Carlo Brera - Istituto Superiore di SanitÃ

LE MICOTOSSINE NEL FRUMENTO:Aggiornamenti e aspettative per il 2009Metodi rapidi e di screeningnell’analisi delle micotossineCarlo BreraIstituto Superiore di SanitàBologna, 28 maggio 2009

• Sono sostanze dotate di elevato potere cancerogeno• Sono sostanze che manifestano tossicità croniche e raramente acute• Sono sostanze termostabili• Sono fortemente elettrostatiche• Sono ubiquitariamente presenti sul territorio• Presentano una tipologia di contaminazione eterogenea(a macchia di leopardo)• Non presentano difficoltà da un punto di vista di determinazione analitica

Regolamento CE/1126/2007 dellaCommissione del 28 settembre2007che modifica il regolamento 1881/2006 chedefinisce i tenori masimi di alcunicontaminanti nei prodotti alimentari perquanto riguarda le Fusarium tossine nelgranoturco e nei prodotti derivati

Regolamento CE/1126/2007Considerando 34E’ opportuno stabilire tenori massimi diFusarium-tossine per i cereali non trasformaticommercializzati per la prima trasformazione.I procedimenti di pulizia, cernita edessiccazione NON sono considerati partedella prima trasformazione se non vieneesercitata alcuna azione fisica sullacariosside, mentre la decorticazione vaconsiderata parte della prima trasformazione

Regolamento 1126/2007

Distribuzione del DON nel processo di molitura del grano3500300030002500+143%2000150012501000500950 950-25%700-25%600- 37%0

Andamento processo produttivo- ROSA test - DON• Il processo di decorticazione produceun abbattimento dal 20 al 30%• Concentrazione nel tritello efarinaccio dal 150% al 250 %• Nella semola non si osservanoabbattimenti

La filiera analiticaCampionamentoPreparazioneDel campioneAnalisi Quali/quantitativa

7 tDAL CAMPO AL BANCONE1 : 600.0000.00016 % 30 t5 kg1 kg50 grammi

Campionamento• Procedure conformi al Regolamento CE/401/2006(Controllo ufficiale)• Da evitare il controllo nei silos• Da preferire quello sui camion in condizioni dinamichepiuttosto che statiche• Campionatori automaticiPER OTTENERE INFORMAZIONI ATTENDIBILISI DEVE INVESTIRE SUL CAMPIONAMENTO

Preparazione del campione• Macinazione del campione globale fino agranulometria fine• Omogeneizzazione del campione macinato asecco o con acqua• Prelievo in modo rappresentativo diun’aliquota da destinare all’analisi

Macinazione con acqua(slurry)

MycotoxinAflatoxinsTrichothecenes(type A)Trichothecenes(type B)ZearalenoneOchratoxin AFumonisinsExtraction solventacetonitrile/water, methanol/water,acetone/wateracetonitrile/water, methanol/wateracetonitrile/water, water (DON)acetonitrile/water, methanol, acetonitrilechloroform/H 3 PO 4 , acetonitrile/water,methanolo/3% NaHCO 3 , toluene/HCl/MgCl 2methanol/water, acetonitrile/water,acetonitrile/methanol/water

Purificazione• Colonnine di immunoaffinità (Euroclone, R-Biopharm, Romer, VICAM)• Colonnine di immunoaffinità rigenerabili(Euroclone, Generon)• MycoSep®/MultiSep® columns (Romer)• Colonnine multi-micotossina (R-BiopharmRHONE, Romer, VICAM)

DON – HPLC-UVMetodo ISS• Principio del metodo: estrazione conacqua• Purificazione su CIA• Determinazione per HPLC con rivelazioneUV a 220 nm• Fase mobile : Acqua: MeOH 85:15(isocratica)• LQ: 0.050 mg/kg

DON – Metodi di screening• Estrazione con acqua• Chiarificazione dell’ estratto• Diluizione• Incubazione• Lettura

Regolamento EC 882/2004Caratterizzazione dei metodi di analisi• Accuratezza• Applicabilità (matrice e concentrazione)• LR/LQ• Precisione (ripe/riproducibilità)• Recupero• Selettività• Sensibilità• Linearità• Incertezza di misura

