27.07.2013 Views

Forord - Skog og landskap

Forord - Skog og landskap

Forord - Skog og landskap

SHOW MORE
SHOW LESS

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

Genetisk variasjon hos jordskokk.<br />

Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i<br />

Stine Kooyman<br />

2006<br />

Institutt for naturvitenskapelige fag<br />

Fakultet for realfag<br />

Høgskolen i Agder, Kristiansand


© Stine Kooyman 2006<br />

HiA Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i, referansenr.: 008 - Bio<br />

Innlevert som oppgave i emnet: Bio300 Bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i, v-2006,<br />

under veiledning av Førsteamanuensis Audun Slettan<br />

Alle rettigheter reservert. Ingen deler av denne oppgaven kan kopieres uten<br />

tillatelse fra forfatteren.<br />

Bilde, Forside: http://www.jardin-mundani.org/compositae/aguaturmasZ.jpg<br />

Bilde, Innledning: http://forum.funghiitaliani.it/uploads/post-72-<br />

1102024925_thumb.jpg&imgrefurl=http://forum.funghiitaliani.it/index.php%3Fshowtopic%<br />

3D14829&h=635&w=800&sz=87&tbnid=9U3Mol7Ip2HDRM:&tbnh=112&tbnw=142&hl<br />

=no&start=3&prev=/images%3Fq%3Dhelianthus%2Btuberosus%26svnum%3D10%26hl%<br />

3Dno%26lr%3D<br />

II


<strong>Forord</strong><br />

Denne bacheloroppgaven om genetisk variasjon hos jordskokk ble<br />

igangsatt av Høgskolen i Agder, fakultet for realfag, i samarbeid med<br />

Bioforsk avdeling Grimstad, i forbindelse med oppnåelse av bachelorgrad i<br />

Biol<strong>og</strong>i.<br />

Det praktiske <strong>og</strong> teoretiske arbeidet i forbindelse med denne oppgaven<br />

ble utført i perioden januar 2006- mai 2006.<br />

Veileder gjennom hele prosessen har vært førsteamanuensis ved Høgskolen<br />

i Agder, Audun Slettan. Tusen takk for all hjelp, støtte <strong>og</strong> inspirasjon. Jeg<br />

vil <strong>og</strong>så takke Åsmund Asdal ved Bioforsk i Grimstad for hjelp med<br />

innhøsting av plantemateriale, informasjon om plantene <strong>og</strong> utvelgelse av<br />

aktuelle planter.<br />

Til slutt vil jeg takke min samboer, Oddbjørn Haaland, for hjelp med laging<br />

av PCR- figurene, <strong>og</strong> diverse annen dataassistanse.<br />

Høgskolen i Agder. 22. mai 2006<br />

Stine Kooyman<br />

III


Sammendrag<br />

Denne bacheloroppgaven handler om genetisk variasjon hos jordskokk.<br />

Med tanke på fremtidig bevaring av kulturplanten jordskokk, har jeg i<br />

denne oppgaven hatt som mål å etablere en metode for å studere genetisk<br />

variasjon hos denne planten. Det ble isolert DNA fra jordskokk ved hjelp<br />

av DNeasy Plant Mini- kit fra Qiagen. Det ble bestilt primere som tidligere<br />

hadde vert brukt på den nære slektningen solsikke, <strong>og</strong> det ble kjørt PCR<br />

med disse. PCR- produktene ble så kjørt i en 2% agarosegel for å se om de<br />

hadde virket. Primerene som virket ble bestilt på nytt, men fluoriserende 5’ende.<br />

Det ble så kjørt en ny PCR med de merkede primerne, <strong>og</strong> PCR-<br />

produktet fra denne kjøringen ble satt inn i 3130 Genetic Analyzer for<br />

automatisk analyse. Etter analysen i 3130 Genetic Analyzer ble råmaterialet<br />

gjennomgått <strong>og</strong> resultatene ført ned i tabeller. Gjennom bruk av PCR,<br />

gelelektroforese <strong>og</strong> automatisk analyse av PCR- produkter i 3130 Genetic<br />

Analyzer har man fått etablert en metode for å se på den genetiske variasjonen.<br />

IV


Innhold<br />

Innledning 1<br />

Jordskokk 1<br />

Genetisk variajon 3<br />

Metoder for å studere genetisk variasjon 3<br />

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) 4<br />

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) 5<br />

DNA sekvensering <strong>og</strong> minisekvensering for studier av variasjon 5<br />

Microarray 6<br />

Problemstilling <strong>og</strong> hypotese 6<br />

Hvordan nå målet? 8<br />

Materialer <strong>og</strong> metoder 9<br />

Innsamling <strong>og</strong> oppbevaring av analysemateriale 9<br />

Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev ved bruk av<br />

DNeasy Plant Mini Kit 11<br />

Beregning av DNA- utbytte 13<br />

Valg av genetiske markører 13<br />

PCR (Polymerase Chain Reaction) 14<br />

Prosedyre for PCR 17<br />

Prosedyre for laging av agarose gel elektroforese 19<br />

Nybestilling av PCR- primere med fluorescensmerket5’ende 21<br />

PCR med merkede primere 21<br />

Resultater 23<br />

Resultater fra agarosegel 23<br />

Resultater fra DNA- utbytte analyse 26<br />

Resultater fra 3130 Genetic Analyzer 27<br />

Diskusjon 30<br />

DNA- isolering 30<br />

DNA- utbytte analyse 30<br />

3130 Genetic Analyzer 31<br />

Fenotypisk variasjon 33<br />

Konklusjon 34<br />

Kilder 35<br />

V


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Innledning<br />

Jordskokk<br />

Som bacheloroppgave i biol<strong>og</strong>i ved Høgskolen i Agder har jeg valgt å<br />

undersøke genetisk<br />

variasjon hos kulturplanter.<br />

Kulturplanter er vekster<br />

som gjennom dyrking eller<br />

foredling er tatt i bruk til<br />

menneskelige formål. Man<br />

skiller mellom fire grupper;<br />

matplanter, medisinplanter,<br />

prydplanter <strong>og</strong> planter til industriell eller teknisk bruk som for eksempel<br />

bomull.<br />

Planten som skal undersøkes er jordskokk (Helianthus tuberosus).<br />

Jordskokk er en flerårig plante i kurvplantefamilien <strong>og</strong> en nær slektning<br />

av solsikke (Helianthus annus). Den er ganske høy, med gule blomster <strong>og</strong><br />

spiselige knoller. Planten setter ikke modne frø i Norge, som altså vil si at<br />

den formerer seg vegetativt, <strong>og</strong> må bevares som knoller. På 90- tallet ble<br />

40 knoller samlet inn av en arbeidsgruppe for grønnsaker ved Nordisk<br />

Gen Bank (NGB) <strong>og</strong> befinner seg nå hos Bioforsk på Landvik i Grimstad.<br />

Knollene ble samlet inn med tanke på studier på forskjeller mellom dem<br />

<strong>og</strong> fremtidig bevaring av de ulike typene. Knollene i samlingen viser stor<br />

variasjon med henhold til farge <strong>og</strong> form. De er blitt nærmere undersøkt<br />

med tanke på egenskaper ved knoller, stengel, blad <strong>og</strong> blomst. Avling <strong>og</strong><br />

knollstørrelse er <strong>og</strong>så registrert(Asdal, Å).<br />

1


Jordskokk: (Helianthus tuberosus)<br />

2<br />

• Latin: Helianthus tuberosus<br />

• Familie: Korgplantefamilien (Asteraceae)<br />

• Engelsk: Jerusalem artichoke<br />

Stine Kooyman<br />

• Beskrivelse: Flerårig, men dyrkes som ettårig.<br />

Underjordiske stengelknoller, hvite, gule eller rosa. (2n= 102)<br />

• Innholdsstoffer: Inulin i stedet for stivelse.<br />

• Bruk <strong>og</strong> historie: Kokes <strong>og</strong> formeres som poteter<br />

