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Attività enzimatiche dei batteri lattici isolati da impasti acidi per la ...

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Capitolo IIIAt t i v i t à e n z i m at i c h e d e i b at t e r i l at t i c i i s o l at i d a i m p a s t ia c i d i p e r l a p r o d u z i o n e d e l Co r n e t t o d i Mat e r aQuarantuno ceppi di <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong>, <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> <strong>per</strong> <strong>la</strong> produzionedel Cornetto di Matera, sono testati sul<strong>la</strong> base di attività <strong>enzimatiche</strong> rilevantinel<strong>la</strong> fermentazione. Le attività ureasica, pepti<strong>da</strong>sica, fitasica, fosfatasicae β-glucosi<strong>da</strong>sica sono state determinate in substrati sintetici utilizzandometodi spettrofotometrici. L’attività proteolitica è stata misurata in <strong>impasti</strong><strong>acidi</strong> modello, utilizzando <strong>impasti</strong> neutri e <strong>acidi</strong>ficati come controllo.Tutti i ceppi hanno mostrato una bassa attività ureasica, glutami<strong>la</strong>minopepti<strong>da</strong>sica e iminopepti<strong>da</strong>sica, mentre significative differenze sonostate osservate all’interno delle specie <strong>per</strong> le altre attività <strong>enzimatiche</strong>. I ceppidi Leuconostoc mesenteroides e Lactobacillus curvatus hanno dimostratoun’elevata attività aminopepti<strong>da</strong>sica, X-prolil dipeptidil aminopepti<strong>da</strong>sica,β-glucosi<strong>da</strong>sica, fitasica, mentre le attività <strong>enzimatiche</strong> <strong>dei</strong> ceppi di Lb.p<strong>la</strong>ntarum, Lb. pentosus e Weissel<strong>la</strong> cibaria erano dipendenti <strong>da</strong>l ceppo. Alfine di c<strong>la</strong>ssificare i ceppi sul<strong>la</strong> base di un profilo enzimatico simile, è statacondotta una cluster analysis gerarchica. Diversi ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarume Lb. curvatus e tutti i ceppi di Leuc. mesenteroides hanno mostrato uninteressante profilo di attività <strong>enzimatiche</strong>, suggerendo il loro impiegocome colture starter nel settore del<strong>la</strong> panificazione.3.1. IntroduzioneI <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> svolgono un ruolo importante nel<strong>la</strong> produzione di diversialimenti fermentati. Grazie al<strong>la</strong> loro attività metabolica, in realtà, essisono responsabili <strong>dei</strong> cambiamenti chimici e sensoriali che si verificanodurante <strong>la</strong> fermentazione <strong>dei</strong> prodotti <strong>la</strong>ttiero-caseari, carnei e vegetali.L’a<strong>da</strong>ttamento a specifici ecosistemi alimentari, tuttavia, può influire sulmetabolismo microbico e spiegare <strong>la</strong> prevalenza e il contributo di alcunespecie durante i processi di fermentazione.Gli <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> sono complessi sistemi biologici in cui si svolgono diverseattività microbiche. Il sistema proteolitico <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong>, caratterizzato<strong>da</strong>l<strong>la</strong> presenza di proteinasi, pepti<strong>da</strong>si e sistemi di trasporto intracellu<strong>la</strong>re, è55


in grado di idrolizzare le proteine in piccoli peptidi e amino<strong>acidi</strong>, che sonoimportanti <strong>per</strong> <strong>la</strong> crescita microbica e come precursori <strong>per</strong> lo sviluppo dicomposti aromatici. Gli enzimi proteolitici <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> degra<strong>da</strong>no leproteine del glutine influenzando <strong>la</strong> reologia degli impasto e, di conseguenza,<strong>la</strong> tessitura del pane (Di Cagno et al., 2004). Inoltre, i peptidi ri<strong>la</strong>sciati<strong>da</strong>ll’idrolisi delle pro<strong>la</strong>mmine che colpiscono <strong>la</strong> mucosa dell’intestinoumano nei soggetti affetti <strong>da</strong> morbo celiaco (Di Cagno et al., 2002) possonoessere degra<strong>da</strong>ti durante <strong>la</strong> proteolisi. L’attività delle X-prolil dipeptidi<strong>la</strong>minopepti<strong>da</strong>si, in partico<strong>la</strong>re, sembrano avere un grande potenziale nel<strong>la</strong>riduzione del contenuto di peptidi di gliadina ricchi di prolina che causano<strong>la</strong> risposta immunitaria nel morbo celiaco (Gallo et al., 2005).Le proprietà sensoriali del pane possono essere migliorate attraverso l’idrolisi<strong>dei</strong> polisaccaridi. Le β-glucosi<strong>da</strong>si sono uno <strong>dei</strong> principali gruppi di glicosilidro<strong>la</strong>si in grado di catalizzare l’idrolisi del legame β-1,4- presente in varidisaccaridi, oligosaccaridi e derivati β-D-glucosidici (Yan et al., 1998 ).L’idrolisi <strong>dei</strong> glucosidi ha un ruolo importante in diversi processi biologicie applicazioni biotecnologiche. Le β-glucosi<strong>da</strong>si, infatti, sono responsabilidell’idrolisi del cellobiosio nel<strong>la</strong> fase terminale del<strong>la</strong> degra<strong>da</strong>zione del<strong>la</strong>cellulosa, un importante fonte di fibre nei prodotti alimentari a base di cereali(Bhatia et al., 2002).La fermentazione degli <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong>, inoltre, aumenta il valore nutrizionaledel pane. Nei cereali una gran parte del fosforo è presente come acido fitico(mio-inositolo esafosfato, IP6), collocato negli strati esterni del chicco.L’acido fitico è considerato un composto anti-nutrizionale poichè è unagente che<strong>la</strong>nte di proteine, amino<strong>acidi</strong> e minerali bivalenti come Ca 2+ ,Fe 2+ , Mg 2+ e Zn 2+ , che quindi non possono essere assorbiti <strong>da</strong>ll’uomo (DeAngelis et al., 2003 ). Pertanto, <strong>la</strong> degra<strong>da</strong>zione dell’acido fitico durante <strong>la</strong>fermentazione degli <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> è auspicabile. Gli enzimi che degra<strong>da</strong>nol’acido fitico durante <strong>la</strong> fermentazione provengono <strong>da</strong>i <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> e <strong>da</strong>ilieviti (Lopez et al., 2000; Reale et al ., 2004). I bassi valori di pH causati <strong>da</strong>l<strong>la</strong>produzione di acido <strong>la</strong>ttico durante <strong>la</strong> fermentazione, inoltre, promuovonol’attivazione delle fitasi endogene del<strong>la</strong> farina, che contribuiscono ad unamaggiore degra<strong>da</strong>zione dell’acido fitico (Leenhardt et al., 2005; Lopez etal., 2001).Durante l’uso come colture starter, i <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> sono sottoposti adiversi stress che influenzano le loro attività metaboliche e ne riducono le56


prestazioni. In partico<strong>la</strong>re, <strong>la</strong> produzione di acido <strong>la</strong>ttico e acetico durante<strong>la</strong> fermentazione promuove una forte diminuzione di pH che può incideresull’equilibrio microbico. La risposta <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> allo stress acido si verificain modo diverso. Tra i meccanismi di risposta, l’attività ureasica sembrasvolgere un ruolo importante nel<strong>la</strong> protezione di alcuni microrganismi aibassi valori di pH attraverso <strong>la</strong> conversione di urea in ammoniaca e anidridecarbonica (van de Guchte et al., 2002).Le attività proteolitica, pepti<strong>da</strong>sica, β-glucosi<strong>da</strong>sica, fitasica e ureasicasono state valutate <strong>per</strong> <strong>la</strong> maggior parte <strong>dei</strong> gruppi di <strong>batteri</strong>, ma pochistudi sulle attività <strong>enzimatiche</strong> <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong>sono presenti in letteratura. Nel presente <strong>la</strong>voro è stato investigato il profiloenzimatico <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>per</strong> comprendere il loro ruolo nel processo difermentazione, nonché <strong>per</strong> delineare proprietà rilevanti nel<strong>la</strong> produzione dipane.3.2. Materiali e metodi3.2.1. Ceppi e condizioni di colturaI <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> utilizzati in questo studio sono stati <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong>utilizzati <strong>per</strong> produrre il pane Cornetto di Matera (Ricciardi et al., 2002).I ceppi sono stati mantenuti come colture liofilizzate nel<strong>la</strong> collezione <strong>dei</strong>microrganismi del Dipartimento di Biologia, Difesa e Biotecnologie Agro-Forestali, Università degli Studi del<strong>la</strong> Basilicata, Potenza, Italia. Gli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong>sono stati propagati in MRS liquido (Oxoid) <strong>per</strong> 16 ore a 30°C prima dieffettuare i vari saggi enzimatici.3.2.2. Attività proteoliticaLe sospensioni cellu<strong>la</strong>ri stan<strong>da</strong>rdizzate (DO 650= 2) e cresciute overnightin MRS liquido, sono state utilizzate <strong>per</strong> inocu<strong>la</strong>re (10% v/v) <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong>modello preparati mesco<strong>la</strong>ndo acqua e farina di grano tenero (tipo “00”,Divel<strong>la</strong> SpA, Bari, Italia) con una spato<strong>la</strong> sterile <strong>per</strong> 3 minuti al fine di ottenereun impasto con rendimento (DY) pari a 400. Dopo 24 ore di incubazione a30°C, i pre-<strong>impasti</strong> sono stati aggiunti (10% v/v) al<strong>la</strong> secon<strong>da</strong> serie <strong>impasti</strong><strong>acidi</strong> e incubati <strong>per</strong> 24 ore a 30°C. Due fermentazioni, ottenute mediantel’aggiunta di antibiotici all’impasto, sono state effettuate asetticamente apH 6,0 e 3,5, rispettivamente. La concentrazione totale di amino<strong>acidi</strong> liberinegli estratti solubili in soluzione salina (solvente: 0,5 mol/L di NaCl e 15057


