PDF-Mol-utv-bio-stamceller-Sigurd From-april-2004.pdf

Momenter ved undervisningen i
Molekylær r utviklingsbiologi
og
embryo- / stamcelle- relaterte
teknologier
ved
Sigurd H. From

INNHOLDSFORTEGNELSE
1 Innledning
2 Generelle molekylære mekanismer / fenomener under ontogenesen.
Basis for funksjonell genomikk
3 Molekylære mekanismer for styring - og opprettholdelse - av
ekspresjonsmønstre som basis for stabil celledifferensiering
4 Endogene og eksogene signalsystemer som påvirker gen-ekspresjon.
Morfogenetiske gradienter
5 Molekylære mekanismer ved bestemte faser i embryogenesen
6 Embryo - relaterte teknologier. Medisinske implikasjoner
7 Kloning og stamceller. Ex vivo embryogenese
Appendix 1:
Appendix 2:
Appendix 3:
Appendix 4:
Ordliste - Definisjoner
Tidsinndelinger av fosterperioden hos mennesket
Litteratur - referanser
Web - referanser

1 INNLEDNING
1
Betegnelsen UTVIKLINGSBIOLOGI har tradisjonelt omhandlet det enkelte individs utvikling fra éncelletrinnet
gjennom fosterperioden, - og for mange arters vedkommende, også frem til voksen
organisme og død (ontogenesen).
EVOLUSJONSLÆREN på den annen side dreier seg om artenes utvikling på jorden (fylogenesen).
Bruk av molekylærbiologiske og molekylærgenetiske analysemetoder i utviklingsbiologien i de siste 20
år har vist oss den nære sammenheng det er mellom disse disipliner. Det er utallige eksempler på at gener
og proteiner som først er blitt identifisert i enklere arter, særlig bananflue, men også gjærceller og
bakterier, er konservert opp gjennom dyrerekken. Til dels utfører de tilsvarende eller lignende funksjoner
hos mus og menneske som i de enklere arter.
De pågående genom- og proteom-prosjekter bekrefter i høy grad dette, og de vil ha en enorm innflytelse
på fagområdet MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI i tiden fremover. Molekylær
utviklingsbiologi vil i stadig større grad omfatte både de fylogenetiske og ontogenetiske aspekter ved de
forskjellige former for liv her på jorden.
Man regner med at det idag finnes et sted mellom 10 og 100 millioner levende arter på jorden; de aller
fleste er éncellede. Fundamentale fellestrekk for alle celler er:
- De lagrer sin arveinformasjon i DNA
- De replikerer sin arveinformasjon ved templat polymerisering
- De transkriberer deler av sin arveinformasjon til samme type (intermediært) produkt: RNA
- De translaterer RNA til proteiner på samme måte
Alle arter plasseres nå i tre hovedgrupper som vist i følgende figur hentet fra ”Molecular Biology of The
CELL”, 4. utgave, 2002: (=The CELL”)
Figur 1 - 1

Følgende figur gir en oversikt over størrelsene til genomer for store grupper:
2
Figur 1 -2
Det er antatt at det trengs minimum 200-300 forskjellige gener for å gi en proteinbefolkning som er
nødvendig for de enkleste celleformer (”minimumsgenom”). Forsøk er i gang for in vitro å lage en
”celle” med et slikt antall gener.
Ut i fra hva vi idag vet om arveinformasjon for alt levende, så har alle arter ca 200 gen-familier felles.
Neste illustrasjon fra The CELL-2002 gir en oversikt over disse:
Table 1 - 1
Gjennom evolusjonen har nye gener (og dermed arter) oppstått fra allerede eksisterende former. Vi
kjenner i dag ingen måter som fører til at det i naturen kan dannes helt nye gener fra ”scratch”.

Neste figur viser fire vanlige veier for ”genetisk innovasjon” og som utgjør hovedmekanismer for
molekylære evolusjon i de siste 2 – 4 milliarder år:
3
Figur 1 - 3
Med ontogenesen forstår man det enkelte individs utvikling fra fertilisasjonen til individets død.
Tradisjonelt har utviklingsbiologi i denne sammenheng omfattet en omtale av individets utvikling fra
fertilisasjon til fødsel, ofte brukt synonymt med embryologi. I dag blir det mer og mer vanlig å
anvende betegnelsen molekylær utviklingsbiologi om endringsprosessene under hele ontogenesen.
I vår sammenheng vil omtalen av molekylær utviklingsbiologi stort sett være begrenset til
menneskets utvikling i de to første månemånedene etter fertilisasjonen, også kalt den egentlige
embryonalperioden, samt tilsvarende periode hos enkelte modelorganismer som mus. Utviklingen av
kjønnscellene, gametogenesen, vil også inngå da dette representerer en essentiell forutsetning for
etablering av et nytt individ
For mange kan det kanskje også være uklart hvorfor slike kunnskaper er nødvendige for fremtidig
yrkesutøvelse. MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI er ikke en samling teoretisk tankegods, men
dreier seg om basale problemer som burde oppta oss alle. Og som i høy grad også har praktiskt relevans.
Tidsskriftet ”Cell” er av de fleste regnet som det fremste av alle tidsskrift innen moderne biomedisin med
en meget stor redaksjonsstab av de ypperste forskere fra hele verden på dette fagfeltet. Over halvparten av
disse definerer seg selv som utviklingsbiologer, og de har i høy grad vært blant de fremste til å skape
grunnlaget for molekylær biologi, molekylær genetikk og molekylær medisin og molekylær cellemedisin.
Teknologier for gen-diagnostikk, preimplantasjonsdiagnostikk, gen-terapi, in vitro
fertilisasjon, transgene dyr som modeller for human-sykdommer, komparativ
genomikk, ”knock-down” teknologier (som RNAi), kloning og stamceller osv. er i høy
grad utviklet av forskere som arbeider innen utviklingsbiologi. Dette er alle eksempler
på områder som i tiden fremover vil få stadig større betydning for klinisk
yrkesutøvelse. Dette heftet inneholder derfor et avsnitt om ”Embryo- og stamcellerelaterte
teknologier”.
De mest dramatiske begivenheter i biomedisinen i de siste årene er knyttet til
kloningen av sauen ”Dolly” og dens etterfølgere, - sammen med etableringen av
embryonale stamceller (ES-celler) fra mennesket. Det er ikke lengre utenkelig at man
kan ta en differensiert celle fra en pasient og omgjøre denne til en ES-celle gjennom
det som kalles ”terapeutisk kloning” eller på annen måte. Slike ES-celler vil man så

differensiere og eventuelt gen-modifisere in vitro til den type behandlingscelle som
pasienten trenger, enten som vehikler for gen-terapi eller som erstatningsceller ved
degenerative tilstander eller for andre formål. Ved transplantasjon av slike celler vil
man ikke vente forkastelsesreaksjoner siden cellene opprinnelig kom fra pasienten
selv. Det er heller ikke urealistisk, - ut fra forsøk på mus - å anta at det i tiden
fremover vil bli utviklet stadig mere avansert teknologi for in vitro organogenese
basert på slike ES-celler og kanskje stamceller fra fødte individer (adulte stamceller).
For mange av oss er det nesten utrolig – ut fra vanlig tenkemåte i molekylær
cellebiologi - at f. eks. en fibroblast som har vært dyrket i kultur i månedsvis og som
stammer fra en 17 år gammel okse eller lignende (se følgende figur) kan
”omprogrammeres” og resultere i dannelsen av en komplett organisme.
4
Figur 1 - 4
Ved kloning, altså overføring til en kjernefri eggcelle, må fibroblastens kjerne ”lære
seg” på noen timer det som spermier og oocytter bruker måneder og år på ! -
innbefattet rekonfigurere sine telomerer og sitt epigenetiske mønster - pregningsbilde
/ methyleringsbilde – histon kode.
Det er vanskelig å tenke seg en mer fantastisk demonstrasjon av miljøets
betydning for ”funksjonell genomikk”.
MOLEKYLÆR UTVIKLINGSBIOLOGI er også et fag som stimulerer til undring
over hva ”liv” er og over livets mangfoldighet.
I 1965 fikk Francois Jacob Nobelprisen i ”fysiologi eller medisin” sammen med
Jacques Monod for sitt grunnleggende pionerarbeid om gen-reguleringsmekanismer
hos prokaryote. Disse to, sammen med Louis Pasteur og Madame Curie er vel
Frankrikes mest kjente vitenskapspersoner gjennom tidene. Francois Jacob var i over
50 år knyttet til Pasteur-instituttet i Paris. Etter Nobelpristildelingen skiftet han fra å
studere prokaryote organismer til utviklingsbiologi med hovedvekt på studier av
transkripsjonsmekanismer og med transgene mus som modellsystem. I sin siste bok
(fra 1997 ”La souris, la mouche et l’homme”) skriver han bl.a.:
” Det helt utrolige er at når befruktningen har funnet sted, begynner den første
celle, den befruktede eggcelle, å dele seg. Det gir to celler, så fire. Så åtte.
Deretter en liten klump av celler. At denne klump setter seg fast i livmorveggen,
at den blir lengere, vokser og noen måneder senere er blitt til et barn som i 95 %
av tilfellene er utstyrt med alt som skal til for reisen gjennom verden og til og
med kan tenke, det er mirakelet.
Det er det mest forbløffende fenomen som forekommer her i verden. Så
forbløffende at det burde være gjenstand for forundring over hele jorden. At
menneskene burde bruke sin tid på å spørre seg selv om hvilke
mekanismer som ligger til grunn for et sådant under.”

I ”essential cell biology”, 2. utgave 2004, er lignende tanker formulert på
denne måten:
5
”Fertlization marks the beginning of one of the most remarkable phenomena in
all of biology - the process of embryogenesis, in which the zygote divides to
produce large numbers of diploid cells that develop into a new individual.”
Sigurd H. From
April 2004
(s.h.fromm@basalmed.uio.no)

2 Generelle molekylære mekanismer /
fenomener under ontogenesen.
Basis for funksjonell genomikk
2.1 Det nye individs genetiske konstitusjon bestemmes ved fertilisasjonen.
Dette bestemmes av DNA-innholdet i kjernene til den sædcelle og eggcelle som fusjoner ved
fertilisasjonen og derved danner startcellen, zygoten. I tillegg vil også DNA-innholdet i
eggcellens mitochondrier være av betydning. Man antar at sædcellen ikke bidrar med
mitochondrier ved zygotedannelse.
2.2 Økning i celletallet ved mitotiske delinger (proliferasjon).
Den første celledelingen finner sted ca 24 timer etter fertilisasjonen. Gjennom hele fosterperioden
er det høy mitotisk aktivitet. Et nyfødt menneske består av ca 5000 milliarder celler
og som voksen av opp mot 100.000 milliarder celler. Totalantallet celledelinger i løpet av et
menneskeliv har vært angitt til 10 16 , noe som i gjennomsnitt svarer til 350 milliarder mitoser
hvert døgn eller 3 millioner mitoser hvert sekund.
Mus, som er det mest benyttede forsøksdyr, består av ca 2 milliarder celler ved fødselen (etter en
19 døgns fosterperiode) og av ca 40 milliarder celler som voksen.
Parallelt med nydannelsen foregår en programmert celledød.
2.3 Essentielle prosseser under fosterutviklingen
I tillegg til den uttalte celleproliferasjon er det tallrike andre kompliserte prosesser som finner
sted under fosterutviklingen. Et svært viktig punkt er den fenotypiske forskjelliggjøring av
cellene (spesialisering eller differensiering) som foregår, videre utstrakte cellevandringer
(-migrasjoner) til bestemte destinasjoner i organismen, utvelgende samhold (adhesjon) mellom
visse celletyper og avvisninger (repulsjoner) mellom andre. Videre evne til signaloppfangelse og
-utsendelse, signalformidling og selektiv respons på myriader av påvirkninger og med et mønster
som er et resultat av cellenes ”erfaringsbakgrunn” og tidsriktige (homokrone) kompetanse i
påvirkningsøyeblikket slik at ugunstige / letale cellereaksjoner ikke oppstår. Cellene må hele
tiden ha erkjennelse av sin posisjon i organismen og en ”forståelse” av organismens arkitektur og
de relative størrelsesforhold. Etterhvert utvikles også det molekylære grunnlag for kognitive
reaksjoner. Tilsammen representerer fosterutviklingen (og hele ontogenesen) et uhyre komplekst
system og med en logistikk som vi er langt fra å ha overblikk over. Allikevel er det så at i løpet
av de siste 100 år og særlig de 20 siste årene har vi fått en ganske bra oversikt over mange
fundamentale forhold i molekylær utviklingsbiologi.

2
Noen av de mest sentrale ledd vil bli omtalt i denne fremstillingen.
2.4 Genetisk ekvivalens
Gjennom embryogenesen dannes det stadig flere forskjellige celler hva angår struktur og
funksjon. Dette skyldes ikke endringer av DNA-sekvenser. Alle somatiske celler er DNA-messig
lik zygoten (med unntak av visse immunkompetente celler og de kjønnsceller som individet
lager). Man sier at alle individets celler er genetiske ekvivalente med zygoten hva angår DNAsammensetning.
Denne fundamentale erkjennelse fremkom gjennom kloningseksperimenter utført av britiske
forskere på 1950-og 1960-tallet, særlig av John Gurdon.
Figur 2.1 viser slike forsøk.
Fig. 2 - 1
Senere kloningsforsøk har bekreftet at tesen om genetisk ekvivalens også er korrekt for pattedyr.

3
2.5 Differensiell gen-ekspresjon er basis for dannelse de ulike celle-fenotyper.
Man mener i dag (2004) at det er 30.000 - 35.000 gener i det humane genom. Det antas at hver
enkelt celle i organismen uttrykkes omkring 15.000 gener som resulterer i dannelse av mange
former for genprodukter Med uttrykket genprodukter har man tradisjonelt tenkt på proteiner,
men i dag opererer man med en langt videre inndeling som her angitt:
Primære gen-produkter er alltid RNA-molekyler.Disse kan igjen inndeles i translaterbare RNAenheter
(exoner) som resulterer i proteinsyntese og ikke-translaterbare RNA-enheter (også kalt
RNA fra non-protein-coding DNA). Eksempler på ikke-translaterbare RNAer er terminale
(infrastrukturelle) RNA-molekyler som rRNA, tRNA, katalytiske RNA-varianter (ulike ribozymtyper)
og riboregulatorer som miRNA, siRNA og (potensielt) prosesserte introner .
Det er grunn til å tro at ca 10.000 av disse genene uttrykkes i alle celler og i hovedsak resulterer i
dannelse av proteiner som cellene benytter i sitt intermediære stoffskifte og til andre generelle
cellefunksjoner (såkalte ”husholdningsproteiner”) I tillegg uttrykkes flere tusen gener som gir de
forskjellige grupper av celler sine spesielle fenotyper, morfologiske manifestert som epitelceller,
bindevevsceller, blodceller, muskelceller, nerveceller osv. Slike ”differensieringsgener” befinner
seg primært i den del av genomets ”gen-pool” (20.000 - 25.000 gener ?) som kommer i tillegg til
nevnte ”husholdningsgener”.
Med betegnelsen transkriptom forstås det komplette sett av gener som uttrykkes i en celle under
gitte betingelser (alternativt i et organ eller en hel organisme). Det betyr samtlige RNA-molekyler
som er tilstede,også inkludert mRNA-typer som er et resultat av alternativ spleising og multiple
mRNAer dannet fra samme gen.
Molekylær utviklingsbiologi dreier seg i betydelig grad om å forstå de mekanismer som bevirker
utvelgelse og transkripsjon av de gener som er nødvendig for å etablere de ulike cellefenotyper
som oppstår under embryogenesen og som muliggjør ko-operasjon mellom cellepopulasjonene.
Dette kan kalles for funksjonell genomikk og omfatter nå viktige sektorer som:
- konvensjonell transkripsjonsregulering (se del 3.2)
- epigenetiske modifikasjoner (se del 3.3)
av kromatinmaterialet som methylering-, acetylerings- og fosforyleringsforhold,
inkludert histon-koder. Dette er essentielle komponenter i de prosesser som gjør at
en gitt differensiert celle opprettholder sitt transkripsjonsmønster gjennom tallrike
cellesykluser. (Normalt vil f. eks alle etterkommere av en fibroblast være fibroblaster.)
- riboregulatorer (microRNA = miRNA, RNAi, se del 3.4)
Når det blir mulig å gjøre transkriptom- og proteom-analyser på enkeltcellenivå, vil man ha et
langt bedre grunnlag for å presisere hva som ligger i uttrykk som differensierte celler og
differensieringsnivåer. Inndelingen på morfologisk grunnlag i 200 - 300 celletyper er inadekvat.
Med utgangspunkt i et totalt celletall på 100.000 milliarder celler i en voksen
menneskeorganisme er det mer sannsynlig at det foreligger 1000 milliarder ulike fenotyper (hvis

