You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Genetisk variasjon hos jordskokk.<br />
Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i<br />
Stine Kooyman<br />
2006<br />
Institutt for naturvitenskapelige fag<br />
Fakultet for realfag<br />
Høgskolen i Agder, Kristiansand
© Stine Kooyman 2006<br />
HiA Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i, referansenr.: 008 - Bio<br />
Innlevert som oppgave i emnet: Bio300 Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i, v-2006,<br />
under veiledning av Førsteamanuensis Audun Slettan<br />
Alle rettigheter reservert. Ingen deler av denne oppgaven kan kopieres uten<br />
tillatelse fra forfatteren.<br />
Bilde, Forside: http://www.jardin-mundani.org/compositae/aguaturmasZ.jpg<br />
Bilde, Innledning: http://forum.funghiitaliani.it/uploads/post-72-<br />
1102024925_thumb.jpg&imgrefurl=http://forum.funghiitaliani.it/index.php%3Fshowtopic%<br />
3D14829&h=635&w=800&sz=87&tbnid=9U3Mol7Ip2HDRM:&tbnh=112&tbnw=142&hl<br />
=no&start=3&prev=/images%3Fq%3Dhelianthus%2Btuberosus%26svnum%3D10%26hl%<br />
3Dno%26lr%3D<br />
II
<strong>Forord</strong><br />
Denne bacheloroppgaven om genetisk variasjon hos jordskokk ble<br />
igangsatt av Høgskolen i Agder, fakultet for realfag, i samarbeid med<br />
Bioforsk avdeling Grimstad, i forbindelse med oppnåelse av bachelorgrad i<br />
Biol<strong>og</strong>i.<br />
Det praktiske <strong>og</strong> teoretiske arbeidet i forbindelse med denne oppgaven<br />
ble utført i perioden januar 2006- mai 2006.<br />
Veileder gjennom hele prosessen har vært førsteamanuensis ved Høgskolen<br />
i Agder, Audun Slettan. Tusen takk for all hjelp, støtte <strong>og</strong> inspirasjon. Jeg<br />
vil <strong>og</strong>så takke Åsmund Asdal ved Bioforsk i Grimstad for hjelp med<br />
innhøsting av plantemateriale, informasjon om plantene <strong>og</strong> utvelgelse av<br />
aktuelle planter.<br />
Til slutt vil jeg takke min samboer, Oddbjørn Haaland, for hjelp med laging<br />
av PCR- figurene, <strong>og</strong> diverse annen dataassistanse.<br />
Høgskolen i Agder. 22. mai 2006<br />
Stine Kooyman<br />
III
Sammendrag<br />
Denne bacheloroppgaven handler om genetisk variasjon hos jordskokk.<br />
Med tanke på fremtidig bevaring av kulturplanten jordskokk, har jeg i<br />
denne oppgaven hatt som mål å etablere en metode for å studere genetisk<br />
variasjon hos denne planten. Det ble isolert DNA fra jordskokk ved hjelp<br />
av DNeasy Plant Mini- kit fra Qiagen. Det ble bestilt primere som tidligere<br />
hadde vert brukt på den nære slektningen solsikke, <strong>og</strong> det ble kjørt PCR<br />
med disse. PCR- produktene ble så kjørt i en 2% agarosegel for å se om de<br />
hadde virket. Primerene som virket ble bestilt på nytt, men fluoriserende 5’ende.<br />
Det ble så kjørt en ny PCR med de merkede primerne, <strong>og</strong> PCR-<br />
produktet fra denne kjøringen ble satt inn i 3130 Genetic Analyzer for<br />
automatisk analyse. Etter analysen i 3130 Genetic Analyzer ble råmaterialet<br />
gjennomgått <strong>og</strong> resultatene ført ned i tabeller. Gjennom bruk av PCR,<br />
gelelektroforese <strong>og</strong> automatisk analyse av PCR- produkter i 3130 Genetic<br />
Analyzer har man fått etablert en metode for å se på den genetiske variasjonen.<br />
IV
Innhold<br />
Innledning 1<br />
Jordskokk 1<br />
Genetisk variajon 3<br />
Metoder for å studere genetisk variasjon 3<br />
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) 4<br />
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) 5<br />
DNA sekvensering <strong>og</strong> minisekvensering for studier av variasjon 5<br />
Microarray 6<br />
Problemstilling <strong>og</strong> hypotese 6<br />
Hvordan nå målet? 8<br />
Materialer <strong>og</strong> metoder 9<br />
Innsamling <strong>og</strong> oppbevaring av analysemateriale 9<br />
Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev ved bruk av<br />
DNeasy Plant Mini Kit 11<br />
Beregning av DNA- utbytte 13<br />
Valg av genetiske markører 13<br />
PCR (Polymerase Chain Reaction) 14<br />
Prosedyre for PCR 17<br />
Prosedyre for laging av agarose gel elektroforese 19<br />
Nybestilling av PCR- primere med fluorescensmerket5’ende 21<br />
PCR med merkede primere 21<br />
Resultater 23<br />
Resultater fra agarosegel 23<br />
Resultater fra DNA- utbytte analyse 26<br />
Resultater fra 3130 Genetic Analyzer 27<br />
Diskusjon 30<br />
DNA- isolering 30<br />
DNA- utbytte analyse 30<br />
3130 Genetic Analyzer 31<br />
Fenotypisk variasjon 33<br />
Konklusjon 34<br />
Kilder 35<br />
V
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Innledning<br />
Jordskokk<br />
Som bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i ved Høgskolen i Agder har jeg valgt å<br />
undersøke genetisk<br />
variasjon hos kulturplanter.<br />
Kulturplanter er vekster<br />
som gjennom dyrking eller<br />
foredling er tatt i bruk til<br />
menneskelige formål. Man<br />
skiller mellom fire grupper;<br />
matplanter, medisinplanter,<br />
prydplanter <strong>og</strong> planter til industriell eller teknisk bruk som for eksempel<br />
bomull.<br />
Planten som skal undersøkes er jordskokk (Helianthus tuberosus).<br />
Jordskokk er en flerårig plante i kurvplantefamilien <strong>og</strong> en nær slektning<br />
av solsikke (Helianthus annus). Den er ganske høy, med gule blomster <strong>og</strong><br />
spiselige knoller. Planten setter ikke modne frø i Norge, som altså vil si at<br />
den formerer seg vegetativt, <strong>og</strong> må bevares som knoller. På 90- tallet ble<br />
40 knoller samlet inn av en arbeidsgruppe for grønnsaker ved Nordisk<br />
Gen Bank (NGB) <strong>og</strong> befinner seg nå hos Bioforsk på Landvik i Grimstad.<br />
Knollene ble samlet inn med tanke på studier på forskjeller mellom dem<br />
<strong>og</strong> fremtidig bevaring av de ulike typene. Knollene i samlingen viser stor<br />
variasjon med henhold til farge <strong>og</strong> form. De er blitt nærmere undersøkt<br />
med tanke på egenskaper ved knoller, stengel, blad <strong>og</strong> blomst. Avling <strong>og</strong><br />
knollstørrelse er <strong>og</strong>så registrert(Asdal, Å).<br />
1
Jordskokk: (Helianthus tuberosus)<br />
2<br />
• Latin: Helianthus tuberosus<br />
• Familie: Korgplantefamilien (Asteraceae)<br />
• Engelsk: Jerusalem artichoke<br />
Stine Kooyman<br />
• Beskrivelse: Flerårig, men dyrkes som ettårig.<br />
Underjordiske stengelknoller, hvite, gule eller rosa. (2n= 102)<br />
• Innholdsstoffer: Inulin i stedet for stivelse.<br />
• Bruk <strong>og</strong> historie: Kokes <strong>og</strong> formeres som poteter<br />
(Aarnes. H)<br />
Mange av plantene i Helianthus-slekten er polyploide (A Brief Overview<br />
of the Compositae, Lettuce and Sunflower). Det betyr at det har foregått<br />
en kromosomal endring som gjør at organismen inneholder mer enn to<br />
komplette kromosomsett (2002, Campell & Reece. #1).<br />
Jordskokken kom opprinnelig fra Nord- Amerika på 1600- tallet. Den<br />
ansees som en grønnsak <strong>og</strong> det diskuteres om den kan være av interesse<br />
for diabetikere på grunn av sitt høye innhold av karbohydratet inulin. Ved<br />
oralt inntak av inulin vil karbohydratet ikke absorberes <strong>og</strong> derfor ikke<br />
påvirke blodsukkernivået, noe som kan gjøre knollen egnet som mat for<br />
diabetikere. Inulin sies <strong>og</strong>så å være foretrukket næring for lactobacillus <strong>og</strong><br />
kan forbedre balansen av denne bakterien i tarmen. Bifidobacteria<br />
fordøyer inulin til ulike syrer hvor av en av syrene påstås å kunne ha<br />
forebyggende effekt på tarmkreft (Spiller, GA. 1994).<br />
Variasjonsstudier hos jordskokk<br />
Det er tidligere gjort lite for å studere genetisk variasjon hos jordskokk,<br />
