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Capitolo 7 - Omero

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ANALISI DELLA SEQUENZANUCLEOTIDICA DEL DNA


• Uno dei metodi più comunemente usati per questaanalisi è quello di Sanger, detto anche metodo dellaterminazione della catena o deididesossiribonucleotidi (ddNTP).• Si tratta di una metodica elegante e relativamentesemplice che consiste nel far sintetizzare frammentidi catena polinucelotidica di lunghezza diversa sullostampo del DNA che si vuole sequenziare. Ciò siottiene facendo avvenire la sintesi della nuovacatena utilizzando oltre ai 4 dNTP anche uno dei 4ddNTP. In presenza di DNA polimerasiun ddNTP puòessere incorporato all’estremità 3’ di una catenanucleotidica in accrescimento su uno stampo diDNA, ma non può poi legare un altro nucleotideperchè non è disponibile l’OH in 3’.


ddNTP


Il principio del procedimento può esserebrevemente riassunto: si prepara una miscela direazione contenete• - il frammento di DNA da sequenziare,denaturato, quindi a singolo filamento;• - un primer, cioè una breve sequenza nucleotidicacon le estremità 3’ e 5’ libere;• - una DNA polimerasi con elevata processività ebassa attività esonucleasica (sia in direzione 5’-3’,sia in direzione 3’-5’; as es. Sequenasi delcommercio);• - i 4 dNTP;• - un dNTP marcato con 32 P o con 35 S (incorporatoin una base modificata).


• Si suddivide quindi la miscela in 4 frazioni (A, T, G, C), aciascuna delle quali si aggiunge un diverso ddNTP, cioèddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP e si incuba per un tempoopportuno.• Poichè l’incorporazione del ddNTP nella catena inaccrescimento è del tutto casuale, durante l’incubazionesi formano in ciascuna frazione frammentipolinucleotidici di lunghezza diversa, aventi tutti comesequenza iniziale quella del primer, sequenza successivain direzione 5’ 3’ complementare al segmentoduplicato del DNA stampo, e tutti terminanti con ilddNTP presente in quella frazione.• Dopo incubazione le quattro frazioni vengonodenaturate al calore, per separare le catene nucleotidicheappaiate, e sottoposte ad elettroforesi in un unico gel dipoliacrilammide.


Terminazione della catena


ddCTPddCTPddCTPPRIMERDNA Polimerasi5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’+ ddNTP ( per es. ddCTP)STOP5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza di ogni ddCTPddCTPddCTPddCTP


Schema di sequenziamento a terminazione di catenaDNA stampo asingola elica3’-GGCTAAC5’ 3’3’-GGCTAAC+[ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +DNA PolimerasiIbridazione conIl primerddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP-CCG ddA-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC-ddC-CddCA C G TSequenza: 5’-CCGATTG-CC ddG-CCGATT ddGGTTAGCCDirezione dilettura-CCGA ddT-CCGAT ddT


• Le diverse catene polinucleotidicheneosintetizzate migreranno nel gel versol’anodo in funzione della loro lunghezza epossono essere facilmente localizzate, poichèradioattive, per autoradiografia. Si possono cosìevidenziare centinaia di bande e separare cateneche differiscono di un solo nucleotide.• Nelle 4 corsie del gel le bande si disporranno inordine di lunghezza dal fondo verso la zona dideposizione.• Dalla successione di tutte le bande presenti nelle4 corsie del gel si può risalire alla sequenza delframmento di DNA usato come stampo.


Metodo di sequenziamentodel DNA “dideossi” diSanger


• Alla rilevazione per autoradiografia si può sostituire unarilevazione con marcatori fluorescenti di quattro coloridiversi legati all’estremità 5’ del primer. Si incuba ilprimer di colore diverso per ciascuna delle quattrofrazioni. Al termine dell’incubazione si mescolano lequattro frazioni e si fanno correre in un unico pozzetto. Siotterranno sul tracciato bande fluorescenti di coloridiversi, che identificano la base con cui termina ciascunframmento. Questa modalità ha consentito di mettere apunto metodi di sequenziamento automatizzato delDNA, nei quali si effettua una scnsione del gel con unraggio laser che eccita I fluorofori e si rilevano eregistrano le diverse colorazioni delle singole bande.• Ciò consente di esaminare in un unico gel più campioni,ognuno in una diversa corsia, di identificare per ognicampione la sequenza di diverse centinaia di basi, diparagonare tra loro diversi campioni.


Sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescentiConiugando a ciascunddNTPun diverso marcatorefluorescente, èpossibile effettuare lequattro reazioni disequenziamento in ununico tubo da saggioe caricare il tutto insolo pozzetto di gelddAddTddCddG


Fluorescent DNA SequencingA G T A C T G G G A T CGelElectrophoresis


Detection of Fluorescently Tagged DNADNA FragmentsSeparated byElectrophoresisOpticalDetection SystemOutput to ComputerScanning LaserExcitesFluorescent Dyes


Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colorediverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.elettroferogramma


Fluorescent DNA Sequencing Data


Un altro metodo per la determinazione dellasequenza, attualmente di larga diffusione, èquello definito Pyrosequencing od anchesequenziamento per sintesi. La primadenominazione che è un termine brevettatoderiva dal fatto che l’analisi sfrutta la liberazionedi pirofosfato che si ha quando la DNApolimerasireagisce con un nucleoside trifosfato elega un nucleotide ad una catenapolinucleotidica in accrescimento. Come nel metodo di Sanger, si opera su unsegmento di DNA a singolo filamento che agiscecome template per la sintesi di una nuova catenapoilinucleotidica ad opera della DNA polimerasi.E’ diversa la modalità che consente ilrilevamento dell’accrescimento.


Le tappe del pyrosequencing possono essere riassuntecome segue:il DNA di cui si vuole determinare la sequenza vieneridotto in frammentidi un centinaio di paia di basi edenaturato così da formare DNA a singolo filamentoche sarà il template;al frammento di ssDNA viene aggiunto un primer equindi un cocktail di enzimi e di substrati DNApolimerasi, ATP solforilasi, apirasi, luciferasi,adenosinfosfosolfato (APS) e luciferina;si da quindi inizio alla reazione di sintesi aggiungendoin successione , separatemente, uno dei 4 dNTP.Reazione catalizzata della ATP solforilasi:ATP + H 2 SO 4 APS + PPi


• Step 1A sequencing primer is hybridized to a single-strandedPCR amplicon that serves as a template, and incubatedwith the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase,luciferase, and apyrase as well as the substrates,adenosine 5' phosphosulfate (APS), and luciferin.


• Step 2The first deoxribonucleotide triphosphate (dNTP) isadded to the reaction. DNA polymerase catalyzes theincorporation of the dNTP into the DNA strand, if it iscomplementary to the base in the template strand. Eachincorporation event is accompanied by release ofpyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to theamount of incorporated nucleotide.


• Step 3ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5'phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase-mediatedconversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light inamounts that are proportional to the amount of ATP. The lightproduced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a chargecoupled device (CCD) chip and seen as a peak in the raw data output(Pyrogram). The height of each peak (light signal) is proportional tothe number of nucleotides incorporated.


• Step 4Apyrase, a nucleotide-degrading enzyme, continuouslydegrades unincorporated nucleotides and ATP. Whendegradation is complete, another nucleotide is added.


• Step 5Addition of dNTPs is performed sequentially. It should be noted thatdeoxyadenosine -thio triphosphate (dATP·S) is used as a substitutefor the natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it isefficiently used by the DNA polymerase, but not recognized by theluciferase. As the process continues, the complementary DNA strandis built up and the nucleotide sequence is determined from thesignal peaks in the Pyrogram trace.


• Il pyrosequencing ha notevoli vantaggi perchè nonnecessita l’utilizzo di dNTP marcati, ne di ddNTs, e non ènecessaria la separazione elettroforetica dei frammenti.• Il metodo è stato automatizzato e sono stati messi apunto sequenziatori che effettuano le determinazioni sumolti campioni in parallelo, utilizzando DNA chip; inpratica in ciascun pozzetto è fissato un frammento dissDNA. Il succedersi delle reazioni che avvengonocontemporaneamentein tutti i pozzetti, il rilevamento,l’analisi e l’elaborazione dei risultati è gestito da unsoftware dedicato, che riporta I dati in pirogrammi od intabulati riferiti a ciascun campione.• Con queste strumentazioni è possibile determinare inpoche ore sequenze geniche di milioni di paia di basi.• E’ anche possibile anche effetuare contemporaneamenteun’analisi comparativa di DNA di origine diversa, erilevare con facilità mutazioni di singole basi.


Metodo di Sequenziamento di Maxam e Gilbert« Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento« Denaturazione e separazione dei due filamenti« Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognunodei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una odue delle 4 basi del DNA.G = DMS + piperidinaG + A = DMS + piperidina + acido formicoC + T = idrazina + piperidinaC = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M« Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazioneparziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradateproducendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalladistanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio« Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e« Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia


Metodo diSequenziamentochimico secondoMaxam e Gilbert

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