(Aarnes. H)<br />

Mange av plantene i Helianthus-slekten er polyploide (A Brief Overview<br />

of the Compositae, Lettuce and Sunflower). Det betyr at det har foregått<br />

en kromosomal endring som gjør at organismen inneholder mer enn to<br />

komplette kromosomsett (2002, Campell & Reece. #1).<br />

Jordskokken kom opprinnelig fra Nord- Amerika på 1600- tallet. Den<br />

ansees som en grønnsak <strong>og</strong> det diskuteres om den kan være av interesse<br />

for diabetikere på grunn av sitt høye innhold av karbohydratet inulin. Ved<br />

oralt inntak av inulin vil karbohydratet ikke absorberes <strong>og</strong> derfor ikke<br />

påvirke blodsukkernivået, noe som kan gjøre knollen egnet som mat for<br />

diabetikere. Inulin sies <strong>og</strong>så å være foretrukket næring for lactobacillus <strong>og</strong><br />

kan forbedre balansen av denne bakterien i tarmen. Bifidobacteria<br />

fordøyer inulin til ulike syrer hvor av en av syrene påstås å kunne ha<br />

forebyggende effekt på tarmkreft (Spiller, GA. 1994).<br />

Variasjonsstudier hos jordskokk<br />

Det er tidligere gjort lite for å studere genetisk variasjon hos jordskokk,<br />

slike studier vil gi mye nyttig biol<strong>og</strong>isk kunnskap om variasjon hos


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

planter generelt <strong>og</strong> informasjon for bevaring av en viktig historisk <strong>og</strong><br />

fremtidig kulturplante. Det er imidlertid gjort en del for å studere<br />

fenotypisk variasjon, med tanke på knollform, knollfarge,<br />

stengelbehåring, stengelfarge <strong>og</strong> grenethet. Plantene som er innsamlet<br />

viser på disse områdene store variasjoner. Genetisk variasjonsstudier er<br />

gjort på den nært beslektede solsikken, noe som avdekket stor variasjon<br />

mellom amerikanske solsikkestammer (Tang S, Knapp S. J, 2002).<br />

Genetisk variasjon<br />

Genetisk variasjon er den variasjonen som finnes i arvestoffet, innad <strong>og</strong><br />

mellom individer, arter <strong>og</strong> mellom populasjoner. Genetisk variasjon er<br />

viktig for å bevare det biol<strong>og</strong>iske mangfoldet her på jorda. Variasjonen<br />

gjør det mulig for arter å tilpasse seg forandringer i miljøet de lever i.<br />

Genetisk mangfold finnes på individnivå, men <strong>og</strong>så som genetisk<br />

variasjon mellom populasjoner. Genetisk diversitet mellom populasjoner<br />

assosieres med tilpasninger til lokale forhold. Dersom en populasjon dør<br />

ut har arten mistet noe av sin genetiske variasjon som gjør tilpasning<br />

mulig. Den genetiske variasjonen er viktig å bevare fordi den gjør at<br />

dersom miljøet endres kan det finnes populasjoner som kan takle<br />

forandringene <strong>og</strong> populasjoner som ikke takler endringene (Campbell &<br />

Reece, 2002. #2). Ettersom jordskokk kun formerer seg vegetativt i Norge<br />

vil dette begrense den genetiske variasjonen noe.<br />

Metoder for å studere genetisk variasjon<br />

Det er genene, sammen med miljøet som bestemmer en organismes<br />

fenotype. Variasjoner i sammensetning <strong>og</strong> organisering av genene danner<br />

grunnlaget for evolusjonær utvikling. Gjennom studier av den genetiske<br />

variasjonen mellom individer av samme art (slik som i denne oppgaven)<br />

3


4<br />

Stine Kooyman<br />

kan vi lære mye om organismens respons på sykdommer, biol<strong>og</strong>isk<br />

virkemåte til grunnleggende prosesser i kroppen <strong>og</strong> skille mellom<br />

individer. Man kan <strong>og</strong>så lære mer om slektskap mellom arter gjennom<br />

studier av genetisk variasjon. Det finnes mange ulike metoder for å<br />

studere genetisk variasjon. Man kan sammenlikne hele DNA sekvensen til<br />

forskjellige individer, men dette er tidkrevende <strong>og</strong> dyrt. Inntil dette kan<br />

gjøres på en rask <strong>og</strong> billig måte benyttes en lang rekke analysemetoder.<br />

VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)<br />

Korte DNA- sekvenser som er repetert flere ganger etter hverandre i<br />

tandem kalles VNTR. Om man da kutter med restriksjonsenzymer vil det<br />

gi fragmenter med ulik lengde avhengig av antall repetisjoner av VNTR.<br />

Dersom man behandler dette i en polyacrylamidgel vil man få ulike bånd<br />

alt ettersom hvor lange fragmentene blir, altså etter hvor mange repeterte<br />

sekvenser som er tilstede. VNTR- fragmentene kan <strong>og</strong>så analyseres ved<br />

hjelp av PCR. Primere vil feste seg på enkelte steder, <strong>og</strong> man vil få<br />

oppformert området mellom dem. Ved ulikt antall VNTR vil fragmentene<br />

få ulik lengde, noe som vil vises på en agarosegel (se figur 3 <strong>og</strong> 4).<br />

Dersom det repeterte elementet er veldig kort (200 eller færre baser)<br />

kalles VNTRen for en mikrosatellitt. Ingen vet akkurat hva disse<br />

segmentene gjør, men de kan ikke være så veldig viktige ettersom at de er<br />

ekstremt variable i lengde, <strong>og</strong> tilfeldig spredt rundt om i genomet. Ved å<br />

utføre PCR med et antall flankerende primere, kan et genetisk<br />

fingeravtrykk dannes, <strong>og</strong> gjøre det mulig å trekke konklusjoner om et<br />

individs identitet <strong>og</strong> genetisk forhold til andre individer, med stor<br />

sikkerhet (Dale,J . von Schantz, M. 2002). Det er først <strong>og</strong> fremst<br />

mikrosatellitter som brukes i denne oppgaven.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism)<br />

Det finnes en sekvensvariasjon mellom alleler (genvarianter) som kan<br />

påvises ved at DNA- fragmenter får ulik lengde på grunn av at<br />

restriksjonsseter har oppstått eller blitt fjernet som følge av en punktmutasjon.<br />

Ved RFLP- analyse kuttes DNA med et restriksjonsenzym, dersom<br />

det har skjedd en punktmutasjon <strong>og</strong> et restriksjonssete har blitt fjernet<br />

eller satt inn vil dette gi utslag i ev. kortere eller lenger fragment av DNA<br />

som kuttes. Dersom man etterpå kjører en gel vil man kunne se om<br />

fragmentet kuttes eller ikke.<br />

DNA sekvensering <strong>og</strong> minisekvensering for studier<br />

av variasjon.<br />

I mange tilfeller ønsker man å studere variasjonen i selve DNA-sekvensen<br />

mellom individer. Man vil for eksempel finne hvilken genvariant eller<br />

mutasjon som forårsaker en bestemt sykdom. For å gjøre dette kan man<br />

amplifisere genet, eller deler av det, ved hjelp av PCR <strong>og</strong> videre<br />

sekvensere PCR- produktet. Dersom samme mutasjonen finnes f. eks. hos<br />

alle syke personer, mens ingen analyserte friske personer har det, har man<br />

identifisert en mutasjon som er koblet til sykdommen. Mutasjonen er ikke<br />

nødvendigvis årsak til sykdommen.<br />

Minisekvensering brukes til å finne sekvensen av en DNA- bit hvor<br />

man mistenker at det kan finnes en mutasjon. PCR amplifiserer området<br />

med mulig mutasjon. Primerne hybridiseres like inntil mulig mutasjon.<br />

ddGTP, ddATP, ddTTP <strong>og</strong> ddCTP tilsettes. Dersom disse er merket<br />

forskjellig kan alle blandes i samme rør. DNA- polymerasen inkorporerer<br />

det rette ddXTP avhengig av hvilken nukleotid som er på<br />

punktmutasjonsstedet. Analyse på automatisk sekvenseringsmaskin<br />

detekterer hvilken nukleotid som er innkorporert hvor, altså genotypen.<br />

5


6<br />

Stine Kooyman<br />

Det finnes områder med stor grad av sekvensvariasjon, som for eksempel<br />

mitokondrieområder, som kan sekvenseres.<br />

Microarray<br />

Det finnes mange varianter av microarray. For deteksjon av SNP eller<br />

andre mutasjoner i genomisk DNA brukes metoden som beskrives her.<br />

Oligonukleotid med komplementær sekvens til kjente mutasjoner festes til<br />

et microarray (chip). Et stort antall slike prober (100 000) kan festes til<br />

chippen, noe som gjør at det kan testes for mange mutasjoner. Aktuelle<br />

områder man vil teste for mutasjoner amplifiseres av PCR <strong>og</strong> merkes.<br />