slike studier vil gi mye nyttig biol<strong>og</strong>isk kunnskap om variasjon hos
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
planter generelt <strong>og</strong> informasjon for bevaring av en viktig historisk <strong>og</strong><br />
fremtidig kulturplante. Det er imidlertid gjort en del for å studere<br />
fenotypisk variasjon, med tanke på knollform, knollfarge,<br />
stengelbehåring, stengelfarge <strong>og</strong> grenethet. Plantene som er innsamlet<br />
viser på disse områdene store variasjoner. Genetisk variasjonsstudier er<br />
gjort på den nært beslektede solsikken, noe som avdekket stor variasjon<br />
mellom amerikanske solsikkestammer (Tang S, Knapp S. J, 2002).<br />
Genetisk variasjon<br />
Genetisk variasjon er den variasjonen som finnes i arvestoffet, innad <strong>og</strong><br />
mellom individer, arter <strong>og</strong> mellom populasjoner. Genetisk variasjon er<br />
viktig for å bevare det biol<strong>og</strong>iske mangfoldet her på jorda. Variasjonen<br />
gjør det mulig for arter å tilpasse seg forandringer i miljøet de lever i.<br />
Genetisk mangfold finnes på individnivå, men <strong>og</strong>så som genetisk<br />
variasjon mellom populasjoner. Genetisk diversitet mellom populasjoner<br />
assosieres med tilpasninger til lokale forhold. Dersom en populasjon dør<br />
ut har arten mistet noe av sin genetiske variasjon som gjør tilpasning<br />
mulig. Den genetiske variasjonen er viktig å bevare fordi den gjør at<br />
dersom miljøet endres kan det finnes populasjoner som kan takle<br />
forandringene <strong>og</strong> populasjoner som ikke takler endringene (Campbell &<br />
Reece, 2002. #2). Ettersom jordskokk kun formerer seg vegetativt i Norge<br />
vil dette begrense den genetiske variasjonen noe.<br />
Metoder for å studere genetisk variasjon<br />
Det er genene, sammen med miljøet som bestemmer en organismes<br />
fenotype. Variasjoner i sammensetning <strong>og</strong> organisering av genene danner<br />
grunnlaget for evolusjonær utvikling. Gjennom studier av den genetiske<br />
variasjonen mellom individer av samme art (slik som i denne oppgaven)<br />
3
4<br />
Stine Kooyman<br />
kan vi lære mye om organismens respons på sykdommer, biol<strong>og</strong>isk<br />
virkemåte til grunnleggende prosesser i kroppen <strong>og</strong> skille mellom<br />
individer. Man kan <strong>og</strong>så lære mer om slektskap mellom arter gjennom<br />
studier av genetisk variasjon. Det finnes mange ulike metoder for å<br />
studere genetisk variasjon. Man kan sammenlikne hele DNA sekvensen til<br />
forskjellige individer, men dette er tidkrevende <strong>og</strong> dyrt. Inntil dette kan<br />
gjøres på en rask <strong>og</strong> billig måte benyttes en lang rekke analysemetoder.<br />
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)<br />
Korte DNA- sekvenser som er repetert flere ganger etter hverandre i<br />
tandem kalles VNTR. Om man da kutter med restriksjonsenzymer vil det<br />
gi fragmenter med ulik lengde avhengig av antall repetisjoner av VNTR.<br />
Dersom man behandler dette i en polyacrylamidgel vil man få ulike bånd<br />
alt ettersom hvor lange fragmentene blir, altså etter hvor mange repeterte<br />
sekvenser som er tilstede. VNTR- fragmentene kan <strong>og</strong>så analyseres ved<br />
hjelp av PCR. Primere vil feste seg på enkelte steder, <strong>og</strong> man vil få<br />
oppformert området mellom dem. Ved ulikt antall VNTR vil fragmentene<br />
få ulik lengde, noe som vil vises på en agarosegel (se figur 3 <strong>og</strong> 4).<br />
Dersom det repeterte elementet er veldig kort (200 eller færre baser)<br />
kalles VNTRen for en mikrosatellitt. Ingen vet akkurat hva disse<br />
segmentene gjør, men de kan ikke være så veldig viktige ettersom at de er<br />
ekstremt variable i lengde, <strong>og</strong> tilfeldig spredt rundt om i genomet. Ved å<br />
utføre PCR med et antall flankerende primere, kan et genetisk<br />
fingeravtrykk dannes, <strong>og</strong> gjøre det mulig å trekke konklusjoner om et<br />
individs identitet <strong>og</strong> genetisk forhold til andre individer, med stor<br />
sikkerhet (Dale,J . von Schantz, M. 2002). Det er først <strong>og</strong> fremst<br />
mikrosatellitter som brukes i denne oppgaven.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)<br />
Det finnes en sekvensvariasjon mellom alleler (genvarianter) som kan<br />
påvises ved at DNA- fragmenter får ulik lengde på grunn av at<br />
restriksjonsseter har oppstått eller blitt fjernet som følge av en punktmutasjon.<br />
Ved RFLP- analyse kuttes DNA med et restriksjonsenzym, dersom<br />
det har skjedd en punktmutasjon <strong>og</strong> et restriksjonssete har blitt fjernet<br />
eller satt inn vil dette gi utslag i ev. kortere eller lenger fragment av DNA<br />
som kuttes. Dersom man etterpå kjører en gel vil man kunne se om<br />
fragmentet kuttes eller ikke.<br />
DNA sekvensering <strong>og</strong> minisekvensering for studier<br />
av variasjon.<br />
I mange tilfeller ønsker man å studere variasjonen i selve DNA-sekvensen<br />
mellom individer. Man vil for eksempel finne hvilken genvariant eller<br />
mutasjon som forårsaker en bestemt sykdom. For å gjøre dette kan man<br />
amplifisere genet, eller deler av det, ved hjelp av PCR <strong>og</strong> videre<br />
sekvensere PCR- produktet. Dersom samme mutasjonen finnes f. eks. hos<br />
alle syke personer, mens ingen analyserte friske personer har det, har man<br />
identifisert en mutasjon som er koblet til sykdommen. Mutasjonen er ikke<br />
nødvendigvis årsak til sykdommen.<br />
Minisekvensering brukes til å finne sekvensen av en DNA- bit hvor<br />
man mistenker at det kan finnes en mutasjon. PCR amplifiserer området<br />
med mulig mutasjon. Primerne hybridiseres like inntil mulig mutasjon.<br />
ddGTP, ddATP, ddTTP <strong>og</strong> ddCTP tilsettes. Dersom disse er merket<br />
forskjellig kan alle blandes i samme rør. DNA- polymerasen inkorporerer<br />
det rette ddXTP avhengig av hvilken nukleotid som er på<br />
punktmutasjonsstedet. Analyse på automatisk sekvenseringsmaskin<br />
detekterer hvilken nukleotid som er innkorporert hvor, altså genotypen.<br />
5
6<br />
Stine Kooyman<br />
Det finnes områder med stor grad av sekvensvariasjon, som for eksempel<br />
mitokondrieområder, som kan sekvenseres.<br />
Microarray<br />
Det finnes mange varianter av microarray. For deteksjon av SNP eller<br />
andre mutasjoner i genomisk DNA brukes metoden som beskrives her.<br />
Oligonukleotid med komplementær sekvens til kjente mutasjoner festes til<br />
et microarray (chip). Et stort antall slike prober (100 000) kan festes til<br />
chippen, noe som gjør at det kan testes for mange mutasjoner. Aktuelle<br />
områder man vil teste for mutasjoner amplifiseres av PCR <strong>og</strong> merkes.<br />
PCR- produktet kan så hybridisere til chippen. Analyse viser hvilke<br />
posisjoner PCR- produktene har hyridisert til <strong>og</strong> følgelig hvilke<br />
mutasjoner/ alleler personen som er testet har. Microarray brukes <strong>og</strong>så i<br />
genekspresjonsstudier.<br />
Problemstilling <strong>og</strong> hypotese<br />
Problemstilling: Det er ønskelig å undersøke grad av genetisk variasjon<br />
mellom de innsamlede plantene. Ettersom det tidligere er gjort svært lite<br />
når det gjelder studier av genetisk variasjonen hos jordskokk er det behov<br />
for et testsystem for deteksjon av DNA- variasjon hos plantene utvikles.<br />
Hypotese: solsikkemarkører kan brukes for å studere den genetiske<br />
variasjonen hos jordskokk.<br />
Nært beslektede organismer ofte har mye likt DNA. Solsikke(Helianthus<br />
annus) <strong>og</strong> jordskokk (Helianthus tuberosus) er så beslektet at de kan<br />
krysses, men dette må gjøres manuelt (The biol<strong>og</strong>y of Helianthus annus<br />
L).