mmol/L di fosfato di sodio, pH 6,8) è stata determinata utilizzando il metododel TNBS (Adler-Nissen, 1979). Una curva di taratura è stata preparatautilizzando <strong>la</strong> glicina (Gly, Sigma), come stan<strong>da</strong>rd (range 0,0 - 0,5 mmol/Ldi Gly) e risultati sono stati espressi come mg di Gly/kg di impasto.3.2.3. Attività pepti<strong>da</strong>sicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono state raccoltemediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), <strong>la</strong>vate due volte con tamponepotassio fosfato sterile 50 mmol/L, pH 7, e ri-sospese nello stesso tampone<strong>per</strong> ottenere una sospensione cellu<strong>la</strong>re stan<strong>da</strong>rdizzata (DO 650= 1) <strong>da</strong>utilizzare <strong>per</strong> il dosaggio degli enzimi. Le attività delle aminopepti<strong>da</strong>sigenerali (PepNC), prolina iminopepti<strong>da</strong>si (Pepi), glutamil aminopepti<strong>da</strong>si(Pepa) e X-prolil dipeptidil aminopepti<strong>da</strong>si (PepX) sono state misurate,in accordo con Macedo et al. (2000), utilizzando come substrati sinteticiLys-p-nitroanilide (-p-NA), Pro-p-NA, Glu-p-NA e Gly-Pro-p-NA o Arg-Pro-p-NA, rispettivamente. Per il dosaggio sono stati mesco<strong>la</strong>ti 30 μL disubstrato ad una concentrazione finale di 20 mmol/L in metanolo, 195 μLdi tampone potassio fosfato (50 mmol/L, pH 7,0), 95 μL di sodio azide0,05% (w/v) e 75 μL di sospensione cellu<strong>la</strong>re. Dopo l’incubazione a 30°C<strong>per</strong> 4 ore, <strong>la</strong> reazione è stata interrotta con 900 μL di acido acetico al 10%(v/v); il ri<strong>la</strong>scio di p-nitroanilina (p-NA) nei surnatanti (12000 x g, 5 min)è stata misurata spettrofotometricamente a 410 nm. I <strong>da</strong>ti ottenuti sonostati confrontati con una curva di taratura costruita utilizzando soluzionidi p-NA (range 0,1 - 20,0 mmol/L p-NA). Una unità di attività enzimatica(μkatal) è stata definita come <strong>la</strong> quantità di enzima necessario <strong>per</strong> liberare1 μmol di p-NA <strong>per</strong> secondo.3.2.4. Screening <strong>per</strong> l’attività ureasicaL’attività ureasica è stata determinata valutando qualitativamente ilri<strong>la</strong>scio di ammoniaca utilizzando un metodo basato sul viraggio del rossofenolo (Mora et al., 2004). I ceppi sono stati coltivati in MRS liquidocontenente 5 g/L di urea (concentrazione finale) e 0,05 g/L di nichel solfato(concentrazione finale). Le cellule, raccolte mediante centrifugazione(12000 x g, 5 min), sono state <strong>la</strong>vate due volte con una soluzionesalina sterile (0,85% w/v di NaCl) e ri-sospese in 100 μL di soluzionefisiologica sterile. Per il dosaggio enzimatico sono stati mesco<strong>la</strong>ti 10058


μL di sospensione cellu<strong>la</strong>re e 400 μL di una soluzione contenente 1volume di reagente A (2 g di urea disciolta in 2 ml di etanolo e 4 mL diacqua <strong>dei</strong>onizzata sterile) e 19 volumi di reagente B (1 g/L di KH 2PO 4,1 g/L di K 2HPO 4, 5 g/L di NaCl e 20 μg/ml di rosso fenolo). La misce<strong>la</strong>di reazione è stata incubata a 37°C <strong>per</strong> 2 ore e lo sviluppo di un colorerosso-vio<strong>la</strong>ceo indicava <strong>la</strong> presenza di attività ureasica.3.2.5. Attività fitasica e fosfatasicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido sono stateraccolte mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), <strong>la</strong>vate due voltecon soluzione salina sterile e ri-sospese in acqua <strong>dei</strong>onizzata sterile <strong>per</strong>ottenere le sospensioni cellu<strong>la</strong>ri stan<strong>da</strong>rdizzate (DO 650= 1) <strong>da</strong> utilizzare<strong>per</strong> gli es<strong>per</strong>imenti. L’attività fitasica è stata misurata utilizzando fitato disodio (Sigma) come substrato. Il dosaggio è stato effettuato mesco<strong>la</strong>ndo600 μL di substrato (Na-fitato 3 mmol/L in