Capitolo 6 - Omero

Forma B

• Il DNA si caratterizza per una struttura stabile e pocoreattiva, di facile manipolazione; può essereconservato a + 4°C od anche a temperatura ambiente.• Gli RNA al contrario sono strutture estremamentelabili, facilmente degradati dalle RNAsi, enzimicellulari ubiquitari, con attività ampia e notevoleresistenza alla denaturazione. L’estrazione degli RNAimpone condizioni di sterilità e di particolareaccuratezza, l’uso di vetreria e reagenti sterili ededicati esclusivamente all’estrazione degli RNA. GliRNA vanno conservati a -70°C in condizionidenaturanti (0,5% SDS, formaldeide).

• 1) Gli AN vanno liberati dal legame con le proteine, edai lipidi.• 2) Estrazione degli AN dal miscuglio di composti chene risulta.• 3) Separazione degli AN da eventuali contaminanti.• 4) Conservazione degli AN in condizioni chimicofisicheidonee e compatibili con le analisi e le eventualiutilizzazioni successive.Metodo comunemente utilizzato: estrazione fenolica.

L’ AN da estrarre, dopo omogenizzazione del tessuto olisi delle cellule, viene trattato con adeguateproporzioni di fenolo (in H2O o tampone), e dopoagitazione viene centrifugato. Si separano 3 fasi:• Fase inferiore organica, di maggiore densità,contenente lipidi e parte delle proteine;• Interfacie opaca in cui si raccolgono la maggior partedelle proteine;• Fase superiore acquosa che contiene gli AN.

Le miscele di estrazione degli AN sono costituite da: fenolo,cloroformio, alcol isoamilico ed appropriati tamponi.• Il fenolo deve essere di un alto grado di purezza(commercialmente disponibile come grado di purezza xbiologia molecolare). Il fenolo agisce come potentedenaturante delle proteine e solvente dei lipidi.• Il cloroformio è aggiunto per aumentare l’azionedenaturante del fenolo sulle proteine, migliorare lasolubilizzazione dei lipidi e migliorare il recupero deglimRNA che in presenza di solo fenolo tenderebbero aperdersi nella fase organica. Il cloroformio, inoltre,accentua la differenza di densità tra la fase organica e lafase acquosa, facilitandone la separazione.• L’alcol isoamilico è aggiunto per evitare la formazione dischiuma.

• Estrazione del DNA: fenolo/cloroformio/alcol isoamilico 25 : 24 : 1 (V/V).• Estrazioni degli RNA: fenolo/cloroformio/alcol isoamilico 50 : 49 : 1 , ma anche fino a 500 : 49 : 1.• Quando il pH di queste miscele organiche è debolmentealcalino (7,4 – 7,8), DNA ed RNA si raccolgono nella faseacquosa. Ad un pH compreso tra 4,0 e 5,2 il DNA vieneritenuto nella fase organica, le proteine si raccolgonoall’interfacie, e gli RNA si raccolgono quantitativamentenella fase acquosa.• La concentrazione salina del tampone deve essere intorno a100 mM, per favorire il recupero dei piccoli oligonucleotidi,che altrimenti verrebbero persi nella fase organica.• La concentrazione dei cationi bivaleneti , in particolareMg 2+ , deve essere possibilmente tenuta a 0, aggiungendoEDTA al tampone.

Lo ione Mg 2+ :• a) coopera alla formazione di aggragati tra AN eproteine che precipitano in condizioni alcaline;• b) ha discreta attività come catalizzatore metallicodell’idrolisi degli RNA;• c) è un cofattore di molte ribonucleasi potenzialmentecontaminanti.

• Recupero degli AN nella fase acquosa di un estratto fenolicomediante precipitazione alcolica.• Si aggiunge alla fase acquosa NaCl in modo che laconcentrazione dello ione Na + raggiunga 300 mM, favorendo cosìla formazione di sali di Na + dagli AN; quindi si aggiungono 2volumi di etanolo assoluto.• In queste condizioni, a T ambiente, gli AN ad alto pesomolecolare precipitano in pochi minuti. Se si vuole ottenereanche la precipitazione quantitativa di AN di dimensioni minoridi 300 bp si mantiene la miscela idroalcolica a -70°C per 2 h.• Il precipitato di AN viene raccolto centrifugando a 12.000 g per20 min a +4°C. Si risospende il pellet in etanolo al 70% e sicentrifuga di nuovo; infine il pellet vine risospeso in acquabidistillata (RNA) od in un appropriato tampone (DNA).

Estrazione del DNA: il tessuto è omogenizzato o le cellule sonolisate in tampone contenente Triton X-100 ed SDS. Gli RNA e leproteine vegono rimossi per estrazione con la miscelafenolo/cloroformio/alcol isoamilico/tampone, e per incubazionecon ribonucleasi e con un enzima proteolitico, proteinasi K(serino proteasi). Il DNA è precipitato dalla fase acquosadell’estratto fenolico per aggiunta di etanolo. Nella fase acquosarestono i nucleotidi derivati dalla digestione degli RNA. Il DNA può essere denaturato per riscaldamento o peresposizione a pH estremi. La denaturazione è accompagnatadall’effetto ipercromico, che consiste in un aumentodell’assorbimento nell’UV (260 nm) dovuto alla formazione delDNA a singolo filamento. Il DNA a singolo filamento può ancheessere distinto da quello a doppia elica mediante trattamento conbis-benzimide. La bis-benzimide è intensamente fluorescentesolo quando è legata al DNA a doppia elica, e non quandointeragisce con il DNA a singolo filamento.