PCR- produktet kan så hybridisere til chippen. Analyse viser hvilke<br />

posisjoner PCR- produktene har hyridisert til <strong>og</strong> følgelig hvilke<br />

mutasjoner/ alleler personen som er testet har. Microarray brukes <strong>og</strong>så i<br />

genekspresjonsstudier.<br />

Problemstilling <strong>og</strong> hypotese<br />

Problemstilling: Det er ønskelig å undersøke grad av genetisk variasjon<br />

mellom de innsamlede plantene. Ettersom det tidligere er gjort svært lite<br />

når det gjelder studier av genetisk variasjonen hos jordskokk er det behov<br />

for et testsystem for deteksjon av DNA- variasjon hos plantene utvikles.<br />

Hypotese: solsikkemarkører kan brukes for å studere den genetiske<br />

variasjonen hos jordskokk.<br />

Nært beslektede organismer ofte har mye likt DNA. Solsikke(Helianthus<br />

annus) <strong>og</strong> jordskokk (Helianthus tuberosus) er så beslektet at de kan<br />

krysses, men dette må gjøres manuelt (The biol<strong>og</strong>y of Helianthus annus<br />

L).


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

I dette prosjektet var hovedmålet å undersøke om genetiske markører fra<br />

solsikke kan benyttes til å etablere et testsystem (plukke ut genetiske<br />

markører som viser variasjon mellom de ulike typene jordskokk) for studier<br />

av genetisk variasjon hos jordskokk.<br />

1: Avella 2: Dagnøytral 4: Søm<br />

6: Kapell 11: Moskva 12: Wuestman<br />

28: Gram 30: Dømmesmoen 37: Elverum<br />

38: Planck<br />

Figur 1: Bildene viser knollene til de 10 plantene som ble plukket ut til forsøket.<br />

7


Hvordan nå målet?<br />

8<br />

Stine Kooyman<br />

Det er viktig å kontrollere om de ulike tingene fungerer. DNA kan være<br />

noe mer problematisk å isolere hos planter på grunn av den sterke<br />

celleveggen. Først ble det isolert DNA fra en plante. For å kontrollere at<br />

DNA- isolering var oppnådd ble det kjørt PCR med en markør fra et av de<br />

få genene isolert fra jordskokk, ettersom dette genet ikke hadde noe navn<br />

refererer vi til markøren som kontroll. Kontrollmarkøren ble brukt som<br />

positiv kontroll, <strong>og</strong> som negativ kontroll ble det brukt vann. Ut fra<br />

resultatene så det ut til at DNA var isolert.<br />

Det ble så isolert DNA fra resten av plantene på samme måte som på den<br />

første (se prosedyre DNeasy Mini Kit). Det ble plukket ut to tilfeldige<br />

planter som så ble kjørt i PCR med alle primerne, for så å sjekke med<br />

agarosegel for å se hvilke primere som virket. De markørene som virket<br />

bestilte jeg merkede markører av, for så å kunne kjøre dem i DNA analyse<br />

maskinen (3130 Genetic Analyzer fra Applied Biosystems). DNA analyse<br />

maskinen vil mer nøyaktig kunne analysere lengden på de ulike<br />

fragmentene som dannes i PCR, <strong>og</strong> målet er å finne primere som virker på<br />

alle plantene, men der plantene viser stor lengdevariasjon i PCR produktene.<br />

DNAet ble <strong>og</strong>så analysert med tanke på DNA-konsentrasjon. Det ble<br />

fortynnet med vann <strong>og</strong> kjørt i spektrofotometer for å se absorbansen ved<br />

260nm <strong>og</strong> 280nm.<br />

Det ble isolert DNA fra 10 innsamlede eksemplarer jordskokk, for så å<br />

plukke ut genetiske markører hos den beslektede arten solsikke som skal<br />

brukes til å undersøke ved hjelp av DNA- analyser (PCR) <strong>og</strong> analyse i<br />

agarosegel for å se om de utvalgte markørene fungerte i jordskokk. Av de


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

markørene som gir PCR- produkt ble den ene delen av primersettet bestilt<br />

på nytt med 5’ende merket med fluoriserende fargestoff. Man vil så<br />

forsøke å bestemme grad av variasjon i markørene som fungerte i<br />

jordskokk ved hjelp av en 3130 Genetic Analyzer, som er en DNA<br />

analyse maskin. De ti plantene som ble undersøkt var plukket ut av<br />

Åsmund Asdal ved Bioforsk med tanke på at de skulle være mest mulig<br />

forskjellige, <strong>og</strong> det ble forventet at plantene derfor skulle vise noe<br />

variasjon i genmateriale. Vi forventet at de plantene som er samlet fra<br />

steder som ligger lengst fra hverandre vil være mest forskjellige. Ettersom<br />

jordskokk ikke formerer seg ved hjelp av frø i Norge, vil dette begrense<br />

den genetiske variasjonen. Den planten som skilte seg mest ut fra de andre<br />

ved første øyekast, var plante nummer 11, Moskva, som hadde en knoll<br />

som er vinrød av farge, hvor de andre knollene er lysebrune. Plantene var<br />

ellers kartlagt med tanke på stengelbehåring, stengelfarge, grenethet,<br />

stilklengde, bladbredde, blomstring, knollform, knollfarge, knollutvekster,<br />

knolltype, knollfarge <strong>og</strong> diverse andre egenskaper av Nordisk GenBank<br />

(Bioforsk)ved Landvik i Grimstad.<br />

Materialer <strong>og</strong> metoder<br />

Innsamling <strong>og</strong> oppbevaring av analysemateriale<br />

Utstyr: Sprittusj, oppbevaringsglass, saks, spirende planter.<br />

Fremgangsmåte<br />

Samlet inn plantevev/ blader fra de ti plantene, fortrinnsvis unge skudd (se<br />

figur 1). Vevet ble plassert i hver sin plastikkpose <strong>og</strong> posene ble merket<br />

godt. Etter innhøsting ble plantevevet lagret ved<br />

-20 °C. Det ble foretrukket ungt materiale fordi det inneholder mer celler<br />

per vekt <strong>og</strong> derfor resulterer i mer DNA. I tillegg inneholder dette<br />

9


10<br />

Stine Kooyman<br />

materialet mindre polysakkarider <strong>og</strong> polyfenoler <strong>og</strong> er derfor letter å<br />

håndtere. Plantene har<br />

tidligere vært studert<br />

med tanke på<br />

knollform, knollfarge<br />

<strong>og</strong> liknende <strong>og</strong> i<br />

sammenheng med dette<br />

blitt nummerert. Vi<br />

brukte det samme<br />

nummersystemet.<br />

Figur 2. figuren viser de ti plantene vi samlet inn<br />

materiale fra.<br />

Plantene vi samlet inn var:<br />

Tabell 1. Tabellen viser plantenavn <strong>og</strong> nummer som ble samlet inn.<br />

Plantenummer Plante navn<br />

1 Avella<br />

2 Dagnøytral<br />

4 Søm<br />

6 Kapell<br />

11 Moskva<br />

12 Wuestman<br />

28 Gram<br />

30 Dømmesmoen<br />

37 Elverum<br />

38 Planck


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Prosedyre ved isolasjon av Total DNA fra plantevev<br />

ved bruk av DNeasy Plant Mini Kit<br />

Utstyr: Plantemateriale, vekt, skalpellblader, veieskip, eppendorfrør,<br />

varmeblokk, mikropistill, is, isoporeske til å ha is i, DNeasy Plant mini kit<br />

fra QIAGEN.<br />

Fremgangsmåte:<br />

1. DNeasy Plante prosedyre er optimalisert for et maksimum av<br />

100mg våt vekt start materiale. Bruk av for mye materiale vil gi<br />

ufullstendig lysering <strong>og</strong> lav renhet.<br />

2. Bruker en mikropistill til å knuse plantemateriale godt. Passet på<br />

at det ikke var klumper i materialet.<br />

3. Tilsatte 400µl av Buffer AP1 <strong>og</strong> 4µl av RNase A stam<br />

løsning(100mg/ml).<br />

4. Inkuberte blandingen i 10minutter ved 65°C. Blandet 2-3ganger<br />

under inkubasjonen ved å vende røret. Dette lyserte cellene <strong>og</strong><br />

bryter ned RNA.<br />

5. Tilsatte 130µl Buffer AP2 til lysatet <strong>og</strong> blandet. Inkuberte i<br />

5minutter på is. Dette steget tok bort detergenter, proteiner <strong>og</strong><br />

polysakkarider.<br />

6. Sentrifugerte i 1 minutt på max speed (14000rpm).<br />

7. Tilsatte lysatet til QIAshredder Mini Spin Column (lilla) plassert i<br />

en 2ml oppsamlingsrør (medfølger i kitet) <strong>og</strong> sentrifugerte i<br />