Metodi di screening e/o rapidi• Elevato numero di campioni per die• Interesse ad individuare un livello soglia (ad esempio limite legale)• Diversità delle matrici da analizzare• Differenti sostanze da ricercare• Rapidità di risposta• Sensibilità accettabile• Bassa cross-reattività• Contenimento dei costi• Esperienza del personale• Possibilità di utilizzo in-situSi rivolgono principalmente alleaziende nello svolgimento delleattività di autocontrolloImpiego nella ricerca

Tipi di test• Test qualitativi con cut-off (rispostasi/no) risposta visuale/lettore• Test quantitativi che richiedono unreader ottico o scanner per la letturadella concentrazione

Scelta della strategia di controllo• Laboratorio interno• Laboratorio esternoAttrezzato??Esperto??• Metodi ufficiali• Metodi rapidi• Metodi di screening• Metodi di conferma

Metodi ufficiali e di riferimentoMicotossina Matrice Metodo PRINCIPIOAFLATOSSINE CerealI AOAC-991.31 IAC-HPLC-FLDAFLATOSSINE Mais AOAC-993.16 ELISAAflatossina B1 Mangimi AOAC-2003.02IAC-HPLC-FLDCEN-ISO 17375:2006Aflatossina B1 Baby foods AOAC-2000.16 IAC-HPLC-FLDOcratossina A Cereali e Prodotti Derivati CEN-ISO 15141-1:1998 IAC-HPLC-FLDOcratossina A Mais ed orzo AOAC-991.44 IAC-HPLC-FLDOcratossina A ORZO AOAC-2000.03 IAC-HPLC-FLD

Metodi ufficiali e di riferimentoMicotossina Matrice Metodo PRINCIPIOOcratossina A Orzo CEN-ISO 14132:2003 IAC-HPLC-FLDOcratossina A Baby foods CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEIAC-HPLC-FLDDeossinivalenolo Grano AOAC-986-18 IAC-HPLC-UVDeossinivalenolo Cereali e prodotti derivati CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEDeossinivalenolo Baby foods CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEIAC-HPLC-UVIAC-HPLC-UVDeossinivalenolo Grano AOAC-986.17 IAC-HPLC-UVZearalenone Mais AOAC-985.18 IAC-HPLC-FLD

Micotossina Matrice Metodo PRINCIPIOZearalenone Cereali e prodotti derivati CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEZearalenone Baby foods CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEIAC-HPLC-FLDIAC-HPLC-FLDZearalenone Grano e mangimi AOAC-994.01 ELISA qualitativoZearalenone Mais AOAC-976.22 TLCFumonisine Mais AOAC-995.15 HPLCFumonisine Prodotti alimentari a base di mais AOAC-2001.04;CEN-ISO14352:2005IAC-HPLC-FLDFumonisine Mais CEN 13585:2002 SPE-HPLC conderivatizzazione pre-colonnaFumonisine Mais AOAC-2001.06 ELISAFumonisine Baby foods CEN - IN VIA DIAPPROVAZIONEIAC-HPLC-FLD

Metodologie analitiche a confrontoMetodologia Vantaggi SvantaggiHPLC/UPLCLC/MS/MSELISAOttima sensibilitàOttima selettivitàBuona ripetibilitàTempi di analisi relativamente breviMetodi ufficiali disponibili (AOAC)Possibilità di automatizzazioneSimultanea analisi di più micotossineBuona sensibilitàCostituisce metodo di confermaNon è necessaria la derivatizzazionePreparazione del campione sempliceEquipaggiamento mediamente costosoAlta sensibilitàValida per screeningAnalisi simultanea di molti campioniCosto della strumentazioneCosto dell’analisiEsperienza del personaleDerivatizzazione (aflatossine, fumonisina)Uso di solventi organiciCosti elevati della strumentazioneEffetti matriceAlta esperienza del personaleCross-reattività con altre micotossine(specificità)Effetti matricePresenza di falsi positivi/negativiRichiede analisi di confermaRipetibilità e riproducibilità criticheEsperienza del personale

ELISA principlesDirect competitive ELISAThe antibody is coated on to the wells of theELISA plate.The test sample and the enzymelabelledmycotoxin conjugate are added tothe wells. If no toxin is present in the sample,the enzyme labelled toxin will bind to thecapture antibody coated to the wells. If toxinis present in the sample, it will compete withthe labelled toxin for binding to the antibody.During washing procedures any unboundlabelled enzyme will be washed away. On theaddition of substrate, a colour will develop,the intensity of which is proportional to theamount of mycotoxin-enzyme bound to thewell; i.e., the colour intensity decreases withincreasing concentrations of the toxin in thesample.