Estrazione degli RNA: meno semplice dell’estrazione del DNA.I campioni sono facilmente contaminati da ribonucleasi.• Ribonuleasi endogene: la loro attività va prevenuta conopportuni inibitori.• Ribonucleasi esogene: 1) utilizzo di reattivi ad elevato grado dipurezza; 2) uso di vetreria sterile; 3) uso di guanti.• Gli RNA sono saldamente associati alle proteine. Pertanto imetodi di estrazione si basano sull’uso della proteinasi k perliberare gli RNA dalle proteine e successiva estrazione fenolica, osull’uso di isotiocianato di guanidina e sarcosinato di sodio perdenaturare le proteine ed inattivare le ribonucleasi.• In alternativa all’uso dell’estrazione fenolica, dopo il trattamento degliRNA con la soluzione denaturante e dopo una prima centrifugazione a12.000 g, il sovranatante può essere centrifugato per 18 h a 100.000 g suuno stato di CsCl 5,7 M. Gli RNA passano attraverso il CsCl e si raccolgonosul fondo, mentre proteine e DNA rimangono nella fase acquosa. Il pelletdi RNA viene ripreso in tampone e precipitato con etanolo freddo odisopropanolo.

• Assorbimento in UV. Per preparazioni purificate di AN ladeterminazione dell’assorbimento in UV a 260. 270 e 280 nmconsente una valutazione quantitativa agevole ed accurata. La A 260consente di calcolare la concentrazione di AN tenendo presente che1 unità di A 260 corrisponde a 50 mg/ml di DNA a doppia elica, a 40mg/ml di DNA ad elica singola o di RNA e a circa 20 mg/ml dioligonulceotidi di 15 – 50 basi.• L’assorbimento a 280 nm si utilizza per valutare il grado di purezzadella preparazione: se il rapporto A260/A280 è tra 1,7 e 1,9 per ilDNA e 1,8 e 2 per gli RNA, la preparazione è priva di contaminantisignificativi. Se invece questi rapporti scendono al di sotto di 1,6 lapreparazione è contaminata in maniera significativa , in genere conproteine.• Un picco di assorbimento a 270 nm indica la presenza di tracce difenolo che sono suffienti ad inibire le reazioni enzimatiche edevono perciò essere assolutamente eliminate. Si tatta più volte lapreparazione di AN con egual volume di etere etilico che estrae ilfenolo, e si verifica il rapporto A 260 /A 270 .

• Fluorescenza con bromuro di etidio. Perpreparazioni di AN a concentrazioni inferiori a 250ng/ml o fortemente contaminate con sostanze cheinterferiscono sull’assorbimento, si può sfruttare lafluorescenza indotta dal bromuro di etidio. Lafluorescenza è direttamente proporzionale allaquantità di AN; paragonando il campione in esamecon una curva standard si possono stimare, con buonaprecisione, quantità di 1 - 5 ng totali.

• Per la determinazione quantitativa del DNA e degliRNA in estratti non purificati nei quali non è possibilel’analisi spettrofotometrica, si può ricorrere alladeterminazione dei pentosi, mediante reazionicromatiche specifiche. Per la determinazione del DNAsi usa la difenilamina che reagisce con il desossiribosioe dà luogo alla formazione di un complesso conmassimo di assorbimento a 600 nm (Metodo diBurton). Per la determinazione degli RNA si usal’orcinolo che reagisce con il ribosio dando un derivatocon massimo di assorbimento a 660 nm.

• La reazione con la difenilamina è specifica per ildesossiribosio, e gli RNA non interferiscono. Lareazione con l’orcinolo non è specifica per il ribosio, edanche il DNA dà reazione positiva. Si devono farecurve di calibrazione del DNA con i due reattivi.• L’analisi può essere anche effettuata direttamente suun campione di tessuto. Il campione viene immerso inacido perclorico, scaldato a 70 – 80°C per 30 – 90 min,e quindi centrifugato. Si utilizza il sovranatante.• Si devono fare curve di calibrazione standard con DNAe/o RNA purificati.

• La metodica standard per separare, identificare epurificare gli AN è l’elettroforesi in gel di agaroso o dipoliacrilammide. I gel si possono preparare con pori didimensioni adeguate per gli RNA e per la maggiorparte delle molecole e dei frammenti di DNA.• Per un’analisi qualitativa del DNA è comunementeoperazione preliminare ottenerne dei frammenti didimensioni relativamente ridotte, facilmenteidentificabili.

• Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi di originebatterica che riconoscono e tagliano il DNA a doppiaelica a livello di ben definiti siti di riconoscimento (direstrizione), costituiti in genere da una sequenzapalindroma diadica di 4-6 basi. Si definisce sequenzapalindroma diadica un sequenza che, letta in direzione5’-3’, è uguale in ciascuna delle due catenecomplementari. Ne sono esempi le sequenze:5’ xxxACGTxxx 3’ 5’ xxxGAAATTCxxx 3’3’ xxxTGCAxxx 5’ 3’ xxxCTTTAAGxxx 5’

• Sono stati identificati migliaia di enzimi di restrizionenelle varie specie batteriche ed oltre un centinaio disiti di restrizione. Esistono tre tipi di endonucleasi direstrizione, indicate come I, II e III e classificati consigle che fanno riferimento alla specie batterica da cuivengono isolati.• Gli enzimi di tipo I digeriscono il DNA in punti casualianche a grande distanza dal sito di riconoscimento;quelli di tipo III tagliano il DNA a circa 25 basi dal sitodi riconoscimento.

• Gli enzimi di tipo II tagliano il DNA all’interno dellasequenza di riconoscimento ed hanno trovatolarghissima utilizzazione soprattuto per la formazionedi DNA ricombinante.• Da un DNA di media lunghezza, per azione di enzimidi restrizione si possono ottonere diverse centinaia diframmenti, la cui lunghezza dipende dalla natura delDNA e degli enzimi utilizzati.

