Legionella spp

watermicro.gr

Legionella spp

Εργαστήριο ΥγιεινήςΤµήµα ΙατρικήςΠανεπιστήµιο Πατρών«Legionella spp»Κατερίνα Φράγκου, M.ScΥποψήφια ∆ιδάκτωρ Ιατρικής ΣχολήςΠανεπιστηµίου ΠατρώνΤηλ/fax 2610969875email: fragou@med.upatras.gr


Ευνοϊκές συνθήκεςΘερµοανθεκτικό 20-45 0 C16,5 – 64 0 CL.pneumophila πολ/σµός 25-42 0 CL.pneumophilaανάπτυξη 35 0 C


Κλινική εικόναΣυµπτωµατικές µολύνσεις πουεπηρεάζουν κυρίως τουςπνεύµονες.Εµφάνιση σε δύο µορφές:Pontiac πυρετόςΣυµπτώµατα παρόµοιαγρίπης (2-5 µέρες)Νόσος των ΛεγεωνάριωνΣοβαρή µορφήπνευµονίας (θάνατος)


Συµπτώµατα Νόσου ΛεγεωνάριωνΕκδήλωση 2-14 ηµέρεςΣυµπτώµατα παρόµοια πνευµονίαςΠυρετός 40-40,5 0 CΒήχαςΡίγοςΜυϊκός πόνος και πονοκέφαλοςΑντιµετώπιση αντιβιοτικά


Συµπτώµατα Νόσου ΛεγεωνάριωνΠαραγωγικός βήχας, αιµόπτυσηΠόνος, δύσπνοιαΚούραση, ανορεξίαΕµετοί, διάρροιαΣύγχυση, παραισθήσεις, διαταραχές πνευµατικώνλειτουργιώνΣοβαρές επιπλοκέςΑναπνευστική ανεπάρκειαΣηψαιµικό σοκΟξεία νεφρική ανεπάρκειαΘΑΝΑΤΟΣ


Ευπαθείς ΟµάδεςΚάθε άτοµο µπορεί δυνητικά να προσβληθεί από την νόσοΝεογνάΗλικιωµένοι άνω των 50 ετών (κυρίως άντρες)Καπνιστές, διαβητικοί, νεφροπαθείςΚαρκινοπαθείςΜεταµοσχευµένα άτοµαΆτοµα µε εξασθενηµένο ανοσοποιητικό σύστηµα∆ΙΑΓΝΩΣΗΤεστ σε ούρα και αίµαΑκτινογραφία θώρακος


Που ζει η Legionella ;;;;;;Υδάτινο περιβάλλον (λίµνες, ποτάµια,υπόγεια νερά, θάλασσα)Σε τεχνητά συστήµατα (νερό ύδρευσης,νοσοκοµεία, βιοµηχανίες, πλοία, πισίνες,ξενοδοχειακές µονάδες)Συστήµατα κυκλοφορίας ζεστού/κρύουνερούΕξατµιστικοί συµπυκνωτέςΒρύσες, ντουςΠισίνες, δεξαµενές υδροµαλάξεων (σπα)∆ιακοσµητικά σιντριβάνιαΕξοπλισµός αγωγής του αναπνευστικούσυστήµατοςΠύργοι ψύξης


Εισπνεόµενα σταγονίδιαΑερολύµατα :Ψεκασµός νερούΤρόποι µετάδοσης νόσου∆ιοχέτευση αέρα σε υδάτινεςσυλλογέςΚρούση νερού σε στερεέςεπιφάνειεςΗ µόλυνση γίνεται µε εισπνοή σταγονιδίων, ατµού ή υγρασίαςΚαταγράφηκαν εξάρσεις της νόσου σε ξενοδοχεία, κρουαζιερόπλοια – σεψυκτικά συστήµατα, σε µπάνια, πισίνες, συστήµατα κλιµατισµού


Επιδηµιολογική επιτήρηση1986 “European Working Group for Legionella Infections-EWGLI”www.ewgli.org∆ίκτυο EWGLINETΑναφορά κρουσµάτων πουσχετίζονται µε ταξίδια στην Ελλάδα και παραµονή σετουριστικό κατάλυµα