2minutter ved 20000 x g (14000rpm). Dette fjernet det meste<br />

cellematerialet, men en liten del vil nok ha passert gjennom <strong>og</strong><br />

dannet en pellet i oppsamlingsrøret.<br />

8. Overførte væsken som gikk gjennom membranen fra forrige steg<br />

til et nytt rør uten å forstyrre en eventuell pellet i bunnen av<br />

oppsamlingsrøret.<br />

11


12<br />

Stine Kooyman<br />

9. Tilsatte 1,5 volum Buffer AP3/E til det klare lysatet <strong>og</strong> mikset før<br />

pipettering. Eksempelvis hvis man har 450µl lysat tilsetter man<br />

650µl Buffer AP3/E.<br />

10. Tilsatte 650µl av miksen fra forrige steg, inkludert eventuelt<br />

bunnfall som har blitt dannet, til DNeasy Mini Spin Column i et<br />

2ml oppsamlingsrør (medfølger). Sentrifugerte i 1minutt ved<br />

≥6000x g (korresponderer til ≥8000rpm for de fleste<br />

mikrosentrifuger) <strong>og</strong> kvittet meg med det som gikk gjennom.<br />

DNA er nå festet til filteret.<br />

11. Repeterte forrige trinn, brukte samme oppsamlingsrør.<br />

12. Plasserte DNeasy Mini Spin Column I et nytt 2ml<br />

oppsamlingsrør(medfølger ), tilsatte 500µl Buffer AW (med<br />

etanol tilsatt) til DNeasy Mini Spin Column <strong>og</strong> sentrifugerte i<br />

1minutt ved ≥6000x g (≥8000rpm). Kvittet meg med det som gikk<br />

igjennom <strong>og</strong> brukte samme oppsamlingsrør i neste trinn. Dette<br />

gjøres for å vaske bort uønskede elementer.<br />

13. Tilsatte 500µl Buffer AW til DNeasy Mini Spin Column <strong>og</strong><br />

sentrifugerte i 2minutter ved 20000x g (14000rpm) til å tørke<br />

membranen. Det var viktig å tørke membranen fordi rester av<br />

etanol kunne forstyrre andre reaksjoner.<br />

14. Overførte DNeasy Mini Spin Column til et 1,5ml eller 2ml<br />

mikrosentrifugerør(medfølger ikke) <strong>og</strong> pipetterte 100µl Buffer AE<br />

direkte på mikrosentrifuge membranen. Inkuberte i 5 minutter ved<br />

romtemperatur (15-25°C) <strong>og</strong> sentrifugerte i 1minutt ved ≥6000x g<br />

(≥8000rpm) for å trekke ut DNA. AE er en lavsalt buffer som<br />

fører til at DNA løsner fra filteret <strong>og</strong> isoleres i eget rør.<br />

15. Repeterte forrige trinn èn gang.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

16. Overførte løsningen, som inneholdt DNA, til et eppendorfrør.<br />

Passet på å merke røret godt.<br />

Beregning av DNA- utbytte<br />

For å få en idé om DNA- mengden ble det gjennomført en<br />

konsentrasjonsanalyse med et spektrofotometer av typen Helios gamma<br />

levert av Unicam. Spektrofotometeret ble innstilt på 260nm <strong>og</strong> 280nm.<br />

DNA- konsentrasjonen ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) =<br />

Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml<br />

gir absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning<br />

(35). DNAet ble fortynnet i vann 35x<br />

DNA 7 µl<br />

Destillert Vann 240 µl<br />

Valg av genetiske markører<br />

For å kjøre PCR trengs det primere som er komplementære til deler av<br />

DNA, slik at de kan feste seg. Vi brukte primere som fungerer i Solsikke,<br />

som er nært beslektet med jordskokk. Da ingen genetiske markører er<br />

funnet hos jordskokk, ønsket man å forsøke med markører fra solsikke.<br />

DNA- sekvenser hos nært beslektede arter er ofte veldig lik <strong>og</strong> det er<br />

demonstrert at genetiske markører isolert fra én art ofte kan benyttes til å<br />

studere genetisk variasjon hos andre, beslektede arter. Det måtte først<br />

plukkes ut et utvalg primere som forhåpentligvis skulle virke på<br />

jordskokk. Det ble valgt 6 primere som var listet i artikkelen S. Tang, S.J<br />

Knapp (2002): Microsatellites uncover extraordinary diversity in native<br />

American land races and wild populations of cultivated sunflower<br />

(primere fra genomisk DNA som er funnet å virke på en rekke<br />

angiospermarter), <strong>og</strong> 2 primere fra artikkelen Wills, D.M, Hester M. L<br />

13


14<br />

Stine Kooyman<br />

(2005). Chloroplast SSR polymorphism in the Compositae and the mode<br />

of organellar inheritance in Helianthus annus (primere fra kloroplast<br />

DNA). Vi brukte primere fra kloroplast DNA fordi det kun nedarves fra<br />

morssiden <strong>og</strong> dermed kan være et viktig verktøy <strong>og</strong>så for fremtidige<br />

populasjonsgenetiske studier. Som positiv kontroll brukte vi markør for et<br />

av de få genene isolert fra jordskokk, referert til som kontroll. Markørene<br />

ble bestilt fra MWG- Biotech AG via internett. Markørene som ble bestilt<br />

var:<br />

Tabell 2. Tabellen viser markørnavn <strong>og</strong> nummer.<br />

Navn Nummer<br />

Kontroll (L <strong>og</strong> R) I<br />

ORS 310 (A <strong>og</strong> B) II<br />

ORS 311 (A <strong>og</strong> B) III<br />

ORS 317 (A <strong>og</strong> B) IV<br />

ORS 331 (A <strong>og</strong> B) V<br />

ORS 351 (A <strong>og</strong> B) VI<br />

ORS 388 (A <strong>og</strong> B) VII<br />

ccmp5 (Fwd <strong>og</strong> Rev) VIII<br />

NTCP39 (Fwd <strong>og</strong> Rev) IX<br />

Romertallene bak primernavnene er tallene jeg brukte for å skrive ned<br />

rekkefølger <strong>og</strong> liknende, ved PCR <strong>og</strong> agarosegel.<br />

PCR (Polymerase Chain Reaction)<br />

PCR er en metode som brukes først <strong>og</strong> fremst til å oppformere DNA. PCR<br />

kan brukes til å lage millioner kopier av et bestemt område på DNA.<br />

Templat- DNA, nukleotidene dATP, dCTP, dGTP <strong>og</strong> dTTP (samlet kalt<br />

nNTP), DNA- primere, passende reaksjonsbuffer <strong>og</strong> DNA- polymerase<br />

pipetteres over i PCR- rør. PCR- røret plasseres i en ”Thermocycler”, en


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

maskin som er i stand til å raskt varme opp <strong>og</strong> kjøle ned materialet i<br />

rørene. Det dobbeltrådete DNA som skal oppformeres varmes opp slik at<br />

de to trådene denatureres (går fra hverandre). DNA- polymerasen(Taqpolymerase)<br />

som brukes er isolert fra den termofile (varmeelskende)<br />

bakterien Thermus aquaticus slik at enzymet fortsatt virker under høye<br />

temperaturer. Temperaturen senkes så slik at enkelttrådene kan feste seg<br />

til primere (korte DNA stykker) som er komplementære til sekvensen på<br />

tråden som skal oppformeres(Mullis, K. B & Fallona, F. A (1987)).<br />

Temperaturen heves så <strong>og</strong> Taq- polymerasen syntetiserer DNA fra<br />

