Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31

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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 1


Entrevista Nova tecnologia no combate ao “mal da vaca louca” mal da vaca louca, conhecido cientificamente como BSE (sigla em inglês para encefalopatia espongiforme bovina), afeta o cérebro do animal, provocando descontrole motor. As células morrem e o cérebro fica com a aparência de uma esponja. A vaca passa a agir como se estivesse enlouquecida, o que explica o fato de ser conhecida popularmente como mal da vaca louca. Não há tratamento conhecido para essa doença, que já foi detectada em cerca de 20 países da Europa, atingindo mais de 180 mil cabeças de gado. Ao contrário da maior parte das enfermidades, o mal da vaca louca não é transmitido por fungos, vírus ou bactérias, e sim por proteínas específicas denominadas prions. Essa doença nunca foi detectada no Brasil e a sua entrada, certamente, resultaria em um desastre para o país, que tem na pecuária um de seus principais alicerces econômicos, representando ganhos de mais de R$ 55 bilhões por ano. Sem falar que o rebanho brasileiro é hoje maior do que a soma dos rebanhos da Argentina, Paraguai e Uruguai. Diante da necessidade urgente de conter a sua disseminação, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), por meio de uma de suas 40 unidades de pesquisa, a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, localizada em Brasília, DF, desenvolveu um método para detecção de proteínas de origem animal em rações destinadas a mamíferos, especialmente ruminantes, que tem como objetivo monitorar a qualidade do alimento e evitar a transmissão de doenças causadas por substâncias infecciosas, tais como prions transmissores de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE), principalmente o mal da vaca louca. O método, desenvolvido pela equipe do pesquisador Carlos Bloch Jr há cerca de três anos, cuja patente foi depositada pela Embrapa em 2002, utiliza aparelhos de última geração denominados espectrômetros de massa, para a detecção das proteínas. Para se ter uma idéia do grau de modernidade e de eficiência desses aparelhos, eles possuem tecnologia comparável à que está sendo usada pelos robôs Spirit e Opportunity nas pesquisas que estão sendo feitas pela NASA no Planeta Marte, para a detecção de outros tipos de moléculas. De acordo com o pesquisador, esses aparelhos são hipersensíveis, com um limite de detecção altíssimo, de uma parte por milhão, ou seja, se fizermos uma comparação com uma balança na qual fossem colocadas um milhão de pessoas, o espectrômetro de massa seria capaz de detectar a ausência de apenas uma delas. 2 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Metodologia detecta proteínas na ração e evita a contaminação de animais Entrevista concedida a Maria Fernanda Diniz


Para falar sobre essa metodologia e a sua importância para a pesquisa agropecuária brasileira, a revista Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento entrevistou o pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Carlos Bloch Jr. Durante a entrevista, ele falou sobre o método desenvolvido por sua equipe e das vantagens que representa sobre os outros métodos utilizados até o momento, além dos rumos dessas pesquisas para o futuro. BC&D – Em que consiste o método utilizado pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e há quanto tempo foi desenvolvido? Bloch – O método começou a ser desenvolvido pela nossa equipe há cerca de três anos, foi aperfeiçoado ao longo de 2001 e em 2002 foi depositada a patente. O objetivo desse método é avaliar a qualidade das rações destinadas a ruminantes e, assim, evitar a transmissão de TSE’s (encefalopatias espongiformes transmissíveis), especialmente a encefalopatia espongiforme bovina (BSE), pela detecção de proteínas de origem animal, em particular daquelas provenientes de restos de carcaças de animais abatidos que pudessem ser misturados à ração. O desenvolvimento dessa metodologia compreende três etapas: a primeira e mais trabalhosa é a extração do material protéico para separá-lo, principalmente de lipídeos e dos carboidratos. Em seguida, cada amostra pode ser analisada em dois tipos de espectrômetros de massa simultaneamente, o primeiro analisa em poucos minutos a presença de moléculas de proteína animal, como a mioglobina, cadeias alfa e beta da hemoglobina e proteínas plasmáticas, para dizer se existe ou não algum indício de contaminação. O segundo analisa e quantifica os seus fragmentos (peptídeos) derivados de moléculas inteiras de contaminantes, que podem se formar a partir do ataque de microrganismos e/ou da ação mecâ- nica durante o processo de fabricação. A terceira etapa é a interpretação dos dados para determinar os níveis de contaminação e a sua origem, ou seja, se as moléculas contaminantes encontradas eram provenientes de bovinos, suínos, eqüinos, ovinos, aves, peixes, etc. “O O grande grande avanço avanço propiciado propiciado por por essa essa metodologia metodologia é é o o fato fato de de poder poder detectar detectar as as proteínas proteínas inteiras inteiras ou ou fragmentos fragmentos delas delas com com uma uma precisão precisão de de uma uma parte parte por por milhão milhão (PPM).” (PPM).” BC&D – Qual é a vantagem da espectrometria de massa sobre os outros métodos utilizados para o controle dessas doenças? Bloch – A espectrometria de massa é um método muito mais sensível, rápido e seguro para se diagnosticar a presença desse tipo de molécula. Não é à toa que você encontra espectrômetros de massa espalhados por locais e em atividades que até bem pouco tempo atrás não se poderia imaginar. Só para citar alguns exemplos, encontram-se hoje espectrômetros de massa nos aeroportos, nos correios, nos esportes, nos tanques e aviões de guerra, sem falar nas missões espaciais. São esses equipamentos que produzem, com mais rapidez e eficiência, respostas sobre a presença ou não de explosivos, material de guerra química ou biológica. Atualmente, são utilizados três métodos para monitorar a qualidade dos alimentos dos ruminantes: o primeiro é o de microscopia ótica, que se baseia na procura de fragmentos de pele, ossos etc. na ração; o segundo é o método ELISA, que utiliza anticorpos para detectar as proteínas alvo; e o terceiro e mais novo é o método PCR, que detecta o DNA das proteínas por meio de um primer (um tipo de gene marcador). Todos esses métodos apresentam li- mitações da mesma natureza, ou seja, não detectam diretamente a presença de proteína. O primeiro, e mais utilizado ainda hoje na União Européia é também o mais falho de todos, já que a microscopia ótica não permite a detecção de proteínas. O método ELISA tem como fator limitante o fato de utilizar anticorpos específicos para determinadas classes de proteínas, o que impede a identificação de outros grupos; e o terceiro, o de PCR, esbarra no problema do DNA ser fragmentado depois do processo de industrialização, tornando difícil a sua amplificação para a análise. Logo, a espectrometria de massa aparece como o método mais preciso para a detecção direta e não indireta de proteínas. O grande avanço propiciado por essa metodologia é o fato de poder detectar as proteínas inteiras ou fragmentos delas com uma precisão de uma parte por milhão (PPM). O que isso significa? Se fizermos uma analogia com uma balança na qual são colocadas um milhão de pessoas, o espectrômetro é capaz de detectar a ausência de apenas uma delas. E os níveis de detecção estão sendo melhorados cada vez mais. Os últimos espectrômetros lançados já têm poder de menos de uma parte por milhão, ou seja, menos de uma pessoa, se continuarmos a seguir aquela analogia, e tudo isso com muita rapidez e eficiência automatizáveis. A parte mais demorada desse processo é a primeira etapa, na qual é feita a extração do material a ser analisado. Essa etapa pode demorar de 36 a 72 horas, mas é comum a todos os outros métodos. Em suma, ao que tudo indica, essa metodologia é o que existe hoje de mais moderno e seguro para monitorar a qualidade dos alimentos oferecidos aos ruminantes e, logo, controlar a disseminação das encefalopatias espongiformes transmissíveis, ou TSE’s, como são conhecidas. BC&D – As TSE’ s , entre as quais a mais nociva é a BSE (encefalopatia espongiforme bovina), ou mal da vaca louca, re- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 3


presentam uma ameaça não apenas para os animais como também para os seres humanos. Como se dá a contaminação e qual o tratamento existente hoje para essas doenças? Bloch – As encefalopatias espongiformes transmissíveis, ou TSE’s, são doenças progressivas e letais que afetam o sistema nervoso central e se caracterizam por alterações anatômicas localizadas no cérebro. Essas alterações são um tipo de lesão histológica, constituídas de vacúolos e depósitos protéicos. As TSE’s podem resultar de infecções espontâneas, transmissão hereditária ou exposição a materiais contaminados. As TSE’s incluem: a BSE, conhecida popularmente como “mal da vaca louca”; a scrapie, ou paraplexia enzoótica dos ovinos, que afeta ovinos e caprinos em muitos países há mais de 200 anos; e a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) que afeta seres humanos, principalmente com mais de 50 anos de idade. Essa doença tem distribuição mundial, com incidência anual de aproximadamente um caso por milhão e ocorre de três formas: esporádica (responsável por 85 a 90% dos casos). familiar (associada a mutações genéticas, representa 5 a 10% dos casos) e iatrogênica, ou seja, por contaminação, (responsável por menos de 5% dos casos). Logo, em humanos, a chance de desenvolver a doença por contaminação é de menos de 5%. Nos outros 95% dos casos, a doença se desenvolve naturalmente. Em ovinos e bovinos, os principais sintomas são agressividade e falta de coordenação motora. Em humanos, os principais sintomas são: mioclonia – contração muscular brusca e breve – e demência. Não existe tratamento conhecido para a BSE, portanto, a única forma de combatê-la é evitando a contaminação. Cerca de 125 casos foram registrados no mundo em humanos, segundo os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos, e na Europa, aproximadamente 100 pessoas morreram em função dessa doença. Mas, para os ani- mais, a situação é bem mais séria, visto que já foi detectada em mais de 20 países da Europa, atingindo mais de 180 mil cabeças de gado. BC&D – Então a BSE tem se disseminado de forma rápida, especialmente na Europa. Como se dá a contaminação? Bloch – A natureza do agente infeccioso da BSE, assim como das outras TSE’s, é ainda motivo de controvérsia. Acredita-se que as partículas infecciosas responsáveis pela BSE são predominantemente proteínas específicas denominadas prions, que são compostas, em quase a sua totalidade, de uma glicoproteína de conformação anormal, que se prende à superfície externa das células. Em outras palavras, a teoria mais aceita hoje afirma que o agente infeccioso, prion, é derivado de uma proteína da membrana celular, que sofre uma mutação e forma um tipo insolúvel e patogênico de prion. Ainda hoje não está totalmente esclarecido o mecanismo pelo qual essa proteína anormal produz as alterações patológicas no cérebro dos animais ou indivíduos afetados. BC&D – Desde que foi diagnosticada pela primeira vez no mundo, como se deu a evolução da BSE ao longo dos anos? Bloch – Os primeiros casos de BSE foram diagnosticados no Reino Unido, em 1986. No final de 1987, o Departamento de Epidemiologia do Laboratório Veterinário Central daquele país concluiu que a disseminação da doença entre os bovinos ocorria mediante o consumo de farinha de carne e ossos, obtida a partir de carcaças de animais contaminados e incorporada à ração oferecida aos bovinos. Essa teoria foi plenamente confirmada, já que a proibição do uso daquele produto na alimentação de ruminantes teve efeito claro, resultando em redução significativa no aparecimento de 4 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 novos casos de BSE. Foram levantadas outras possibilidades de contaminação, como por exemplo, a transmissão vertical da vaca para o bezerro. Mas, o que se sabe de fato é que a epidemia do “mal da vaca louca” não teria acontecido se não houvesse disseminação por meio da farinha de carne e ossos. Diante disso, pode-se dizer que se um bovino contaminado for introduzido num país ou região onde não existe BSE, como é o caso do Brasil, só poderá ocorrer uma epidemia se a carcaça desse animal for utilizada para produzir farinha destinada à alimentação de ruminantes porque isso gera um sistema de disseminação e amplificação do agente infeccioso na população animal. Após o início da epidemia no Reino Unido, surgiu a teoria de que os primeiros casos de BSE teriam resultado da utilização de carcaças de ovinos contaminados com scrapie na alimentação de bovinos e que uma mudança no processo industrial de produção de farinha de carne e ossos teria diminuído a probabilidade de inativação do agente infeccioso. Entretanto, foram surgindo evidências de que a BSE e a scrapie são doenças diferentes, embora pertencentes ao mesmo grupo. Uma das evidências foi obtida a partir da inoculação experimental de scrapie em bovinos, que resultou em uma doença diferente da BSE. Além disso, a BSE mantém as suas características durante toda a epidemia, mesmo quando é transmitida a outra espécie animal, ao contrário da scrapie. Sem falar que essa doença não pode contaminar seres humanos, como é o caso da BSE. Na verdade, o ponto em comum entre as TSE’s é a elevada resistência a tratamentos físico-químicos de esterilização. BC&D – Mas há indícios de que a doença possa ter surgido antes de 1986, não é verdade? Bloch – Alguns relatórios técnicos mais recentes indicam que os


casos de BSE diagnosticados a partir de 1986 não teriam sido os primeiros casos da doença que, provavelmente, já existia no Reino Unido anteriormente. Alguns veterinários britânicos alegam ter visto casos semelhantes antes de 1986 que, na época, foram diagnosticados como doenças metabólicas comuns em vacas de alta produção. Mas não há comprovação científica sobre essas evidências. BC&D – Então a causa mais provável para a transmissão da BSE em bovinos está mesmo na mudança no processo de fabricação de farinha de carne e ossos, que tornou possível a reciclagem do agente infeccioso? Bloch – Essa, sem dúvida, é a causa mais provável para a transmissão dessa doença, o que tem representado um prejuízo para os produtores em escala mundial, já que as rações à base de farinha de osso, sangue e carne vinham sendo largamente recomendadas e usadas na alimentação de animais, como uma fonte de proteína, devido à presença de aminoácidos essenciais, minerais e vitamina B12. Além disso, essa forma de aproveitamento é uma maneira eficaz de reciclar os subprodutos proveniente do abate, evitando custos econômicos e ambientais adicionais. No entanto, como os materiais à base de osso e carnes de animais mamíferos presentes em dietas para ruminantes foram considerados a provável causa da BSE em bovinos, o seu uso foi proibido na Comunidade Européia, nos EUA e também no Brasil. Diante das vantagens desse tipo de alimentação para os bovinos, várias têm sido as tentativas de cessar a transmissão das TSE’s, em particular da BSE. Alguns trabalhos têm sido direcionados para a inativação das partículas infecciosas, favorecendo, assim, o aproveitamento dos resíduos do abate. Outros têm visado eliminar a possibilidade da transmissão pela detecção de proteínas animais nas rações e a sua rejeição no caso de teste positivo. Ambas as formas fazem uso de procedimentos analíticos para garantir a ausência de agentes causadores das TSE’s na alimentação animal. Dentre esses procedimentos, estão os que eu já descrevi na questão anterior, ou seja, a microscopia ótica, o método ELISA e as análises de DNA por PCR. A complexidade e especificidade das biomoléculas têm dificultado em muito a aplicação das técnicas freqüentemente utilizadas para a identificação e caracterização de compostos inorgânicos e orgânicos nas rações. Esse fato vem motivando o desenvolvimento de técnicas analíticas cada vez mais sofisticadas e eficientes, com ênfase na precisão requerida pela moderna biotecnologia. Dessa forma, chegamos hoje aos espectrômetros de massa que, como eu também já mencionei antes, são o que há de mais moderno e preciso para a detecção de proteínas nas rações de ruminantes. BC&D – E quais são os passos daqui pra frente, já existe alguma parceria para repasse dessa tecnologia à iniciativa privada? Existe alguma demanda do governo brasileiro para que essa tecnologia se torne obrigatória, de modo a evitar a entrada do “mal da vaca louca” no Brasil? Bloch – Creio firmemente que antes de nos preocuparmos com qualquer tipo de avanço tecnológico e sua comercialização, como é o caso desse método, devemos vê-lo como uma ferramenta de trabalho. Ela só poderá servir ao seu propósito e alcançar sua plenitude de uso se houver a visão clara do objetivo final que queremos atingir. Ou seja, se o nosso objetivo final for o lucro imediato, puro e simples para satisfazer acionistas, balanças de pagamentos e manutenção dos mesmos paradigmas de produção vigentes há décadas, essa tecnologia terá um impacto modesto e servirá somente nos momentos de crise, como o que estamos vivendo hoje, caso contrário cairá no esquecimento, como de fato ela se encontrava, até o surgimento da BSE nos Estados Unidos. Contudo, se tomarmos a decisão de priorizar a vida, a qualidade e a sanidade dos alimentos que chegam às mesas dessa geração e das próximas, essa tecnologia com certeza será de grande utilidade, não somente no processo de identificação de contaminantes intencionais ou acidentais, mas poderá didaticamente demonstrar internamente e para o exterior que esse país possui tecnologia de alto nível para responder a problemas mundiais imediatos, bem como para oferecer alternativas mais inteligentes e com visão de perspectiva para um setor tão importante como o do agronegócio. No que diz respeito aos aspectos legais dessa tecnologia, ela já está patenteada e pronta para ser licenciada à iniciativa privada. Estamos aguardando propostas de empresas interessadas em utilizála. Quanto ao governo brasileiro, a Embrapa e o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) estão em entendimento para discutir a melhor forma de implementá-la e, assim, dar um grande passo para reduzir ainda mais a possibilidade da presença de proteínas animais nas rações. Provavelmente, será por meio de uma portaria que obrigue as empresas a testarem seus produtos. A nossa equipe da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tem plenas condições de atender a essas demandas. Serão necessárias apenas algumas adaptações nos laboratórios de espectrometria de massa, de forma a torná-los mais aptos a prestar serviços – visto que hoje são laboratórios de pesquisa – além da contratação de pessoal especializado. Nós já atendemos a uma demanda do MAPA para análise de 800 amostras e, dessas, grande parte continha proteínas animais. No final do mês de fevereiro, teremos uma nova reunião com a equipe do Ministério para fechar essa questão. ___________________________________ O e-mail do Professor Carlos Bloch Júnior é: cbloch@cenargen.embrapa.br Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 5


BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento KL3 Publicações Fundador Dr. Henrique da Silva Castro Direção Geral e Edição Ana Lúcia de Almeida E-mail biotecnologia@biotecnologia.com.br Home-Page www.biotecnologia.com.br Projeto Gráfico KL3 Publicações LTDA SHIN CA 05 Conjunto “J” Bloco “B” Sala 105 Lago Norte - Brasília - DF Tel.: (061) 468-6099 Fax: (061) 468-3214 Os artigos assinados são de inteira responsabilidade de seus autores. ISSN 1414-4522 Carta ao Leitor Prezados Leitores, Já está bem divulgado o problema do “mal da vaca louca” no mundo todo, principalmente sobre os surtos que aconteceram na Europa e dizimaram milhares de cabeças de gado, causando imenso prejuízo. Aqui no Brasil, felizmente até agora, fomos poupados, mas sabemos também que pode ser apenas uma questão de tempo. Por isso mesmo o apoio à pesquisa dessa importante doença é primordial para a pecuária no país. Para falar sobre o assunto convidamos o Dr. Carlos Bloch Jr., que desenvolve, na Embrapa-Cenargen, um método de combate à doença. Confira a entrevista. Dr. Henrique da Silva Castro Nota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS (International Information System for the Agricultural Sciences and Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados da Agricultura Brasileira).


Conselho Científico Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento Vegetal Dr. Henrique da Silva Castro - Saúde; Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia; Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal; Dr. Naftale Katz - Saúde; Dr. Pedro Jurberg - Ciências; Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas; Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos; Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi Dr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Fundação Dalmo Catauli Giacometti Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética; Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico; Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN Dr. José Roberto Rogero Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotec Dr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPA Dr. Diógenes Santiago Santos - UFRGS Dr. José Luiz Lima Filho - UFPE Dra. Elba P. S. Bon - UFRJ Entrevista Entrevista Colaboraram nesta edição: Adriano Luiz Tonetti, Alessandra Pereira Fávero, Alexandre Patto Kanegae, Ana Paula Pacheco Clemente, Anderson Kurunczi Domingos, Antonio Costa de Oliveira, Bruno Coraucci Filho, Carla M. Y. Lemos, Celso Omoto, David John Bertioli, Eleni Gomes, Eliane Cristina Gruszka Vendruscolo, Elza Fernandes de Araújo, Enio Luiz Pedrotti, Erica Fuchs, Everaldo Gonçalves de Barros, Fábio Rueda Faucz, Fernando Irajá Félix de Carvalho, Francismar Corrêa Marcelino, Gabrielle Mouco, Gaspar Malone, Gláucia Maria Pastore, Helena Maria Wilhelm, Jorge Fernando Pereira, José Fernandes Barbosa Neto, Juliana Oliveira Lima, Karina Proite, Karla Thomas Kucek, Luiz Pereira Ramos, Maira Jardim Bernardino, Marcio Antônio Silva Pimenta, Márcio de Carvalho Moretzsohn, Márcio Nitschke, Marcos Barros de Medeiros, Maria Fernanda Diniz, Maria José Araújo Wanderley, Marisa Vieira de Queiroz, Marta Fonseca Martins, Maurílio Alves Moreira, Melânia Lopes Cornélio, Monita Fiori de Abreu, Patrícia Messenberg Guimarães, Paulo Alves Wanderley, Paulo Dejalma Zimmer, Paulo Henrique Machniewicz, Pilar Ximena Lizarazo Medina, Ricardo Antonio Polanczyk, Roberto da Silva, Rodrigo Barros Rocha, Ronaldo Stefanutti, Rubens Onofre Nodari, Samuel Martinelli, Sérgio Batista Alves, Soraya Cristina Leal-Bertioli, Valdir Marcos Stefenon. Nova tecnologia no combate ao “mal da vaca louca” 2 Pesquisa esquisa Silenciamento Gênico e Transgênicos 8 Detecção de resíduos de transgênicos em grãos e produtos derivados 14 Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 18 Biodiesel 28 Biofertilizantes Líquidos 38 Iniciativas Genômicas 45 Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 53 Biosurfatantes a partir de resíduos agroindustriais 63 Controle de qualidade de ervas medicinais 68 Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos 74 Glucoamilase:Estrutura e termoestabilização 86 Marcadores Moleculares no Melhoramento Genético de Araucária 95 Micropropagação de Macieira 100 Método Alternativo de Tratamento de Esgotos 109 Amendoim Selvagem 116 Bioética 120


Pesquisa Eliane Cristina Gruszka Vendruscolo MSc, Melhoramento Genético Vegetal. Professora de Genética/UFPR - Campus Palotina vendruscolo.1@osu.edu; egvendru@vn.com.br Silenciamento Gênico e Transgênicos Introdução A estrutura genômica de plantas pode ser alterada por transformação genética durante o processo de transferência gênica utilizandose Agrobacterium tumefaciens, biobalística e outras técnicas que integram parte de um genoma (gene exógeno) em um outro genoma (no caso, vegetal). A transgenia tem sido usada com o propósito de integrar seqüências gênicas de interesse com conseqüente alteração da expressão gênica. A expressão desse transgene nem sempre pode ser predita. Desse modo, o estudo das conseqüências dessas transformações tem-se tornado relevante nos últimos anos (VOINNET & BAULCOMBE, 1997; WATERHOUSE et al., 1998; VAUCHERET et al., 2001). Vários termos podem ser encontrados na literatura para descrever o silenciamento gênico. Esses incluem cossupressão, RNAi (RNA de interferência) e quelling (interrupção da seqüência gênica) em leveduras. A cossupressão seria o termo aplicado ao silenciamento gênico do gene endógeno pela ação do RNA do transgene. Aqui ambos os genes, exógeno e endógeno, são coordenadamente suprimidos. Quelling é um termo de cossupressão usado em Neurospora crassa, e o RNAi é aplicado ao silenciamento gênico em animais, quando esse acontece pela ação de uma fita dupla de RNA, causando a não transcrição nem a tradução de determinado gene(BAULCOMBE, 2002). 8 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Importância, mecanismos e modelos do silenciamento gênico Em vários experimentos, foram obtidas evidências do silenciamento gênico em plantas, que levaram à conclusão que, ao aumentar o número de cópias de um gene de interesse em particular, poderia reduzir a sua expressão (MAZTKE & MAZTKE, 1995; DEPICKER & VAN MONTAGU, 1997). WEI et al. (2001) comentam sobre uma correlação positiva entre o número de insertos com pobre expressão gênica. Vários transgenes inseridos podem ser silenciados após uma (relativamente) longa fase de expressão e podem, às vezes, silenciar a expressão (parcialmente) de genes homólogos localizados em posições ectópicas no genoma (FAGARD & VAUCHERET, 2000). Em alguns casos, o silenciamento gênico de transgenes pode desencadear a resistência a vírus e, em outros casos, a infecção viral pode silenciar a expressão de genes endógenos nas plantas (BAULCOMBE, 1996). Mecanismos de silenciamento gênico O silenciamento gênico, como processo, corresponde a uma interação entre seqüências homólogas de DNA ou RNA. Até hoje, sabe-se que o RNA está envolvido em 2 tipos de silenciamento gênico dependente de homologia (SGDH): 1) SGPTS (silenciamento gênico pós-transcricional), onde a degradação de RNAs homólogos no citoplasma levaria a não tradução e 2) SGT (silenciamento gênico transcricional), que está


relacionado com o bloqueio na transcrição induzido por um RNA antisenso derivado do próprio DNA, que promoveria uma metilação na região promotora, a nível nuclear, e a homologia para a metilação dirigida ocorreria nas regiões transcritas (WASSENEGGER, 2000; FAGARD & VAUCHERET, 2000; VAUCHERET et al., 2001). Embora os genes que interagem podem estar muito próximos no mesmo cromossomo e iniciar a inativação em cis, muitos sistemas estudados envolvem a interação de seqüências localizadas em diferentes cromossomos ou a transinativação. Ambos os tipos de SGDH estão freqüentemente associados com metilações de novo em seqüências-específicas do DNA nuclear (KOOTER et al., 1999; WASSENEGGER, 2000). O mecanismo de silenciamento gênico transcricional (SGT) estaria associado a metilações de novo na região do promotor do transgene, que poderiam ser meioticamente herdáveis (KOOTER et al., 1999). Essa metilação seria induzida por pareamento de regiões homólogas de DNA ou ainda DNA- RNA. Esse pareamento constitui o passo inicial para a iniciação do SGPT (WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). O pareamento induziria a uma metilação dentro da região codificante do transgene, que levaria a uma prematura interrupção de sua transcrição. Como resultado dessa síntese irregular de mRNA, um RNA aberrante (abRNA) seria formado (WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998; HAMILTON & BAULCOMBE, 1999; MATZKE et al., 2001). Estudos recentes têm encontrado presença de um RNA de, aproximadamente, 25 nt em sense e antisense, com homologia ao RNA alvo, em plantas que apresentam cossupressão e resistência a vírus, mas que não são encontradas em plantas usadas como controle. Tal fato contribui para evidenciar que existem diferentes formas de silenciamento, porém todas agindo num mesmo mecanismo (HAMILTON & BAULCOMBE, 1999). A resistência a vírus seria explicada pelo fato de estes abRNA serem o molde para que as RNA polimerases dependentes de RNA (RPdR) do hospedeiro (vegetal) possam sintetizar pequenas moléculas de RNA anti-sense (METTE et al., 1999; MATZKE et al., 2001; MLOTSHWA et al., 2002). Esses pequenos RNA antisense agiriam em trans, em seqüências de RNA complementares (RNA viral), levando à formação de RNA fita dupla (dfRNA). Um complexo de RNAses específicas para esses dfRNAs (conhecidas como Complexo DICER ou RNAses tipo III, específicas para as dfRNAs), levariam a degradação dessas moléculas híbridas e, em conseqüência, tornariam a planta resistente ao vírus (METZLAFF et al., 1997; CERUTTI, 2003). No caso das integrações múltiplas, como as cópias do transgene, o silenciamento se iniciaria por um pareamento não recíproco entre o transgene e o gene endógeno, ou entre os transgenes e, como conseqüência desse pareamento, o locus receptor seria metilado, levando a uma terminação prematura da transcrição (ENGLISH & BAULCOMBE, 1996; WASSENEGGER, 2000). A posição de integração do transgene também parece ser importante para o silenciamento pelo fato de o loci silenciador usualmente consistir de múltiplas cópias do transgene ligadas. Outro modelo que explica o silenciamento de transgenes em cópias múltiplas e invertidas é a formação de um RNA em alça (alRNA), que, posteriormente, se transformaria em dfRNA pela ação de RNA nucleases causando o efeito do silenciamento conforme foi descrito acima (WATERHOUSE et al., 2001). De modo similar, o dfRNA poderia também ser usado como molde para algumas RNA polimerases que transcreveriam moléculas de RNA antisenso, homólogos aos mRNAs, formando os dfRNAs e continuando o ciclo de silenciamento por indução do SGT e SGPT (KOOTER et al., 1999; FAGARD & VAUCHERET, 2000). Modelos para explicar o silenciamento gênico Vários autores têm sugerido modelos para os mecanismos moleculares envolvidos no silenciamento gênico, que não são eventos mutuamente exclusivos, mas que podem ser usados individualmente ou em conjunto para explicar o silenciamento gênico. 1. Silenciamento mediado pelo pareamento DNA-DNA Esse modelo tem sido proposto para explicar certos tipos de cossupresssão (JORGENSEN, 1990; MEYER & SAEDLER, 1996); a trans-inativação (MATZKE & MATZKE; 1990; CHANDLER & VAUCHERET, 2001) e a paramutação (MEYER et al., 1993; CHANDLER & VAUCHERET, 2001). O pareamento de regiões homólogas do DNA, devido à interação entre duas seqüências homólogas numa interfase da meiose, levaria à formação de estruturas em alças, que seria o precursor da difusão de metilações no DNA, induzindo o SGT (ENGLISH & BAULCOMBE, 1996). Os transgenes diferem muito em sua capacidade de trans-inativar cópias homólogas, o que parece estar associado à capacidade de procurar outras posições cromossomais com homologia. A presença de genes silenciadores muito próximos ao telômero sugere que regiões teloméricas são sítios favoráveis para a interação com seqüências homólogas (MEYER & SAEDLER, 2001). 2. Degradação de RNA em excesso Em transgênicos, é comum o uso de promotores fortes para se conseguir a alta expressão do transgene. Como conseqüência, para a detecção de planta com o inserto, são esperados níveis altos do mRNA do transgene. Nesse modelo, os abRNA seriam produzidos devido a uma alta taxa de transcrição do DNA, com isso, os altos níveis de mRNA. Se essa taxa de mRNA exceder a taxa de tradução, pode ocorrer, além da de- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 9


gradação parcial desses mRNA, a terminação abrupta da transcrição, o processamento irregular, originando abRNAs e induzindo ao SGPT (WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). Outrossim, o excesso de produção de uma determinada proteína pode transmitir um sinal para a maquinaria de tradução a fim de induzir a terminação de sua própria transcrição. As proteínas em excesso seriam marcadas por ubiquitinas, por fosforilação ou por outras modificações pós-transcricionais (HOCHSTRASSER, 1996; WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). 3. Híbridos DNA-RNA A observação de que o pareamento DNA-RNA pode induzir padrões de metilação sugere mudanças no estado epigenético caracterizado por um estado específico de metilação do DNA ou da estrutura da cromatina, durante o período pré-meiótico ou de hibridização somática (MEYER & SAEDLER, 2001). Estudos indicaram que fragmentos de RNA poderiam induzir uma hipermetilação em seqüências homólogas (pareamento DNA -RNA), causando as mudanças epigenéticas. Tal fenômeno foi comprovado em estudos com plantas transgênicas que continham o cDNA dos virióides do PSTV da batata. A metilação no genoma do viróide foi observada mesmo sem que a replicação do seu RNA tivesse ocorrido (WASSENEGGER et al., 1994; WASSENEGGER, 2000). Os transcritos poderiam induzir a metilação em regiões homólogas de DNA, que seria comum em transformantes, os quais acumulariam grandes concentrações dos transcritos no núcleo, devido às altas taxas de tradução e do processamento irregular desses RNAs. Como conseqüência dessa marcação, a proteína e seus produtos, após degradação, poderiam reconhecer seqüências homólogas surgindo nos ribossomos, e levando ao término prematuro da transcrição, além de uma deadenilação na posição 3’ e, com isso, ao surgimento dos abRNAs e a indução do SGPT (JONES et al., 1999). 4. Modelo mediado por RNA antisenso O RNA antisenso parece ser fundamental nos mecanismos de cossupressão. As fitas duplas de RNA seriam alvos gerados pelos promotores presentes no DNA do transgene e pela ação de RNA polimerases dependente de RNA ( RPdR) (LINDBO et al., 1993). WASSENEGGER & PÉLISSIER (1998) ainda propõem que esse RNA poderia surgir devido à posição da seqüência de DNA produtora do RNA antisenso, próximo a um promotor localizado adjacente a uma cópia de T-DNA integrado e em anti-senso . A produção de RNA antisenso pelas RPdR dependeria de níveis específicos do RNA senso e do acúmulo de intermediários de RNA (durante o processamento ou transporte). Essa hipótese se baseia no fato de que as RPdR reconheceriam os transcritos aberrantes, que seriam derivados de transcrição, transporte ou tradução incorreta do transgene. A produção de abRNA poderia induzir as mudanças epigenéticas do gene que influenciaria o seu processamento (MEYER & SAEDLER, 1996; WASSENEGGER, 2000). Certos transgenes somente podem silenciar ou cossuprimir seqüências caso contenham um final 3’ homólogo, enquanto certos transgenes com regiões 5’ homólogas não são afetadas (ENGLISH et al., 1996). Essas observações sugerem que os transcritos antisenso são feitos preferencialmente nas regiões 3’ do transgene (WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998). O papel da metilação e da estrutura da cromatina no silenciamento gênico Em recentes estudos sobre silenciamento em plantas, a ocorrência de pareamento entre seqüências homólogas parece ser condição importante para o silenciamento (BAULCOMBE & ENGLISH, 1996; VOINNET et al., 1998). O silencia- 10 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 mento em trans seria quando uma região metilada teria homologia com a região promotora de um determinado gene, dirigindo uma metilação de novo nessa região, para induzir o SGT. Tal fenômeno é conhecido como metilação do DNA dirigida por DNA (MDdD)(JONES et al., 1999; METTE et al., 1999; WASSENEGGER, 2000). Muitos genes eucarióticos e elementos transponíveis exibem uma forte correlação inversa entre densidade de metilação do DNA e atividade transcricional ou transposicional. Ao certo, não se sabe se a ação da metilação da citosina alteraria a estrutura da cromatina, mas estudos em plantas demonstram uma correlação positiva entre o número de cópias do transgene, o aumento da metilação e a diminuição da atividade transcricional (KUMPATLA et al.,1997). Em eucariontes, os resíduos de citosina do DNA genômico podem ser metilados na posição 5’da citidina. As enzimas das DNA metiltransferases que realizam essa reação têm preferências por grupos CpG ou CpNpG. Em ambos os casos, o DNA recentemente replicado, que contém grupos CpG ou CpNpG hemimetilados, são fortes substratos para a ação das DNA metiltransferases. Tal padrão asseguraria as metilações de manutenção e de padrões de metilação pré-existentes nos cromossomos filhos (ATHERLY et al.,1999). Em transgenes, esse padrão de metilação não é igual. As metilações localizadas em resíduos de citosina não estão localizadas em seqüências CpG ou CpNpGp. Os fatores que especificam esse padrão de metilação não simétrico são ainda uma incógnita, mas parece que a metilação do DNA é dirigida por um RNA. Não se sabe se esse RNA seria o sinal em todos os casos da metilação não simétrica das citosinas em plantas (FINNEGAN et al., 1998). Alguns autores denominam esse fenômeno de metilação do DNA dirigida por RNA (MDdR)(WASSENEGGER, 2000; BAULCOMBE, 2002). Esse padrão também não parece ser conservado


durante a meiose, em contraste com o padrão de metilação simétrica (PARK et al., 1996; LUFF et al., 1999). Estudos têm demonstrado que a metilação do DNA e a estrutura da cromatina têm um importante papel no SGT e SGPT. Nessa forma de silenciamento, a região promotora e, às vezes, a região codificante dos transgenes silenciados apresentamse densamente metilados (KOOTER et al., 1999). Plantas mutantes para o gene da proteína DDM1, que remodela a cromatina, não apresentaram o silenciamento gênico. Isso indica um possível papel da metilação do DNA e da estrutura da cromatina no estabelecimento e na manutenção de SGPT. Supõe-se que o aumento da metilação leve à heterocromatização do DNA e, com isso, ao difícil acesso às RNA polimerases, diminuindo a ação transcricional (YE et al., 1996; WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998; WASSENEGGER et al., 2000). Embora os modelos atuais proponham que a produção de um RNA aberrante, fruto de uma metilação, seja o causador de uma finalização prematura da transcrição do mRNA, existem estudos com linhagens defeituosas de N. crassa para o gene da metilase da citosina (dim2) que exibiram a mesma capacidade de silenciamento que a linhagem controle (dim +) (COGONI & MACINO, 1999). Fato semelhante foi observado em estudos realizados com plantas transgênicas de fumo, onde o gene nptII (neomicina fosfotransferase) metilado teve a transcrição e o SGPT normais quando comparado com uma cópia do gene nptII não metilado e não silenciado (VAN HOUDT et al., 1997). Tais fatos indicam que a metilação não parece ser condição sine qua non para a indução e a manutenção do SGPT (PARK et al., 1996). Razões para a ocorrência do silenciamento gênico Diversos autores têm levantado o papel do silenciamento gênico . O silenciamento gênico parece estar envolvido com a defesa a ácidos nucléicos estranhos (COVEY, 2000; JORGENSEN, 1995; MOURAIN et al., 2000), com a proteção do genoma contra a inserção de elementos transponíveis (KETTING et al., 1999; BAULCOMBE, 2002) e com a regulação da expressão gênica de famílias de multigenes ou ainda genes duplicados em plantas (TANZER et al., 1997; CHANDLER & VAUCHERET, 2001). Uma outra questão poderia ser levantada, se seqüências homólogas de DNA podem parear e se tornar silenciadas, como então explicar que membros de famílias de genes poderiam escapar da inativação? MATZKE & MATZKE (1995) propõem a existência de duas maneiras de prevenir esse pareamento: ou pela divergência de seqüências encontradas em alelos (heterozigosidade) ou devido à redução do comprimento de seqüências homólogas, o que sugere um papel muito importante para os íntrons, que dividiriam a região codificante da proteína em segmentos pequenos demais para realizar um pareamento efetivo. Parece bastante unânime entre vários autores que o silenciamento gênico tem como função principal prevenir a superexpressão gênica, controlando o número de cópias de determinado gene ou ainda ser um mecanismo de defesa contra a superexpressão de transgenes (WASSENEGGER & PÉLISSIER, 1998; KOOTER et al., 1999; WASSENEGGER, 2000). Difusão e amplificação do silenciamento gênico Um dos mais importantes aspectos do silenciamento gênico é que este é um mecanismo autômato, isto é, pode ser induzido localmente e pode se espalhar para distantes locais no organismo (VOINNET et al., 1998; COVEY, 2000). Esse transporte sistêmico do sinal de silenciamento parece relacionar-se com um sinal móvel, não metabólico, ainda não completamente identificado. Esse si- nal, sendo parte integral do processo de silenciamento, parece interagir com proteínas de membranas, movendose de célula em célula através do floema (plasmodesmata), assemelhando-se com o padrão de infecção de vírus nas plantas (PALAUQUI et al., 1997; VOINNET & BAULCOMBE, 1997; VOINNET et al., 1998; MLOTSHWA et al., 2002). O SGPT teria três fases: início, manutenção e difusão propriamente dita. Os transgenes, os vírus e até mesmo o DNA exógeno (proveniente da transformação) poderiam iniciar o SGPT. Alguns autores sugerem que esse sinal seja na forma de RNA, mas não é conhecido ainda qual o tipo de RNA que estaria envolvido: se abRNA, dfRNA ou ainda o asRNA (METTE et al., 1999; KOOTER et al., 1999; MATZKE et al., 2001; MLOSTHWA et al., 2001). Esse conceito de difusão célulacélula e de transporte a longas distâncias não pode ser descartado, visto que o vírus tem seu genoma composto por RNA e esse RNA difunde-se para dentro da planta, podendo se mover de célula-célula através de proteínas codificadas pelo seu próprio genoma (WATERHOUSE et al., 2001). Ainda não está completamente elucidado como o sinal para o silenciamento pode se espalhar sistemicamente pela planta e ainda ter seus efeitos amplificados. O silenciamento parece ser um mecanismo de prevenção, como a vacina é para os humanos. Parece sensato estabelecer que o silenciamento nada mais é que uma mensagem enviada pelas células já infectadas pelo vírus para aquelas que ainda não o foram, mas que estejam na iminência de o ser, para que essas preparem suas defesas contra o agente invasor. Se esse sinal contiver fragmentos da seqüência viral, as células receptoras poderiam estar preparadas para degradar qualquer RNA que contivesse essas seqüências, mesmo antes de o vírus chegar (RATCLIFF et al., 1997; WATERHOUSE et al., 2001). Esse modelo poderia explicar algumas observações:1) de que plantas Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 11