Παγκόσµια παρουσία:Ν. και Β.ΑµερικήΑσίαΑυστραλίαΝ.ΖηλανδίαΕυρώπηΑφρικήΈτοςΑριθµόςπεριστατικώνΑριθµός χωρών πουπροσέφερανδεδοµέναΠληθυσµός(Εκατοµµύρια)Ποσοστόανά εκατοµµύριο2000 2156 28 400 5.382001 3470 29 455 7.602002 4696 32 466 10.12003 4578 34 468 9.82004 4588 35 557 8.2Περιστατικά για την Νόσο των Λεγεωνάριων 2000-2004 στην Ευρώπη


Επιδηµιολογικές µελέτες2000 – 2007 Ιρλανδία 67 περιστατικά (5 θάνατοι)2001 500 κρούσµατα στην Ευρώπη διαµονή σεξενοδοχεία2005 755 κρούσµατα στην Ευρώπη (20) ταξίδια2006 6280 περιστατικά στην Ευρώπη (35)Μεγαλύτερη εµφάνιση Ισπανία, Ολλανδία, ∆ανίαΜεµονωµένες περιπτώσεις ή σποραδικές περιπτώσειςΕπιδηµίες νόσου ξενοδοχειακά συγκροτήµατα ,νοσοκοµείακαι µεγάλα κτιριακά συγκροτήµατα κλιµατιστικά συστήµατα


Αντιµετώπιση ΝόσουΕγκύκλιος Υ2/Γ.Π/οικ.79305/8-8-2002«Πρόληψη νόσου των λεγεωνάριων»Υπουργείο Υγείας καιΠρόνοιας , Γενική ∆ιεύθυνσηΥγείας, ∆ιεύθυνση Υγιεινήςκαι Περιβάλλοντος,Αύγουστος 2002.


Χώρες που ακολουθούν την Ευρωπαϊκή οδηγία(Μάρτιος 2006)


∆ιαδικασία ανίχνευσηςΣυλλογή 1 λίτρου δείγµατος νερούΑνάδευση του δείγµατος, περίπου 10-15 φορές.∆ιήθηση 1 λίτρου δείγµατος µέσω µεµβράνης 0.22µm,Μεταφορά του φίλτρου µε τσιµπίδα σε stomacher bagΠροσθήκη 10ml PBS στο stomacher bag.47mmΤρίψιµο του φίλτρου µε τα δάχτυλα, έτσι ώστε το φίλτρο να είναισε επαφή µε το PBS τουλάχιστον για 1 min.Μεταφορά σε centrifuge tubes (falkon 50mL) όσο το δυνατόνπερισσότερου υγρού από το stomacher bagΚαταγραφή του όγκου που µεταφέρεται


Πρωτόκολλο εργασίαςΦυγοκέντρηση των tubes στις 6000x g (6000 RCF ) για 10min, στους21 o C, µε φρένοΑφαίρεση του υπερκείµενου, χωρίς αναταραχή εκτός του 1ml.Vortex καλά, για να γίνει κατακρήµνιση του ιζήµατος µε τουπολειπόµενο 1 ml.Το 1 ml αποτελεί τον τελικό µας όγκο ( concentrate ).Επεξεργασία του concentrate µε τους ακόλουθους τρεις τρόπους A, B,Γ.•Επεξεργασία του concentrate µε τους ακόλουθους τρεις τρόπουςA, B, Γ.


Επεξεργασία concentrate( Α )Heat treatmentΜεταφορά 0.2mL του τελικού concentrate σεeppendorf (1.5mL)Μεταφορά σε υδατόλουτρο στους 50 o C για30min± 2minΑνάδευση του δείγµατος καλά και στρώσιµοάµεσα 0.1 mL µε spreader σε τρυβλία GVPCLegionella Selective SupplementΤοποθέτηση των τρυβλίων, αφού έχουναπορροφηθεί καλά, σε αποστειρωµένη πλαστικήσακούλα (stomacher bag) σε κλίβανο µε 2,5 %CO 2 στους 36 ο C± 2 ο C


Επεξεργασία concentrate( B )Acid treatmentΜεταφορά 0.2mL του τελικού concentrate σε eppendorf(1.5mL)Προσθήκη ίσου όγκου (0.2mL) acid buffer pH= 2.2±0.2Ύστερα από 5min± 30sec, στρώσιµο 0.2 mL µε spreader σετρυβλία GVPC Legionella Selective SupplementΤοποθέτηση των τρυβλίων, αφού έχουν απορροφηθεί καλά,σε αποστειρωµένη πλαστική σακούλα (stomacher bag) σεκλίβανο µε 2,5 % CO 2 στους 36 ο C±2 ο C.