• La lunghezza media dei frammenti di DNA, prodottidalla scissione del DNA genomico con un enzima direstrizione, dipende dalla frequenza con cui unparticolare sito di restrizione compare in una molecoladi DNA; questo a sua volta dipende dalla lunghezzadella sequenza di riconoscimento. Usando enzimi chericonoscono 4 nucleotidi si ottengono frammenti chein media hanno una lunghezza di alcune centinaia dinucleotidi, mentre usando enzimi che riconosconosequenze di 6 nucleotidi, i frammenti prodotti hannouna lunghezza di alcune migliaia di nucleotidi;utilizzando enzimi che riconoscono sequenze di 8nucleotidi si ottengono frammenti di circa 1 milione dipaia di basi.

• Data la riproducibilità e la precisione con cui leendonucleasi di restrizione agiscono, è possibileutilizzare questi enzimi per descrivere a livellomolecolare un frammento più o meno lungo di DNA,individuando in esso diversi siti riconosciuti da questienzimi. Si ottengono, in questo modo, le cosiddettemappe di restrizione.• Dopo che una molecola di DNA è stata scissa inframmenti, questi possono essere separati inelettroforesi

Riconoscono sequenze di 4,6, o 8 coppie di basi.

Note: The "Recognition site" of a restriction enzyme is also called the restriction site. In thiscolumn, the first line is from 5' to 3' and the second line is from 3' to 5'. The arrow indicates thecleavage site. If the cleavage site is not at the center, the restriction enzyme will generate sticky endswhich can base-pair with other DNA fragments cleaved by the same restriction enzyme. If thecleavage site is at the center, the restriction enzyme will generate blunt ends.

Gli enzimi di restrizione possonogenerare estremità piatte (bluntends) oppure estremità coesive(sticky ends).Isoschizomeri: enzimi direstrizione che riconoscono lastessa sequenza.Isocaudameri: riconoscono sitidiversi, ma lasciano estremitàcompatibili (es. BamHI e Sau3A).5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’5’-GATC-3’3’-CTAG-5

• A pH neutro od alcalino i gruppi fosfato degli ANhanno cariche negative uniformi per unità dilunghezza delle molecole, che pertanto in un campoelettrico migrano tutte verso l’anodo.• Poichè tutte le molecole hanno la stessa densità dicarica, in un supporto poroso come il gel di agaroso odi poliacrilammide, la mobilità elettroforetica è infunzione essenzialmente delle dimensioni dellemolecole, oltre chè ovviamente del grado di porositàdel gel. Poichè le dimensioni delle molecole di DNAdipendono dalla lunghezza delle catene, le dimensionidi queste molecole vengono espresse in termini di paiadi basi, bp.

Separation of DNA fragments of different lengths by gelelectrophoresis. A gel is prepared by pouring a liquid containingeither melted agarose or unpolymerized acrylamide between twoglass plates a few millimeters apart. As the agarose solidifies orthe acrylamide polymerizes into polyacrylamide, a gel matrix(orange ovals) forms consisting of long, tangled chains ofpolymers. The dimensions of the interconnecting channels, orpores, depend on the concentration of the agarose or acrylamideused to form the gel. Because the pores are larger in agarose gelsthan in polyacrylamide gels, the former are used to separate largeDNA fragments (≈500 bp to ≈20 kb) and the latter to separatesmall DNA fragments (1 nucleotide to ≈2 kb). The mixture ofDNA fragments to be separated is layered in a well at the top ofthe gel and an electric current is passed through the gel. DNAfragments move toward the positive pole at a rate inverselyproportional to the log of their length, forming bands that can bevisualized by autoradiography (if the fragments are radiolabeled)or by addition of a fluorescent dye such as ethidium. Agarose gelscan be run in a horizontal orientation; in this case, the meltedagarose is allowed to harden on a single horizontal glass or plasticplate. This is not easily done with polyacrylamide gels becauseoxygen in the atmosphere inhibits polymerization of acrylamide.Gels are generally depicted with the origin at the top andmigration downward.

• La porosità di un gel dipende dalla concentrazioned’agaroso; con gel diversi tra lo 0,5 ed il 2% di agaroso sipossono separare molecole di DNA che variano da 200 a50.000 bp.• La separazione viene generalmente fatta in sistemiorizzontali, utilizzando come running buffer Tris-borato0,089 M a pH 8,4 addizionato con EDTA 0,002 M (TBE).• I campioni vengono preparati aggiungendo un colorantecome il blu di bromofenolo, che permette di seguire meglioil caricamento del campione e funge da marcatore delfronte di migrazione. I gel comunemente utilizzatimisurano cm 25 x 12 e vengono fatti correre per 10-12 ore inun campo elettrico di 1,5 V/cm.

• Il DNA può essere localizzato nel gel includendo inquesto una piccola quantità di bromuro di etidio,sostanza di per se fluorescente, ma la cui fluorescenzaaumenta quando legato al DNA, nel quale si intercalatra le basi. Nella lastrina posta sotto la luce UV, oattraversata da luce UV su di un transilluminatore, lebande di DNA mostano netta fluorescenza rossoarancionecon massimo a 590 nm.

Separa le molecole di DNA in base allalunghezza facendole migrare in uncampo elettrico.Per visualizzare il DNA si usa EtidioBromuro, una molecola fluorescentealla luce ultravioletta.

• Un altro reattivo per la localizzazione per fluorescenza diDNA o RNA nel tracciato elettroforetico è il SYBR Green,di cui sono in commercio due diverse forme, SYBR Green Ie SYBR Green II. Sono molecole brevettate rapportabilialla classe dei coloranti polimetinici definiti comunementecianine. Hanno una sensibilità fino ad un ordine digrandezza superiore rispetto al bromuro di etidio, rispettoal quale sono anche molto meno mutageni.• Il SYBR Green I ha un’affinità preferenziale per il DNA adoppia elica, al quale si lega al solco minore. A differenzadel bromuro di etidio, è fluorescente solo se legato al DNA.Ha un massimo di assorbimento a 494 nm, ma anche con di 254, 312 o 365 nm, come nei comuni transilluminatori, dàuna fluorescenza verde con massimo a 529 nm. Il limite disensibilità è di 60 pg di DNA a doppia elica.

