 接 方 式Changes of amino acids content and residue numbersbefore and after alkali-β-elimination(%)Amino Before After Amino Before AfteracidacidAsp 14.82 13.99 Leu 5.27 4.99Thr 9.76 8.75 Tyr 4.41 4.70Ser 9.88 8.64 Phe 4.32 4.95Glu 11.28 10.38 Lys 4.04 4.23Gly 4.96 5.96 His 1.63 1.63Ala 4.71 5.35 Arg 2.79 3.00Cys 2.97 2.02 Pro 2.13 3.95Val 9.47 11.28 Met 2.36 2.09Ile 2.68 2.10 Trp 2.51 1.95

第 四 部 分 小 结1. MALDI-TOF-MS 测 定 了 GAPⅡa 分 子 量 是 29248Da。2. GAPⅡa 是 由 分 子 量 接 近 、 氨 基 酸 序 列 相 似 的 两条 肽 链 , 相 互 间 通 过 二 硫 键 连 接 组 成 的 蛋 白 质 。3.GAPⅡa 为 含 有 少 量 糖 的 糖 蛋 白 , 肽 链 与 糖 之 间 以O- 糖 苷 键 连 接 。4.ESI-MS 和 MALDI-TOF-MS 测 定 了 GAPⅡa 的 肽 质 量酶 谱 , 用 以 标 记 GAPⅡa。5.ESI-MS/MS 测 定 了 肽 段 (2470) 和 肽 段 (1911)的 氨 基 酸 序 列 。6. 肽 质 量 酶 谱 和 肽 序 列 标 签 用 于 蛋 白 质 数 据 库 搜 索 , 证 明GAPⅡa 为 一 未 知 蛋 白 质 。

第 五 部 分GAPⅡa 分 子 构 象 的 表 征拉 曼 光 谱 分 析 GAPⅡa 的 二 级 结 构GAP 红 外 光 谱 分 析园 二 色 谱 分 析 GAPⅡa 的 二 级 结 构GAPⅡa 晶 体 特 性 的 测 定GAPⅡa 聚 集 状 态 的 扫 描 电 镜 和 透 射 电 镜 观 察GAPⅡa 荧 光 光 谱 研 究紫 外 差 光 谱 分 析 分 子 的 二 级 结 构GAPⅡa 的 构 象 与 抗 氧 化 活 性 关 系 的 研 究及 其 机 理 初 探蛋 白 质 结 构 预 测

拉 曼 光 谱 分 析 GAPⅡa 的 二 级 结 构1649168049004700450043004100390037003500800 1000 1200 1400 1600 1800 2000Raman spectrum of GAPⅡa在 酰 胺 I 带 1680cm -1 峰 的 出 现 说 明 含 有 β- 折 叠 结 构 ;1649 cm -1 峰 出 现说 明 含 有 α- 螺 旋 结 构 ,1649 cm -1 峰 远 远 小 于 1680cm -1 峰 又 说 明 GAPⅡa分 子 中 主 要 以 β- 折 叠 的 结 构 为 主 ,α- 螺 旋 结 构 含 量 较 少 。

GAPⅡa 红 外 光 谱 分 析1233cm -1 ——β- 折 叠 结 构1311 cm -1 ——α- 螺 旋 结 构1532 cm -1 —— 反 式 肽 键1394cm -1 —— 顺 式 肽 键FTIR spectrum of GAPⅡaβ- 折 叠 结 构 所 占 比 例 远 大 于 α- 螺 旋 结 构 , 与 拉 曼 光 谱 相 吻 合 。反 式 肽 键 吸 收 峰 远 大 于 顺 式 肽 键 吸 收 峰 , 说 明 GAPⅡa 在 提 取 、 分离 、 纯 化 时 , 保 持 了 天 然 的 构 象 。