4
man legger til grunn at 99% av cellene er klonale ekspansjoner av en gitt celletype i en gitt
lokalisasjon og under gitte bestingelser (ref.: John S. Mattick. Nature Review of Genetics. April
2004).
2.6 Komparativ genomikk. Organiseringen av det humane genom
Her nevnes bare noen få punkter:
Hver somatisk celle har 1 meter DNA ( 3.2 . 10 9 np) fra sædcellen og 1 meter DNA ( 3.2 . 10 9 np)
fra eggcellen, fordelt på de 46 paternale og maternale kromosomene.Hvis vi setter den haploide
lengde (1 meter) lik 3000 km (Oslo - Napoli), svarer 1 np til 1 mm.
De 2 meter med DNA sammen med de kromosomale proteiner og annet skal ha organisert plass
en cellekjerne som gjennomsnittlig har en diameter på 6 µm. Dette tilsvarer å plassere en sytråd
på 40 km i et bestemt mønster inne i en tennisball.
Et gjennomsnitts gen i det humane genom er på 27.000 np. Nesten alle gener i det humane
genom er delt i exoner og introner. Exonene utgjør i snitt ca 5% av hvert gen, intronene 95%. Et
gjennomsnittsexon består av 145 np og det finnes ca 9 exoner i et snitt-gen (max. antall exoner i
et gen er 178). I et snitt-gen er det 8 introner med en middelverdi på ca 3200 np, ialt pr. gen ca
25600 np. Genene (exoner og introner) utgjør kun 25% av genomet. Bare ca 1% av det humane
genom består av proteinkodende områder. Alle intronene utgjør 24% av genomet. Samtlige
exoner i genomet utgjør ca 32 millioner np og ca 40 km av genomets 3000 km! Tilsvarende tall
for alle introner er 800 millioner np og 720 km.
Gener som koder for proteiner (gener som inneholder exoner) transkriberes til pre-mRNA.
Pre-mRNA må som kjent prosseseres i kjernen på ulike måter (capping, polyA-hale m.m.) I
tillegg må intronene kuttes ut og exonene ligeres, enten i samme sekvens som informasjonen
finnes i genet, eller ved alternativ spleising. Man mener nå at transkriptene fra over 60% av
humane gener blir gjenstand for alternativ spleising. Over 80% av slik spleising resulterer i
proteiner med en endret aminosyresekvens. Dette er basis for at det humane genom antas å gi
grunnlag for et proteom som omfatter mellom 50.000 og 60.000 proteiner til tross for et gen-tall
på 30.000 - 35.000.
Såvel sekvensielle som alternative kutte- og spleiseprosesseringer av pre-mRNA til mRNA
forestås av meget store riboprotein-”maskiner”, kalt spliceosomer. Nyere data viser at slike
”maskiner” består av fem snRNA - molekyler (sn = small nuclear) og opp til 300 forskjellige
proteiner. Det har vært en utbredt oppfatning at utkuttede introner ikke har noen funksjoner og at
de blir degradert i kjernen. Dette syn er i ferd med å endre seg i retning av at de kan ha viktige
regulatoriske funksjoner (bl.a. som miRNA, se senere), og at de kan plasseres i den store gruppen
som nå kalles ncDNA (non-codingDNA) eller bedre npcDNA (non-protein-coding-DNA).
npcDNA omfatter betydelige deler av genomet i tillegg til intron-kodendeDNA.

5
Figur 2 - 2
Komparative genom-analyser viser at mengde npcDNA pr. genom har økt betydelig gjennom
evolusjonen, illustrert i følgende figur (hentet fra John S. Mattick. Nature Review Genetics. April
2004)

6
Figur 2 - 3
Disse genom-endringene i npcDNA viser et visst sammenfall med evolusjonsmessig
kompleksitet til arter på jorden, særlig til overgangen mellom prokaryote og eukaryote
som illustrert i neste figur hentet fra samme kilde:

7
Figur 2 - 4
2.7 Kvalitative og kvantitative vurderinger av translaterbare RNA - populasjoner
(mRNA-populasjoner) pr. celle
Det antas at en gjennomsnittlig somatisk celle totalt inneholder 10.000 - 15.000
forskjellige mRNA-molekyler. Mange av dem (10.000 ?) er like for alle somatiske celler i
kroppen. Det er antatt at cellene inneholder færre enn 10 eksemplarer av hver av disse
mRNA former (”få-eksemplar gruppen” - gruppe 1). I en ”mellomgruppe” (gruppe 2)
finnes omkring 10 mRNA typer som hver foreligger i ca. 1000 eksemplarer. Den
”tallrikeste gruppen” omfatter bare noen ganske få mRNA-typer (1-5 ?), men disse kan
finnes i opptil 100.000 eksemplarer pr. celle.
2.8 Kvalitative og kvantitative vurderinger av ikke-translaterbare RNA - populasjoner
(non-protein-coding) npcRNA - populasjoner pr. celle
Dette omfatter typer av RNA nevnt under punkt 2.5. Dette er nå et forskningsfelt i
rivende utvikling. Kvantitative data kan ennå ikke angies.

8
2.9 Kvalitative og kvantitative vurderinger av total protein-populasjon pr. celle
(proteomet)
Det er flere enn 10.000 forskjellige proteinmolekyler i en somatisk celle (som et resultat
særlig av differensiert transkripsjon og alternativ spleising). I gjennomsnitt er det ca 1
million av hvert proteinmolekyl (men med stor spredning). Følgelig inneholder en
somatisk celle omkring 10 milliarder proteinmolekyler totalt (og antagelig ca 4 millioner
ribosomer). Ved symmetriske celledelinger antar man at hver av de to nye celler får ca 5
milliarder proteinmolekyler og 2 millioner ribosomer. I løpet av G 1 øker proteintallet på
nytt til 10 milliarder. Transkripsjonshastighet ved dannelse av mRNA er ca 40 nt pr.
sekund og ved proteinsyntese koples 15 aa sammen pr. sekund.
Totalantall proteiner i en musezygote kan være opp til 1300 milliarder og i en human
zygote opp til 4400 milliarder.
Et gjennomsnittsprotein består av 300 aa. Teoretisk kan det lages 10 390 forskjellige
proteiner som alle er på 300 aa ut i fra de 20 forskjellige aminosyrer som er til
disposisjon. Dette tallet er så stort at det å lage et slikt antall proteiner vil kreve flere
atomer enn hva hele universet er anslått til å inneholde.
De 50.000 - 60.000 proteinene som skal til for å lage et menneske er derfor et lite og
meget selektivt utvalg i forhold til de teoretiske muligheter. Dette er en proteinskatt som
vi i stor grad har fått fra de andre artene på jorden, og som vi i betydelig utstrekning
deler med dem. Et resultat av evolusjonsprosesser over 4 milliarder år.

3 Molekylære mekanismer for styring - og
opprettholdelse - av gen-ekspresjonsmønstre som
grunnlag for stabil celledifferensiering
3.1 Nivåer for kontroll av gen-ekspresjon på veien til
funksjonelle sluttprodukter.
Figur 3 - 1
3.2 ”Konvensjonell” transkripsjonsregulering.
Transkripsjonsfaktorer. Gen-regulatoriske proteiner inkl.
DNA-bindende proteiner og deres kognate
nukleotidsekvenser
Med ”konvensjonell” transkripsjonsregulering tenker man først og fremst på mekanismer som styrer ekspresjon fra
proteinkodende gener. Den tradisjonelle modellen for dette er vist i figur 3 - 2, bestående av et promotorområde og
enhancer regioner, begge plassert oppstrøms for det ”strukturelle gen”. En rekke gen-regulatoriske proteiner inngår i de
komplekser som avgjør om påvirkningen leder til uttrykking av genet eller represjon av samme. Sentralt i styringskompleksene er
DNA-bindende proteiner (hyppig kalt transkripsjonsfaktorer) som spesifikt kan interagere med utvalgte, kognatenukleotidsekvenser,
ofte bestående av 6-10 nukleotider og lokalisert i enhancer-område

2
Figur 3 - 2
Figur 3 - 3
Ernhancer-områdene er ofte lokalisert flere tusen nucleotider fra promotorregionene. Det er en vanlig antagelse at de regulatoriske
proteiner i begge regioner interagerer ved løkkedannelse av DNA til et stor funksjonelt styringskompleks.

Transkripsjonsfaktorers spesifisitet til kognate nucleotidsekvenser beror på utformningen av funksjonelle domener (”motifs”) i
de DNA-bindende proteiner. En vanlig hovedinndeling av slike domener er som følger:
3
3.2.1 Helix - Turn - Helix utformning.
Dette er en stor samling av DNA-bindende proteiner som bl.a. omfatter en meget viktig gruppe av
transkripsjonsfaktorer av den største betydning under fosterutviklingen. Sistnevnte gruppe kalles homeotiske gener. En rekke av
dem koder kun for ett DNA-bindende proteindomene. Slik informasjon finnes i gen-sekvenser på 180 nt (homeoboksen) som
koder for helix-turn-helix domener i proteinuttrykkene. Disse er på 60 aa og kalles homeodomener. Slike homeotiske poteiner
fungerer gjerne som homo-dimerer ved transkripsjonsregulering. Homeotiske gener som koder for proteiner som kun inneholder
denne type DNA-bindende domene, kalles hox-gener. En rekke homeotiske proteiner inneholder også andre typer DNA-bindende
domener i tillegg til homeodomenet. Gruppen homeotiske gener omfatter derfor mange flere utviklingsgener enn hox-genene
Neste figur viser strukturell organisasjon av et homeodomene protein
Figur 3 - 4
Figur 3 - 5

Bananfluer har 8 homeotiske gener, samlet i to klynger eller ”clustre”. Det er ca. 500 millioner år siden vi (mus og mennesker)
var bananfluer. I løpet av denne utviklingsperioden har de homeotiske gen-samlingene amplifisert seg og fordelt seg på fire av
våre kromosomer (humankromosomer nr. 2, 7, 12 og 17). Neste figur viser et standardkart over de homeotiske gener hos
bananflue og pattedyr inkludert mennesket. Hos vertebrater kalles disse genene Hox-gener.
4
Figur 3 - 6
Legg merke til 3’ - 5’ orienteringen. 3’ –gener uttrykkes tidligere enn 5’ –gener og mere anteriort i organismen. Man sier at det er
en form for ko-linearitet mellom gen-organiseringen i kromosomene og ekspresjonsmønsteret i kroppen.
Hox-gener er avgjørende for identiteten til kroppsavsnitt spesielt langs den anterior –posteriore lengdeakse (hode-hale). Dette
kommer til uttrykk bl.a. i utformningen av neuralrør og neurallister, somitter, ekstremiter m.m.
(Derimot er det utviklingsgener som koder for proteinligander som særlig preger spesifiseringen av dorso-ventral akser (eks. DVakse
i neuralrør) og medial-lateralakser (ML-akser, høyre-venstre akser og organ asymmetrier.)
NON-HOX HOMEOBOKS GENER (NB: Husk alle er TFer!):
Spesifisiteten til homeoboksgener hva angår krav til målgener, øker hvis homeoboksgenet også inneholder nucleotidsekvenser
som koder for andre DNA-bindingsdomener i transkripsjonsfaktorene enn homeodomenene..
Neste figur er en illustrasjon på grupper av slike gener:

5
Figur 3 - 7
Av stor betydning under hele ontogenesen har den undergruppen som kalles Pax-gener .
3.2.2 Transkripsjonsfaktorer med ”zink-finger - domener
I slike proteiner utgjøres DNA-bindingsdomenene ikke bare av en gitt aminosyresekvens, men også av zink-atomer som
strukturelle komponeneter. Et eksempel på strukturell organisasjon figur 3 - 8
Figur 3 - 8
Zink-finger konfigurasjonen benyttes i en rekke transkripsjonsfaktorer som er uttrykt fra utviklingsgener.

3.2.3 Transkripsjonsfaktorer med ”leusin-glidelås-” (Leucine Zipper-) domener.
Heterodimerer
6
Denne type proteiner danner ofte dimerer med proteiner med andre former for DNA-bindende domener, noe som i betydelig grad
øker mulighetene for bindingsspesifisitet til kognate DNA-sekvenser. Mange transkripsjonsfaktorer, kodet for av utviklingsgener,
benytter slike mekanismer.
Figur 3 - 9 illustrerer heterodimerers interaksjon med DNA.
Figur 3 - 9
3.3 Epigenetikk. Kjerne - territorier
Dette fagområdet er for tiden gjenstand for intens forskning, ikke minst som følge av kloning basert på overføring av
differensierte, somatiske celler til enucleerte oocytter. Dette innebærer en grad av reprogrammering av celledifferensiering som
meget få trodde var mulig for få år siden. Her omtales kort visse gen-bruks mekanismer ved normal ontogenese.
Reprogrammering og transdifferensiering omtales i kap. 7.
Regulering av gen-ekspresjon gjennom de konvensjonelle transkripsjonsmekanismer nevnt foran, forutsetter at de involverte
transkripsjonsfaktorer og andre komponenter kan komme i direkte fysisk kontakt med aktuelle cis-regulatoriske områder for et
gitt gen. Dette krever at lokal topografi i kromatinmaterialet er slik at tilgang muliggjøres - ”aktivt kromatin eller ”eukromatin”,
noe som igjen innebærer at det kromosomale målområdet er dekondensert i forhold til heterokromatin. Kromatinets
kondenseringsgrad er også avgjørende for prosesser som DNA-replikasjon, rekombinasjon og DNA-reparasjon i tillegg til gentranskripsjon.
Det er fortsatt mange uklarheter med hensyn til hva om styrer kromsomers kondenseringsgrad i interfase og dermd eukromatin- /
heterokromatin-bildet. Det samme gjelder de enkelte kromosomers plassering i interfasekjerner, f.eks. hvorvidt et gitt kromosom
primært er lokalisert til et bestemt delområde eller territorium innen kjernen.
Vedvarende tilgjengelighet for transkripjonskomplekser til geners regulatoriske sekvenser forutsetter styring av kromosomkonfigurasjoner
på en slik måte at etablerte transkripsjonmønstre kan opprettholdes og dermed være med på å danne basis for
stabile celledifferensieringer og proliferasjonsforhold. Eksempelvis vil fibroblaster, selv etter tallrike mitoser, gi opphav til celler
som fenotypisk er fibroblaster, det vil si transkriberer fibroblast-spesifikke gener. Embryogenesen er hovedfasen i livet for
etablering av differensierte celleformer korrelert med celleproliferasjon. Samtidig legges grunnlaget for å bevare, - stabilisere -
de etablerte transkripsjonsmønstre som er basis for celledifferensieringen.
Hva er de molekylære mekanismer for slike former for celle-hukommelse? Som presisert foran skyldes det ikke endringer av
DNA-sekvenser. Kloningseksperimentene har jo vist at så godt som alle differensierte celler i en organisme er genetisk
ekvivalente.