DON - Cross reattivitàNei kit ELISA commercialmente disponibili, èpossibile l’esistenza di cross-reattività con alcunimetaboliti del DON che portano ad unasovrastima dei risultati- DON-3-glucoside- AcetilDON- 3-OH DON- 15-OH DONDIPARTIMENTO DI SANITA’ PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

Hana Jaslova, 2008DIPARTIMENTO DI SANITA’ PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

DIPARTIMENTO DI SANITA’ PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

STUDIO INTERLABORATORIO.METODO IMMUNOENZIMATICO PER LADETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO INCAMPIONI DI GRANO TENEROCarlo Brera, Francesca Debegnach, Elisabetta Prantera, Marina MiragliaReparto OGM e MicotossineDipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza AlimentareIstituto Superiore di Sanità

Caratteristiche di efficienza - ELISA≤ 20%≤ 40%70-110%

Progetto MICOCER - DON nel frumentoCONFRONTO HPLC vs ELISA2500HPLC200015001000y = xR² = 1y = 0,7969x + 5,0687R² = 0,9992Lineare (HPLC v.s.ELISA )Lineare (retta 45)50000 500 1000 1500 2000 2500ELISASOVRASTIMA COSTANTE

ParametriDON (µg/kg)Materiali 1 2 3 4 5 6 Valori UEValori assegnati < LOQ 213 3299 1055 992 1572Valori di riferimento < LOQ 191 2934 800 1062 1323Anno 2008Numero dei lab 10 10 10 10 10 10Numero dei lab dopooutliers10 10 10 10 10Numero di outliers 0 0 0 0 0Numero di risultatiaccettati10 10 10 10 10Numero di repliche 2 2 2 2 2Media, µg/kg 211 3380 1013 998 1540Sr , µg/kg 36 505 137 172 330RSDr, % 17.3 15.0 13.6 17.3 21.4 ≤ 20r (=2,8xSr) µg/kg 101 1414 384 482 924SR, µg/kg 67 524 239 185 363RSDR , % DIPARTIMENTO DI SANITA’ 31.6 PUBBLICA 15.5 VETERINARIA 23.5 E SICUREZZA 18.6 ALIMENTARE 23.5 ≤ 40R (=2,8xSR) µg/kg 188 1467 669 518 1016Recupero, % 111 115 127 94 116 60-120

Andamento del kit ELISA rispetto al valore di riferimento ottenuto dall’analisi in HPLC per lo studio divalidazione interlaboratorio per la determinazione del DON in campioni di grano tenero (2008/2009).HPLC3500300025002000150010005000y = xR 2 = 1y = 0.882x + 4.1165R 2 = 0.98650 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500ELISADIPARTIMENTO DI SANITA’ PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

Confronto ELISA – GC/MSDr.ssa Emma Tealdo VENETO AGRICOLTURA - Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari, 2008

Comparison of ELISA and HPLC methods to determineconcentrations of aflatoxins (ppb) in Sicilian durumwheat grain in 2006. (Gallo, 2008)

Principi teorici del Lateral Flow Device (LFD)L’LFD competitivo si basa sulla competizione della micotossina presentenel campione con i siti attivi di un recettore anticorpale marcato per i sitiattivi di un complesso coniugato micotossina - recettore. La linea testcontiene un complesso coniugato - micotossina immobilizzato allamembrana che lega il recettore non legato per formare un complessoconiugato micotossina-recettore colorato. La linea di controllo include unanticorpo specifico legato alla membrana che si lega con il recettoremarcato. Il legame comporta una colorazione della banda. Se il segnalenella linea test è mancante o più debole come intensità, il test indica chel’analita è presente (test positivo). Se la linea test è chiaramente visibile,vuol dire che il campione non contiene la micotossina

LATERAL FLOW DIPSTICKMetodo Rapido

800DON - Correlazione HPLC-LFDy = 1,226x + 10,51R² = 0,836700HPLC60050040030020010000 100 200 300 400 500 600 700SOTTOSTIMARosa Test (ug/KG)

Don - Correlazione HPLC-LFDLFD800TRITELLOy = 0,920x + 123,6R² = 0,501700HPLC (ug/Kg)6005004003002001000LFD (ug/Kg)0 100 200 300 400 500 600 700sottostima costante