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
I dette prosjektet var hovedmålet å undersøke om genetiske markører fra<br />
solsikke kan benyttes til å etablere et testsystem (plukke ut genetiske<br />
markører som viser variasjon mellom de ulike typene jordskokk) for studier<br />
av genetisk variasjon hos jordskokk.<br />
1: Avella 2: Dagnøytral 4: Søm<br />
6: Kapell 11: Moskva 12: Wuestman<br />
28: Gram 30: Dømmesmoen 37: Elverum<br />
38: Planck<br />
Figur 1: Bildene viser knollene til de 10 plantene som ble plukket ut til forsøket.<br />
7
Hvordan nå målet?<br />
8<br />
Stine Kooyman<br />
Det er viktig å kontrollere om de ulike tingene fungerer. DNA kan være<br />
noe mer problematisk å isolere hos planter på grunn av den sterke<br />
celleveggen. Først ble det isolert DNA fra en plante. For å kontrollere at<br />
DNA- isolering var oppnådd ble det kjørt PCR med en markør fra et av de<br />
få genene isolert fra jordskokk, ettersom dette genet ikke hadde noe navn<br />
refererer vi til markøren som kontroll. Kontrollmarkøren ble brukt som<br />
positiv kontroll, <strong>og</strong> som negativ kontroll ble det brukt vann. Ut fra<br />
resultatene så det ut til at DNA var isolert.<br />
Det ble så isolert DNA fra resten av plantene på samme måte som på den<br />
første (se prosedyre DNeasy Mini Kit). Det ble plukket ut to tilfeldige<br />
planter som så ble kjørt i PCR med alle primerne, for så å sjekke med<br />
agarosegel for å se hvilke primere som virket. De markørene som virket<br />
bestilte jeg merkede markører av, for så å kunne kjøre dem i DNA analyse<br />
maskinen (3130 Genetic Analyzer fra Applied Biosystems). DNA analyse<br />
maskinen vil mer nøyaktig kunne analysere lengden på de ulike<br />
fragmentene som dannes i PCR, <strong>og</strong> målet er å finne primere som virker på<br />
alle plantene, men der plantene viser stor lengdevariasjon i PCR produktene.<br />
DNAet ble <strong>og</strong>så analysert med tanke på DNA-konsentrasjon. Det ble<br />
fortynnet med vann <strong>og</strong> kjørt i spektrofotometer for å se absorbansen ved<br />
260nm <strong>og</strong> 280nm.<br />
Det ble isolert DNA fra 10 innsamlede eksemplarer jordskokk, for så å<br />
plukke ut genetiske markører hos den beslektede arten solsikke som skal<br />
brukes til å undersøke ved hjelp av DNA- analyser (PCR) <strong>og</strong> analyse i<br />
agarosegel for å se om de utvalgte markørene fungerte i jordskokk. Av de
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
markørene som gir PCR- produkt ble den ene delen av primersettet bestilt<br />
på nytt med 5’ende merket med fluoriserende fargestoff. Man vil så<br />
forsøke å bestemme grad av variasjon i markørene som fungerte i<br />
jordskokk ved hjelp av en 3130 Genetic Analyzer, som er en DNA<br />
analyse maskin. De ti plantene som ble undersøkt var plukket ut av<br />
Åsmund Asdal ved Bioforsk med tanke på at de skulle være mest mulig<br />
forskjellige, <strong>og</strong> det ble forventet at plantene derfor skulle vise noe<br />
variasjon i genmateriale. Vi forventet at de plantene som er samlet fra<br />
steder som ligger lengst fra hverandre vil være mest forskjellige. Ettersom<br />
jordskokk ikke formerer seg ved hjelp av frø i Norge, vil dette begrense<br />
den genetiske variasjonen. Den planten som skilte seg mest ut fra de andre<br />
ved første øyekast, var plante nummer 11, Moskva, som hadde en knoll<br />
som er vinrød av farge, hvor de andre knollene er lysebrune. Plantene var<br />
ellers kartlagt med tanke på stengelbehåring, stengelfarge, grenethet,<br />
stilklengde, bladbredde, blomstring, knollform, knollfarge, knollutvekster,<br />
knolltype, knollfarge <strong>og</strong> diverse andre egenskaper av Nordisk GenBank<br />
(Bioforsk)ved Landvik i Grimstad.<br />
Materialer <strong>og</strong> metoder<br />
Innsamling <strong>og</strong> oppbevaring av analysemateriale<br />
Utstyr: Sprittusj, oppbevaringsglass, saks, spirende planter.<br />
Fremgangsmåte<br />
Samlet inn plantevev/ blader fra de ti plantene, fortrinnsvis unge skudd (se<br />
figur 1). Vevet ble plassert i hver sin plastikkpose <strong>og</strong> posene ble merket<br />
godt. Etter innhøsting ble plantevevet lagret ved<br />
-20 °C. Det ble foretrukket ungt materiale fordi det inneholder mer celler<br />
per vekt <strong>og</strong> derfor resulterer i mer DNA. I tillegg inneholder dette<br />
9
10<br />
Stine Kooyman<br />
materialet mindre polysakkarider <strong>og</strong> polyfenoler <strong>og</strong> er derfor letter å<br />
håndtere. Plantene har<br />
tidligere vært studert<br />
med tanke på<br />
knollform, knollfarge<br />
<strong>og</strong> liknende <strong>og</strong> i<br />
sammenheng med dette<br />
blitt nummerert. Vi<br />
brukte det samme<br />
nummersystemet.<br />
Figur 2. figuren viser de ti plantene vi samlet inn<br />
materiale fra.<br />
Plantene vi samlet inn var:<br />
Tabell 1. Tabellen viser plantenavn <strong>og</strong> nummer som ble samlet inn.<br />
Plantenummer Plante navn<br />
1 Avella<br />
2 Dagnøytral<br />
4 Søm<br />
6 Kapell<br />
11 Moskva<br />
12 Wuestman<br />
28 Gram<br />
30 Dømmesmoen<br />
37 Elverum<br />
38 Planck
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev<br />
ved bruk av DNeasy Plant Mini Kit<br />
Utstyr: Plantemateriale, vekt, skalpellblader, veieskip, eppendorfrør,<br />
varmeblokk, mikropistill, is, isoporeske til å ha is i, DNeasy Plant mini kit<br />
fra QIAGEN.<br />
Fremgangsmåte:<br />
1. DNeasy Plante prosedyre er optimalisert for et maksimum av<br />
100mg våt vekt start materiale. Bruk av for mye materiale vil gi<br />
ufullstendig lysering <strong>og</strong> lav renhet.<br />
2. Bruker en mikropistill til å knuse plantemateriale godt. Passet på<br />
at det ikke var klumper i materialet.<br />
3. Tilsatte 400µl av Buffer AP1 <strong>og</strong> 4µl av RNase A stam<br />
løsning(100mg/ml).<br />
4. Inkuberte blandingen i 10minutter ved 65°C. Blandet 2-3ganger<br />
under inkubasjonen ved å vende røret. Dette lyserte cellene <strong>og</strong><br />
bryter ned RNA.<br />
5. Tilsatte 130µl Buffer AP2 til lysatet <strong>og</strong> blandet. Inkuberte i<br />
5minutter på is. Dette steget tok bort detergenter, proteiner <strong>og</strong><br />
polysakkarider.<br />
6. Sentrifugerte i 1 minutt på max speed (14000rpm).<br />
7. Tilsatte lysatet til QIAshredder Mini Spin Column (lilla) plassert i<br />
en 2ml oppsamlingsrør (medfølger i kitet) <strong>og</strong> sentrifugerte i<br />
2minutter ved 20000 x g (14000rpm). Dette fjernet det meste<br />
cellematerialet, men en liten del vil nok ha passert gjennom <strong>og</strong><br />
dannet en pellet i oppsamlingsrøret.<br />
8. Overførte væsken som gikk gjennom membranen fra forrige steg<br />