I dag bruker man betegnelsen epigenetikk for å beskrive slike stabile endringer av genekspresjonspotensialet som særlig etableres
i fosterperioden, men som også kan oppstå / videreutvikles senere i livet og som ikke innebærer DNA-sekvens forandringer. Til
tross for dette er de epigenetiske endringene arvelige, hereditære. De molekylære mekanismer for epigenetikk er spesielt knyttet
til kovalente modifikasjoner som methylering av DNA (inkludert såkalt imprinting eller pregning), videre til det som nå kalles
”histon-koden” (se senere), til non-histon proteiner i kromatin samt ATP-avhengige remodellerings-komplekser.
7
3.3.1 DNA-methylering
Methylgrupper finnes på bestemte steder i DNA og knyttet til cytosin i CpG dubletter og i begge polynucleotidkjeder. Fra 2-7%
av cytosin i DNA hos animalske celler er methylert. Prosessen katalyseres av bestemte methyltransferaser. Slike methylering kan
direkte blokkere mulighetene for transkripsjon av et nærliggende gen (bl.a. ved å hindre enhancer - promotor interaksjon) eller
ved at bestemte methyl-CpG-bindende proteiner bidrar til blokkeringen. I visse tilfeller kan også methylering fremme
transkripsjon.
Like etter fertilisasjonen, under furingsdelingene, foregår det en utstrakt demethylering av genomet (unntatt pregede områder, se
under). Etter implantasjonen starter en global methyleringsbølge (basert på methyltransferase-aktivitet) som er særlig aktiv under
gastrulasjonen hvoretter den avtar. Det er vel etablert at slik DNA-methylering er essentiell for embryogenesen hos vertebrater.
Globalt er over 80% av CpG-sekvenser methylerte i ikke embryonale celler. Men det finnes umethylerte CpG øyer i dette
”methylerte havet”. Slike CpG-øyer kan være 1000 - 2000 nukleotidpar lange. Det er antatt at genom hos pattedyr inneholder ca
20.000 slike øyer, ofte lokalisert til promotor-områder knyttet til ”husholdningsgener”
IMPRINTING (pregning)
En viktig form for methylering av DNA inngår i fenomenet IMPRINTING. Med dette forstår geners hvis ekspresjon er beroende
på om genet kommer fra far eller mor (paternalt eller maternalt allele).
Imprinting ble oppdaget ved eksperimenter utført på mus tidlig på 1980-tallet. Man forsøkte da å få uniparentale, diploide
musefostre til å utvikle seg. (Haploide eggceller kan eksperimentelt diploidiseres og gir da gynogene fostre. Alternativt kan i en
zygote eggcellers kjerne fjernes og sædcellens kjerne eksperimentelt diploidiseres. Dette gir androgene fostre). Ingen av disse to
varianter utviklet seg ut over de tidligste stadier, noe som indikerte epigenetiske forskjeller mellom de paternale og maternale
gameter og at begge er nødvendige for normal fosterutvikling og placentadannelse. De epigenetiske forskjellene knyttet til
imprinting beror særlig på det DNA-methyleringsmønster som etableres i cis-områder til visse gener under gametogenesen. Tallet
på slike gener hos mus og menneske angis ofte til 60-80 stykker. Dette mønster av pregede gener forblir stabilt etter
fertilisasjonen og gjennom den videre utvikling.
Det er visse likheter mellom imprinting som omtalt her og X-kromosom inaktivering hos hunnkjønn.
3.3.2 Histon-koden
Denne er basert på oppfatninger om at histoner, særlig i nucleosomene, kan kovalent modifiseres ved forskjellige former for
enzymaktivitet som fører til methylering, acetylering og deacetylering, fosforylering og ubiquitinering. Videre at non-histon
proteiner kan lese og interagere med slike konjungasjonsmønstre og derved modifisere kromatinstrukturen så f.eks. gener i aktuelt
kromosomområde kan transkriberes.
Sidekjeder til nucleosomale histoner er preferensielle modifikasjonsseter som vist i figur

Figur 3 - 10
8

9
Figur 3 - 11
Det er også gode indikasjoner på at det er et samspill mellom de mekanismer som inngår i histon-kode komplekset og
styringsregimer for DNA-methylering.
Figur 3 - 12

10
3.4 Riboregulatorer. RNAi, miRNA og siRNA.
Translasjonskontroll
RNAi står for RNA interferens. Dette er et forskningsfelt som har fått enorm oppmerksomhet i de siste årene. RNAi er i ferd med
å revolusjonere molekylær biomedisin, både hva angår vår forståelse av mekanismer som fungerer under normal
celledifferensiering, embryogenese / ontogenese og som årsaker til utviklingsdefekter og en rekke sykdommer iberegnet cancer.
Sammenfattet kan man si at RNAi særlig hemmer translasjon av mRNA molekyler og dermed blokkerer dannelsen av kognate
proteinmolekyler. Visse former for RNAi synes også å kunne delta i transkripsjonskontroll og i prosesser som fører til strukturelle
endringer av kromatin.
I tillegg er RNAi også i ferd med å bli et av våre viktigste verktøy for eksperimentelle påvirkninger og analyser innen genomikk,
genetikk og for fenotype-manifestasjoner. Eksperimentell bruk av RNAi vil bli omtalt i kap 6 og 7.
Her vil vi ta for oss noen av de biologiske funksjoner.
Fenomener knyttet til det vi i dag kaller RNAi fikk sitt gjennombrudd i 1998 da Andrew Fire og medarbeidere publiserte en
artikkel i Nature om at tilføring av dobbelt trådet RNA (dsRNA) til modellorganismen C. elegans (en rundorm) førte til sekvensspesifikk
ned-regulering av gen-ekspresjon. (Dette var på en del måter en videreføring og presisering av eksperimenter gjort tidlig
på 1990-tallet på petuniaer, hvor spesielle transgene modifikasjoner hadde gitt slike planter med endret pigmentasjon.) Fires
forsøk hadde også nær relasjon til noe andre C.elegans forskere hadde registrert allerede i 1993 og som var knyttet til ekspresjon
av visse endogene rundorm-gener). Det er en stor overraskelse for de fleste at observasjoner som disse - og særlig Fires arbeid -
på få år skulle få en slik innflytelse på molekylær biologi for planter og dyr og molekylær medisin som vi ser i dag. Man kjenner
i dag en rekke gener knyttet til RNAi hos mange vertebrater, inkludert mus og mennesker.
Det er nå enighet om at RNA-interferens fenomener skyldes effekter av dsRNA, enten dsRNA foreligger inne i celler som følge
av transkripsjon av gener for spesielle (”non-coding”) ncRNA eller fra andre endogene kilder som former for heterokromatisk
DNA, transposoner, visse virustyper eller er tilført fra eksogene kilder. Slikt dsRNA vil bli prosessert inne i cellene i hovedtrekk
på samme måte enten dsRNA har en celleintern eller -ekstern opprindelse. Prosesseringen fører til dannelse av dsRNAer på (ca.)
22 np.
Slike RNA-molekyler kalle microRNA (miRNA) hvis opprindelsen er fra ncRNA-gener (nå også kalkt miRNA-gener). Det
primære transkripsjonsprodukt fra disse gener er på opp til 1000 np og benevnes nå ofte pri-miRNA. Slike molekyler prosesseres
inne i kjernen av et proteinkompleks (kalt Drosha) til pre-miRNA. Selektive eksportmediatorer (som eksportin5) bevirker
transport av pre-miRNA fra kjernen til cytoplasma via kjerneporer. Her bindes pre-miRNA til et nytt proteinkompleks (kalt Dicer)
som videredegraderer pre-miRNA til miRNA. Dette miRNA vil så koples til nok et proteinkompleks, kalt RISC (RNA-induced
silencing complex). Gjennom denne bindingen blir miRNA gjort enkelttrådet (ss = single stranded) og brakt i kontakt med målmRNA
(= mRNA for proteinsyntese) ut i fra nucleotid-komplementaritet mellom ss-miRNA og mål-mRNA. Dette leder til
inaktivering / degradering av mål-mRNA og manglende syntese av det (kognate) protein som det inaktiverete mRNA inneholdt
informasjon for. Man har nå identifisert ca 250 miRNA gener hos mus og menneske.
Biogenesen av miRNA i planteceller følger de samme hovedlinjer som her angitt for animalsk miRNA, men med en del ulikheter i de enkelte ledd
Også prosessering av eksogen RNA fører til dannels av molekyler på 22 np. Disse kalles hyppig small iinterfering RNA (siRNA)
og koples til RISC-komplekser med samme effekter som for miRNA.
Både miRNA og siRNA er derfor en viktige mekanismer for translasjonskontroll.
Figur 3 - 13 (fra D.P.Bartel i tidsskriftet Cell for 23. jan. 2004) gir en sammenfattet fremstilling av disse prosesseringsveier:

11
Figur 3 - 13
RNAi systemet er mest kjent i relasjon til translasjonskontroll med hemming av manglende proteinsyntese som resultant. Det bør
understrekes at slike dsRNA-molekyler også kan ha andre effekter, så som aktivering av transkripsjon av proteinkodende gener.:
Et meget sentralt punkt i utviklingsbiologi er spørsmålet om hvordan de ulike vevstyper og cellelinjer innen disse, etableres. Slike
spørsmål blir nærmere behandlet i kap.7. Her skal bare nevnes som et eksempel visse forhold hva angår multipotente, adulte,
neurale stamceller i hippocampus. Slike celler kan proliferere, men transkripsjon av de gener som skal til for å gjøre dem til aktive
neuroner er normalt hemmet. Hvordan kan denne hemmingen oppheves ved behov? Fred Gage og medarbeidere ved Salk
instituttet har nylig (mars 2004) vist at en bestemt type dsRNA på ca 20 np er nødvendig og tilstrekkelig for å oppheve
differensieringshemningen av slike stamceller og dirigere dem inn på en utviklingsvei til å bli aktive neuroner.
RNAi-systemet kan også bevirke forandringer av kromatin-konfigurasjoner, muligens ved å påvirke DNA-methyleringsforhold.
Nylig (februar 2004) er det fremstilt transgene mus hvor et gen for et essensielt protein i Dicer-komplekset er satt ut av funksjon.
Derved umuliggjøres også Dicer-funksjonen. Dette er letalt allerede i gastrulasjonsfasen for homozygote knockout-mus av denne
typen, en klar indikasjon på betyningen av RNAi-prosesser i tidlige trinn av fosterutviklingen.
Det er grunn til å tro at videre forskning i de nærmeste årene vil klarlegge mange sider ved RNAi-systemets betydning for
fosterutvikling / ontogenese hos mus og mennesker

12
3.5 Andre translasjonskontrollpunkter
Disse fremgår av figur 3 - 14.
Figur 3- 14

4 Endogene og eksogene signalsystemer som
påvirker gen-funksjoner .
Morfogenetiske gradienter.
Funksjonell genomikk er først og fremt et spørmål om informasjon som ligger lagret i et gitt gen eller grupper av gener blir
uttrykt (blir aktivert) i form av gen-produkter som RNA og proteiner eller om informasjonsuttrykking hindres, blokkeres.
Slike aktiverings- / represjonsvalg er svært avhengig av hvilke signaler som når frem til aktuelle gener og deres regulatoriske
områder noe som også i betydelig grad avhenger av kromatin-topografien (inkluderte de epigenetiske forhold) i aktuelle genregioner,
se kap. 3.
I denne del skal vi særlig befatte oss med visse sider av signalsystemene. Noen hovedfaktorer er vist i neste figur:
Figur 4 - 1
4.1 Endogene (interne) signaler
er signaler fra cellen selv. De kan f.eks. ha sin opprinnelse i intracellulære forskjeller i molekylfordelinger i celler som har
gjennomgått asymmetriske mitoser. Dattercellene etter asymmetriske mitoser vil nødvendigvis innbyrdes ha ulike
molekylfordelingsmønstre. Man vet relativt lite om hvordan topografiske forskjeller av denne art kan lede til signaldannelse og
hvilke signalveier som er operative for å formidle signalene til gen-regulatoriske områder. Forholdene kompliseres også ved at
slike celler hele tiden påvirkes av eksogene signaler.

2
4.2 Eksogene (eksterne) signaler
Grunnlaget for ”ekstern” kommunikasjon er celle-celle- og celle-ECM-interaksjoner. Fra gammelt av (”klassisk embryologi”)
ble slik kommunikasjon eller signalformidling - kalt embryonal induksjon.
I dag vet vi at disse signalene (induksjonssubstansene) er definerte, kjemiske forbindelser, hyppigst protein-vekstfaktorer,
produsert og utskilles av nettopp naboceller. Videre vet vi nå at potensielle målceller for en gitt ligand er de celler i området som
er utstyrt med kognate receptorer for det aktuelle signalstoff. Celler uten slike receptorer er ikke målceller.
Hvis signalstoffene er proteiner, vil kognate reseptorer befinne seg i målcellenes ytre cellemembran, og interaksjonen vil starte
opp former for intracellulær signal- formidling.
(Er signalstoffene derimot lipofile forbindelser, som retinsyre (et vitamin A – derivat), steroider, thyroxin e.l., vil substansene
kunne passere målcellenes cellemembran for deretter å binde seg til intracellulære receptorer. Best kjent er de såkalte
”kjernereceptorer” – som har vært omtalt i andre sammenhenger i molekylær cellebiologi. Dette vil ikke bli gjentatt her, men det
er viktig å understreke at bl.a. retinsyre har en helt sentral plass i reguleringen av embryogenesen)
Neste figur viser viktige ledd i slik intracellulær signalformidling:
Figur 4 - 2

3
Proteinligander – vekstfaktorer – som fungerer under embryogenesen - er til dels slike som allerede er omtalt under andre emner i
molekylær cellebiologi med reseptorer som er G-protein koplet (7TM Seven pass transmembrane receptor) og reseptorer som er
enzym-koplede (særlig
RTK: Receptor Tyrosine Kinases og Receptor Serine/Threonine Kinases).
I tillegg kommer signalveier hvor regulert proteolyse er et essensielt element.
Signalveiene leder frem til gener som har kognate sekvenser i sine regulatoriske områder. Slike MÅLGENER kan være gener
som koder for nye proteinligander som utskilles fra målcellene. Eller målgenene kan kode for transkripsjonsfaktorer som initierer
eller hemmer transkripsjon fra et annet sett av målgener i de samme målcellene. Derved utløses kaskadeeffekter som ofte
forsterker (amplifiserer) responsen fra de primære målceller i tillegg til hva som skyldes transduksjons-fenomener under
signalledningen.
4.2.1 Eksempler på tyrosin-kinase koplede reseptorer som er viktige under
embryogenesen
Figur 4 - 3
Mest kjent i fosterutviklingssammenheng er Fibroblast Growth Factor (FGF) gruppen. Den omfatter (ca.) 12 ligandmedlemmer.
4.2.2 Eksempel på Serin / Threonin Kinase koplede reseptorer:
Transforming Growth Factor β− (TGFβ-) superfamilien omfatter flere enn 25 proteinligander som Bone Morphogenetic Proteins
(BMPer) og activiner som er svært sentrale for embryogenese. Hovedpunkter i signalveiene er vist i neste figur:

4
Figur 4 - 4
4.2.3 Signalveier som avhenger av regulert proteolyse
4.2.3.1 Notch - Delta systemet
Signalisering via Notch reseptor og signalproteinet Delta er kanskje den hyppigst benyttede signalvei under fosterutviklingen hos
dyr og mennesker. Hovedleddene er vist i neste figur:
Figur 4 - 5

5
4.2.3.2 Wnt og β-catenin systemet (Wingless)
(Wnt uttales “vint”)
Det er identifisert vel 10 Wnt-ligand medlemmer.
Figur 4 - 6
4.2.3.3 Hedgehog – systemet
Hedgehog-proteinene kodes av minst 3 gener hos vertebrater. Mest kjent er genet som koder for protein-liganden Sonic
Hedgehog og som har et utall sentrale funksjoner under fosterutviklingen og ellers. Dessuten finnes gener for protein-ligandene ”
Desert Hedgehog” og ”Indian Hedgehog. ”Den aktive formen av hedgehog-proteinene er alle kovalent koplet til cholesterol i
plasmamembraner hvilket er medbestemmende for deres ekstracellulære diffusjonsmuligheter. Disse poteinligandene må også
binde til seg en bestemt fettsyrekjede for å bli funksjonelle. Hovedleddene i signalveiene er nå klarlagt og vises i neste figur:

6
Figur 4 - 7
4.3 MORFOGENETISKE GRADIENTER
I alle disse situasjoner (og en rekke andre) er sentrale spørsmål: 1) hva som bestemmer rekkevidden til de utskilte ligander og 2)
hvordan fordeles ligandmolekylene i forhold til produsentcellenes posisjoner. Settes det f. eks.opp gradienter slik at
ligandkonsentrasjonen avtar med avstand fra produksjonssted (”morfogenetiske gradienter”)? I så fall hva er grunnlaget for
gradientetableringen? Hva betyr binding til ECM? Videre, vil ulike ligandkonsentrasjoner kunne utløse forskjellige
differensieringsprogrammer i målceller osv. Et sammendrag av forskjellige syn på dette presenteres i figur 4 - 8 og 4 - 9.

Figur 4 - 8
7

8
Figur 4 - 9
(Fra: John Gurdon. Annual review of Cell and Developmental Biology. 2002)
4.4 Interaksjoner mellom proteinligander
Hvorvidt en celle i en multicellulær organisme kan respondere på en gitt ligand avhenger primært av om den har egnede
reseptorer for liganden. Men i tillegg må cellen som helhet være i en kompetent status hva angår den videre intracellulære
signalformidling. Videre er det viktig å være klar over at celler hele tiden blir utsatt for hundrevis av signalmolekyler fra
omgivelsene. Ofte er det slik at bestemte kombinasjoner av signalpåvirkninger må foreligge for å gi en adekvat respons. En slik
responsiv fase kan også være meget kortvarig. Påvirkningen må derfor finne sted innenfor bestemte tidsvinduer. Utenfor disse vil
en gitt ligand eller ligandkombinasjon ikke ha noen effekt eller en helt annen påvirkningskarakter.
Ligandenes halveringstid er også av stor betydning.