SYBER Green I

SYBER Green I

• Il SYBR Green I si lega anche al DNA a singolo filamento ,ma con affinità molto minore. Il colorante può essere usatotrattando il DNA prima dell’elettroforesi, può essereinserito nel gel, o il gel può essere colorato dopol’elettroforesi molto semplicemente immergendolo in unasoluzione tamponata del reattivo ; non è necessaria unadecolorazione.• Il SYBR Green II (che ha massimo di assorbimento a 481nm) ha maggiore affinità per il DNA a singolo filamento eper gli RNA; si può evidenziare 1 ng di RNA o di DNA asingolo filamento.• Per raffronto con campioni di dimensioni note (standard)saparati sullo stesso gel si risale alle dimensioni degli ANpresenti nel campione in esame.

• Esistono apparecchiature che permettono di esaminare igel per transilluminazione con luce laser di determinata ,di determinare l’intensità di fluorescenza delle singolebande e così effettuare un dosaggio quantitativo.• L a separazione elettroforetica può essere effettuata ancheper elettroforesi capillare, CE. Utilizzando come supportoidrossimetil-propil cellulosa si possono ottenere ottimesaparazioni di frammenti di dsDNA e ssDNA di lunghezzavariabile da pochi nucleotidi a qualche decina di migliaiadi basi. La rlevazione può essere effettuata con detector afluorescenza laser (LIF); anche in CE il SYBR Green è moltoefficiente, consentendo di identificare, per eccitazione conun laser ad argon di 488 nm, quantità di dsDNAdell’ordine dei fg.

• Per l’identificazione di frammenti di DNA dallesequenze nucleotidiche in essi presenti si ricorrre allatecnica dell’ibridizzazione con “sonde” marcate(probes).• Si fanno cioè reagire i frammenti di DNA separati perelettroforesi , previa denaturazione e quindi non più adoppia elica, con una sonda oligonucleotidica ,marcata, a sequenza nota, che si legherà alla suasequenza complementare, se presente nel frammentodi DNA.

• Con il termine di sonda (probe) si indica un frammentospecifico di DNA (o RNA) reso radioattivo.Solitamente come sonde vengono utilizzati deglioligonucleotidi, cioè dei brevi (20 o più nucleotidi)filamenti lineari di DNA sintetizzati chimicamente.Questa sintesi viene realizzata automaticamente daisintetizzatori di oligonucleotidi, apparecchi chepossono produrre quantità anche elevatedell'oligonucleotide corrispondente alla sequenza danoi desiderata.• Esistono diversi metodi che possono essere utilizzatiper rendere radioattivi i frammenti di DNA o RNA.Questi metodi permettono di marcare la molecola diacido nucleico o alle due estremità (5' o 3') o in tutta lasua lunghezza.

• Un metodo di marcatura all'estremità 5' prevede iltrattamento del frammento di DNA, che si vuole marcare,dapprima con una fosfatasi alcalina, un enzima in grado dieliminare il gruppo fosfato all'estremità 5'. Il DNA cosìdefosforilato viene trattato con la polinucleotide chinasi, unenzima capace di catalizzare il trasferimento dell'atomo difosforo in dell'ATP ad un terminale 5' defosforilato di unacido nucleico. Se si utilizzano molecole di ATP marcateradioattivamente al fosforo in , la reazione catalizzatadalla chinasi permetterà di ottenere un frammento di DNAmarcato all'estremità 5’.

• Se, invece, si vuole marcare un acido nucleicoall'estremità 3', si può usare la terminal trasferasi, unenzima che catalizza l'aggiunta di ~ 20-30deossinucleotidi all'estremità 3'-OH di un filamento diDNA. Se come substrato della terminal trasferasi siutilizzano nucleotidi trifosfati marcati con 32 P inposizione , la coda di nucleotidi che viene aggiunta alfilamento di DNA conterrà un atomo di fosfororadioattivo per ogni base.

• Il metodo più usato per marcare un frammento di DNA intutta la sua lunghezza è la cosiddetta nick-translation.Questo metodo prevede l'utilizzazione di un frammento diDNA a doppia elica. Si fa agire in un primo tempol'endonucleasi Dnasi I in grado di catalizzare la scissione diun legame fosfodiestereo 5' P-3' OH su un filamento diDNA, si produce in questo modo un nick, cioè un taglio inun punto dell'elica del DNA. Si può quindi aggiungere laDNA polimerasi I e i 4 desossiribonucleotidi trifosfatimarcati al fosforo in . A partire dal taglio prodotto sulfilamento di DNA, la polimerasi I eliminerà i nucleotidifreddi mediante l'attività esonuclesica 5’ 3' e li sostituiràcon nucleotidi marcati mediante la propria attivitàpolimerasica.

• La denaturazione del DNA consiste nella separazionecompleta dei due filamenti complementari che locostituiscono. Il processo inverso è dettorinaturazione.• Il DNA può essere denaturato quando la soluzione chelo contiene viene riscaldata oltre una certatemperatura. L'aumento della temperatura determinauna riduzione delle interazioni legate all'impilamentotra le basi e la rottura dei legami ad idrogeno tra lebasi. La denaturazione del DNA può essere seguitamisurando le variazioni di assorbimento a 260 nm (lalunghezza d'onda a cui si ha il massimo diassorbimento degli acidi nucleici). La denaturazionecomporta un aumento dell'assorbimento.