til et nytt rør uten å forstyrre en eventuell pellet i bunnen av<br />
oppsamlingsrøret.<br />
11
12<br />
Stine Kooyman<br />
9. Tilsatte 1,5 volum Buffer AP3/E til det klare lysatet <strong>og</strong> mikset før<br />
pipettering. Eksempelvis hvis man har 450µl lysat tilsetter man<br />
650µl Buffer AP3/E.<br />
10. Tilsatte 650µl av miksen fra forrige steg, inkludert eventuelt<br />
bunnfall som har blitt dannet, til DNeasy Mini Spin Column i et<br />
2ml oppsamlingsrør (medfølger). Sentrifugerte i 1minutt ved<br />
≥6000x g (korresponderer til ≥8000rpm for de fleste<br />
mikrosentrifuger) <strong>og</strong> kvittet meg med det som gikk gjennom.<br />
DNA er nå festet til filteret.<br />
11. Repeterte forrige trinn, brukte samme oppsamlingsrør.<br />
12. Plasserte DNeasy Mini Spin Column I et nytt 2ml<br />
oppsamlingsrør(medfølger ), tilsatte 500µl Buffer AW (med<br />
etanol tilsatt) til DNeasy Mini Spin Column <strong>og</strong> sentrifugerte i<br />
1minutt ved ≥6000x g (≥8000rpm). Kvittet meg med det som gikk<br />
igjennom <strong>og</strong> brukte samme oppsamlingsrør i neste trinn. Dette<br />
gjøres for å vaske bort uønskede elementer.<br />
13. Tilsatte 500µl Buffer AW til DNeasy Mini Spin Column <strong>og</strong><br />
sentrifugerte i 2minutter ved 20000x g (14000rpm) til å tørke<br />
membranen. Det var viktig å tørke membranen fordi rester av<br />
etanol kunne forstyrre andre reaksjoner.<br />
14. Overførte DNeasy Mini Spin Column til et 1,5ml eller 2ml<br />
mikrosentrifugerør(medfølger ikke) <strong>og</strong> pipetterte 100µl Buffer AE<br />
direkte på mikrosentrifuge membranen. Inkuberte i 5 minutter ved<br />
romtemperatur (15-25°C) <strong>og</strong> sentrifugerte i 1minutt ved ≥6000x g<br />
(≥8000rpm) for å trekke ut DNA. AE er en lavsalt buffer som<br />
fører til at DNA løsner fra filteret <strong>og</strong> isoleres i eget rør.<br />
15. Repeterte forrige trinn èn gang.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
16. Overførte løsningen, som inneholdt DNA, til et eppendorfrør.<br />
Passet på å merke røret godt.<br />
Beregning av DNA- utbytte<br />
For å få en idé om DNA- mengden ble det gjennomført en<br />
konsentrasjonsanalyse med et spektrofotometer av typen Helios gamma<br />
levert av Unicam. Spektrofotometeret ble innstilt på 260nm <strong>og</strong> 280nm.<br />
DNA- konsentrasjonen ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) =<br />
Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml<br />
gir absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning<br />
(35). DNAet ble fortynnet i vann 35x<br />
DNA 7 µl<br />
Destillert Vann 240 µl<br />
Valg av genetiske markører<br />
For å kjøre PCR trengs det primere som er komplementære til deler av<br />
DNA, slik at de kan feste seg. Vi brukte primere som fungerer i Solsikke,<br />
som er nært beslektet med jordskokk. Da ingen genetiske markører er<br />
funnet hos jordskokk, ønsket man å forsøke med markører fra solsikke.<br />
DNA- sekvenser hos nært beslektede arter er ofte veldig lik <strong>og</strong> det er<br />
demonstrert at genetiske markører isolert fra én art ofte kan benyttes til å<br />
studere genetisk variasjon hos andre, beslektede arter. Det måtte først<br />
plukkes ut et utvalg primere som forhåpentligvis skulle virke på<br />
jordskokk. Det ble valgt 6 primere som var listet i artikkelen S. Tang, S.J<br />
Knapp (2002): Microsatellites uncover extraordinary diversity in native<br />
American land races and wild populations of cultivated sunflower<br />
(primere fra genomisk DNA som er funnet å virke på en rekke<br />
angiospermarter), <strong>og</strong> 2 primere fra artikkelen Wills, D.M, Hester M. L<br />
13
14<br />
Stine Kooyman<br />
(2005). Chloroplast SSR polymorphism in the Compositae and the mode<br />
of organellar inheritance in Helianthus annus (primere fra kloroplast<br />
DNA). Vi brukte primere fra kloroplast DNA fordi det kun nedarves fra<br />
morssiden <strong>og</strong> dermed kan være et viktig verktøy <strong>og</strong>så for fremtidige<br />
populasjonsgenetiske studier. Som positiv kontroll brukte vi markør for et<br />
av de få genene isolert fra jordskokk, referert til som kontroll. Markørene<br />
ble bestilt fra MWG- Biotech AG via internett. Markørene som ble bestilt<br />
var:<br />
Tabell 2. Tabellen viser markørnavn <strong>og</strong> nummer.<br />
Navn Nummer<br />
Kontroll (L <strong>og</strong> R) I<br />
ORS 310 (A <strong>og</strong> B) II<br />
ORS 311 (A <strong>og</strong> B) III<br />
ORS 317 (A <strong>og</strong> B) IV<br />
ORS 331 (A <strong>og</strong> B) V<br />
ORS 351 (A <strong>og</strong> B) VI<br />
ORS 388 (A <strong>og</strong> B) VII<br />
ccmp5 (Fwd <strong>og</strong> Rev) VIII<br />
NTCP39 (Fwd <strong>og</strong> Rev) IX<br />
Romertallene bak primernavnene er tallene jeg brukte for å skrive ned<br />
rekkefølger <strong>og</strong> liknende, ved PCR <strong>og</strong> agarosegel.<br />
PCR (Polymerase Chain Reaction)<br />
PCR er en metode som brukes først <strong>og</strong> fremst til å oppformere DNA. PCR<br />
kan brukes til å lage millioner kopier av et bestemt område på DNA.<br />
Templat- DNA, nukleotidene dATP, dCTP, dGTP <strong>og</strong> dTTP (samlet kalt<br />
nNTP), DNA- primere, passende reaksjonsbuffer <strong>og</strong> DNA- polymerase<br />
pipetteres over i PCR- rør. PCR- røret plasseres i en ”Thermocycler”, en
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
maskin som er i stand til å raskt varme opp <strong>og</strong> kjøle ned materialet i<br />
rørene. Det dobbeltrådete DNA som skal oppformeres varmes opp slik at<br />
de to trådene denatureres (går fra hverandre). DNA- polymerasen(Taqpolymerase)<br />
som brukes er isolert fra den termofile (varmeelskende)<br />
bakterien Thermus aquaticus slik at enzymet fortsatt virker under høye<br />
temperaturer. Temperaturen senkes så slik at enkelttrådene kan feste seg<br />
til primere (korte DNA stykker) som er komplementære til sekvensen på<br />
tråden som skal oppformeres(Mullis, K. B & Fallona, F. A (1987)).<br />
Temperaturen heves så <strong>og</strong> Taq- polymerasen syntetiserer DNA fra<br />
3’enden av primerne. Slik får man to nye, like DNA- tråder. Prosessen<br />
gjentas ønsket antall ganger til man har fått nok DNA. Mengden DNA<br />
fordobles med hver runde <strong>og</strong> veksten blir derfor eksponentiell.<br />
For å regulere temperaturendringene brukes en PCR- termosykler som kan<br />
forhåndspr<strong>og</strong>rammeres til det temperaturpr<strong>og</strong>rammet, inkubasjonstid <strong>og</strong><br />
antall sykluser man ønsker å bruke.<br />
15
16<br />
Stine Kooyman<br />