Na-acetato 0,2 mol/L, pH4,0) e 150 μL di sospensione cellu<strong>la</strong>re. Dopo 2 ore di incubazione a45°C, <strong>la</strong> reazione è stata stoppata con 750 μL di acido tricloroaceticoal 5% (w/v) (De Angelis et al., 2003). Il fosforo inorganico liberato èstato determinato misurato l’assorbanza a 700 nm. Una unità di attivitàfitasica (μkatal) è stata definita come <strong>la</strong> quantità di enzima necessario<strong>per</strong> liberare 1 μmol di fosforo inorganico al secondo.L’attività del<strong>la</strong> fosfatasi aci<strong>da</strong> è stata determinata utilizzando ilp-nitrofenil fosfato (p-NPP) come substrato. La misce<strong>la</strong> di reazioneconteneva 200 μL 1,5 mmol/L p-NPP (concentrazione finale) in 0,2mol/L di Na-acetato, pH 5,2, e 400 μL di sospensione cellu<strong>la</strong>re. Dopo2 ore di incubazione a 45°C, <strong>la</strong> reazione è stata stoppata con l’aggiuntadi 600 μL di NaOH 0,1 mol/L e il p-nitrofenolo (p-NP) ri<strong>la</strong>sciato è statodeterminato misurando l’assorbanza a 405 nm sui campioni centrifugati(12000 x g, 5 min). Una unità di attività del<strong>la</strong> fosfatasi (μkatal) è statadefinita come <strong>la</strong> quantità di enzima necessario <strong>per</strong> liberare 1 μmol dip-NP al secondo.3.2.6. Attività β-glucosi<strong>da</strong>sicaLe cellule cresciute in fase stazionaria in MRS liquido (1,5 mL) sono stateraccolte mediante centrifugazione (12000 xg, 5 min), <strong>la</strong>vate due volte inTris-HCl 50 mmol/L, pH 8, e ri-sospese in 150 μL dello stesso tampone59


contenente 2 mg di lisozima/ml (Sigma). Delle biglie di vetro (0,15 a 0,212mm di diametro, Sigma) sono state aggiunte e le sospensioni cellu<strong>la</strong>ri, dopoessere state agitate su vortex ad alta velocità <strong>per</strong> 3 min, sono state incubatea 37°C <strong>per</strong> 1 ora e sottoposte <strong>da</strong> tre cicli di sonicazione (10 min <strong>per</strong> ognitrattamento, potenza 10%; Sonorex Su<strong>per</strong> 10P, Bandelin, Berlino). Dopol’incubazione, le biglie di vetro e i frammenti cellu<strong>la</strong>ri sono stati rimossimediante centrifugazione (12000 x g, 5 min) e i surnatanti sono stati utilizzati<strong>per</strong> il dosaggio dell’enzima. La concentrazione di proteine in lisati cellu<strong>la</strong>riè stato determinato utilizzando il metodo Bradford (Bradford, 1976).L’attività β-glucosi<strong>da</strong>sica è stata misurata utilizzando il p-nitrofenil-β-Dglucopiranoside(p-NPG) come substrato, in accordo con Gallo (2004).Nel<strong>la</strong> misce<strong>la</strong> di reazione sono stati mesco<strong>la</strong>ti 900 μL di p-NPG 2,5 mmol/L(concentrazione finale) in tampone potassio fosfato 0,5 mol/L pH 7,5 e 100μL di estratto cellu<strong>la</strong>re. Dopo 1 ora di incubazione a 40°C, <strong>la</strong> reazione èstata bloccata riscal<strong>da</strong>ndo <strong>la</strong> misce<strong>la</strong> a 95°C <strong>per</strong> 5 min. L’assorbanza è statamisurata a 410 nm. I <strong>da</strong>ti ottenuti sono stati confrontati con una curva ditaratura costruita utilizzando p-NP. Una unità di attività β-glucosi<strong>da</strong>sica(μkatal) è stata definita come <strong>la</strong> quantità di enzimia necessario <strong>per</strong> liberare1 μmol di p-NP al secondo sotto. L’attività β-glucosi<strong>da</strong>sica specifica è statadefinita come unità enzimatica/mg di proteina.3.2.7. Analisi statisticaTutte le analisi statistiche e i grafici sono state effettuati utilizzando Systat10.0 <strong>per</strong> Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).3.3. Risultati e discussioneQuarantuno ceppi di <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> <strong>per</strong> <strong>la</strong> produzionedel Cornetto di Matera, un pane tipico del<strong>la</strong> Basilicata, sono stati analizzatiin questo studio. L’attività proteolitica in <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> modello inocu<strong>la</strong>ti concolture di <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> è stata espressa come concentrazione di amino<strong>acidi</strong>liberi dopo 24 ore di incubazione. Due fermentazioni, ottenute aggiungendoantibiotici all’impasto, sono state condotte a pH 6,0 e 3,5, rispettivamente,<strong>per</strong> valutare <strong>la</strong> proteolisi in assenza di metabolismo microbico. In generale,gli <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> e l’impasto di controllo <strong>acidi</strong>ficato a pH 3,5 hanno mostratoun aumento del<strong>la</strong> concentrazione di amino<strong>acidi</strong> liberi rispetto a quel<strong>la</strong>dell’impasto di controllo a pH neutro (Figura 1).60