• Un DNA ricco in A/T fonde più rapidamente di unoricco in G/C, perché in quest'ultimo le interazioni diimpilamento tra le coppie di basi sono più forti.• La Tf di una molecola di DNA a doppia elica èfortemente dipendente dalla forza ionica dellasoluzione in cui si trova. I gruppi fosfato a caricanegativa non vengono neutralizzati se laconcentrazione salina è bassa , e le repulsionielettrostatiche causano la separazione dei duefilamenti di DNA a temperature minori. Le alteconcentrazioni saline, invece, schermano le carichenegative degli atomi di ossigeno dei gruppo fosfato,che vengono quindi neutralizzate e quindi il DNA adoppio filamento si denatura a temperature piùelevate.

Il confronto delle curve didissociazione e riassociazionedella doppia elica ( "melting eannealing") dimostra una chiaraisteresi tra le due curve cheimplica la presenza di duecinetiche diverse. Questa isteresiha implicazioni pratiche nellacomprensione di metodiche qualila PCR in cui si utilizzanotemperature diverse nellariassociazione dello stampo diDNA con i primer (temperaturadi annealing) e nella fase diallungamento (temperatura di"extension" 72°C).

• Per l’ibridizzazione si opera su DNA immobilizzato suun supporto solido, di solito un foglio di nitrocellulosa.Dopo l’elettroresi i frammenti di DNA che si sonoseparati sul gel di agaroso vengono denaturati pertrattamento del gel con una soluzione basica, e quinditrasferiti sul foglio di nitrocellulosa, e poi ibridizzati.Sono disponibili semplici apparecchiature per iltrasferimento dal gel alla nitrocellulosa: il gel vieneposto sul foglio di nitrocellulosa collocato a chiusuradella faccia superiore di una vasca a tenuta nella qualesi pratica il vuoto; il contenuto del gel passa sul fogliodi nitrocellulosa. In alternativa si applicasemplicemente un peso al di sopra del gel o si operaper elettroblotting.

Southern blotting. (a) The DNA to be analyzed isdigested with restriction enzymes and then separated byagarose gel electrophoresis. (b) The DNA fragments inthe gel are denatured with alkaline solution andtransferred onto a nitrocellulose filter or nylonmembrane by blotting, preserving the distribution of theDNA fragments in the gel. (c) The nitrocellulose filteris incubated with a specific probe. The location of theDNA fragment that hybridizes with the probe can bedisplayed by autoradiography.

The Southern blot technique for detecting the presence of specific DNAsequences following gel electrophoresis of a complex mixture ofrestriction fragments. The diagram depicts three restriction fragments inthe gel, but the procedure can be applied to a mixture of millions of DNAfragments. A similar procedure, called Northern blotting, is used to detectspecific RNA sequences. [See E. M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508.]

• Se si scelgono sonde appropriate l’insieme delle bande diuna analisi di questo tipo è caratteristico di ogni individuo,e costituisce quella che viene definita l’impronta del DNAche consente di identificare un singolo individuo, cosìcome le impronte digitali.• Poichè l’analisi richiede quantità discrete di campione diDNA, si aumenta la quantità disponibile mediante unareazione catalizzata dalla DNA polimerasi e ripetutanumerose volte. E’ la tecnica ideata nel 1983 ed ormaiacquisita anche in sistemi automatizzati, denominataPolymerase chain reaction o semplicemente PCR.

• La proprietà di specificità di riconoscimento e tagliodel DNA ad opera di enzimi di restrizione vieneampiamente utilizzata in diagnostica di malattiecausate da mutazioni, delezioni ed inserzioni chemodificano la dimensione dei frammenti di DNA chesi possono ottenere da un tratto di DNA mediante unenzima di restrizione. La combinazione diamplificazione di frammenti di DNA e digestione conenzimi di restrizione specifici offre un sistema dielevata rapidità e accuratezza per la diagnosi dimutazione.

• La mutazione implica la formazione di una sequenza diriconoscimento per l' enzima di restrizione EagI , infattidalla sequenza a doppia elicaTTGGCCGTCGGCCGAACCGGCAGCCGGCLeu ....Arg -si passa alla sequenza- Ser……Arg• che viene riconosciuta da questo enzima di restrizione ditipo II e tagliato in corrispondenza delle frecce.L'associazione di PCR e digestione con enzima direstrizione offrì la possibilità di associare la presenza dellamutazione alla malattia in un soggetto vivente e in unparente deceduto per identica patologia molti anni prima edi cui si conservava piccolissima quantità di tessuto fissatoin formalina.

• Un esempio classico di una malattia causata da unamutazione puntiforme sul DNA è l'anemia falciforme,causata dalla sostituzione di una A con una T nel sestocodone del gene per la globina. Il codone alteratodetermina la sostituzione del Glu in posizione 6 dellacatena con una Val. Questa sostituzione amminoacidicadetermina un difetto strutturale della molecola dellaglobina, la quale tende a polimerizzare e a formareaggregati quando si trova nella forma deossigenata. Gliaggregati precipitano all'interno del globulo rossodeterminandone una distorsione della membranaplasmatica e l'assunzione della caratteristica forma a falce,da cui il nome della malattia. I globuli rossi così alteratirisultano più fragili ed emolizzano più facilmente, inoltrerestano intrappolati nei piccoli vasi sanguigni alterando lacircolazione e provocando danni a numerosi organi.

• L'anemia falciforme ha un'elevata incidenza soprattutto tra lapopolazione africana (circa 4 casi ogni 1000 nascite) nell'ambitodella quale si possono avere sia pazienti omozigoti per questodifetto genetico, sia eterozigoti. Questi ultimi sono solitamenteasintomatici, mentre gli omozigoti soffrono di una grave anemia epresentano danni a numerosi organi, come le ossa, i reni e ilsistema nervoso centrale. I pazienti omozigoti possiedono, infatti,solo l'emoglobina S (emoglobina con catena mutata) mentre gliomozigoti hanno sia l'emoglobina S che l'emoglobina A (la formanormale).• La frequenza del gene per l'anemia falciforme in Africa èstrettamente correlata all'incidenza della malaria, tale correlazioneè da imputare al fatto che il tratto falciforme aumenta di poco, main maniera significativa il grado di protezione contro la forma piùletale della malaria, forse accelerando la distruzione degli eritrocitiinfetti. Si è riscontrato infatti che gli individui eterozigoti, per ildifetto genetico causa dell'anemia falciforme, sono più resistentialla malaria rispetto agli individui che non possiedono tale difetto.