transgênicas com transgenes derivados de vírus podem apresentar uma recuperação, isto é, apresentar os sintomas da infecção inicial do vírus, seguida de crescimento sem os sintomas e de resistência ao vírus. 2) plantas transgênicas apresentando cossupressão tendem, inicialmente, a apresentar atividade do transgene, mas um silenciamento progressivo em tecidos em crescimento (WATERHOUSE et al., 2001). Considerações finais Na última década, o estudo do silenciamento gênico cresceu consideravelmente. Já existem evidências de que características específicas do DNA, como a metilação e a estrutura da cromatina, são importantes para o fenômeno do silenciamento. Todavia, o seu mecanismo molecular ainda não foi totalmente elucidado, mas, em razão de observações funcionais dos RNA anti-senso, abRNA, dfRNA, RNA polimerases e RNA nucleases, os estudiosos desse assunto puderam elaborar modelos para os mecanismos de SGDH , o SGT e SGPT. É notória a existência de algumas dificuldades para o estudo do silenciamento gênico em plantas transgênicas. Variações entre as linhas de plantas transgênicas constituem uma grande barreira para o completo estudo desses mecanismos. Duas linhas transgênicas não são similares pelo fato de o transgene em cada planta se situar em diferente domínio no cromossomo, em diferente arranjo e também devido à associação com diferentes quantidades de DNA do vetor de transformação (IGLESIAS et al., 1997; STAM et al., 1997). Apesar das dificuldades, vislumbram-se para essa área da ciência grandes e importantes descobertas: o completo entendimento da regulação gênica, a identificação dos fatores que podem afetar a expressão gênica e dos transgenes (talvez se discuta no futuro algumas propriedades dessa tecnologia) e, ainda mais, a compreensão dos mecanismos evolutivos. Agradecimentos Aos pesquisadores Ivan Schuster (Coodetec) e Maria Júlia Corazza Nunes (UEM/PR) pelas correções e sugestões dadas. Agradeço a Deus por tudo. Referências bibliográficas ATHERLY, A.; GIRTON, J.; MCDONALD, J. F. The molecular structure of prokaryotic and eukaryotic chromosomes. The science of genetics. Ed. Saunders College Publish. 1999, p.299-301. BAULCOMBE, D..RNA silencing. Current Opinion in Biology. 12(3),R82-R84,2002. CERUTTI, H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions? Trends in Genetics. 19(1),39-46,2003. CHANDLER, V. & VAUCHERET, O. Gene activation and gene silencing. Plant Physiology. 125, 145-148, 2001. COGONI, C. & MACINO, G. Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA dependent RNA polymerase. Nature 399, 166-169, 1999. COVEY, S. Silencing genes silencing genes. Trends in Plant Science. 5(10), .404-406,2000. DEPICKER, A. & VAN MONTAGU, M post-transcriptional gene silencing in plants. Current Opinion in Cell Biology. 9, 373-382, 1997. ENGLISH, J. J. & BAULCOMBE, D. C. 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Pesquisa Francismar Corrêa Marcelino Mestre em Genética Molecular, Laboratório de Análises Genéticas - AgroGenética eg34680@vicosa.ufv.br Marta Fonseca Martins Doutora em Genética Molecular, Laboratório de Análises Genéticas - AgroGenética mmartins@tdnet.com.br Marcio Antonio Silva Pimenta Doutor em Genética Molecular, Universidade Federal de Viçosa marciopimenta@vicosa.ufv.br Maurilio Alves Moreira PhD, Bioquímica & Genética de Plantas, Universidade Federal de Viçosa moreira@ufv.br Everaldo Gonçalves de Barros PhD, Biologia Molecular de Plantas, Universidade Federal de Viçosa ebarros@ufv.br Ilustrações cedidas pelos autores Detecção de resíduos de transgênicos em grãos e produtos derivados Mais de 58 milhões de hectares são cultivados atualmente no mundo com espécies transgênicas, sendo a soja, o milho, o algodão e a canola, as principais delas. Os países com as maiores áreas cultivadas com transgênicos são, nesta ordem, os Estados Unidos, a Argentina, o Canadá e a China. Estes países respondem por cerca de 99% da área total plantada com cultivos transgênicos. O cultivo de plantas geneticamente modificadas vem crescendo rapidamente em vários países, inclusive no Brasil, onde no mês de setembro foi aprovado, embora com restrições, o plantio de soja transgênica para o ano agrícola 2003/2004 (Medida Provisória 131, de 25 de setembro de 2003). A demanda por análises da presença de resíduos de transgênicos em matérias-primas e em alimentos tem aumentado significativamente no Brasil, nos últimos dois anos, principalmente após a comprovação do cultivo ilegal da soja transgênica, resistente ao herbicida glifosato, destacadamente no estado do Rio Grande do Sul, com sementes provenientes da Argentina. A maior parte das 14 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 A experiência da Universidade Federal de Viçosa análises tem sido demandada por empresas exportadoras de grãos de soja e de produtos derivados. Esses produtos são exportados, na maioria, para a Europa, Japão e Coréia. Já antevendo esse cenário, a Universidade Federal de Viçosa (UFV), por intermédio do Instituto de Biotecnologia (BIOAGRO), desenvolveu e otimizou metodologias baseadas na técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) para determinar a presença e quantificar resíduos de transgênicos em amostras de DNA extraídas de grãos, bem como de seus produtos derivados. Recentemente, a AgroGenética, laboratório incubado na Incubadora de Empresas de Base Tecnológica da UFV, foi credenciado junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) - Portaria Nº 27, de 15 de maio de 2003, para a “detecção de modificação genética em produtos de origem vegetal”. As modificações genéticas introduzidas que derivam os organismos geneticamente modificados (OGMs) podem ser produzidas por pelo menos três metodologias: Figura 1 - Representação da construção presente na soja RR® (Roundup Ready). Região promotora 35S do vírus do mosaico da couve flor, peptídeo de trânsito de Petúnia, gene que codifica a proteína EPSPS, que confere a resistência ao herbicida, e o terminador do gene da nopalina sintase (NOS).


Figura 2 - Análise qualitativa de OGM em amostras de grãos de soja. O DNA das amostras foi extraído pelo método Wizard e amplificado com primers específicos que anelam ou no gene da lectina (controle A e B), ou na região do promotor 35S do CaMV (C e D), ou na região terminadora NOS (E e F), ou na região codificadora do gene EPSPS (G e H). Após a reação de PCR, os produtos amplificados foram separados em géis de agarose. À esquerda (A, C, E e G) está exemplificado um resultado negativo e à direita (B, D, F e H), um resultado positivo. Os símbolos nas canaletas representam: (–), reação de PCR sem DNA (controle); N, soja normal (controle); T, soja transgênica (controle); 1, 2 e 3, referem-se a amostras de grãos de soja. As setas indicam as bandas de DNA de interesse. Figura 3 - Curva de amplificação de uma análise quantitativa em PCR de tempo real. A determinação da porcentagem de resíduos de OGM é baseada na comparação da curva de amplificação da amostra analisada com as curvas de amplificação de padrões certificados contendo quantidades conhecidas de OGMs. - técnicas do DNA recombinante, utilizando vetores para transformação de plantas; - técnicas envolvendo a introdução direta do material genético no organismo; - fusão celular por métodos não naturais. A construção genética utilizada para produzir OGMs consiste de três elementos básicos: o promotor, que controla a expressão do transgene no organismo; a região codificadora, que codifica a proteína de interesse; e a região terminadora, que determina o final do processo de transcrição do gene. Além disso, pode ser usado um gene marcador que serve para selecionar as células que, de fato, foram transformadas. A soja resistente ao herbicida glifosato, por exemplo, tem como região reguladora o promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor (CaMV); como região codificadora, o gene para a proteína EPSPS de Agrobacterium tumefasciens, que confere a resistência ao herbicida, e como região terminadora, o terminador do gene da nopalina sintase (NOS), também de Agrobacterium (Figura 1). A identificação de alimentos geneticamente modificados pode ser feita facilmente com o auxílio de técnicas de biologia molecular. OGMs podem ser identificados pela detecção direta do DNA exógeno nele contido, do mRNA correspondente produzido, da proteína resultante ou, ainda, pela característica introduzida. Os principais métodos analíticos de detecção utilizam a técnica da reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR) para detectar o DNA exógeno, ou métodos imunológicos, como o ELISA, para detectar a proteína. O método analítico escolhido deve ser sensível, confiável, reprodutível, minimizando, assim, falsos positivos e falsos negativos. Em nosso laboratório a detecção e quantificação de resíduos de OGMs em grãos, ingredientes e produtos derivados é feita pela técnica de PCR. Para tal, é necessária a extração de DNA das amostras e amplificação do fragmento de interesse. Para ser amplificado, o DNA purificado deve apresentar boa qualidade. Além disso, como controle, um gene normalmente presente no organismo, é amplificado em uma reação paralela. Para produtos que contenham soja na sua composição é utilizado o gene da lectina. Para produtos à base de milho, é utilizado o Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 15


Figura 4 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2000. Figura 5 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2001. Figura 6 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2002 Figura 7 - Percentual dos diferentes produtos analisados para a detecção de OGMs em 2003. 16 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 gene da delta zeína. Quando se quer detectar a presença de OGM em uma amostra de salsicha, por exemplo, amplifica-se como controle o gene da lectina, uma vez que a salsicha geralmente contém pelo menos 2% de proteína de soja na sua composição. O nosso laboratório procura utilizar métodos validados internacionalmente nas suas análises. Para a extração de DNA das amostras é utilizada a metodologia Wizard, método já validado pela Comunidade Econômica Européia. O transgene, ou seja, o segmento de DNA que foi introduzido na planta, é amplificado com primers específicos. Para a detecção do gene RR (Roundup Ready) são utilizados primers que se ligam ou à região do promotor 35S do CaMV, ou à região codificadora, ou ao terminador NOS. Após a reação de PCR os produtos amplificados são separados em géis de agarose. Para as análises quantitativas, o DNA das amostras é extraído pela metodologia PrepMan- Ultra e a análise é baseada no método TaqMan ® , que utiliza a técnica de PCR em Tempo Real, para amplificar a seqüência de DNA do promotor 35S, o qual está presente na maioria dos OGMs comercializados até o momento. O procedimento é extremamente preciso devido à perfeita complementaridade entre os primers usados na reação de PCR, a sonda TaqMan ® e as seqüências alvo de DNA que estão sendo amplificadas. A fluorescência liberada durante a reação é lida pelo sistema de detecção ABI PRISM ® 7000 e os dados gerados são analisados eletronicamente. Como a metodologia é bastante sensível, podese detectar, numa dada amostra, uma contaminação da ordem de 0,01%. No entanto, devido ao limite de recuperação do DNA durante o processo de extração e também aos erros inerentes ao processo de amostragem, temos trabalhado com um nível de detecção e quantificação da ordem de 0,1%. Isto é, uma amostra contendo 0,1% de transgênicos é classificada como positiva na nossa análise, tendo como referência um padrão certificado. Amostras com uma contaminação menor que 0,1% são classificadas como negativas. A Figura 2 mostra os possíveis resultados obtidos em uma análise qualitativa, enquanto que na Figura 3 pode ser visualizada uma curva de amplificação numa análise quantitativa em tempo real. A quantificação de uma determinada amos-


tra é feita com base na comparação da sua curva de amplificação com as de padrões certificados contendo quantidades conhecidas de OGMs. Desde o ano de 2000, o laboratório vem realizando a detecção de OGMs em grãos e em produtos derivados. Inicialmente a demanda era concentrada em amostras de grãos de soja e milho e em diferentes tipos de preparações de proteínas de soja. Com o passar dos anos, observamos um aumento na demanda pelas análises bem como uma diversificação das amostras enviadas. Atual- mente, temos recebido amostras de condimentos e temperos, óleos, amido de milho, sopas, fubá, entre outras. A partir de 2001 foram feitas as primeiras análises de produtos cárneos. A partir de 2002 houve um aumento expressivo no número de análises para esse tipo de produto. Naquele ano, 12,3% do total de amostras analisadas foram de produtos cárneos. Até setembro de 2003 a porcentagem foi de 7,3%. As Figuras 4, 5, 6 e 7 mostram a porcentagem de cada classe de produto analisado em relação ao total de amos- Figura 8 - Percentual de amostras positivas para a presença de resíduos de OGMs com relação ao número total de amostras analisadas, entre os anos de 2000 e 2003. Quadro 1 - Porcentagem de amostras positivas dentro de cada classe de amostras e com relação ao total de amostras analisadas % de % de % de % de % de % de % de % de amostras amostras amostras amostras amostras amostras amostras amostras Tipo de Amostra positivas pelo total de positivas dentro da classe positivas pelo total de positivas dentro da classe positivas pelo total de positivas dentro da classe positivas pelo total de positivas dentro da classe amostras analisada amostras analisada amostras analisada amostras analisada em 2000 em 2000 em 2001 em 2001 em 2002 em 2002 em 2003 em 2003 Soja grão Diferentes 3, 89 12, 96 7, 74 35, 42 6, 16 31, 69 9, 22 64, 20 tipos de proteínas de soja 0, 00 0, 0020 0, 00 0, 00 0, 96 3, 91 2, 13 7, 41 Farelo de soja 1, 11 11, 76 1, 37 14, 64 7, 93 54, 72 8, 33 54, 49 Produ tos cárneos 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 7, 93 63, 04 5, 32 73, 17 Milho grão 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 1, 06 13, 04 Ração 0, 00 0, 00 1, 82 21, 62 3, 56 49, 06 2, 30 35, 14 Hidrolisad o de soja 0, 00 0, 00 0, 23 4, 76 0, 00 0, 00 0, 18 25, 00 Sopas 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 Fubá de milho Condimen- 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 18 14, 29 tos e temperos 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 55 36, 36 1, 42 61, 54 Lecitina de soja 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 82 75, 00 0, 00 0, 00 Óleos e gorduras 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00 0, 27 40, 00 0, 00 0, 00 Outros 0, 00 0, 00 0, 23 2, 22 0, 27 5, 88 2, 30 37, 14 tras desde o ano de 2000. Ao longo dos anos que temos realizado análises de OGM em grãos e diferentes tipos de alimentos, pudemos observar um aumento gradual no número de amostras positivas, demonstrando que embora seja proibido o plantio e a comercialização de OGM no país, estes de alguma forma estão presentes no mercado, pelo menos, desde o ano de 2000. Naquele ano apenas 5% das amostras analisadas foram positivas para a presença de resíduos de OGM. Em 2001, esse percentual subiu para 11,5%. Em 2002, para 28,5%, e até setembro de 2003, 32,3% das amostras apresentaram resultado positivo. A Figura 8 representa de forma gráfica estes resultados. A porcentagem de amostras positivas dentro de cada classe de produtos também sofreu elevação, principalmente no caso de grãos de soja, farelo de soja e ração. A porcentagem de amostras de grãos de soja positivas para a presença de OGM em 2000 foi de 3,89 % com relação ao total de amostras analisadas. Com relação apenas às amostras de grãos analisadas, esse percentual foi de 12,96%, atingindo 35,42%, 31,69% e 64,20%, respectivamente, em 2001, 2002 e 2003. As amostras de farelo OGM subiram de 1,11% do total de amostras analisadas, em 2000, para 8,33% em 2003, enquanto as de ração eram 1,82% em 2001 e 2,3% em 2003. A porcentagem de amostras de produtos cárneos contendo resíduos de OGM foi de 7,93% do total de amostras analisadas e 63,04% com relação ao total de amostras dessa classe de produtos em 2002. Em 2003, esses valores foram de 5,32% e 73,17%, respectivamente. Com relação às amostras de milho e derivados apenas em 2003 começamos a detectar algumas amostras positivas, o que reflete a presença de outros cultivos transgênicos, que não a soja RR®, no mercado mundial. O Quadro 1 mostra a porcentagem de amostras positivas em relação ao número total de amostras analisadas e dentro de cada classe de amostras. Os nossos dados permitem concluir que no período de 2000 a 2003 houve um aumento gradual da presença de resíduos de transgênicos em grãos, ingredientes e alimentos derivados no país, especialmente com relação à soja. Os dados apontam também para a necessidade de definição de normas claras de rotulagem de alimentos. Para esse fim, é importante que se disponham de laboratórios qualificados para realizar esse tipo de análise. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 17


Pesquisa Ricardo Antonio. Polanczyk Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP). rapolanc@esalq.usp.br Samuel Martinelli Engenheiro Agrônomo, Doutorando – Programa de Pós Graduação em Entomologia (Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ -USP). smartine@esalq.usp.br Celso Omoto Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola (ESALQ-USP). celomoto@esalq.usp.br Sérgio Batista Alves Engenheiro Agrônomo, Prof. Dr. Depto Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola (ESALQ-USP). sebalves@esalq.usp.br Ilustrações cedidas pelos autores Bacillus thuringiensis no Manejo Integrado de Pragas 1. Introdução A exploração agrícola intensiva, necessária para atender à crescente demanda interna por alimentos, aumento do volume de exportações agrícolas e necessidade por produtos como fibras, tem como fator limitante o impacto negativo nos ecossistemas. De acordo com Tilman et al. (2001), diante da continuidade dos impactos ambientais globais provocados pela agricultura, 10 9 hectares de ecossistemas naturais serão convertidos em sistemas agrícolas até o ano de 2050. Do mesmo modo, os agroquímicos, utilizados para o controle de pragas agrícolas são muitas vezes responsáveis por contaminações do meio ambiente e intoxicações de produtores rurais. Portanto, é importante o desenvolvimento e implementação de táticas de controle de pragas menos agressivas, que estejam de acordo com as premissas do Manejo Integrado de Pragas, e que, ao mesmo tempo, proporcionem o retorno econômico ao agricultor. Neste sentido, o controle biológico é uma importante estratégia que, através da liberação, incremento e conservação de insetos parasitóides, predadores e microrganismos, impede que os insetos-praga atinjam níveis populacionais capazes de causar dano econômico. Indiretamente, diminui o impacto dos agroquímicos sobre o meio ambiente, pois minimiza ou torna desnecessário o seu uso. Entre os microrganismos com potencial para serem empregados no controle biológico 18 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Do uso convencional em Pulverização à Biotecnologia destaca-se o entomopatógeno Bacillus thuringiensis (Bt). Esta bactéria é capaz de produzir inclusões cristalinas durante a esporulação, que são responsáveis pela sua atividade tóxica. As suas toxinas, após a ingestão, solubilização e ativação no intestino do inseto, unem-se às células do epitélio, formando poros e desestabilizando os gradientes osmótico e iônico, fazendo com que este cesse a alimentação, morrendo por inanição ou septicemia (Priest, 2000; Glare & O´Callagham, 2000). Para que a patologia de Bt ocorra é necessário que o intestino do inseto permita a eficiente solubilização do cristal e que proteases ativem as protoxinas resultantes desta solubilização. Estas etapas são essenciais para que a toxina passe pela membrana peritrófica e se ligue aos receptores presentes na parede do intestino médio do inseto. Em função da variabilidade genética, entre os insetos há diferenças específicas e não específicas com relação à especificidade dos receptores das toxinas de Bt. A especificidade do receptor assume papel vital na defesa do organismo contra esta ação inseticida, juntamente com a solubilização do cristal e ativação da toxina. A ausência de necessidade de solubilizar o cristal e ativar as toxinas produzidas pelas plantas transgênicas pode influenciar a suscetibilidade dos organismos-alvos e nãoalvos de controle. A morte do inseto, no caso de produtos à base de Bt é uma interação da ação da toxina e dos esporos; o primeiro fator leva à formação de poros no tecido epitelial,


causando desiquilíbrio osmótico e iônico e a segundo causa septicemia devido à germinação dos esporos, proporcionada pela redução do pH intestinal devido à ação das toxinas. No caso de plantas-Bt, a causa da morte é somente a toxina. As primeiras tentativas de utilização de Bt no controle de pragas foram feitas na Europa durante a década de 30. Devido aos êxitos iniciais, a produção deste patógeno começou na França em 1938. Nos EUA, o interesse por este patógeno aumentou após 1950, principalmente para o controle de lepidópteros (Lambert & Peferoen, 1992; Beegle & Yamamoto, 1992). Deve-se salientar que a pressão da opinião pública quanto à saúde humana e preservação do meio ambiente incentivou a utilização de produtos microbianos, principalmente em hortaliças e frutíferas com alto valor comercial. Em 1970 foi lançado no mercado o Dipel (Bt kurstaki) que provou ser 20 a 200 vezes mais potente que outros isolados desta bactéria (Beegle & Yamamoto, 1992). Este produto, atualmente, é utilizado para o controle de mais de 167 lepidópterospraga (Glare & O’Callagham, 2000). Além disso, em 1976 foi caracterizado um isolado eficaz para o controle de insetos da ordem Diptera, denominado Bt israelensis e em 1983 outro letal para coleópteros denominado de Bt tenebrionis. O sucesso do uso de Bt no mundo só não é maior até agora, em função da existência de inseticidas químicos baratos que podem substituí-lo no controle de lepidópteros. Além de ser utilizado como bioinseticida, a partir da metade da década de 1980, foram obtidas as primeiras plantas transgênicas com a incorporação dos genes codificadores das proteínas tóxicas de Bt em plantas de fumo e tomate (Dias, 1992). Segundo Ely (1993), mais de 50 espécies de plantas sofreram transformações deste tipo com resultados satisfatórios. Formas truncadas dos genes que codificam proteínas inseticidas de Bt na sua forma ativa foram introduzidas e expressas com sucesso em plantas de fumo (Vaeck et al., 1987) e algodão (Perlak et al., 1990). Koziel et al. (1993), através da inserção de uma versão modificada do gene truncado cry1Ab, conseguiram a expressão da proteína Cry1Ab em altos níveis em plantas de milho e, em testes de campo, foi verificada a proteção contra o consumo foliar e perfuração de colmos por Ostrinia nubillalis, uma importante praga da cultura do milho nos EUA. De acordo com Clive (2002), estima-se que foram ocupados cerca de 58,7 milhões de hectares com culturas transgênicas no ano de 2002, com um aumento de 11,6% em relação ao ano anterior (Figura 1). A Índia, o maior produtor mundial de algodão, comercializou algodão-Bt pela primeira vez em 2002. Também, foi verificado um aumento da área pré-comercial de algodão-Bt na Colômbia e em Honduras. O EUA foi o país com maior área plantada, cerca de 39 milhões de hectares (66%), seguido pela Argentina (23%), Canadá (6%) e China (4%). A China apresentou o maior incremento anual (40%) entre 2001 e 2002 na área plantada com algodão-Bt, ocupando 51% da área cultivada com esta espécie. Em termos mundiais, o milho geneticamente modificado ocupou 12,4 milhões de hectares (com aumento de 9% em relação à área de 2001), seguido pelo algodão e canola com 6,8 e 3 milhões de hectares, respectivamente (Figura 2). 2. Vantagens e Limitações O emprego de biopesticidas à base de Bt é altamente desejável em programas de controle de insetos devi- do à sua alta especificidade e rápida degradação do ambiente. No entanto, de acordo com Vaeck et al. (1987), independentemente das vantagens do uso de inseticidas à base de toxinas produzidas pela bactéria Bt, o emprego destes produtos em escala comercial é limitado em função da instabilidade do cristal protéico em campo, devido à ação da luz ultravioleta e do seu alto custo de produção. Em relação ao efeito destas toxinas sobre insetos benéficos, Glare & O´Callagham (2000) relatam estudos realizados sobre o efeito de várias subespécies e produtos à base de Bt sobre 9 ordens de predadores, distribuídos em 25 famílias. Em relação aos parasitóides, os mesmos autores enumeram uma série de trabalhos realizados com Diptera (Tachinidae) e Hymenoptera (Aphelinidae, Braconidae, Chalcididae, Encyrtidae, Eulophidae, Eupelmidae, Ichneumonidae, Pteromalidae, Scelionidae e Trichogrammatidae). Em ambos os casos, embora os estudos tenham mostrado alguma variação nos resultados, os produtos formulados com Bt e suas subespécies apresentam pouco ou nenhum efeito sobre estes inimigos naturais. Os benefícios potenciais do uso de plantas geneticamente modificadas como, por exemplo, milho-Bt, não se limitam apenas à redução na aplicação de inseticidas de largo espectro. Estudos mostram a diminuição dos níveis de micotoxinas nos grãos destas plantas (Munkvold et al., 1999). De acordo com Obrycki et al. (2001), os riscos ou limitações no uso das plantas geneticamente mo- Figura 1. Adoção mundial de plantas geneticamente modificadas (GM) Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 19


dificadas podem ser agrupados em três categorias: troca de material genético entre as plantas geneticamente modificadas e espécies selvagens aparentadas por meio da dispersão de grãos de pólen; a seleção de indivíduos resistentes na população do inseto-alvo de controle e o impacto da tecnologia sobre outros insetos e organismos não-alvos do controle. Com relação à troca de material genético, segundo Ellstrand et al. (1999), as plantas domesticadas e utilizadas em sistemas agrícolas não podem ser consideradas como indivíduos evolutivamente separados de seus parentes selvagens. Dentre as 13 mais importantes espécies utilizadas para a produção de alimentos, 90% destas formam híbridos com seus parentes selvagens em algum local dentro de sua área de distribuição agrícola. Deste modo, os centros de origem das espécies seriam os locais mais suscetíveis a tal fenômeno. A taxa de fluxo gênico neste caso tende a ser extremamente variável e as suas conseqüências evolutivas dependem de sua magnitude. A conseqüência evolutiva mais clara do fluxo gênico é a sua tendência em homogeneizar a composição genética das populações. A taxa de fluxo gênico pode ser efetivamente zero entre plantas com incompatibilidade de cruzamento que estejam isoladas espacialmente ou que não apresentem sobreposição de suas épocas de florescimento. Porém, os autores chamam a atenção em particular para os agroecossistemas. Em tais casos, o plantio concentrado de uma espécie de interesse econômico pode permitir que outras espécies (ex: plantas daninhas) sofram hibridização e introgressão de genes vindos do campo de produção agrícola. Assim, o fluxo gênico entre as plantas domesticadas e seus parentes selvagens apresenta potencialmente duas conseqüências danosas: o aumento da capacidade de invasão de ambientes por algumas espécies e o aumento do risco de extinção destes parentes selvagens. De acordo com Wolfenbarger & Phifer (2000), modificações genéticas através do melhoramento genético, convencional ou através de engenharia genética, de uma espécie cultivada, ou não, podem produzir mudanças e promover a habilidade de um organismo se tornar invasor de diferentes ecossistemas. Deste modo, a transferência de pólen de plantas de milho-Bt para plantas selvagens aparentadas é uma preocupação decorrente da adoção desta tecnologia (Bergelson et al., 1998). No entanto, esta transferência é limitada a regiões do México e América Central onde ocorrem plantas do grupo dos teosíntos (Ellstrand et al., 1999). O impacto das plantas geneticamente modificadas sobre a entomofauna benéfica começou a receber grande atenção após a publicação de Losey et al. (1999) na revista Nature. Este estudo mostrou que o pólen do milho transgênico expressando toxinas de Bt causou mortalidade de cerca de 50% das lagartas da borboleta monarca (Dannaus plexippus) (Lepidoptera: Nymphalidae), quatro dias após a ingestão. Porém, este trabalho foi bastante criticado, principalmente, por não relatar precisamente a quantidade de toxina utilizada nos bioensaios. Outros estudos, como os realizados por Leong et al. (1992) e Hansen & Obrycki (1999) indicam que este inseto pode ser afetado pelo milho-Bt, porém os níveis de mortalidade são bastante inferiores aos verificados por Losey et al., (1999). Glare & O´Callagham (2000) ressaltam que o comportamento do inseto, migração a partir de áreas com esta toxina, poderia reduzir o efeito da toxina sobre esta espécie. 20 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 2. Taxa de adoção mundial das principais culturas GM em 2002 Deve-se ressaltar que o impacto das plantas geneticamente modificadas sobre os organismos não-alvos do controle pode ser avaliado através de estudos toxicológicos e/ou ecológicos (Obrycki et al., 2001). Nos estudos toxicológicos, o parâmetro avaliado é a mortalidade dos herbívoros e dos consumidores de pólen quando expostos às toxinas de Bt como realizado por Losey et al. (1999). Por sua vez, nos estudos ecológicos são observados os efeitos da utilização destas plantas sobre os demais níveis tróficos constituintes de uma cadeia alimentar (herbívoros predadores e parasitóides). Ainda existem questionamentos quanto ao impacto das toxinas presentes em plantas de milho-Bt sobre insetos polinizadores de outras plantas. Vandenberg (1990) detectou valores significativos de mortalidade de abelhas domesticadas quando expostas à solução de Bt tenebrionis, o qual é considerado específico para coleópteros. Ainda, segundo Obrycki et al. (2001), os efeitos das plantas de milho-Bt também deveriam ser avaliados sobre decompositores presentes no solo (ex: Collembola) e outros predadores vertebrados. Estes últimos estudos se justificam já que algumas espécies de pássaros e morcegos são predadoras de lepidópteros que freqüentemente ocorrem em campos de milho. Em relação ao efeito de plantas transgênicas sobre inimigos naturais, de acordo com Orr & Landis


(1997), o número de predadores e o parasitismo de massas de ovos de O. nubilalis não foram adversamente afetados por plantas de milho-Bt expressando Cry1A(b). Entre os predadores foram avaliados adultos e ninfas do percevejo predador Orius insidiosus, bem como adultos e larvas de coccinelídeos e crisopídeos. Pilcher et al. (1997) conduziram estudos em laboratório e campo para determinar os efeitos de milho-Bt expressando Cry1A(b) sobre insetos predadores. No laboratório, não foi verificado qualquer efeito detrimental agudo sobre o desenvolvimento pré-imaginal e sobrevivência de Coleomegilla maculata, O. insidiosus e Chrysoperla carnea. No campo, em estudo realizado por dois anos consecutivos, não foram observados efeitos adversos sobre a abundância de predadores de O. nubilalis (coccinelídeos, crisopídeos e antocorídeos) quando comparadas a áreas de milho não geneticamente modificado. Ainda, os números de predadores observados antes, durante e após a liberação dos grãos de pólen pelas plantas de milho-Bt sugerem que movimento dos inimigos naturais no campo não foi afetado por este tipo de pólen. Os efeitos de presas alimentadas com milho-Bt sobre a mortalidade e desenvolvimento de larvas do predador C. carnea foram estudados em condições de laboratório por Hilbeck et al. (1998a). O predador foi criado com lagartas de O. nubilalis, e Spodoptera litorallis alimentadas com milho contendo a toxina Cry1A(b). Foi observado prolongamento no período larval de crisopídeos criadas continuamente com presas que foram alimentadas com o milho geneticamente modificado foi significativamente maior comparada com a testemunha, baixo valor nutricional. Ainda, foi observado prolongamento no período larval de crisopídeos criados com lagartas de O. nubilalis alimentas com milho geneticamente modificado. Este efeito pode ser atribuído à exposição à toxina inseticida em conjunto com o uso de presas de baixo valor nutricional. O desenvolvimento e mortalidade de formas larvais do predador Orius majusculus criadas sobre tripes Anaphothrips obscurus, alimentados com milho geneticamente modificado expressando a d-endotoxina Cry1A(b), foi estudado por Zwahlen et al. (2000). A atividade inseticida das plantas de milho Bt foi comprovada através de bioensaios utilizando-se lagartas de O. nubilalis. Não houve diferença significativa na mortalidade e no desenvolvimento das formas imaturas do predador criadas em A. obscurus alimentados com milho transgênico expressando a toxina Cry1A(b), quando comparados à testemunha criada com tripes não expostos à proteína inseticida de B. thuringiensis. Os resultados obtidos não evidenciaram efeitos letais ou subletais nos indivíduos de O. majusculus no modelo de interação tritrófica (milho Bt – herbívoro – predador) elaborado pelos autores. Segundo os autores, a resposta de O. majusculus alimentados com tripes expostos à Cry1A(b) pode ser explicada pela insensibilidade deste percevejo à toxina ou pela baixa quantidade de proteína inseticida ingerida pelos tripes que se alimentaram do milho Bt. AlDeeb & Wilde (2003) não identificaram diferenças significativas entre parcelas com milho Bt Cry3Bb1 e o isogênico, com relação ao número de insetos não alvos de controle coletados em armadilhas do tipo alçapão. As inspeções visuais de adultos e formas imaturas de C. maculata , O. insidiosus e Hippodamia convergens também não mostraram diferenças significativas entre os materiais testados. Segundo Al-Deeb et al. (2001), não houve diferença significativa entre o número de adultos e ninfas de O. insidiosus em plantas milho Bt expressando a toxina Cry1A(b) e milho convencional em condições de campo, em duas localidades estudadas. Ainda os autores conduziram teste em laboratório para avaliar os efeitos de estilo-estigmas de milho- Bt na mortalidade de formas imaturas de O. insidiosus. Os resultados mostraram que quando criados continuamente sobre estilo-estigmas de milho convencional ou milho Bt as ninfas deste percevejo predador apresentaram 100% de mortalidade, sugerindo que estes insetos sofreram com insuficiência nutricional nesta dieta. Porém, não houve diferença significativa na mortalidade das ninfas do percevejo quando alimentadas com estilo-estigmas de milho-Bt ou convencional e ovos de O. nubilalis em dias alternados. Segundo Barton & Dracup et al. (2000), as práticas agrícolas têm causado impactos ambientais nos ecossistemas. Deste modo, os riscos e benefícios em potencial da adoção da tecnologia de plantas geneticamente modificadas devem ser ponderados tomando-se como referencial os impactos ambientais decorridos dos sistemas atuais de produção agrícola. Porém, os riscos ao ambiente das plantas geneticamente modificadas devem ser avaliados antes de sua liberação para o plantio comercial, e posteriormente as áreas ocupadas com estas culturas devem ser monitoradas. Portanto, conforme apontado por Fernandes & Martinelli (2000), os estudos com plantas transgênicas resistentes a insetos em áreas extensas com o objetivo de se determinar quais são as espécies indicadoras de impacto ambiental destas plantas em um determinado sistema devem ser priorizados. Ainda há a necessidade de se padronizar métodos de avaliação e interpretação de resultados, possibilitando a avaliação destas plantas por todo o Brasil. Deste modo, estes resultados poderiam ser levados a público promovendo uma ampla discussão sobre o tema. Não obstante, a evolução da resistência às toxinas presentes nas plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos é uma das principais preocupações para a liberação comercial destas plantas. De acordo com Heckel (1997) a partir do momento em que ocorrer a liberação para plantio em áreas extensas, as toxinas de Bt representarão um importante fator de mortalidade para as populações dos insetos-alvos. Esta alta pressão de seleção pode conduzir à evolução da resistência a estas Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 21


toxinas inseticidas nas populações dos insetos expostos. Existem várias conseqüências negativas no desenvolvimento de resistência às toxinas de Bt. Além da perda das plantas transgênicas que expressam tais toxinas como opção no controle de insetos, há o risco de que o uso de formulações comerciais de inseticidas à base de Bt não seja mais viável para a aplicação em lavouras de milho ou em outras culturas. Os produtores orgânicos perderiam uma importante opção para o manejo de pragas, o qual é certificado para o seu sistema de produção. Além disso, as possibilidades de substituição destes produtos de origem biológica por outros são mínimas. O aumento da utilização de inseticidas sintéticos também é outra conseqüência em potencial do desenvolvimento da resistência às toxinas de Bt (EPA, 1998). 3. Evolução da Resistência a Produtos à Base de Bt e Plantas Geneticamente Modificadas A resistência é um fenômeno pré-adaptativo que se desenvolve por seleção de indivíduos raros que podem sobreviver à aplicação de um inseticida a uma determinada dose. Um grande número de fatores genéticos, bio-ecológicos e operacionais influenciam a taxa de evolução da resistência. Os fatores genéticos incluem a variabilidade natural nas populações, número de genes envolvidos na manifestação da resistência e sua freqüência inicial na população (Georghiou & Taylor, 1977), a herança da característica (ex: grau de dominância) e custo adaptativo associado à resistência (Van Rie & Ferré, 2000). O potencial das populações de insetos em desenvolver resistência aos produtos formulados com Bt utilizados no controle de pragas é uma das principais ameaças ao emprego desta estratégia de controle de pragas agrícolas. A evolução da resistência dos insetos para inseticidas químicos é bastante comum, com mais de 500 espécies sendo resistentes a um ou vários inseticidas Já para os bioinseticidas é comparati- vamente mais rara, principalmente devido ao fato de que estes são pouco utilizados, se compararmos com a área tratada com inseticidas químicos em todo mundo. Há dois modos de estudar a influência da variabilidade em populações naturais sobre a resistência a Bt. A primeira envolve os estudo das diferenças na suscetibilidade entre e dentro de populações. Trabalhos neste sentido foram desenvolvidos por van Frankenhuyzen et al. (1995) e Huang et al. (1997) para Choristoneura fumiferana e O. nubilalis, respectivamente. Outra estimativa da variabilidade para genes de resistência em populações naturais é medir a herdabilidade (h 2 ) em experimentos laboratoriais a partir de uma amostra da população. Este índice representa a proporção da variação fenotípica de um determinado caráter responsável pela variação genética. Tabashnik (1994a) estimou o h 2 para 8 espécies de insetos, com valor relativamente alto para Plodia interpunctella, mostrando abaixa variação fenotípica e alta variação genética aditiva deste inseto. A estimativa indireta da freqüência dos alelos de resistência é fornecida por experimentos laboratoriais que obtiveram êxito em selecionar populações resistentes a Bt (Van Rie & Ferré, 2000). Nestes casos, pelo menos uma cópia do alelo de resistência deve estar presente para o início da seleção. Em experimentos com lepidópteros (Gould et al., 1992; 1995), a freqüência de alelos de resistência nas populações testadas foi relativamente alta (de 1 a 5 x 10 -3 ). Quanto à herança da resistência, McGaughey (1985, 1988) mostraram que para P. interpunctella a herança é autossômica de parcialmente a completamente recessiva. O mesmo foi verificado para Plutella xylostella por Tabashnik et al. (1992) e Tang et al. (1997). Em outro trabalho com este mesmo inseto, (Ferré et al., 1991) verificaram que a suscetibilidade da progênie F1 depende do sexo do inseto no cruzamento parental, ainda que a ligação com o sexo tenha sido eliminada com base na razão sexual 1:1 dos sobreviventes da F1 a várias doses da Cry1Ab. 22 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Já para H. virescens os trabalhos demostraram que os resultados dependem da linhagem do inseto estudada. Por exemplo: para a linhagem SEL a herança mostrou-se autossômica, incompletamente dominante, e controlado por vários fatores genéticos (Sims et al., 1991). Em relação ao número de genes envolvidos na resistência, para P. xylostella há trabalhos que indicam a ocorrência de mais de um gene envolvido (Tang et al., 1997). Porém, segundo Glare & O´Callagham (2000), a resistência deste inseto para Cry1Ab mostra-se recessiva controlada principalmente por um único alelo autossômico e recessivo, embora isto não seja sempre atribuído ao mesmo “loci”. Tabashnik et al. (1997) relatou que populações do Hawai e Pensilvânia dividem um “locus” em que uma mutação recessiva associada com a reduzida ligação ao receptor confere resistência extremamente alta a 4 toxinas de Bt. Entretanto, outra população, das Filipinas, mostrou um controle “multilocus”, de espectro mais reduzido, e para algumas toxinas de Bt, a herança genética não é recessiva e não está associada com a redução da ligação ao receptor. Já para Heliothis virescens é provável que um gene principal parcialmente recessivo confere resistência a várias toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry1Fa, causando modificações no receptor (Gould et al., 1995; Lee et al., 1995). Embora a resistência em laboratório seja obtida em poucas gerações em alguns insetos, ela é na maioria dos casos instável, reduzindo logo após a diminuição da pressão de seleção, como foi observado por Tabashnik et al. (1994) e Tang et al. (1997) para P. xylostella. O custo adaptativo associado à evolução da resistência é a causa mais provável da instabilidade da resistência em P. xyllostella. Groeters et al. (1994) mostraram tal redução no custo adaptativo, sendo que após 5 gerações, a eclosão das lagartas e fecundidade foram reduzidos em 10% na linhagem resistente em comparação com a suscetível. A compreensão desta instabilidade pode indicar porque a


Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 23 e d e s a b à s o t u d o r p a a i c n ê t s i s e r e d o t n e m i v l o v n e s e d e d s o t a l e R - 1 a l e b a T s i s n e i g n i r u h t s u l l i c a B u o . ) 3 0 0 2 , . l a t e k i n h s a b a T e 0 0 0 2 , m a h g a l l a C ´ O & e r a l G e d o d a c i f i d o m ( o i r ó t a r o b a l m e s a n i x o t o t e s n I e i c é p s e b u S e d l e v í N a i c n ê t s i s e r ) s ( a n i x o T a i c n ê t s i s e R a d a z u r c a r u e n o t s i r o h C a n a r e f i m u f o t t o s x 8 , 3 - - a t p i r c s a l e m o s y r C - x 0 0 0 . 5 a m i c a a A 3 y r C a B 1 y r C s i n o i r b e n e t x 9 5 3 y r C - a l l e t u a c a i t s e h p E i k a t s r u k x 7 - - a m o s o e o e m o H m u l l e t c e l e i k a t s r u k x 7 , 1 - a r e g i m r a s i h t o i l e H c A 1 y r C x 7 5 - 3 1 - s n e c s e r i v . H i k a t s r u k 1 - D H x 4 2 e d s i a m 1 y r C - i k a t s r u k 1 - D H x 9 6 - 2 1 b A 1 y r C - - x 3 5 - 0 5 c A 1 y r C A 2 y r C , b A 1 y r C - x 0 0 0 . 0 1 c A 1 y r C , b A 1 y r C , a A 1 y r C C 1 y r C , B 1 y r C , F 1 y r C A 2 y r C e a s r a t o n i t p e L a t a e n i l m e c e d A 3 y r C x 0 0 4 e 0 0 1 a m i c a s i l a l i b u n a i n i r t s O - l e v í n o x i a b b A 1 y r C i k a t s r u k x 3 7 a m i c a - - a r o h p o n i t c e P a l l e i p y s s o g - 0 0 1 . 3 c A 1 y r C - a l l e t c n u p r e t n i a i d o l P i k a t s r u k x 0 5 2 e d a m i c a - - i k a t s r u k ) l e p i D ( x 0 5 2 a m i c a - , s i s n e i g n i r u h t i k a t s r u k s o n e m ( e ) 1 - D H e a i r e l l a g i k a t s r u k ) l e p i D ( x 5 2 e d a m i c a - - i k a t s r u k ) l e p i D ( x 6 0 1 a m i c a b A 1 y r C - x 5 7 8 e d a c r e c b A 1 y r C - i k a t s r u k x 0 4 1 - - i a w a z i a x 1 6 - 8 2 - - s u d i c o m o t n e x 1 2 - - a l l e t s o l y x a l l e t u l P i k a t s r u k x 6 6 - 5 1 - - - x 2 6 - 2 2 , a A 1 y r C , C 1 y r C , c A 1 y r C , b A 1 y r C 2 y r C e F 1 y r C J 1 y r C , F 1 y r C C 1 y r C 0 0 4 . 2 1 - c A 1 y r C 0 0 8 . 6 e d a m i c a - 0 0 3 x - a u g i x e a r e t p o d o p S i k a t s r u k x 2 - 1 - - x 0 5 8 C 1 y r C , C 1 y r C , b A 1 y r C H 1 y r C , C 1 y r C / E 1 y r C A 2 y r C e a d r e p i g u r f . S i k a t s r u k x 9 , 4 - - s i l a r o t t i l . S i a w a z i a x 0 0 5 e d s i a m C 1 y r C e E 1 y r C , D 1 y r C b A 1 y r C i n a i s u l p o h c i r T x 1 3 b A 1 y r C c A 1 y r C u o a A 1 y r C i a w a z i a + i k a t s r u k x 5 1 - - i k a t s r u k 1 - D H x 7 0 3 - - i a w a z i a e 2 1 1 - D H 3 3 1 - D H x 7 9 e 8 2 e 3 3 1 , 8 9 1 , 1 - D H 8 9 1 e 2 1 1 , 1 - D H - s u d i c o m o t n e - D H 8 9 1 x 2 3 3 3 1 e 2 1 1 , 1 - D H - i a w a z i a + i k a t s r u k x 0 0 1 - 2 6 e 4 6 1 s u d i c o m o t n e -


Tabela 2 - Relatos de possível desenvolvimento de resist ência de insetos para B acil l us thuring iensis em campo ( Glare & O´ Callagham, 2000) . Inseto Subespécie N ível de resistên cia Toxina( s) Helico verp a armiger a kurst aki - Heliot his vires cens MVP II Tolera nte Cry1 Ac Plod ia interp unctell a kurst aki Baixo Plutel la xylo stell a kurst aki 25 - 426 x Cry1 Ab aizawa i 3 - 20 x Cry1 Ac Spod opt era frugip erda kurst aki 1, 48 x evolução da resistência ao Bt é tão rara e pode auxiliar na elaboração de estratégias para incrementar a utilização deste bioinseticida (Tabashnik et al., 1994). A alteração da atividade proteolítica (ativação da toxina) foi verificada em P. interpunctella para Bt entomocidus e Bt kurstaki (Johnson et al., 1990; Oppert et al., 1997). Em trabalho semelhante realizado por Van Rie et al. (1990), foi observada a redução de 50 vezes na afinidade da toxina pelo receptor. Porém, os autores não verificaram alteração no número de receptores presentes para Cry1Ab na linhagem resistente. Estes dados indicam que a resistência, neste caso, é devida a alterações no receptor de Cry1Ab, pois o mesmo decréscimo de afinidade não foi observado para Cry1Ca, que possui 3 vezes mais receptores que a outra toxina. Este elevado número de receptores pode explicar a alta suscetibilidade da linhagem selecionada para Cry1Ca. Para H. virescens foi verificado por Lee et al. (1995) que a ligação da toxina Cry1Aa ao receptor foi drasticamente reduzida, mas o mesmo não foi verificado para Cry1Ab e Cry1Ac. Porém, as toxinas do grupo Cry1A dividem os mesmos receptores nesta espécie de inseto, portanto Cry1Ac e Cry1Ab também se ligam ao receptor de Cry1Aa. Consequentemente foi considerada a hipótese que o receptor alterado para Cry1Aa causa resistência ao 3 subclasses de Cry1A (Van Rie & Ferré, 2000). Exemplos de Resistência de Insetos a produtos à base de Bacillus thuringiensis: 1) Em laboratório Existem vários relatos de evolução da resistência a Bt em laboratório (Tabela 1). Para a maioria das espécies testadas a resistência evolui rapidamente para Bt kurstaki, Bt entomocidus e Bt tenebrionis ou Bt aizawai. Quando a diferença entre as populações suscetíveis e resistentes é menor que 10, não fica claro se a população desenvolveu resistência, propriamente dita, ou se existe tolerância entre subgrupos ou genótipos da espécie em questão (Glare & O´Callagham, 2000). O primeiro exemplo de resistência em laboratório ocorreu com Musca domestica ao Bt thuringiensis, provavelmente envolvendo b-exotoxina. De modo semelhante, trabalhos mostraram uma evolução de resistência de 10 da mesma toxina para Drosophila melanogaster em 30 gerações (Harvey & Howell, 1964; Wilson & Burns, 1968; Carlberg & Lindstrom, 1987). A partir do primeiro relato de resistência de Plodia interpunctella a d-endotoxina (McGaughey & Beeman, 1988), vários relatos de desenvolvimento de resistência em laboratório foram feitos. Em alguns casos os estudos envolvem a suspensão esporo + cristal enquanto que em outros casos apenas toxina(s). Em alguns casos níveis elevados de resistência foram obtidos em apenas algumas gerações usando-se alta pressão de seleção, como por exemplo: P. interpunctella para Bt kurstaki e P. xylostella para Bt aizawai Cry1C, de 3 e 6 gerações respectivamente (Glare & O´Callagham, 2000). 2) Em campo Embora alguns trabalhos realizados em laboratório com alta pressão de seleção de Bt sobre P. xylostella (traça-das-crucíferas) [sic] não tenha sido verificado alteração significativa na suscetibilidade 24 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 (Devriendt & Martouret, 1976), este inseto foi o primeiro a mostrar evolução de resistência para Bt em campo (Tabashnik et al., 1997), sendo, até o momento, o único exemplo em que foi verificada a evolução da resistência em campo de um inseto para Bt, embora para outras espécies de lepidópteros (Tabela 1) tenha sido sugerido esta possibilidade, porém pouca diferença na suscetibilidade foi verificada entre as populações de campo (resistente) e a de referência em laboratório (suscetível). Segundo Glare & O´Callagham (2000), outros relatos de resistência deste inseto a produtos à base de Bt foram feitos em vários países como Tailândia, Havaí, Japão, Coréia, China, EUA e América Central. A espécie influencia a probabilidade de evolução da resistência devido à variabilidade genética na população e à possibilidade de encontrar o inóculo. Por exemplo, o hábito migratório e polífago de Helicoverpa punctigera leva à diluição de qualquer população resistente devido ao cruzamento de indivíduos resistentes com suscetíveis, entretanto, P. xylostella é um inseto com mobilidade limitada, não ocorrendo à diluição da resistência, pelo cruzamento com insetos suscetíveis vindos de outras áreas (Glare & O´Callagham, 2000). A incidência de resistência cruzada é geralmente baixa, mas foi verificada para várias toxinas (Tabela 1). Esta parece estar ligada a composição da toxina do isolado utilizado. McGaughey & Johnson (1994) realizam um estudo detalhado abordando a resistência para as toxinas individualmente após a seleção para resistência aos isolados Bt kurstaki (HD-1), Bt aizawai (HD- 112 e 133) e Bt entomocidus (HD- 198). Para P. interpunctella, HD-1 resultou em resistência para Cry1Ab e Cry1Ac, mas não para Cry1Aa, Cry1B, Cry1C e Cry2A. Resistência para HD-133 e HD-198 resultou em resistência a uma maior gama de toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B, Cry1C e Cry2A. Os autores sugeriram que o espectro relativamente limitado de resistência às


diferentes toxinas em Bt kurstaki indicou que a resistência cruzada a outras subespécies era menos provável de ocorrer, portanto produtos baseados em Bt kurstaki deveriam ser utilizados primeiro. A resistência de Heliothis virescens é normalmente relatada à toxina Cry1Ac, porém existem relatos de resistência para outras toxinas como: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1F e Cry2A (Gould et al., 1992). 4. Manejo da Resistência Os programas de manejo da resistência apresentam 3 objetivos principais: evitar, retardar e reverter a evolução da resistência (Croft, 1990). Estes objetivos são os mesmos para o manejo da resistência a produtos à base de Bt sendo muitas táticas baseadas nos princípios mostrados para plantas geneticamente modificadas. No caso das plantas Bt são preconizadas várias estratégias, tais como plantas com altas doses das toxinas associadas a áreas de refúgio, misturas de plantas com diferentes toxinas, mosaicos de plantas geneticamente modificadas, combinações de toxinas com diferentes modos de ação, ou a combinação de plantas expressando baixas doses das toxinas e controle complementar das pragas pelos inimigos naturais e a expressão das toxinas em determinados tecidos ou em um período de ataque mais intenso da praga (Neppl, 2000). A estratégia empregada nos países com plantio de milho Bt onde as pragas apresentam hábito migratório dos adultos e alta mobilidade nas formas larvais tem sido a utilização de plantas expressando altas doses das toxinas associadas às áreas de refúgio. Esta tática começou a ser adotada baseandose no princípio de que os insetos suscetíveis poderiam imigrar para uma área com predominância de insetos resistentes e, por cruzamento, diluir os alelos de resistência na população da praga. Este princípio apenas é valido com a expressão das toxinas de Bt em altas doses de modo que a resis- tência seja funcionalmente recessiva. Deste modo, apenas restariam na área com plantas geneticamente modificadas os indivíduos resistentes. O refúgio pode variar em tamanho e disposição e servir como reservatório de insetos suscetíveis. O sucesso desta estratégia depende das seguintes condições: que o acasalamento seja aleatório entre os indivíduos resistentes e suscetíveis, que os insetos suscetíveis migrem da área de refúgio para a área com as plantas geneticamente modificadas e exista sincronia na emergência de insetos entre as duas áreas. Outra estratégia possível para a liberação de plantas geneticamente modificadas é a mistura de sementes transgênicas e convencionais na forma de linhas da cultura ou faixas de plantio. Uma área que utilize esta estratégia resulta numa mistura de plantas-Bt e convencionais. Deste modo, o refúgio de plantas convencionais seria disposto internamente na área com as plantas transgênicas. Este refúgio interno consistiria no reservatório de suscetibilidade para o fornecimento de indivíduos suscetíceis para acasalamento aleatório com os resistentes que restariam nas plantas geneticamente modificadas. A principal limitação deste método é a taxa de movimento entre plantas nas formas larvais da praga-alvo de controle. Esta tática é indicada para casos específicos nos quais a forma larval da praga que se encontra nas plantas convencionais não se disperse para plantas geneticamente modificadas resistentes causando a morte dos indivíduos suscetíveis. A mistura de sementes na forma de linhas de plantio com sementes convencionais internamente à área de algodão Bt têm sido utilizada com sucesso no Arizona, EUA, para o manejo de lagarta rosada Pectinophora gossypiella. Neste caso, a lagarta rosada permanece dentro das maçãs atacadas o que limita o movimento das formas larvais desta espécie entre as plantas garantindo a sobrevivência dos indivíduos suscetíveis. Esta estraté- gia não seria adequada para o manejo de S. frugiperda já que está espécie apresenta alta mobilidade na sua larval. A técnica do plantio em forma de mosaico envolve áreas com plantas Bt expressando diferentes toxinas inseticidas. Deste modo, os insetos estariam sofrendo diferentes pressões de seleção ao longo da faixa de plantio de áreas geneticamente modificadas. No entanto, para que esta estratégia funcione é importante que não ocorra resistência cruzada entre as toxinas empregadas. Além disso, existem críticas quanto à possível eficiência das diferentes áreas Bt em atuarem como reservatórios de suscetibilidade recíprocos, o que possibilitaria a imigração de indivíduos suscetíveis entre as diferentes áreas para a diluição dos alelos de resistência. Outra alternativa viável é a rotação de plantas dispondo deferentes toxinas inseticidas. Assim como no caso do mosaico, a resistência cruzada entre as toxinas pode comprometer a eficácia deste método. As bases teóricas na estratégia da rotação são que o custo adaptativo associado à resistência leva a redução da freqüência dos indivíduos suscetíveis e a imigração de indivíduos suscetíveis. (Hoy, 1988). A expressão da toxina de Bt em tecidos e estádio fenológicos adequados específicos é uma estratégia que visa diminuir a pressão de seleção das plantas-Bt sobre a população de insetos (Frutos et al., 1999). Esta estratégia é similar ao uso de áreas refúgio e mistura de sementes no sentido que a própria planta pode atuar como refúgio (Mallet & Porter, 1992). As plantas poderiam produzir as toxinas somente quando o nível de dano fosse alcançado ou em determinados tecidos mais propensos ao ataque. No entanto, esta estratégia não funcionaria para pragas que atacam todas as partes da planta. Além disso, esta tática é dependente de estudos avançados em biologia molecular a fim de se encontrar os promotores específicos que seriam responsáveis pelo direcionamento da expressão das toxinas inseticidas. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 25


Embora estudos conduzidos em laboratório relatem a casos de resistência as toxinas de Bt e freqüência inicial elevada de resistência, nos países que adotam a tecnologia de plantas Bt no manejo das pragas os programas de monitoramento não detectaram ainda aumento na frequência de resistência (Tabashnik et. al.,2003). Exemplos de programas de monitoramento estabelecidos e bem sucedidos incluem O. nubilalis (Estados Unidos – 6 anos), P. gossypiella (Arizona-5 anos), Helicoverpa armigera (Nordeste da China-3 anos) e Helicoverpa zea (Carolina do Norte-2 anos). Assim, torna-se fundamental o desenvolvimento de programas de monitoramento como parte dos programas que visem manejar a evolução da resistência. Entretanto, as estratégias para o manejo da resistência somente obtêm o êxito esperado se forem adequadamente implementadas. É importante que o agricultor compreenda estas estratégias, além do monitoramento e assistência técnica para o sucesso destes programas (Neppl, 2000). Ainda são necessários estudos para otimizar os resultados obtidos com as estratégias de manejo da resistência, entre estes, destacam-se as pesquisas voltadas para os hábitos dos insetos (migração e acasalamento) que podem influenciar decisivamente na viabilidade das táticas empregadas. Dificilmente pode-se assegurar o êxito destes programas, pois em campo muitas variáveis são somadas aos modelos propostos e, atualmente, nenhuma das táticas acima descritas são completamente aceitáveis em termos de eficácia. 5. Considerações Finais O uso das estratégias de manejo implica significativa demanda de mão-de-obra especializada, principalmente no sentido de monitorar a evolução da resistência em áreas cultivadas com plantas geneticamente modificadas expressando toxinas de Bt. Geralmente, a assistência técnica disponível aos agricultores limita-se a recomendação de insumos para viabilizar sua ativi- dade agrícola, de maneira que os extensionistas dificilmente atuam como agentes introdutórios de novas tecnologias e conhecedores do seu impacto sobre o meio onde atuam. Além de determinar o impacto das plantas transgênicas sobre o meio ambiente, é necessário também instruir e qualificar tanto o agricultor como o extensionista sobre o potencial desta moderna tática de controle de pragas. A implementação de estratégias de manejo de resistência e programas de monitoramento são fundamentais para a exploração sustentável da tecnologia das plantas Bt. Estas atividades são exigentes em mão-de-obra treinada e apoio logístico pelos produtores rurais, órgãos de assistência técnica, grupos de consultores envolvidos com a cultura e das empresas produtoras de sementes geneticamente modificadas. Por fim, não é correto se pensar que as plantas geneticamente modificadas serão a alternativa definitiva para o controle de pragas. O sistema planta-inseto deve ser estudado e avaliada a relação custo x benefício da adoção destas plantas geneticamente modificadas resistentes a insetos. Deve-se conhecer toda a gama de alternativas existentes e escolher aquela que melhor viabiliza a atividade agrícola, porém levando-se em conta o seu impacto sobre o meio ambiente em comparação às demais alternativas disponíveis para o controle de pragas. 6. Referências Carlberg, G.; Lindstrom, R. Testing fly resistance to Thuringiensin produced by Bacillus thuringiensis, serotype H-1. Journal of Invertebrate Pathology, v.49, p.194-197, 1997. Croft, Developing a philosophy and program of pesticide resistance management. In: Pesticide Resistance in Arthropods. Roush, R. T.; Tabashnik, E. B. (Eds). New York: Chapman & Hall, 1990. p. 277-296. Devriendt, M.; Martouret, D. 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Pesquisa Luiz Pereira Ramos, Ph.D. Professor Adjunto IV, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná lramos@quimica.ufpr.br Karla Thomas Kucek, B.Sc. Mestranda em Química Orgânica, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná k.kucek@hotmail.com Anderson Kurunczi Domingos, B.Sc. Mestrando em Química Orgânica, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná anderson@quimica.ufpr.br Helena Maria Wilhelm, Ph.D. Pesquisadora, Unidade Tecnológica de Química Aplicada, Depto. de Química Aplicada, Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento, LACTEC helenaw@lactec.org.br Ilustrações cedidas pelos autores Biodiesel 28 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Um projeto de sustentabilidade econômica e sócio-ambiental para o Brasil 1 - Introdução Desde o século passado, os combustíveis derivados do petróleo têm sido a principal fonte de energia mundial. No entanto, previsões de que esse recurso deva chegar ao fim, somadas às crescentes preocupações com o ambiente, têm instigado a busca de fontes de energia renovável (Ghassan et al., 2003). O Protocolo de Quioto, concebido durante o fórum ambiental Rio-92 e ratificado, desde então, por mais de 93 países, vem tentando mobilizar a comunidade internacional para que promova uma ação conjunta com o objetivo de estabilizar na atmosfera a concentração dos gases causadores do efeito estufa e, assim, limitar a interferência antropogênica sobre o sistema climático global (Greenpeace International, 2003). Infelizmente, os termos do referido acordo somente entrarão rigorosamente em vigor quando o conjunto de seus signatários somar, no mínimo, 55% do total de países emissores do globo, algo que somente será possível com a ratificação de, pelo menos, uma das grandes potências mundiais, a Rússia ou os Estados Unidos. Em pronunciamentos recentes, o Presidente da Rússia, Vladimir Putin, declarou estar ainda avaliando as condições que levarão o seu país a tomar tal decisão, demonstrando que, apesar da evidência de que o acúmulo desses gases na atmosfera comprometa fortemente o equilíbrio dos diferentes ecossistemas terrestres, interesses geopolíticos e/ou comerciais têm prevalecido so- bre os mais eloqüentes interesses da humanidade. O Brasil, apesar de não ser um grande emissor de gases poluentes, vem promovendo medidas condizentes com essa nova conjuntura, através do desenvolvimento e da atualização periódica de inventários nacionais sobre o tema (Ministério da Ciência e Tecnologia, 2002). No momento em que o mercado de carbono estiver regulamentado, esses inventários terão uma importância vital para que o país possa conquistar espaço e usufruir dessa nova estratégia de redistribuição de riquezas e de inclusão social. Sabe-se que as metas estabelecidas pelo Protocolo de Quioto somente poderão ser alcançadas pelo uso sustentado da biomassa para fins energéticos. No entanto, recentes levantamentos demonstram que apenas 2,2% da energia consumida no mundo é proveniente de fontes renováveis (Pessuti, 2003), o que evidencia um extraordinário potencial para a exploração de outras fontes. Considerando-se apenas a biomassa proveniente de atividades agroindustriais, ou seja, resíduos agrícolas, florestais e agropecuários, calcula-se que o potencial combustível desse material seja equivalente a, aproximadamente, 6.587 milhões de litros de petróleo ao ano (Staiss e Pereira, 2001). Diante de todo esse potencial, tem havido uma crescente disseminação de projetos e de ações voltados para o uso de óleos vegetais e de resíduos urbanos e agroindustriais


para a geração de energia, particularmente por meio de projetos de co-geração (Cenbio, 2003). 2 - Óleos vegetais como fonte de energia renovável Por se tratar de uma fonte de energia renovável e por seu uso sustentado não provocar danos ao meio ambiente, a biomassa tem atraído muita atenção nos últimos tempos (Ministério da Indústria e do Comércio, 1985; Ministério da Ciência e Tecnologia, 2002; U.S. Department of Energy, 1998). Dentre as fontes de biomassa prontamente disponíveis, os óleos vegetais têm sido largamente investigados como candidatos a programas de energia renovável, pois proporcionam uma geração descentralizada de energia e um apoio à agricultura familiar, criando melhores condições de vida (infra-estrutura) em regiões carentes, valorizando potencialidades regionais e oferecendo alternativas a problemas econômicos e sócio-ambientais de difícil solução. A utilização de óleos vegetais in natura como combustível alternativo tem sido alvo de diversos estudos nas últimas décadas (Nag et al., 1995; Piyaporn et al., 1996). No Brasil, já foram realizadas pesquisas com os óleos virgens de macaúba, pinhãomanso, dendê, indaiá, buriti, pequi, mamona, babaçu, cotieira, tingui e pupunha (Barreto, 1982; Ministério da Indústria e do Comércio, 1985; Serruya, 1991) e nos testes realizados com esses óleos em caminhões e máquinas agrícolas, foi ultrapassada a meta de um milhão de quilômetros rodados (Ministério da Indústria e do Comércio, 1985). No entanto, esses estudos demonstraram a existência de algumas desvantagens no uso direto de óleos virgens: (a) a ocorrência de excessivos depósitos de carbono no motor; (b) a obstrução nos filtros de óleo e bicos injetores; (c) a diluição parcial do combustível no lubrificante; (d) o comprometimento da durabilidade do motor; e (e) um aumento considerável em seus custos de manutenção. Outros autores (Goering e Fry, 1984; Kobmehl e Heinrich, 1998; Ghassan et al., 2003) demonstraram que a alta viscosidade e a baixa volatilidade dos óleos vegetais in natura podem provocar sérios problemas ao bom funcionamento do motor. Dentre os problemas que geralmente aparecem após longos períodos de utilização, destacam-se a formação de depósitos de carbono por combustão incompleta, a diminuição da eficiência de lubrificação do óleo pela ocorrência de polimerização (no caso de óleos poli-insaturados) e a atomização ineficiente e/ou entupimento dos sistemas de injeção (Peterson et al., 1983; Pryde, 1983; Ma e Hanna, 1999). Para resolver as desconformidades descritas acima, houve um considerável investimento na adaptação dos motores para que o uso de óleos vegetais in natura pudesse ser viabilizado, particularmente na produção de energia elétrica em geradores movidos por motores estacionários de grande porte. Nesses casos, o regime de operação do motor é constante e isso facilita o ajuste dos parâmetros para garantir uma combustão eficiente do óleo vegetal, podendo ser utilizada, inclusive, uma etapa de pré-aquecimento (pré-câmaras) para diminuir a sua viscosidade e facilitar a injeção na câmara de combustão. No entanto, para motores em que o regime de funcionamento é variável (e.g., no setor de transportes), foi necessário desenvolver uma metodologia de transformação química do óleo para que suas propriedades se tornassem mais adequadas ao seu uso como combustível. Assim, em meados da década de 70, surgiram as primeiras propostas de modificação de óleos vegetais através da reação de transesterificação (Figura 1), cujos objetivos eram os de melhorar a sua qualidade de ignição, reduzir o seu ponto de fluidez, e ajustar os seus índices de viscosidade e densidade específica (Shay, 1993, Stournas et al., 1995; Ma e Hanna, 1999). 3 - O biodiesel como alternativa para a matriz energética nacional Por definição, biodiesel é um substituto natural do diesel de petróleo, que pode ser produzido a partir de fontes renováveis como óleos vegetais, gorduras animais e óleos utilizados para cocção de alimentos (fritura). Quimicamente, é definido como éster monoalquílico de ácidos graxos derivados de lipídeos de ocorrência natural e pode ser produzido, juntamente com a glicerina, através da reação de triacilgliceróis (ou triglicerídeos) com etanol ou metanol, na presença de um catalisador ácido ou básico (Schuchardt et al., 1998; Zagonel e Ramos, 2001; Ramos, 1999, 2003). Embora essa tenha sido a definição mais amplamente aceita desde os primeiros trabalhos relacionados com o tema, alguns autores preferem generalizar o termo e associálo a qualquer tipo de ação que promova a substituição do diesel na matriz energética mundial, como nos casos do uso de: (a) óleos vegetais in natura, quer puros ou em mistura; (b) bioóleos, produzidos pela conversão catalítica de óleos vegetais (pirólise); e (c) microemulsões, que envolvem a injeção simultânea de dois ou mais combustíveis, geralmente imiscíveis, na câmara de combustão de motores do ciclo diesel (Ma e Hanna, 1999). Portanto, é importante frisar que, para os objetivos deste artigo, biodiesel é tão-somente definido como o produto da transesterificação de óleos vegetais que atende aos parâmetros fixados pelas normas ASTM D6751 (American Standard Testing Methods, 2003) e Figura 1. Reação de transesterificação de óleos vegetais e/ou gorduras animais. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 29


DIN 14214 (Deutsches Institut für Normung, 2003), ou pela Portaria n o 255 da ANP (Agência Nacional do Petróleo, 2003) que, apesar de provisória, já estabelece as especificações que serão exigidas para que esse produto seja aceito no mercado brasileiro. A grande compatibilidade do biodiesel com o diesel convencional o caracteriza como uma alternativa capaz de atender à maior parte da frota de veículos a diesel já existente no mercado, sem qualquer necessidade de investimentos tecnológicos no desenvolvimento dos motores. Por outro lado, o uso de outros combustíveis limpos, como o óleo in natura, as microemulsões, o gás natural ou o biogás requerem uma adaptação considerável para que o desempenho exigido pelos motores seja mantido (Laurindo, 2003). Do ponto de vista econômico, a viabilidade do biodiesel está relacionada com o estabelecimento de um equilíbrio favorável na balança comercial brasileira, visto que o diesel é o derivado de petróleo mais consumido no Brasil, e que uma fração crescente desse produto vem sendo importada anualmente (Nogueira e Pikman, 2002). Em termos ambientais, a adoção do biodiesel, mesmo que de forma progressiva, ou seja, em adições de 2% a 5% no diesel de petróleo (Ministério da Ciência e Tecnologia, 2002), resultará em uma redução significativa no padrão de emissões de materiais particulados, óxidos de enxofre e gases que contribuem para o efeito estufa (Mittelbach et al., 1985). Sendo assim, sua difusão, em longo prazo, proporcionará maiores expectativas de vida à população e, como conseqüência, um declínio nos gastos com saúde pública, possibilitando o redirecionamento de verbas para outros setores, como educação e previdência. Cabe aqui ainda ressaltar que a adição de biodiesel ao petrodiesel, em termos gerais, melhora as características do combustível fóssil, pois possibilita a redução dos níveis de ruído e melhora a eficiência da combustão pelo aumento do número de cetano (Gallo, 2003). Em diversos países, o biodiesel já é uma realidade. Na Alemanha, por exemplo, existe uma frota significativa de veículos leves, coletivos e de carga, que utilizam biodiesel derivado de plantações específicas para fins energéticos e distribuído por mais de 1.000 postos de abastecimento. Outros países também têm desenvolvido os seus programas nacionais de biodiesel e, como conseqüência, o consumo europeu de biodiesel aumentou em 200.000 ton. entre os anos de 1998 e 2000. Já nos Estados Unidos, leis aprovadas nos estados de Minnesotta e na Carolina do Norte determinaram que, a partir de 1º/1/2002, todo o diesel consumido deveria ter a incorporação de, pelo menos, 2% de biodiesel em base volumétrica. No Brasil, desde as iniciativas realizadas na década de 80, pouco se investiu nesse importante setor da economia, mas a reincidência de turbulências no mercado internacional do petróleo, aliada às pressões que o setor automotivo vem sofrendo dos órgãos ambientais, fez com que o Governo atual iniciasse um novo tra- 30 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 balho com vistas à utilizar óleos vegetais transesterificados na matriz energética nacional. Esse trabalho foi recentemente materializado na forma de um programa nacional, intitulado PROBIODIESEL (Portaria n o . 702 do MCT, de 30 de outubro de 2002), cujo lançamento solene foi realizado em Curitiba durante a cerimônia de abertura do Seminário Internacional de Biodiesel (24 a 26 de outubro, Blue Tree Towers Hotel). Naquela mesma ocasião, foi também divulgada a criação do CERBIO, Centro Nacional de Referência em Biocombustíveis, nas dependências do Tecpar, em Curitiba. A missão do CERBIO será a de desenvolver o conceito de biocombustíveis em sua plenitude, desde a certificação de produtos até o desenvolvimento tecnológico de novas rotas que contribuam para o aumento da viabilidade e competitividade técnica do biodiesel nacional. Ao longo dos últimos anos, o PROBIODIESEL vem se desenvolvendo por meio de ações integradas entre instituições de tecnologia, ensino e pesquisa, e empresas e associações direta ou indiretamente ligadas ao tema, sob a forma de grupos de trabalho que integram a chamada Rede Brasileira de Biodiesel. Esse programa tem como principal objetivo promover o desenvolvimento das tecnologias de produção e avaliar a viabilidade e a competitividade técnica, sócio-ambiental e econômica do biodiesel para os mercados interno e externo, bem como de sua produção e distribuição espacial nas diferentes regiões do país (Andrade, 2003; Ministério da Ciência e Tecnologia, 2002). Tabela 1. Número de iodo e composição química em ácidos graxos de alguns dos principais óleos vegetais e gorduras animais disponíveis para a produção de biodiesel ( adaptad o de Alsberg e Taylor, 1928) . Fonte Número de Iodo Láurico Mirístico Principais Ácidos Graxos Palmítico Esteárico Oléico Linoléico Linolênico Sebo bovino 38-46 - 2, 0 29, 0 24, 5 44, 5 - - Banha ( suíno s) 46-70 - - 24, 6 15, 0 50, 4 10, 0 - Côco 8, 10 45, 0 20, 0 5, 0 3, 0 6, 0 - - Oliva 79-88 - - 14, 6 - 75, 4 10, 0 - Amend oin 83-100 - - 8, 5 6, 0 51, 6 26, 0 - Algodão 108-110 - - 23, 4 - 31, 6 45, 0 - Milho 111-130 - - 6, 0 2, 0 44, 0 48, 0 - Flax 173-201 - 3, 0 6, 0 - - 74, 0 17, 0 Soja 137-143 - - 11, 0 2, 0 20, 0 64, 0 3, 0


4 - Principais matériasprimas para a produção de biodiesel De uma forma geral, pode-se afirmar que monoalquil-ésteres de ácidos graxos podem ser produzidos a partir de qualquer tipo de óleo vegetal (Tabela 1), mas nem todo óleo vegetal pode (ou deve) ser utilizado como matéria-prima para a produção de biodiesel. Isso porque alguns óleos vegetais apresentam propriedades não ideais, como alta viscosidade ou alto número de iodo, que são transferidas para o biocombustível e que o tornam inadequado para uso direto em motores do ciclo diesel. Portanto, a viabilidade de cada matériaprima dependerá de suas respectivas competitividades técnica, econômica e sócio-ambiental, e passam, inclusive, por importantes aspectos agronômicos, tais como: (a) o teor em óleos vegetais; (b) a produtividade por unidade de área; (c) o equilíbrio agronômico e demais aspectos relacionados com o ciclo de vida da planta; (d) a atenção a diferentes sistemas produtivos; (e) o ciclo da planta (sazonalidade); e (f) sua adaptação territorial, que deve ser tão ampla quanto possível, atendendo a diferentes condições edafoclimáticas (Ramos, 1999, 2003). Dada a grandeza do agronegócio da soja no mercado brasileiro, é relativamente fácil e imediado reconhecer que essa oleaginosa apresenta o maior potencial para servir de modelo para o desenvolvimento de um programa nacional de biodiesel. Apenas como exemplo, dados divulgados pela Abiove (Associação Brasileira dos Produtores de Óleos Vegetais) demonstram que o setor produtivo da soja já está preparado para atender à demanda nacional de misturar até 5% de biodiesel no diesel de petróleo, sendo que proporções superiores a esta mereceriam uma nova avaliação para que não haja dúvidas quanto ao abastecimento de óleo a esse novo setor da economia. Por outro lado, segundo da- dos oficiais da Embrapa (Peres e Junior, 2003), o Brasil apresenta um potencial de 90 milhões de hectares disponíveis, em áreas degradadas e/ou não exploradas, para a expansão da atual fronteira agrícola. Considerando-se apenas a utilização da soja como matéria-prima para a produção de biodiesel, serão necessários apenas 3 milhões de hectares, ou 1,8 bilhões de litros de óleo, para a implementação do B5 (mistura composta de 5% de biodiesel e 95% do petrodiesel), o que culminaria na geração de cerca de 234 mil empregos diretos e indiretos. Além da soja, várias outras oleaginosas (e.g., Tabela 1), que ainda se encontram em fase de avaliação e desenvolvimento de suas cadeias produtivas, podem ser empregadas para a produção do biodiesel (Parente, 2003). A região norte, por exemplo, apresenta potencial para uso de dendê, babaçu e soja; a região nordeste, de babaçu, soja, mamona, dendê, algodão e coco; a região centro-oeste, de soja, mamona, algodão, girassol, dendê e gordura animal; a região sul, de soja, colza, girassol e algodão; e a região sudeste, de soja, mamona, algodão e girassol (Campos, 2003; Peres e Junior, 2003). Várias dessas oleaginosas já tiveram as suas respectivas competitividades técnica e sócio-ambiental demonstradas para a produção de biodiesel, restando, na maioria dos casos, um estudo agronômico mais aprofundado que ratifique os estudos de viabilidade. Deve-se ainda destacar que a inserção do biodiesel na matriz energética nacional representa um poderoso elemento de sinergia para com o agronegócio da cana, cujo efeito será extremamente benéfico para a economia nacional (Ramos, 1999, 2003). A produção de etanol é expressiva em, praticamente, todas as regiões do país, e o novo programa somente terá a contribuir para o aumento da competitividade do setor, valendo-se, inclusive, da rede de distribuição já existente e do excelente desempenho das tecnologias desenvolvidas para a ca- deia produtiva da cana (Campos, 2003). Nesse contexto, o Brasil se encontra em uma condição que país algum jamais esteve na história do mundo globalizado. Com a evidente decadência das fontes fósseis, nenhuma outra região tropical tem porte e condições tão favoráveis para assumir a posição de um dos principais fornecedores de biocombustíveis e tecnologias limpas para o século XXI (Vidal, 2000). 5 - O processo de produção de biodiesel por catálise homogênea em meio alcalino A transesterificação de óleos vegetais ou gordura animal, também denominada de alcoólise, pode ser conduzida por uma variedade de rotas tecnológicas em que diferentes tipos de catalisadores podem ser empregados, como bases inorgânicas (hidróxidos de sódio e potássio e bases de Lewis), ácidos minerais (ácido sulfúrico), resinas de troca iônica (resinas catiônicas fortemente ácidas), argilominerais ativados, hidróxidos duplos lamelares, superácidos, superbases e enzimas lipolíticas (lipases) (Schuchardt et al., 1998; Ramos, 2003). Não há dúvidas de que algumas dessas rotas tecnológicas, particularmente aquelas que empregam catalisadores heterogêneos, apresentam vantagens interessantes como a obtenção de uma fração glicerínica mais pura, que não exija grandes investimentos de capital para atingir um bom padrão de mercado. Porém, é também correta a afirmação de que a catálise homogênea em meio alcalino ainda prevalece como a opção mais imediata e economicamente viável para a transesterificação de óleos vegetais (Zagonel e Ramos, 2001; Ramos, 2003). Um fluxograma simplificado do processo de produção de biodiesel, utilizando a transesterificação etílica em meio alcalino como modelo, encontra-se apresentado na Figura 2. Seja qual for a rota tecnológica escolhida, a transesterificação de óleos vegetais corresponde a uma reação reversível, cuja cinética é Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 31