9
Ut i fra slike vurderinger er det overraskende at det er mange eksempler på at eksperimentell eksponering for en del ligand-typer
på en dramatisk måte kan påvirke embryogenesen. En forklaring er at noen ekstracellulære proteinligander kan ha inhibitoriske
effekter på hverandre (chordin – noggin –BMPer) hva angår konsentrasjon eller distribusjon av funksjonelle signalkomplekser.
Det har lenge vært kjent at dannelse av sekundær embryo kan utløses ved transplantasjon av den dorsale blastopor-leppe hos
amfibier. Den primitive knute (Hensens knute) er en tilsvarende struktur.
Lignende resultater kan idag oppnås ved bruk av definerte signalproteiner som appliseres på egnede steder i fosteret. Alternativt
kan mRNA molekyler for denne type proteiner injiseres i celler. Translasjon av slike mRNAer kan føre til dannelse av sekundær
embryoner. (Det er vanskelig å gjøre amfibier transgene, derfor benyttes teknikker som her angitt).
Figur 4 - 10
Figur 4 - 11

5 Molekylære mekanismer ved bestemte trinn i
embryogenesen
5.1 Gametogenese
Kjønnscelleutviklingen finner jo sted før fertilisasjonen og dermed før starten av embryogenesen. Men gametogenesen omfatter
en rekke celluære og molekylære prosesser av avgjørende betydning for etableringen av et nytt individ. Det er derfor vanlig å
medta dette emneområdet i en omtale av molekylær utviklingsbiologi. I vår sammenheng blir dog bare utvalgte hovedpunkter
omtalt.
Dannelsen av kjønnsceller er en langvarig og krevende opplæringsprosess. Oocytter og spermier må sees på som høyt
spesialiserte celler. Når en eggcelle og sædcelle fusjonerer ved fertilisasjonen, dannes en zygote som har informasjon for å
utvikle seg til et komplett nytt individ.
På et meget tidlig fostertrinn, kanskje allerede på blastocysttrinnet, segregeres visse celler i forhold til de øvrige cellene i den
indre cellemasse (ICM). Slike celler har dermed slått inn på en differensieringsvei som noe senere gjør dem til forstadieceller for
kjønnsceller. Slike forstadieceller kalles primordiale kimceller,(” primordialer germ cells”, PGC). Hos mennesket kan
primordiale kimceller med sikkerhet først påvises i slutten av 3. fosteruke i veggen av plommesekken (se Langman, fig. 1.7). Her
deler de seg mitotisk og migrerer så mot slutten av 4. fosteruke og i første del av 5. fosteruke inn i selve fosteret og videre til
gonadeanleggene. PCG i ovarieanlegg fortsetter med mitotiske celledelinger og differensieres etterhvert til oogonier. Også
oogoniene deler seg mitotisk. Tallet på dem øker hos mennesket til antatt ca 7 millioner i 5. fostermåned. I tidsperioden frem til
7. fostermåned vil en rekke oogonier differensieres til primære oocytter. Etter gjennomgått S-fase vil primære oocytter gå inn i 1.
meiotiske profase Oogonier som ikke differensieres, vil bli borte som følge av programmert celledød. Nær fødselen er alle
primære oocytter i meiotisk profase 1. Antallet på dette tidspunkt er anslått til 1 - 2 millioner. Den meiotiske celledeling stopper
opp i profase 1 inntil individet når puberteten. På dette tidspunkt er tallet på primære oocytter redusert til ca 400.000. Fra
puberteten av vil 5 - 15 primære oocytter med tilhørende hjelpeceller fortsette meiose-og modningsprosessene pr.
menstruasjonscyclus. Vanligvis ovuleres kun én eggcelle pr. syklus. Meiosen fullføres kun hvis den ovulerte eggcellen blir
fertilisert.. Totalt vil ikke over 500 eggceller bli ovulert i en kvinnes reproduktive periode.
Hos menn begynner differensieringen av de primordiale kimceller til spermatogonier først ved puberteten. Disse cellene fungerer
som stamceller som deler seg mitotisk resten av livet til nye stamceller og til primære spermatocytter som så gjennomgår meiose
og den prosess som kalles spermiogenese., noe som tilsammen er angitt til å ta 64 døgn. Meiosen ved spermieutvikling tar 24
døgn Antall spermier i et ejakulat er ca 200 - 300 millioner, men bare omlag 200 av disse når frem til fertiliseringområdet som er
den del av en eggleder som ligger nærmest et ovarium.
Meiose er et avgjørende ledd i gametogenesen. Gjennom meiose I og II vil diploide celler med 46 to-kromatid kromosomer gi
opphav til fire celler som hver har 23 én-kromatid kromosomer. Essensiell er den tilfeldige fordelingen av maternale og paternale
to-kromatid kromosomer under meiose I (2 23 =8.6 x 10 6 varianter kan teoretisk dannes). I tillegg kommer overkrysningen mellom
maternale og paternale kromatidene i homologe kromosompar under profase I. Begge disse forhold gjør meiosen til en genetisk
forskjelliggjøringsprosess.
Det er dessuten viktig å være klar over den epigenetiske reprogrammering som foregår under gametogenesen. Best kjent er
endringene hva angår methylering av DNA. I tidlige stadier av gametogenesen skjer det en utstrakt demethylering av DNA.
Denne etterfølges senere i kjønnscelleutviklingen i dannelse av et nytt og omfattende mønster av methylert DNA., inkludert
selektiv methylering av paternale og maternale alleler (imprinting, se kap. 3).

2
Figur 5 - 1
5.2 Fertilisasjon og preimplantasjonsutviklingen
(furingsdelinger -”cleveage”- og blastocystdannelse)
5.2.1 Fertilisasjon
Fertilisasjonen finner normalt sted i ampulledelen av ovidukten.
Hit må eggcellen transporteres etter ovulasjon til peritonealhulen, fortsatt omgitt av zona pellucida og
corona radiata. Det er antatt at cilievirksomhet og kontraksjoner av glatte muskelceller i egglederveggen er
viktig for transporten inn i ovidukten. Likeledes må spermier nå frem til ampulledelen fra deponeringssted
i vagina. Normalt varierer ejakulatvolumet mellom 2 – 6 ml og spermietallet fra 40 – 250 millioner. Av
disse antar man at bare ca 200 stykker når frem til ampulleområdet. Kontraksjon av glatte muskelceller i
oviduktveggen samt spermienes flagellebaserte bevegelser utgjør transportmekanismen.
Selve fertilisasjonen omfatter følgende hovedpunkter:
Spermiens penetrasjon av corona radiata
Feste til og penetrasjon av zona pellucida
Adhesjon til eggcellen og fusjon mellom spermien og eggcellen (zygotedannelse)
Umiddelbare reaksjoner i zygoten
Spermiene baner seg vei mellom corona radiata celler ved svømmebevegelser og muligens ved frigjøring av
hyaluronidase fra acrosomkappen.
Hos mennesket er zona pellucida 13 µm tykk.
Hos mus består zona pellucida særlig av 3 typer av glykoproteiner, kalt ZP1, ZP2 og ZP3. som kan
interagere med hverandre og danne nettverksstrukturer. Zona pellucida hos mus inneholder over 1
milliard ZP3 molekyler som kan fungere som reseptorer for molekyler som galaktosyl transferase i
spermienes cellemembran. Dette leder til influx av Ca ++ i spermiehodet, noe som utløser acrosomal

3
reaksjonen hvilket frigjør et stort antall enzymer som kan nedbryte zona pellucida lokalt. Av særlig stor
betydning er en serin protease. Spermien kan deretter penetrere zona pellucida og komme inn i
mellomrommet mellom denne og eggcellens cellemembran. Dette rommet kalles perivitellinrommet.
Binding av en spermie til eggcellens cellemembran synes å være basert på molekylkomplekser som
etableres i spermiens cellemembran svarende til ekvatorialområdet av spermiehodet som et resultat av
acrosomal reaksjonen. Disse molekylkompleksene muliggjør binding av spermien til utvalgte integriner i
eggcellens cellemembran. På kontaktstedet vil det så skje en fusjon mellom eggcellens cellemembran og
spermiens cellemembran og en zygote etableres. Denne kontinuiteten av de to cellers membraner fører til
at spermiens hode, kropp og hale inkorporeres i eggcellens cytoplasma.
Derved vil også spermiens mitochondrier bli opptatt, men disse synes ikke å bidra under dannelsen av det nye individ. I så fall er
det nye individs mitochondrier alle av maternal opprinnelse.
Man antar at disse fertilisasjonsmekanismene hos mus i hovedtrekk er tilsvarende hos mennesket.
Figur 5 - 2
Det nye individs genetiske kjønn bestemmes av om det er en spermie med X- eller Y-kromosom som fertiliserer eggcellen.
Polyspermi-forebyggende reaksjoner
Straks én spermie har fusjonert med eggcellen, sperres adgangen for andre spermier til eggcellen. To hovedmekanismer opererer
hos mus. Den første består av en hurtig elektrisk depolarisering av zygotens plasmamembran. Hos flere arter endres
hvilepotensialet fra –70 mV til + 10 mV på 2-3 sekunder etter fusjonen. Endringer varer noen ganske få minutter. Man antar nok
en gang at lignende forhold gjør seg gjeldende også hos mennesket.
Deretter trer neste mekanisme i funksjon. Denne starter med en influx-bølge av Ca ++ på fusjonsstedet. Ca ++ -økningen fordeles
over hele zygoten og aktiverer sekvensielt cortical granula slik at disse sekretblærene fusjonerer med zygotens plasmalem og
blæreinnholdet (polysakkarider og hydrolytiske enzymer) tømmes ut i perivitellinområdet. Dette bevirker hydrolyse av
spermiereseptorene (ZP3) i zona pellucida og hindrer flere spermier i å binde seg til denne.

4
Metabolsk aktivering av zygoten
Dette skjer meget snart etter fertilisasjonen, sannsynligvis som et resultat av Ca ++ -influxen
Dekondensering av spermiekjernen. Pronuclei
Kort tid etter spermiens inntrengning i eggcellen erstattes protaminene i sædcellens kromosomer med histoner, noe som fører til et
normalt kjernebilde, som også ligner på eggcellens kjerne. De to haploide kjerner i zygoten med slikt utseende, kalles pronuclei..
Hver av disse pronuclei går så inn i en S-fase. De to pronuclei møtes og deres kjernemembraner oppløses. Snart vil zygoten gå inn
i sin første mitose. Kromosomtallet er 46 to-kromatidkromosomer og 12 pg (picogram) DNA, dvs. det samme som forut for
mitose for alle somatiske celler hos mennesket. Slik sett representerer fertilisasjonsprosessen en reversering av meiosen med
nyetablering av en diploid celle, zygoten.
Figur 5 - 3
Det finnes tallmateriale fra Vest-Europa og USA som indikerer at bare ca 30% av etablerte kontaktforhold mellom en spermie og
en eggcelle resulterer i fødte mennesker. Det betyr i så fall at omlag 70% av slike kontaktforhold resulterer i en eller annen form
for spontan abort. I tillegg kommer tallet på provoserte aborter.
5.2.2 Furingsdelinger. ”Cleavage”. Blastulasjon.
Den første delingen av zygoten finner sted ca 24 timer etter fertilisasjonen Denne plus alle etterfølgende celledelinger er mitoser,
altså
konserverende hva angår genetisk informasjon. Følgelig kan det nye individ sees på som en celleklon med zygoten som

5
utgangscelle. På 2-celletrinnet vil hver av cellene ha en masse som er svært lik halvparten av zygotens, på 4-celletrinnet
har hver celle en masse som er lik en fjerdepart av zygotens masse osv. De enkelte cellene kalles blastomerer og prosessen
benevnes blastulasjon. Den pågår i ca 5 døgn inntil celletallet er noe over hundre. Da vil fosteret være transportert til uterus og
snart klar for innvekst i endometriet.
Figur 5 - 4
Blastomerene er alle plassert innenfor zona pellucida Denne hinnen har tilnærmet konstant diameter under hele blastulasjonen og
av samme størrelse som før fertilisasjonen. Cellesyklus under blastulasjonen består nesten bare av S-fasen og mitose-fasen idet
blastomerene deler mellom seg eggcellens cytoplasma. Celledelingene er asynkrone slik at man finner fostre med ulike tall celler.
I hvilken grad disse celledelingene også er asymmetriske – på molekyl fordelingsnivå – er ikke klarlagt. Transkripsjon av det nye
individs genom, ”zygote-genomet” starter hos pattedyr på 2-celletrinnet, men med moderat intensitet under mesteparten av
preimplantasjonsutviklingen.
Når tallet på celler er blitt 8-16 vil ikke alle blastomerene kunne ha den samme topologiske posisjon i fosteret. Noen blastomerer
plasseres sentralt, bort fra zona pellucida, de resterende befinner seg perifert. Dette sees på som en av de første avgjørende
celledifferensieringene noe som kan skyldes at de to grupper av celler får forskjellige mikromiljøer. De perifert beliggende celler
vil på dette trinn danne mange ”gap-” og ”tight-junctions”, noe som gir en markert celleadhesjon og gjør det vanskelig å observere
de enkelte celler i lysmikroskopet. Prosessen kalles ”compaction”. Fra gammelt av sammenlignes nå fosteret med et morbær.
Dette særtrinn under blastulasjonen benevnes morula-stadiet.

6
Figur 5 - 5
I denne perioden vil et Na + -, K + - ATPase basert Na + transportsystem føre til at Na + og H 2 O forflyttes fra det perifere
blastomerskiktet og samler seg i mellomrom mellom de sentralt beliggende blastomerer. På døgn 4-5 vil disse små væskefylte
hulrom ha konfluert i ett større, kalt blastocoelen (”blastocølen”). De perifere blastomerer benevnes nå trofoblaster og de sentralt
plasserte blastomerer den indre cellemasse (ICM). Fosteret som en helhet kalles en blastocyst. Alle cellene har fått en størrelse på
linje med vanlige ”kroppsceller”, somatiske celler.
Det nye individ vil i sin helhet utvikles fra noen få (3-5 ?) av cellene i ICM. De resterende ICM-celler og alle trofoblastene vil kun
danne fosterhinner, se figur 5 - 6 her:

7
I løpet av døgn 5-6 vil fosteret klekkes, det vil si komme ut av zona pellucida. Enkelte trofoblaster blir i stand til å skille ut et
trypsinlignende enzym som bevirker dannelsen av et lokalt hull i zona. Fosteret ”smyger” seg ut av dette hullet for så (i de
fleste tilfelller) å feste seg midt på bakre uterusvegg. Dette skjer hos mennesket 6-7 døgn etter fertilisasjonen. Neste trinn er selve
implantasjon av fosteret i uterus.
Under hele preimplantasjonsperioden skjer det en global demethylering av DNA med unntak for de pregede (imprinted) gener.
Disse beholder det methyleringsmønster som ble etablert i de siste deler av gametogenesen. Ny global DNA-methylering finner
sted særlig under gastrulasjonsfasen.
For omtale av implantasjonen og utviklingen i uke 2 henvises til kapittel 3 i Langmans bok.
5.3 Gastrulasjonsprosessen. Etablering av de tre kimlag
Gastrulasjonen
De tre kimlag (ektoderm, mesoderm og endoderm) dannes alle fra epiblastskiktet gjennom den prosess som kalles gastrulasjon.
Starten av gastrulasjonsprosessen kan observeres fra begynnelsen av 3. fosteruke (døgn 15-17) som en strekformet fortykning i
midtlinjen i apex-området av det pæreformede epiblast-laget, sett fra ”taket av amnionhulen”, ”ned på epiblastlaget”, ”dorsalt
fra”.
Fortykningen er et resultat av at epiblastceller deler seg og migrerer mot dette området. Den strekformede fortykningen, som
kalles den primitive strek (”primitive streak”) er et resultat av ”kødannelse”, volddannelse, på hver sin side av midtlinjen av slike
migrerende epiblaster som konvergerer mot dette området. Epiblaster i det primitive strek-området vil så form-endre seg og
migrere inn under (ventralt for) epiblastlaget, mellom dette og hypoblastlaget.Prosessen kalles ingresjon. Dette nye skikt benevnes
nå midtlaget (mesoderm), samtidig omdøpes epiblastlaget til ektoderm. Det er noe uklart hvordan det indre kimblad (den
definitive endodermen) dannes hos mennesket, men det vanligste syn nå er at omdannede epiblaster fra den primitive strek
vandrer inn og fortrenger hypoblastcellene for så å etablere endodermskiktet, parallelt med mesoderm-dannelsen.
Etableringen av den primitive strek er også en markering av at fosterets lengdeakse i anterior – posterior, AP- (senere kalt
craniocaudal-) retning nå er bestemt og dermed også venstre – høyre- aksen (left – right, LR). Den dorso-ventrale akse (DVaksen)
er forlengst etablert som angitt foran. Dermed er alle de tre primære kroppsakser fastlagt.
De volder av epiblaster som er nevnt over, er kontinuerlig med hverandre i anterior retning og begrenser her en grop som også er
en avslutning av den renne som man finner mellom de to voldene. Gropen kalles det primitive innsøkk og sammen med volden
akkurat i dette området benevnes hele strukturen den primitive knute (”node”) eller Hensens knute. Den primitive knute er et
overordnet organisasjonssenter under fosterutviklingen, og en struktur som tilsvarer det som kalles den dorsale blastoporleppe
ned gjennom chordatrekken .