园 二 色 谱 分 析 GAPⅡa 的 二 级 结 构[θ]无 规 卷 曲100α- 螺 旋8060β- 折 叠40200190-20210 230 λ/nm-40-60聚 -L- 赖 氨 酸 的 CDCD spectrum of vinyl L-lysine[θ]2520151050-5180 190 200 210 220 230 240 250-10-15λ/nm-20-25GAPⅡa 的 园 二 色 谱CD spectrum of GAPⅡaGAPⅡa 其 园 二 色 谱 在 199nm 有 一 个 正 峰 , 在 207nm处 有 一 个 负 槽 。 且 此 负 槽 的 形 状 为 单 峰 , 这 与 标 准的 β- 折 叠 峰 型 很 相 似 , 说 明 GAPⅡa 含 有 较 多 的 β-折 叠 结 构 。

GAPⅡa 的 内 源 荧 光 光 谱FI100806040200-20290 340 390nm图 7-12.GAPⅡa 的 荧 光 光 谱 图Fig7-12.Fluorescence spectrum ofGAPⅡaTrpGAPⅡaTrp λ ex max =282nmTrp λ em max =355nmGAPⅡa λ ex max =282nmGAPⅡa λ em max =344nmGAPⅡa 内 源 荧 光 相 对 于 游 离 Trp 荧 光 发生 蓝 移 说 明 Trp 残 基 位 于 分 子 链 的 内 部 。

酸 碱 度 对 GAPⅡa 荧 光 的 影 响Fluorescence intensity of GAPⅡa at difference pHpH 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0FI 79 80 80.6 78.6 81.4 84 81.8 82.4 82.8酸 碱 度 对 荧 光 的 影 响 较 小 , 说 明GAPⅡa 在 不 同 pH 环 境 中 可 以 保 持 较 稳定 的 构 象 。

有 机 溶 剂 对 GAPⅡa 荧 光 光 谱 的 影 响FI454035302520151050300 320 340 360 380 nm图 7-13.GAPⅡa 在 不 同 溶 剂 中 的 荧 光 光 谱Fig7-13.Fluorescence spectrum of GAPⅡain different solvent蒸 馏 水乙 醇甘 油二 甲 亚 砜蛋 白 质 分 子 在 有 机 溶 剂 中 荧 光 强 度 和 荧 光 位 置 都发 生 了 变 化 , 一 方 面 说 明 在 天 然 状 态 下 ,GAPⅡa 分子 中 Trp 残 基 既 存 在 于 GAPⅡa 表 面 , 也 存 在 于 其 内部 。 另 一 方 面 说 明 GAPⅡa 构 象 对 有 机 溶 剂 敏 感 , 应尽 量 避 免 与 有 机 溶 剂 接 触 。

紫 外 差 光 谱 分 析 GAPⅡa 的 二 级 结 构ABS0.50.40.30.20.10230 250 270 290 310 330Fig7-19.UV 图 .GAPⅡa( 乙 二 醇 ) 紫 difference外 差 光 谱spectrophotometer of GAPⅡanm当 加 入 微 扰 剂 后 , 产 生 了 差 光 谱 。 说 明GAPⅡa 分 子 链 上 的 部 分 Trp 和 Tyr 残 基 外 露 。 这 与荧 光 光 谱 分 析 的 结 果 一 致 。

GAPⅡa 的 构 象 与 抗 氧 化 活 性 关 系 的研 究 及 其 机 理 初 探FI6560555045403530290 340 390control0.5mol/L1.0mol/L2.0mol/L3.0mol/L4.0mol/LnmFI6560555045403530290 310 330 350 370 390control15min1h20hnm图 7-7(C).GAPⅡa 在 胍 中 的 荧 光 光 谱 图 (20h)Fig7-7(c).Fluore scence spectra of GAPⅡa in GdnHCL图 7-21(B)GAPⅡa 胍 溶 液 中 的 荧 光 光 谱 图 (1.0mol/L)Fig7-21(B).Fluorescenc spectra of GAPⅡa in GdnJCL利 用 盐 酸 胍 作 为 变 性 剂 , 通 过 在 不 同 浓度 胍 中 和 不 同 作 用 时 间 的 荧 光 变 化 以 及 紫 外差 光 谱 变 化 , 探 讨 了 GAPⅡa 伸 展 程 度 与 抗 氧化 活 性 的 关 系 。