Figura 2. Fluxograma simplificado de produção de ésteres etílicos a partir de óleos vegetais e gordura animal. regida pelo princípio enunciado em 1888 pelo químico francês Henry- Louis Le Chatelier (1850-1936) (Figura 1). Portanto, o rendimento da reação dependerá do deslocamento do equilíbrio químico em favor dos ésteres, através da otimização de fatores, tais como a temperatura de reação, a concentração e caráter ácido-base do catalisador, bem como o excesso estequiométrico do agente de transesterificação (álcool). Porém, conversões totais serão literalmente impraticáveis em uma única etapa reacional, pois, além de reversível, tem-se a ocorrência de reações secundárias como a saponificação. Para limitar a presença de triacilgliceróis não reagidos além dos limites tolerados pelo motor, muitos processos recorrem à condução da reação em duas etapas seqüenciais, que garantam taxas de conversão superiores a 98%. Por outro lado, a eliminação de sabões, catalisador residual e glicerol livre somente é possível através de etapas eficientes de lavagem. De acordo com a literatura, a reação de obtenção do éster metílico exige um excesso estequiométrico de metanol igual a 100% (razão molar álcool:óleo de 6:1), e uma quantidade de catalisador alcalino equivalente a 0,5% a 1,0% em relação à massa de óleo, para que sejam obtidos rendimentos superiores a 95% (Freedman et al., 1986). No entanto, duas observações limitam a simples aplicação de uma recomendação como esta: (a) primeiramente, a matéria-prima a ser 32 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 utilizada em cada região é diferente e isso implica na necessidade de estudos localizados, que permitam uma otimização realística ligada a avaliações confiáveis de toda a cadeia produtiva; e (b) as condições utilizadas para a reação de metanólise não podem ser transferidas para situações em que outros álcoois, como o etanol, sirvam de modelo. Com efeito, a transesterificação com metanol é tecnicamente mais viável do que a com etanol comercial, porque a água existente no etanol (4%-6%) retarda a reação. O uso de etanol anidro efetivamente minimiza esse inconveniente (Figura 2), embora não implique solução para o problema inerente à separação da glicerina do meio de reação que, no caso da síntese do éster metílico, é indiscutivelmente muito mais facilitada (Freedman et al., 1986; Schuchardt et al., 1998; Ramos, 1999). No entanto, basta um ajuste nas condições de reação para que a separação de fases aconteça espontaneamente, sendo que a eficiência do processo de decantação (da fração glicerínica) pode ser acelerada pelo uso de centrífugas contínuas, auxiliadas ou não pela adição de compostos tensoativos (Ramos, 2003). O processo de produção de biodiesel deve reduzir ao máximo a presença de contaminações no produto, como glicerina livre e ligada, sabões ou água (Figura 2). No caso da glicerina, reações de desidratação que ocorrem durante a combustão podem gerar acroleína, um poluente atmosférico muito perigoso, que pode, devido a sua reatividade, envolver-se em reações de condensação, que acarretam um aumento na ocorrência de depósitos de carbono no motor (Mittelbach et al., 1985). Sabões e ácidos graxos livres acarretam a degradação de componentes do motor, e a umidade, desde que acima de um limite tolerável, pode interferir na acidez do éster por motivar a sua hidrólise sob condições não ideais de estocagem. Por essas e outras razões, é imprescindível que sejam definidas especificações rígidas para o biodiesel, de forma que o sucesso do programa não venha a ser compro-


metido por ocorrências associadas ao mau controle de qualidade do produto. Independentemente da rota tecnológica, a aceitação do biodiesel no mercado precisa ser assegurada e, para isso, é indispensável que esse produto esteja dentro das especificações internacionalmente aceitas para o seu uso. No Brasil, esses parâmetros de qualidade encontram-se pré-fixados pela Portaria n o . 255 da ANP, cuja proposta foi baseada em normas já existentes na Alemanha (DIN) e nos Estados Unidos (ASTM). Tais características e/ ou propriedades, determinantes dos padrões de identidade e qualidade do biodiesel, incluem ponto de fulgor, teor de água e sedimentos, viscosidade, cinzas, teor de enxofre, corrosividade ao cobre, número de cetano, ponto de névoa, resíduo de carbono, número de acidez, curva de destilação (ou a temperatura necessária para a recuperação de 90% do destilado), estabilidade à oxidação, teor de glicerina livre e total, cor e aspecto (Agência Nacional do Petróleo, 2003). Dentre esses parâmetros, alguns têm merecido críticas da comunidade científica por não apresentarem aplicação direta ao biodiesel, como o índice de corrosividade ao cobre e a curva de destilação. Por essa razão, a especificação definida pela portaria é ainda provisional e poderá ser modificada em função de novas argumentações e dados experimentais gerados pela comunidade científica. Um aspecto extremamente importante da Portaria n o 255 da ANP está relacionado com as limitações que oferece para o aproveitamento de todos os óleos vegetais que se encontram disponíveis no território nacional. No entanto, é importante esclarecer que a especificação define a qualidade do produto a ser utilizado puro, ou seja, sem a sua diluição com diesel de petróleo. Por outro lado, se a concepção do programa nacional é a de facultar o uso de misturas dos tipos de B2 a B20, restringindo o uso de B100 apenas a situações especiais (como na geração de energia elétrica em grupo-geradores), talvez fosse adequada (e possível) a flexibilização das especificações com vistas a uma maior inserção das diferentes oleaginosas que compõem o conjunto de alternativas regionais de nosso território. Essa flexibilização estaria, portanto, restrita somente ao uso do biodiesel em misturas, valendo-se do fator de diluição que a razão volumétrica definida pela mistura proporciona (Ramos, 2003). Vale ressaltar que a adição de um biodiesel de qualidade ao diesel, até um limite de 20% (B20), não modifica drasticamente as suas propriedades e não o desqualifica perante a Portaria n o . 310 da ANP, cujo conteúdo estabelece as especificações para comercialização de óleo diesel automotivo em todo o território nacional. Obviamente, tal hipótese precisa ser estudada em todas as suas implicações, pois precisam ser dadas garantias para que a credibilidade do programa não sofra o impacto de serem consideradas experiências mal sucedidas possíveis falhas no funcionamento do motor e o subseqüente aumento nos seus custos de manutenção. Da mesma forma como foram definidos alguns aspectos agronômicos essenciais para que um determinado óleo vegetal apresente competitividade como matéria-prima para a produção de biodiesel, importantes aspectos tecnológicos também precisam ser atendidos e estes estão relacionados: (a) à complexidade exigida para o processo de extração e tratamento do óleo; (b) à presença de componentes indesejáveis no óleo, como é o caso dos fosfolipídeos presentes no óleo de soja; (c) ao teor de ácidos graxos poli-insaturados; (d) ao tipo e teor de ácidos graxos saturados; e (e) ao valor agregado dos co-produtos, como hormônios vegetais, vitaminas, anti-oxidantes, proteína e fibras de alto valor comercial. Diferentes oleaginosas apresentam diferentes teores em óleos vegetais (Tabela 1) e a complexidade exigida para a extração do óleo pode contribuir negativamente para a viabilidade do processo (Alsberg e Taylor, 1928). Oleaginosas de baixo teor de óleo, como a soja, exigem procedimentos de extração caros e relativamente complexos que praticamente restringem a viabilidade dessa matéria-prima àquelas regiões em que já exista uma razoável capacidade instalada para o esmagamento de grãos. Porém, oleaginosas de maior teor em óleos vegetais, cujos processos de extração sejam mais simplificados, certamente apresentarão melhor competitividade econômica por não exigirem a instalação de operações unitárias complexas para esse objetivo. Por outro lado, a qualidade do óleo poderá exigir uma etapa de refino para que também a qualidade no produto final seja garantida. Esse é certamente o caso da soja, que depende do refino para reduzir a presença de gomas e fosfolipídeos no biodiesel. Mais uma vez, é provável que essa observação tenha pouco significado para regiões onde a agroindústria da soja esteja verticalizada ao óleo refinado, mas, onde não haja esse potencial agroindustrial, seria desejável que as matérias-primas selecionadas para a produção não apresentassem tal limitação e pudessem sofrer a alcoólise sem exigir a implantação de uma unidade de refino. Há evidências de que alguns óleos vegetais podem oferecer essa vantagem, como os de girassol e de várias espécies de palmáceas (óleos laurílicos). O tipo e o teor de ácidos graxos presentes no óleo vegetal (Tabela 1) têm um efeito marcante sobre a estabilidade do biodiesel diante do armazenamento e da oxidação. Por exemplo, quedas bruscas na temperatura ambiente promovem o aumento da viscosidade e a cristalização de ésteres graxos saturados que, eventualmente, podem causar o entupimento de filtros de óleo e sistemas de injeção. A tendência à “solidificação” do combustível é medida através dos pontos de névoa e de fluidez (ou de entupimento), que devem ser tanto mais baixo quanto possível. Abaixamentos no Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 33


ponto de fluidez, muitas vezes motivados pela aditivação de inibidores de cristalização (Stournas et al., 1995; Ramos, 2003), representam menores restrições do biocombustível à variações de temperatura, evitando problemas de estocagem e de utilização em regiões mais frias. Obviamente, esse problema não é exclusivo do biodiesel, pois o diesel de petróleo contém parafinas que apresentam tipicamente o mesmo comportamento. A formação de depósitos por precipitação também ocorre em função do envelhecimento e/ou oxidação do biodiesel. Testes realizados pela Bosch (Dabague, 2003), em parceria com a ANFAVEA (Associação Nacional dos Fabricantes de Veículos Automotores), AEA (Associação Brasileira de Engenharia Automotiva) e Sindipeças (Sindicato Nacional da Indústria de Componentes para Veículos Automotores), constataram que a degradação oxidativa do biodiesel gera resinificação que, por aderência, constitui uma das principais causas da formação de depósitos nos equipamentos de injeção. Em decorrência desse fenômeno, foi também observada uma queda no desempenho, aumento da susceptibilidade à corrosão e diminuição da vida útil dos motores. O ranço oxidativo está diretamente relacionado com a presença de ésteres monoalquílicos insaturados. Trata-se da reação do oxigênio atmosférico com as duplas ligações desses ésteres, cuja reatividade aumenta com o aumento do número de insaturações na cadeia (Moretto e Fett, 1989). Assim, por ser relativamente insaturado, o biodiesel derivado do óleo de soja é muito susceptível à oxidação. Os ácidos linoleico e linolênico, que, juntos, correspondem a mais de 61% da composição desse óleo, apresentam, respectivamente, duas e três duplas ligações, que podem reagir facilmente com o oxigênio. A oxidação de óleos insaturados representa um processo relativamente complexo que envolve reações entre radicais livres e oxigê- nio molecular. Todo esse processo é geralmente resumido em três etapas, denominadas de iniciação, propagação e finalização. O processo de polimerização pode ser iniciado por traços de metais, calor (termólise), luz (fotólise) ou radicais hidroxila e hidroperoxila, gerados pela cisão homolítica de moléculas de água expostas à radiação (Kumarathasan et al., 1992). Os peróxidos e hidroperóxidos produzidos através da reação de auto-oxidação podem se polimerizar com outros radicais e produzir moléculas de elevada massa molar, sedimentos insolúveis, gomas e, em alguns casos, pode quebrar a cadeia do ácido graxo oxidado, produzindo ácidos de cadeias menores e aldeídos (Prankl e Schindlbauer, 1998). Estudos anteriores (Clark et al., 1984; Tao, 1995; System Lab Services, 1997) constataram que a formação desses ácidos pode estar ligada à corrosão do sistema combustível dos motores porque, devido à alta instabilidade dos hidroperóxidos, eles apresentam forte tendência a atacar elastômeros. A maioria dos trabalhos até então realizados sobre a estabilidade diante da oxidação do biodiesel referem-se ao estudo de ésteres metílicos (Prankl e Schindlbauer, 1998; Ishido et al., 2001; Pedersen e Ingermarsson, 1999), visto que a maioria dos países que instituíram o uso desse biocombustível não apresenta disponibilidade nem infra-estrutura para produzir etanol como o Brasil. Esses trabalhos têm confirmado que, de um modo geral, o biodiesel de natureza metílica se oxida após curtos períodos de estocagem, e que sua inércia química está diretamente relacionada com os óleos vegetais empregados na sua produção (Prankl e Schindlbauer, 1998). Um dos meios mais comumente utilizados para se inferir sobre a susceptibilidade de um determinado óleo à oxidação é a avaliação de seu número de iodo. O número de iodo revela o número de insaturações de uma determinada amostra e 34 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 esse valor constitui um dos parâmetros de identidade dos óleos vegetais. Sendo assim, diferentes tipos de biodiesel apresentam números de iodo semelhantes aos dos triglicerídeos de origem. No entanto, deve-se salientar que, quando o objetivo é avaliar a estabilidade à oxidação de um dado óleo, as informações obtidas através desse método não são adequadas, pois o número de iodo não discrimina que compostos estão contribuindo para o valor encontrado. Desse modo, há óleos diferentes com números de iodo semelhantes, porém, com estabilidades à oxidação consideravelmente distintas. Para se inferir previsões acerca da estabilidade à oxidação de um dado óleo é, portanto, necessário que se conheça a sua composição percentual em ácidos graxos, o que só é possível através do emprego de métodos cromatográficos de análise. Somente através do conhecimento pleno das propriedades que determinam os padrões de identidade e a qualidade do biodiesel é que será possível estabelecer parâmetros de controle que garantirão a qualidade do produto a ser incorporado na matriz energética nacional. 6 - Aspectos ambientais relacionados com o uso do biodiesel Sabe-se que o aumento na concentração dos gases causadores do efeito estufa, como o dióxido de carbono (CO 2 ) e o metano (CH 4 ), tem acarretado sérias mudanças climáticas no planeta. Efeitos como o aumento da temperatura média global, as alterações no perfil das precipitações pluviométricas e a elevação do nível dos oceanos poderão ser catastróficos frente à contínua tendência de aumento da população mundial (Peterson e Hustrulid, 1998; Shay, 1993). Nesse sentido, a inserção de combustíveis renováveis em nossa matriz energética precisa ser incentivada para frear as emissões causadas pelo uso continuado de combustíveis fósseis.


Vários estudos têm demonstrado que a substituição do diesel de petróleo por óleos vegetais transesterificados reduziria a quantidade de CO 2 introduzida na atmosfera. A redução não se daria exatamente na proporção de 1:1, pois cada litro de biodiesel libera cerca de 1,1 a 1,2 vezes a quantidade de CO 2 liberada na atmosfera por um litro de diesel convencional. Todavia, diferentemente do combustível fóssil, o CO 2 proveniente do biodiesel é reciclado nas áreas agricultáveis, que geram uma nova partida de óleo vegetal para um novo ciclo de produção. Isso acaba proporcionando um balanço muito mais equilibrado entre a massa de carbono fixada e aquela presente na atmosfera que, por sua vez, atua no chamado efeito estufa. Portanto, uma redução real no acúmulo de CO 2 somente será possível com a diminuição do uso de derivados do petróleo. Para cada quilograma de diesel não usado, um equivalente a 3,11 kg de CO 2 , mais um adicional de 15% a 20%, referente à sua energia de produção, deixará de ser lançado na atmosfera. Foi também estimado que a redução máxima na produção de CO 2 , devido ao uso global de biodiesel, será de, aproximadamente, 113-136 bilhões de kg por ano (Peterson e Hustrulid, 1998). A utilização de biodiesel no transporte rodoviário e urbano oferece grandes vantagens para o meio ambiente, tendo em vista que a emissão de poluentes é menor que a do diesel de petróleo (Masjuk e Sapuan, 1995; Clark et al., 1984). Chang et al. (1996) demonstraram que as emissões de monóxido e dióxido de carbono e material particulado foram inferiores às do diesel convencional, enquanto que os níveis de emissões de gases nitrogenados (NOx) foram ligeiramente maiores para o biodiesel. Por outro lado, a ausência total de enxofre confere ao biodiesel uma grande vantagem, pois não há qualquer emissão dos gases sulfurados (e.g., mercaptanas, dióxido de enxofre) normalmente detectados no escape dos motores movidos a diesel. Outro aspecto de interesse ambiental está relacionado com as emissões de compostos sulfurados. Sabese que a redução do teor de enxofre no diesel comercial também reduz a viscosidade do produto a níveis não compatíveis com a sua especificação e que, para corrigir esse problema, faz-se necessária a incorporação de aditivos com poder lubrificante. Consumada a obrigatoriedade na redução dos níveis de emissão de compostos sulfurados a partir da combustão do diesel, a adição de biodiesel em níveis de até 5% (B5) corrigirá esta deficiência viscosimétrica, que confere à mistura propriedades lubrificantes vantajosas para o motor. Trabalhos já desenvolvidos no Brasil na década de 80, quando foram utilizados vários óleos vegetais transesterificados, também demonstraram bons resultados quando utilizados em motores de caminhões e tratores, tanto puros quanto em misturas do tipo B30 (Ministério da Indústria e do Comércio, 1985). Mais recentemente, foram realizados testes no transporte urbano da cidade de Curitiba com ésteres metílicos de óleo de soja (Laurindo, 2003). Cerca de 80 mil litros de biodiesel foram cedidos pela American Soybean Association (EUA) e testados na forma da mistura B20, apresentando resultados bastante satisfatórios em relação ao controle. Os testes foram realizados em 20 ônibus de diferentes marcas durante três meses consecutivos, no primeiro semestre de 1998; ao final dos trabalhos, os resultados obtidos mostraram uma redução média da fumaça emitida pelos veículos de, no mínimo, 35% (Laurindo e Bussyguin, 1999). O caráter renovável do biodiesel está apoiado no fato de as matériasprimas utilizadas para a sua produção serem oriundas de fontes renováveis, isto é, de derivados de práticas agrícolas, ao contrário dos derivados de petróleo. Uma exceção a essa regra diz respeito à utilização do metanol, derivado de petróleo, como agente transesterificante, sendo esta a matéria-prima mais abundantemente utilizada na Europa e nos Estados Unidos. Isso significa que a prática adotada no Brasil, isto é, a utilização do etanol, derivado de biomassa, torna o biodiesel um produto que pode ser considerado como verdadeiramente renovável (Zagonel, 2000). Assim, por envolver a participação de vários segmentos da sociedade, tais como as cadeias produtivas do etanol e das oleaginosas, a implementação do biodiesel de natureza etílica no mercado nacional abre oportunidades para grandes benefícios sociais decorrentes do alto índice de geração de empregos, culminando com a valorização do campo e a promoção do trabalhador rural. Além disso, há ainda as demandas por mão-de-obra qualificada para o processamento dos óleos vegetais, permitindo a integração, quando necessária, entre os pequenos produtores e as grandes empresas (Campos, 2003). 5 - Conclusão A intensidade com que o tema biodiesel tem sido abordado em reuniões políticas, científicas e tecnológicas tem dado testemunho do interesse com que a sociedade e o setor produtivo vem encarando essa nova oportunidade de negócios para o país. Com efeito, diante de tantos benefícios, como a criação de novos empregos no setor agroindustrial, a geração de renda, o fomento ao cooperativismo, a perspectiva de contribuição ao equilíbrio de nossa balança comercial e pelos comprovados benefícios ao meio ambiente, pode-se dizer que o biodiesel tem potencial para constituir um dos principais programas sociais do governo brasileiro, representando fator de distribuição de renda, inclusão social e apoio à agricultura familiar. No entanto, neste momento em que as bases do programa nacional estão sendo ainda definidas, o desenvolvimento de projetos de cunho científico e tecnológico, que possam oferecer maior segurança aos nossos tomadores de decisão, é, no mínino, estrategicamente imprescindível ao país. No que diz respeito à evolução do programa nacional de biocombustíveis, algumas ações governa- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 35


mentais poderiam ser de extrema importância para acelerar o atendimento às suas principais metas tecnológicas: (a) instalação de uma unidade-piloto, desinteressada de qualquer ganho comercial e preferencialmente estabelecida em parceria com instituições públicas de pesquisa e desenvolvimento, para auxiliarem nos estudos de viabilidade técnica e econômica do biodiesel; (b) estabelecimento das especificações a serem exigidas para o licenciamento do produto (processo já iniciado pela ANP, através da Portaria n o . 255); (c) ampliação dos testes em frota cativa para dirimir quaisquer dúvidas que ainda persistam sobre o desempenho e a viabilidade do biodiesel, particularmente de natureza etílica, seja puro ou em misturas do tipo B2 a B20; e (d) abertura de linhas de financiamento para o desenvolvimento de novas rotas tecnológicas, com vistas a simplificar e/ou a otimizar o processo, a ampliação das perspectivas para a utilização de seus subprodutos e a diversificação da matéria-prima para atender a vocações regionais. 6 - Referências Bibliográficas 1. AGÊNCIA NACIONAL DO PE- TRÓLEO. Portarias de Qualidade, 2003. Disponível em: 2. ALSBERG, C. L.; TAYLOR, A. E. The fats and oils, a general review. California: Food Research Institute, Stanford University, 1928 3. ANDRADE, E. B. Programa brasileiro de desenvolvimento tecnológico de combustíveis alternativos. In: SEMINÁRIO PARANAENSE DE BIODIESEL, 1., 2003, Londrina. Anais eletrônicos... Disponível em: Acesso em: 23 de agosto de 2003. 4. AMERICAN SOCIETY TESTING METHODS. D6751. USA, 2003. 5. BARRETO, C. R. Óleo de dendê substitui petróleo como combus- tível e matéria-prima. Petro & Química, ano 5, n.50, Out/1982 6. CAMPOS, I. Biodiesel e Biomassa: duas fontes para o Brasil. Revista de Ecologia do Século 21, Rio de Janeiro, v.80, Disponível em: Acesso em: 26/08/2003. 7. CENBIO, CENTRO NACIONAL DE REFERÊNCIA EM BIOMASSA. Banco de dados de biomassa no Brasil. Disponível em: Acesso em: 27 de setembro de 2003. 8. CHANG, Y. Z. D.; GERPEN, V. H. J.; LEE, I.; JOHNSON, A. L.; HAMMOND, G. E.; MARLEY, J. S. Fuel properties and emissions of soybean oil esters as diesel fuel. J. Am. Oil Chem. Soc., v.73, n.11, p.1549-1555, 1996. 9. CLARK, S. J.; WAGNER, L.; SCHROCK, M. D.; PIENNAAR, P. G. Methyl and ethyl soybean esters as renewable fuels for diesel engines. J. Am. Oil Chem. Soc., v.61, n.10, p.1632–8, 1984. 10. DABAGUE, R. Programa de testes para o uso da mistura diesel/ biodiesel. In: SEMINÁRIO PARANAENSE DE BIODIESEL, 1., 2003, Londrina. Anais eletrônicos... Disponível em: Acesso em: 15 de setembro de 2003. 11. DEUTSCHES INSTITUT FÜR NORMUNG E.V. 14214. Alemanha, 2003. 12. FREEDMAN, B.; BUTTERFIELD, R.; PRYDE, E. H. Transesterification kinetics of soybean oil. J. Am. Oil Chem. Soc., v.63, n.10, p.1375- 1380, 1986. 13. GALLO, W. L. R. Especificações de novos combustíveis: o papel da ANP. In: SEMINÁRIO PARANAENSE DE BIODIESEL, 1., 2003, Londrina. Anais eletrônicos... Disponível em: Acesso em: 23 de agosto de 2003. 14. GHASSAN, T. A.; MOHAMAD I. AL-WIDYAN, B.; ALI O, A. Combustion performance and emissions of ethyl ester of a waste 36 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 vegetable oil in a water-cooled furnace. Appl. Thermal Eng., v.23, p.285-293, 2003. 15. GOERING, C. E.; FRY, B. Engime durability screening test of a diesel oil/ soy oil/ alcohol microemulsion fuel. J. Am. Oil Chem. Soc., v.61, n.10, p.1627-1631, 1984. 16. GREENPEACE INTERNACIONAL – Kyoto protocol. Disponível em: Acesso em: 24/ 08/2003. 17. KOBMEHL, S. O.; HEINRICH, H. Assesment of the use of biofuels in passenger vehicles. Sustainable agricultural for food, energy and industry, p.867-875, 1998. 18. KUMARATHASAN, R.; RAJKUMAR, A. B.; HUNTER, N. R. Autoxidation and yellowing of methyl linolenate. Prog. Lipid Res., v.31, n.2, p.109- 126, 1992. 19. ISHIDO, E.; MINEMOTO, S.; ADACHI, S.; MATSUNO, R. Oxidations of linoleic acid and methyl linoleate mixed with saturated fatty acid or its methyl ester. Disponível em: Acesso em: 19/09/2003. 20. LAURINDO, J. C. Combustíveis alternativos no Tecpar e na UFPR. In: SEMINÁRIO PARANAENSE DE BIODIESEL, 1., 2003, Londrina. Anais eletrônicos... Disponível em: < http://www.tecpar.br/ cerbio/Seminario-palestras.htm> Acesso em: 23 de agosto de 2003. 21. LAURINDO, J. C.; BUSSYGUIN, G. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE SOJA, 1999, Londrina. Anais... Londrina: Embrapa-Soja, 1999, p. 237. 22. MA, F.; HANNA, M. A. Biodiesel production: a review. Biores. Technol., v.70, n.1, p.1-15, 1999. 23. MASJUK, H.; ZAKI, A. M.; SAPUAN, S. M. A rapid test to performance, emission and wear of a diesel engine fueled with palm oil diesel. J. Am. Oil Chem. Soc., v.70, n.10, p.1021-1025, 1993. 24. MINISTÉRIO DA CIÊNCIA E TEC- NOLOGIA, Primeiro inventário brasileiro de emissões antrópicas de gases de efeito estufa. Brasília, 2002.


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Pesquisa Marcos Barros de Medeiros Doutor em Entomologia - ESALQ/USP Professor Adjunto Centro de Formação de Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras. barros@iwpb.com.br; ciagra@cft.ufpb.br Paulo Alves Wanderley Doutor em Agronomia - FCAV/UNESP, Professor nível E do Centro de Formação de Tecnólogos / UFPB - Campus de Bananeiras Maria José Araújo Wanderley Doutora em Agronomia - FCAV/UNESP, Bolsista de Desenvolvimento Científico Regional CNPq, UFPB Departamento de Ciências Básicas e Sociais, Campus de Bananeiras Ilustrações cedidas pelos autores Biofertilizantes Líquidos 38 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Processo trofobiótico para proteção de plantas em cultivos orgânicos 1 - Introdução Nos países desenvolvidos e em vários outros em desenvolvimento, como o Brasil, os organoclorados foram proibidos para o uso agrícola. Porém, essa foi apenas uma medida isolada, uma vez que tais produtos circulam hoje por toda a biosfera (Paschoal, 1995). O uso de produtos químicos sem a observação da complexidade de fatores que interagem nos agroecossistemas tem sido a maior causa de desequilíbrio nesses sistemas, tais como o desenvolvimento de resistência ao pesticida, ressurgimento e desencadeamento de pragas secundárias e quebra de cadeias alimentares a partir da eliminação de seus inimigos naturais (parasitóides e predadores) (Medeiros, 1998). Até 1945 os ácaros fitófagos eram tidos como pragas secundárias da agricultura. No entanto, o desenvolvimento destas espécies nocivas vem atingindo, cada vez mais, uma elevada significação econômica, ao mesmo tempo em que sua lista não pára de crescer. Antes de 1946, havia apenas 10 espécies de insetos e carrapatos resistentes, todas a produtos inorgânicos minerais. Em 1969 a resistência foi confirmada para 424 espécies, sendo 97 de importância médica ou veterinária e 127 de importância agrícola e florestal e de produtos armazenados (Paschoal, 1979; Chaboussou 1980). Na década de 90, pelo menos 504 espécies de insetos e ácaros foram dadas como resistentes a pelo menos um pesticida. Destas, 23 espécies são benéficas e 481 são nocivas, sendo 283 de impor- tância agrícola e 198 de importância médico-veterinária (Georghiou & Lagunes-Tejeda, 1991). Uma nova teoria, hoje amplamente difundida, converge ao explicar que, além destes fatores, estes desequilíbrios também estão fortemente associados ao estado de proteólise dominante nos tecidos da planta. Estudos comprovam que produtos químicos sintéticos, tais como agrotóxicos e fertilizantes minerais solúveis, contêm substâncias que interferem na proteossíntese, provocam o acúmulo de aminoácidos livres e açúcares redutores nos tecidos da planta, reduzindo sua resistência às pragas e doenças (Alves et al., 2001; Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). Segundo Primavesi (1998), três condições são necessárias para que uma planta seja atacada por pragas e doenças: 1) a planta deve ser deficientemente nutrida, oferecendo alguma substância utilizável para o agente; 2) o agente possa se multiplicar livremente sem controle biológico, o que ocorre mais facilmente em monoculturas; 3) o sistema de autodefesa da planta deve estar desequilibrado, em função da nutrição e do uso de agrotóxicos. Estes princípios convergem com os fundamentados por Francis Chaboussou, então diretor do “Institut National de la Recherche Agronomique” (INRA) na França, que em 1979 formulou a Teoria da Trofobiose. Segundo essa teoria, todo processo vital está na dependência da satisfação das necessidades dos organismos vivos, sejam eles vegetais ou animais. Dessa forma, a planta, ou mais precisa-


Figura 01. Simulação da cinética de crescimento celular e da produção de metabólitos ao longo da fermentação aeróbica do biofertilizante no processo de CLC. Metabólitos primários: (Etapas de anabolismo e catabolismo): Açúcares, aminoácidos, ácidos graxos, proteínas, lipídeos, bases nitrogenadas (nucleotídeos e ácidos nucleicos), precursores moleculares etc. Metabólitos secundários: (Biossíntese de macromoléculas de elevado peso molecular): toxinas, antibióticos, fitoreguladores (IAA e giberelinas), ácidos graxos de cadeia longa, fosfolipídeos, polissacarídeos, terpenos fenóis, polifenois, citoquininas, etc. mente o órgão vegetal, será atacado somente quando seu estado bioquímico, determinado pela natureza e pelo teor de substâncias nutritivas solúveis, corresponder às exigências tróficas (de alimentação) da praga ou do patógeno em questão. Estudando-se a relação entre o estado nutricional de plantas e sua resistência às doenças constatou-se que toda circunstância desfavorável ao crescimento celular tende a provocar um acúmulo de compostos solúveis não utilizados, como açúcares e aminoácidos, diminuindo a resistência da planta ao ataque de pragas e doenças (Dufrenoy, 1936). Comprovou-se mais tarde que a ação dos agrotóxicos na planta resulta na inibição da proteossíntese, resultando num aumento de ácaros, pulgões e lepidópteros e de doenças (Chaboussou, 1999; Tokeshi, 2002). Espécies de pulgões, cochonilhas, cigarrinhas, cigarras, tripes, outros insetos sugadores e várias espécies de ácaros fitófagos, não são capazes de desdobrar proteínas em aminoácidos para serem posteriormente recombinados à conveniência de cada um. Por isso, eles dependem de aminoácidos livres existentes na seiva das plantas ou suco celular e de microrganismos simbiontes (Chaboussou, 1980; Panizzi & Parra, 1991; Pinheiro & Barreto, 1996; Gallo et al., 2002) Os adubos minerais solúveis, especialmente os nitrogenados, e os agrotóxicos orgânicos sintéticos, que quando absorvidos pelas plantas e translocados em seu interior, são capazes de interferir com a fisiologia vegetal, reduzem a proteossíntese, desencadeando processo de acúmulo de aminoácidos livres e açúcares redutores, substâncias prontamente utilizáveis pelas pragas e agentes fitopatogênicos, o que foi correlacionado positivamente com o aumento populacional desses organismos (Chaboussou, 1985). Na agricultura orgânica o uso de biofertilizantes líquidos, na forma de fermentados microbianos enriquecidos, têm sido um dos processos mais empregados no manejo trofobiótico de pragas e doenças. Essa estratégia é baseada no equilíbrio nutricional da planta (trofobiose), onde a resistência é gerada pelo melhor equilíbrio energético e metabólico do vegetal (Chaboussou, 1985; Pinheiro & Barreto, 1996). Os biofertilizantes funcionam como promotores de crescimento (equilíbrio nutricional) e como elicitores na indução de resistência sistêmica na planta. Além disso, ajudam na proteção da planta contra o ataque de doenças, por antibiose (Bettiol et al, 1998) e contra o ataque de pragas, por ação repelente, fagodeterrente (inibidores de alimen- tação) ou afetando o seu desenvolvimento e reprodução. 2 - Biofertilizantes líquidos e sua aplicação na proteção de plantas Os biofertilizantes possuem compostos bioativos, resultantes da biodigestão de compostos orgânicos de origem animal e vegetal. Em seu conteúdo são encontradas células vivas ou latentes de microrganismos de metabolismo aeróbico, anaeróbico e fermentação (bactérias, leveduras, algas e fungos filamentosos) e também metabólitos e quelatos organominerais em soluto aquoso. Segundo Santos & Akiba (1996), os metabólitos são compostos de proteínas, enzimas, antibióticos, vitaminas, toxinas, fenóis, ésteres e ácidos, inclusive de ação fitohormonal produzidos e liberados pelos microrganismos. Na citricultura paulista, os biofertilizantes vêm sendo produzidos pelo método de compostagem líquida contínua em “piscinas” escavadas no solo, revestidas de lona plástica de polietileno, com capacidade de até 50 mil litros. No processo são utilizados água não clorada e o inoculante à base de esterco fresco bovino, e posteriormente enriquecido com um composto orgânico nutritivo. O Microgeo é um composto orgânico, com registro no Ministério da Agricultura e certificado pelo IBD, preparado à base de diversas fontes orgânicas e inorgânicas, sendo enriquecido com rochas moídas que contêm cerca de 48% de silicatos de magnésio, cálcio, ferro e outros oligoelementos, fundamentais para estimulação do metabolismo primário e secundário das plantas. Segundo Alves et al. (2001) biofertilizantes obtidos com o Microgeo vêm sendo utilizados, em pulverização sobre as plantas, em mais de 8 milhões de pés de laranja no estado de São Paulo. A potência biológica de um biofertilizante é expressa pela grande quantidade de microrganismos ali existentes, responsáveis pela liberação de metabólitos e antimetabólitos, entre eles vários antibióticos e hormônios vegetais. Castro et al. (1992) e Bettiol et al. (1998) isolaram Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 39


Figura 2. Produção de biofertilizantes pelo sistema de compostagem líquida contínua a céu aberto, em recipientes plásticos. várias leveduras e bactérias, destacando Bacillus subitilis, reconhecido produtor de antibióticos. Atualmente os biofertilizantes vêm sendo aplicados em diversas culturas associadas com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana, importante inimigo natural de pragas. Os efeitos do biofertilizante no controle de pragas e doenças de plantas têm sido bem evidenciados. Efeitos fungistático, bacteriostático e repelente sobre insetos já foram constatados. Santos & Sampaio (1993) verificaram uma propriedade coloidal do biofertilizante que provoca a aderência do inseto sobre a superfície do tecido vegetal. Os autores destacaram também o efeito repelente e deterrente de alimentação contra pulgões e moscas-das-frutas. Medeiros et al. (2000b) verificaram que o biofertilizante à base de conteúdo de rúmen bovino e o composto orgânico Microgeo Ò reduziu a fecundidade, período de oviposição e longevidade de fêmeas do ácaro-da-leprose dos citros, Brevipalpus phoenicis, quando pulverizado em diferentes concentrações. Esses mesmos autores comprovaram que este biofertilizante agiu sinergicamente com Bacillus thuringiensis e o fungo B. bassiana, reduzindo a viabilidade dos ovos e sobrevivência de larvas do bicho-furão-dos-citros (Ecdytolopha aurantiana) (Medeiros et al. 2000c). Estudos recentes comprovaram a redução de até 95% da fecundidade do ácaro rajado Tetranychus urticae, de hábito polífago, em concentrações entre 5 e 50% (Medeiros et al., 2000a; Berzaghi et al., 2001). Também verificou-se redução de até 64% da população do pulgão Aphis sp., quando utilizado o biofertilizante (10%) associado aos inseticidas Boveril ® e Metarril ® , 5 kg/ha, em cultivo de acerola (Medeiros et al., 2001). Aplicações do biofertilizante associadas à calda viçosa ou com o Bacillus thuringiensis reduziram significativamente o ataque da traça (Tuta absoluta) e a broca pequena (Neoleucocinodes elegantalis) em tomateiros (Picanço et al., 1999; Nunes & Leal, 2001). Também foi constatado menor severidade de oídio e de cigarrinha verde em plantas de feijoeiro pulverizadas com diferentes misturas de biofertilizantes (Cunha et al., 2000). Trabalhos conduzidos por Medeiros (2002) no Laboratório de Patologia e Controle Microbiano de Insetos da ESALQ/USP comprovaram que o biofertilizante líquido reduziu de modo crônico e significativamente a fecundidade e o potencial de crescimento populacional e o tempo de desenvolvimento de descendentes dos ácaros da leprose dos citros Brevipalpus phoenicis, criados sobre plantas tratadas com biofertilizantes. O estudo comprovou que o biofertilizante testado agiu por conta- 40 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 to direto e residual e também funcionou de forma sistêmica na planta. A ação antibiótica e indução de resistência sistêmica da planta são provavelmente os principais mecanismos de ação do biofertilizante sobre a praga (D´Andréa & Medeiros, 2002). Os fenômenos podem estar diretamente associados à complexa e pouco conhecida composição química e biológica dos biofertilizantes. Compostos metabólitos (micro e macromoléculas), tais como enzimas, antibióticos, vitaminas, toxinas, fenóis e outros voláteis, ésteres e ácidos, inclusive de ação fitohormonal têm sido identificados nos biofertilizantes (Santos, 1992). Um composto coloidal, de consistência mucilaginosa (goma) e de composição ainda não conhecida, foi observado por Medeiros (2002) causando a imobilização e morte do ácaro B. phoenicis sobre a folha devido à obstrução de seu sistema digestivo. 3 - Processos envolvidos na produção de biofertilizantes Não existe uma fórmula padrão para produção de biofertilizantes. Receitas variadas vêm sendo testadas, utilizando-se componentes minerais para o enriquecimento do meio de cultivo (Santos, 1992; Magro, 1994). O processo de fermentação é complexo e os microrganismos existentes passam quatro fases distintas de crescimento celular: 1) Latência - Compreende o período de adaptação dos microrganismos, após o qual as células dão início à fermentação. 2) Crescimento exponencial – Nessa fase ocorre elevado processo de divisão celular, com a produção de biomassa e liberação dos metabólitos primários: carboidratos, aminoácidos, lipídeos, nucleotídeos, vitaminas e proteínas e enzimas. 3) Fase estacionária – As células param de se dividir e as colônias, após juntarem-se, iniciam um processo de diferenciação celular produzindo metabólitos secundários como forma de defesa (antibióticos, toxinas, fenóis, ácidos orgânicos e outras proteínas de cadeia longa, de alto interesse biotecnológico). 4) Morte Celular-Esgotadas to-