Figur 3: Figuren viser prinsippet ved en PCR- reaksjon hvor målsekvensen er en<br />
mikrosatellitt. PCR- reaksjonen gjentas i ønsket antall sykluser til man har ønsket<br />
mengde DNA.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Figur 4: Figuren til<br />
høyre viser ulike<br />
allel klasser av<br />
mikrosatelitt fragmenter oppformert i PCR. Fragmentene testes så i en gel, hvor<br />
de separeres etter lengde. Man kan se forskjell på individer med ulikt antall<br />
repeterte elementer i mikrosatellitten, ettersom båndene vandrer ulikt på grunn av<br />
ulik lengde.<br />
Prosedyre for PCR<br />
Utstyr<br />
Destillert vann, 10xPCR- buffer, Gold Taq- polymerase, dNTP, markører<br />
som listet tidligere, PCR- rør, PCR maskin (GeneAmp PCR System<br />
9700), pipetter, pipettespisser, engangshansker.<br />
Generelt<br />
På grunn av den enorme amplifikasjonen som er mulig med PCR, vil selv<br />
små nivåer av DNA kontaminering, spesielt fra tidligere PCR<br />
amplifiseringer, prøver med høye DNA nivåer <strong>og</strong> positiv kontroll<br />
templater, resultere i produktdannelse selv når DNA ikke er tilsatt med<br />
vilje. Om mulig burde alle reaksjoner settes opp i et område separat fra<br />
PCR produkt analyse. Bruk av engangsinstrumenter, løsninger <strong>og</strong> pipetter<br />
til DNA preparering, reaksjons miksing <strong>og</strong> prøveanalyse vil redusere fare<br />
for kontaminering.<br />
17
18<br />
Stine Kooyman<br />
Prosedyre<br />
En master miks av reagenser (vann, buffer, dNTP, PCR- primere <strong>og</strong><br />
enzymer) for alle prøvene forberedes først, mengde lages etter hvor<br />
mange prøver som skal analyseres, <strong>og</strong> fordeles i hvert sitt rør. Templat<br />
DNA tilsettes så.<br />
Oppskrift på reaksjonsmiks i et rør:<br />
Destillert vann 17,80 µl<br />
10X PCR buffer II 2,50 µl<br />
10mM dNTP 0,50 µl<br />
Primer 1 (5pmol/ µl) 1,50 µl<br />
Primer 2 (5pmol/ µl) 1,50 µl<br />
AmpiTaq Gold DNA Polymerase 0,20 µl<br />
Templat DNA 1,00 µl<br />
Total miks 25,00 µl<br />
Plasserte PCR-rørene i PCR maskinen (GeneAmp PCR System 9700) <strong>og</strong><br />
pr<strong>og</strong>rammerte inn temperatur <strong>og</strong> tid. Stilte inn PCR maskinen på 37<br />
sykluser.<br />
95°C 10 min<br />
94°C 45 sek<br />
52°C 45 sek >37sykler<br />
72°C 45 sek<br />
72°C 7 min<br />
4°C ∞
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Med 95°C i 10 minutter, 94°C i 45 sekunder, 52°C i 45 sekunder, 72°C i<br />
45 sekunder, 72°C i 7 sekunder <strong>og</strong> når selve prosessen er ferdig 4°C<br />
resten av tiden.<br />
Prosedyre av laging av agarose gel elektroforese<br />
Bakgrunn<br />
Agarose gel elektroforese er den enkleste <strong>og</strong> vanligste måten å separere<br />
DNA etter størrelse <strong>og</strong> analysere DNA på. Prinsippet baserer seg på at<br />
makromolekyler separeres på bakgrunn av sin bevegelsesfart gjennom<br />
gelen i et elektrisk felt(Campbell & Reece, 2002. #3). For DNA er<br />
migrasjonsraten, hvor langt molekylet beveger seg mens strømmen er på,<br />
invers proporsjonal med molekylets størrelse. Nukleinsyrer har negativt<br />
ladde fosfatgrupper proporsjonale til sin lengde, men fibrene i gelen<br />
forhindrer bevegelse av lange fragmenter mer enn korte. DNA avsettes i<br />
små brønner på den negativt ladde polen av gelen, når strømmen slåes på,<br />
vandrer de mot den positive polen på grunn av de negativt ladde<br />
fosfatgruppene. Meningen med gelen kan være å se på DNA eller isolere<br />
et spesielt bånd. DNA visualiseres i gelen ved å tilsette ethidiumbromid.<br />
Dette binder sterkt til DNA ved å interkalere mellom basene <strong>og</strong> er<br />
fluoriserende, som betyr at det absorberer usynlig UV lys <strong>og</strong> overfører<br />
energien som synlig lys. Ulike konsentrasjoner av gelene fører til ulik<br />
oppløsning på gelen, slik at man noen ganger må prøve seg fram for å<br />
finne den konsentrasjonen som separerer fragmentene best.<br />
Laging av 2% agarosegel (2% gel, 100ml).<br />
Utstyr: Veieskip, agarose, vekt, erlenmeyerkolbe, 1x TAE,<br />
mikrobølgeovn, ethidiumbromid.<br />
19
20<br />
Stine Kooyman<br />
1. Veide opp 2g agarose i en 250ml erlenmeyerkolbe. Tilsatte 100ml<br />
1xTAE, ristet forsiktig for å mikse.<br />
2. Satte i mikrobølgeovn i ca 1minutt for å løse opp agarosen.<br />
3. Lot løsningen stå på benken <strong>og</strong> kjøle seg ned til ca 60 °C.<br />
4. Tilsatte 5 µl etidiumbromid(10 µg/ µl) <strong>og</strong> ristet forsiktig for å<br />
blande.<br />
5. Satte i kammen <strong>og</strong> sjekket at den var korrekt satt i. Helte gelen<br />
sakte over på tanken <strong>og</strong> passet på at det ikke ble luftbobler.<br />
6. Lot gelen stå å stivne.<br />
7. Helte 1x TAE buffer i geltanken <strong>og</strong> over gelen slik at bufferen<br />
gikk 2-5mm over gelen. Dette var kjøringsbufferen.<br />
Forberedelse av prøvene:<br />
Loadingbufferen bestod av 50% glyserol <strong>og</strong> Bromfenolblått.<br />
Størrelsesstandarden som ble brukt var 1kb Plus fra Invitr<strong>og</strong>en.<br />
Loadingbuffer 2,0 µl<br />
PCR produkt 2,0 µl<br />
(eller 1 µl størrelsesstandard)<br />
Destillert vann 6,0 µl<br />
Totalt volum 10 µl<br />
Etter at gelen var stivnet <strong>og</strong> kammen tatt ut ble DNA prøvene blandet med<br />
loadingbuffer <strong>og</strong> vann <strong>og</strong> 10 µl ble pipettert over i brønnene. Passet på å<br />
merke meg hvilken rekkefølge prøvene ble avsatt i.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Nybestilling av PCR- primere med<br />
fluorescensmerket5’ende<br />
Etter vurdering av resultatene på agarosegelen ble markør II(ORS 310)<br />
forkastet, <strong>og</strong> primere til resten av markørene ble bestilt på nytt fra Applied<br />
Biosystems merket med fluoriserende fargestoff i 5’enden. Kun den ene<br />
halvdelen av hvert primersett ble bestilt på nytt.<br />
Tabell 3. Tabellen viser hvilken del av primersett som ble bestilt på nytt, hva de<br />
ble merket med <strong>og</strong> hvilken primerdel som ble merket.<br />
Navn Nummer Merket del Merket med<br />
Kontroll (L <strong>og</strong> R) I L 6- FAM<br />
ORS 311 (A <strong>og</strong> B) III A VIC<br />
ORS 317 (A <strong>og</strong> B) IV A NED<br />
ORS 331 (A <strong>og</strong> B) V A 6- FAM<br />
ORS 351 (A <strong>og</strong> B) VI A VIC<br />
ORS 388 (A <strong>og</strong> B) VII A NED<br />
ccmp5 (Fwd <strong>og</strong> Rev) VIII Fwd 6- FAM<br />
NTCP39 (Fwd <strong>og</strong> Rev) IX Fwd VIC<br />
De fluoriserende fargene:<br />
6- FAM: fluoriserende blå<br />
VIC: fluoriserende grønn<br />
NED: fluoriserende gult<br />
PCR med merkede primere<br />
PCR miks:<br />
Destillert vann 17,8 µl<br />
10x PCR buffer 2,5 µl<br />