su<strong>per</strong>iore a quel<strong>la</strong> dell’impasto di controllo <strong>acidi</strong>ficato (49,6 - 48,5 - 47,6 -47,0 Gly mg/kg di impasto dopo 24 ore di fermentazione, rispettivamente),anche se il pH finale era su<strong>per</strong>iore (4,39 - 4,32 - 4,01 - 4,21, rispettivamente)a quel<strong>la</strong> del controllo <strong>acidi</strong>ficato. Le concentrazioni più basse di amino<strong>acidi</strong>sono state osservate negli gli <strong>impasti</strong> inocu<strong>la</strong>ti con diversi ceppi di Lb.p<strong>la</strong>ntarum e uno con Lb. curvatus (parte inferiore del grafico).Nessun ceppo ha mostrato attività ureasica. Lo sviluppo del colore rossovio<strong>la</strong>ceoè stato rilevato solo in due ceppi di Leuc. mesenteroides dopo2 giorni di incubazione, dimostrando che l’attività enzimatica era moltobassa nelle specie di <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> testate.I risultati re<strong>la</strong>tivi alle altre attività <strong>enzimatiche</strong> sono mostrati in Figura2. L’attività delle pepti<strong>da</strong>si sono state misurate sulle sospensioni cellu<strong>la</strong>riin quanto il processo di fermentazione <strong>per</strong> <strong>la</strong> produzione di pane italianosi verifica in poche ore (5-10 ore) ed in questo <strong>per</strong>iodo i ceppi sono attivisulle proteine del glutine senza lisi cellu<strong>la</strong>re. In generale, le attività delleglutamil aminopepti<strong>da</strong>si (Pepa) e delle iminopepti<strong>da</strong>si (Pepi) erano moltobasse o assenti in tutti i ceppi. Ad eccezione di W. cibaria, le specie nonpresentano differenze significative rispetto all’attività delle aminopepti<strong>da</strong>sigenerali (PepNC). Il più alto livello di enzima PepNC è stato trovato nelceppo Lb. pentosus DBPZ0984 e in tutti i ceppi di Lb. curvatus. I ceppi diLb. p<strong>la</strong>ntarum e Lb. parap<strong>la</strong>ntarum hanno mostrato un’attività di PepNCinferiore a quel<strong>la</strong> <strong>dei</strong> ceppi di Leuc. mesenteroides. Una notevole variabilitàintraspecifica nell’attività di PepX, su substrato Gly-Pro-p-NA (PepXgly),è stata osservata tra i ceppi di Lb. curvatus, del gruppo Lb. p<strong>la</strong>ntarum,mentre gli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> di Leuc. mesenteroides e W. cibaria hanno mostratolivelli di attività enzimatica simili. Il valore più elevato è stato misurato<strong>per</strong> il ceppo Lb. pentosus DBPZ0984. L’attività di PepX, su substrato sulArg-Pro-p-NA (PepXarg), era inferiore a quel<strong>la</strong> corrispondente di PepXglyin tutte le specie, ad eccezione <strong>dei</strong> ceppi Lb. p<strong>la</strong>ntarum DBPZ1021, Lb.parap<strong>la</strong>ntarum DBPZ1027 e Lb. curvatus DBPZ1009 e DBPZ1020.Le attività fitasica e fosfatasica sono state determinate sulle sospensionicellu<strong>la</strong>ri <strong>per</strong>ché questi enzimi sono sia intracellu<strong>la</strong>ri che associati al<strong>la</strong>parete cellu<strong>la</strong>re. E’ stato dimostrato che <strong>la</strong> maggior parte <strong>dei</strong> ceppi erain grado di degra<strong>da</strong>re il fitato, anche se i livelli di attività enzimaticaerano ceppo-specifici. Sono state riscontrate differenze all’interno del<strong>la</strong>specie Lb. curvatus e del gruppo Lb. p<strong>la</strong>ntarum <strong>per</strong> quanto riguar<strong>da</strong>62


Figura 2. Grafico del<strong>la</strong> distribuzione delle attività <strong>enzimatiche</strong> (attività proteolitica,glutamil aminopepti<strong>da</strong>sica, prolina iminopepti<strong>da</strong>sica, X-prolil dipeptidil aminopepti<strong>da</strong>sicasu Gly-pro-pNA e Arg-pro-pNA, β-glucosi<strong>da</strong>sica, fitasica, fosfatasica) <strong>dei</strong> ceppi di <strong>batteri</strong><strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong>gli <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> <strong>per</strong> <strong>la</strong> produzione del Cornetto di Matera. Lb. curvatus(Lbcu); Lb. parap<strong>la</strong>ntarum, Lb. pentosus, Lb. p<strong>la</strong>ntarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides(Leme); W. cibaria (Wecb).l’attività fitasica e all’interno del<strong>la</strong> specie Leuc. mesenteroides e delgruppo Lb. p<strong>la</strong>ntarum rispetto all’attività del<strong>la</strong> fosfatasi. I livelli piùalti di degra<strong>da</strong>zione del fitato (0,488 μkatal/ml) sono stati misurati neiceppi di Leuc. mesenteroides e in alcuni ceppi appartenenti al gruppoLb. p<strong>la</strong>ntarum. Gli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> di Lb. curvatus e W. cibaria hanno mostratovalori di attività enzimatica <strong>da</strong> 0,042 a 0,263 μkatal/ml, mentre un elevatonumero di Lb. p<strong>la</strong>ntarum presentavano bassi valori di attività fitasica. Le63