Figura 3. Detalhes do experimento utilizando-se ácaros de B. phoenicis criados em arena, sobre a folha a planta de Canavalia ensiformis. Fonte: Medeiros (2002) das as reservas de energia, as células começam a morrer numa velocidade exponencial. Cada microrganismo participante degrada alimento para outro, numa relação de interdependência mútua e harmônica e, assim, o processo de fermentação acaba sendo contínuo, desde que seja alimentado com meio nutritivo, o que fundamentou o processo de compostagem líquida descrito por D’Andréa & Medeiros (2002). 4 - Produção do biofertilizante pelo processo de Compostagem Líquida Contínua (CLC) 4.1 - Dimensionamento da Produção Tanques para compostagem do biofertilizante podem ser utilizados para volumes de até 1.000 litros, caixas de fibrocimento ou plásticas. Para volumes maiores constrói-se diretamente no solo, ‘piscinas’ com as dimensões do volume pretendido, e com a profundidade máxima de um metro, as quais são revestidas com lona plástica. A localização do tanque deve ser em área ensolarada, mantendo-o descoberto. Para o dimensionamento do volume do tanque, deverá ser considerado um consumo diário máximo de 10% de biofertilizante, da sua capacidade. Exemplo: Para um consumo diário de 100 litros de biofertilizante, o tanque deverá ter o volume de 1.000 litros. 4.2- CLC com uso de esterco e composto orgânico enriquecido Início da CLC: Para início da produção do biofertilizante, adicionase no tanque o esterco fresco de gado (inoculante), um composto orgânico enriquecido com minerais (Ex.: MICROGEO MCO) e água (não clorada). No caso do Microgeo, pesquisado e desenvolvido pela equipe do Laboratório de Patologia e Controle Microbiano da ESALQ, o preparo é feito nas seguintes proporções:1,0 quilo do composto orgânico / 4,0 litros esterco de gado / 20,0 litros água (completando o volume ). Exemplo: Para a produção de 1.000 litros de biofertilizante, adiciona-se no tanque 50 quilos do composto, mais 200 litros de esterco de gado de qualquer origem, completando com água o volume de 1.000 litros do tanque. Agitar duas vezes ao dia manualmente com um ‘rodo’, que também permitirá determinar a espessura da camada orgânica (biomassa) depositada no fundo do tanque, com o objetivo de se quantificar a reposição do esterco de gado no processo CLC. Iniciar o uso do biofertilizante com aproximadamente 15 dias, após a mistura inicial dos insumos. Manutenção da CLC: Para manter a compostagem em meio líquido de forma contínua, contabilizar diariamente os volumes de biofertilizante consumidos repondo no tanque os insumos nas seguintes proporções: a) Reposição do composto orgânico: para cada 30,0 a 40,0 litros de biofertilizante usado, repor 1,0 quilo do composto/inoculante. O intervalo de reposição poderá ser semanal até mensal, ou seja, intervalos menores quanto maior o volume de biofertilizante utilizado. b) Reposição do esterco de gado: adicionar um volume de esterco de gado (fresco) suficiente para manter a mesma proporção biomassa/ água do início do processo, sempre quando se verificar com ajuda do ‘rodo’ a diminuição da camada orgânica no fundo do tanque. c) Reposição da água: está em função do volume de biofertilizante consumido, da evaporação e das chuvas. O volume de água a ser adicionado deverá ser o suficiente para a manutenção do nível inicial do tanque. A freqüência de reposição poderá ser diária, usando-se registro bóia ou até mensal, também em função do volume de biofertilizante usado. Nos períodos de chuvas, recomenda-se fechar os tanques de até 1.000 litros nos momentos de ocorrência delas. Manter descobertos os tanques maiores de 1.000 litros, retirando para uso posterior o volume do biofertilizante que eventualmente poderá transbordar, armazenando-o em tambores. É importante sempre manter as proporções de composto inoculante e esterco de gado, descritas acima, evitando o uso do biofertilizante muito diluído (Microbiol, 2001; D’Andréa & Medeiros, 2002). 5 - Recomendações de uso Segundo Pinheiro & Barreto (1996), devido aos elevados efeitos hormonais e altos teores das substâncias sintetizadas, o uso de biofertilizantes em pulverizações foliares normalmente são feitos com diluições entre 0,1 e 5%. Concentrações maiores, entre 20 e 50%, foram utilizadas por Santos & Akiba (1996) com o Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 41


Figura 4. Caracterização de cadáveres do ácaro da leprose dos citros Brevipalpus phoenicis: (a) control, (b) Ácaro morto por ação de contato do biofertilizante; (c) e (d) Foco microbiano e vista ventral e dorçal do gnatosoma e pernas anteriores aderidas por uma substancia coloidal (goma). Fonte: Medeiros (2002). biofertilizante “Vairo”. Porém, em concentrações muito elevadas, o biofertilizante pode causar estresse fisiológico na planta retardando seu crescimento, floração ou frutificação. Isso se deve provavelmente ao excessivo desvio metabólico para produção de substâncias de defesa. Para hortaliças recomendam-se pulverizações semanais, utilizando entre 0,1 e 3 % de concentração do biofertilizante, considerando que as plantas são de ciclo vegetativo curto e possuem maior velocidade de crescimento, com demanda constante de nutrientes. Em fruteiras, pulverizações entre 1 e 5% do biofertilizante com Microgeo produziram resultados significativos na sanidade na cultura. Este biofertilizante também vem sendo empregado sobre o solo em concentrações de até 20%. Este quando aplicado sobre o mato roçado, como “input” microbiano, é capaz de aumentar a compostagem laminar, isto é diretamente no campo, acelerando os processos bioquímicos e potencializando maior atividade microbiana sobre o solo (D’Andréa & Medeiros, 2002). As aplicações de biofertilizantes deverão ser realizadas durante as fases de crescimento e/ou produção, evitando-se no florescimento. Devese dar preferência pelos dias de chu- va ou irrigação e os horários vespertino ou noturno, evitando-se os períodos secos e as horas mais quentes do dia. Altas concentrações do biofertilizante podem provocar na planta demanda de água muito maior para o seu equilíbrio. Mesmo assim, pulverizações com o biofertilizante, na diluição de 1%, nos períodos secos são possíveis. Apesar de estarem sob os efeitos do estresse hídrico, as plantas estarão recebendo energia entrópica (não utilizável pelos insetos) e outros fatores de proteção. 6 - Biofertilizantes, bioinseticidas e biorremediação O aumento da população e a maior atividade industrial fizeram com que o problema da poluição do ambiente atingisse níveis alarmantes. Além de contaminação por detritos pouco biodegradáveis, como plásticos e detergentes, soma-se o problema dos resíduos de industrias e, principalmente, dos resíduos agroindustriais, como a vinhaça ou o vinhoto, resultante da produção de etanol em grande escala. Estes problemas podem ser atacados pelo desenvolvimento de linhagens microbianas capazes de degradar ou assimilar esses 42 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 compostos para uso como agentes de biorremediação. O processo da biorremediação consiste na descoberta e procriação de bactérias capazes de “comer” os agrotóxicos que ficam por muitos anos no solo e na água. Estas bactérias devoram os componentes químicos existentes nos venenos, fazendo com que o produto perca sua capacidade de poluir o solo, a água e até mesmo o organismo humano. Estas bactérias também não são prejudiciais ao meio ambiente. Caso os resultados da pesquisa sejam confirmados, será um grande avanço para a preservação do meio ambiente, pois o uso do veneno é um grande vilão que prejudica o solo, a água, os animais e o homem (Azevedo, 1998). Uma saída promissora para esses problemas seria a multiplicação em massa desses agentes de biodegradação de agentes químicos, em tanques abertos, adotandose a técnica de cultura em compostagem líquida contínua. A produção de biofertilizantes líquidos, à base de resíduos oriundos da agricultura e da indústria, modificados por microorganismos, gerarão substratos úteis como fertilizantes de solo e como bioprotetores de plantas para a agricultura. A partir de compostos ricos em nutrientes, facilmente acessíveis e de baixo custo operacional, como os resíduos sólidos e líquidos oriundos da agricultura e da indústria, é possível a adição de microrganismos (leveduras, bactérias e actinomicetos, por exemplo) previamente selecionadas, com as condições necessárias de ecologia nutricional, que promoverem o rápido crescimento populacional, resultando em alta produção de massa microbiana. Técnicas sofisticadas, porém com o mesmo princípio, têm sido utilizadas em laboratórios, sob condições controladas em biofermentadores, na produção líquida de inseticidas à base de microrganismos entomo patogênicos (fungos, vírus, bactérias e nematóides) capazes de controlar as pragas em níveis aceitáveis, econômicos e ecológicos (Alves, 1998). A preocupação em se gerar alternativas ecológicas ao problema dos rejeitos líquidos e sólidos na agricultura, transformá-los em insumos de bai-


Figura 5. Crescimento do fungo entomopatogênico Beauveria bassiana em meio de biofertilizante líquido Figura 6. Leveduras isoladas de um biofertilizante produzido por compostagem líquida contínua xo custo e capazes de serem aplicados na atividade produtiva primária, em cultivos orgânicos, representa um grande avanço na preservação do meio ambiente. Contudo, serão necessários alguns anos de investigação e desenvolvimento, para que se produzam metodologias de elevado alcance social, e grandes esforços no sentido de se consolidar o emprego desses processos bioquímicos como forma de se promover a sustentabilidade dos ambientes agrícolas. 7 - Referências bibliográficas ALVES, S. B. (Ed.). Controle Microbiano dos Insetos. 2 a ed. Piracicaba: FEALQ, 1998. 1163p. ALVES, S. B.; MEDEIROS, M. B.; TAMAI, M. A.; LOPES, R. B. Trofobiose e microrganismos na proteção de plantas: Biofertilizantes e entomopatógenos na citricultura orgânica. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, v. 21. p. 16-21. 2001. AZEVEDO, J. L. Genética de microrganismos. Piracicaba: FEALQ, 1998. 490p. BERZAGHI, L. M; MEDEIROS, M. B.; GARCIA, M. O. TAMAI, M. A.; ALVES, S. B. Efeito do biofertilizante na fecundidade do ácaro T. urticae. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE INICIA- ÇÃO CIENTÍFICA DA USP, 9. Anais. ESALQ/USP: Piracicaba 2001 BETTIOL, W.; TRATCH, R.; GALVÃO, J. A. H. Controle de doenças de plantas com biofertilizantes. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPMA. 1998. 22p (EMBRAPA-CNPMA: Circular Técnica, 02). CASTRO, C.M. DE; SANTOS, A.C.V. DOS; AKIBA, F. Bacillus subtilis isolado do biofertilizante “Vairo” com ação fungistática e bacteriostática em alguns fitopatógenos. In: SIMPÓSIO DE CONTROLE BIOLÓGICO, 3., 1992, Águas de Lindóia. Anais. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPDA. 1992. p.291. CHABOUSSOU, F. Les Plantes Malades des Pesticides. Paris: Editions Débard, 1980. 265p. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 43


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Pesquisa Paulo Dejalma Zimmer, Dr. Professor do Departamentode de Fitotecnia FAEM / UFPel djzimmer@ufpel.tche.br Gaspar Malone Doutorando do Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Sementes / FAEM / UFPel malone@gaspar.com.ar Fernando Irajá Félix de Carvalho, PhD. Professor do Departamento de Fitotecnia FAEM / UFPel carvalho@ufpel.tche.br José Fernandes Barbosa Neto, PhD. Professor do Departamento de Plantas de Lavoura Faculdade de Agronomia / UFRGS jfbn@ufrgs.br Antonio Costa de Oliveira, PhD. Professor do Departamento de Fitotecnia FAEM / UFPel acosta@ufpel.tche.br Ilustrações cedidas pelos autores Iniciativas Genômicas Aplicações da ciência genômica no melhoramento de plantas para as regiões de várzea do sul do Brasil melhoramento genético de plantas tem contribuído de forma decisiva para o incremento da produção mundial de grãos (BORLAUG, 1983). Entretanto, a necessidade e os desafios para as próximas duas décadas são imensos, o ganho genético para a produtividade está se reduzindo a cada ano e já não acompanha mais o aumento da demanda por alimentos (BORLAUG, 1997; MANN, 1997 e 1999). Atualmente, grandes esforços estão sendo direcionados no sentido de elucidar o potencial genético das espécies cultivadas, objetivando incrementar a produtividade e a qualidade. Para o lançamento de novos cultivares que atendam à demanda crescente por alimentos, os programas de melhoramento de plantas necessitam de grandes mudanças, principalmente no que tange à estrutura, à estratégia e à própria ciência envolvida (STUBER et al., 1999; KOORNNEEF & STAM, 2001). Além do foco na qualidade e na produtividade, o melhoramento genético também pode ser direcionado no sentido de aumentar a adaptabilidade das espécies. Essa também pode ser considerada uma forma de incrementar a produção de alimentos, pois áreas marginais podem ser incorporadas ao sistema produtivo mediante o desenvolvimento de genótipos adaptados. No Sul do Brasil, há cerca de 6,8 milhões de hectares de terras baixas, caracterizadas por solos hidromórficos, que têm o seu sistema agrícola alicerçado na pecuária extensiva e no plantio do arroz irrigado. A exploração inadequada dessa região, possivelmente associada às dificuldades operacionais, não tem permitido uma apropriada rotação de culturas nem o requerido tempo de pousio, o que favorece a infestação da cultura por espécies daninhas, principalmente o arroz vermelho. A degradação das características físicas do solo provocada pela intensa movimentação de máquinas e equipamentos extremamente pesados também impõe a necessidade de pousio (Figura 1). Dessa forma, extensas áreas estão sendo inviabilizadas a cada ano, tornando-se, muitas vezes, extremamente árdua a sua recuperação. A busca de alternativas para compor o sistema agrícola regional tem motivado iniciativas importantes nas Universidades Federais de Pelotas e do Rio Grande do Sul (UFPel e UFRGS) e na Embrapa Clima Temperado (PORTO et al., 1998). A inclusão de novas culturas, como a aveia, o milho e o azevém, no sistema agrícola das áreas de várzea tem recebido atenção especial, porém a simples introdução de genótipos não é suficiente para a correção, em função da inexistência de constituições genéticas adaptadas à condição de encharcamento dos locais. Desse modo, há uma grande demanda por iniciativas voltadas para a geração Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 45


de variabilidade genética, seleção de constituições genéticas adaptadas às condições do ambiente e aumento da eficiência dos programas de melhoramento de plantas. Advento das Técnicas Moleculares Até a década de 70, pouco se conhecia sobre a organização do DNA. A composição dos pequenos segmentos com função conhecida, os genes, era a jóia mais desejada naquela época. Nos últimos anos, com o surgimento das técnicas moleculares, e entre elas a técnica de clonagem molecular, tornou-se possível o isolamento e a purificação de porções genômicas. Esses avanços contribuíram para tornar a molécula de DNA o foco das principais investigações nos últimos anos. A clonagem molecular consiste no isolamento e na multiplicação de moléculas de DNA idênticas, e compreende, pelo menos, dois estágios importantes: primeiro, o fragmento do DNA de interesse, chamado de inserto, é ligado a uma outra molécula de DNA, denominada vetor, para formar o que se chama de DNA recombinante; segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado transformação bacteriana. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante passa, então, a ser chamada transformante ou célula transformada. Atualmente, as fronteiras da Tecnologia do DNA recombinante, principalmente para fins comerciais, parecem ser ilimitadas. Além dos reflexos diretos, a tecnologia do DNA recombinante proporcionou avanços em todas as áreas da bioquímica, da fisiologia e da genética. Esses avanços permitiram a caracterização, a identificação e a clonagem de uma série de genes de enzimas, que se tornaram ferramentas decisivas para o surgimento de técnicas como a de marcadores moleculares e de seqüenciamento de DNA, o que con- tribuiu para a elucidação de importantes vias de biossíntese. No que tange aos desafios para tornar eficiente o melhoramento de plantas e para incrementar a produção mundial de grãos, várias ferramentas moleculares podem ser incorporadas aos programas de melhoramento de plantas com o objetivo de otimizar a obtenção de genótipos superiores, por exemplo, a transgenia (YE et al., 2000), a seleção assistida por marcadores (FRARY et al., 2000), a mutação induzida (MALUSZYNSKI, 1998) e a genômica (LIU, 1998; McCOUCH, 2001). A busca por soluções para diversificar o sistema agrícola nas áreas de várzea do sul do Brasil passa pela elucidação dos mecanismos fisiogenéticos envolvidos na tolerância dos cereais ao encharcamento. Embora já tenham sido relatadas (DANTAS et al., 2001), algumas respostas à deficiência de oxigênio no solo provocada pelo excesso de água (encharcamento), ainda permanecem muitas dúvidas relacionadas com as interações genéticas que facultam algumas espécies ou variedades a suportarem solos com hipoxia decorrente do excesso de água. A incorporação de tecnologias moleculares e a formação de melhoristas treinados para selecionar genes poderão se refletir em grandes ganhos de eficiência nos programas de melhoramento de plantas. 46 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 1 - Sistema de preparação do solo para plantio de arroz pré-germinado em solos de várzea, utilizando máquinas extremamente pesadas em solos inundados. Essa associação afeta negativamente a estrutura física do solo. Cortesia Prof. Silmar Peske. Sintenia e Genomas Modelos A sintenia é caracterizada pela conservação na ordem e no conteúdo de genes, ou grupos gênicos, entre espécies relacionadas. Essa característica também é denominada colinearidade, e poderá ser altamente informativa para estudos comparativos de função, ação e regulação gênica entre diferentes genomas (Figura 2). Embora não seja uma condição estável, pois a sintenia pode ser perdida no decorrer da evolução, vários trabalhos evidenciam a importância das regiões cromossômicas conservadas para estudos genéticos comparativos (BENNETZEN et al., 1998; GALE & DEVOS, 1998; DEVOS et al., 1999; FEUILLET & KELLER, 2002). A sintenia é bastante estudada na família Brassicaceae e na família Gramineae, atualmente denominada Poaceae. Essa família é constituída por muitas espécies, entre elas algumas das principais espécies agrícolas como milho, arroz, trigo, sorgo, cevada, centeio e aveia (cereais). Além das variações fenotípicas e genotípicas existentes entre os cereais, há muitas variações na estrutura desses genomas. A variação pode ser no número de cromossomos, no nível de ploidia e no tamanho do genoma - estimado em pares de


Figura 2 – Sintenia entre os genomas do arroz, milho, cevada e trigo. As informações provenientes do genoma menor podem ser utilizadas para guiar ações no sentido de localizar, mapear e clonar genes em genomas maiores. Os pontos em amarelo indicam o posicionamento de alguns genes e os números indicam o cromossomo (Modificado de GALE & DEVOS, 1998). bases (pb), podendo existir genomas muito grandes como o genoma do trigo, com cerca de 16 bilhões de bases, como também pode ocorrer genomas muito pequenos, como é o caso do do arroz, com cerca de 430 milhões de bases. A estratégia atual está sendo estudar e caracterizar os sistemas gênicos em genomas pequenos (arabidopsis e arroz) e, considerando a sintenia existente, inferir sobre os genomas grandes (milho – 2 500 Mpb, trigo – 16 000 Mpb e cevada - 4 800 Mpb, por exemplo). Características de um Genoma Modelo A presença de determinadas características numa espécie pode torná-la altamente atraente para a ciência. Sob esse enfoque, as características mais atraentes numa espécie vegetal, as quais poderão contribuir para que ela se torne um modelo, estão relacionadas com a duração do ciclo, com o número de sementes produzidas, com o tamanho do seu genoma, com a capacidade de multiplicação em diferentes ambientes, com a facilidade de manipulação da polinização (direcionamento de cruzamentos), com a capacidade de cultivo in vitro e com a disponibilidade de informações já existentes (banco de dados para a espécie). Essas características geralmente definem a facilidade de se obterem resultados, bem como o seu volume e sua qualidade. A primeira espécie vegetal utilizada como modelo para estudos genéticos foi a ervilha (Pisum sativum L.), quando Gregor Mendel publicou os resultados dos primeiros estudos genéticos, no ano de 1865. É lógico que naquela época Mendel não considerou os critérios utilizados atualmente, mas certamente escolheu a ervilha pela familiaridade que ele tinha com o cultivo daquela espécie. Embora as leis de Mendel não tenham sido validadas até o seu redescobrimento, no início do século XX, cons- tituíram a base científica dos estudos realizados até hoje. Na história recente da Biologia de Plantas, uma outra espécie apresentava muitas características atraentes e surgia como modelo entre as dicotiledôneas; tratava-se da Arabidopsis thaliana. Essa espécie vegetal é membro da família Brassicaceae, a qual inclui espécies cultivadas como o repolho, o rabanete e a canola. Embora a arabidopsis não possua importância agronômica, essa espécie apresenta vantagens importantes para a pesquisa básica em genética e biologia molecular. Além disso, ou como conseqüência disso, essa espécie possui o maior volume de informação disponível dentre todos os vegetais. No entanto, o modelo genético Arabidopsis thaliana limitava-se principalmente ao sistema genético das dicotiledôneas, quando um complemento para as monocotiledôneas começou a ser procurado. Nos últimos anos, está sendo dispensada muita atenção a uma outra espécie, o arroz (Oryza sativa L.), por ele possuir também bons atributos para se tornar um modelo genético vegetal. Embora seu genoma seja pouco maior, cerca de três vezes maior que o genoma de Arabidopsis thaliana L., ainda assim é cerca de 40 vezes menor do que o genoma do trigo (Triticum aestivum L.). Entretanto, a estratégia de direcionar os esforços para tornar o arroz um genoma modelo está alicerçada no interesse de se obter um modelo entre as gramíneas, principalmente aquelas produtoras de grãos, pois, praticamente, todas as ações dos programas de melhoramento de plantas estão voltadas para produtividade, resistência a moléstias e adaptabilidade. Outro fator fundamental no interesse de tornar o arroz um genoma modelo é a existência de sintenia ou colinearidade entre os genomas dessa família. Atividades voltadas para a identificação e a clonagem de genes com a utilização de genomas modelos, como o arroz, são bem mais eficientes do que em genomas grandes. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 47


Portanto, atualmente a estratégia mais racional será estudar o arroz, identificar, clonar e caracterizar seus genes e, quando tudo estiver mensurado, atingir os genomas mais complexos, como os do trigo e do milho. Dessa forma, os programas de melhoramento de plantas poderão aumentar em muito sua eficiência. A particularidade que o arroz possui, de ser cultivado sob irrigação por inundação (várzeas) e sequeiro (terras altas), também torna essa espécie modelo para o entendimento dos mecanismos que controlam a adaptabilidade das plantas. O Centro de Genômica e Fitomelhoramento (CGF) da UFPel está buscando, mediante a utilização de tecnologias modernas, o entendimento do sistema de raízes do arroz (modelo genético). A identificação de mecanismos morfofisiológicos e os respectivos controles genéticos permitirão a identificação e a clonagem dos genes envolvidos. A sintenia e a utilização de ferramentas genômicas adequadas conduzirão à rápida utilização desse conhecimento para o desenvolvimento e lançamento de genótipos superiores, de diversas espécies que poderão ser adaptadas aos solos encharcados do sul do Brasil. Seqüenciamento de Genomas Os primeiros passos para o seqüenciamento de DNA foram dados por Sanger, em 1977, com o desenvolvimento do método de seqüenciamento manual conhecido também como método da cadeia interrompida. Hoje o método de Sanger baseiase na amplificação, por PCR, de fragmentos de DNA clonados previamente dentro de vetores conhecidos. Dessa forma, oligonucleotídeos iniciadores (primers), complementares à seqüência do vetor, são utilizados para amplificar o inserto do DNA a ser seqüenciado. A metodologia foi chamada de “cadeia interrompida” em função de que são utilizados dNTPs (deoxi-Nucleotídeos Trifosfatos) modificados, os ddNTPs (dideoxi-Nucleotídeos Trifosfatos), os quais, quando incorporados pela enzima Taq polimerase (a enzima que amplifica o DNA), não permitem a inclusão do nucleotídeo seguinte por não apresentarem a hidroxila no carbono 3 da dideoxi-ribose do nucleotídeo terminador. Portanto, a síntese da molécula de DNA pára nesse ponto (Figura 3). Pelo método de Sanger, o processo de seqüenciamento é realizado em quatro reações independentes. Em cada uma delas é adicionado um ddNTP diferente (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP), geralmente marcados radiativamente com 32 P. Na cópia de cada fita de DNA, a partir do molde, as moléculas são sintetizadas até que incorporem o nucleotídeo terminador (ddNTP). O acúmulo de moléculas terminadas numa mesma base possibilita sua visualização no gel. A geração aleatória de moléculas terminadas nas bases distintas de uma fita molde de DNA permitirá o estabelecimento da seqüência de nucleotídeos do referido molde. A leitura da seqüência de bases é realizada mediante a separação, num gel de poliacrilamida de alta resolução, dos fragmentos amplificados por PCR. Nesse tipo de técnica, é possível identificar cerca de 200 a 300 nucleotídeos. A Figura 3 apresenta um esquema sintetizado dessa metodologia. 48 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 3 – Esquema representativo do método de seqüenciamento desenvolvido por Sanger (A) e do método de seqüenciamento automatizado (B). Consulte o texto para conferir os detalhes de cada método. Na última década, o surgimento dos seqüenciadores automáticos, aliado à elevada capacidade de processar informações que a informática proporcionou, revolucionou a genômica, dando origem a bioinformática. O seqüenciamento automático mantém o mesmo princípio do método de seqüenciamento manual proposto por Sanger, mas a possibilidade de utilizar ddNTPs marcados fluorescentemente com cores distintas para cada um deles (ddCTP, ddGTP, ddATP e ddTTP) permitiu automatizar o processo (veja Figura 3). Outra grande vantagem do seqüenciamento automático é a incorporação de metodologias laser e programas computacionais que fazem a leitura dos resultados. As moléculas fluorescentes utilizadas nos ddNTPs, quando sensibilizadas pelo laser, emitem um comprimento de onda, que é capturada por uma câmera acoplada ao seqüenciador. A informação é processada e transformada em seqüências nucleotídicas por softwares adequados. Devido à baixa capacidade de produção proporcionada pelo método de Sanger, as primeiras seqüências nucleotídicas foram geradas para estudos pontuais, como o estabelecimento da seqüência de alguns genes e de pequenas regiões cromossômi-


Figura 4 – Detalhes de um exemplar de Arabidopsis thaliana L. cultivado em laboratório. Cortesia Dra. M. E. Alvarez. CIQUIB – CONICET, Universidad Nacional de Córdoba – Argentina. cas. À medida que foram desenvolvidos os seqüenciadores de nucleotídeos automatizados, a capacidade de produção de seqüências foi aumentada muito rapidamente. Em função disso, surgiram, mediante a associação de grupos de pesquisa, várias iniciativas voltadas para o seqüenciamento de alguns genomas. Os primeiros esforços foram direcionados para alguns microorganismos e, em seguida, para a Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative*, 2000) e para a Drosophila melanogaster (ADAMS et al., 2000), dois organismos utilizados como modelo na biologia. Na seqüência, apresentaremos o que já foi realizado com o intuito de gerar informações genéticas das principais espécies, com vistas ao melhoramento vegetal. Arabidopsis thaliana - o genoma da Arabidopis (125 milhões de nucleotídeos – 125 Mpb) foi seqüenciado por uma associação internacional de pesquisadores cha- Figura 5 – Esquema representativo das principais etapas na geração de bibliotecas de seqüenciamento. A – Para seqüenciamento estrutural via construção de biblioteca BAC (Bacterial Artificial Chromosomes). 1 – DNA genômico; 2 – Alinhamento de fragmentos de 100 a 200 kb em mapa físico (Biblioteca BAC); 3 – Fragmentação individual dos BACs; 4 – Subclonagem de fragmentos entre 2 e 5 kb. B – Para seqüenciamento de ESTs (Expressed sequence tags) ou do transcriptoma. 1 – Extração de RNA mensageiro; 2 – Síntese reversa utilizando RT-PCR; 3 – Síntese de cDNA dupla fita; 4 – Clonagem dos cDNAs. mada de Iniciativa Genoma da Arabidopsis (The Arabidopsis Genome Initiative * , 2000). A seqüência, o mapa e as anotações disponíveis atualmente são resultado de esforços conjuntos do TIGR (The Institute for Genomic Research), MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences) e TAIR (The Arabidopsis Information resource). Veja uma foto dessa espécie vegetal observando a Figura 4. Arroz (Oryza sativa L.) – Foram empregados esforços públicos e privados para seqüenciar essa espécie. O primeiro esforço privado foi realizado pela Monsanto (PENNISI, 2000). Mais tarde, os resultados gerados seriam somados aos resultados do IRGSP (International Rice Genome Sequencing Project). O segundo esforço privado, uma associação entre duas empresas, a Myriad Genetics e a Syngenta, utilizou o método whole genome shotgun, e não acrescentou resultados significativos ao conjunto de dados disponibilizados pelos outros projetos (GOFF et al., 2002). Foram implementados também dois esforços públicos para o seqüenciamento do arroz. O primeiro deles, o Projeto Internacional de Seqüenciamento do Genoma do Arroz (IRGSP – International Rice Genome Sequencing Project), teve como objetivo seqüenciar a subespécie japonica. Essa associação teve início no ano de 1997, em uma reunião do Simpósio Internacional de Biologia Molecular de Plantas realizado em Singapura. Naquela ocasião, o objetivo da comunidade científica era socorrer o idealizador do projeto de seqüenciamento estrutural do arroz, o RGP (Rice Genome Project) do Japão. O segundo esforço público foi liderado pela Academia Chinesa de Ciências (Chinese Academy of Sciences) de Beijing, China. Esse projeto iniciou-se em abril de 2000 e, dois anos mais tarde, seus resultados foram publicados pela revista Science (YU et al., 2002). A grande distinção estabelecida entre as subespécies seqüenciadas por esses dois esforços públicos foi em relação à importância econômica e geográfica que elas apresentam. A subespécie seqüenciada pelo grupo liderado pelos japoneses, spp japonica, é amplamente cultivada no Japão, nos Estados Unidos, na Coréia do Sul e em parte da China. Por outro lado, a subespécie seqüenciada pelos chineses, spp indica, é bastante cultivada na China e no Sudeste Asiático, bem como no Sul do Brasil. Além disso, as estratégias de seqüenciamento utilizadas pelos dois grupos foram distintas; enquanto o grupo dos chineses focava a anotação de genes, pois utilizou a estratégia whole genome shotgun, o grupo liderado pelo RGP Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 49


Figura 6 – Detalhes de uma lavoura de arroz irrigado do cultivar BRS 7 “Taim”. Cortesia Prof. Silmar Peske. Figura 7 – Detalhes de uma lavoura de trigo (Triticum aestivum). Cortesia Prof. Silmar Peske. focou, além da anotação dos genes, a geração de informações precisas ao nível de estruturação e organização do genoma, pois utilizou a técnica de seqüenciamento estrutural via construção de bibliotecas BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Figura 5 A). Veja uma foto dessa espécie vegetal observando a Figura 6. Trigo (Triticum aestivum) – os esforços para determinar a seqüência de nucleotídeos do trigo depararam-se com duas grandes barreiras. A primeira delas se refere ao tamanho do genoma, que é, aproximadamente, de 16 bilhões de nucleotídeos (16.000 Mpb) - cerca de 40 vezes maior que o genoma do arroz. A segunda delas é que o seu genoma é diferente do do arroz e da arabidopsis, ambos diplóides, enquanto o trigo é hexaplóide. Esses impedimentos impuseram uma estratégia preliminar para que fossem determinadas as seqüências transcritas: o transcriptoma (bibliotecas de cDNA) de diferentes estádios do desenvolvimento da planta (Figura 5 B) Portanto, considerando a estrutura e o tamanho do genoma do trigo essa ação é mais lógica do que pensar num inexeqüível projeto de seqüenciamento estrutural dessa espécie. De uma forma geral, a estratégia visa a gerar seqüências nucleotídicas dos genes transcritos em determinados estádios de desenvolvimento ou sob determinados estresses do ambiente. O esboço de uma associação internacional voltada para a geração dessas informações começou a ser definido em 1998, com a criação de uma ação Internacional Cooperativa para a produção de ESTs (Expressed Sequence Tags) de trigo. Atualmente, as ações 50 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 8 - Detalhes de uma lavoura de cevada (Hordeum vulgare), safra 2003, da Linhagem CEV 97043 da propriedade do Produtor Adelar Crespi. com a intenção de determinar a posição no mapa dos transcritos são coordenadas pelo International Triticeae Mapping Initiative. Os principais esforços para a criação de uma coleção de ESTs representativos do trigo estão sendo liderados pelos EUA (U. S. Wheat Genome Project), pelo Canadá (AAFC – Agriculture and Agri-Food Canada) e pela Inglaterra (BBSRC – Biotechnology and Biological Sciences Research Council). Veja uma foto dessa espécie vegetal observando a Figura 7. Cevada (Hordeum vulgare) – os esforços para determinar a seqüência de nucleotídeos da cevada também sofrem impedimentos devido ao tamanho do seu genoma ~ 4,8 bilhões de nucleotídeos (4800 Mpb). O primeiro passo para contornar esse impedimento foi a produção de mapas físicos do genoma da cevada com alta densidade de marcadores; isso proporcionará a realização de comparações com o genoma do arroz. O próximo passo será a criação do transcriptoma da espécie. Essas decisões estão sendo implementadas em um esforço combinado entre cientistas da América do Norte (North American Barley Genome Mapping


Figura 9 – Detalhes de uma lavoura de milho (Zea mays) e de espigas maduras (direita inferior). Cortesia Prof. Silmar Peske. Project, USA e North American Barley Genome Mapping Project, Canadá) e da Europa (Plant Genome Resource Centre, Alemanha e Scottish Crop Research Institute, Inglaterra), para criar uma biblioteca de ESTs (Expressed Sequence Tags) o mais completa possível (Figura 5 B). Veja uma foto dessa espécie vegetal observando a Figura 8. Milho (Zea mays) – a principal iniciativa para seqüenciamento do genoma do milho foi anunciada em setembro de 2002 pelo NFS (National Science Foundation) dos Estados Unidos. No entanto, há muito tempo os geneticistas da área do milho buscavam somar esforços com esse objetivo (BENNETZEN et al., 2001). Quatro fatores contribuíram para que essa iniciativa fosse retardada até 2002. Primeiro, os avanços na tecnologia de seqüenciamento reduziram consideravelmente o custo em comparação com o passado. Segundo, novas metodologias de fingerprinting, de alta resolução e produção, permitiram aumentar a eficiência na seleção de clones para o seqüenciamento, reduzindo ao mínimo a sobreposição de regiões seqüenciadas. Terceiro, foram desenvolvidas novas metodologias para preparar frações do genoma do milho ricas em genes (YUAN et al., 2002). Quarto, análises comparativas do milho com o arroz (Oryza sativa) ou Arabidopsis sugerem que a seqüência do genoma dessas duas espécies não serão suficientes para entender detalhadamente o conteúdo de genes do milho e sua expressão (BENNETZEN et. al., 2001; CHANDLER & BRENDEL, 2002). Além disso, algumas características no genoma do milho sempre dificultaram a implementação de projetos de seqüenciamento da espécie. Destaca-se a existência de várias subespécies importantes (Zea mays spp. Huehuetenangensis, Zea mays spp. mays (mayze), Zea mays spp. mexicana (teosinto), e Zea mays spp. Parviglumis); o elevado conteúdo de DNA repetitivo (regiões duplicadas) presente no genoma do milho (HELENTJARIS, 1995) e o tamanho do seu genoma, cerca de 2500 Mpb. Da mesma forma que está ocorrendo na geração de seqüências nucleotídicas da cevada e do trigo, o foco para o milho também será a geração de seqüências dos genes (o transcriptoma). As interações do sistema gênico poderão ser obtidas em genomas como o arroz, principalmente devido à ocorrência da sintenia entre os cereais. Veja uma foto dessa espécie vegetal observando a Figura 9. Reflexos da Tecnologia na Produção de Cereais Os grandes avanços na produção mundial de grãos, gerados a partir de meados do século passado, são decorrentes de uma contribuição decisiva do melhoramento clássico de plantas (BORLAUG, 1983). Ao contrário do que alguns entusiastas esperavam, as grandes expectativas decorrentes das inovações científicas dos últimos 30 anos não se refletiram em significativos incrementos na produção de grãos. Para que as tecnologias moleculares possam render os resultados esperados, algumas barreiras precisam ser superadas. A principal delas diz respeito à mudança de cultura nos programas de melhoramento de plantas, sendo necessário selecionar genes ao invés de selecionar plantas (KOORNNEEF & STAM, 2001). Superadas as barreiras culturais, a eficiência na implementação de ferramentas moleculares em programas de melhoramento de plantas poderá ser incrementada mediante a automatização dos processos de extração de DNA, a geração de um maior número de seqüências ligadas (marcadores) a caracteres de importância agronômica e o barateamento dos equipamentos e insumos utilizados. O treinamento de novos melhoristas também deverá merecer atenção especial, pois, além da sólida formação em melhoramento clássico e em estatística, é recomendado que esses profissionais sejam treinados em genética molecular e técnicas moleculares aplicadas ao melhoramento de plantas. Principalmente por que é através desses novos profissionais que os programas de melhoramento clássicos poderão incorporar as novas ferramentas da biologia molecular. O setor de melhoramento de plantas também necessita se articular para melhorar a capacidade de processamento das informações já disponíveis, principalmente aquelas decorrentes dos diferentes projetos de seqüenciamento de genomas. Atualmente, dois fatores contribu- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 51


em para que as informações disponíveis não sejam aplicadas rotineiramente. A primeira delas é que há carência de bons sistemas de informática capazes de trocar informações com os bancos de dados com a agilidade requerida; a segunda é que poucos profissionais estão habilitados a realizarem buscas e a fazerem comparações de seqüências através de computadores. Buscando alternativas para compor o sistema agrícola das várzeas do Sul do Brasil, sugerimos a implementação de ferramentas moleculares e de bons sistemas de informática para os programas de melhoramento locais. Essas ações devem estar voltadas para a: i) identificação de genes de tolerância a estresses abióticos em genomas “modelo” (arroz), com posterior caracterização em espécies de interesse (trigo, milho, cevada, sorgo, aveia e azevém); ii) caracterização molecular do germoplasma local; iii) identificação de “genes maiores”, responsáveis pela adaptação do arroz ao encharcamento; e, iv) criação de um banco de mutantes para o sistema de raízes. Refrências Bibliográficas ADAMS, M.D.; et al., The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science, v. 287, n.5461, p. 2185-2195, 2000. BENNETZEN, J.F.; SAN MIGUEL, P.; CHEN, M.; TIKHONOV, A. Grass genomes. Proceedings of the National Academy of Science. v. 95, pp. 1975-1978, 1998. BENNETZEN, J.L.; CHANDLER, V.S.; SCHNABLE, P. National Science Foundation-Sponsored Workshop Report. Maize Genome Sequencing Project. Plant Physiology, v. 127, p. 1572-1578, December, 2001. BORLAUG, N.E. Contribution of Conventional Plant Breeding to Food Production. 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Pesquisa Paulo Henrique Machniewicz Biólogo - Faculdades Integradas “Esprírita” Especialista em Genética Humana PUC-PR, Responsável pelos laboratórios de Genética, Imunologia e Microbiologia do Centro Universitário Campos de Andrade - UniAndrade - Curitiba-PR paulo.mach@bol.com.br Fábio Rueda Faucz, Dr Biologo - UFPR Mestrado em Ciências Biológicas - UFPR Doutorado em Genética - UFPR Professor adjunto - PUC-PR Professor Titular - UNICEMP-PR fabiogenetica@yahoo.com Ilustrações cedidas pelos autores Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 Associação de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 causadoras do câncer de mama hereditário Resumo Cerca de 10% dos cânceres de mama podem ser associados a mutações na linhagem germinativa. Em 1990, foi identificado, no cromossomo 17, o gene BRCA1, composto de 24 exons e codifica para uma proteína de 1.863 aminoácidos. Mutações neste gene são responsáveis por metade de todos os casos familiares de câncer de mama. Já em 1995, identificaram o BRCA2, com 27 exons, codificando para uma proteína de 3.350 aminoácidos. Este gene encontra-se no cromossomo 13. Mutações neste gene são responsáveis por cerca de 35% dos casos familiares precoces de câncer de mama. Estes dois genes, associados a outras proteínas, desencadeiam a doença que mais mata mulheres. No Brasil, registram-se cerca de 35.000 novos casos de câncer de mama por ano. O câncer representa uma proliferação maligna das células ou lóbulos epiteliais que revestem os ductos ou lóbulos da mama. O câncer feminino é raramente encontrado antes dos 25 anos de idade, exceto em casos hereditários. A transmissão hereditária de câncer de mama segue o clássico padrão mendeliano de transmissão autossômica dominante, com 50% das crianças de carreadoras, herdando mutações BRCA1. As portadoras femininas de mutações são estimadas a terem um risco de 85% de desenvolvimento de câncer de mama e ovário, com maior incidência de câncer bilateral e mais de 50% dos cânceres de mama, ocorrendo, antes dos 50 anos. A prevalência de mutações de BRCA1 e BRCA2 é ocasionalmente mais alta que o esperado, devido à transmissão aumentada de algumas mutações, em certas populações, devido ao efeito do fundador. A população de Judeus Askenazi é a que representa um exemplo claro de mutações, devido ao efeito do fundador, por cultivarem suas tradições de união restrita. Por conseqüência, as mutações encontradas nesta população são iguais em inúmeros países para onde migraram. Outras populações, como Espanhóis, Indianos, Paquista-neses, Russos e até tribos Aborígines do Canadá, também apresentam algumas mutações que são mais freqüentes e que podem ser atribuídas ao efeito do fundador. 1. Introdução O nosso organismo é constituído por trilhões de células, que se reproduzem pelo processo de divisão celular. Este é um processo ordenado e controlado, responsável pela formação, crescimento e regeneração de tecidos saudáveis do corpo. Algumas vezes, no entanto, as células perdem a capacidade de limitar e comandar seu próprio crescimento, passando, então, a se multiplicarem muito rapidamente e de maneira aleatória e desordenada, formando nódulos. O câncer surge por causa de alterações no DNA, que resulta na proliferação incontrolável de células. A maioria dessas alterações envolve modificações seqüenciais reais de DNA. Elas podem surgir como conseqüência de erros de replicação aleatórios, exposição a carcinógenos, ou processos defeituosos de reparo do DNA. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 53