dNTP 0,5 µl<br />
21
22<br />
Gold Taq- polymerase 0,12 µl<br />
Primer 1 (5pmol/ µl) 1,5 µl<br />
Primer 2 (5pmol/ µl) 1,5 µl<br />
DNA 1 µl<br />
Totalt PCR- volum 25 µl<br />
Stine Kooyman<br />
PCRen ble kjørt på samme måte som tidligere, men antall sykluser ble<br />
endret til 28 på grunn av at 3130 Genetic Analyzer har et meget sensitivt<br />
detektorsystem <strong>og</strong> vi trenger derfor ikke så mye DNA.<br />
Forberedelse av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer:<br />
HiDi Formamid 9,8 µl<br />
Størrelses standard (LIZ 500) 0,2 µl<br />
PCR- produkt 1,0 µl<br />
Analyser av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer<br />
PCR- produktet, størrelsesstandarden samt HiDi formamid ble pipettert<br />
opp i en 96- brønners PCR- plate <strong>og</strong> satt inn i 3130 Genetic Analyzer. Når<br />
brettet ble satt inn, ble det på en tilhørende datamaskin laget et oppsett for<br />
hvilken brønn som inneholdt hvilken prøve <strong>og</strong> maskinen ble fortalt<br />
hvilken størrelsesstandard som ble brukt. 3130 Genetic Analyzer fungerte<br />
på den måten at den har 4 kapillærrør fylt med en polymer som fungerer<br />
på tilsvarende måte som en gel, nemlig ved å separere fragmentene etter<br />
størrelse. Når prøven passerer en laser, gir de merkede fragmentene fra<br />
seg et lysglimt som blir registrert av et kamera <strong>og</strong> omgjort til en ”topp” på<br />
skjermen på datamaskinen (Se figur 7). Den maskinen som ble brukt<br />
hadde 4 kapillærrør <strong>og</strong> kunne altså analysere 4 prøver om gangen.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Resultater<br />
Resultater fra agarosegel<br />
Kjørte PCR i 37 sykluser med alle plantene <strong>og</strong> markør I(Kontroll) for å se<br />
om vi hadde DNA, etterfulgt av analyse i 1% agarosegel. Kjørte <strong>og</strong>så PCR<br />
for resten av markørene på plante 11 <strong>og</strong><br />
12. Fikk resultat, men det var vanskelig å<br />
tolke ettersom gelen ikke separerte<br />
fragmentene godt nok. Testet prøvene en<br />
gang til på 2 % agarosegel <strong>og</strong> fikk da<br />
lesbare resultater. For å kunne se på resultatene<br />
av agarosegelen ble det brukt en<br />
UV-boks med et digitalkamera i slik at<br />
bildene av gelene (som det nedenfor)<br />
kunne lagres på en minnebrikke, eller<br />
skrive ut direkte.<br />
Figur 5. Figuren viser 1kb<br />
Plus DNA Ladder på 0,9%<br />
agarosegel farget med<br />
etidiumbromid.<br />
Justerte antall PCR- sykluser til 35 <strong>og</strong> kjørte så PCR med alle primerne på<br />
plantene 4 <strong>og</strong> 6 for å teste de nye PCR- betingelsene <strong>og</strong> analyserte PCRproduktene<br />
i agarosegel (2 %). Båndene ble klare <strong>og</strong> fine(data ikke vist).<br />
På alle gelene ble det <strong>og</strong>så satt på en størrelsesstandard (1kb Plus DNA<br />
Ladder) for å indikere lengden på fragmentene.<br />
Kjørte så PCR der jeg testet alle plantene for alle primerne<br />
(satte opp annealingtemperaturen i PCR- profilen til 59 grader).<br />
23
24<br />
Figur 6a)<br />
Figur 6b)<br />
Figur 6c)<br />
Stine Kooyman
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Figur 6 a, b <strong>og</strong> c. Figuren viser resultatene fra analysen av PCR- produkt i 2%<br />
agarosegel. Det første sporet på hver rekke er alltid størrelsesstandard. Tallene<br />
over sporene markerer hvilken plante som er testet, <strong>og</strong> minustegnet markerer<br />
negativ kontroll. Figur 5A viser resultatet av agarosegel med PCR- produkt med<br />
markør II (ORS 310), III (ORS 311) <strong>og</strong> IV (ORS 317) på alle plantene. Figur 5B<br />
viser resultater fra agarosegel med PCR- produkt med markør V(ORS 331), VI<br />
(ORS 338) <strong>og</strong> VII (ORS 351) på alle plantene. Figur 5C viser resultatene fra<br />
agarosegeltesting med av PCR- produkt med markør VIII(ccmp5) <strong>og</strong><br />
IX(NTCP39).<br />
Fra figuren kan vi se at det ikke ble resultat på plante 37 <strong>og</strong> 38 på noen av<br />
primerne. Det er da trolig at DNA- isoleringen har vært mislykket <strong>og</strong> dette<br />
ble gjort på nytt. På resultatet fra markør II (ORS 310) kan man ikke se<br />
bånd <strong>og</strong> det konkluderes med at primeren ikke har virket. Resultatene fra<br />
markør III (ORS 311) <strong>og</strong> IV (ORS 317) er det klare bånd <strong>og</strong> vi<br />
konkluderer med at primerne har virket. Båndene fra markør V(ORS 331)<br />
er klare <strong>og</strong> tydelige <strong>og</strong> primerne har virket. Resultatene fra VI (ORS 338)<br />
<strong>og</strong> VII (ORS 351) er noe mer uklare, uten at vi kan si hvorfor, men disse<br />
forkastes ikke fordi det er interessant å se hva som blir resultatet av<br />
analysen i 3130 Genetic Analyzer. Resultatene fra markør VIII(ccmp5) <strong>og</strong><br />
IX(NTCP39) er <strong>og</strong>så klare <strong>og</strong> tydelige <strong>og</strong> primerne har virket. Med<br />
utgangspunkt i disse resultatene ble markørene I(Kontroll L), III(ORS 311<br />
A), IV(ORS 317 A), V(ORS 331 A), VI(ORS 351 A), VII(ORS 388 A),<br />
VIII(ccmp5 Fwd) <strong>og</strong> IX(NTCP39 Fwd) bestilt på nytt, med 5’ merket<br />
ende. Vi konkluderte med at markør II ikke fungerte, <strong>og</strong> forkastet denne.<br />
Markør I, som er Kontrollmarkøren(I) brukt til positiv kontroll bestilte vi<br />
<strong>og</strong>så merket av, men den ble ikke testet i bildene vist over fordi den er<br />
positiv på alle plantene(data ikke vist).<br />
25
Resultater fra DNA- utbytte analyse<br />
Plantenavn/nr.<br />
26<br />
Abs.<br />
260nm<br />
Abs.<br />
280nm<br />
Forhold abs.<br />
260nm/280nm<br />
Stine Kooyman<br />
Konsentrasjon<br />
(µg/ml)<br />
1: Avella 0,34 0,029 1,72 595<br />
2: Dagnøytral 0,129 0,098 1,316 225,75<br />
4: Søm 0,143 0,109 1,311 250,25<br />
6: Kapell 0,069 0,065 1,061 120,75<br />
11: Moskva 0,179 0,084 2,13 313,25<br />
12: Wuestman 0,057 0,035 1,628 99,75<br />
28: Gram 0,041 0,025 1,64 71,75<br />
30: Dømmesmoen 0,025 0,018 1,388 43,75<br />
37: Elverum -0,023 -0,03 0,766 0<br />
38: Planck 0,054 0,038 1,421 94,5<br />
Tabell 4. Tabellen viser resultatene fra absorbansmålingene på DNA. DNAkonsentrasjonen<br />
ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) =<br />
Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml gir<br />
absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning (35).<br />
Forholdet mellom absorbansen ved 260nm <strong>og</strong> 280nm burde egentlig være<br />
over 1,8, resultater lavere enn dette kan tyde på forurensninger. Siden det<br />
kreves svært små mengder DNA til PCR- reaksjonen vil ikke dette ha<br />