• La sostituzione del Glutammato con la Valina nellaposizione 6 dell'emoglobina S è dovuta allatrasformazione della tripletta GAG codificante il Glunella tripletta GTG codificante la Val. La sequenzaGAG dell'allele normale fa parte della sequenzaCCTGAGG la quale viene riconosciuta dall'enzima direstrizione MstII. La mutazione non permetteall'enzima di riconoscere questa sequenza. Per questomotivo la digestione della catena dell'emoglobina Scon l'enzima MstII produce un frammento di 1,3 kb,mentre dalla digestione della catena dell'emoglobinaA si ottiene un frammento di 1,1 kb. I frammentiottenuti possono essere separati in elettroforesi edidentificati con il Southern blotting.

• La diagnosi dell'anemia falciforme può essere eseguitasu campioni di DNA estratti da qualsiasi tipo di cellula,è possibile anche una diagnosi prenatale nelle primefasi della gravidanza. Si può, infatti, analizzare il DNAestratto dagli amniociti, cellule di natura fibroblasticaoriginate dalla desquamazione di tessuti fetali presentinel liquido amniotico in cui è immerso il feto.Mediante questa tecnica, che prende il nome diamniocentesi, è possibile prelevare 20-30 ml delliquido amniotico ed eseguire l'analisi del DNA fetale.E' stata messa a punto anche una metodica chepermette nel primo trimestre di gravidanza l'analisidel DNA embrionale estratto da un villo coriale.

La coesistenza di più alleli in uno stesso locus genico viene definitocome polimorfismo genetico e un allele viene definito come polimorficose è presente con una frequenza di almeno l'1% in una popolazione. Labase del polimorfismo risiede in mutazioni che modificano funzioni diproteine che hanno ricadute sul fenotipo. Ci possono essere mutazioniche non hanno nessun effetto sulle proteine e questo polimorfismogenomico può essere messo in evidenza con la sequenza nucleotidica opiù semplicemente e velocemente con mappe di restrizione. In quest'ultimo caso il criterio diagnostico deriva dal pattern dei frammentiprodotti dal taglio con un enzima di restrizione. Se un sito di taglio èpresente in un genoma e assente in un altro avremo nel primo caso dueframmenti di DNA e nel secondo caso un frammento solo di dimensioniuguali alla somma dei primi due. Una differenza nella mappa direstrizione di due individui è chiamata RFLP. In questo modo si valutadirettamente il genotipo dei soggetti. Una frequenza di ricombinazionepuò essere misurata tra un particolare fenotipo e un pattern di unamappa di restrizione.

Un tipo particolare di polimorfismo è quello dovuto non ad unamutazione, ma a variazioni reali di lunghezza di alcuni tratti delgenoma compresi tra due punti fissi e appartenenti ad individuidifferenti. Spesso queste regioni sono costituite da brevisequenze di 10-20 coppie di basi ripetute per un numero di voltevariabile da individuo ad individuo. Nel caso in cui il DNA vengaframmentato con enzimi di restrizione che riconosconosequenze al di fuori di queste regioni ripetute, si otterrannoframmenti di lunghezza differente. Queste regioni prendono ilnome di regioni ipervariabili o anche minisatelliti erappresentano dei marcatori genetici. Questo polimorfismo dilunghezza è talmente caratteristico di ciascun individuo che puòessere utilizzato per l'attribuzione della paternità o perl'identificazione di una determinata persona, ad esempio nellecause penali. In questo tipo di analisi, il DNA viene digerito con enzimi direstrizione opportuni e i frammenti ottenuti vengono ibridaticon una o più sonde marcate. Si potrà osservare una serie dibande di ibridazione. Ogni singola banda viene ereditata digenerazione in generazione come un carattere mendeliano el'insieme di queste bande rappresenta il fingerprint molecolare diun individuo e lo identifica in modo inconfondibile

• Il Northern blot è una tecnica di ibridizzazioneanaloga al Southern blot che viene usata perl’identificazione di sequenze nucleotidiche degli RNA,in particolare mRNA. Anche in questo caso la sondamarcata è rappresentata da una sequenza didesossiribonucleotidi.• Vengono usate comunemente sonde radioattive(marcate in genere con 32 P) e la ibridizzazione vienerilevata per autoradiografia di foglio di nitrocellulosa.• Si possono anche usare sonde con marcatura nonradioattiva: si utilizza un nucleotide cui è stata legatabiotina, fluoresceina, od un enzima come la fosfatasialcalina.

• Northern Blot – Come il Southern blot, il Northern blotconsiste in una separazione elettroforetica di RNA su geld'agarosio e un successivo trasferimento su un filtro dinitrocellulosa o di nylon, che viene poi ibridato con unasonda opportuna. Per ottenere una buona separazioneelettroforetica, è consigliabile utilizzare un gel d'agarosodenaturante e risospendere il campione di RNA, che deveessere analizzato, in un tampone denaturante contenenteformammide.• La sonda utilizzata per l'ibridazione corrisponde ad unoligonucleotide radiomarcato complementare ad unadeterminata sequenza dell'RNA che si vuole identificare.Prima di operare l'ibridazione, il filtro viene preincubatocon una soluzione di albumina o di polivinilpirrolidone, inmodo da evitare reazioni aspecifiche della sonda.Successivamente, si immerge il filtro in una soluzionecontenente la sonda radioattiva denaturata, la qualeformerà un ibrido con il filamento di RNA immobilizzatosul filtro. Questo ibrido radioattivo potrà essere poiidentificato mediante autoradiografia.