diverse specie, al contrario, hanno mostrato livelli di attività fosfatasicasimili. La massima produzione di enzima è stata misurata nei ceppi Lb.p<strong>la</strong>ntarum DBPZ1019 e DBPZ1003, Lb. parap<strong>la</strong>ntarum DBPZ1027 e neidue ceppi di W. cibaria, mentre i più bassi valori di idrolisi di p-NPP sonostati osservati <strong>per</strong> alcuni ceppi di Leuc. mesenteroides e <strong>per</strong> alcuni ceppidi del gruppo Lb. p<strong>la</strong>ntarum. L’attività β-glucosi<strong>da</strong>sica è stata misuratasugli estratti cellu<strong>la</strong>ri <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong>. Le maggiori differenze nel<strong>la</strong>produzione di quest’enzima sono state trovate nei ceppi del gruppo Lb.p<strong>la</strong>ntarum e del<strong>la</strong> specie Leuc. mesenteroides. Gli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> di Lb. curvatushanno mostrato una moderata produzione di β-glucosi<strong>da</strong>si, mentre quellidi W. cibaria, insieme con alcuni ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, avevano <strong>la</strong> piùbassa attività enzimatica.Al fine di c<strong>la</strong>ssificare i ceppi sul<strong>la</strong> base di un profilo enzimatico simile è statacondotta una cluster analysis gerarchica (UPGMA) sulle attività <strong>enzimatiche</strong>.La c<strong>la</strong>ssificazione ha generato sette gruppi principali a una distanza di 0,3(Figura 3). Solo due ceppi (posizione 1 bis e 2 bis) non erano raggruppati innessun cluster, poiché avevano un profilo enzimatico diverso <strong>da</strong> quello deglialtri ceppi. Le repliche dello stesso ceppo (Lb. p<strong>la</strong>ntarum DBPZ1023) eranoraggruppate ad una distanza massima di 0,022, dimostrando che l’analisi eraripetibile.I più alti livelli di attività <strong>enzimatiche</strong> sono stati individuati tra i ceppiappartenenti ai cluster C1 e C4. I tre ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, raggruppatinel cluster C1, erano caratterizzati <strong>da</strong> un elevato livello di PepA e PepI, ma<strong>da</strong> bassi livelli di PepNC e PepXarg. Il cluster C2 raggruppava un ceppodi Lb. p<strong>la</strong>ntarum e uno di Leuc. mesenteroides caratterizzati <strong>da</strong> una forteattività proteolitica e <strong>da</strong> elevati livelli di PepI e fitasi. Il cluster maggiore C3comprendeva <strong>la</strong> maggior parte degli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> di Leuc. mesenteroides e diversiceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum con un’elevata attività di PepI, β-glucosi<strong>da</strong>sica efitasica. Il cluster C4 comprendeva quattro ceppi di Lb. curvatus con un profilosimile a quello <strong>dei</strong> ceppi del cluster C3, ad eccezione del<strong>la</strong> maggiore attivitàdi PepNC. I cluster C5, C6 e C7, nel<strong>la</strong> parte inferiore del dendrogramma,includevano i ceppi con le più basse attività <strong>enzimatiche</strong>. Il cluster C6raggruppava tre ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum con un elevata attività proteolitica,insieme ad una buona attività β-glucosi<strong>da</strong>sica e fosfatasica. I cluster C5 e C7,al contrario, includevano ceppi con una bassa attività proteolitica, ma elevativalori di β-glucosi<strong>da</strong>si e fosfatasi, rispettivamente.64


caseari ed è importante <strong>per</strong> <strong>la</strong> crescita <strong>dei</strong> microrganismi e <strong>la</strong> maturazione<strong>per</strong> i formaggi (Magboul and McSweeney, 2000; Tsakalidou et al.,1998; Bockelmann et al., 1991). Gallo et al. (2005) hanno dimostrato<strong>la</strong> presenza di PepX in dodici <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> di Lb. sanfranciscensis, giungendoal<strong>la</strong> conclusione che questo enzima è ampiamente diffuso all’interno diquesta specie. Recenti studi (Di Cagno et al., 2004) hanno dimostrato che<strong>la</strong> degra<strong>da</strong>zione <strong>dei</strong> peptidi di gliadina ricchi di prolina può influenzare<strong>la</strong> tolleranza dell’uomo alle proteine del glutine. Le proline, infatti,impongono restrizioni sul<strong>la</strong> organizzazione strutturale delle proteine tali<strong>da</strong> limitare l’idrolisi <strong>da</strong> parte degli enzimi digestivi (Gallo et al., 2005) equesto suggerisce un potenziale uso <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>per</strong> <strong>la</strong> degra<strong>da</strong>zione<strong>dei</strong> peptidi tossici che inducono <strong>la</strong> risposta immunitaria delle cellule Tintestinali nei pazienti affetti <strong>da</strong> morbo celiaco.L’aggiunta di <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> nel<strong>la</strong> produzione di pane può influenzare <strong>la</strong>salute umana in vari modi. Durante <strong>la</strong> fermentazione <strong>la</strong> degra<strong>da</strong>zionedell’acido fitico migliora <strong>la</strong> bio-disponibilità di minerali e può avere effettibenefici sul<strong>la</strong> salute, come <strong>la</strong> riduzione del rischio di ma<strong>la</strong>ttie cardiache,renali e alcuni tipi di tumori (Konietzny, 2004 ). Le fitasi sono enzimidistribuiti in vari <strong>batteri</strong>, ma che non sembrano essere comuni tra i <strong>batteri</strong><strong><strong>la</strong>ttici</strong> (Pa<strong>la</strong>cios et al., 2005; Konietzny, 2004). Tuttavia, poiché i <strong>batteri</strong><strong><strong>la</strong>ttici</strong> sono utilizzati negli alimenti fermentati anche di origine vegetaleessi potrebbero essere una fonte di fitasi. Infatti, le specie utilizzatenel<strong>la</strong> produzione prodotti <strong>la</strong>ttiero-caseari, come Lb. acidophilus, Lb.casei, Lb. delbrueckii, Lactococcus <strong>la</strong>ctis e Streptococcus spp. sonopoveri produttore di fitasi, mentre i ceppi provenienti <strong>da</strong> alimenti diorigine vegetale sono ottimi produttori di questi enzimi (De Angeliset al., 2003). Il nostro studio ha dimostrato che alcuni ceppi sono ingrado di degra<strong>da</strong>re l’acido fitico, in partico<strong>la</strong>re quelli appartenenti allespecie Leuconostoc mesenteroides, Lb. p<strong>la</strong>ntarum e Lb. parap<strong>la</strong>ntarum.Pa<strong>la</strong>cios et al. (2005) hanno studiato l’attività fitasica e fosfatasica inalcuni <strong>la</strong>ttobacilli <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> <strong>acidi</strong> dimostrando <strong>la</strong> presenzadegli enzimi in questi ceppi. Leenhardt et al. (2005) hanno dimostratoche <strong>la</strong> fermentazione effettuata con ceppi di Lb. brevis è più efficienterispetto a quel<strong>la</strong> effettuata con lievito nel<strong>la</strong> riduzione dell’acido fitico. Inaggiunta, uno studio di Reale et al. (2004) ha evidenziato che durante <strong>la</strong>fermentazione di <strong>impasti</strong> inocu<strong>la</strong>ti con ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, Lb. brevis67


e Lb. curvatus l’acido fitico era degra<strong>da</strong>to in misura maggiore rispettoal<strong>la</strong> fermentazione di <strong>impasti</strong> inocu<strong>la</strong>ti con Saccharomyces cerevisiae.Una maggiore concentrazione di magnesio solubile in <strong>impasti</strong> inocu<strong>la</strong>ticon ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntrum o Leuc. mesenteroides subsp. mesenteroides estato osservato <strong>da</strong> Lopez et al. (2001). La capacità di idrolizzare il fitato èstato oggetto di in<strong>da</strong>gine anche in uno studio di De Angelis et al. (2003);Lb. sanfranciscensis CB1, in partico<strong>la</strong>re, ha mostrato il più alto livello diattività enzimatica, ma una buona degra<strong>da</strong>zione dell’acido fitico è stataosservata anche <strong>per</strong> i ceppi Lb. fructivorans DA106, W. confusa 14A, Lc.<strong>la</strong>ctis subsp. <strong>la</strong>ctis 11M e Lb. alimentarius 5D.I nostri risultati hanno dimostrato che i più alti livelli di attivitàβ-glucosi<strong>da</strong>sica sono stati osservati nel ceppo di Lb. pentosus e in alcuniceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, Lb. parap<strong>la</strong>ntarum e Leuc. mesenteroides.Le β-glucosi<strong>da</strong>si sono state studiate in diversi gruppi di <strong>batteri</strong>,compresi i <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong>. La presenza di glicosi<strong>da</strong>si è stata osservata inCarnobacterium piscico<strong>la</strong>, una specie generalmente iso<strong>la</strong>ta <strong>da</strong> carne opesce (Coombs e Branchley, 2001). Inoltre, Spano et al. (2005) hannocaratterizzato un gene che codifica <strong>per</strong> una β-glucosi<strong>da</strong>si <strong>da</strong> un ceppocommerciale di Lb. p<strong>la</strong>ntarum e <strong>da</strong> un ceppo di Oenococcus oeni, <strong>per</strong>dimostrare <strong>la</strong> capacità <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong>l vino a idrolizzareglicoconiugati durante <strong>la</strong> fermentazione