noen innvirkning på forsøkene. Absorbansen hos plante 37 ble negativ <strong>og</strong><br />
DNA- konsentrasjonen ble satt til null. Det er likevel noe DNA tilstede<br />
ettersom planten får resultat med to av markørene.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Resultater fra 3130 Genetic Analyzer<br />
Figur 7: Figuren viser resultater fra plante nummer 6 (øverst), 11 <strong>og</strong> 12 testet<br />
med markør VI(ORS 351). De grønne toppene er PCR- produktene. De oransje<br />
toppene er størrelsesstandarden. Den rosa streken i toppen hos plante 6 <strong>og</strong> 12<br />
indikerer at den grønne toppen er så høy at den går ut av skalaen i pr<strong>og</strong>rammet.<br />
Figur 6 illustrerer hvordan resultatene vil være når PCR- produktene har<br />
blitt analysert i 3130 Genetic Analyzer. Slike figurer fikk man for alle<br />
plantene testet med de ulike markørene(data ikke vist). De grønne toppene<br />
på figuren er det samme som et bånd i en gel. Fordelen med å bruke 3130<br />
Genetic Analyzer er at den med stor nøyaktighet angir lengden på PCRproduktene.<br />
27
28<br />
Stine Kooyman<br />
Plantenr./navn I: Kontroll III: ORS 311 IV: ORS 317 V: ORS 331<br />
1: Avella 176, 179<br />
2: Dagnøytral 176, 179<br />
4: Søm 176, 179<br />
6: Kapell 176, 179<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
11: Moskva 176, 179 342, 346 183, 185 179<br />
12: Wuestman 176, 179<br />
28: Gram 176, 179<br />
30: Dømmesmoen 176, 179<br />
37: Elverum 176, 179<br />
38: Planck 176, 179<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
342, 346, 350,<br />
355<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
180, 187,<br />
191, 193 179<br />
Tabell 5. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de<br />
ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene<br />
indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at<br />
denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Plantenr./navn VI: ORS 351 VII: ORS 388 VIII: ccmp5 IX: NTCP39<br />
1: Avella 262 - 94 170<br />
2: Dagnøytral 262 - 94 170<br />
4: Søm 262 - 94 170<br />
6: Kapell 262 - 94 170<br />
11: Moskva 247, 257, 284 - 94 160<br />
12: Wuestman 262 - 94 170<br />
28: Gram 262 - 94 170<br />
30: Dømmesmoen 262 - 94 170<br />
37: Elverum - 94<br />
38: Planck 262 - 94 170<br />
Tabell 6. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de<br />
ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene<br />
indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at<br />
denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten.<br />
Det var kun ccmp5 som virket på plante 37 ved første kjøring. Plante 12<br />
ble blank på ORS 311(III). Plante 37 ble kjørt på nytt med ulike PCR<br />
mikser, en der alle primerne ble tester, men DNA- templatvolumet var<br />
1,5µl <strong>og</strong> en der DNA- templatvolumet var 2µl. Disse ble kjørt om igjen <strong>og</strong><br />
det ble da bra resultat på plante 12, men plante 37 virket kun på markør<br />
ORS 311, <strong>og</strong> gav svake resultater. Markør VII (ORS 388) gav ingen<br />
synlige produkt på noen av plantene. Selv ikke etter gjentatte forsøk med<br />
varierende PCR- betingelser.<br />
29
Diskusjon<br />
DNA- isolering<br />
30<br />
Stine Kooyman<br />
DNA- isoleringen fungerte bra, men det var viktig å knuse plantene godt.<br />
Selv om jeg behandlet alle plantene likt på alle måter viste det seg likevel<br />
at det var behov for å isolere DNA på nytt fra henholdsvis plante 37 <strong>og</strong><br />
38. Disse ble <strong>og</strong>så behandlet likt under isoleringen, men likevel var det<br />
dårlig DNA- utbytte på plante 37. Det er uvisst hvorfor dette var tilfelle,<br />
men denne planten krevde ny isolering av DNA, noe det ikke var<br />
anledning til ettersom det var for tidkrevende <strong>og</strong> krevde mer<br />
plantemateriale.<br />
DNA- utbytte analyser<br />
I tabell 4 ser vi at forholdet mellom 260nm <strong>og</strong> 280nm var lavere enn 1,8.<br />
Dette kan bety at det er forurensninger tilstede som for eksempel proteiner<br />
<strong>og</strong> rester fra DNA isoleringen. I vårt tilfelle betydde det mindre at DNAkonsentrasjonen<br />
var lav <strong>og</strong> forholdet var lavt fordi vi trengte svært små<br />
mengder DNA for at PCR- reaksjonen skulle fungere. På plante 37 fikk vi<br />
negative verdier på absorbansen <strong>og</strong> DNA- konsentrasjonen kan regnes ut<br />
til å bli negativ. Dette er selvsagt ikke mulig, <strong>og</strong> DNA- konsentrasjonen<br />
ble satt til null. Det at absorbansen ble negativ i spektrofotometeret<br />
skyldes nok at det var veldig små mengder DNA tilstede, <strong>og</strong> med de<br />
naturlige svingningene i spektrofotometeret kan nok dette skje. Planten<br />
gav likevel resultater på markør I (Kontroll) på agarosegel <strong>og</strong> markør III<br />
(ORS 311) <strong>og</strong> VIII (ccmp5), så det tyder på at det var noe DNA- tilstede,<br />
bare ikke nok til å få reaksjon på alle markørene.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
3130 Genetic Analyzer<br />
I: Kontroll<br />
Alle plantene var like på dette området. Det var to bånd, et på ca 176 <strong>og</strong><br />
en på 189. Det kan være lengdeforskjeller hvor det ene kromosomet har<br />
en lengde <strong>og</strong> det andre kromosomet en annen. Vi kan spekulere i om<br />
individene er heterozygote. I <strong>og</strong> med at 189 toppen er kraftig vil<br />
fortynning antagelig føre til at det kun blir resultat på den. Blankt resultat<br />
på plante 37.<br />
III: ORS 310<br />
Alle plantene hadde bånd på 342, 346, 350 <strong>og</strong> 355 basepar. Plante 37 gav<br />
resultat på denne markøren, men noe svakere enn de andre plantene, som<br />
kan komme av at det ser ut til at det var dårlig utbytte av DNAisoleringen.<br />
Plante 11 skilte seg noe ut, den hadde kun bånd på 342,346.<br />
Det er sannsynlig at alle plantene her er heterozygote.<br />
IV: ORS 317<br />
Alle plantene var like utenom plante 11. Det ble blankt resultat på plante<br />
37. De fleste plantene hadde bånd på 180, 187, 191 <strong>og</strong> 193 basepar, plante<br />
11 hadde bånd på 185 <strong>og</strong> 183 basepar. Der var ellers ganske mange bånd<br />
<strong>og</strong> det var vanskelig å si hva som stemmer, det måtte eventuelt gjøres flere<br />
analyser. Det var vanskelig å si hvorfor nr 11 hadde to bånd <strong>og</strong> de andre<br />
fire, det kunne være uspesifikke bånd. Normalt ville man forvente et eller<br />
to bånd alt ettersom om planten er homo- eller heterozygot. Flere bånd<br />
kan komme av at jordskokk en gang i evolusjonen har hatt en dobling av<br />
kromosomene, den er polyploid. I enkelte artikler hevdes den å være<br />