• Durante l'ibridazione, è importante sceglierecondizioni sperimentali (temperatura e forza ionicadella soluzione) che favoriscano l'appaiamentocorretto della sonda con l'RNA.• Vengono definite condizioni stringenti, quellecondizioni sperimentali caratterizzate da temperaturaelevata e bassa forza ionica che favorisconoappaiamenti molto specifici.• Vengono invece definite condizioni di bassastringenza, quelle condizioni di temperatura e forzaionica in cui vengono favoriti appaiamenti menospecifici.

• Per la separazione degli mRNA si può sfruttare lapresenza della poliadenilazione utilizzando unatecnica di cromatografia di affinità. Si farannoappaiare le code di adenina del messaggero con letimine di un oligonucleotide sintetico (poliT) legato auna fase stazionaria quale il sefarosio; l'appaiamentostabile e specifico si realizza ad elevata forza ionica (es.0,5 M NaCl), mentre l'eluizione si realizza in presenzadi H 2 O.

‣ Un cDNA è una molecola di DNA a doppia elicasintetizzata sullo stampo di un RNA messaggero. Lemetodiche utilizzate per la produzione in vitro di molecoledi cDNA sono diverse, tutte prevedono comunquel'utilizzazione della trascrittasi inversa di origineretrovirale.‣ Questo enzima possiede tre attività enzimatiche, tutteessenziali per la duplicazione virale:• 1. attività DNA polimerasica diretta dall'RNA in direzione5’ 3' e richiede un primer.• 2. attività RNasica H, è una attività esonucleasica in gradodi degradare specificamente i filamenti di RNAappartenenti ad ibridi RNA/DNA.• 3. attività DNA polimerasica diretta dal DNA. Mediantequesta attività si ha la replicazione del DNA a singolofilamento che rimane dopo la degradazione da partedell'RNasi H del genoma virale.

Sintesi di cDNA da un mRNA poliadenilato. Si può utilizzare una molecola di mRNA purificata oppureuna popolazione di messaggeri presenti nelle cellule di undeterminato tessuto. L'mRNA viene incubato con unoligonucleotide formato solamente da timidine (oligo-dT),il quale si appaierà con la sequenza poliA presenteall'estremità 3' dell'mRNA. L'oligo-dT funge da innesco perla sintesi di un filamento di DNA ad opera della trascrittasiinversa. Si ottiene quindi un ibrido mRNA-cDNA, da cuil'mRNA può essere rimosso per trattamento con alcali ocon la ribonucleasi H (RNasi H). Rimuovendo l'RNArimane il DNA neosintetizzato a singolo filamento, chetenderà a ripiegarsi all'estremità 3' formando una specie diansa che può fungere da innesco per l'azione della DNApolimerasi I o più precisamente del frammento di Klenowdella DNA polimerasi I, corrispondente alla porzionedell'enzima che conserva l'attività polimerasicaedesonucleasica 3’ 5', ma non l'attività esonucleasica5’ 3'.

Sintesi del cDNA

• Si ottiene, quindi, una molecola di DNA in cui i due filamentisono continui, a causa dell'ansa al 3', la quale può essere rimossamediante l'azione della nucleasi S1. In questo modo, tuttavia,vengono eliminati alcuni nucleotidi corrispondenti all'estremità5' del DNA compresi all'interno dell'ansa eliminata. Questorappresenta un grosso inconveniente, a cui si è cercato di ovviareintroducendo alcune modifiche nel protocollo originale. E'possibile, ad esempio, operare in maniera che la RNasi H nonrimuova completamente il filamento di RNA, ma vi introducadiversi tagli lasciando quindi dei piccoli frammenti di RNAappaiati al filamento di DNA. Questi frammenti fungono dainnesco per la DNA polimerasi I, che grazie alla sua attivitàesonuclesica 5' 3' è in grado di degradare i frammenti di RNAe di sostituirli con un filamento di DNA continuo. Le regioni asingole elica che rimangono all'estremità del cDNA a doppia elicasono rimosse dall'attività esonuclesica 3' 5' della DNApolimerasi del fago T4. In questo modo si producono molecole dicDNA con estremità piatte.

• Queste molecole possonoessere trasformate in molecoledi cDNA con estremità coesivemediante aggiunta dioligonucleotidi opportuni.• Il cDNA sintetizzato vienequindi clonato utilizzandovettori opportuni.• Avendo la possibilità diclonare il cDNA derivante damRNA è possibile costruire unabanca dicDNA.

E’ finalizzata ad ottenere da una miscela complessa dimateriale di partenza anche di non elevato grado dipurificazione , sufficienti quantità di una determinataregione di DNA di 200-500 nucleotidi, la cui sequenzasia nota.

Questa tecnica permette di amplificare in vitro sequenzespecifiche di DNA che siano delimitate alle estremità 5' e 3'da regioni di DNA a sequenza nota. Si deve disporre di dueoligonucleotidi costituiti da almeno 10-15 nucleotidi chesiano complementari (primers) a tali sequenze delimitanti.Si opera in modo da dissociare il doppio filamento di DNAcon un aumento della temperatura fino a 95°C,successivamente si abbassa la temperatura a un punto taleche gli oligonucleotidi (in grande eccesso molare rispetto alDNA stampo) possano associarsi alla sequenza di DNAcomplementare e infine si sfrutta la proprietà della DNApolimerasi di catalizzare l'allungamento del primercomplementare in presenza di desossinucleotidi trifosfati etamponi opportuni. Il completamento della reazionecomporta la sintesi di un nuovo filamento di DNAcomplementare al DNA stampo.

La sintesi di un nuovo filamento di DNA può essereripetuta dalla successione dei tre momenti dellareazione :• 1° - dissociazione del doppio filamento;• 2° - associazione del DNA a singolo filamento conoligonucleotidi;• 3° - allungamento catalizzato dalla DNA polimerasi perun numero variabile di volte (circa 30 volte).