3’enden av primerne. Slik får man to nye, like DNA- tråder. Prosessen<br />

gjentas ønsket antall ganger til man har fått nok DNA. Mengden DNA<br />

fordobles med hver runde <strong>og</strong> veksten blir derfor eksponentiell.<br />

For å regulere temperaturendringene brukes en PCR- termosykler som kan<br />

forhåndspr<strong>og</strong>rammeres til det temperaturpr<strong>og</strong>rammet, inkubasjonstid <strong>og</strong><br />

antall sykluser man ønsker å bruke.<br />

15


16<br />

Stine Kooyman<br />

Figur 3: Figuren viser prinsippet ved en PCR- reaksjon hvor målsekvensen er en<br />

mikrosatellitt. PCR- reaksjonen gjentas i ønsket antall sykluser til man har ønsket<br />

mengde DNA.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Figur 4: Figuren til<br />

høyre viser ulike<br />

allel klasser av<br />

mikrosatelitt fragmenter oppformert i PCR. Fragmentene testes så i en gel, hvor<br />

de separeres etter lengde. Man kan se forskjell på individer med ulikt antall<br />

repeterte elementer i mikrosatellitten, ettersom båndene vandrer ulikt på grunn av<br />

ulik lengde.<br />

Prosedyre for PCR<br />

Utstyr<br />

Destillert vann, 10xPCR- buffer, Gold Taq- polymerase, dNTP, markører<br />

som listet tidligere, PCR- rør, PCR maskin (GeneAmp PCR System<br />

9700), pipetter, pipettespisser, engangshansker.<br />

Generelt<br />

På grunn av den enorme amplifikasjonen som er mulig med PCR, vil selv<br />

små nivåer av DNA kontaminering, spesielt fra tidligere PCR<br />

amplifiseringer, prøver med høye DNA nivåer <strong>og</strong> positiv kontroll<br />

templater, resultere i produktdannelse selv når DNA ikke er tilsatt med<br />

vilje. Om mulig burde alle reaksjoner settes opp i et område separat fra<br />

PCR produkt analyse. Bruk av engangsinstrumenter, løsninger <strong>og</strong> pipetter<br />

til DNA preparering, reaksjons miksing <strong>og</strong> prøveanalyse vil redusere fare<br />

for kontaminering.<br />

17


18<br />

Stine Kooyman<br />

Prosedyre<br />

En master miks av reagenser (vann, buffer, dNTP, PCR- primere <strong>og</strong><br />

enzymer) for alle prøvene forberedes først, mengde lages etter hvor<br />

mange prøver som skal analyseres, <strong>og</strong> fordeles i hvert sitt rør. Templat<br />

DNA tilsettes så.<br />

Oppskrift på reaksjonsmiks i et rør:<br />

Destillert vann 17,80 µl<br />

10X PCR buffer II 2,50 µl<br />

10mM dNTP 0,50 µl<br />

Primer 1 (5pmol/ µl) 1,50 µl<br />

Primer 2 (5pmol/ µl) 1,50 µl<br />

AmpiTaq Gold DNA Polymerase 0,20 µl<br />

Templat DNA 1,00 µl<br />

Total miks 25,00 µl<br />

Plasserte PCR-rørene i PCR maskinen (GeneAmp PCR System 9700) <strong>og</strong><br />

pr<strong>og</strong>rammerte inn temperatur <strong>og</strong> tid. Stilte inn PCR maskinen på 37<br />

sykluser.<br />

95°C 10 min<br />

94°C 45 sek<br />

52°C 45 sek >37sykler<br />

72°C 45 sek<br />

72°C 7 min<br />

4°C ∞


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Med 95°C i 10 minutter, 94°C i 45 sekunder, 52°C i 45 sekunder, 72°C i<br />

45 sekunder, 72°C i 7 sekunder <strong>og</strong> når selve prosessen er ferdig 4°C<br />

resten av tiden.<br />

Prosedyre av laging av agarose gel elektroforese<br />

Bakgrunn<br />

Agarose gel elektroforese er den enkleste <strong>og</strong> vanligste måten å separere<br />

DNA etter størrelse <strong>og</strong> analysere DNA på. Prinsippet baserer seg på at<br />

makromolekyler separeres på bakgrunn av sin bevegelsesfart gjennom<br />

gelen i et elektrisk felt(Campbell & Reece, 2002. #3). For DNA er<br />

migrasjonsraten, hvor langt molekylet beveger seg mens strømmen er på,<br />

invers proporsjonal med molekylets størrelse. Nukleinsyrer har negativt<br />

ladde fosfatgrupper proporsjonale til sin lengde, men fibrene i gelen<br />

forhindrer bevegelse av lange fragmenter mer enn korte. DNA avsettes i<br />

små brønner på den negativt ladde polen av gelen, når strømmen slåes på,<br />

vandrer de mot den positive polen på grunn av de negativt ladde<br />

fosfatgruppene. Meningen med gelen kan være å se på DNA eller isolere<br />

et spesielt bånd. DNA visualiseres i gelen ved å tilsette ethidiumbromid.<br />

Dette binder sterkt til DNA ved å interkalere mellom basene <strong>og</strong> er<br />

fluoriserende, som betyr at det absorberer usynlig UV lys <strong>og</strong> overfører<br />

energien som synlig lys. Ulike konsentrasjoner av gelene fører til ulik<br />

oppløsning på gelen, slik at man noen ganger må prøve seg fram for å<br />

finne den konsentrasjonen som separerer fragmentene best.<br />

Laging av 2% agarosegel (2% gel, 100ml).<br />

Utstyr: Veieskip, agarose, vekt, erlenmeyerkolbe, 1x TAE,<br />

mikrobølgeovn, ethidiumbromid.<br />

19


20<br />

Stine Kooyman<br />

1. Veide opp 2g agarose i en 250ml erlenmeyerkolbe. Tilsatte 100ml<br />

1xTAE, ristet forsiktig for å mikse.<br />

2. Satte i mikrobølgeovn i ca 1minutt for å løse opp agarosen.<br />

3. Lot løsningen stå på benken <strong>og</strong> kjøle seg ned til ca 60 °C.<br />

4. Tilsatte 5 µl etidiumbromid(10 µg/ µl) <strong>og</strong> ristet forsiktig for å<br />

blande.<br />

5. Satte i kammen <strong>og</strong> sjekket at den var korrekt satt i. Helte gelen<br />

sakte over på tanken <strong>og</strong> passet på at det ikke ble luftbobler.<br />

6. Lot gelen stå å stivne.<br />

7. Helte 1x TAE buffer i geltanken <strong>og</strong> over gelen slik at bufferen<br />

gikk 2-5mm over gelen. Dette var kjøringsbufferen.<br />

Forberedelse av prøvene:<br />

Loadingbufferen bestod av 50% glyserol <strong>og</strong> Bromfenolblått.<br />

Størrelsesstandarden som ble brukt var 1kb Plus fra Invitr<strong>og</strong>en.<br />

Loadingbuffer 2,0 µl<br />

PCR produkt 2,0 µl<br />

(eller 1 µl størrelsesstandard)<br />

Destillert vann 6,0 µl<br />

Totalt volum 10 µl<br />

Etter at gelen var stivnet <strong>og</strong> kammen tatt ut ble DNA prøvene blandet med<br />

loadingbuffer <strong>og</strong> vann <strong>og</strong> 10 µl ble pipettert over i brønnene. Passet på å<br />

merke meg hvilken rekkefølge prøvene ble avsatt i.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Nybestilling av PCR- primere med<br />

fluorescensmerket5’ende<br />

Etter vurdering av resultatene på agarosegelen ble markør II(ORS 310)<br />

forkastet, <strong>og</strong> primere til resten av markørene ble bestilt på nytt fra Applied<br />