8
Figur 5 - 7
Den generelle mesoderm kommer til å separere ektoderm og endoderm nesten alle steder, unntatt i det området som kalles oropharyngealmembranen
og cloacalmembranen, se fig. 3-15. Dette betyr at vi også finner mesoderm mellom ektoderm og endoderm
i den mest anteriore del av fosteret, ”foran” oro-pharyngelamembranen. Her anlegges hjertet i slutten av tredje fosteruke.
De epiblastceller (senere ektodermceller) som proliferer i lengdeakseområdet anteriort for den primitive strek, migrerer mot
Hensens knute hvor de ingrerer for så samlet å migrere som en cellulær streng i midtlinjen fra Hensens knute og i anterior retning
mellom ektoderm og endoderm. Den særformen av mesoderm kalles chordamesoderm, men hyppigst brukes betegnelsene chorda
dorsalis eller notochord. Alle dyr som under embryogenesen har en slik ryggstreng, benevnes chordater. Denne gruppen
inkluderer alle vertebrater.
Ryggstrengen strekker seg i anterior retning nesten til oro-pharyngealmembranen, bare skilt fra denne av en spesialstruktur som
kalles prochordalplaten. Denne består av alle tre kimlag. Mesodermen her har spesielle egenskaper (se senere).
Figur 5 - 8
Den generelle mesodermen, som ligger på hver sin side av ryggstrengen, navnsettes i medial – lateral retning ut i fra lokalisasjon i
forhold til denne aksestrukturen. Den del av mesodermen som ligger nærmest ryggstrengen, på hver sin side av denne, benevnes
den paraksimale mesoderm (para-aksiale), den del av den generelle mesoderm som ligger lengst ut til siden i fosteret, kalles
lateralplate mesodermen og mesodermen mellom disse to områder benevnes den mellomliggende mesoderm eller intermediær
mesodermen.

9
5.4 Dannelse av neuralrør og neurallister (neurulasjon)
Figur 5 - 9

10
Figur 5 - 10
Figur
5 - 11

11
Dorso-ventral differensiering av neuralrøret, se figur 5 - 12:
Figur 5 - 12

12
Dannelse av neurallister, se figur 5 - 13
Figur 5 - 13

13
5.5 Regionalisering av mesodermen. Somittdannelse
Figur 5 - 14
Figur 5 - 15

Figur 5 - 16
14

6 Embryo-relaterte teknologier.
Medisinske implikasjoner
Den meget store økningen i vår forståelse av mange basale mekanismer innn molekylær embryologi i de senere år skyldes i høy
grad at utviklingsbiologer har utviklet en rekke avanserte, embryo-relaterte teknologier. Mange av disse har store medisinske
implikasjoner og har etterhvert fått en rekke praktiske applikasjoner.
Embryo-relaterte teknologier omfatter bl.a.:
(Kloning av dyr (reproduktiv og terapeutisk kloning, samt isolasjon og karakterisering av embryonale og andre former for
stamceller vil bli omtalt i kapittel 7. Det samme gjelder eksempler på retningsdirigert differensiering av stamceller,
celletransplantasjoner og celleterapi.)
6.1 In vitro fertilisasjon
Figur 6 - 1

2
6.2 Spermie-injeksjon i eggcelle
Figur 6 - 2
6.3 Pre-implantajonsdiagnostikk (fig. 21.10 s. 694
Figur 6 - 3

3
6.4 Fremstilling av chimere mus
Dette er en meget viktig teknikk i molekylær utviklingsbiologi. Den er en forutsetning for å kunne fremstille såkalte ”knockout /
knockin” - mus etter målrettede gen-modifikasjoner av embryonale stamceller (ES-celler, se kap. 7) Kimlinje -transgene, chimere
dyr kan tilbakekrysses til homozygositet.
Figur 6 - 4

4
6.5 Transgene mus inkludert knockout- / knockin- transgene dyr. CreLox-teknologi
For en nærmere omtale av teknologier for fremstilling av transgene dyr, inkludert mus hvis egne gener er blitt modifisert, se
essential cell biology, fig. 10-38 og tilhørende tekstsider.
Det er verdt å påpeke at ved bruk av transgener designet for homolog rekombinasjon til endogene gener, vil interaskjon med
spesifikt målgen kunne foregå i løpet av minutter og slik at det endogene målgen blir satt ut av funksjon eller endret på annen
måte umiddelbart. Til og med enkeltnucleotid-modifikasjoner kan skje (svarende til å finne én bestemt millimeter innenfor en
strekning på 3000 km).
Her skal kun omtales den såkalte CreLox-teknologi. Kort fortalt gå den ut på å endre - som regel fjerne - DNA-sekvenser i
genomet som er flankert av to nukleotidstrekninger på ca 30 nt. Disse strekningen tjener som sete-spesifikke bindingsomåder for
en bestemt gruppe av rekombinaser, i denne sammenheng den som kalles for Cre (=causes recombination).
CreLox-teknologi bernyttes særlig til to formål:
6.5.1 Til tid- og sted-kontrollert utkutting av endogene gener /-genfragmenter
Når Cre foreligger i kjernen på celler med Lox-flankerte DNA-sekvenser (f.eks. et endogent gen), så vil enzymet kutte ut DNAsekvensen.
I slike tilfeller må aktuell DNA-sekvens på forhånd være blitt flankert med Lox-strekninger, noe som utøres ved
homolog rekombinajons -prosedyrer.
Det avgjørende for tid- og sted-kontroll blir styringen av Cre’s tilstedeværelse. Tradisjonelt har man derfor fremstilt transgene
muselinjer med ønskede Lox-flankerte gen-områder. Slike mus krysses med mus gjort transgene for Cre-genet, styrt av en
vevsspesifikk og / eller induserbar promotor. Der hvor Cre uttrykkes vil Lox-flankert gen-område deleteres. Cre-enzymet kan
også appliseres lokalt ved in vivo elektroporasjon.
Ved konvensjonell knockout-teknologi vil fremgangsmåten føre til at det endogene gen fjernes / inaktiveres i alle celler fra
begynnelsen av fosterutviklingen. Dreier det seg om et gen hvis ekspresjon er essensielt på tidlig embryotrinn av, så vil
delesjonen være letal allerede ved starten av fosterutviklingen. Dette umuliggjør studier av slike geners betydning på langt senere
trinn i utviklingen som under organdannelse.
6.5.2 Til tid- og sted-kontroll av transgeners ekspresjon
Et vanlig transgen består av en promotor (styringsområdet for ekspresjon) og selve transgenet. Mellom disse to kan man ved
konstruksjonen innsette et Lox-flankert DNA-fragment på ca 1000 nt. Dette DNA-fragment hindrer ekspresjon av transgenet og
kalles ”STOPP”. Nærvær av Cre-enzymet vil kutte ut STOPP og dermed føre til ekspresjon av transgenet i samsvar med
styringsområdets konstruksjon.
6.6 Autofluorescerende proteiner (AFP) som celle- og gen-markører
I eksperimentell molekylær utviklingsbiologi inngår ofte ulike former for transplantasjoner av celler, vev og organer til ektopiske
lokalisasjoner eller mellom organismer. I tillegg er kombinasjoner mellom vevstyper vanlige, f. eks. epitel- / mesenchymrekombinanter
ved organogenese studier. Det er av uvurderlig betydning å ha genetiske markører som gjør det lett å holde orden
på opprinnelsen til transplantatene. Spesielt viktig er det å ha markører som enkelt muliggjør identifikasjon i levende materiale.
I de senere år har man fra forskjellige marine arter isolert gener som koder for proteiner som fluorescerer hvis de blir utsatt for lys
med egnet bølgelengde. Slike proteiner sies å være autofluorescerende (AF). Det er mulig å transfektere celler og å fremstille
transgene dyr med DNA-konstrukter for slik AF-proteiner. Transkripsjonen av AF-genenene kan reguleres av styringsområder
som gir ekspresjon i alle celler i transgene dyr (global ekspresjon) eller styringsområdene kan være satt opp for vevsspesifikk,
regional ekspresjon. AF-proteinene interferer ikke med normal aktivitet til celler hvor de forekommer.
I dag finnes det en rekke muselinjer som er transgene for slike AF-proteiner, bl.a. AF-proteiner som gir grønn-, gul- og blå
fluorescens ved eksitasjon. Figur 6 - 5 (fra Andras Nagys arbeider) viser to typer av museblastocyster fra muselinjer transgene for
henholdsvis grønt-AF-protein (GFP) og blått- (cyan-) AF-protein (CFP). Figur 6 - 6 viser tilsvarende musefostre i senere
utviklingstrinn:

5
Figur 6 - 5
Figur 6 - 6
Gener for autofluorescerende proteiner kan i DNA-konstrukter koples til aktuelt transgen slik at begge gentyper uttrykkes.
Alternativt kan de to gener koples sammen ved hjelp av IRES-sekvenser (IRES = internal ribosome entry site) slik at det dannes
proteiner fra markør-gen og transgen. Dette gjør det enklere å analysere transgenets ekspresjon og produktlokalisasjon. I mange
tilfeller vil markørproteinets tilstedeværelse ikke interferere med transgen-proteinets aktivitet.
6.7 Tetraploide teknologi (TEC-teknologi)
Hvis de to blastomerer bringes til å fusjonere når et musefoster er på to-celle stadiet, dannes det et foster bestående av én celle
som er tetraploid. Denne vil dele seg i kultur og etter noen dager gi et foster på blastocysttrinnet. Alle blastocystens celler er

6
tetraploide. Det har vist seg at hvis tetraploide blastocyster innføres i vertshunner, så vil implantasjon kun lede til dannelse av
fosterhinner og intet foster. Hvis tetraploide preimplantasjonsfostre aggregeres med diploide blastomerer fra et annet foster eller
med diploide ES-celler, så vil et slikt foster - etter overføring til en vertsmor - utvikle både fosterhinner og selve museembryoet.
Embryoet vil kun bestå av etterkommere av de diploide ES-cellene. Denne prosedyren kalles ”Tetraploid Embryo
Complementation” (TEC) Fremgangsmåten er vist i neste figur hvor det tetraploide foster kommer fra en muselinje med global
ekspresjon av grønt fluorescerende protein (GFP) og de diploide ES-celler er derivert fra en muselinje med global ekspresjon av
cyan fluorescerende protein (CFP).
Figur 6 - 7
ES-celler som benyttes til slike formål kan gen-endres på alle kjente måter, inkludert målrettede ”knockout / knockin”-strategier
av endogene gener. Det er også mulig å sette begge alleler for et aktuelt gen ut av funksjon på ES-celle nivå.
Samlet betyr dette at man ved TEC-teknologien kan få etablert musefostre / mus som er homozygote for en designet delesjon av
begge alleler av et gitt endogent gen i løpet av noen få uker, eventuelt også med integrasjon av ønsket knockin-konstrukt på
allelenes delesjonssteder. Konvensjonell teknologi basert på dannelse av ”vanlige chimerer” og påfølgende tilbakekryssing tar
over ett år.
Prinsippene for TEC-teknologien ble utviklet for mange år siden, men forskjellige vanskeligheter gjorde at få mus som ble
fremstilt på denne måte, ble født. I de siste 2-3 år har man lykkes i å forbedre fremgangsmåten betraktelig, bl.a. hva angår valg av
innavlede musestammer. Nå foreligger det derfor et stort antall viktige muselinjer hvor musene i sin helhet er utviklet ut fra genendrede,
in vitro dyrkede, embryonale stamceller.

7
Figur 6 - 8
6.8 RNA interferens - teknologier.
Global og regional knockdown av gen-ekspresjonsprodukter
I avsnitt 3.3 omtalte vi enkelte biologiske effekter av dsRNA-molekyler, dannet ved transkripsjon av en særgruppe gener innen
storgruppen av non-coding RNA-gener eller fra eksterne kilder som visse vira. Slike dsRNA-molekyler blir prosessert
intracellulært på måter angitt i figur 3-13 til såkalte mikroRNAer (miRNAer).
Hvis dsRNA-molekyler på flere hundre np eksperimentelt tilføres celler vil også disse dsRNAer kunne bli prosessert til små
interferende RNA - molekyler på 21-23 np (siRNA). Disse siRNAene vil likesom miRNA-molekyler kunne interagere med RICS
og binde seg sekvensspesifikt til endogene mRNA-molekyler hvis translasjon derved hindres. Følgelig uteblir eller reduseres
dannelsen av kognate proteinmolekyler (se fig 3-13).
Hvis celler eller forsøksdyr tilføres syntetisk fremstilt siRNA med en nukleotidsekvens komplementær til et gitt mål-mRNA, vil
også dette føre til redusert dannelse av kognat protein. Valgt sekvens for tilført siRNA er viktig for å oppnå maksimal effekt. I
forsøk er det derfor vanlig å tilføre siRNA med tre forskjellige sekvensstrekninger for å treffe særlig ”sårbare” områder i målmRNA.
Effekten vil kun vare den tid som eksperimentelt siRNA er tilstede i cellene. Endringer i fenotype vil derfor som regel være
transiente.
Hvis man ønsker å benytte denne RNAi-teknologien for å frembringe en varig ”knockdown” i proteintype fra et gitt
proteinkodende gen, så kan det gjøres ved å konstruere ekspresjonsvektorer for ønsket siRNA (eller forstadier). Slike vektorer må
deretter transfekteres til celler i forsøket eller benyttes som transgener ved fremstilling av gen-modifiserte dyr (særlig transgene
mus).
Nylig (februar 2004) er det beskrevet vektorer som muliggjør både induserbar, reversibel og stabil RNA interferens i
pattedyrceller. På litt sikt vil denne teknologien sikkert også bli koplet til CreLoxP-teknologien ( se punkt 6.5) og med bruk av
vevsspesifikke promotorer for å styre knockdown i transgene mus.