As lesões da mama limitam-se, predominantemente, ao sexo feminino por possuir uma estrutura mamária mais complexa, volume mamário maior e extrema sensibilidade às influências endócrinas predispõem esse órgão a diversas condições patológicas (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2001). As neoplasias constituem as lesões mais importantes da mama feminina, apesar de não serem as mais comuns. Elas podem surgir a partir de epitélio escamoso, estruturas glandulares e tecido conjuntivo. Existem três grupos de influências importantes no câncer de mama: • Fatores genéticos; • Influências hormonais; • Fatores ambientais. No Brasil, registram-se 35.000 novos casos de câncer de mama por ano, 11.000 deles, só no Estado de São Paulo. Fatores de risco de câncer na família, alimentação rica em gorduras, início precoce da menstruação, menopausa tardia, 1ª gestação após os 30 anos e o fato de a mulher nunca ter engravidado são alguns dos fatores que influenciam para desenvolver um tumor maligno na mama. O câncer de mama representa uma proliferação maligna das células epiteliais que revestem os ductos ou lóbulos da mama. É considerado o mais comum em mulheres, podendo existir por um longo período, como doença não-invasiva ou invasiva, mas não-metástica. Este fato torna-se mais urgente a necessidade do diagnóstico precoce e da conduta apropriada. Cerca de 10% dos cânceres de mama podem ser associados a mutações na linhagem germinativa. Esta área tem sofrido uma elevação notável com a identificação de genes responsáveis por casos em famílias (BATES, HOCKELMAN, 1982 ). KING, et al. (1990), usou análise genética de ligação para identificar o gene BRCA1 localizado no cromossomo 17q21. Ele é responsável por aproximadamente metade de todos os casos familiares precoces de câncer de mama, bem como pela maioria dos casos familiares de câncer de mama e ovário. SCHUTTE, et al. (1995), identificou um gene na região 13q12-q13, com seis mutações diferentes em famílias com câncer de mama e identificou como BRCA2. Mutações nesse gene são responsáveis por aproximadamente 35% dos casos familiares precoces de câncer de mama. Estão ainda associados a um risco aumentado de câncer de mama e de próstata em homens, e de câncer ovariano e pancreático. Estes dois genes associados a outras proteínas desencadeiam a doença que mais mata mulheres. Para que se tenha uma avaliação precisa do risco de desenvolver um câncer é necessário que se obtenha uma história da paciente, uma genealogia do câncer precisa, onde é possível confirmar os tipos de cânceres através de documentos hospitalares e exames. Devido aos altos custos e dificuldades para testar mutações em BRCA1 e BRCA2, são realizadas provas nas mutações mais prováveis nas populações. Nas famílias de Judeus as três principais mutações de fundador mais freqüentes, 185 del AG, 5382 ins C em BRCA1 e 617 del T em BRCA2. Estas três mutações mais freqüentes respondem por mais de 90% da população. Quando uma mutação de fundador é encontrada, esta já é suficiente para autorizar a blindagem para todos as três mutações (BAST, et al 2000). 2. Localização da mama A mama está localizada entre a 2ª e a 6ª costela, entre a margem esternal e a linha medioaxilar. O tecido mamário possui três componentes principais: • Tecido glandular: é organizado em 12 a 20 lobos, onde cada qual termina num canal que se abre na superfície do mamilo. • O tecido glandular é sustentado por tecido fibroso, incluindo os ligamentos suspensórios que estão conectados tanto à pele quanto à fascia que fica por debaixo da mama. • A gordura circunda a mama e predomina tanto superficialmente, quanto na periferia (SPENCER, 1991). 54 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Os vasos linfáticos de grande parte da mama drenam para a axila. A borda anterior da axila é formada pelos músculos peitorais; as bordas posteriores incluem o subescapular e o grande dorsal; a borda interna pelo quadril cortal e músculo denteado anterior; e a borda externa pela parte superior do braço. Os gânglios axilares na parte alta da axila, perto das costelas e do denteado anterior. Para dentro deles, drenam canais provenientes de três outros grupos de gânglios linfáticos: 1. o grupo peitoral ou anterior; 2. o grupo subescapular (posterior); 3. o grupo lateral; Convém observar que nem todos os linfáticos da mama drenam para a axila. Dependendo da localização de uma lesão no seio, a disseminação pode se processar diretamente para os gânglios infraclaviculares, para dentro dos canais profundos existentes no interior do tórax ou do abdômen, e até para a mama oposta (BATESE, HOCKENAM, 1982). Na glândula mamária, os lobos possuem muitas subdivisões que são chamadas de lóbulos; estes terminam em dezenas de pequenos bulbos produtores de leite. Os lobos, lóbulos e bulbos são interligados por tubos finos denominados ductos. Estes ductos vão até o mamilo (papilo), localizado no centro da área escura da pele que se chama auréola. Somente com o início da gravidez é que a mama assume a maturação morfológica e atividade funcional completa. Após a cessação da lactação, os lóbulos regridem e sofrem atrofia, havendo uma redução notável no tamanho total da mama. A maioria das neoplasias mamárias não contém tecido adiposo e, em exames como a mamografia, elas aparecem como massas de maior densidade, contrastando com o estroma circundante. Por conseguinte, a mamografia é menos sensível em mulheres jovens, nas quais essas massas podem ser obscurecidas por tecido denso circundante (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2001).


3. Sinais visíveis de Câncer Mamário BATES, HOCKELMAN, (1982) descreveram alterações na mama que caracterizam um tumor, entre elas destacam-se: • Produção de fibrose, ou formação de tecido cicatricial; • Sinais de retração que incluem covas cutâneas, alterações nos contornos mamários e achatamento ou desvio do mamilo; • Aparecimento de nódulo ou endurecimento da mama ou embaixo do braço; • Mudanças no tamanho e ou formato da mama; • Alteração na coloração ou na sensibilidade da pele da mama ou da auréola; • Secreção contínua por um dos ductos; • Retração da pele da mama ou do mamilo; • Inchaço significativo ou distorção da pele. • As alterações no contorno são identificadas por inspeção cuidadosa das superfícies normalmente convexas das mamas e comparando uma mama com a outra. • Edema de pele, produzindo por bloqueio linfático. 4. Classificação dos tipos de Câncer de Mama O câncer de mama é subdividido em dois grandes grupos: • Carcinomas: que podem ser diferenciados em câncer lobular onde começa nos bulbos (pequenos sacos que produzem leite); ou câncer dos ductal, que se formam nos ductos que levam o leite dos lóbulos para o mamilo (papila). • Sarcomas: formam-se nos tecidos conjuntivos, onde é mais comum o câncer se dissipar para outras partes do corpo. O carcinoma é o mais comum. Ele é mais comumente encontrado e diagnosticado na mama esquerda do que na mama direita. Os cânceres são bilatérias ou seqüenciais na mesma mama em 4% ou mais dos casos. Entre os carcinomas de mama pequenos o suficiente para identificar sua área de origem, cerca de 50% surgem no quadrante superior externo, 10% em cada um dos quadrantes restantes e cerca de 20% na região central ou subareolar, o local de origem influência de modo considerável o padrão de metástase linfonodal. Os carcinomas são divididos em carcinomas não–inflitrantes ou in situ e carcinomas inflitrantes. ♦ Carcinomas in situ: • Carcinoma ductal in situ; • Carcinoma lobular in situ; ♦ Carcinomas Invasivos (infiltrante): • Carcinoma ductal infiltrante sem tipo específico; • Carcinoma lobular invasivo ou infiltrante; • Carcinoma medular; • Carcinoma colóide; • Carcinoma tubular; • Carcinoma papilar invasivo. 5. Estágios de desenvolvimento do Câncer de Mama Os diferentes tipos de câncer de mama, quando são diagnosticados e confirmados com exame laboratorial, são classificados conforme o seu tamanho e presença de metástases nos linfonodos e a distância. Esta classificação foi criada para que o médico possa saber indicar qual o tratamento mais adequado para o paciente ( HARRISON, et al. 1998 ). • TX: tumor primário que não pode ser demonstrado. • T0: não existe evidência de tumor primário. • TIS carcinoma in situ: carcinoma intraductal e carcinoma lobular in situ. • T1: tumor de até 2 cm. • T1a: tumor de até 0,5 cm. • T1b: tumor 0,5 > 1 cm. • T1c: tumor 1cm > 2 cm. • T2: tumor com mais de 2 cm e menos de 5 cm. • T3: tumor com mais de 5 cm. • T4: tumor de qualquer tamanho com possível extensão direta a parede do tórax. • T4a: extensão a parede do tórax. • T4b: edema, ou ulceração, ou nódulos satélites na parede da mesma mama. • T4c: quando encontra-se T4a e T4b. • T4d: carcinoma inflamatório. Gânglios Linfáticos (N) • NX: quando não se pode afirmar o comprometimento dos gânglios. • N0: sem metástase em gânglios regionais. • N1: metástase em gânglios axilares unidos uns aos outros e a outras estruturas. • N3: metástase em gânglios linfáticos da mama interna. Classificação Patológica • PNX: quando não se pode excluir a presença de gânglios. • PN0: sem metástase em gânglios regionais. • PN1: metástase em gânglios regionais laterais móveis. • PN1a: somente micrometástases < 0,2 cm. • PN1b: metástase em gânglios maiores de 0,2 cm. • PN1b1: metástase de 1 a 3 gânglios > 0,2 < 2 cm. • PN1b2: metástases de 4 ou mais gânglios > 0,2 a < 2 cm. • PN1b3: quando atravesa a parede do gânglio < 2 cm. • PN1b4: metástase a gânglios linfáticos de 2 cm ou massa e dimensão maior. • PN2: metástase em gânglios axilares unidos uns aos outros e a outras estruturas. • PN3: metástase em gânglios linfáticos da mama interna. Metástase a Distância (M) • MX: presença de metástase à distância, mas que não pode ser demonstrado. • M0: não há evidência de metástase à distância. • M1: presença de metástase supraclaviculares. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 55


São considerados cinco estágios de desenvolvimento de tumor segundo o Comitê Americano de Câncer. • Estágio 0:Carcinoma ductal in situ e carcinoma lobular in situ. Sem evidência de tumor nos linfonodos e metástase à distância. • Estágio 1: Quando o tumor tem até 2 cm , mas sem qualquer evidência de ter se espalhado pelos gânglios linfáticos próximos. • Estágio 2: Inclui tumores de até 2 cm, mas com envolvimento de gânglios linfáticos, ou, então, um tumor primário de até 5 cm, com linfonodos axilares afetados, porém móveis, sem metástase à distância, ou tumor com mais de 5 cm sem comprometimento linfonodal nem metástases distantes. • Estágio 3: Quando o tumor tem mais de 5 cm e há envolvimento dos gânglios linfáticos da axila do lado da mama afetada. • Estágio 4: Quando existem metástases distantes, como no fígado, ossos, pulmão, pele ou outras partes do corpo. 6. Frequência e epidemiologia O câncer de mama feminino é raramente encontrado antes dos 25 anos de idade, exceto em casos familiares. A idade habitual que se identifica gira em torno dos 30–80 anos, sendo mais comum na meia idade e velhice. Encontra-se entre as doenças mais comuns e a que mais mata mulheres no Brasil. Dados do Instituto Nacional do Câncer –I NCA mostram que foram diagnosticados neste ano cerca de 30 mil casos novos e oito mil morreram por causa da doença. Este tipo de tumor foi considerado o 3º que mais mata no Brasil. A obtenção de uma história familiar constitui um fator de risco para desenvolvimento do câncer de mama; 5 a 10% dos casos são atribuíveis á herança de um gene autossômico dominante. A probabilidade de herança genética aumenta se houver vários parentes afetados e se for constatada a ocorrência do câncer numa idade jovem. Dois genes são responsáveis pela maioria dos cânceres de mama hereditário: o BRCA1 e BRCA2. O BRCA1, localizado no cromos-somo 17, quando mutante, é capaz de produzir alto risco (talvez até 85% ao longo da vida) de câncer de mama e também de câncer ovariano (talvez50% de risco ao longo da vida). Cerca de 1/500 mulheres carregam uma mutação BRCA1 na linhagem germinativa, com freqüência, dando origem a uma história familiar consistente. Homens com mutações BRCA1 podem ter um aumento modesto no risco de câncer de próstata. “... há uma série de heterogeneidade mutacional descrito para o BRCA1, como em geral é o caso nos distúrbios genéticos. Uma exceção são as populações Judia Askenazi, em que um de 100 indivíduos carregam uma deleção 2-pb particular a 185 del AG no BRCA1.” 1 Mutações em outro gene no cromossomo 13, o BRCA2 também confere alto risco de câncer de mama, e um risco um pouco menor de câncer ovariano; em homens essas mutações também os tornam propensos ao desenvolvimento de câncer de mama. “Estima-se que a freqüência das Mutações BRCA 2 seja cerca da metade da freqüência do BRCA 1 . Cerca de 1% de Judeus Askenazi outra vez tem uma mutação comum há 6174 del T .” 2 A incidência global do câncer de mama é menor em mulheres negras. As mulheres nesse grupo desenvolvem câncer com uma idade mais avançada e apresentam um aumento da taxa de mortalidade, em comparação com as caucasóides. Os Estados Unidos e a Europa Setentrional apresentam a maior incidência da doença. Tumores de mama associados ao BRCA1 são mais prováveis em mulheres com filhos, possuem uma 56 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 fase S maior, e quantidade elevada de estrógeno e baixos receptores de progesterona. 7. Hereditariedade A transmissão hereditária de câncer de mama segue o clássico padrão mendeliano de transmissão autossômica dominante, com 50% das crianças de carreadoras herdando mutações BRCA1. As portadoras femininas de mutações são estimadas a ter um risco de 85% de desenvolvimento de câncer de mama e/ou ovariano, com uma maior incidência de câncer bilateral e mais de 50% dos cânceres de mama ocorrendo antes dos 50 anos. (BIESECKER, et al. 1993). “... o câncer de mama genético incide, geralmente, em mulheres jovens, antes dos 50 anos de idade. A ocorrência de mais de 2 casos em uma família de mulheres jovens, com menos de 50 anos, sugere que existe a possibilidade de que seja um defeito genético na família. Além disso, estes tumores costumam ser bilaterais; é freqüente que surjam nas duas mama, ás vezes não ao mesmo tempo. A ocorrência de múltiplos casos em mulheres jovens de tumores bilaterais, chama a atenção para que esta seja pela falta de risco . Outro sinal se dá pelo fato de o câncer de mama estar associado, nestes casos genéticos, ao câncer de ovário. A incidência, em uma mesma família, de uma mutação genética que predisponha à ocorrência do câncer. Estes casos constituem, aproximadamente, de 6% a 10% dos casos genéticos de câncer de mama. De 90% a 94% não temos uma história familiar.” 3 CROOP, et al (1990), constataram que mutações na linhagem germinativa do BRCA1 são responsáveis por 2% a 4% de todos os cânceres mamários. Embora mais que 90% deles sejam casos esorádicos ocorrendo em mulheres sem evidências de susceptibilidade hereditária, análises de espécies de tumores mamá- _________________________________________________________________ 1 COLLINS,Francis S. 1998. 2 TRENT, Jeffrey M. 1998. 3 Revista Hands nº3 , 2002.


rios sugerem que anormalidades somáticas adquiridas no BRCA1 possam também desempenhar um papel em muitos desses cânceres. 8. Estudo de associação Os dois principais genes responsáveis pela transmissão hereditária do câncer de mama, o BRCA1 e BRCA2, codificam proteínas de 1.863 e 3.350 aminoácidos, respectivamente (Anexo 03). Ambos os genes são complexos formados por mais de 20 exons. O BRCA1 foi identificado no lócus 17q21. Este gene codifica uma proteína zíncica cujo produto pode, portanto, atuar como fator de transcrição. (FAUCI, et al 1998) descreveu que este gene possui 22 exons codificantes e 2 exons não-codificantes, estendendo-se por cerca de 100 kb de seqüência genômica. Seu produto é uma proteína de 1.863 aminoácidos. O BRCA2, localizado no cromos-somo 13q12-q13, está associado com uma maior incidência de câncer da mama em homens do que em mulheres, (FAUCI, et al 1998). Este gene possui 27 exons dispersos por 70 kb de DNA genômico, e seu transcrito estende-se por cerca de 10 à 12 kb codificando para uma proteína de 3.418 aminoácidos. Acredita-se que o BRCA1 e o BRCA2 se comportam como genes supressores de tumores clássicos, e que com a perda de uma cópia predispõem o portador ao desenvolvimento do câncer (BAST, et al. 2000). WOOSTER, et al. (1994), estudaram o acoplamento do genoma em 15 famílias com alto risco de câncer de mama no BRCA1 em 17q21. Esta análise descobriu um segundo lugar suscetível ao câncer de mama, o BRCA2 no cromossomo 13q12–q13. O estudo em BRCA2 confere um alto risco de câncer de mama e não confere um risco substancialmente elevado de câncer ovariano, como é o risco do BRCA1. Várias pesquisas indicaram uma associação entre BRCA1 e a proteína p53, e o encarecimento subseqüente de atividade de p53 incrimina BRCA1. O BRCA1 forma complexos com BRCA2 e Rad 51, que é homólogo do gene Rec A da E. coli em humanos e que é essencial à recombinação normal e estabilidade do genoma (BAST, et al 2000). O BRCA1 também pode fazer um papel de regulação na transcri- ção, controle do ciclo celular e desenvolvimento. O BRCA1 foi associado com a RNA polimerase holoenzima 32 e fita CREB33, que implica na regulação de transcrição. Em uma mulher que desenvolve câncer de mama, antes dos 40 anos, a chance que ela leva uma mutação em BRCA1 pode ser tão alta quanto 10%. O que não é aplicado para BRCA2, que pode ser associado a uma idade ligeiramente mais elevada. A prevalência de certas mutações de BRCA1 e BRCA2 é ocasionalmente mais alta que o esperado, devido à transmissão aumentada de algumas mutações, em certas populações, devido ao efeito do fundador (BAST, et al. 2000). Foram identificadas mutações de fundador características para BRCA1 e BRCA2 em famílias de Judeus Ashkenazi e de descendentes na Islândia, Finlândia, Hungria, Rússia, França, Holanda, Bélgica, Suécia, Dinamarca e Noruega. A maioria dos estudos realizados em BCRA1 e BCRA2 foram feitos em caucasóides dos Estados Unidos e Europa (BAST, et al. 2000). Significantemente, existem menos dados sobre as taxas de muta- Tabela 1: Quadro comparativo mostrand o as propriedades e funções dos genes BRCA1 e BRCA2 BCRA1 BCRA2 Cromo s omo 17q21 13q12 Gene 100kb 70kb Prote ína 1. 863 amino ácidos Compo nente da holoen zima RNA-polime rase 3. 418 amino ácidos Funçã o Supre s or tumo ral Inter age com Supre ssor tumo ral Inter age com prot eínas nucle ares Possí vel papel no prot eínas nucle aresP ossív el papel no repa ro do DNA repa ro do DNA Mutaçõ es > 500 identi ficadas > 200 identi ficadas Risc o de cânce r de mama Mais de 70% aos 80 anos de idade Mais de 60% aos 70 anos de idade Idade de iníci o Idade mais jovem ( quart a á quinta década de vida) 50 anos; mais idosa do que o BCRA1. Risc o de outro s tumo res Risc o de cânce r ovari ano de 30-60% aos Câncer de mama masc ulina , ovári o, 70 anos de idade Próst ata, cólon. bexig a, prós tata, pâncr eas. Mutaçõ es no cânce r não - famil iar M uito rara s ( < 5% ) < 5% Epidemi ologia Mutaçõ es especí ficas mais comun s em Mutaçõ es especí ficas mais comun s em alguns grupo s étnic os ( p. ex. , pres ença de uma muta ção em 20 a 30% dos cânce res de mama em mulhe res Judias Ashke nazi) . alguns grupo s étnic os Patolo gia dos cânce res de Maior incid ência : 13% de carc inoma s Tipos variá veis podend o depend er de mama medula res e tumo res de maior grau Carci noma ductal in situ meno s freqü ente. muta ções especí ficas. Fonte : COTRAN, R. S. ; KUMAR, V. ; COLLINS, T. 2001. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 57


ções de BRCA1 e BRCA2 em famílias de outros grupos étnicos e raciais (BAST, et al 2000). TRAVTIGIAN, et al (1996), observaram como o BRCA1, a proteína de BRCA2 é altamente carregada, ¼ dos resíduos é ácido ou básico. Porém, havia poucas pistas sobre a função bioquímica de BRCA2. Foram observados níveis mais altos de expressão em mama e timo, e ligeiramente níveis mais baixos em pulmão, ovário e baço. Em estudo de 18 famílias, em 9 foi observado a deleção de 3 nucleotídeos que altera a armação de leitura, e conduzem a mutilação da proteína BRCA2. Os autores notaram que o BRCA2 é notavelmente semelhante a BRCA1. Ambos possuem o exon 11 grande; em ambos a tradução começa no exon 2; ambos têm sucessões de codificação que são ricas em Adenina; e são compostos de aproximadamente 70 Kb de Dna genômico. O BRCA2 é composto de 27 exons. WEBER, et al. (1996), estudaram 3 exons de BRCA2 ( exons 10, 11 e 27) em 69 amostras aleatórias de tumor de mama congelados. Eles identificaram uma mutação somática truncada de BRCA2 em carcinoma ductal primário: deleção de 1 par de bases e substituídas pela adição de 9 aminoácidos modernos e terminação da tradução no códon 894. CONNOR, et al. (1997), em seus estudos com ratos observaram que o BRCA1 e BRCA2 são altamente expressos proliferando células ao limite de G1/S do ciclo celular da mama comum vistos em pacientes com mutações nestes genes, sugere que BRCA1 e BRCA2 possam estar agindo no mesmo tempo. SARAN, et al. (1997), identificaram uma interação de proteína de BRCA2 com a proteína de DNA conserto Rad51. DAVIS, et al. (2001) mostrou que o BRCA2 faz um papel duplo na regulação da Rad51, que é uma proteína essencial para a recombinação homóloga e conserto de DNA. Primeiramente, as interações de Rad51 e o BCR3, ou regiões de BCR4 do BRCA 2, bloqueiam a formação de filamentos nucleoprotéicos por Rad51. Alterações para a região de BCR3 que imitam mutações associa- das ao câncer de BRCA2 não exibem este efeito. Em segundo, o transporte de Rad51 para o núcleo estava defeituoso em células que carregam uma mutação associada ao câncer de BRCA2. Assim, BRCA2 regula a localização intracelular e a habilidade de ligação de DNA de Rad51. STRUEWING, et al. (1997), estudaram 120 portadoras de mutações em BRCA1 e BRCA2. As mutações em BRCA1 estudadas eram 185delAG, e 5382insC; a mutação de BRCA2 estudada era 6174delT. O risco calculado de câncer de mama em pacientes com até 70 anos era de 56%, de câncer ovariano 16%; e de câncer de próstata 16%, não havia diferença significante no risco de câncer de cólon entre os parentes dos portadores. Concluíram que de 2% de Judeus Ashkenazi levam mutações em BRCA1 e BRCA2, o que confere um risco aumentado de câncer de mama, ovário e próstata. NEUHAUSEN, et al. (1998), analisaram famílias Judias e identificou 3 mutações mais freqüentes, possivelmente através do efeito do fundador que são: 185del AG e 5832 ins C em BRCA1 e 6174 del T em BRCA2. JERNISTON, et al. (1999), concluíram em seus estudos que os portadores do BRCA1 e mutações do BRCA2, que têm filhos, estão mais suscetíveis a desenvolverem câncer de mama, antes dos 40 anos, que as portadoras que são nulíparas. Cada gravidez aumenta o risco de desenvolver câncer de mama. As mutações da linhagem germinativa do BRCA1 são responsáveis por 2% a 4% de todos os cânceres mamários. Embora mais que 90% deles sejam casos esporádicos, ocorrendo em mulheres sem evidências de susceptibilidade hereditária, análises de espécies de tumores mamários sugerem que anormalidades somáticas adquiridas no BRCA1 possam também desempenhar um papel em muitos desses cânceres (CROOP, et al. 1990). FODOR, et al. (1998) determinando a freqüência do BRCA1 comum e mutações de BCRA2: 185 del AG, 5382 ins C e 6174 del T, o DNA foi analisado para as 3 mutações através de hibridização de oligonu- 58 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 cleotídeos alelo–específicos (ASO). Oito pacientes (3%) eram heterozigotos para a mutação 185 del AG, dois pacientes (0,75%) para 5382 ins C e oito pacientes (3%) para 6174 del T. O risco vitalício para câncer de mama em Judeus Ashkenazi portadores do BCRA1 185del AG ou BRCA2 6147 del T foram calculadas para ser 36%, aproximadamente 3 vezes o risco global para a população em geral. Na Austrália, BAHAR, et al. (2001), encontraram em Judeus Ashkenazi a mesma prevalência alta de 4 mutações do fundador, da mesma forma que acha em Judeus Ashkenazi nos Estados Unidos e Israel. As quatro mutações analisadas era 185 del AG e 5182 ins C em BRCA1; 6174 del T em BRCA2 e 11307K em APC. STRUEWING, et al. (1995) declarou que mais de 50 mutações sem igual tinham sido descobertas no gene BRCA1, em indivíduos com câncer de mama e ovário. Em genealogias de alto risco, portadoras femininas de uma mutação de BRCA1 tiveram 80 a 90% de risco vitalício em câncer de mama e 40 a 50% de risco de câncer de ovário. STRUEWING, et al. (1995), determinaram a freqüência da mutação 185 del AG em 858 Ashkenazi, que buscam prova genética para condições sem conexão para câncer, e em 815 pessoas de referência não selecionadas pela origem étnica. Eles acharam a mutação 185 del AG em 0,9% de Ashkenazi . Os resultados sugeriam que 1/100 mulheres de descendência Ashkenazi possam ter alto risco de desenvolver câncer de mama ou ovário. Entre as 39 mulheres Judias com câncer de mama antes dos 40 anos, (FITZ, et al. 1996) acha que 8 (2%) carregam a mutação 185 del AG. Em câncer de mama esporádico, (THOMPSON, et al. 1995) acha o RNAm do BRCA1 em níveis notadamente diminuídos durante a transcrição de carcinoma in situ para câncer invasivo. THOMPSON, et al. (1995), acharam que aquela inibição experimental da expressão de BRCA1 com oligonucleotídeos antisense produziu crescimento acelerado de células nor-


mais e células malignas, mas não teve nenhum efeito em células epiteliais não mamárias. Eles interpretaram estes resultados como indicado que o BRCA1, normalmente pode servir como um regulador negativo de crescimento de células epiteliais mamárias. HEDENFALK, et al. (2001), usando a tecnologia de microarray para determinar a expressão de genes em câncer de mama, foi achado BRCA1 positivos como constatado com cânceres de mama BRCA2 positivos. A suspeita de que uma diferença poderia ser achada veio do fato que os 2 tipos de tumores são freqüentemente distintos, histologicamente. Além disso, tumores com mutações de BRCA1 são geralmente negativos para estrógeno e receptores de progesterona, considerando que a maioria dos tumores, com mutações de BRCA2, é positivo para receptores de hormônios. Amostras de RNA de tumores primários de 7 portadores da mutação de BCRA1 e 7 portadores da mutação de BCRA2 foi com um microarray de 6.512 clones de cDNA de 5.361 genes. ROA, et al. (1996), observaram a mutação 185 del AG em 1,09% de aproximadamente 3000 Judeus Ashkenazi, e a mutação 5382 ins C em 0,13%, a análise do BCRA2 em 3.058 indivíduos da mesma população mostraram uma freqüência de portador de 1,52% pela 6174 del T. Estes dois alelos são os mais freqüentes, que predispõem o câncer de mama hereditário entre Judeus Ashkenazi . BAR–SADE, et al. (1997), em estudo com 639 Judeus Iraquianos saudáveis, que são um grupo de pouco risco para a mutação 185 del AG, que é predominantemente em Ashkenazi, foram identificados 3 indivíduos portadores da mutação 185 del AG . As análises de haplótipo iraquiano mostram que 2 compartilham um haplótipo em comum com 6 portadores Ashkenazi, e um terço teve um haplótipo que diferiu por um único marcador. Isto sugeriu que a mutação 185 del AG do BCRA1 pode ter sugerido antes da dispersão das pessoas judias no Diáspora, pela mesma época de Cristo. Alelos mutantes de genes supressores de tumores, quando herdados, predispõem os indivíduos a tipos particulares de câncer. Além de um envolvimento na suscetibilidade herdada para câncer, estes genes de supressão tumoral são objetivos para mutações somáticas em tipos de câncer esporádicos. Uma exceção é o BRCA1, que contribui com uma fração significante de câncer de mama e ovário, mas sofre mutação a taxas baixas em câncer de mama e ovário esporádicos. Este achado sugere que outros genes possam ter como objetivo principal causar mutações somática em carcinoma de mama. O outro gene BRCA2 conta, neste estudo, com uma proporção quase igual a do BRCA1. O BRCA1 e o BRCA2 se comportam de forma dominante, tendo em vista que herda um alelo mutante e têm um risco maior de desenvolver um tumor; tumores que eles desenvolverem perdem o alelo do tipo selvagem através da perda da heterogozidade. (TENG, et al. 2002.) STEPHENSON, em (2003), estudou mulheres com mutações no BRCA1 e BRCA2, que têm um risco mais elevado de desenvolverem câncer de mama, se fizeram uso de métodos contraceptivos orais, por, pelo menos, 5 anos ou antes de 1975 (quando preservativos orais geralmente tinham um conteúdo de estrógeno mais alto que os produzidos depois). Estas têm um risco vitalício de 50 a 80% de desenvolverem câncer de mama. O estudo contou com 1311 pares de mulheres que eram portadoras de mutações danosas, em um ou ambos genes, a metade de quem teve câncer de mama e a metade de quem não tiveram. LLORT, et al. (2002), em seus estudos com pacientes espanholas, analisando mutações em BRCA1 e BRCA2 têm uma proporção hereditária significativa baixa, no que diz respeito ao câncer de mama. O espectro mutacional nestes genes é muito grande, com centenas de mutações de BRCA diferentes mundialmente informadas. Mutações devido ao efeito do fundador têm uma fração significativa de todas as mutações de grupos étnicos. Em estudo com 35 famílias espanholas que desenvolveram câncer de ovário e mama, foram achadas 13 mutações, das quais se tinham notícias de apenas 3, na Espanha. As dez mutações modernas são: IVS5+1G>A, 1491delA Leu 1086 Ter, e Gln 895Ter em BRCA1; Glu 49 Ter, 5373del GTAT, 5947del CTCT, 6672 del TA, 8281 ins A, e Pro 3039 Leu em BRCA2. Este estudo, comparado com outros realizados no país, mostra que das várias mutações encontradas na Espanha, nenhuma parece ter relação, com efeito, do fundador. KUMAR, et al. (2002), analisaram a sucessão de codificação do gene BRCA1 e BRCA2 em 14 pacientes de câncer de mama hereditário em mulheres Indianas. A análise foi realizada em gel de eletroforese sensível (CSGE), seguido de seqüenciamento. Três mutações delas modernas no exon 7, enquanto a outra é um apagamento de par básico no exon 11 que resulta em mutilação de proteína. A mutação 185 del AG, previamente descrita, em Judeus Askenazi, também foi encontrada nesta população. Mesmo este sendo o 1º estudo realizado com famílias da Índia (14 no total) sugestiona uma baixa prevalência, mas com um envolvimento definitivo de mutações no gene BCRA1, entre mulheres Indianas com câncer de mama. A população do Paquistão possui uma taxa de câncer de mama extremamente alta para populações Asiáticas e uma das taxas mais altas, mundialmente, do câncer ovariano. Neste estudo com 341 casos de câncer de mama, 120 casos de câncer ovariano e 200 controles femininos. A prevalência de mutações no BRCA1 e BRCA2 em pacientes com câncer de mama são de 6,7%, de câncer ovariano são 15,8%. Mutações no gene BRCA1 respondem por 84% das mutações de câncer ovariano e 65% das mutações de câncer de mama. A maioria das mutações descobertas são novas para o Paquistão. Cinco mutações de BRCA1: 2080 ins A, 3889 del AG, 4184 del 4, 4284 del AG, e IVS14 – 1A>G , e uma mutação de BRCA2 3337C>T, foram encontradas em múltiplos casos e representam fortes candidatos ao efeito do fundador, segundo (LIEDE, et al. 2002). TERESCHENKO, et al. (2002), estudaram 25 famílias Russas com cân- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 59


cer de mama e ovário, onde analisaram mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, usando análise de heteroduplex e multiplex. Além disso, foram testadas 22 pacientes com câncer de mama diagnosticados antes dos 40 anos, sem história familiar e 6 pacientes com câncer de mama bilateral. A freqüência de mutações no BRCA1 era de 16%. Uma mutação de BRCA1, 5382 ins C, foi achada em 3 famílias. Este estudo juntamente com outro sugere que 5382 ins C no BRCA1 é uma mutação de fundador na população Russa. No BRCA2 foram encontradas 3 mutações em pacientes com câncer de mama sem história familiar, 2 em pacientes jovens e 1 em pacientes com câncer bilateral. Foram encontradas 4 mutações modernas : 695 ins T, 1528 del 4, 9318 del 4, S1099X. No ano de 2000 foram diagnosticados quase 80.000 casos novos de câncer de mama na Índia. Embora a identificação de BRCA1 e BRCA2 aumentou a compreensão na genética do câncer de mama em populações de descendência da Europa Ocidental, o papel destes genes no restante da população indiana é inexplorado. A análise de 20 pacientes com câncer de mama com qualquer história familiar, ou idade precoce, conduziu a identificação de duas variantes (331+1G>T; 4476+2T>C) em BRCA1 (10%) (SAXENA, et al. 2002). RUIZ, et al. (2002), analisaram heteroduplex de pacientes mexicanos com câncer de mama, onde identificaram mutação truncada em BRCA1 e BRCA2 (3857 del T; 2663 – 2664 ins A) e oito variantes raras de significação desconhecida, principalmente no gene BRCA2, um caso de câncer de mama masculino também foi identificada. A maioria das alterações parecia ser distinta com uma única observada em mais de uma família. LIEDE, et al. (2002), encontraram duas famílias de descendência aborígines, ambas com as mesmas alterações de BRCA1 (1510 ins G; 1506 A>G). As famílias representam duas Aborígines de tribos canadenses, embora uma origem ancestral comum é provável. Esta é a primeira evidência de uma mutação de BRCA1, específica para pessoas aborígines do Norte da América. A detecção de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 é feita por técnicas de biologia molecular capazes de identificar a alteração de uma única base na seqüência de DNA. Devido ao grande tamanho das seqüências de BRCA1 e 2, primeiramente, busca-se identificar qual exon contém o sítio mutado, antes de se proceder ao sequenciamento do DNA. A seqüência de DNA correspondente aos vários exons é amplificada por PCR (reação em cadeia da polimerase) para a realização desses testes. Para o screening inicial de mutações, uma técnica muito utilizada é a de single strand conformation polymorphism - SSCP, combinada com heteroduplex analysis. A técnica de SSCP baseia-se no fato de que a conformação tridimensional de fragmentos de DNA de fita simples depende da seqüência de nucleotídeos, sendo que a diferença de um nucleotídeo altera o padrão de migração eletrofo-rética. A técnica de heteroduplex analysis deriva da observação de que, em reações de PCR, onde estão presentes moléculas de DNA selvagens e mutantes, durante os últimos ciclos, podem ser formados heteroduplex entre essas duas espécies de moléculas, os quais terão um padrão de migração eletroforética diferente dos homoduplexes. Utilizando-se fragmentos de tamanho entre 100 e 350 pares de bases, a taxa de detecção de mutações para o SSCP como para o heteroduplex analysis, e a associação dos dois métodos pode elevar essa taxa para perto de 100% (sob condições bem controladas e processamento semi-automatizado). Após a identificação do exon, que a abriga a mutação, esta é caracterizada pelo sequenciamento do DNA. Conhecida a mutação, torna-se possível, também, por sequenciamento, pesquisá-lo em outros membros da família do paciente, com vistas ao aconselhamento genético. 9. Discussão Com a identificação dos dois principais genes responsáveis pelo câncer de mama hereditário, o BRCA1 e o BRCA2, a genética deu um grande salto em busca da cura de doenças que são estritamente comuns e que mais matam mulheres. 60 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Em muitas populações, algumas mutações tornam-se mais freqüentes devido ao efeito do fundador. Uma das populações que teve suas mutações amplamente estudadas foi o de Judeus Askenazi, onde cerca de 2% da população leva mutações em BRCA1 e BRCA2 o que confere um risco aumentado de câncer de mama, ovário e próstata. Em Judeus Askenazi, as principais mutações encontradas devido ao efeito do fundador e que já foram descritas em inúmeros países, são a 185 del AG e 5382 ins C no gene BRCA1, e no BRCA2 a 6174 del T. A prevalência alta destas mutações de fundador na linhagem germinativa são responsáveis por 2% a 4% de todos os tipos de câncer mamário. Em pacientes Espanholas, das inúmeras mutações já analisadas em BRCA1 e BRCA2 tem uma proporção hereditária significativa baixa. A comparação com outros estudos realizados no país mostra que nenhuma tem relação, com efeito, do fundador. Em mulheres indianas, 3 mutações modernas foram encontradas e a 185 del AG foi amplamente encontrada. Existe uma baixa prevalência, mas com um envolvimento definitivo de mutações no gene BRCA1. No Paquistão, dentre as muitas mutações já descritas, a 3337 C>T no BRCA2 representam uma forte candidata ao efeito do fundador. Na Rússia, a mutação no BRCA1 5382 ins C foi caracterizada por ser uma mutação de fundador, e tribos do Canadá também têm 2 mutações que são estritamente freqüentes. A identificação de portadoras de mutações BRCA1 está limitada a um número contado de laboratórios, com acesso para raras famílias, na qual a análise de vários parentes oferece informação suficiente para identificar carreadores com um alto grau de certeza. Com base na taxa de carreadoras de uma em 200 a 400 mulheres, a demanda para um rastreamento populacional será provavelmente substancial. A atenção deve ser voltada para os riscos sociais do teste genético, como potencial perda de seguro, estigmatização e discriminação do empregado.