两 亲 性 与 亲 水 性 预 测预 测 肽 段 (2470)、 肽 段 (2355) 和 肽 段 (1911) 的 螺旋 轮 , 红 色 表 示 亲 水 残 基 , 兰 色 表 示 疏 水 残 基 。 红 色 多 于兰 色 表 明 , 亲 水 性 强 , 并 且 亲 水 残 基 有 在 一 侧 的 倾 向 。

第 五 部 分小 结1. 园 二 色 谱 、 红 外 光 谱 和 拉 曼 光 谱 的 结 果 显 示GAPⅡa 存 在 2 种 以 上 结 构 形 式 , 主 要 以 β- 折 叠结 构 为 主 ,α- 螺 旋 结 构 含 量 较 少 。2. 紫 外 差 光 谱 和 荧 光 光 谱 显 示 在 水 溶 液 中 ,GAPⅡa 中的 Trp 残 基 两 种 类 型 都 存 在 , 既 有 暴 露 于 分 子 外 部 的Trp 残 基 , 也 有 处 于 疏 水 内 部 的 Trp 残 基 。3. 在 盐 酸 胍 中 ,GAPⅡa 一 定 程 度 的 伸 展 有 利 于 提 高其 抑 制 羟 基 自 由 基 的 活 性 , 并 且 GAPⅡa 有 比 较 稳 定 的抗 氧 化 活 性 。

第 六 部 分白 果 蛋 白 生 物 活 性 研 究1 白 果 蛋 白 在 非 脂 质 体 系 中 的 抗 氧 化 作 用2 白 果 蛋 白 抗 生 物 氧 化 性 能3 白 果 活 性 蛋 白 对 果 蝇 寿 命 影 响 的 研 究4 白 果 清 蛋 白 对 小 鼠 密 闭 缺 氧 存 活 时 间 的影 响

白 果 蛋 白 对 超 氧 阴 离 子 自 由 基 的 清 除 作 用IR(%)100806040200IR(%)706050403020100GAP GGP GAPⅠ GAPⅡa TP图 8-1.GP 抗 超 氧 自 由 基 活 性 比 较Fig8-1.Compare capability of scavengingsuproxide free radicaly = 21.572Ln(x) - 42.052R 2 = 0.98250 100 200 300 400 500 600concentration(ug/mL)图 8-2.GAP 清 除 超 氧 阴 离 子 自 由 基 活 性 量 效 关 系Fig8-2. relationship between concentration andscavenging superoxide free radical of GAP白 果 蛋 白 都 有 很 好 的清 除 超 氧 阴 离 子 自 由基 的 活 性 。 其 中 清 蛋白 的 抗 氧 化 活 性 明 显高 出 球 蛋 白 一 倍 多 ,100ug/mL 的 清 蛋 白 与20ug/mL 的 茶 多 酚 活性 相 当 。 清 蛋 白 各 级分 之 间 相 差 不 大 , 都有 较 好 的 活 性 。

白 果 蛋 白 清 除 羟 基 自 由 基 (·OH) 的 作 用IR(%)807060504030201000 200 400 600 800 1000 1200 1400GAPGSPGGPIR(%)9080706050403020100y = 11.658Ln(x) - 12.182R 2 = 0.97940 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500GAPconcentratron(ug/mL)IR(%)706050403020100concentration(ug/mL)GAP GAPⅠ GAPⅡ GAPⅡa图 8-5.GAP 不 同 级 分 清 除 羟 基 自 由 基 活 性 比 较Fig8-5.Compare capability of scavengingsuperoxide free radical among novels GAP图 8 4 白 果 清 蛋 白 清 除 羟 基 自 由 基 的 量 效 关 系纯 化 的 GAPⅠ 略 比 GAP 低 , 而GAPⅡ 和 GAPⅡa 却 比 GAP 有 所 提高 。 经 过 长 时 间 的 分 离 纯 化 处理 ,GAPⅡa 还 能 保 持 相 当 高 的抗 氧 化 活 性 , 说 明 GAPⅡa 生 物活 性 比 较 稳 定 , 同 时 也 说 明 ,本 文 确 定 的 提 取 、 分 离 和 纯 化工 艺 对 于 白 果 活 性 蛋 白 来 说 是一 条 合 理 途 径 。