8
De typer av siRNA-forsøk som vi her kort har skissert, berører i hovedsak knockdown at ett eller noen få genprodukter pr.
eksperiment. I så måte har teknologien flere fellestrekk med konvensjonelle antisens RNA - teknikker og på ”knockout”-
teknologier hvor man benytter homolog rekombinasjon i ES-celler med påfølgende fremstilling av chimere mus.
I før-genom tiden var ”forward genetics” hovedmetoden for å analysre gen-funksjoner i stor skala, særlig ved hjelp av kjemisk
fremkalte mutasjoner som ga ”tap av funksjon” i et stort antall gener.
Et stort arbeid er nedlagt i denne type analyser av Drosophila og senere zebrafisk, ikke minst hva angår klarleggingen av
forskjellige utviklingsgeners betydning for frembringelsen av embryonale fenotyper. Nobelprisvinneren C.Nüsslein Volhard store
innsats på dette felt er et godt eksempel. Men denne type forskning er meget tid- og ressurskrevende.
I løpet av de senere år er det komplette genom for en rekke av de mest sentral modellorganismer i molekylær utviklingsbiologi
blitt sekvensert. Det gjelder bl.a. C. elegans, Drosophila og mus.I tillegg er jo det humane genom sekvensert. De komplette
sekvenser er selvsagt av stor betydning for forståelse av mange utviklingsbiologiske forhold, men gir ikke noen direkte
informasjon hva angår ”funksjonell genomikk”.
Eksperimentell anvendelse av RNAi-teknologien har i løpet av de aller siste årene revolusjonert dette forholdet. I det siste året har
sentrale forskningsgrupper publisert artikler om stor-skala, systematiske, funksjonsanalyser av store deler av genomet hos
C.elegans (i 2003), Drosophila (i 2003) og mus og menneske (2 artikler i mars 2004).
Alle arbeidene er gjort på celler i kultur fra de forskjellige arter.
Fremgangsmåten til den ene gruppen som har arbeidet med funksjonsanalysene hos mus og menneske, var basert på å produsere
ekspresjonsbibliotek av siRNA og såkalt shRNA (sh = short hairpin) mot ialt 9610 ekspresjonsprodukter fra humane proteinkodende
gener (og 5563 ortologe musegener) For hvert målgen ble det konstruert minst tre typer shRNA, slik at totalen ble ca
28.000 ekspresjonskasetter - som alle ble kontrollsekvensert. og innebygget i multi-funksjonelle vektorer slik at kassettene
relativt enkelt kan overføres til retrovirus former og videre til andre vektorer etter behov. I tillegg ble hver av kassettene utstyrt
med egen spesifikk”gjenkjennings-markører (”bar codes”). De relative mengder av hver type shRNA-kassett koplet til RISCprodukter
kan derved vurderes ved hjelp av micro-array teknologier.
Slike RNAi-bibliotek vil muliggjøre utallige funksjonsanalyser for forskningsgrupper verden rundt både hva angår stor-skala
(”global”) genomikk og for utvalgte cellulære prosesser som signalsystemer, transkripsjonsregulering, cellesyklus / proliferasjon,
migrasjon, impulsledning osv., osv. I slike sammenhenger kan man nedregulere en rekke kandidatproteiner i antatte
reaksjonskjeder parallelt med fenotypeanlyser. (eks ved automatisert fluorescensmikroskopi).
Hva mere er: Funksjonelle genomikk-analyser basert på RNAi-strategier tar uker, ikke måneder
tradisjonelle gen-endringer basert på indusert mutagenese av DNA.
og mange år slik tilfellet er ved
Et felt hvor man kan vente seg særlig stor fremgang ved bruk av RNAi-basert knockdown-strategier er i embryonale
stamceller som ledd i proliferasjonsanalyser og etablering av avanserte regimer for in vitro retningsdirigert
celledifferensiering og organogenese, - ex vivo embryogenese (se også kap. 7).

7 Kloning og stamceller. Ex vivo embryogenese
7.1 Reproduktiv kloning og terapeutisk kloning
Det er viktig å skille mellom disse to begrepene:
Med reproduktiv kloning forstår vi forsøk på å fremstille fødte organismer ved at en somatisk cellekjerne overføres (”nuclear
transfer” = nt) til en kjernefri (enucleert) eggcelle som deretter plasseres i livmoren hos en vertsorganisme for videreutvikling
inntil fødsel.
Figur 7 - 1
Ved terapeutisk kloning overføres også en somatisk cellekjerne (nuclear transfer) til en enucleert eggcelle. Denne form for zygote
(rekonstituert celle) dyrkes så i kultur inntil blastocysttrinnet . Hos mus og menneske tar dette 4 - 6 døgn. Deretter isoleres
embryonale stamceller (ntES-celler) fra den indre cellemasse i blastocysten. De resterende deler av blastocysten destrueres.
7.1.1 Reproduktiv kloning
Kloningen av sauen ”Dolly” i 1997 og av musen ”Cumulina” i 1998 fikk en enorm innflytelse på moderne biomedisin. For første
gang ble det demonstrert at differensierte somatiske celler, også fra pattedyr, kan reprogrammeres til å oppføre seg som genomet
i en zygote bare miljøet endres radikalt nok slik som det er i cytoplasmaet i en kjernefri eggcelle.
Siden 1997 er nå en rekke arter blitt klonet slik som kyr, griser og aper. Hovedstrategien er stort sett den samme:
Enucleeringen (fjerning av eggcellens kjerne) gjøres ved mikrokirurgi ved at en tynn pipette føres inn i eggcellen. Kjernen suges
inn i pipetten og fjernes. Oocytter i forskjellige trinn av meiose II har vært benyttet som recipienter.

2
Donorcellens genom overføres deretter til den enucleerte eggcelle enten ved mikroinjeksjon av donorcellens kjerne eller ved
indusert fusjon mellom donorcelle og eggcellen. Hvis overføringen teknisk sett er vellykket, kan det være aktuelt å ”aktivere” den
kjernetransplanterte eggcellen, bl.a. ved kortvarige endringer i konsentrasjonen av divalente ioner. Deretter holdes cellen i kultur
til furingsdelingene har startet før overføring til eggleder eller uterus i vertsmor.
Hvis kloningen gjennomføres ved fusjon mellom donorcelle og enucleert oocytt, vil det nye individ få en blandet populasjon av
mitochondrier. Tallet på mitochondrier i en eggcelle er imidlertid vesentlig høyere enn i somatiske celler. Det er foreløpig uklart
om mitochondriell heterogeniteter av betydning for de klonede dyr, f. eks. hva angår mitochondrielle sykdommer.
(Hvis kloning skjer mellom to arter, eks. kjerne fra menneske og enucleert eggcelle fra en ku eller kanin (xenocybrider), vil
mitochondrielle arveforhold sannsynligvis bli av betydning. Slike forsøk er nylig utført i USA og Kina- som en kompensasjon for
bruk av humane oocytter- og for å klarlegg basal reprogrammeringsmekanismer.)
I de tidlige kloningsforsøk basert på bruk av donorceller fra voksne organismer, la man stor vekt på det trinn i cellesyklus som
donorcellen befant seg i. Men etterhvert har det vist seg at donorceller i forskjellige syklusstadier kan resultere i vellykket
kloning. I tillegg vet man nå at det er mulig å anvende en rekke forskjellige, differensierte celletyper som kjernedonorer.
Donorcellene fra såvel hannkjønnsindivider som hunner kan benyttes. Donororganismens alder synes også å spille en mindre
rolle. Donorfibroblaster fra øret til en 17 år gammel okse viste seg å resultere i klonede kalver etter fusjon med enuclerte
eggceller (okser blir sjelden mere enn 20 år).
Også differensierte celler som har vært dyrket i kultur, ja endog blitt gen-modifiserte ved transfeksjon, har vist seg egnet som
donorceller.
Celler fra gamle individer og celler som har vært holdt lenge i primærkultur, vil ofte ha en redusert telomerlengde. Dette oppfattes
som et tegn på aldring og at cellene nærmer seg slutten av sin livslengde. Det er oppsiktsvekkende at slike celler i det hele tatt kan
gi grunnlag for vellykkede kloningsforsøk, og det har vært stor spenning knyttet til levealder for individer klonet med et slikt
utgangspunkt
.
Figur 7 - 2. er en bemerkelsesverdig illustrasjon Det spesielle ved dette bildet er at kalvene ble klonet ut fra celler som hadde vært
i kultur så lenge at de normalt snart ville ha gått til grunne, og cellene viste tydelig langtkomne aldersendringer. Slike celler har
korte telomerer, noe som ofte blir tatt som en indikasjon på deres alder. Allikevel kan de brukes til kloning. Innført i kjernefrie
eggceller modifiseres kromosomene slik at telomerene blir vesentlig lengre enn i celler fra unge dyr. Hva mer er: Celler fra
klonede dyr, laget på denne måten, kan i kultur gjennomgå over 90 celledelinger, mens celler fra ikke-klonede kalver bare
gjennomfører ca 60 celledelinger. Man vet foreløpig ikke hva som forårsaker telomerforlengelsen og om de klonede dyrenes
levealder forlenges tilsvarende.
(Fra: Robert P. Lanza og medarbeidere. Science 28. april 2000 (288: 665-669). ”Extention of Cell Life-
Span and Telomere Length in Animals Cloned from Senescent Somatic Cells.”)
Figur 7 - 2
At det er mulig gjennom kloning å fremstille celler med sterkt forlenget levealder kan få den største betydning i arbeidet med å
utvikle embryonale og adulte stamceller til behandling av mange sykdommer hos mennesket..

3
Det er dog utvilsomt slik at suksessraten ved reproduktiv kloning av dyr hittil har vært lav, og at mange fostre og fødte dyr har
oppvist en rekke defekter. Dette er ikke overraskende når man tenker på at en somatisk kjerne må radikalt omprogrammeres på få
timer til å kunne utgjøre et startgenom for et nytt inivid. Som tidligere nevnt bruker gameter meget lang tid på sin utdannelse før
fertilisasjon, inkludert etablering av en rekke epigenetisk forhold. Det utrolige er jo at reproduktiv kloning av pattedyr virkelig er
mulig i visse tilfeller. Men den enstemmige oppfatning blant alle seriøse forskere i feltet er at reproduktiv kloning av mennesker
er forkastelig både av faglige og andre grunner.
7.2 Generelt om stamceller
Standard kriterier for å kalle en celle for en stamcelle (The CELL,2002) er at den:
1 ikke selv er terminalt differensiert
2 kan dele seg så lenge organismen lever
3 Når en stamcelle deler seg, så kan en dattercelle fortsette som stamcelle eller slå inn på en
differensieringsbane
Man opererer med forskjellige nivåer av stamceller ut fra “klassiske” syn på differensieringspotensialet:
- totipotente eller omnipotente stamceller
Dette er stamceller som kan gi opphav til alle typer celler som en organisme består av inkludert
fosteravledede fosterhinneceller.
Denne gruppen omfatter kun zygoter og tidlige blastomerer.
- pluripotente stamceller / multipotent stamceller
Språkbruken er lite konsistent hva angår disse betegnelser.
Tradisjonelt har uttrykket pluripotent vært anvendt om embryonale stamceller (ES-celler)
avledet fra den indre cellemasse på blastocysttrinnet. Enkelte forskere inkluderer også
primordiale kimceller i denne gruppen.
ES-celler kan differensieres til alle typer celler som inngår i organismen, men ikke til
typer av fosterhinneceller
alle
Betgnelsen multipotente stamceller benyttes hyppigst om stamceller som har et snevere
differensieringspotensiale enn ES-celler
Vi har former for stamceller i kroppens ulike organer, sannsynligvis hele livet igjennom (samlenavn
ADULTE stamceller). Tallet på adulte stamceller i de enkelte organer er lavt. I beinmarg antar man at bare
ca 1 av 10.000 celler kvalifiserer til betegnelsen stamcelle (The CELL. 2002).
Det er en vanlig oppfatning at stamceller er lokalisert til nisjer hvor de er omgitt av naboceller som
forsyner dem med signalmolekyler og andre former for kooperasjon. Man legger i dag stor vekt på slike
nisjers innflytelse for de asymmetriske miljøforhold som stamceller eksponeres for og som også antas å ha
stor innflytelse på asymmetriforhold under stamcelle-mitoser. Den dominerende oppfatning er at
stamceller eller deres etterfølgere (progenitorer) ikke vil endre sin løpebane (transdifferensieres) sålenge de
befinner seg i sin tradisjonelle nisjer. Men nå vet man at hvis miljøet endres radikalt nok, som ved
kloning, kan en omfattende ”reprogrammering” finne sted på alle trinn fra stamcelle til terminalt
differensiert celle.

4
Rekrutteringen til terminalt differensierte celler i mange organer synes å gå gjennom en fase med celler
som på engelsk omtales som ”committed transit amplifying cells” som vist i figur 7-4.
Figur 7 - 3
Figur 7 - 4

5
7.3 Embryonale stamceller (ES-celler) fra mus og menneske. Ex vivo
embryogenese. Molekylær cellemedisin
Embryonale stamceller (ES-celler) isoleres fra den indre cellemasse (ICM) når et foster er i
blastocysttrinnet. Hvis embryonale stamceller isoleres fra et klonet foster på blastocysttrinnet, kalles
cellene ntES-celler (nt = nuclear transfr). Embryonale kimceller (embryonic germ cells, EG-celler) isoleres
fra gonadeanlegg i tidlig embryotrinn. Adulte stamceller (AS-celler) kan isoleres fra en rekke organer hos
fødte individer (som beinmarg, hjerne, muskelvev, epidermis, dermis, tarmslimhinne m.fl.)
Figur 7 - 5
7.3.1 ES-celler isolert fra ikke-klonede (”ordinære”) blastocyster
Embryonale stamceller ble for første gang isolert fra museblastocyster i 1981. De kan holdes i kultur i
udifferensiert form i tallrike cellegenerasjoner ved spesielle dyrkningsbetingelser. Tidlig på 1980-tallet ble
det vist at slike ES-celler kunne danne chimere mus etter ES-celle injeksjon i museblastocyster eller ved
aggregasjon med musefostre i morula-trinnet, - for deretter å bli overført til vertsmor.
ES-cellenes store betydning i biomedisinsk forskning ble klart dokumentert da man i 1987-88 ble i stand
til å inaktivere utvalgte endogene gener i slike celler ved innføring av DNA-konstrukter som muliggjorde

6
målrettet integrasjon i musegenomet ut fra prinsipper for homolog rekombinasjon. Deretter ble de genendrede
ES-cellene benyttet til å danne chimere mus som angitt foran. Tilbakekryssingsregimer gjorde det
mulig å produsere homozygote ”knockout”-mus for aktuelt gen. Det er siden det tidspunkt produsert flere
tusen muselinjer hvor ett (eller flere) endogene gener er satt ut av funksjon som basis for fenotypeanalyser
av de fremkalte mutasjoner. I mange år har dette vært en av våre aller fremste strategier for
forskning vedrørende ”funksjonell genomikk”.
Et viktig ledd i denne teknologien var å legge forholdene til rette for at ES-cellene kunne proliferere i
kultur uten å slå inn på differensieringsbaner. Dette klarte man ved å dyrke ES-cellene på cellesyklusinaktiverte
”feeder-celler” som skilte ut stoffer som hindret ES-celle differensiering. Nylig er det utviklet
flere andre regimer for å hindre differensiering av ES-celler og samtidig stimulere deres proliferasjon.
Hvis slike proliferasjonsstimulerende regimer ikke fungerer optimalt, vil ES-celler i kultur ”spontant”
utvikle seg til visse differensierte celleformer, hvorav neuron-lignende celler synes å være en vanlig
”default”-vei..
I mange år klarte man kun å utvikle ES-celler fra mus (mES-celler = murine ES-celler) og ikke fra andre
pattedyr. Det var et stort gjennombrudd da amerikanske forskere i 1998 lykkes i å isolere humane ESceller
(hES-celler) fra blastocyster. Injeksjon av hES-celler i museblastocyster viste at disse cellene i
denne type in vivo system, kunne differensiere seg til tallrike, spesialiserte former for human-celler.
Disse resultatene førte til et enormt oppsving i interessen for in vitro differensiering av ES-celler, både fra
mus og menneske. I løpet av få år er det blitt etablert dyrkningsregimer som gjør det mulig å bevirke
planlagt, retningsdirigert differensiering av begge typer ES-celler til tallrike former for spesialiserte celler
slik man finner dem hos mus og menneske. Differensieringskriteriene er basert på såvel morfologi som
funksjon og med ekpresjonsmønstre, analysert ved in situ hybridisering, immuncytokjemi og micro-array
teknologier, som klart identifiserer de in vitro - frembrakte, spesialiserte celleformer.
Det er meget bemerkelsesverdig at slik in vitro retningsbestemt differensiering av ES-celler i de fleste tilfeller
kan foregå i dyrkningskar med tilsetting av helt definerte medier, det vil si at man kjenner alle
komponentene. Den retningsbestemte differensieringsvei avgjøres først og fremt av hvilke vekstfaktorer og
andre ligander som mediet tilføres. Ofte dreier det seg om bare 3-4 forskjellige stoffer for å oppnå et bestemt
resultat. I en del tilfeller skjer differensieringen via et såkalt ”embryoid body -stadium” (aggregater av ESceller
i suspensjon). Tidsrammen fra differensieringsstart av ES-celler til et ønsket resultat er oppnådd, kan
være ned til 2-3 uker. Hva mere er: visse slike celletypr kan også starte på organdannelse i kulturskålen
(som utvikling av hjerteanlegg fra ES-celle deriverte cardiomyocytter).
De vekstfaktorer man velger for å fremskaffe en gitt celletype, er som regel plukket ut fra lister over hvilke
signalstoffer som styrer in vivo differensieringen.
Her må man huske på at i normal embryogenese inngår det mange kompliserte trinn fra blastocystfasen
til høyt differensierte celleformer foreligger, trinn som implantasjon, gastrulasjon, etablering av de tre
kimblad og regionalisering av disse, dannelse av åresystem og nerver m.m.
At såvel murine som humane ES-celler i kultur kan gå utenom mange av disse ”opplæringstrinn” er
svært forbausende og har lagt grunnlaget for det som man nå kaller ”ex vivo embryogenese”.
7.3.2 Transplantasjon av ES-celler og ”ES-celle-deriverte celler” til
mottaksorganismer
Resultater som nevnt foran brakte naturlig nok straks frem tanken på å transplantere ES-celler og EScelle
deriverte celleformer til forsøksdyr som mus med fremkalte behov for regenerativ celleterapi - og med
tanke på å utvikle modellsystemer som basis for molekylær celleterapi hos mennesker. Forutsetningen for
tankegangen er selvfølgelig at de transplanterte cellene vil finne frem til skadesteder og der interagere med
den lokale cellebefolkning for å oppnå funksjonell rekonstitusjon. I modellsystemer finnes det nå en rekke
eksempler på vellykkede resultater av slike forsøk.