Metodi rapidiMetodologia Vantaggi SvantaggiLateral flowdipsticks(LFD)Strip testRapidità di esecuzioneNon è necessaria la purificazioneBasso costo della apparecchiaturaFacile da usareNon necessaria alta qualifica delpersonaleDiscreta esattezzaCosti operativi mediBuona sensibilità (limiti di legge)Costi operativi medio-bassiUso limitato di solventi organiciValidi per test di screeningPossibilità di essere utilizzati in locoEffetto matricePossibilità di falsi positivi/negativiMetodi esistenti non validatiTest qualitativi (soglia)Cross-reattività con altre micotossinePrecisione critica

Alcuni prodotti per il DONELISAR5901 RIDASCREEN ® FAST DON• R5902 RIDASCREEN ® FAST DON• R5905 RIDASCREEN ® FAST DON SC• R5906 RIDASCREEN ® DONCampo di concentrazioni: 0 – 6 mg/kgCross reattività: determina anche il 3-Acetil-DON – LQ: 18.5 µg/kgColonnine di immunoaffinità• P50 / P50B DONPREP ®Lateral flow test• R5904 RIDA ® QUICK DONLivello soglia ≥ 1.25 mg/kg o : ≥ 0.5 mg/kgTempo di incubazione: 5 minStandards• P63 DEOXYNIVALENOL STANDARD : Concentrazione : 100 µg/mlMateriali di Riferimento• P64-D Deoxynivalenol Reference MaterialAzienda: R-Biopham Rhone

Colonnine di immunoaffinità• DON TEST : Campo di concentrazione 0.1 – 10 mg/kgAzienda: VICAMColonnine di immunoaffinità• MycoSep®/MultiSep®ELISA Test Kits:• AgraQuant ® DON: Campo di concentrazione 0.25 – 5 mg/kg : LOQ: 0.2 mg/kg; tempo di incubazione: 20 minAccuTox® DON: LOQ: 0.5 mg/kgLateral Flow Test Kits:AgraStrip® DON: Campo di concentrazione: 0.5 – 5 mg/kg. Tempo di incubazione: 4 minStandards: Concentrazione - 100 µg/mLAzienda : ROMER LABS

Lateral Flow Test Kits:• ROSA TEST : campo di concentrazione : 0 – 6 mg/kgAzienda: CHARM/FOSSELISA Test Kits:• KIT AGRI-SCREEN (analisi qualitativa) – Controllo a 1 mg/kg; Tempo di analisi 10 min; cross-R 3-acetyl DON• KIT VERATOX (analisi quantitativa) - Vomitossina HS – DON: Campo di concentrazioni: 0.025-0.250 mg/kg; TA=20 mi• Vomitossina 5/5 – DON Campo di concentrazione: 0.25 – 3 mg/kg; TA = 10 minLateral Flow Dipsticks :• REVEAL DON : Reveal DON – CUT OFF: 2 mg/kg; TA= 6 minColonnine di immunoaffinitàAZIENDA DIESSECHEM

ELISA KIT Quantitativo 96 e 48 pozzettiLateral Flow Dipsticks STRIP TEST DON : Campo di concnetrazione: 0,5 - 1 - 2 mg/kgAZIENDA: ASTORIELISA• Deossinivalenolo Elisa Kit: campo di concentrazione 0 – 10 mg/kg; LQ = 0.5 mg/kg; TA=20 – 30 minAZIENDA: EUROCLONEELISA• DON GOLD (VT344/345): campo di concentrazione 0.05 – 5 mg/kg; LQ:0.05 mg/kg; TA=30 minAZIENDA: TECNA

I metodi immunoenzimatici possono presentare sia una leggerasovrastima sia una sottostima rispetto al dato ottenuto dall’analisi inHPLCIl metodo immunoenzimatico per la determinazione deldeossinivalenolo nel grano mostra un andamento soddisfacente perun’analisi di screening anche se in presenza di una leggerasovrastimaConfrontando i risultati ottenuti negli studi interlaboratorio con iparametri riportati nel Regolamento 401/2006, si può affermare cheesiste un sostanziale accordo, anche in considerazione del fatto che iparametri di riferimento riportati nel Regolamento riguardano metodidi conferma

3°Congresso NazionaleLe micotossine nella filieraagroalimentare e zootecnicaIstituto Superiore di Sanità28-30 settembre 2009