E' intuitivo che ogni filamento di DNA neosintetizzatodiventa esso stesso lo stampo per la sintesi di un nuovofilamento di DNA e da questo deriva il concetto di"reazione a catena". Le prime reazioni comportano lasintesi di filamenti di DNA che ovviamente non terminanoesattamente nella zona delimitata dal primer anti parallelo,ma l'interruzione avviene quando il filamento vienesintetizzato su un stampo di DNA che sia stato esso stessoil prodotto di reazione innescato da un primer antiparallelo . Anche se la reazione di amplificazione èestremamente efficiente ed esponenziale, essa non èillimitata. L'effetto limitante si accentua negli ultimi cicli diamplificazione ed è legato alla progressiva denaturazionedell' enzima, ma anche all'aumento degli strands di DNAche si possono riassociare tra loro, infatti i neo-strandscompetono con gli oligonucleotidi (primers) .

Temperature100Melting94 o C500T i m e3’5’Heat5’3’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C0T i m e3’5’5’5’5’3’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x0T i m e3’5’Heat5’5’Heat5’5’3’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’5’5’5’5’5’5’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’3’Heat5’5’Heat5’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’5’5’5’5’5’5’

Temperature10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’Fragments ofdefined length5’5’5’5’5’5’

La tecnica di PCR è stata inventata nel 1985 da KaryMullis e questa scoperta gli è valsa la conquista delpremio Nobel per la chimica del 1993. L'originaleprotocollo di amplificazione prevedeva l'uso delframmento di Klenow della polimerasi di E.coli cheperò è termolabile e pertanto si doveva aggiungereenzima ad ogni ciclo di amplificazione.

In breve tempo furono introdotte due innovazioni che resero lametodica estremamente efficiente:• 1. L'uso di DNA polimerasi termostabile che rende superflual'aggiunta di nuova polimerasi ad ogni ciclo. La prima polimerasitermostabile introdotta fu quella estratta dal Termus acquaticus equesta polimerasi indicata come Taq polimerasi è ancora stabile a95°C. Questa termostabilità aumenta la specificità della reazioneperchè il DNA viene ricopiato a 72°C e non a 37°C. La Taq polimerasiè però priva di funzione esonucleasica 3’ 5' e pertanto compie piùerrori del frammento di Klenow di E.coli. Altre polimerasi sono statepoi introdotte come quella estratta dall' ipertermofilo PyrococcusFuriosus che presenta una temperatura di "ottima crescita" intornoai 100°C e tale polimerasi che presenta una importante funzioneesonucleasica 3’ 5' è nota nei laboratori come vent polimerasi opfu polimerasi. La fedeltà di trascrizione della Vent polimerasi èconsiderata di almeno 10 volte superiore alla Taq. Bisogna avere l'accortezza di aggiungere l'enzima come ultimo reagente perchè inassenza di dNTP l'attività esonucleasica comporterebbe unadegradazione deiprimer. E' inoltre interessante ricordare che la Pfupolimerasi incorpora con efficienza 10 volte superiore rispetto allaTaq l'- 35 S dATP che viene utilizzata nel sequenziamento del DNAcon metodo enzimatico.

• 2. Lo sviluppo di apparecchiature automatizzate(termostati a cicli "thermal cyclers") che permettonol'automazione dei cicli di riscaldamento eraffreddamento. Vengono utilizzati vari tipi di sistemi:riscaldamento e raffreddamento con fluidi;riscaldamento con resistenza elettrica eraffreddamento con fluidi; riscaldamento da resistenzaelettrica e raffreddamento con semiconduttori(sistema Peltier).

Dopo 30 cicli si avrà oltre un miliardo di copie dellasequenza bersaglio, teoricamente calcolabili dallarelazione 2 n – 2n, in cui n = numero di cicli ( ad es.dopo 20 cicli si avranno 1.048.536 copie della sequenzae soltanto 40 molecole di DNA in cui le due catenehanno lunghezza diversa). L’intera operazionerichiede poche ore. Il DNA amplificato può esserefacilmente isolato.Con la PCR può essere analizzato il DNA di un singolocapello per identificare senza ambiguità un individuo.E’ una metodica di uso comune in indagini dimedicina forense.

Vantaggi della PCR1. E’ più veloce rispetto al clonaggio tramite vettori2. E’ sufficiente una piccola quantità di DNA3. E’ una tecnica altamente selettiva e sensibile (DNA nonpurificato)Svantaggi della PCR1. Per sintetizzare i primers bisogna conoscere le sequenzealle estremità del frammento di interesse2. Si può impiegare solo per amplificare frammenti corti (noproof-reading)3. Problema dei falsi positivi (mismatch dei primers econtaminazioni di DNA)

Una variante della PCR è la RT-PCR, che consente diamplificare mRNA. Si utilizza la trascrittasi inversa(reverse trascriptase, RT) per sintetizzare un segmentodi cDNA complementare al mRNA, che sarà poiutilizzato nella PCR.• Consente di analizzare anche trascritti molto deboli odRNA virali presenti a bassissime concentrazioni.

Il DNA da amplificare deriva dalla retrotrascrizionedell’mRNARICHIEDE:1. Un tampone2. Una RT DNA polimerasi (di origine retrovirale)3. Miscela di mRNA contenente la sequenza da amplificare4. Primer oligo dT o oligomeri random cDNA I 4 dNTP 2 primers Una DNA polimerasi termoresistente

Diagnosi infezioni batteriche e virali(diagnosi HIV, diagnosi diinfezione da virusdell’epatite C, diagnosi della Tubercolosi) Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni Controllo efficacia terapie anti-cancro Determinazione del sesso Medicina legale Ricerca di base• Frammenti da inserire in un vettore• Sonde per screening di librerie genomiche o dicDNA