Uma vez que o gene BRCA1 e BRCA2 tenham sido identificados e um teste clínico para mutações comuns esteja disponível, os problemas levantados no aconselhamento de uma única família irão assumir enormes proporções. A prevalência de carreadoras de mutações BRCA1, com um risco de aproximadamente 85% de desenvolverem câncer de mama, em muito excedem a incidência de qualquer outra doença genética para qual o rastreamento pré-sintomático esteja atualmente disponível. O rastreamento para mutação BRCA1 é provavelmente o 1º teste pré-sintomático que terá lugar na prática clínica geral, e um sucesso ou falha desses esforços trará um grande impacto no futuro deste campo, com todo o seu potencial para o avanço da medicina preventiva, evitando doenças e reduzindo os custos da saúde. Tem-se a esperança de que, com o rastreamento genético, a suscetibilidade ao câncer de mama, muitas armadilhas possam ser evitadas. 10. Referências Bibliográficas BAHAR, A. 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Pesquisa Márcia Nitschke Doutoranda em Ciência de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP nitschke@bol.com.br Gláucia Maria Pastore Prof a Dr a - Laboratório Bioquímica de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP glaupast@fea.unicamp.br Ilustrações cedidas pelos autores Biosurfatantes a partir de resíduos agroindustriais Avaliação de resíduos agroindustriais como substratos para a produção de biosurfatantes por Bacillus Introdução Os surfatantes constituem uma classe importante de compostos químicos amplamente utilizados em diversos setores industriais. Estima-se que a produção mundial de surfatantes exceda 3 milhões de toneladas por ano (Banat, 2000), sendo utilizados principalmente como matériaprima na fabricação de detergentes de uso doméstico. A grande maioria dos surfatantes disponíveis comercialmente é sintetizada a partir de derivados de petróleo. Entretanto, o crescimento da preocupação ambiental dos consumidores combinado com novas legislações de controle do meio ambiente levaram os cientistas a pesquisar surfatantes biológicos como alternativa para os produtos existentes. Os biosurfatantes produzidos por microrganismos vêm, nos últimos anos, despertando considerável interesse devido à sua natureza biodegradável, baixa toxicidade e diversidade de aplicações. Entre as aplicações comerciais dos biosurfatantes destacam-se a recuperação do petróleo, biorremediação de poluentes, formulação de lubrificantes, além de diferentes utilizações na indústria têxtil, cosmética, alimentícia e farmacêutica. Atualmente, os biosurfatantes ainda não são amplamente utilizados pela indústria, devido ao seu alto custo de produção, associado a métodos ineficientes de recuperação do produto e ao uso de substratos caros. Porém, o problema econômico da produção de biosurfatantes pode ser significativamente reduzido por meio do uso de fontes alternativas de nutrientes facilmente disponíveis e de baixo custo. Uma possível alternativa para a produção de biosurfatantes seria o uso de subprodutos agrícolas ou de processamento industrial. Atualmente, o aproveitamento de resíduos vem sendo incentivado por contribuir para a redução da poluição ambiental, bem como por permitir a valorização econômica dos resíduos que seriam simplesmente descartados. O que são biosurfatantes? Os biosurfatantes possuem uma estrutura comum: uma porção lipofílica, usualmente composta por cadeia hidrocarbonada de um ou mais ácidos graxos, que podem ser saturados, insaturados, hidroxilados ou ramificados, ligados a uma porção hidrofílica, que pode ser um éster, um grupo hidróxi, fosfato, carboxilato ou carbohidrato (Cameotra & Makkar, 1998; Bognolo, 1999). Os microrganismos produtores distribuem-se em diversos gêneros, sendo a maioria produzida por bactérias. As principais classes de biosurfatantes incluem glicolipídios, lipopeptídios e lipoproteínas; fosfolipídios e ácidos graxos; surfatantes poliméricos e surfatantes particulados (Desai & Desai,1993). Em relação aos surfatantes convencionais, os biosurfatantes apre- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 63


sentam vantagens como (Bognolo, 1999): • elevada atividade superficial e interfacial, o que os torna comparáveis ou superiores aos sintéticos (detergentes aniônicos sulfatados) em termos de efetividade e eficiência; • maior tolerância a pH, temperatura e força iônica; • biodegradabilidade; • baixa toxicidade. Os biosurfatantes apresentam ainda a vantagem de poder ser sintetizados a partir de substratos renováveis e de possuir grande diversidade química, possibilitando aplicações específicas para cada caso particular (Desai & Banat, 1997). Outra vantagem dos biosurfatantes reside no fato de não serem compostos derivados de petróleo, fator importante à medida que os preços do petróleo aumentam. Além disso, a estrutura química e as propriedades físicas dos biosurfatantes podem ser modificadas através de manipulações genéticas, biológicas ou químicas, permitindo o desenvolvimento de novos produtos para necessidades específicas. Substratos não convencionais O sucesso da produção industrial de biosurfatantes depende do desenvolvimento de processos mais baratos e do uso de matérias-primas de baixo custo, uma vez que estas representam entre 10% a 30% do custo total (Cameotra & Makkar, 1998). Apesar disso, poucos trabalhos têm sido publicados com vistas a produzir biosurfatantes a partir de resíduos (Tabela 1). A dificuldade na seleção de um resíduo está em encontrar a composição adequada de nutrientes que permita o crescimento celular e o acúmulo do produto de interesse. Em geral, substratos agroindustriais que contenham altos níveis de carbohidratos ou de lipídeos suprem a necessidade de fonte de carbono para a produção de biosurfatantes. O estabelecimento de um processo biotecnológico a partir desses substratos alternativos também apresenta outra dificuldade, que é a padronização devido às variações naturais de composição, bem como os custos de transporte , armazenagem e tratamento prévio necessários. Entretanto, a utilização de resíduos pode diminuir os custos de produção para níveis competitivos em relação aos similares obtidos por via petroquímica e, ao mesmo tempo, reduzir os problemas ambientais relativos ao descarte e aos custos do tratamento (Mercade & Manresa, 1994; Makkar & Cameotra, 1999a; Makkar & Cameotra, 2002). Finalmente, deve-se considerar que o Brasil é um país essencialmente agrícola e que, portanto, a quantidade e a facilidade de acesso aos subprodutos agroindustriais é bastante significativa. 64 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Biosurfatantes produzidos por Bacillus Algumas bactérias do gênero Bacillus produzem diversos lipopeptídeos que demonstram atividade tensoativa ( Rosenberg & Ron, 1999). As culturas de Bacillus subtilis produzem um lipopeptídeo cíclico conhecido como surfactina ou subtilisina (Arima et al., 1968), considerado um dos mais potentes biosurfatantes conhecidos (Figura 1). A surfactina também demonstrou atividade anticoagulante, antitumoral, antimicrobiana, e, mais recentemente, estudos comprovaram atividade antiviral e antimicoplasma (Vollenbroich et al, 1997a, 1997b). O objetivo deste estudo foi verificar a potencialidade do uso de substratos alternativos para a produção de biosurfatante por isolados de Bacillus. Materiais e Métodos Foram utilizados cinco isolados de Bacillus sp. produtores de biosurfatante pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Bioquímica de Alimentos. Para a Figura 1. Estrutura da surfactina produzida por Bacillus subtilis. Tabela 1. Exemplos de utilização de resíduo s na produção de biosurfatan tes Substrato s Classe química Microrganismo Referência Efluente extração óleo oliva r hamnolipídeos Pseudomonas sp. M ercade et al. , 1993 Residuos refino óleo de soja rhamnolipídeos P. aeruginosa Abalos et al, 2001 Água lavagem de batatas lipopeptídeos B. subtilis Fox & Bala, 2000 Melaço lipopeptídeos B. subtilis Makkar & Cameotra, 1997 Soro de leite rhamnolipídeos P. aeruginosa Koch et al, 1988 Água de turfa lipopeptídeos B. subtilis Sheppard& Mulligan 1987 Óleo de fritura usado rhamnolipídeos P. aeruginosa Haba et al, 2000 Óleo lubrificante usado g licolipídeos Rhodococcus sp. Mercade et al, 1996 Soro leite desproteinizado sophorolipídeos C. bombicola Daniel et al, 1998 Manipueira lipopeptídeos B. subtilis Santos et al, 1999


produção de biosurfatante foram utilizados: • melaço (3% v/v sólidos solúveis) pH 6,0; • manipueira (resíduo líquido proveniente da fabricação de farinha de mandioca) pH 5,8-5,9; • soro de leite (fabricação de queijo mussarela) pH 6,4 ; • meio sintético proposto por Cooper et al. (1981) pH 6,8-6,9. A manipueira foi tratada previamente com aquecimento a 100°C, por 3 minutos e centrifugação a 10.000 rpm, por 20 minutos, para remoção de sólidos. O pH dos resíduos não foi ajustado. Os meios foram esterilizados em autoclave a 121°C, por 20 minutos. Uma alçada das culturas mantidas a 4°C foi transferida para erlenmeyer de 50 mL, com 20 mL de caldo nutriente e incubada em agitador rotatório a 120 rpm, 30°C, por 24 horas. Após, 1 mL de cada cultura a ser testada foi inoculado em frascos erlenmeyers de 50 mL contendo 15 mL dos respectivos meios, que foram incubados em agitador rotativo tipo shaker a 30°C e 150 rpm, por 72 horas. Os meios foram centrifugados a 10.000 rpm, por 15 minutos, e o sobrenadante, livre de células, utilizado para determinações analíticas. A tensão superficial foi determinada em tensiômetro Krüss, modelo K12, utilizando o método da placa. O biosurfatante foi isolado do meio de cultivo por precipitação ácida a pH 2,0, seguida de extração com clorofórmio/metanol (65:15), segundo Makkar & Cameotra (1999b). A atividade emulsificante (E 24 ) foi realizada em tubos com tampa rosca contendo 4 mL de solução aquosa, 1mg/mL de biosurfatante (obtido em manipueira) adicionados de 6 mL de hidrocarbonetos, sendo que cada tubo foi submetido a vortex máximo por 2 minutos e deixado em repouso por 24 horas. O índice E 24 foi determinado medindo-se a altura da camada emulsionada (cm) dividindo-a pela altura total de líquido x 100. A remoção de petróleo de areia contaminada foi testada através da saturação de 60g de areia com 5 mL de petróleo. Porções de 20g da areia contaminada foram Figura 2. Percentagem de redução na tensão superficial obtida por isolados de Bacillus sp. em diferentes substratos. Figura 3. Atividade emulsificante (E 24 ) de solução de biosurfatante frente à diferentes hidrocarbonetos. (1) Hexano, (2) Tolueno, (3) Heptano, (4) Decano, (5) Querosene, (6) Tetradecano, (7) Hexadecano, (8) Óleo de soja, (9) Gordura de côco. colocadas em erlenmeyer de 250 mL, adicionando-se-lhe 20 mL de água (frasco controle) e 20 mL de solução aquosa 1mg/mL de biosurfatante obtido (frasco teste). Os frascos foram agitados a 150 rpm, por 12 horas em temperatura ambiente. Retirou-se deles o líquido da primeira lavagem e procedeu-se a uma segunda adição de 20 mL de água e biosurfatante, incubando-os nas mesmas condições acima. O líquido da segunda lavagem foi removido e a areia foi retirada do frasco sendo colocada em estufa a 50°C até a secagem. Resultados e Discussão Os resultados obtidos nos ensaios de produção de biosurfatante em diferentes substratos alternativos são mostrados na Figura 2. Nota-se que todos os isolados testados demonstraram capacidade de produzir biosurfatante e, conseqüentemente, de reduzir a tensão superficial dos meios testados, sendo que a manipueira forneceu as maiores percentagens de redução , na ordem de 42% , para todos os isolados testados; entretanto, o soro de leite apresentou uma redução média Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 65


Figura 4. Capacidade de remoção de petróleo de amostra de areia utilizando solução de biosurfactante. (1) Biosurfatantes, (2) controle, (3) água. Tabela 2. Atividade emulsificante do biosurfatan te obtido em manipueira H idrocar boneto E24 ( % ) Hexano 66, 6 Tolueno 72, 7 Heptano 66, 6 Decano 70, 4 Querosene 70, 4 Tetradeca no 70, 9 Hexadecano 69, 0 Óleo de soja 74, 0 Gordura e côco 70, 9 Petróleo 69, 0 de 10% , ressaltando que o isolado LB5a não produziu surfatante nesse resíduo. O melaço também demonstrou boa potencialidade como substrato para produção de biosurfatante pelos microrganismos testados e apresentou redução média de, aproximadamente, 33%. O meio sintético utilizado como padrão foi definido por Cooper et al. (1981), para a produção de surfactina por Bacillus subtilis ATCC 21332 e vem sendo utilizado, desde então, como uma referência para a produção de biosurfatantes de Bacillus. Nota-se que, apesar de permitir a produção de biosurfatante por todos os isolados, esse meio mostrou resultados inferiores (com redução média de 21,5%) aos da manipueira e do melaço, sugerindo que estes dois resíduos possuem uma composição de nutrientes adequada para a produção de biosurfatantes. Embora a composição química varie de acordo com a época do ano e com o tipo de cultivar de mandioca, a manipueira possui em sua composição uma grande quantidade de carbohidratos (40-60 g/L ) destacando-se ainda a presença de frutose, glicose e sacarose, além de nitrogênio (1-2 g/L) e mine- rais como P, K, Mg, Mn, S, Fe, Cu, Zn, Ca (Cereda, 1994). Segundo Cooper et al. (1981), os sais minerais, principalmente Fe e Mn, são fatores nutricionais importantes para a produção de surfatantes por linhagens de Bacillus. A presença desses minerais, além de fontes de carbono e nitrogênio, seja, provavelmente, o principal motivo de haver maior produção de biosurfatantes nesse resíduo. Em adição à tensão superficial, a estabilização de emulsões é freqüentemente utilizada como um indicador da atividade superficial (Abu-Ruwaida 66 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 5 . Águas de lavagem da areia impregnada com petróleo. A1-A2: água; BS1-BS2: solução biosurfatante 1mg/mL. et al, 1991). A capacidade emulsificante do biosurfatante obtido em manipueira pelo isolado LB5a foi avaliada através do índice E 24 com diferentes hidrocarbonetos (Tabela 2). Os índices obtidos (60%-80%) revelam alta especificidade do biosurfatante contra todos os hidrocarbonetos testados, formando emulsões estáveis do tipo A/O (Figura 3). O composto obtido possui potencial para uso na biorremediação, recuperação de petróleo e emulsificação de óleos e gorduras. Com vistas a avaliar a capacidade do biosurfatante produzido em


manipueira pelo isolado LB5a em remover petróleo de areia contaminada, procedeu-se a um experimento ilustrado nas Figuras 4 e 5, onde se observa que a areia tratada com solução de biosurfatante apresenta aspecto mais claro e as respectivas águas de lavagem demonstram maior capacidade de recuperação do petróleo em relação ao tratamento sem tensoativo. Conclusões Entre os resíduos agroindustriais testados, a manipueira foi que demonstrou a maior potencialidade para uso como substrato alternativo na produção de biosurfatantes por isolados de Bacillus, sendo que o composto obtido apresentou capacidade para uso em biorremediação de poluentes e em recuperação de petróleo. Referências Bibliográficas ABU-RUWAIDA, A. S.; BANAT, I.M.; HADITIRTO, S.; SALEM, A.; KADRI,M. Isolation of biosurfactant-producing bacteria product characterization, and evaluation. Acta Biotechnologica, 11(4): 315-324, 1991. ABALOS, A.; PINAZO, A.; INFAN- TE, M.R.; CASALS, M.; GARCÍA, F; MANRESA, A. 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Pesquisa Gabrielle Mouco Aluna de graduação em Farmácia - UNIP gabimouco@yahoo.com.br Maira Jardim Bernardino Aluna de graduação em Farmácia - UNIP mjb@ajato.com.br Melânia Lopes Cornélio, Ph.D Farmacêutica, Ph.D- Química de Produtos Naturais Professora Titular da Disciplina de Farmacognosia UNIP - Universidade Paulista-SP melaniacornelio@yahoo.com.br Ilustrações cedidas pelos autores Controle de qualidade de ervas medicinais 68 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Controle de qualidade de Phyllanthus niruri L. (quebra-pedra) Introdução O controle de qualidade da droga vegetal é imprescindível, pois muitas espécies vegetais são vendidas sem nenhuma garantia de qualidade, o que favorece desde a venda de espécies falsificadas até o armazenamento inadequado da droga vegetal durante a sua comercialização. A análise aqui descrita foi realizado com a droga vegetal adquirida e conhecida popularmente como quebra-pedra. O controle de qualidade dessa droga vegetal foi feito a começar da sua descrição microscópica, para verificar a autenticidade da espécie a fim de evitar equívocos. Também foram realizados testes químicos para confirmar as principais classes de seus constituintes químicos descritos na literatura (De Souza et. al., 2002; Duke, 2000). Os interesses terapêuticos do Phyllanthus niruri L. provêm principalmente de suas propriedades diuréticas para o combate de cálculos renais. Devido a isso, estão sendo desenvolvidos vários estudos para isolar a substância responsável por tais propriedades, além de elucidar a melhor maneira de tratamento (Teske et. al., 1995). Estudos experimentais com as folhas e as sementes também têm demonstrado a sua ação hipoglicemiante, antibacteriana e anticancerígena. Em ensaios especiais, mostrou-se que é ativa contra o vírus da hepatite B in vivo e in vitro. Além disso, possui a virtude de dissolver cálculos renais, impedindo a contração do ureter e promovendo a sua desobstrução. Desenvolve atividade diurética pela elevação da filtração glomerular e excreção urinária dos sais de uratos (Tona et. al., 2001; Teske et. al., 1995; Ogata et. al., 1992). Outro estudo realizado mostrou o efeito do Phyllanthus niruri sobre a cristalização do oxalato de cálcio in vitro. Por meio desse estudo, pôde-se concluir que o extrato de quebra-pedra interfere no crescimento e na agregação dos cristais na urina humana, sugerindo que essa planta tem um papel potencial na prevenção de cálculo renal ou do desenvolvimento (Barros, 2002; Freitas et. al., 2002; Campos et. al., 1999; Dias et. al., 1995). Materiais e Métodos 1 - Dados da Amostra A amostra analisada foi adquirida em uma farmácia comercial e apresentava as folhas secas em fragmentos de 0,5 cm a 1,0 cm. Apresentava uma coloração esverdeada que indicava que a amostra havia passado por processo de secagem. 2 - Controle Físico Processo de Catação - Determinação da Pureza Esse processo visou a avaliar se a amostra apresentava material


estranho, partículas que não correspondessem à droga analisada. A quantidade de amostra analisada foi de 25 g de material vegetal. 3 - Descrição microscópica Os fragmentos da parte da folha foram submetidos a estudo histológico, e neles foram realizados cortes do tipo paradérmico e transversal 4 - Análise química As folhas secas foram submetidas a processos químicos de identificação das seguintes classes de constituintes químicos: taninos, heterosídeos flavanoídicos, heterosídeos saponínicos, heterosídeo antraquinônicos, alcalóides e óleos voláteis (Costa, 2001). A seguir serão apresentadas as metodologias dos ensaios de identificação das classes dos constituintes químicos mencionados. Vale lembrar que são testes qualitativos com vistas a somente verificar a presença ou a ausência do constituinte químico em questão. 4.1 - Métodos de Identificação 4.1.1 - Taninos Os taninos são substâncias polifenólicas, polihidroxiladas, de alto peso molecular, de origens vegetais, capazes de precipitar proteínas, pectinas, alcalóides e metais pesados em solução aquosa (Simões et. al., 2001). A estrutura química é complexa na sua maioria, apresenta características adstringentes ao paladar e são capazes de curtir a pele dos animais, transformando-a em couro. Os taninos são sólidos, amorfos na sua maioria, solúveis em água, álcool, glicerina e polietilenoglicol. São insolúveis em solventes orgânicos apolares. Classifica-se em gálicos, hidrolisáveis, catequínicos ou condensados. Extração Genérica de Taninos Pesou-se cerca de 2g da droga (quebra-pedra) pulverizada; Extraíram-se os taninos com cerca de 40 mL de água destilada, deixando-a ferver durante, aproximadamente, 2 minutos; Filtrou-se em papel de filtro, procurando manter o pó no fundo do recipiente; Repetiram-se mais duas extrações, com cerca de 10 mL de água cada; Filtrou-se novamente, como indicado anteriormente; Utilizou-se o filtrado para as reações de identificação seguintes. Reação com Cloreto Férrico Em um tubo de ensaio colocou-se cerca de 1,0 mL da solução extrativa e adicionaram-se-lhe 5,0 mL de água destilada e uma gota de cloreto férrico 2% (escorrendo-o pela parede do tubo). Foi necessário que se observasse a formação de um precipitado ou o aparecimento de colorações: preta, verde, azul, conforme o tipo de estrutura química. Reação com Solução Aquosa de Alcalóides Em um tubo de ensaio colocou-se 1,0 mL da solução extrativa, diluída a uma proporção 1:5. Adicionaram-se-lhe 5 gotas de ácido clorídrico a 5% e 1 ou 2 gotas de solução de sulfato de alcalóides. Esperou-se para observar a formação de um precipitado branco ou castanho esbranquiçado. Reação com Acetato Neutro de Chumbo Em um tubo de ensaio colocou-se 1,0 mL da solução extrativa diluída na proporção 1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas de solução aquosa de acetato neutro de chumbo a 10%. Esperou-se para observar a formação de um precipitado castanho avermelhado volumoso e denso. Reação com Solução de Acetato de Cobre Em um tubo de ensaio colocou-se cerca de 1,0 mL de solução extrativa diluída na proporção de 1:5. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas de solução aquosa de acetato de cobre a 5%. Esperou-se para se observar a formação de um precipitado castanho avermelhado. Reações Específicas de Taninos: Reação com Acetato de chumbo e Ácido Acético Glacial Em um tubo de ensaio colocaram-se cerca de 3 mL de solução extrativa e adicionaram-se-lhe cerca de 2 ml de ácido acético glacial a 10% e 3 mL da solução de acetato de chumbo a 10%. Esperou-se para observar a formação de um precipitado castanho avermelhado que indicasse a presença de taninos gálicos. Obs: A adição de ácido acético impede a precipitação de taninos catequínicos. Reação com Reativo de Wasicky Eliminou-se o precipitado da reação com acetato de cobre (anterior) por filtração e utilizou-se o filtrado. Adicionaram-se cerca de 0,5 mL de solução de poli-metil-aminobenzaldeído. Esperou-se para observar a formação de um precipitado carmim ou róseo que indicasse a presença de tanino catequínico. 4.1.2– Saponinas Saponinas são glicosídeos de esteróides ou terpenos policíclicos. Esse tipo de estrutura, que possui uma parte lipofílica (triterpeno ou esteróide) e outra hidrofílica (açúcares), determina a propriedade de redução da tensão superficial da Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 69


água, característica de suas ações detergente e emulsificante (Simões et. al., 2001). Extração Genérica das Saponinas Em um aparelho de refluxo colocaram-se 90 mL de extrato aquoso 1% da droga. Adicionaram-se-lhe cerca de 10 mL de ácido clorídrico. Deixou-se o processo em refluxo por aproximadamente uma hora para, em seguida, desligá-lo e deixá-lo esfriar. Transferiu-se o líquido para um funil de separação de 200 mL e adicionaram-se-lhe 50 mL de clorofórmio. Repetiu-se a extração com clorofórmio por mais duas vezes. Reduziu-se o volume a 75 mL em banho-maria. Processos Gerais de Identificação de Saponinas Obs.: Para cada reação de identificação, evaporou-se cerca de 5 mL da fase orgânica obtida anteriormente. Reação de Rossol: No tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 mL da fase orgânica, adicionou-se uma gota de ácido sulfúrico concentrado. Esperou-se para observar o aparecimento de uma coloração vermelha ou violeta que indicasse a presença da sapogenina. Reação de Mitchell: No tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 mL da fase orgânica, adicionou-se uma gota de ácido sulfúrico concentrado e vestígios de nitrato de prata. Esperou-se para observar o aparecimento de uma coloração avermelhada que indicasse a presença de sapogenina. Reação de Rosenthalen: No tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 mL da fase orgânica, adicionaram-se uma ou duas gotas de solução de vanilina a 1% em ácido clorídrico. Esperou-se para observar o aparecimento de coloração azul que se desenvolvesse somente a quente. Reação com Reativo de Sulfo-vanílico: No tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 mL da fase orgânica, adicionaram-se uma ou duas gotas de solução de vanilina 1% em ácido sulfúrico. Esperou-se para observar o aparecimento de coloração violetaazulada. Reação de Liebermann: No tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 mL da fase orgânica, dissolveu-se o resíduo em 2 mL de ácido acético glacial. Adicionaram-se-lhe 1 ou 2 gotas de cloreto férrico a 3%. Em seguida, verteram-se , pela parede do tubo, 1 ou 2 mL de ácido sulfúrico sem agitar . Na superfície de contato entre os dois líquidos, poderia formar-se um anel com coloração pardo-avermelhada ou verde, que indicaria a presença de derivados esteroidais, ou com coloração azul, que indicaria a presença de derivados triterpenóides. 4.1.3- Flavonóides Os flavonóides, biossintetizados a partir da via dos fenilpropanóides, constituem uma importante classe de polifenóis, presentes com relativa abundância entre os metabólitos secundários de vegetais (Simões et. al. 2001). Extração Genérica de Compostos Flavonoídicos: Pesaram-se cerca de 2,0 g da droga; Colocada em um béquer, adicionaram-se-lhe cerca de 15 mL de etanol a 75%; Foi fervida por alguns minutos; Em seguida, foi esfriada e filtrada em papel de filtro; 70 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Reservou-se esse extrato para executar as reações gerais de identificação. Reações Genéricas de Identificação de Flavonóides Reação de Shinoda: Adicionaram-se cerca de 5 mL do extrato em um tubo de ensaio que continha uma pitada de magnésio metálico. Acrescentaram-se-lhe 0,5 - 1,0 mL de ácido clorídrico. Observou-se o desenvolvimento de coloração rósea-avermelhada indicaria a presença de flavonóis; violeta indicaria a presença de flavanonas e laranja indicaria a presença de flavonas. Obs.: O desenvolvimento da cor pode ocorrer imediatamente ou após algum tempo. Reação com Cloreto de Alumínio: Sobre um papel de filtro, demarcaram-se duas áreas A e B. Depositaram-se em cada uma delas algumas gotas do extrato da droga e esperou-se secar. Em seguida, colocou-se em uma das áreas 1 gota de solução de cloreto de alumínio 5% em etanol. Eliminouse o etanol. Verificou-se o comportamento da substância nas duas áreas frente à luz ultravioleta. Observou-se o aspecto fluorescente que indicasse a presença de flavonóides. Reação com Cloreto Férrico: Diluiu-se o extrato com água na proporção de 1:5, em seguida, colocaram-se em dois tubos de ensaio 5 mL do extrato diluído. Adicionouse pela parede de um dos tubos 1 gota de cloreto férrico 2%. Esperou-se para observar o desenvolvimento de cor, que poderia variar entre verde, amarelo-castanho e violeta, de acordo com o tipo de composto flavonoídico. Reação com Hidróxido de Sódio: Diluiu-se o extrato na proporção de 1:5. Colocaram-se 5 mL desse extrato diluído em um tubo de ensaio e adicionaram-se-lhe 1


ou 2 gotas de NaOH 5%. Observou-se o desenvolvimento de coloração amarela, que varia de intensidade. 4.1.4- Glicosídeos Antraquinônicos São compostos naturais encontrados sob forma glicosídica ou livres derivados do núcleo antracênico. Relacionam-se diretamente com antraquinona, uma dicetona insaturada. Possuem ação catártica e são classificadas, como catártico estimulante (Akisue, 2002). Extração dos glicosídoes antraquinônicos Reação de Bornträeger: Pesouse cerca de 1g da droga, adicionaram-se-lhe cerca de 20 mL de etanol a 75% e foi aquecida durante 2 minutos em banho-maria. Em seguida, realizou-se a filtração em funil simples e adicionaram-se ao filtrado cerca de 2mL de ácido sulfúrico que foi levado ao banho-maria durante 1 minuto. Deixou-se o filtrado acidificado esfriar. Realizou-se a extração em um funil de separação com 10 mL de acetato de etila, e repetiu-se a extração por mais duas vezes. Mediram-se cerca de 5 mL da fase orgânica e adicionaram-se-lhe cerca de 1 ou 2 gotas de hidróxido de amônio. Esperou-se para observar a formação de uma coloração amarela, que indicasse a presença da antraquinona na forma reduzida, ou vermelha, que indicasse a presença da antraquinona na forma oxidada. Reação com Hidróxido de sódio: Pesaram-se 0,5 g de droga, que foi colocada em um vidro de relógio e adicionaram-se-lhe algumas gotas de hidróxido de sódio a 0,5%. Esperou-se para observar o aparecimento de uma coloração amarelada, que indicasse a pre- sença da antraquinona na forma reduzida, ou de uma coloração avermelhada que indicasse a presença da antraquinona na forma oxidada. 4.1.5 - Alcalóides Os alcalóides que contêm um átomo de nitrogênio em um anel heterocíclico são chamados de alcalóides verdadeiros e são classificados de acordo com o sistema anelar presente na molécula. As substâncias com o átomo de nitrogênio que não pertença a um sistema heterocíclico são denominados de protoalcalóides. Compostos nitrogenados com e sem anéis heterocíclicos, que não são derivados de aminoácido, são chamados de pseudoalcalóides (Simões et. al., 2001). Métodos de Identificação de Alcalóides Pesar cerca de 1g da droga em um béquer, adicionar 30 mL de solução de HCL 1,5% e aquecer por aproximadamente 3 minutos. Em seguida, filtrar o sobrenadante em algodão e transferir o filtrado para um funil de separação. Testes de Identificação Alcalinizar o filtrado obtido anteriormente com solução de Hidróxido de Amônio (NH 4 OH) até atingir um pH entre 9 e 10 (utilizar papel tornassol para determinar o pH). Em seguida, adicionar ao filtrado alcalinizado cerca de 15 mL de Clorofórmio (CHCl 3 ) e agitar para que os alcalóides presentes passem para a porção orgânica. Colocar cinco gotas do extrato em cada cápsula de porcelana, colocá-las em uma chapa e esperar secar, após isso, dissolver o resíduo com 4 gotas de solução de HCl 1,5% em todas as cápsulas e em cada uma adicionar o reagente de identificação de alcalóides: Reagente de Sheibler - Adicio- nar algumas gotas sobre o resíduo e observar desenvolvimento de coloração amarelo claro. Reagente de Bourchardat - Adicionar algumas gotas sobre o resíduo e observar o desenvolvimento de coloração amarelo tijolo. Reagente de Bertrand - Adicionar algumas gotas sobre o resíduo e observar o desenvolvimento de coloração amarelo tijolo. Reagente de Mayer - Adicionar algumas gotas sobre o resíduo e observar desenvolvimento de um precipitado floculoso branco. Reagente de Dragendorff - Adicionar algumas sobre o resíduo e observar desenvolvimento de coloração amarelo tijolo. 4.1.6 - Óleos voláteis Os óleos voláteis são definidos como produtos obtidos de partes de planta por meio da destilação por arraste com vapor d’água. São misturas complexas de substâncias voláteis lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas (Simões et. al., 2001). Pesar cerca de 1 g da droga a ser analisada, colocar em um gral de vidro, adicionar cerca de 1 mL de etanol absoluto e triturar. Pingar uma gota em um papel de filtro, evaporar e sentir o aroma, o qual indica a presença de óleos voláteis. 5 - Resultados Na amostra continha fragmentos de folhas e caules de tamanhos que variavam de 0,1 a 1,0 cm de tamanho. Observou-se que em 25 g da amostra que 0,75 g correspondia a fragmentos de materiais estranhos à planta. A Farmacopéia Brasileira recomenda que a porcentagem de material estranho de outra parte da planta tenha um limite de tolerência em torno de 10%. A análise microscópica da droga vegetal através dos cortes histológicos e a sua descrição macroscópica foram comparadas com dados da literatura, o que permitiu confirmar que a droga vegetal Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 71


Tabela 1- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de taninos em P. niruri Reativos Anacardium occidentale Phyllanthus niruri Reação com clore to Fér r ico ( Gerai s) PRECIPI TADO AZUL - Reação com Solução Aquosa de Alcaló ides PRECIPI TADO CASTANH O - Reação com Acetat o Neutro de Chumb o PRECIPI TADO CASTANH O - Reação com Solução de Acetat o de Cobre PRECIPI TADO CASTANH O - Reação com Acetat o de Chumb o e Ácido acétic o Glacial PRECIPI TADO CASTANH O - Reati vo de WASICK Y PRECIPI TADO ROSA - Reação com Clore to Fér r ico ( Especí fica) ( -) ausênc ia COLORAÇÃO VERDE - Tabela 2- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de glicosídeos saponínicos. Reativos Quilaia saponaria Phyllanthus niruri R ossol + - M itche ll + - R osent halen + - R eativo Sulfo-Vaníl ico + - L ieberm ann ( + ) pres ença ( -) ausênc ia + - Tabela 3- Resultado das reações indicativas da presença ou ausência de glicosídeos flavanoídicos. Reativos Ginkgo biloba Phyllanthus niruri S hino da V ERDE ( flavona s) VERDE ( flavona s) Clore to de Alumí nio FLORESC ÊN CIA AMARELO - ACASTAN HADO ( flavono l) FLORESC ÊN CIAAMARE LO-ACASTA- NHADO ( flavono l) Clore to Fér r ico AMARELO -ACASTAN HADO ( flavono l) VERDE ( flavona s) H idró xido de sódio A MARELA ( flavono l) AMARELA ( flavono l) Tabela 4- Resultado das reações da presença ou ausência de glicosídeos antraquinônicos. Reativos Dimorphandra mollis Phyllanthus niruri Bornt räege r verme lho verme lho Hidró xido de Sódio verme lho verme lho Tabela 5- Resultados das reações indicativas da presença ou ausência de alcalóides. Reativos Chichona calisaya Phyllanthus niruri Sheibl er AMARELO CLARO AMARELO CLARO Bourch ardat AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO Dragen dorff AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO Bertr and AMARELO TIJOLO AMARELO TIJOLO Mayer BRANCO BRANCO em análise era mesmo a espécie Phyllanthus niruri L (Souza, 2003). Nos testes realizados para identificar os taninos, foi usada como droga padrão o cajueiro (Anacardium occidentale), droga vegetal que tem como principais constituintes químicos os taninos, e a droga em estudo não indicou a presença de taninos nos testes realizados (Tabela-1). 5.1 - Saponinas Para as reações de identificação de heterosídeos saponínicos foi utilizada como droga padrão a quilaia (Quilaia saponaria) para compará-la com a droga em estudo. Os resultados demonstraram que a P. niruri não possui saponinas (Tabela-2). 72 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 5.2 - Flavonóides Para as reações de identificação de flavonóides, utilizou-se como droga padrão a Ginkgo (Ginkgo biloba ). Os resultados das análises mostraram que a espécie P. niruri apresentou flavonóides na sua composição química, de acordo com que se pode observar na tabela (Tabela-3).