Carlo BreraIstituto Superiore di SanitàDipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e SicurezzaAliementare (DSPVSA)Reparto OGM e MicotossineTel. 06-49902377E-mail: carlo.brera@iss.it

Title: Masked mycotoxins: determination of a deoxynivalenol glucoside in artificially and naturally contaminatedwheat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Personal Authors: Berthiller, F., Dall'Asta, C., Schuhmacher, R., Lemmens, M., Adam, G., Krska, R.Author Affiliation: Christian Doppler Laboratory for Mycotoxin Research, Institute for Plant ProductionBiotechnology, Department for Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Applied LifeSciences, Vienna, Konrad Lorenz Strasse 20, A-3430 Tulln, Austria.Editors: No editorsDocument Title: Journal of Agricultural and Food ChemistryAbstract: Conjugated mycotoxins, in which the toxin is usually bound to a more polar substance like glucose,are referred to as masked mycotoxins, as these substances escape routine detection methods but can releasetheir toxic precursors after hydrolysis. This is the first report on the natural occurrence of a glucoside ofdeoxynivalenol (DON) in Fusarium-infected wheat and maize. To obtain appropriate standards, we chemicallysynthesized deoxynivalenol-3-β-D-glucopyranoside (DON-3-glucoside) and deoxynivalenol-15-β-Dglucopyranoside(DON-15-glucoside). The synthesis products were characterized by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The DON-glucosides showed different collision-induced dissociation (CID)fragmentation behaviors and could therefore be distinguished. Wheat plants were either treated with DON (n=52)or with Fusarium spp. (n=4) at anthesis, and after harvest, wheat ears were analyzed for DON and DONglucosides.All 56 treated wheat samples contained DON and a DON-glucoside with the same retention time,molecular mass, and CID fragmentation behavior as the synthetic DON-3-glucoside. Moreover, the DONglucosidewas also found in two out of three analyzed naturally DON-contaminated maize and in five out of fivenaturally contaminated wheat samples, in a range from 4 to 12% of the DON concentration. To further confirmthe identity of the DON-glucoside, the compound was isolated from wheat extracts and characterized as DON-3-glucoside with NMR. The results of this study indicate the importance to consider both DON and DON-3-glucoside with regard to food and feed safety.Publisher: American Chemical SocietyCarlo Brera

Analysis of deoxynivalenol, masked deoxynivalenol, and Fusarium graminearumpigment in wheat samples, using liquid chromatography-UV-mass spectrometry.Full AbstractTolerable limits set for deoxynivalenol (DON) do not consider DON conjugates such asDON-3-glucoside. Conjugates may be metabolized in vivo to DON. Such maskedmycotoxins and the potentially toxic Fusarium pigment are not routinely analyzed in cereals.We quantified DON, DON-3-glucoside, and a red Fusarium pigment in hard red springwheat, using a new liquid chromatography-mass spectrometry method. Extraction protocolsusing centrifugation and shaking, and methanol-methylene chloride (50:50 [vol/vol]) oracetonitrile-water (84:16 [vol/vol]) were assessed. Purposively and randomly selected hardspring wheat samples were extracted with solvent filtered through a C18 column andanalyzed using liquid chromatography-UV-mass spectrometry. Isocratic mobile phase (70%methanol) was used. Recoveries were 96.4% (DON) and 70.0% (DON-3-glucoside), whilelimits of detection were 1 microg/kg (MS) and 10 microg/kg (UV), and limits of quantificationwere 1 microg/kg (UV) and 0.5 microg/kg (MS), respectively. The pigment limits ofquantification and limits of detection on the MS were 4.3 and 0.0005 microg/kg, respectively.The purposively selected samples had DON, DON-3-glucoside, and pigment averages of3.4 +/- 4.0 microg/g, 3.8 +/- 8.3 microg/g, and 0.31 +/- 3.71 g/kg, respectively. The randomlyselected spring wheat had lower mean levels of DON (1.4 +/- 2.3 microg/g), DON-3-glucoside (0.2 +/- 1.0 microg/g), and pigment (147.93 +/- 247.84 microg/g). Analytical toolssuch as this new liquid chromatography-UV-mass spectrometry method can be used toquantify masked and parent mycotoxins, plus a potentially toxic pigment for riskassessment.Journal of food protection (J Food Prot), published in United States. (Language: eng)Reference: 2008-Jun; vol 71 (issue 6) : pp 1205-13Carlo Brera