7
Hva angår transplantasjon av udifferensierte, murine ES-celler til mus, så innebærer dette en risiko for at
de overførte ES-cellene kan etablere teratocarsinomer i mottaksorganismen. Dette er selvsagt også et
forhold som gjør at udifferensiert hES-celler ikke bør overføres til mennesker ut fra kunnskapsnivået i
dag.
Humane ES-celler fra ordinære blastocyster vil naturlig nok ha en annen genetisk konstitusjon og dermed
et annet antigen-bilde enn en gitt pasient med behov for celleterapi. Man må derfor vente at slike
transplanterte celler vil bli forkastet av recipientens immunsystem. En løsning på dette problem kunne
være å gen-modulere antigen-bildet på celletransplantatet til bedre å samsvare med mottagerens
immunforhold. Dette er antagelig en komplisert vei å gå.
En annen viktig løsning er blitt åpenbar som følge av resultater av kunnskaper basert på terapeutisk
kloning .
7.3.3 Terapeutisk kloning. ES-celler fra klonede blastocyster (= ntES-celler)
Som vist i figur 7-5, så innebærer terpeutisk kloning at en cellekjerne fra en somatisk celle hos et født
individ bli overført til en eggcelle hvis egen kjerne på forhånd er fjernet. Den rekonstituerte cellen dyrkes i
kultur frem til blastocysttrinnet og ES-celler isoleres fra blastocystens indre cellemasse. De resterende
deler av blastocysten destrueres. Slike ES-celler benevnes ntES-celler (nt= nuclear transfer).
Det foreligger nå en rekke forskningsrsultater som viser at murine ntES-celler har de samme
differensieringspotensialer i kultur som konvensjonelle ES-celler, og at de kan gen-modifiseres på samme
måter. Et eksempel på dette er illustrert i figur 7-6 hvor mus som er defisiente for Rag2 (recombination
activating gene 2) - og følgelig ikke kan produsere funksjonelle B- eller T-celler -blir behandlet med genmodifiserte
ntES-celler
Figur 7 - 6

8
Et slående eksempel på avansert differensiering av murine ES-celler og murine ntES-celler i kultur er vist
i figur 7-8 som er et utdrag av en artikkel i Nature Biotechnology for oktober 2003:
Figur 7 - 7
Nylig ble humane ntES-celler for første gang isolert fra klonede humane blastocyster, frembrakt etter
prinsippene for terapeutisk kloning. Resultatene ble publisert i Science i mars 2004. Slike h-ntES-celler
kunne gjennomgå over 70 passasjer i kultur, hele tiden med bibehold av en normal human karyotype.
Somatiske donor-kjerner kom fra cumulus-celler fra de samme kvinner som donerte eggceller til
forsøkene. (Hos mus er det vist at fibroblaster er egnede som kjernedonorer og er en lett tilgjengelig
celletype). Transplantasjonsforsøk er ennå ikke utført.
Man vil ikke vente at differensierte celler derivert fra slike h-ntES-celler vil gi avstøtningsreaksjoner ved
eventuell transplantasjon til eieren av donorcellene. I de her omtalte forsøk kom også eggcellene fra
kjernedonor, slik at det også forelå mitochondriell DNA-identitet (noe som kanskje ikke er en
nødvendighet).

9
Mangel på humane eggceller vil være et stort problem ved bruk av terapeutisk kloning hos mennesker
RETNINGSDIRIGERT in vitro DIFFERENSIERING AV ES-CELLER TIL GAMETER !:
En mulig løsning på mangelen på humane oocytter kan være at det nå også lar seg gjøre å få ihvertfall
murine ES-celler i kultur til å gjennomgå retningsdirigert differensiering til oogonier via et mellomtrinn
som primordiale kimceller. Disse oogoniene går inn i meiose og rekrutterer naboceller til å danne follikkellignende
strukturer. Disse gjennomgår senere ovulasjonslignende prosesser og frigjør celler som minner
om oocytter omgitt av zona pellucida. Disse cellene synes å kunne bli partenogenetisk aktivert slik at
embryogenese til blastocysttrinnet finner sted, noe den amerikanske forskningsgruppen ogsp
demonstrerte. Det er uklart i hvilken grad normale epigenetiske prosesser, inkludert DNA-methylering,
finner sted under dannelse av denne type blastocyster
May 23, 2003 (300: 1251-1256)
Figur 7 - 8
I januar 2004 publiserte en annen amerikansk gruppe i Nature resultater som viser at murine ES-celler i
kultur, via et ”embroid body” - trinn kan differensiere seg til primordiale kimceller og at disse i kultur kan
gjennomgå spermatogenese til haploide spermatocytter. Hvis slike spermatocytter injiseres i normale
oocytter, vil det resultere i fertilisasjon med etablering av en celle med normalt, diploid kromosomtall og
som utvikler seg i kultur til blastocyster. Lignende funn er også gjort av en annen gruppe.

10
Alle disse tre rapportene er på mange måter sensasjonelle. Flere uklarheter gjenstår og bekreftelser fra
flere andre grupper. Men de åpner for en rekke muligheter til grunnleggende forskning av svært sentrale
problemstillinger, bl.a. de molekylære mekanismer ved gametogenese, ikke minst koplet sammen med
RNAi - teknologi og micro-array-analysr.
Hvis det lar seg gjøre å fremstille et ubegrenset antall humane, oocytt-lignende celler (kanskje også
mitochondrie-optimaliserte) som kan fungere som adekvat mikromiljø for reprogrammering av somatiske
celler fra pasienter for deretter å utvikle seg til blastocyster med påfølgende etablering av h-ntES-celler som
kan gen-modifiseres, vil dette kunne bidra til å revolusjonere behandlingsmulighetene ved bruk av designet
celleterapi for en lang rekke sykdommer.
De to følgende figurer er hentet fra kommentarartikkelen i Nature 8. januar 2004 til de funn som er omtalt
her:
Figur 7 - 9 Figur 7- 10

11
7.4 Adulte stamceller
Hvis adulte stamceller kan repogrammeres eller transdifferensieres til en egnet form for behandlingsceller for pasienter med slike
behov, vil stamvellen kanskje kunne hentes fra den aktuelle pasienten. I så fall vil man ikke forvente forkastelsreaksjoner etter
tyransplantasjon av behandlingsceller med en slik bakgrunn.
I hvertfall foreløpig har det vist seg at adulte stamceller har et langt mindre differensieringpotensiale enn embryonal stamceller.
Det har også vist seg at en rekke av de arbeider som først kom om adulte stamcellers plastisitet, var feilaktige. I mange tilfeller er
det senere dokumentert at antatte redifferensieringsegenskaper hos adulte stamceller skyldtes fusjon med andre celler, primært på
skadesteder hos forsøksdyret. Dessuten kommer at det ofte er teknisk vanskelig å isolere adulte stamceller og å dyrke dem i
kultur. Men det finnes lovende kandidater, særlig spesialgrupper av beinmargsceller og kanskje også neurale stamceller.
Etterhvert som vår viten om differensieringsmekanismer øker ut fra forskning basert på embryonale stamceller, så vil det kanskje i
fremtiden bli mulig å utvikle regimer for retningsdirigert spesialisering i kultur også av adulte stamceller til ønskede former for
behandlingsceller.

Sigurd H. From
ORDLISTE – DEFINISJONER
UTVIKLINGSBIOLOGI
Ablasjon
Acros
Allos, allantos
Amelus
Aner, andros
Antisense RNA
Blastocoele
Blastocyst
Blastomerer
Blastulasjon
Branchialbue
-cele
Caudal
Cellehukommelse
Cellehybrider
Cephal
Fjerning. ”Utryddelse”
Spiss, ende, topp
Pølse
Misfoster uten lemmer (melos = lem)
Mann
Nucleotider med en sekvens motsatt et gitt mRNA molekyl.
Hybridiserer med dette og hindrer translasjon. Alternativt
utstyres antisensRNA molekylet med et ”flagg”. Derved
kan hybriddannelse sees i celler i et mikroskop (in situ
hybridisering).
Det væskefylte rom i blastocyster
Foster i sent preimplantasjonsstadium. Cellene er delt i to
hovedgrupper, ICM = den indre cellemasse og
trofoblastene. Se også blastocele.
Navn på de enkelte cellene under blastulasjons-prosessen,
fra 2-celletrinnet til og med blastocyststadiet
Betegnelse for fosterutviklingen fra 2-celletrinnet til og
med blastocyststadiet. Betyr ”knoppskyting” av blastos
=knopp, kim.
Gjellebue (branchia = gjelle)
oppsvulmning som inneholder væske, sml. cystis =blære.
Eks.: blastocyst med blastocele.
i retning mot halen (cauda=hale)
Ofte kalt somatiske cellehybrider. Eksperimentelt
fremkalles de ved indusert fusjon mellom to celler. Cellene
kan komme fra ett og samme individ, fra forskjellige
individer, fra forskjellige arter (som mus og menneske),
eller man kan fusjonere plante- og dyreceller (også pro- og
eukaryote celler). Hybridene kan få to kjerner eller
kjernene kan gå sammen i ett synkaryon. Transkripsjon kan
skje fra begge genomer. Ofte elimineres kromosomene
sekvensielt fra den ene part. I konstellasjonen musmennesket
reduseres tallet på humane kromosomer.
I retning mot hodet (gr.:cephalon, L. = caput)
Chimer
Chyme
Chorda dorsalis
Fra gresk mytologi: Et individ med en løves hode, en geits
kropp og en slanges hale.Alternativt: Fler-foreldre dyr.
Saft. Eks.: Mesenchyme. ”Midt i saften”
Ryggstreng

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
II
Co-aktivatorer, corepressorer
Congenital
Cre
CreLoxP-teknologi
Cyclopi
Cyst
Decidua
Dermatom
Determinering
DNA-bindings
”motifs”
Domene
Dominant negative
reseptor mutasjoner
Dorsal
Dys-
Ect- (gr.), Ekt-
Ektoderm
Eksplantasjon
Ektopisk
Em- (=en-)
Embryo
Proteiner som påvirker transkripsjonen fra målgener ved
protein-protein interaksjon med transkripsjonsfaktorer og
mellom TFs og det primære transkripsjonskompleks
Medfødt
Navn på en sete-spesifikk rekombinase (Cre = Cause
recombination).
Teknikk for å styre tidspunkt / sted for ekspresjon av
transgener eller for å besteme tid og sted for eksisjon av
endogene DNA-sekvenser (kondisjonelle knockouts)
Misfoster med et enkelt eller to sammenfallende øyne.
av cystis = blære
”Den ytterste fosterhinnen, dannet fra livmorslimhinnen.”
”Hud-delen” av en somitt
Fra gammelt av benyttet om celler som ikke endrer sin
differensieringsbane selv om de utsettes for et nytt
lokalmiljø eller transplanteres til andre lokalisasjoner. (Men
kfr. DOLLY.)
Spesielt stabile foldingsmønstre innen (del av) domener i
proteiner som kan interagere med DNA.
Viktige eksempler er:
-”helix-turn-helix” (HTF)
-”zink fingers”
-”leucine zipper”
-”helix-loop-helix (HLH)
Individuelt område innenfor en større struktur
Mange proteiner fungerer først når de danner dimerer
(eventuelt multimerer) med like eller forskjellige partnere
(homo- eller heterodimerer). Dette gjelder bl.a. en rekke
plasmamembranreseptorer og kjernereseptorer. Hvis det
dukker opp et ”partnerprotein” med en ikke-nativ
konfigurasjon (som er resultat av gen-mutasjon), så vil
”avvikeren” kanskje kunne danne dimer med den normale
partner, men komplekset blir da ikke-funksjonelt. Dette
kalles en dominant negativ mutasjon.
Eksperimentelt kan man overføre gener som koder for slike
”avvikere” og dermed sette endogene proteiner ut av
funksjon.
I retning mot ryggen (dorsum), ”bakover”
”Vanskelig å gjennomføre”, eks dysgenesi, dysgenese
Ytre. Alternativt: Ex- (l.)
”ytre” kimblad. Av ect (gresk = ytre). Tilsvarende latinske
betegnelse er ex. Derm av derma = hud.
Uttak av et organ eller en region for videreføring i et kultursystem
på ”galt” sted, ikke normal lokalisasjon
I, inne i
”Indre (frukt)”. Bryo = ”Jeg bærer (frukt) inne i meg

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
III
Embryonal
induksjon
Klassisk: Celler som på en eller annen måte påvirker
naboceller til å endre differensieringsveier.
Molekylært: Cellers påvirkning av naboceller, først og
fremst ved sekresjon av protein-ligander (særlig kodet for
av gen-superfamilier som TGFβ, FGF, Wnt og Shh). Slike
proteiner kan også ha antagonistiske effekter overfor andre
ekstracellulære signalmolekyler.
I, inne i
Hjerne. Inne i hodet. En = inne i, indre. Cephalon = hode.
Indre kimlag
”kommer fra innsiden”
Livmorslimhinne
Fjerne nucleus
Utenpå
God, riktig,
En- (= em-)
Encephalon
Endoderm
Endogen
Endometrium
Enucleere
Epi-
Eu-
Fertilisasjon Befruktning
FGF Fibroblast Growth Factor –superfamilie. 10-12
medlemmer. Genene koder alle for sekreterte (secernerte!)
proteinligander som påvirker et utall av forhold under
embryogenesen.
Føtus (foetus)
Furingsdelinger
(eng. ”cleavage”)
Gastrulasjon
Gen regulatoriske
sekvenser (GRSs)
Generelle
transkripsjonsfaktorer
(TFs)
Latin for ”avkom”
Cellesyklus består nesten bare av S-fase og mitose.
Blastomerene deler mellom seg zygotens cytoplasma (se
også asymmetriske celledelinger). Fosterets diameter er
relativt konstant gjennom pre-implantasjons fasen.
Betegnelse for den del av fosterutviklingen som særlig
omfatter etablering av den primitive fure og primitive knute
(innsøkk) og som leder til dannelsen av det midtre kimblad,
mesodermen, inkludert ryggstrengen. Av gaster som angir
både hulrom (som magesekk) og utbuktning (eks.
muskelbuk)
Nucleotid-(nt)-sekvenser som fungerer som bindingssteder
for gen regulatoriske proteiner (GRPs). Slike
bindingssteder kalles også nucleotid- bindings ”motifs”
Flere enn 220 ulike nt-motifs er hittil identifisert.
Såkalte respons elementer (RE) inngår i denne gruppen,
eks. hormon respons elementer (HRE) og retinoic acid
respons elementer (RARE)
Med relasjon til promotor-områder. Kfr. Spesielle TFs med
relasjon til ”enhancer”-regioner
Gjellebue
Parvise utposninger av ektoderm i den senere ansikt-/hals
regionen. Utposningene fusjonerer med tilsvarende på
motsatt side (kontralateralt). Fylles kontinuerlig med bl.a
migrerende neurallistceller og somitt- (somitomer-)
deriverte celler. Fem definitive gjellebuer anlegges hos
mennesket.