malo<strong>la</strong>ttica. Diversi autori hannosco<strong>per</strong>to che alcuni ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, Lb. brevis, Lb. salivarius,Lb. fermentum e Leuc. mesenteroides sono stati in grado di idrolizzareβ-glucosidi, come amig<strong>da</strong>lina e linamarina, durante <strong>la</strong> fermentazione dimanioca (Obilie et al., 2004; Lei et al., 1999). L’idrolisi di isof<strong>la</strong>voni <strong>da</strong>parte di alcuni <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> durante <strong>la</strong> fermentazione del <strong>la</strong>tte di soiaè stata anche riportata in letteratura (Choi et al., 2002). Tuttavia, sonorari gli studi sul<strong>la</strong> attività enzimatica <strong>dei</strong> <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong>.Solo Gallo (2004) ha purificato e caratterizzato uno β-glucosi<strong>da</strong>siintracellu<strong>la</strong>re <strong>da</strong> Lb. sanfranciscensis CB1.L’attività ureasica è stata ampiamente studiata in <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong>bevande fermentate, vino, prodotti <strong>la</strong>ttiero-caseari (Mora et al., 2004;Pernoud et al., 2004; Ko<strong>da</strong>ma e Yotsuzuka, 1996), tratto gastrointestinale(Sebbane et al., 2002, Toledo et al. , 2002) e cavità orale (Sisson etal., 1999; C<strong>la</strong>ncy e Burne, 1997), ma nessuno <strong>la</strong>voro sul<strong>la</strong> presenzadell’enzima nei <strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>iso<strong>la</strong>ti</strong> <strong>da</strong> <strong>impasti</strong> LAB è stato riportato68


in letteratura. In questo <strong>la</strong>voro, nessuno <strong>dei</strong> ceppi ha mostrato attivitàureasica. Tuttavia, è stato utilizzato un metodo rapido qualitativo el’implicazione dell’enzima nel<strong>la</strong> resistenza allo stress acido deve essereconfermata.In questo <strong>la</strong>voro sono state esaminate alcune proprietà <strong>enzimatiche</strong> <strong>dei</strong><strong>batteri</strong> <strong><strong>la</strong>ttici</strong> <strong>per</strong> selezionare ceppi <strong>da</strong> utilizzare come colture starter nel<strong>la</strong>produzione di pane. In generale, i ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum, Lb. curvatus eLeuc. mesenteroides hanno mostrato una interessante profilo enzimatico,che potrebbe rappresentare un criterio importante <strong>per</strong> <strong>la</strong> preparazione diuna coltura starter mista. Alcuni ceppi di Lb. p<strong>la</strong>ntarum e Lb. curvatuspotrebbero essere selezionati <strong>per</strong> <strong>la</strong> loro attività proteolitica e pepti<strong>da</strong>sica,al fine di ottimizzare il sapore e <strong>la</strong> consistenza del pane; gli elevatilivelli di attività β-glucosi<strong>da</strong>sica e fitasica riscontrati in ceppi di Leuc.mesenteroides, invece, potrebbero costituire un utile caratteristica <strong>per</strong>migliorare il valore nutrizionale del prodotto.BIBLIOGRAFIAAdler-Nissen, J., 1979. Determination of degree of hydrolysis of food proteins hydrolysatesby trinitrobenzensulfonic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27, 1256-1262.Bhatia, Y., Mishra, S., Binaria, V.S., 2002. Microbial β-glucosi<strong>da</strong>ses: cloning, pro<strong>per</strong>tiesand applications. Critical Reviews in Biotechnology, 22, 375-407.Bockelmann, W., Fobker, M., Teuber, M., 1991. Purification and characterization of anX-prolyl dipeptidyl aminopepti<strong>da</strong>se from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus andLactobacillus acidophilus. International of Dairy Journal, 1, 51-66.Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry,72, 248-254.Choi, Y., Kim, K., Rhee, J., 2002. Hydrolysis of isof<strong>la</strong>vone glucosides by <strong>la</strong>ctic acidbacteria. Biotechnology Letters, 24, 2113-2116.C<strong>la</strong>ncy, A., Burne, R.A., 1997. Construction and characterization of a recombinant ureolyticStreptococcus mutans and its use to demonstrate the re<strong>la</strong>tionship of urease activity to pHmodu<strong>la</strong>ting capacity. FEMS Microbiology Letters, 151, 205-211.Coombs, J., Brenchley, J.E., 2001. Characterization of two new glycosyl hydro<strong>la</strong>ses from<strong>la</strong>ctic acid bacterium Carnobacterium piscico<strong>la</strong> strain BA. Applied and EnvironmentalMicrobiology, 67, 5094-5099.De Angelis, M., Gallo, G., Corbo, M.R., McSweeney P.L.H., Faccia, M., Giovine, M.,Gobbetti, M., 2003. Phytase activity in sourdough <strong>la</strong>ctic acid bacteria: purification and69


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