31
32<br />
Stine Kooyman<br />
triploid. Det vil da være mulig med flere topper alt ettersom om det<br />
enkelte kromosomsettet er homo- eller heterozygot. I <strong>og</strong> med at de andre<br />
var så like, men at plante 11 kun hadde to bånd kunne man spekulere i om<br />
dette ikke er tilfeldig, men at det virkelig er en forskjell, dette krever<br />
imidlertid mer analysering.<br />
V: ORS 331<br />
Alle plantene var like <strong>og</strong> hadde høye bånd på 179 basepar. De kan sies å<br />
være homozygote.<br />
VI: ORS 351<br />
Alle plantene utenom plante 11 hadde bånd på 262 basepar, disse kan<br />
være homozygote. Kun nummer 11 hadde bånd på 247, 257 <strong>og</strong> 284<br />
basepar, <strong>og</strong> kan sies å være heterozygot. Blankt resultat på plante 37.<br />
VII: ORS 388<br />
Denne primeren ble blank på to av to kjøringer(data ikke vist). Ut fra<br />
resultatene når denne ble testet på agarosegel, var båndene veldig uklare<br />
<strong>og</strong> mange. Den ble tatt med i bestillingen av merkede primere fordi man<br />
var nysgjerrig på hva resultatet ville bli. Ut fra disse resultatene<br />
konkluderes det med at primeren ikke har virket.<br />
VIII: Ccmp5<br />
Alle plantene har bånd på 94 basepar. Svakt resultat på plante 37.<br />
IX: NTCP39<br />
Alle plantene utenom plante 11 har bånd på 170 basepar. Plante 11 har<br />
bånd på 160 basepar. Blankt resultat på plante 37.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Generelt<br />
Markørene vi hadde valgt var markører som viste stor variasjon(stor grad<br />
av heterozygoti) når de ble brukt på solsikke. Jordskokken viser <strong>og</strong>så noe<br />
heterozygoti. Plantene viser lite variasjon seg imellom, men viser at det<br />
finnes stor variasjon med tanke på antall alleler. Ut fra resultatene kan det<br />
se ut som de fleste plantene er veldig like på de markørene som ble testet,<br />
med unntak av plante 11 (Moskva) som skiller seg ut på noen punkter.<br />
Dette er <strong>og</strong>så den planten som ved første øyekast skiller seg<br />
utseendemessig mest fra de andre fordi den har en vinrød farge på<br />
knollen, mens de knollene fra de andre plantene er nokså like med<br />
lysebrun farge (se Figur 1). Plante 11 var lik de andre plantene på markør<br />
I (Kontroll), III (ORS 311) <strong>og</strong> VIII (ccmp5). På markør IV (ORS 317) er<br />
den helt ulik de andre plantene. På markør V (ORS 331), VI (ORS 351)<br />
hadde den henholdsvis to <strong>og</strong> et bånd til felles med de andre plantene. På<br />
markør IX (NTCP35) var den helt ulik de andre plantene.<br />
På plante 37(Elverum) fikk man kun resultat på markør III <strong>og</strong> VIII, man<br />
kan spekulere i om dette var på grunn av dårlig templat- DNA. Plante 37<br />
krever ny isolering av DNA <strong>og</strong> spesiell rensing <strong>og</strong> ny undersøkelse av<br />
eksisterende DNA. Dette er for tidkrevende <strong>og</strong> krever <strong>og</strong>så ny innsamling<br />
av plantemateriale, noe som ikke lar seg gjøre i løpet av prosjektet. Dette<br />
vil selvsagt bli gjort når man bestemmer seg for mer inngående studier av<br />
plantene <strong>og</strong> andre planter i samlingen til Genressursutvalget for planter.<br />
Fenotypisk variasjon<br />
De ulike plantene i dette prosjektet ble som tidligere nevnt plukket på det<br />
grunnlag at de var forventet å være mest mulig forskjellige. Plantene viser<br />
33
34<br />
Stine Kooyman<br />
stor variasjon når det gjelder knollform, knollfarge <strong>og</strong> knollstørrelse, men<br />
det er <strong>og</strong>så store variasjoner når det gjelder stengelbehåring, stengelfarge<br />
<strong>og</strong> grenethet. De fenotypiske ulikhetene kan skyldes miljøet, men det er<br />
trolig at det <strong>og</strong>så er genetiske ulikheter mellom disse plantene. Plantene<br />
ser utseendemessig forskjellige ut, men er like på genotype på de<br />
markørene som ble testet, dette kan muligens skyldes at markørene ligger<br />
i områder med lite mutasjoner. Ut fra disse forsøkene kan man kun<br />
spekulere ettersom det må gjøres videre undersøkelser for å finne grad av<br />
genetisk variasjon.<br />
Konklusjon<br />
7/9 (ca 77%) av de testede primerne virket. Dette viser at markørene er<br />
egnet til å studere genetisk variasjon hos jordskokk. Markør II(ORS 310)<br />
<strong>og</strong> VII(ORS 351) virket ikke. For å få mer kunnskap om den genetiske<br />
variasjonen hos jordskokk må flere planter undersøkes <strong>og</strong> flere markører<br />
testes.
Genetisk variasjon hos jordskokk<br />
Kilder<br />
Asdal, Å, Bevaring <strong>og</strong> utnytting av genressurser i grønnsaker. Cited 2006-<br />
Mai-7. Tilgjengelig fra:<br />
http://www.genressurser.no/planter/documents/Genressurserigron<br />
nsaker1.pdf<br />
A Brief Overview of the Compositae, Lettuce and Sunflower. Cited 2006-<br />
Mai-9.Tilgjengelig fra:<br />
http://compositdb.ucdavis.edu/compositae_overview.php<br />
Campbell, N. A & Reece, J. B (2002). Biol<strong>og</strong>y 6 th edition. #1, pp glossery:<br />
polyploydi. Pearson Benjamin Cummings Publishing Company.<br />
Aarnes. H. Kulturplanter. Cited 2006- Mai-01. Tilgjengelig fra:<br />
http://biol<strong>og</strong>i.uio.no/plfys/haa/littav/NYTTE.pdf<br />
Spiller, GA (1994). Dietary Fiber in Health and Nutrition. Boca<br />
Raton, Florida: CRC Press. Cited 2006- Mars- 22. Tilgjengelig<br />
fra: http://medherb.com/92INULIN.HTM<br />
Tang S, Knapp S. J. (2002). Microsatellites uncover extraordinary diversity<br />
in native American land races and wild populations of cultivated<br />
sunflower. Springer- Verlag<br />
35
36<br />
Stine Kooyman<br />
Wills, D.M, Hester M. L (2005). Chloroplast SSR polymorphism in the<br />
Compositae and the mode of organellar inheritance in Helianthus<br />
annus.<br />
Mullis, K. B & Fallona, F. A (1987). Spesific synthesis of DNA in vitro<br />
via a polymerase- catalyzed chain reaction. Methods in enzymol<strong>og</strong>y<br />
155, 335-350.<br />
Dale,J . von Schantz, M. 2002, From genes to genomes. Pp 209- 225. John<br />
Wiley & Sons Ltd.<br />
Canadian Food Inspection Agency Plant Products Directorate Plant Biosafety<br />
Office. Biol<strong>og</strong>y Document BIO2005-01: The Biol<strong>og</strong>y of<br />
Helianthus annuusL. Cited 2006- Mai- 20. Tilgjengelig fra:<br />
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dir/dir0501e.shtml<br />
#B3<br />
Campbell & Reece (2002) Biol<strong>og</strong>y 6 th edition. #3. pp 384.Pearson Benjamin<br />
Cummings Publishing Company.<br />
Campbell & Reece (2002) Biol<strong>og</strong>y 6 th edition, #2. pp 1225. Pearson Benjamin<br />
Cummings Publishing Company.