Biosystems merket med fluoriserende fargestoff i 5’enden. Kun den ene<br />

halvdelen av hvert primersett ble bestilt på nytt.<br />

Tabell 3. Tabellen viser hvilken del av primersett som ble bestilt på nytt, hva de<br />

ble merket med <strong>og</strong> hvilken primerdel som ble merket.<br />

Navn Nummer Merket del Merket med<br />

Kontroll (L <strong>og</strong> R) I L 6- FAM<br />

ORS 311 (A <strong>og</strong> B) III A VIC<br />

ORS 317 (A <strong>og</strong> B) IV A NED<br />

ORS 331 (A <strong>og</strong> B) V A 6- FAM<br />

ORS 351 (A <strong>og</strong> B) VI A VIC<br />

ORS 388 (A <strong>og</strong> B) VII A NED<br />

ccmp5 (Fwd <strong>og</strong> Rev) VIII Fwd 6- FAM<br />

NTCP39 (Fwd <strong>og</strong> Rev) IX Fwd VIC<br />

De fluoriserende fargene:<br />

6- FAM: fluoriserende blå<br />

VIC: fluoriserende grønn<br />

NED: fluoriserende gult<br />

PCR med merkede primere<br />

PCR miks:<br />

Destillert vann 17,8 µl<br />

10x PCR buffer 2,5 µl<br />

dNTP 0,5 µl<br />

21


22<br />

Gold Taq- polymerase 0,12 µl<br />

Primer 1 (5pmol/ µl) 1,5 µl<br />

Primer 2 (5pmol/ µl) 1,5 µl<br />

DNA 1 µl<br />

Totalt PCR- volum 25 µl<br />

Stine Kooyman<br />

PCRen ble kjørt på samme måte som tidligere, men antall sykluser ble<br />

endret til 28 på grunn av at 3130 Genetic Analyzer har et meget sensitivt<br />

detektorsystem <strong>og</strong> vi trenger derfor ikke så mye DNA.<br />

Forberedelse av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer:<br />

HiDi Formamid 9,8 µl<br />

Størrelses standard (LIZ 500) 0,2 µl<br />

PCR- produkt 1,0 µl<br />

Analyser av PCR- produkt i 3130 Genetic Analyzer<br />

PCR- produktet, størrelsesstandarden samt HiDi formamid ble pipettert<br />

opp i en 96- brønners PCR- plate <strong>og</strong> satt inn i 3130 Genetic Analyzer. Når<br />

brettet ble satt inn, ble det på en tilhørende datamaskin laget et oppsett for<br />

hvilken brønn som inneholdt hvilken prøve <strong>og</strong> maskinen ble fortalt<br />

hvilken størrelsesstandard som ble brukt. 3130 Genetic Analyzer fungerte<br />

på den måten at den har 4 kapillærrør fylt med en polymer som fungerer<br />

på tilsvarende måte som en gel, nemlig ved å separere fragmentene etter<br />

størrelse. Når prøven passerer en laser, gir de merkede fragmentene fra<br />

seg et lysglimt som blir registrert av et kamera <strong>og</strong> omgjort til en ”topp” på<br />

skjermen på datamaskinen (Se figur 7). Den maskinen som ble brukt<br />

hadde 4 kapillærrør <strong>og</strong> kunne altså analysere 4 prøver om gangen.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Resultater<br />

Resultater fra agarosegel<br />

Kjørte PCR i 37 sykluser med alle plantene <strong>og</strong> markør I(Kontroll) for å se<br />

om vi hadde DNA, etterfulgt av analyse i 1% agarosegel. Kjørte <strong>og</strong>så PCR<br />

for resten av markørene på plante 11 <strong>og</strong><br />

12. Fikk resultat, men det var vanskelig å<br />

tolke ettersom gelen ikke separerte<br />

fragmentene godt nok. Testet prøvene en<br />

gang til på 2 % agarosegel <strong>og</strong> fikk da<br />

lesbare resultater. For å kunne se på resultatene<br />

av agarosegelen ble det brukt en<br />

UV-boks med et digitalkamera i slik at<br />

bildene av gelene (som det nedenfor)<br />

kunne lagres på en minnebrikke, eller<br />

skrive ut direkte.<br />

Figur 5. Figuren viser 1kb<br />

Plus DNA Ladder på 0,9%<br />

agarosegel farget med<br />

etidiumbromid.<br />

Justerte antall PCR- sykluser til 35 <strong>og</strong> kjørte så PCR med alle primerne på<br />

plantene 4 <strong>og</strong> 6 for å teste de nye PCR- betingelsene <strong>og</strong> analyserte PCRproduktene<br />

i agarosegel (2 %). Båndene ble klare <strong>og</strong> fine(data ikke vist).<br />

På alle gelene ble det <strong>og</strong>så satt på en størrelsesstandard (1kb Plus DNA<br />

Ladder) for å indikere lengden på fragmentene.<br />

Kjørte så PCR der jeg testet alle plantene for alle primerne<br />

(satte opp annealingtemperaturen i PCR- profilen til 59 grader).<br />

23


24<br />

Figur 6a)<br />

Figur 6b)<br />

Figur 6c)<br />

Stine Kooyman


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Figur 6 a, b <strong>og</strong> c. Figuren viser resultatene fra analysen av PCR- produkt i 2%<br />

agarosegel. Det første sporet på hver rekke er alltid størrelsesstandard. Tallene<br />

over sporene markerer hvilken plante som er testet, <strong>og</strong> minustegnet markerer<br />

negativ kontroll. Figur 5A viser resultatet av agarosegel med PCR- produkt med<br />

markør II (ORS 310), III (ORS 311) <strong>og</strong> IV (ORS 317) på alle plantene. Figur 5B<br />

viser resultater fra agarosegel med PCR- produkt med markør V(ORS 331), VI<br />

(ORS 338) <strong>og</strong> VII (ORS 351) på alle plantene. Figur 5C viser resultatene fra<br />

agarosegeltesting med av PCR- produkt med markør VIII(ccmp5) <strong>og</strong><br />

IX(NTCP39).<br />

Fra figuren kan vi se at det ikke ble resultat på plante 37 <strong>og</strong> 38 på noen av<br />

primerne. Det er da trolig at DNA- isoleringen har vært mislykket <strong>og</strong> dette<br />

ble gjort på nytt. På resultatet fra markør II (ORS 310) kan man ikke se<br />

bånd <strong>og</strong> det konkluderes med at primeren ikke har virket. Resultatene fra<br />

markør III (ORS 311) <strong>og</strong> IV (ORS 317) er det klare bånd <strong>og</strong> vi<br />

konkluderer med at primerne har virket. Båndene fra markør V(ORS 331)<br />

er klare <strong>og</strong> tydelige <strong>og</strong> primerne har virket. Resultatene fra VI (ORS 338)<br />

<strong>og</strong> VII (ORS 351) er noe mer uklare, uten at vi kan si hvorfor, men disse<br />

forkastes ikke fordi det er interessant å se hva som blir resultatet av<br />

analysen i 3130 Genetic Analyzer. Resultatene fra markør VIII(ccmp5) <strong>og</strong><br />

IX(NTCP39) er <strong>og</strong>så klare <strong>og</strong> tydelige <strong>og</strong> primerne har virket. Med<br />

utgangspunkt i disse resultatene ble markørene I(Kontroll L), III(ORS 311<br />

A), IV(ORS 317 A), V(ORS 331 A), VI(ORS 351 A), VII(ORS 388 A),<br />

VIII(ccmp5 Fwd) <strong>og</strong> IX(NTCP39 Fwd) bestilt på nytt, med 5’ merket<br />

ende. Vi konkluderte med at markør II ikke fungerte, <strong>og</strong> forkastet denne.<br />

Markør I, som er Kontrollmarkøren(I) brukt til positiv kontroll bestilte vi<br />