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
IV
GRPs
Gyneaecos
Gyne
Heterokron
Heterotopisk
Homeoboks gener
Homeodomene
Homeodomene
proteiner
Homeotiske gener
Homeose
Gene Regulatory Proteins (inkluderer bl.a.
transkripsjonsfaktorer, co-aktivatorer og co-repressorer)
Kvinne. Alt. gyne (gr.)
Kvinne. Alt. gynaecos. (gr.)
”Forskjellig tid”
”Forskjellig lokalisasjon”
Defineres som gener som inneholder en homeobokssekvens
(på ca 180 nt). I tillegg inneholder de fleste
homeoboks genene andre domener som er nødvendige for
funksjonene til homeo-domene-proteinene.
Homeoboksgenene er alle utviklingsregulatoriske gener,
men er viktige også i mange andre sammenhenger. Alle
koder for transkripsjonsfaktorer. Flere enn 350 homeoboksgener
er identifisert.. Homeotiske gener (hox-gener) er en
undergruppe av homeoboks gener
DNA-bindings domene i homeodomene-proteiner, kodet
for av homeoboks nucleotid-sekvenser. Det er”Helix-turnhelix”-delene
av homeodomenet som interagerer med
spesifikke DNA-bindingsmotifs. Homeodomener omfatter
60-61 aminosyrer.
Alle er kodet for av homeo-boks gener. Alle er
transkripsjonsfaktorer.
Dette er en undergruppe av homeoboksgenene som
opprindelig ble karakterisert som gener som styrer
identiteten til individuelle kroppsavsnitt (segmenter) hos
Drosophila. Slike gener finnes hos bananflue i to gen-
”clustere” (-klynger), kalt Antennapedia og Bithorax.Hos
vertebrater kalles disse gener for Hox-gener.
Et kroppsavsnitts identitet omgjøres til identiteten til et
annet kroppsavsnitt
Homologe
kromosomer
Hox gener
Hox kode
(kombinatorisk kode
for posisjonserkjennelse)
Tilsvarende maternale og paternale kromosomer.
Dette er homeotiske gener hos vertebrater. De relateres til
Antennapedia- og Bithorax-komplekset hos bananflue. Hos
for eksempel mus og mennesker finnes 38 Hox-gener,
fordelt i ”clustere” - klynger på 4 ulike kromosomer. Hoxgener
inneholder informasjon som i høy grad medvirker til
etablering av kroppsmønstre og celler posisjonserkjennelse,
særlig langs fosterets lengdeakse (paraksialmesodermen,
samt neuralrør (bakhjerne og ryggmarg ) og neurallister.
Hvilke kombinasjoner av Hox-gener som er uttrykt i
forskjellige kroppsavsnitt og som langt på vei spesifiserer
disse.

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
V
Hyper-
Hypo-
Hystera (gr.)
ICM
Implantasjon
Intermediær
mesoderm
Isokron
Kimblads-derivater
Kjernereseptorer
(en tradisjonell
betegnelse. Inngår i
gruppen
intracellulære
reseptorer)
Over
Under
Livmor (alternativt: uterus, metra)
Indre Celle Masse
Innvekst (i livmor-slimhinnen)
Den del av mesodermen som ligger mellom paraksial
mesodermen og lateral plate mesodermen.
”Samme tid som…”
Hvilke vev/organer som utvikles fra de forskjellige
kimblad.
Stor heterogen gruppe. De fleste tilhører Steroid-, thyroid-,
retinoid-superfamilien. Ligandene er relativt små, lipofile,
hydrofobe molekyler. Ligandbinding kan indusere
translokasjon fra cytoplasma til kjernen og ofte dannelse av
homodimerer eller heterodimerer (som RAR/RXR) med
påfølgende binding til genregulatoriske nucleotidsekvenser
(også kalt respons elementer)
Knockouts
Knockdown
Kognat
Ko-linearitet (av
Hox-gener)
Kombinatorisk
transkripsjonskontroll
Kondisjonell styring
av transgener
Kroppskrumninger
Ved help av transgen teknologi kan man sette endogene
gener ut av funksjon. Ved tradisjonell teknikk skjer dette i
alle dyrets celler. DNA-konstruktet lages slik at det
integreres på ønsket sted i genomet. Spesifisiteten er basert
på homolog rekombinasjon med endogene målsekvenser.
Gjennom dette utskiftes også sekvenser i DNAmålområdet
slik at det endogene gen ikke kan gi noe
normalt ekspresjonsprodukt.. Alternativt brukes i tillegg
teknologi for ”Kondisjonell styring av transgener”,
hyppigst CreLoxP-strategien.
Nedregulering av mengde gen-produkt. Hyppigst benyttet i
forbindelse med fremkalt spaltning av mRNA molekyler av
en gitt type (se RNA interferens, RNAi og siRNA samt
miRNA)
”Tilsvarende”, ”passende”, som regel om reseptorer som er
spesifikke for en gitt ligand
Det er samfall mellom genenes rekkefølge på
kromosomene og deres ekspresjonsgrenser langs fosterets
lengdeakse (anterior-posterior akse)
Ny teknikk (basert på bruk av sete-spesifikke rekombinaser
som CRE) muliggjør tid- og stedkontroll av ekspresjon fra
transgener. En variant av teknologien gir kondisjonell
(betinget) kontroll av endogene genners struktur og
funksjon.
I anterior – posterior retning og i medial – lateral
orientering. Foregår hos mennesket særlig i siste del av

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
VI
3.fosteruke og utover i 4. fosteruke.
Lateral plate
mesoderm
Ligand
Den del av mesodermen som ligger ”lengst ut til siden” i
fosteret.
Definert substans som kan binde seg (ligere seg) til
spesifikk reseptor
LoxP
Kort DNA-sekvens som er bindingssekvens for den setespesifikke
rekombinasen ”Cre”. Normalt trenger Cre to
LoxP-seter (som flankerer en mellomliggende DNAstrekning)
for syntén aktivitet (eksisjon /inversjon). Cre kan
også fungere selv om LoxP-setene er plassert i forskjellige
kromosomer. I så fall kan resultatet bli ”designede
translokasjoner”.
Mamma (l.) Bryst. Alt. mastos (gr.)
Mastos (gr.) Bryst (alt.mamma)
Melos
lem, ekstremitet
Mensis, men Måned
Mes-
Midtre. Alt. med- (l.)
Mesencephalon ”Midthjerne”
Mesenchym ”midt i saften”. Embryonalt bindevev
Mesoderm
Mes- = midtre (kimlag)
Meta-
Etter, endre. Eks.: metaplasi = omgjøre (fra en celletype til
en annen.) Sml. transdifferensiering.
Metra
Livmor (alt. uterus, hystera)
Migrasjon
Vandring (celle-)
Morfogen
Kjemiske substanser, særlig protein ligander, som lokalt
kan påvirke differensieringen av celler (en form for
parakrin sekresjon).
Morfogenetisk Et gitt morfogen distribueres i avtagende konsentrasjon fra
gradient
produsentcellen. Morfogenet bindes til målceller og vil
kunne utløse forskjellig differensiering av disse.
Differensieringsforskjellene skyldes bl.a. at målcellene
utsettes for ulike mengder av morfogenet (samt at
morfogenet ekstracellulært kan interagere med andre
proteinformer og derved endre ligandegenskaper).
Morfologi
Formlære, strukturobservasjoner med eller uten bruk av
mikroskop
Morula ”Morbær”. Navn på fosteret slik det ser ut i 8-32
cellestadiet.
Motifs
Samme betydning som motiv, men ulik anvendelse. Motifs
brukes særlig om spesielle sekvenser av aminoyrer eller av
nucleotider innen henholdsvis proteiner og nucleinsyrer.
Myotom
Omfatter de celler i somittene som differensieres til
myoblaster
Målceller
Brukes som regel om celler som responderer på
ekstracellulære ligander basert på at de har kognate
receptorer i ytre cellemembran eller intracellulære
receptorer (ofte upresist kalt ”kjernereceptorer”).

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
VII
Målcellene må følgelig være i en ”påvirkbar” modus (ha en
egnet differensieringsstatus).
Målgener
Neo-
Neoplasi
Neurallist
Neuralrør
Neuropor
Non-Hox
homeoboks gener
Notochord
Oropharyngealmembran
Orthotopisk
Oviduct
Ovulasjon
Para-
Paraksial
(mesoderm)
Paraloge gruppe
Peritoneum
Pharyngealbue
PIFs
Plasma
Placenta
Plasmalem
PLs
Pre-
Primordium
Gener hvis transkripsjonsforhold reguleres av bestemte
begivenheter, f.eks. som følge av at et gitt sett av
proteinligander binder seg til sine spesifikke
plasmamembranreceptorer med påfølgende intracellulær
signalformidling. Videre eksempler er at når Hox-gener
uttrykkes, så vil Hox-proteinene (som er
transkripsjonsfaktorer) påvirke reguleringen av gener som
har kognate bindingsmotifs (GRSs) for Hox-proteinene.
Ny
(se Plasma)
Cellesamlinger som avsnøres fra grensesonen mellom
”vanlig” ektoderm og neuroektoderm. Neurallistceller
vandrer og inngår så i en rekke fosterstrukturer. Omtales
ofte som et fjerde kimblad
Dannes av neuroektodermceller ved en avsnøringsprosess
fra ”vanlig” ektoderm. Blir til store deler av nerve-systemet
Signaler fra ryggstrengen er nødvendig for å indusere
neuralrørsdannelse.
Neuralrørsåpning
Flere enn 300. Alle er transkripsjonsfaktorer. Mange av
stor betydning for kroppsutformingen.
Ryggstreng (også Chorda dorsalis., Chordamesoderm)
Munnhule-svelg membran
”På samme sted som …”
Eggleder
Eggløsning
ved siden av. Eks.: para-aksial = ved siden av aksen
Para-aksial = den del av mesodermen som ligger nærmest
fosterets lengde akse (anterior-posterior akse)
Brukes om tilsvarende Hox gener i de 4 ulike gen-
”clustrene”, slik som Hoxa-1, Hoxb-1 og Hoxd-1.
Hox-genene kan samles i 13 paralog-grupper.
Serøs bukhinne (”noe som er strukket ut”)
Alternativt navn for gjellebue (pharynx = svelg)
Protein Induserende Faktorer, proteiner som binder seg til
plasmamembranreceptorer
Egentlig form. Av gr. plassein = å forme.
Eks: neoplasi =”ny-forming” (svulst)
Morkake (egentlig ”flat kake”)
=Ytre cellemembran
Protein Ligander
Før
Anlegg, ”fosterutgave” av en anatomisk enhet, f.eks. et
organ

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
VIII
Pro-
Foran eller før. Eks.: prochordal plate. Preproproteiner
Prochordalplate
Plate foran strengen (chorda dorsalis, notochord), mellom
denne og oropharyngealmemmbranen.
Proliferasjon Økning i antall celler
Pronucleus Betegnelse på de haploide kjønnscellers kjerner etter
fertilisasjonen frem til zygoten går i mitose.
Prosencephalon ”Forhjerne”. Blir til Telencephalon og Diencephalon
Proteom
Den samlede proteinpopulasjon i en celle, kvalitativt og
kvantitativt
RA (9-cis)
Variant av Retinoic Acid
RA (all trans-) Retinoic Acid (derivat av retinol = vitamin A). Ligand for
RA-Receptorer
RA-indusert Retinsyre indusert homeose
homeosis
RAR (α,β,γ) RA- (kjerne)receptorer. Tre hovedtyper.
RARE
Responselementer relatert til RA-systemet
RA-responsiv (Hypotetisk) sammensatt genregulatorisk enhet som kan
enhancer
initiere transkripsjon av ett eller flere Hox-gener ved RApåvirkning.
Represjon
Undertrykke, stenge, nedregulere
Reproduktiv kloning Kloning hvor formålet er å utvikle ”voksne” organismer
Rhombencephalon ”Bakhjerne”. Blir til Metencephalon og Myelencephalon
Rostralt
i retning mot snute, nebb, nese (rostrum)
RXR α,β,γ Kjernereceptorer for 9-cis RA
Sclerotom
”Hard del”, Den del av en somitt som bl. a. omfatter celler
som blir til brusk- og beinvevsdannende celler i
akseskjelettet.
Sekretere Fornorkset variant av secernere, skille ut sekret !
Shh
Sonic hedgehog. Tilhører hedgehog-familien av sekreterte
protein-ligander. Viktig ved embryonal induksjon, bl. a.
ved ryggstrengens rolle ved neurulasjonen, differensiering i
dorso-ventral retning innen neuralrøret,
somittdifferensierng, dannelse av lemmer m.m.
Signal-kaskader
Skjebnekart
Somatiske celler
Somitt
Splanchnion
Terapeutisk kloning
Basert på merking av celler på tidlig embryotrinn. Deretter
følge cellene og deres etterkommere gjennom forskjellige
embryotrinn for å se hva som blir deres ”skjebne” – i hvilke
regioner/organer de ender opp. Nå benyttes mer og mer
genetisk merking (som gener for autofluorescerende
proteiner)
”Vanlige kroppsceller”, ikke kjønnsceller.
Ursegment. Parvis symmetriske (metamere)oppdelinger av
paraksial mesodermen.
Innvoll
Kloning hvor formålet er fosterutvikling kun frem til
blastocysttrinnet for så å bruke blastocyster til å etablere en

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
IX
Teratogen
Teratologi
Teratos (teras)
ES-celle linje.
Samlenavn for faktorer (fysiske, kjemiske, biologiske) som
kan fremkalle misdannelser
Læren om misdannelser fremkalt av teratogener
Monster
TGFβ
Topos
Transdifferensiering
Transgen
Transgene dyr
Trophe
Uterus
Ventral
Wnt-s
Zona pellucida
Zygon og
avledninger
Zygote
TGF = Transforming Growth Factor). Superfamilie av
gener for mange typer av sekreterte proteinligander med et
vidt spekter av effekter på fosterutviklingen. Over 25
medlemmer.
Plass, sted
Brukes vanligvis om situasjoner hvor man mener at en
differensiert celle ”direkte” går over til en annen differensieret
form
Et DNA-konstrukt som skal overføres til celler eller til
organismer (f.eks. ved injeksjon i en pronucleus i en
zygote). Består ofte av en styringsdel og et ”strukturelt
gen”. Styringsdelen kan være laget for å gi sted -
(celle-/vev-) spesifikk ekspresjon av genet, alternativt være
konstruert for å gi induserbar ekspresjon, f.eks. ved
tilføring av egnet ligand (til kognat ligandbindende faktor).
Transgener av denne type vil integreres på tilfeldig sted i
recipientcellens genom, i ett eller flere kopier i
tandemarrangement. Integrasjonsstedets ”topologi” kan i
betydelig grad påvirke ekspresjonsmulighetene for det
”strukturelle gen” fra ingen uttrykking til høyt nivå.
Dyr som har et ”fremmed DNA-konstrukt” integrert i alle
sine celler, inkludert gameter. Transgene dyr fremstilles
som regel ved injeksjon i en pronucleus på zygotetrinnet
eller ved transfeksjon av ES-celler som så injiseres i
blastocyster. De chimere dyr som derved dannes kan
tilbakekrysses til homozygositet for transgenet (se også
”knockout”-dyr).
Ernæring
Livmor (altwenativt: metra, hystera)
I retning mot buken (venter), ”forover”
Wnt-gener. Flere enn 10 stk, relatert til wingless genet hos
bananflue. Sekreterte proteinligander av stor betydning ved
embryonal induksjon.
Hinne som omgir eggcellers ytre cellemembran, senere
zygoten og fosteret frem til blastocysttrinnet. Zona
pellucida nedbrytes enzymatisk i uterus før implantasjonen
(”klekking”)
forene, trekke sammen. Se zygote.
”Sammensmeltning”

Appendix 1. Ordliste. Definisjoner. Utviklingsbiologi. Januar 2004
X

Appendix 2
Inndeling av fosterperioden hos mennesket
Hos mennesket er svangerskapsperioden 266 døgn, 38 uker eller 9 kalendermåneder, regnet fra
fertilisasjonstidspunktet. Regnet fra 1. dag i siste menstruasjonssyklus øker verdiene med i snitt
14 døgn.
Den egentlige embryonalperioden går fra 0 – 56 døgn. Deretter følger føtalperioden fra det 57. døgn
til døgn 266, altså 210 døgn. Fosterperioden deles også opp i preimplantasjonsperioden (de første
6-7 døgn) og postimplantasjonsperioden (de resterende ca 260 døgn).
En zygote hos mennesket har en diameter på vel 100 µm. Ved slutten av somittperioden, døgn 32,
har et human foster en hode-hale utstrekning på ca 5 mm. Deretter øker denne lengden med
omkring 1 mm pr. døgn frem til slutten av embryonalperioden. På døgn 56 er følgelig fosteret ca.
28 mm. I føtalperioden tiltar denne lengden med i gjennomsnitt 1.5 mm pr døgn i 210 døgn. Ved
fødselen vil lengden målt på denne måten være i størrelsesorden 34 – 35 cm.

Appendix 3
Litteratur-referanser

Appendix 4
Web-referanser