Επεξεργασία concentrate( Γ )UntreatedΣτρώσιµο 0.1mL τελικού concentrate µε spreader σετρυβλία GVPC Legionella Selective SupplementΤοποθέτηση των τρυβλίων, αφού έχουν απορροφηθεί καλά,σε αποστειρωµένη πλαστική σακούλα (stomacher bag) σεκλίβανο µε 2,5 % CO 2 στους 36 ο C±2 ο C.


Αναγνώριση αποικιώνΕξέταση των τρυβλίων ανά δύο µε τρεις µέρες µέχρι καιτην δέκατη µέραΚαταγραφή αποτελεσµάτων και ανακαλλιέργεια τωνύποπτων αποικιώνΑνακαλλιέργεια των ύποπτων αποικιώνΟι ύποπτες αποικίες είναι λευκές και έχουν µία«εσµυρισµένη», ιριδίζουσα εµφάνισηΟι χαρακτηριστικές αποικίες είναι οµαλές και συχνά είναιάσπρες ή γκρι-µπλε-µωβ αλλά µπορεί να είναι και καφέ,ροζ, απαλό πράσινο ή βαθύ κόκκινο.


ΑΝΑΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΣΕ BCYE + ΚΑΙ ΣΕ BCYE -Αν κατά την εξέταση των τρυβλίων GVPC µετά τηνδέκατη µέρα βρεθούν ύποπτες αποικίες τότεεπιλέγονται µε τον κρίκο δύο µε τρειςχαρακτηριστικές αποικίες από κάθε είδος καιακολουθεί ανακαλλιέργεια σε τρυβλία BCYE with L-cysteine (BCYE +) και BCYE without L-cysteine(BCYE -)Τοποθέτηση των τρυβλίων σε αποστειρωµένηπλαστική σακούλα (stomacher bag) σε κλίβανο µε2,5 % CO ο 2 στους 36 C για 2 µε 3 µέρες το ελάχιστο.Οι αποικίες που αναπτύσσονται στο BCYE + και δεναναπτύσσονται σε BCYE – θεωρούνται πιθανέςαποικίες Legionella sppΗ επιβεβαίωση των θετικών αποικιών γίνεται µεlatex agglutination kit.


Duopath Legionella (Merck, Germany)Immunochromatographic rapid testΕπιλέγονται µε τον κρίκο µία µε τρεις χαρακτηριστικές αποικίεςαπό τα τρυβλία BCYE with L-cysteine (BCYE+)∆ιάλυση των αποικιών σε 144µl 0.9%-NaCl/1%-Tween 20-stocksolutionΠροσθήκη 16µl Polymixin stock solutionΚαλή ανάδευσηΕπώαση για 2-5 min σε θερµοκρασία δωµατίουΘέρµανση για 5 min στους 95 o CΑφήνουµε να κρυώσει σε θερµοκρασίαΤοποθέτηση 150µL στην κυκλική επιφάνεια του τεστΠαρατήρηση ύστερα από 30 min για την παρουσία ροζ ζωνώνΎπαρξη ροζ ζωνών, θετικό αποτέλεσµα Legionella pneumophilaή Legionella species


Καταµέτρηση αποικιών C = cfu/ litre του αρχικού δείγµατος n = ο αριθµός των αποικιών που καταµετρούνται στο CVPC v = ο όγκος ( mL) του concentrate ( 1 mL ) i = ο όγκος ( mL ) που εµβολιάζεται στα petri ( 0.1 mL ή 0.2 mL ) s = ο όγκος ( litres ) του νερού που νερού που έγινε η διήθηση (1L ) To petri µε τον µεγαλύτερο αριθµό αποικιών πρέπει ναχρησιµοποιηθεί για την εκτίµηση των αριθµών των θετικώναποικιών Legionella στο αρχικό δείγµα.


Εργαστήριο ΥγιεινήςΤµήµα ΙατρικήςΠανεπιστήµιο ΠατρώνΕυχαριστώ πολύ για τηνπροσοχή σαςΚατερίνα Φράγκου, M.ScΥποψήφια ∆ιδάκτωρ Ιατρικής ΣχολήςΠανεπιστηµίου ΠατρώνΤηλ/fax 2610969875email: fragou@med.upatras.gr

More magazines by this user
Similar magazines