<strong>og</strong>så merket av, men den ble ikke testet i bildene vist over fordi den er<br />

positiv på alle plantene(data ikke vist).<br />

25


Resultater fra DNA- utbytte analyse<br />

Plantenavn/nr.<br />

26<br />

Abs.<br />

260nm<br />

Abs.<br />

280nm<br />

Forhold abs.<br />

260nm/280nm<br />

Stine Kooyman<br />

Konsentrasjon<br />

(µg/ml)<br />

1: Avella 0,34 0,029 1,72 595<br />

2: Dagnøytral 0,129 0,098 1,316 225,75<br />

4: Søm 0,143 0,109 1,311 250,25<br />

6: Kapell 0,069 0,065 1,061 120,75<br />

11: Moskva 0,179 0,084 2,13 313,25<br />

12: Wuestman 0,057 0,035 1,628 99,75<br />

28: Gram 0,041 0,025 1,64 71,75<br />

30: Dømmesmoen 0,025 0,018 1,388 43,75<br />

37: Elverum -0,023 -0,03 0,766 0<br />

38: Planck 0,054 0,038 1,421 94,5<br />

Tabell 4. Tabellen viser resultatene fra absorbansmålingene på DNA. DNAkonsentrasjonen<br />

ble regnet ut ved: DNA-kons. i kyvetten (ug/ml) =<br />

Absorbansverdien fra 260 x 50 fordi en DNA-løsning med kons. 1 ug/ml gir<br />

absorbans 1 ved UV260. Så ble det ganget med grad av fortynning (35).<br />

Forholdet mellom absorbansen ved 260nm <strong>og</strong> 280nm burde egentlig være<br />

over 1,8, resultater lavere enn dette kan tyde på forurensninger. Siden det<br />

kreves svært små mengder DNA til PCR- reaksjonen vil ikke dette ha<br />

noen innvirkning på forsøkene. Absorbansen hos plante 37 ble negativ <strong>og</strong><br />

DNA- konsentrasjonen ble satt til null. Det er likevel noe DNA tilstede<br />

ettersom planten får resultat med to av markørene.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Resultater fra 3130 Genetic Analyzer<br />

Figur 7: Figuren viser resultater fra plante nummer 6 (øverst), 11 <strong>og</strong> 12 testet<br />

med markør VI(ORS 351). De grønne toppene er PCR- produktene. De oransje<br />

toppene er størrelsesstandarden. Den rosa streken i toppen hos plante 6 <strong>og</strong> 12<br />

indikerer at den grønne toppen er så høy at den går ut av skalaen i pr<strong>og</strong>rammet.<br />

Figur 6 illustrerer hvordan resultatene vil være når PCR- produktene har<br />

blitt analysert i 3130 Genetic Analyzer. Slike figurer fikk man for alle<br />

plantene testet med de ulike markørene(data ikke vist). De grønne toppene<br />

på figuren er det samme som et bånd i en gel. Fordelen med å bruke 3130<br />

Genetic Analyzer er at den med stor nøyaktighet angir lengden på PCRproduktene.<br />

27


28<br />

Stine Kooyman<br />

Plantenr./navn I: Kontroll III: ORS 311 IV: ORS 317 V: ORS 331<br />

1: Avella 176, 179<br />

2: Dagnøytral 176, 179<br />

4: Søm 176, 179<br />

6: Kapell 176, 179<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

11: Moskva 176, 179 342, 346 183, 185 179<br />

12: Wuestman 176, 179<br />

28: Gram 176, 179<br />

30: Dømmesmoen 176, 179<br />

37: Elverum 176, 179<br />

38: Planck 176, 179<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

342, 346, 350,<br />

355<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

180, 187,<br />

191, 193 179<br />

Tabell 5. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de<br />

ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene<br />

indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at<br />

denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Plantenr./navn VI: ORS 351 VII: ORS 388 VIII: ccmp5 IX: NTCP39<br />

1: Avella 262 - 94 170<br />

2: Dagnøytral 262 - 94 170<br />

4: Søm 262 - 94 170<br />

6: Kapell 262 - 94 170<br />

11: Moskva 247, 257, 284 - 94 160<br />

12: Wuestman 262 - 94 170<br />

28: Gram 262 - 94 170<br />

30: Dømmesmoen 262 - 94 170<br />

37: Elverum - 94<br />

38: Planck 262 - 94 170<br />

Tabell 6. Tabellen viser resultater fra 3130 Genetic Analyzer. Tallene under de<br />

ulike markørene er fragmentenes lengde i basepar. Grønn farge på tallene<br />

indikerer at denne fragmentlengden finnes hos alle plantene, rød farge markerer at<br />

denne fragmentlengden kun finnes hos denne planten.<br />

Det var kun ccmp5 som virket på plante 37 ved første kjøring. Plante 12<br />

ble blank på ORS 311(III). Plante 37 ble kjørt på nytt med ulike PCR<br />

mikser, en der alle primerne ble tester, men DNA- templatvolumet var<br />

1,5µl <strong>og</strong> en der DNA- templatvolumet var 2µl. Disse ble kjørt om igjen <strong>og</strong><br />

det ble da bra resultat på plante 12, men plante 37 virket kun på markør<br />

ORS 311, <strong>og</strong> gav svake resultater. Markør VII (ORS 388) gav ingen<br />

synlige produkt på noen av plantene. Selv ikke etter gjentatte forsøk med<br />

varierende PCR- betingelser.<br />

29


Diskusjon<br />

DNA- isolering<br />

30<br />

Stine Kooyman<br />

DNA- isoleringen fungerte bra, men det var viktig å knuse plantene godt.<br />

Selv om jeg behandlet alle plantene likt på alle måter viste det seg likevel<br />

at det var behov for å isolere DNA på nytt fra henholdsvis plante 37 <strong>og</strong><br />

38. Disse ble <strong>og</strong>så behandlet likt under isoleringen, men likevel var det<br />

dårlig DNA- utbytte på plante 37. Det er uvisst hvorfor dette var tilfelle,<br />

men denne planten krevde ny isolering av DNA, noe det ikke var<br />

anledning til ettersom det var for tidkrevende <strong>og</strong> krevde mer<br />

plantemateriale.<br />

DNA- utbytte analyser<br />

I tabell 4 ser vi at forholdet mellom 260nm <strong>og</strong> 280nm var lavere enn 1,8.<br />

Dette kan bety at det er forurensninger tilstede som for eksempel proteiner<br />

<strong>og</strong> rester fra DNA isoleringen. I vårt tilfelle betydde det mindre at DNAkonsentrasjonen<br />

var lav <strong>og</strong> forholdet var lavt fordi vi trengte svært små<br />

mengder DNA for at PCR- reaksjonen skulle fungere. På plante 37 fikk vi<br />

negative verdier på absorbansen <strong>og</strong> DNA- konsentrasjonen kan regnes ut<br />

til å bli negativ. Dette er selvsagt ikke mulig, <strong>og</strong> DNA- konsentrasjonen<br />

ble satt til null. Det at absorbansen ble negativ i spektrofotometeret<br />

skyldes nok at det var veldig små mengder DNA tilstede, <strong>og</strong> med de<br />

naturlige svingningene i spektrofotometeret kan nok dette skje. Planten<br />

gav likevel resultater på markør I (Kontroll) på agarosegel <strong>og</strong> markør III<br />

(ORS 311) <strong>og</strong> VIII (ccmp5), så det tyder på at det var noe DNA- tilstede,<br />

bare ikke nok til å få reaksjon på alle markørene.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

3130 Genetic Analyzer<br />

I: Kontroll<br />

Alle plantene var like på dette området. Det var to bånd, et på ca 176 <strong>og</strong><br />

en på 189. Det kan være lengdeforskjeller hvor det ene kromosomet har<br />

en lengde <strong>og</strong> det andre kromosomet en annen. Vi kan spekulere i om<br />

individene er heterozygote. I <strong>og</strong> med at 189 toppen er kraftig vil<br />

fortynning antagelig føre til at det kun blir resultat på den. Blankt resultat<br />

på plante 37.<br />

III: ORS 310<br />

Alle plantene hadde bånd på 342, 346, 350 <strong>og</strong> 355 basepar. Plante 37 gav<br />

resultat på denne markøren, men noe svakere enn de andre plantene, som<br />

kan komme av at det ser ut til at det var dårlig utbytte av DNAisoleringen.<br />

Plante 11 skilte seg noe ut, den hadde kun bånd på 342,346.<br />

Det er sannsynlig at alle plantene her er heterozygote.<br />

IV: ORS 317<br />

Alle plantene var like utenom plante 11. Det ble blankt resultat på plante<br />

37. De fleste plantene hadde bånd på 180, 187, 191 <strong>og</strong> 193 basepar, plante<br />

11 hadde bånd på 185 <strong>og</strong> 183 basepar. Der var ellers ganske mange bånd<br />