白 果 蛋 白 体 外 抗 氧 化 作 用Effect of GP on MDA of rat liver incubated in vitroGroupdosemg/mLcontent of MDA(mg/Ml)warm-bathing Fe 2+ inducing H 2O 2inducingControl 0 3.35±0.12 11.44±0.55 3.45±0.12GSP 64.0 2.28±0.10* 6.00±0.39* 3.20±0.11GAP 64.0 3.69±0.14 10.36±0.57 6.00±0.30*16.0 3.27±0.13 8.43±0.35* 5.88±0.31*4.0 2.44±0.09* 8.27±0.33* 2.66±0.14*2.0 2.71±0.11* 9.04±0.41* 2.93±0.23*1.0 2.92±0.12* 10.35±0.54 3.18±0.25注 :1X±S2n=83 与 对 照 组 相 比 *P

Effect of GP on MDA formation of rat liver plastomasme and red cell in vitroGroupdosemg/mLplastosomecontent of MDA(mg/mL)red cellControl 0 0.62±0.05 1.21±0.10GSP64.0 0.22±0.02* 1.98±0.22*GAP64.0 0.18±0.03* 1.65±0.21*16.0 0.26±0.02* 1.06±0.09*4.0 0.44±0.04* 0.29±0.08*2.0 0.46±0.04* 0.66±0.09*1.0 0.48±0.03* 1.28±0.11注 :1X±S2n=83 与 对 照 组 相 比 *P

白 果 蛋 白 体 内 抗 氧 化 作 用Table 8-9 Changes of body weight(х(—)±s,n=10)GroupAgedControlYoungControlDietary(mg/kg.d)0day7thdayBody weight(g)14thday21thday30thday0 45.3±3.8 45.5±3.9 45.1±4.4 45.6±4.2 45.9±4.70 34.2±3.1 34.8±2.9 35.4±3.3 37.1±3.1 39.5±3.4GAP 100 44.8±4.1 44.7±3.8 44.5±4.2 44.8±4.2 45.1±3.950 46.1±4.5 46.3±3.9 46.0±41 46.3±43 46.5±4.225 43.9±3.9 43.7±3.7 44.1±4.0 44.0±3.8 44.2±4.1GSP 200 46.5±4.2 46.7±4.4 46.3±4.2 46.1±3.9 45.8±4.1100 45.2±3.9 45.1±3.8 45.3±4.1 45.7±4.2 45.5±4.250 46.1±4.3 45.9±3.7 46.3±4.0 45.7±4.4 46.5±3.9

Changes of body weights of Thymus after supplementation of GPGroupDietary(mg/kg.d)Thymus index(mg/10g)Thymus gain(mg/10g)Thymus gainratio(%)Aged Control 0 26.11±7.22YoungControl0 38.33±8.76GAP 100 27.02±6.50 0.91 3.4950 28.15±5.14 2.04 7.8125 29.08±8.12 2.97 11.37GSP 200 27.08±5.27 0.97 3.72100 27.61±3.34 1.50 5.7450 27.65±6.88 1.54 5.90

Effects of GP on MDA in serum and liver of mice (х±s,n=10)Group Dietary (mg/kg.d) In serum In liver(nmol/mL)(nmol/mg protein)Aged Control 0 9.53±1.25 1.91±0.36Young Control 0 4.32±0.57 0.92±0.16GAP 100 7.24±0.54** 1.91±0.2050 7.26±0.61** 1.43±0.30*25 6.76±0.60** 1.28±0.13**GSP 200 6.51±0.51** 1.68±0.40100 6.40±0.43** 1.45±0.32*50 5.85±1.20** 1.43±0.29**:P

Effects of GP on SOD in serum and in liver of mice(х±s,n=10)Group Dietary In serum In liver(mg/kg.d) (NU/mL) ( NU/mg protein)Aged Control 0 164.3±15.1 531.1±58.5Young Control 0 291.2±24.7 968.2±84.3GAP 100 208.0±10.7** 805.8±31.2**50 216.9±17.5** 604.3±39.9*25 195.3±10.3** 592.7±56.9GSP 200 208.5±12.8** 689.1±65.4**100 199.6±19.7** 623.0±29.6*50 203.2±11.5** 611.2±42.9**:P