<strong>og</strong> det var vanskelig å si hva som stemmer, det måtte eventuelt gjøres flere<br />

analyser. Det var vanskelig å si hvorfor nr 11 hadde to bånd <strong>og</strong> de andre<br />

fire, det kunne være uspesifikke bånd. Normalt ville man forvente et eller<br />

to bånd alt ettersom om planten er homo- eller heterozygot. Flere bånd<br />

kan komme av at jordskokk en gang i evolusjonen har hatt en dobling av<br />

kromosomene, den er polyploid. I enkelte artikler hevdes den å være<br />

31


32<br />

Stine Kooyman<br />

triploid. Det vil da være mulig med flere topper alt ettersom om det<br />

enkelte kromosomsettet er homo- eller heterozygot. I <strong>og</strong> med at de andre<br />

var så like, men at plante 11 kun hadde to bånd kunne man spekulere i om<br />

dette ikke er tilfeldig, men at det virkelig er en forskjell, dette krever<br />

imidlertid mer analysering.<br />

V: ORS 331<br />

Alle plantene var like <strong>og</strong> hadde høye bånd på 179 basepar. De kan sies å<br />

være homozygote.<br />

VI: ORS 351<br />

Alle plantene utenom plante 11 hadde bånd på 262 basepar, disse kan<br />

være homozygote. Kun nummer 11 hadde bånd på 247, 257 <strong>og</strong> 284<br />

basepar, <strong>og</strong> kan sies å være heterozygot. Blankt resultat på plante 37.<br />

VII: ORS 388<br />

Denne primeren ble blank på to av to kjøringer(data ikke vist). Ut fra<br />

resultatene når denne ble testet på agarosegel, var båndene veldig uklare<br />

<strong>og</strong> mange. Den ble tatt med i bestillingen av merkede primere fordi man<br />

var nysgjerrig på hva resultatet ville bli. Ut fra disse resultatene<br />

konkluderes det med at primeren ikke har virket.<br />

VIII: Ccmp5<br />

Alle plantene har bånd på 94 basepar. Svakt resultat på plante 37.<br />

IX: NTCP39<br />

Alle plantene utenom plante 11 har bånd på 170 basepar. Plante 11 har<br />

bånd på 160 basepar. Blankt resultat på plante 37.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Generelt<br />

Markørene vi hadde valgt var markører som viste stor variasjon(stor grad<br />

av heterozygoti) når de ble brukt på solsikke. Jordskokken viser <strong>og</strong>så noe<br />

heterozygoti. Plantene viser lite variasjon seg imellom, men viser at det<br />

finnes stor variasjon med tanke på antall alleler. Ut fra resultatene kan det<br />

se ut som de fleste plantene er veldig like på de markørene som ble testet,<br />

med unntak av plante 11 (Moskva) som skiller seg ut på noen punkter.<br />

Dette er <strong>og</strong>så den planten som ved første øyekast skiller seg<br />

utseendemessig mest fra de andre fordi den har en vinrød farge på<br />

knollen, mens de knollene fra de andre plantene er nokså like med<br />

lysebrun farge (se Figur 1). Plante 11 var lik de andre plantene på markør<br />

I (Kontroll), III (ORS 311) <strong>og</strong> VIII (ccmp5). På markør IV (ORS 317) er<br />

den helt ulik de andre plantene. På markør V (ORS 331), VI (ORS 351)<br />

hadde den henholdsvis to <strong>og</strong> et bånd til felles med de andre plantene. På<br />

markør IX (NTCP35) var den helt ulik de andre plantene.<br />

På plante 37(Elverum) fikk man kun resultat på markør III <strong>og</strong> VIII, man<br />

kan spekulere i om dette var på grunn av dårlig templat- DNA. Plante 37<br />

krever ny isolering av DNA <strong>og</strong> spesiell rensing <strong>og</strong> ny undersøkelse av<br />

eksisterende DNA. Dette er for tidkrevende <strong>og</strong> krever <strong>og</strong>så ny innsamling<br />

av plantemateriale, noe som ikke lar seg gjøre i løpet av prosjektet. Dette<br />

vil selvsagt bli gjort når man bestemmer seg for mer inngående studier av<br />

plantene <strong>og</strong> andre planter i samlingen til Genressursutvalget for planter.<br />

Fenotypisk variasjon<br />

De ulike plantene i dette prosjektet ble som tidligere nevnt plukket på det<br />

grunnlag at de var forventet å være mest mulig forskjellige. Plantene viser<br />

33


34<br />

Stine Kooyman<br />

stor variasjon når det gjelder knollform, knollfarge <strong>og</strong> knollstørrelse, men<br />

det er <strong>og</strong>så store variasjoner når det gjelder stengelbehåring, stengelfarge<br />

<strong>og</strong> grenethet. De fenotypiske ulikhetene kan skyldes miljøet, men det er<br />

trolig at det <strong>og</strong>så er genetiske ulikheter mellom disse plantene. Plantene<br />

ser utseendemessig forskjellige ut, men er like på genotype på de<br />

markørene som ble testet, dette kan muligens skyldes at markørene ligger<br />

i områder med lite mutasjoner. Ut fra disse forsøkene kan man kun<br />

spekulere ettersom det må gjøres videre undersøkelser for å finne grad av<br />

genetisk variasjon.<br />

Konklusjon<br />

7/9 (ca 77%) av de testede primerne virket. Dette viser at markørene er<br />

egnet til å studere genetisk variasjon hos jordskokk. Markør II(ORS 310)<br />

<strong>og</strong> VII(ORS 351) virket ikke. For å få mer kunnskap om den genetiske<br />

variasjonen hos jordskokk må flere planter undersøkes <strong>og</strong> flere markører<br />

testes.


Genetisk variasjon hos jordskokk<br />

Kilder<br />

Asdal, Å, Bevaring <strong>og</strong> utnytting av genressurser i grønnsaker. Cited 2006-<br />

Mai-7. Tilgjengelig fra:<br />

http://www.genressurser.no/planter/documents/Genressurserigron<br />

nsaker1.pdf<br />

A Brief Overview of the Compositae, Lettuce and Sunflower. Cited 2006-<br />

Mai-9.Tilgjengelig fra:<br />

http://compositdb.ucdavis.edu/compositae_overview.php<br />

Campbell, N. A & Reece, J. B (2002). Biol<strong>og</strong>y 6 th edition. #1, pp glossery:<br />

polyploydi. Pearson Benjamin Cummings Publishing Company.<br />

Aarnes. H. Kulturplanter. Cited 2006- Mai-01. Tilgjengelig fra:<br />

http://biol<strong>og</strong>i.uio.no/plfys/haa/littav/NYTTE.pdf<br />

Spiller, GA (1994). Dietary Fiber in Health and Nutrition. Boca<br />

Raton, Florida: CRC Press. Cited 2006- Mars- 22. Tilgjengelig<br />

fra: http://medherb.com/92INULIN.HTM<br />

Tang S, Knapp S. J. (2002). Microsatellites uncover extraordinary diversity<br />

in native American land races and wild populations of cultivated<br />

sunflower. Springer- Verlag<br />

35


36<br />

Stine Kooyman<br />

Wills, D.M, Hester M. L (2005). Chloroplast SSR polymorphism in the<br />

Compositae and the mode of organellar inheritance in Helianthus<br />

annus.<br />

Mullis, K. B & Fallona, F. A (1987). Spesific synthesis of DNA in vitro<br />

via a polymerase- catalyzed chain reaction. Methods in enzymol<strong>og</strong>y<br />

155, 335-350.<br />

Dale,J . von Schantz, M. 2002, From genes to genomes. Pp 209- 225. John<br />

Wiley & Sons Ltd.<br />

Canadian Food Inspection Agency Plant Products Directorate Plant Biosafety<br />

Office. Biol<strong>og</strong>y Document BIO2005-01: The Biol<strong>og</strong>y of<br />

Helianthus annuusL. Cited 2006- Mai- 20. Tilgjengelig fra:<br />

http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dir/dir0501e.shtml<br />

#B3<br />

Campbell & Reece (2002) Biol<strong>og</strong>y 6 th edition. #3. pp 384.Pearson Benjamin<br />

Cummings Publishing Company.<br />

Campbell & Reece (2002) Biol<strong>og</strong>y 6 th edition, #2. pp 1225. Pearson Benjamin<br />

Cummings Publishing Company.

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!