5.3 - Glicosídeos Antraderivados Para os resultados das reações indicativas da presença ou ausência foi utilizada como droga padrão o faveiro (Dimorphandra mollis ) e a droga vegetal em análise - P. niruri – apresentou, na sua composição química, indicativo da presença de glicosídeos antraquinônicos na forma oxidada, como podemos observar na tabela (Tabela-4). 5.4 - Alcalóides Para as reações de identificação de alcalóides, utilizou-se como droga padrão a quina (Chichona calisaya) e a espécie P. niruri em estudo apresentou resultado positivo na presença dos reativos para alcalóides, como se pode observar na tabela (Tabela-5). 5.5 - Óleos Voláteis No teste realizado para indicar a presença ou ausência de óleos voláteis, não foi possível, por meio dele, verificar a presença de óleos voláteis na espécie em análise - P. niruri 6 - Discussão Por meio das análises realizadas, foi possível identificar a droga vegetal em estudo como Phyllanthus niruri (quebra-pedra). Antes de se utilizar qualquer droga no preparo de medicamentos, deve-se submetê-la a uma análise rigorosa. A identificação e a pureza da droga, bem como a avaliação de seus princípios ativos são tarefas indispensáveis àqueles que buscam produtos de qualidade. De acordo com a literatura, o Phyllanthus niruri apresenta em sua constituição substâncias como glicosídeos antraquinônicos, flavonóides e alcalóides, além de outras que não foram investigadas no presente trabalho, mas que se sabe fazem parte da constituição química da planta. Acredita-se que algumas dessas substâncias sejam responsáveis pelo efeito terapêutico atribuído ao quebra-pedra, porém não se sabe ao certo qual dessas substâncias é especificamente a responsável por tal propriedade. Assim, os constituintes identificados na análise fitoquímica foram suficientes para afirmarmos que a planta utilizada era realmente o Phyllanthus niruri, sendo identificada a droga como verdadeira. Referências Bibliográficas AKISUE, G. Farmacognosia. Curso de identificação de drogas vegetais. São Paulo: Pharmakon, 2002. BARROS, M. E. Efeito do Phyllanthus niruri sobre a cristalização do oxalato de cálcio in vitro, São Paulo, (Tese de mestrado-Universidade Federal de São Paulo), 72 p, 2002. CAMPOS, A. H., SCHOR, N. Phyllanthus niruri inhibits calcium oxalate endocyte by renal tubular cells: its role in urolithiasis. Nephron, 81(4): 393-7, 1999. COSTA, A F. Farmacognosia. Lisboa. Fundação Calouste Gulbenkian, 3ed , v. 3, 2001. DE SOUZA, T. P., HOLZSCHUH, M. H., LIONCO, M. I., GONZALEZ, O. G., PETROVICK, P. R., Validation of a LC method for the analysis of phenolic compounds from extract of Phyllanthus niruri aerial parts. J. Pharm. Biomed Anal. 30 (2): 351-6, 2002. DIAS, M. A., CAMPOS, A. H., CECHINEL, V. F., YUNES, R. A., CALIXTO, J. B. Analysis of the mechanisms underlying the contract response induced by hydroalcoholic extract of Phyllanthus urinaria in the guinea-pig urinary blad in- vitro. J. Pharmacol, 47 (10): 846-51, 1995. DUKE, J. A. Handbook of Phytochemical Constituints of Gras Herbs and Other Economic Plants. USA: CRC Press, 2000. FREITAS, A. M., SCHOR, N., BOIM, M. A. The effect of Phyllanthus niruri on inhibitor of calcium oxalate crystallization and other factors associated with renal stone formation. BJU Int 89(9): 829-34, 2002. OGATA, T., HIGUCHI, H., MOCHIDA, S., KATO, A. E. T., KAJI, H. HIV-1 reverse transcriptase inhibitor from Phyllanthus niruri. AIDS Res. Hum. Retroviruses, 8 (11): 1937-44. 1992 SOUZA, G. S. Análise comparativa do desenvolvimento floral em Hevea brasiliensis (Willd. Ex. Adr. De Juss) Muell. Arg. e em Phyllanthus niruri L. (Euphorbiaceae). Tese de mestrado- Centro de Energia Nuclear na Agricultura- CENA, 2003. SIMÕES, C. M. O., SCHENKEL, E. P., GOSMANN, G., MELLO, J. C. P., MENTZ, L. A., PETROVICK, P. R. Farmacognosia da Planta ao Medicamento. Porto Alegre: Editora da UFSC, 3 ed. 833 p. 2001. TESKE, M., TRENTINI, A. M.M. Herbarium – Compêndio de Fitoterapia. 3 ed. São Paulo: Herbarium Laboratório Botânico Ltda, 1995. TONA, L., MESIA, K., NGIMBI, N. P., CHRIMWAMI, B., OKOND’AHOKA, C. K., BRUYNE, T., APERS, S., HERMANS, N., TOTTE, J., PIETERS, L., VLIETINCK, A. J., In-vivo antimalarial activity of Cassia occidentalis, Morinda morindoides e Phyllanthus niruri. Ann. Trop. Med. Parasitol, 95(1): 47-5, 2001. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 73


Pesquisa Jorge Fernando Pereira Biólogo, MS em Microbiologia Agrícola, Doutorando em Microbiologia Agrícola; Universidade Federal de Viçosa. dgfernando@yahoo.com Juliana Oliveira Lima Bióloga; Mestranda em Microbiologia Agrícola; Universidade Federal de Viçosa. ju.olima@bol.com.br Rodrigo Barros Rocha Biólogo; Mestrando em Genética e Melhoramento; Universidade Federal de Viçosa. rodrigobarrosrocha@yahoo.com.br Pilar Ximena Lizarazo Medina Bacteriologista; MS em Microbiologia Agrícola; Doutoranda em Microbiologia Agrícola; Universidade Federal de Viçosa. pixilime@hotmail.com Elza Fernandes de Araújo Bióloga; DS em Genética UFRGS; Profª Titular do Departamento de Microbiologia; Universidade Federal de Viçosa. ezfa@ufv.br Marisa Vieira de Queiroz Bióloga; DS em Genética e Melhoramento ESALQ- USP; Professora Adjunta do Departamento de Microbiologia; Universidade Federal de Viçosa. mvqueiro@ufv.br Ilustrações cedidas pelos autores Nitrato Redutase em Fungos Filamentosos O potencial multifuncional da nitrato redutase em pesquisas com biologia molecular de fungos Introdução ungos filamentosos podem metabolizar uma série de compostos nitrogenados para obterem o requerimento nutricional necessário para seu desenvolvimento. Nesses organismos, o metabolismo do nitrogênio é um processo altamente controlado por um complexo de proteínas reguladoras, que assegura grande eficiência na utilização das fontes de nitrogênio disponíveis. Esse complexo é constituído por uma série de proteínas que são requeridas para que vários compostos secundários sejam assimilados quando as fontes preferenciais de nitrogênio, isto é, o amônio ou a glutamina, não estão disponíveis (Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997). Entre os compostos secundários, o nitrato inorgânico é uma excelente fonte utilizável por muitos fungos filamentosos. Seu transporte para o meio intracelular é mediado pela permease do nitrato, e após sua assimilação, ocorre a redução seqüencial do nitrato a nitrito e do nitrito a amônio, catalisada, respectivamente, pelas enzimas nitrato e nitrito redutase. O amônio é considerado o ponto de partida para o metabolismo anabólico do nitrogênio em fungos e a sua incorporação em moléculas orgânicas é, então, realizada por dois sistemas: glutamato desidrogenase (GDH) ou glutamina sintase (GS)/ Glutaminaamida: 2-oxoglutarato amino transferase (GOGAT), que produzem glutamato e glutamina (Griffin, 1994) (Figura 1). A enzima nitrato redutase de fungos é um grande complexo multiredox, que possui 74 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 duas subunidades idênticas, cada uma composta de três grupos prostéticos em domínios separados. Na extremidade C-terminal, localiza-se o domínio FAD, mais ao centro da proteína, o domínio heme, e, na extremidade N-terminal, o domínio molibdênio. A reação catalítica envolve a transferência de um par de elétrons do NADH ou NADPH para os domínios FAD, heme e molibdênio e, então, para o nitrato. A especificidade pelo doador de elétrons é utilizada para classificar as nitrato redutases eucarióticas em 3 grupos: NADHespecífica (EC 1.6.6.1), que está presente na maioria das plantas superiores e em algumas algas, NADPHespecífica (EC 1.6.6.2), que é encontrada em fungos e NAD(P)Hbiespecífica, que é encontrada em algumas plantas e em algumas algas (Losada, 1976; Shen et al., 1976; Renosto et al., 1982). Em 1989, foi descrito o isolamento do primeiro gene da nitrato redutase de fungos filamentosos utilizando-se o organismo modelo Aspergillus nidulans (Malardier et al., 1989). Desde então, genes que codificam para a enzima nitrato redutase vêm sendo clonados e seqüenciados em diversas espécies de fungos filamentosos representados por organismos modelos de estudos genéticos em eucariotos, espécies com potencial de aplicação industrial ou com importância fitopatológica e micorrízica. O interesse na clonagem desse gene é baseado, principalmente, no estabelecimento de protocolos de transformação genética cujo valor biotecnológico é muito importante por representar um método de seleção geral e conveniente. Mas, além


de marca de seleção para transformação, esse gene também pode ser utilizado para estudos de organização e regulação gênica, análises filogenéticas, obtenção de mutantes, estudos de grupos de compatibilidade vegetativa e como isca para detecção e isolamento de elementos transponíveis. Baseado nesse contexto, este trabalho tem como objetivo apresentar resultados que contribuam para esse potencial multifuncional do gene da nitrato redutase em fungos filamentosos. Mesmo que, muitas vezes, dentro de uma mesma espécie, esse gene possa não ser utilizado com toda essa potencialidade, ele representa uma das maiores versatilidades de uso na micologia molecular. Organização dos genes de assimilação do nitrato O seqüenciamento e a comparação das seqüências de genes que codificam para nitrato redutase têm contribuído para estudos de organização gênica em fungos filamentosos, sendo esses estudos imprescindíveis para o conhecimento de características importantes como número e tamanho de íntrons, seqüências envolvidas com mecanismo de splicing, tamanho de regiões promotoras, ligação de genes e sentido da transcrição entre genes ligados. Um quadro comparativo da organização gênica entre os genes da nitrato redutase de 16 diferentes espécies de fungos filamentosos é apresentado na Figura 2. A análise de seqüências do gene da nitrato redutase revela a ausência de íntrons nos fungos Ustilago maydis (Banks et al., 1993) e Botryotinia fuckeliana (Levis et al., 1997a) e um máximo de 12 íntrons para Hebeloma cylindrosporum (Jargeat et al., 2000). Em Aspergillus fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. parasiticus, Penicillium chrysogenum e P. griseoroseum, ocorre a presença de 6 íntrons que, embora possuam tamanhos diferentes, estão localizados nas mesmas posições (Johnstone et al., 1990; Unkles et al., 1992; Kitamoto et al., 1995; Chang et al., 1996; Haas et al., 1996; Amaar e Moore, 1998; Pereira, 2001). Em Leptosphaeria maculans e Stagonospora nodorum, esse gene é interrompido por 4 íntrons que correspondem aos íntrons II, III, IV e VI de Aspergillus e Penicillium (Williams et al., 1994; Cutler et al., 1998), enquanto em Beauveria bassiana (número de acesso no Genbank X84950), Fusarium oxysporum, Gibberella fujikuroi, Metarhizium anisopliae (número de acesso no Genbank AJ001141) e Neurospora crassa, apenas 1 íntron está presente na mesma posição do íntron VI de Aspergillus e Penicillium (Okamoto et al. 1991; Diolez et al., 1993; Tudzynski et al., 1996). O gene da nitrato redutase de H. cylindrosporum parece ser o único que possui íntrons (11 e 12) na região correspondente ao domínio FAD (Jargeat et al., 2000). Pode-se observar na Figura 2 que o tamanho médio dos íntrons é de, aproximadamente, 58 pares de bases (pb), sendo o menor de 46 pb e o maior de 92 pb. Na grande maioria das vezes, esses íntrons não apresentam similaridade a não ser nas seqüências envolvidas com o processo de sua retirada (splicing). Os íntrons encontrados Figura 1 - Assimilação de nitrato em fungos filamentosos. nos genes que codificam a nitrato redutase em eucariotos não interrompem a seqüência codificadora em éxons com os respectivos domínios funcionais da enzima, sendo que a maioria deles parece estar dentro e não entre os domínios funcionais (Zhou e Kleinhofs, 1996). A localização dos íntrons é conservada dentro de fungos, algas e plantas superiores, em relação a genes para nitrato redutase, mas, mesmo assim, difere entre esses grupos. Em algas, os genes da nitrato redutase de Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri possuem 15 e 9 íntrons, respectivamente, localizados nos domínios molibdênio, heme e FAD. A posição de 8 dos 10 íntrons em Volvox é idêntica à de Chlamydomonas. Os quatro íntrons presentes em Oryzae sativa, Phaseolus vulgaris, Lypersicon esculentum e Nicotiana tobacum estão localizados, precisamente, na mesma posição (Zhou e Kleinhofs, 1996). Com base no número e na posição dos íntrons presentes nos genes da nitrato redutase de fungos filamentosos, algas e plantas, Zhou e Kleinhofs (1996) não puderam afirmar se, durante a evolução, os íntrons foram incorporados (gain hypotheses) ou perdidos (loss hypotheses). Então, os íntrons podem ter sido inseridos no gene da nitrato redutase após a divergência entre fungos e plantas, ou o ancestral desses grupos possuía todos os íntrons e esses foram perdidos independentemente após a divergência. Ainda, segundo esses autores, a hipótese de embaralhamento de éxons (exon shuffling), em que as seqüências que codificam regiões estruturais ou funcionais da proteína estariam delimitadas por íntrons, não parece se aplicar a esse caso, pois as seqüências que codificam os domínios funcionais das proteínas nitrato redutase apenas são separadas por íntrons em H. cylindrosporum (íntron 9 entre domínios molibdênio e heme). Além dos íntrons, a organização dos três genes relacionados com a assimilação do nitrato em fungos filamentosos pode ser separada em, pelo menos, quatro grupos diferentes (de A a D). No grupo A, os três genes estão ligados, mas os genes da nitrato e nitrito redutase são transcritos em direções opostas, sendo o gene do transportador transcrito na mesma Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 75


Figura 2 - Comparação da organização dos genes de assimilação do nitrato em fungos filamentosos. Em alaranjado, a região promotora intergênica dos genes nos quais foram relatadas ligação entre nitrito e nitrato redutase. As setas representam o sentido da transcrição nesses genes. As caixas abertas indicam a região estrutural com tamanho e posição dos íntrons em relação às regiões codificadoras dos domínios molibdênio, heme e FAD. O tamanho da região promotora e dos íntrons é dado em pares de bases. O número de aminoácidos das respectivas proteínas é dado à direita. direção da nitrito redutase. Essa organização é encontrada em A. nidulans, A. niger, A. parasiticus, A. fumigatus e P. chrysogenum (Johnstone et al., 1990; Unkles et al., 1992; Chang et al., 1996; Amaar e Moore, 1998; Haas e Marzluf, 1995). O tamanho da região intergênica é de 1.262 pb em A. nidulans (Johnstone et al., 1990), 1.668 pb em A. niger (Unkles et al., 1992), 1.670 pb em A. parasiticus (Chang et al., 1996), 1.229 pb em A. fumigatus (Amaar e Moore, 1998) e 661 pb em P. chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995). No grupo B, os três genes também estão ligados, mas o gene do transportador está entre os genes da nitrato e da nitrito redutase, sendo transcritos na mesma direção descrita no grupo A. Essa organização é encontrada em H. cylindrosporum (Jargeat et al., 2003). No grupo C, os genes da nitrato e da nitrito redutase estão ligados, são transcritos na mesma direção, mas o gene do transportador não está ligado, como é observado em L. maculans e S. nodorum (Williams et al., 1994; Cutler e Caten, 1999). O tamanho da região intergênica é de 1.438 pb em L. maculans (Williams et al., 1994) e 829 pb em S. nodorum (Cutler e Caten 1999). No grupo D, apesar da posição do transportador ainda não ter sido determinada, os três genes não parecem estar ligados, como ocorre em Neurospora crassa (Exley et al., 1993) e em Gibberella fujikuroi (Tudzynski et al., 1996). 76 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Regulação do gene da nitrato redutase As maiores contribuições para o conhecimento da regulação do metabolismo do nitrogênio em fungos filamentosos baseiam-se nos trabalhos realizados com os organismos A. nidulans e Neurospora crassa (Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997), sendo que, nos últimos anos, estudos também têm sido relatados para outras espécies como, por exemplo, Penicillium chrysogenum (Haas e Marzluf, 1995; Haas et al., 1996). A utilização de fontes de nitrogênio secundárias é controlada de maneira positiva e negativa, existindo um sistema de controle global e um


específico. A desrepressão de mais de 100 genes estruturais, incluindo, por exemplo, genes que codificam transportadores de aminoácidos, transportadores de purinas, proteases extracelulares e enzimas catabólicas, é dependente da presença do indutor e da ausência de fontes preferenciais de nitrogênio (amônio e glutamina). Essa desrepressão é realizada tanto pelo regulador global positivo areA em A. nidulans e seus correspondentes nit-2 em N. crassa e nre em P. chrysogenum, quanto por reguladores específicos. O gene areA codifica uma proteína reguladora de 876 resíduos de aminoácidos que contém um único domínio de ligação ao DNA, o qual reconhece e se liga a seqüências que contêm o core GATA (Kudla et al., 1990; Langdon et al., 1995). As proteínas AREA, NIT-2 e NRE possuem somente 30% de homologia, mas, considerando apenas o domínio de ligação ao DNA, a identidade é de 98% (Haas e Marzluf, 1995). Em AREA, o domínio de ligação ao DNA é constituído por um único dedo de Zn com quatro cisteínas, seguido de um domínio terminal básico, que apresenta uma estrutura compacta formada por dois pares de folhas-β seguidas por uma α-hélice e uma cauda não estruturada. As cadeias laterais ao dedo de Zn fazem contato altamente hidrofóbico no sulco maior da molécula de DNA e a cauda carboxi-terminal faz contato com o esqueleto de fosfato (Scazzocchio, 2000). Elementos com, pelo menos, duas cópias de seqüências GATA, que podem estar na mesma direção, ou em direções opostas, e com espaço de, pelo menos, 30 pb, são considerados fortes sítios de ligação para NIT-2 (Chiang e Marzluf, 1994). Para P. chrysogenum, Haas e Marzluf (1995) descreveram fortes sítios de ligação de NRE como regiões com, pelo menos, duas seqüências GATA com espaçamento entre 5 e 27 pb, configuradas na mesma direção ou em direções opostas. Elementos GATA separados por 74 ou 96 pb não demonstraram ser fortes sítios de ligação NRE (Haas e Marzluf, 1995). Para A. parasiticus, Chang et al. (2000) relataram a ligação de AREA a segmentos de 42 pb da região promotora dos genes da nitrato e da nitrito redutase que continham um ou dois elementos GATA. Outro gene importante para o metabolismo do nitrogênio é o nmr (do inglês nitrogen metabolism repressor), que atua de maneira negativa, reprimindo a síntese de vários genes. O gene nmr codifica uma proteína de 54,8 KDa, que não possui domínio de ligação ao DNA, mas é capaz de se ligar a uma pequena região do domínio de ligação ao DNA e à região carboxi-terminal da proteína NIT-2 (e possivelmente de AREA), impedindo a ação dessa proteína, sendo a glutamina o possível sinal para essa ligação (Xiao et al., 1995). Pelo menos para AREA, ainda existem outros dois níveis de regulação: a transcrição de areA é auto-regulada e a estabilidade do mRNA de areA é menor em células que crescem em fontes de nitrogênio preferenciais (Platt et al., 1996). Dessa forma, na presença de fontes preferenciais, além de uma menor estabilidade do mRNA do gene areA, o regulador NMR se liga à proteína AREA já sintetizada e impede que essa proteína se ligue aos promotores e induza a transcrição dos genes relacionados com o metabolismo de fontes secundárias de nitrogênio. Assim, a célula assegura a assimilação de nitrogênio a partir de compostos que são prontamente metabolizáveis. A indução do gene da permease do nitrato e dos genes da nitrato redutase (niaD para Aspergillus sp. e P. chrysogenum ou nit-3 para N. crassa) e nitrito redutase (niiA para Aspergillus sp. e P. chrysogenum ou nit-6 para N. crassa) requer síntese de novo, sendo necessária a ausência das fontes preferenciais e a presença de nitrato como indutor. Nesse caso, além do fator de regulação global, é necessária a presença de um fator específico chamado nirA em A. nidulans e nit-4 em N. crassa (Caddick et al., 1994; Marzluf, 1997). A proteína NIRA liga-se ao DNA a partir de um domínio na sua região amino-terminal (Burger et al., 1991). Essa proteína se liga à seqüência 5’- CTCCGHGG-3’, sendo que foram detectados sítios putativos ou já comprovados para essa proteína em várias espécies de ascomicetos (Punt et al., 1995). Para o reconhecimento de cis-elementos e expressão do gene nit-3 em N. crassa (Feng e Marzluf, 1998), é requerida uma interação específica entre os fatores de regulação NIT-2 e NIT-4. Em N. crassa, um acúmulo máximo de mRNA de nit-3 ocorre apenas 15 minutos após a indução por nitrato, sendo que o acúmulo máximo de proteína ocorre após 60 minutos, e em P. chrysogenum transcritos de niaD são detectados com 15 minutos de indução, e atingem um nível máximo após 60 minutos (Okamoto et al., 1991; Haas et al., 1996). Até a presente data, a única exceção é o basidiomiceto H. cylindrosporum, onde o gene da nitrato redutase possui alto nível de transcrição na presença de nitrato, uréia, serina e glicina, sendo possível, neste caso, a inexistência de fatores de regulação específicos. Entretanto, na presença de amônio, ocorre uma forte, mas incompleta, repressão desse gene, indicando a existência de um sistema de regulação geral (Jargeat et al., 2000). Recentemente, foi reportado, para H. cylindrosporum, que a transcrição dos genes da permease do nitrato e da nitrito redutase também não é induzida por nitrato, mas é completamente reprimida por amônio (Jargeat et al., 2003). Relações filogenéticas baseadas na proteína nitrato redutase Apesar da proteína nitrato redutase apresentar regiões comprovadamente importantes para seu funcionamento, outras regiões parecem poder sofrer variação sem acarretar perda de funcionalidade para a proteína. A região Nterminal e 2 regiões curtas, entre os domínios molibdênio e heme e heme e FAD, apresentaram menor identidade entre 17 outras proteínas nitrato redutase de plantas, algas e fungos quando foram comparadas por Zhou e Kleinhofs (1996). Essa característica de apresentar regiões conservadas que flanqueiam regiões que podem sofrer variação é interessante para estudos de filogenia. Esses mesmos autores verificaram que o gene da nitrato redutase pode ser utilizado como relógio molecular, pois genes de diferentes espécies evoluem em uma taxa constante, e, baseados nesse gene, estimaram o tempo de divergência entre fungos e plantas, em torno de 1 bilhão de anos e, entre algas e plantas superiores, em torno de 750 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 77


milhões de anos. Além do uso como relógio molecular, estudos filogenéticos com a proteína nitrato redutase de fungos filamentosos têm revelado uma tendência de agrupar espécies que pertençam a categorias taxonômicas comuns (Williams et al., 1994; Cutler et al., 1998). Assim, esse gene possui características interessantes para uso em estudos evolucionários. Na Figura 3 é apresentada uma árvore filogenética não enraizada baseada na seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase. Para a construção dessa árvore, seqüências da proteína nitrato redutase de 16 fungos filamentosos e 1 planta foram retiradas do GenBank na página do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov) por meio dos seguintes números: Aspergillus fumigatus (AF336236), A. nidulans (M58291), A. niger (M77022), A. oryzae (D49701), A. parasiticus (U38948), Arabdopsis thaliana (P11832), Beauveria bassiana (X84950), Botryotinia fuckeliana (U43783), Fusarium oxysporum (Z22549), Gibberella fujikuroi (X90699), Hebeloma cylindrosporum (AJ238664), Leptosphaeria maculans (U04445), Metarhizium anisopliae (AJ001141), Neurospora crassa (X61303), Penicillium chrysogenum (U20779), P. griseoroseum (AY255803), Stagonospora nodorum (AJ009827) e Ustilago maydis (AJ315577). O alinhamento de toda a seqüência de aminoácidos foi realizado no programa Clustal X (Thompson et al., 1997), sendo o alinhamento resultante analisado pelo método de parsimônia no programa PAUP* versão 3.1 (Swofford, 1993). Foi feita uma busca heurística e análise de bootstrap com 1.000 réplicas para gerar índices de confiabilidade para cada ramo. Pode-se observar claramente a tendência de se agruparem as espécies analisadas pela ordem à qual essas pertencem de acordo com a Figura 3 - Árvore filogenética não enraizada, baseada em análises pelo método de parsimônia da seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase de vários fungos filamentosos. Os números indicam porcentagem dos valores de bootstrap em análise com 1.000 réplicas. 78 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 taxonomia clássica. Dessa forma, a seqüência de aminoácidos da proteína nitrato redutase apresenta uma aplicação para estudos filogenéticos, com forte reflexo da história natural dos fungos filamentosos. Obtenção de mutantes deficientes na enzima nitrato redutase Uma das grandes vantagens na aplicação do gene da nitrato redutase é a fácil obtenção de mutantes espontâneos por seleção positiva via resistência ao clorato. Essa seleção positiva, que favorece o crescimento do mutante em relação ao selvagem, é baseada na “similaridade” entre a molécula de nitrato e seu análogo tóxico, o clorato. Da mesma forma que o nitrato, o clorato presente no meio de cultura é transportado para o meio intracelular pela permease do nitrato e é reduzido a clorito pela ação da enzima nitrato redutase. Entretanto, diferentemente do nitrito, o clorito é um composto tóxico que promove a morte da célula. A teoria de que o clorato por si só não é tóxico, mas se torna tóxico pela conversão a clorito como resultado da ação da nitrato redutase, foi primeiramente sugerida por Aberg (1947) e tem sido confirmada por uma série de trabalhos. Análises do efeito do clorito de sódio, tanto in vitro como in vivo, sugerem que o clorito cause estresse oxidativo em células de fungos e, por causar oxidação de biomoléculas importantes, torna-se tóxico (Ingram et al., 2003). Dessa maneira, a célula que apresenta uma enzima nitrato redutase funcional morre e aquela que apresenta uma forma não-funcional sobrevive, pois não é capaz de reduzir o clorato a clorito. Nesse momento, a colônia mutante, que cresce no meio de cultura, é resistente ao clorato, mas não necessariamente é mutante para a enzima nitrato redutase. Mutações em, pelo menos, cinco genes podem levar ao fenótipo de resistência ao clorato: (i) mutação no gene da permease do nitrato (crnA), que incapacite a célula de absorver o clorato do meio extracelular; (ii) mutação no gene do regulador específico da assimilação de nitrato (nirA), que impos-


Figura 4 - Obtenção de mutantes nitrato redutase. 1-) Esquema do protocolo para obtenção de mutantes resistentes ao clorato e testes de crescimento para anotação da mutação; 2-) Vias metabólicas envolvidas com o fenótipo de resistência ao clorato (possíveis genes mutados são mostrados em laranja); 3-) Fenótipo de crescimento em placas contendo MM + nitrato (A), MM + nitrito (B) e MM + hipoxantina (C) de mutantes de Penicillium griseoroseum resistentes ao clorato. Colônias que não crescem em A mas crescem em B e C são mutantes nitrato redutase; S indica o tipo selvagem utilizado como controle positivo. sibilite a célula de expressar a enzima nitrato redutase; (iii) mutação no gene do regulador geral da assimilação de nitrogênio (areA), que também impossibilite a célula de expressar a enzima nitrato redutase; (iv) mutação em algum gene envolvido na biosíntese do cofator molibdênio (cnxA-J), que, não estando presente, torna ineficazes a enzima nitrato redutase e outras enzimas dependentes desse cofator; e (v) mutação no próprio gene da nitrato redutase (niaD), impossibilitando a célula de sintetizar essa enzima (Cove, 1976; Cove, 1979). Dessa forma, após a obtenção das colônias resistentes ao clorato, é necessário fazer uma discriminação do fenótipo mutante por meio de um fácil teste de crescimento em meio mínimo contendo as seguintes fontes de nitrogênio: nitrato, nitrito, hipoxantina, glutamato e amônio . O crescimento ou não nes- Tabela 1 - Testes de crescimento de mutantes resistentes ao clorato, em diferentes fontes de nitrogênio. Mutação Designação do mutante* Testes de crescimento Clorato Nitrato Nitrito Hipoxantina Glutamato Amônio Nenhu ma Selvagem - + + + + + Nitra to redut ase n iaD + - + + + + Regula dor especí fico n irA + - - + + + Cofator molib dênio c nxA-J + - + - + + Regula dor geral a reA + - - - - + Perme ase c rnA + + + + + + * denomi nação dos genes para A spe rgillus nidulan s; + indic a cres cime nto e - indic a ausênc ia de cres cime nto. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 79


sas diferentes fontes (Tabela 1) é, então, correlacionado com a mutação em um dos cinco possíveis genes acima relacionados (Figura 4). Como em todas as espécies de fungos filamentosos estudadas até o momento, apenas uma cópia funcional do gene da nitrato redutase foi encontrada, mutantes nitrato redutase são reportados com alta freqüência. A razão do teste de crescimento em hipoxantina é que, além do requerimento por NAD(P)H, as enzimas nitrato redutase são dependentes de uma molécula chamada cofator molibdênio. A ausência desse cofator impossibilita a célula de utilizar o nitrato como também purinas como adenina, hipoxantina e xantina como única fonte de nitrogênio. Os mutantes incapazes de crescer em nitrato e hipoxantina apresentam uma perda pleiotrópica da atividade das enzimas nitrato redutase e xantina desidrogenase, respectivamente. Como esses mutantes são defectivos na síntese de um cofator comum, tanto para a nitrato redutase como para xantina desidrogenase, os genes envolvidos na síntese desse cofator foram denominados cnx (do inglês common component for nitrate reductase and xanthine dehydrogenase) (Pateman et al., 1964; Cove, 1979). Por meio de testes de complementação entre diferentes mutantes, Pateman et al. (1964) reportaram a existência de vários loci (cnx ABC, E, F, G e H) relacionados com vários genes responsáveis pela produção do cofator molibdênio, e Arst et al. (1982) relataram a existência de outro locus (cnxJ). Unkles et al. (1997) comprovaram que o locus cnxABC é parte de um único gene que codifica uma proteína com dois domínios catalíticos requeridos para a síntese de um intermediário do cofator molibdênio. Um protocolo para obtenção de mutantes deficientes na enzima nitrato redutase é apresentado a seguir e está esquematizado na Figura 4. Esse protocolo baseia-se em espécies que apresentam reprodução assexual e/ou sexual possibilitando o uso de esporos na análise. Como na grande maioria das espécies de fungos filamentosos os esporos são uninucleados e contêm genoma haplóide, a mutação é expressa sem efeito de dominância. Mesmo assim, algumas espécies de fungos não produzem esporos in vitro, e esse protocolo pode ser modificado para obtenção de mutantes por intermédio de fragmentos de micélio, onde setores resistentes ao clorato apresentam crescimento mais vigoroso. Entretanto, em algumas espécies de fungos, a resistência ao clorato parece ser natural, o que impossibilita a obtenção de mutantes por essa técnica. Protocolo para obtenção de mutantes nitrato redutase (segundo Cove, 1976; Cove, 1979; Unkles et al., 1989): • Preparar uma suspensão de esporos em tween 80 0,05% contendo cerca de 10 7 .ml -1 esporos; • Plaquear 0,1 ml dessa solução em meio mínimo (MM) sólido (Pontecorvo et al., 1953) sem nitrato e acrescido de 470 mM de clorato de potássio e 10 mM de glutamato de sódio (clorato de potássio 57,6 g; glutamato de sódio monobásico 1,87 g; KH 2 PO 4 1,5 g; KCl 0,5 g; MgSO 4 0,5 g; FeSO 4 0,01 g; ZnSO 4 0,01 g; glicose 10 g; ágar 15 g; água destilada 1.000 ml; pH 6,8); • Incubar as placas a 25 o C por cerca de 7 a 10 dias; • Transferir as colônias resistentes ao clorato para placas contendo meio completo (MC) sólido, Pontecorvo et al. (1953) modificado por Azevedo e Costa (1973) [meio mínimo adicionado de peptona 2,0 g; caseína hidrolisada 1,5 g; extrato de levedura 2,0 g; solução de vitaminas 1,0 ml; (biotina 0,2 mg; ácido p-aminobenzóico 10,0 mg; piridoxina 50,0 mg; tiamina 50,0 mg; ácido nicotínico 100,0 mg; riboflavina 100,0 mg; água destilada 100 ml); ágar 15 g; água destilada 1.000 ml; pH 6,8]; • Fazer purificação monospórica dos mutantes; • Inocular as colônias resistentes em placas de MM contendo 10 mM das seguintes fontes de nitrogênio : nitrato de sódio, nitrito de sódio, cloreto de amônio, hipoxantina e glutamato de sódio; • Incubar a 25 o C por 3 a 5 dias; 80 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 • Verificar o crescimento e anotar os fenótipos mutantes; • Separar e identificar os mutantes nitrato redutase. Assim, o sistema nitrato redutase apresenta vantagens sobre outros sistemas, como a fácil obtenção de mutantes espontâneos por seleção positiva via resistência ao clorato, e, como não há emprego de mutagênese, a possibilidade de mutações secundárias que atinjam genes importantes ou de interesse é reduzida. Também esses mutantes apresentam um único fenótipo desejável, não utilizar nitrato como única fonte de nitrogênio, sendo que esse fenótipo é dispensável sem alterar o crescimento ou fluxos metabólicos importantes. Utilização de mutantes deficientes na utilização do nitrato em estudos de grupos de compatibilidade vegetativa Isolados de uma espécie fúngica podem ser caracterizados pela compatibilidade ou incompatibilidade vegetativa. A compatibilidade ocorre quando micélios de diferentes isolados podem sofrer anastomoses e originar heterocários (hifas que contêm núcleos geneticamente diferentes), enquanto a incompatibilidade ocorre quando não há formação de heterocários. Nem sempre é possível formar essas anastomoses, principalmente quando os cruzamentos são interespecíficos ou intergenéricos, pois o fator determinante da interação entre as células pode estar na parede celular manifestando-se como bloqueio da fusão celular (Peberdy, 1991). Os isolados que apresentem compatibilidade podem ser colocados dentro de um mesmo grupo, formando um grupo de compatibilidade vegetativa (GCV). Em fungos de reprodução assexuada, isolados de um mesmo GCV são mais similares geneticamente que isolados de diferentes GCV. A heterocariose também é a primeira etapa para que fungos assexuados troquem material genético por meio de um ciclo alternativo chamado parassexual. Nesse ciclo, os diferentes núcleos no heterocário se fundem, originando diplóides he-


terozigotos, e, a seguir, ocorre a produção de recombinantes por meio de recombinação mitótica e haploidização (Pontecorvo & Roper, 1952). A detecção de heterocários pode ser alcançada pelo cruzamento de indivíduos portadores de diferentes mutações. Quando são formadas anastomoses entre as hifas desses diferentes mutantes, o heterocário pode ser visualizado já que o núcleo de um indivíduo contém o gene selvagem que complementa a mutação do outro. As diferentes mutações podem estar relacionadas, por exemplo, à coloração da colônia, mas a obtenção de mutantes por técnicas de mutagênese tradicionais é muito trabalhosa, o que torna esse procedimento difícil de ser empregado para estudo com muitos isolados de campo. Assim, vários trabalhos reportam o estudo de GCVs utilizando mutações auxotróficas que incapacitem a célula de utilizar nitrato como única fonte de nitrogênio (Puhala, 1985; Correl et al., 1986; Brooker et al., 1991). Nesses estudos, é suficiente fazer a triagem de populações utilizando indivíduos que contenham mutações únicas em diferentes genes da assimilação do nitrato, que possam ser testados para a sua habilidade de complementar as mutações e de formar heterocário em meio contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. Como o isolamento de mutantes resistentes ao clorato gera mutações de diferentes tipos, essas mutações podem ser utilizadas como marcas de seleção para a formação dos heterocários. Assim, esse sistema tornase simples e rápido para ser utilizado para essa finalidade. Estudos de compatibilidade vegetativa são de particular interesse em fungos que se reproduzem assexuadamente, já que os indivíduos dentro de um GCV podem trocar informações genéticas por meio de heterocariose e de ciclo parasexual. Em fungos fitopatogênicos, os GCVs podem ser correlacionados com a patogenicidade, embora essa correlação não esteja sempre ligada. Puhalla (1985) utilizou mutantes deficientes na assimilação de nitrato para testar a compatibilidade vegetativa entre 21 isolados de F. oxysporum, reportando que membros do mesmo GCV pertenciam à mesma formae speciales. Correl et al. (1986) também utilizaram mutantes incapazes de metabolizar nitrato em testes de compatibilidade vegetativa para identificar F. oxysporum f. sp. apii raça 2 de uma população de raças de F. oxysporum que colonizava raízes de aipo. Assim, o teste de compatibilidade vegetativa é uma ótima ferramenta para estudos de diversidade genética constituindo marcadores genéticos naturais que podem ser utilizados para diferenciar isolados. Além disso, em fungos que se reproduzem sexuadamente, esses estudos também são importantes para determinar genes relacionados com o tipo sexual (mating type), importantes no reconhecimento e desenvolvimento do ciclo sexual. Transformação genética baseada no gene da nitrato redutase Um dos principais passos no desenvolvimento de uma tecnologia para manipulação e análise molecular de um organismo é o estabelecimento de um protocolo que permita introduzir seqüências de DNA clonadas em uma linhagem recipiente. A disponibilidade de um sistema de transformação oferece possibilidade de adição e de deleção de rotas metabólicas em um organismo de interesse, alterando o fenótipo selvagem para uma aplicação específica. As seqüências a serem introduzidas têm interesses distintos, dependendo do tipo de organismo estudado. Dessa forma, o principal objetivo da clonagem de genes que codificam nitrato redutase é o estabelecimento de protocolos de transformação baseados na complementação de mutações no gene da nitrato redutase. Nesse ponto, além das vantagens inerentes a esse sistema, outra característica importante é ser baseado na complementação de uma mutação auxotrófica, o que evita a introdução de genes de seleção baseados na resistência a drogas. A transformação é realizada pela introdução do gene da nitrato redutase em um mutante nitrato redutase por biobalística ou Agrobacterium tumefaciens, sendo que o método mais comum é o da transformação de protoplastos pela técnica do polietilenoglicol (PEG)/CaCl 2 . Após a trans- formação, os protoplastos são plaqueados por pour-plate em meio mínimo contendo estabilizador osmótico e nitrato como única fonte de nitrogênio. Apenas aquelas células mutantes onde o gene da nitrato redutase se integrar, serão capazes de crescer (Figura 5). Para tanto, pode-se utilizar um gene da nitrato redutase já isolado de um organismo em uma espécie de interesse. Quando o gene é de uma espécie diferente da espécie receptora, o sistema é dito heterólogo, e quando o gene foi isolado do organismo receptor, o sistema é dito homólogo. Nos sistemas heterólogos, geralmente há baixa similaridade entre o vetor de transformação e o genoma do organismo receptor, o que resulta em baixa freqüência de transformação, integração aleatória e alto número de cópias do vetor. Esse padrão de integração aleatório pode ser interessante para obtenção de mutantes pela técnica de REMI (do inglês restriction enzyme-mediated integration), descrita por Schiestl e Petes (1991), que é uma variação da técnica de transformação, onde enzima de restrição é adicionada à mistura de transformação juntamente com o plasmídeo linear. Queiroz et al. (1998) verificaram que o gene da nitrato redutase de F. oxysporum se integrava aleatoriamente no genoma de P. griseoroseum, sendo essa característica utilizada por Soares (2002) para obtenção de mutantes de P. griseoroseum pela técnica de REMI. Mesmo assim, sistemas de transformação homólogos têm sido desenvolvidos para vários fungos filamentosos, incluindo A. oryzae (Unkles et al., 1989), Cephalosporium Figura 5 - Seleção de transformantes baseada no gene da nitrato redutase. Placas com meio mínimo contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. (A) Controle negativo - protoplastos do mutante nitrato redutase que não foram transformados; (B) protoplastos do mesmo mutante que foram transformados com gene homólogo da nitrato redutase. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 81


acremonium (Whithead et al., 1990), P. chrysogenum (Gouka et al., 1991), Fusarium oxysporum (Diolez et al., 1993), G. fujikuroi (Tudzynski et al., 1996), B. cinerea (Levis et al., 1997a), S. nodorum (Cutler et al., 1998) e P. griseoroseum (Pereira, 2001). Na literatura, existem relatos para A. oryzae (Unkles et al., 1989) e S. nodorum (Cutler et al., 1998) de 100% de integração do vetor no locus da nitrato redutase, sendo que nesses estudos foram analisados 22 transformantes para A. oryzae e 13 transformantes para S. nodorum. Para B. cinerea (Levis et al., 1997a), a análise de 36 transformantes revelou 34 integrações homólogas, sendo 29 eventos de troca gênica. Mesmo que a utilização de genes homólogos aumente a probabilidade de ocorrência de integração em sítios homólogos, para fungos filamentosos e outros organismos eucariotos, parecem ser mais comuns eventos de integração heteróloga. Sistemas de transformação homólogos, baseados na complementação de mutações nitrato redutase, desenvolvidos para Cephalosporium acremonium (Whitehead et al., 1990) e P. chrysogenum (Gouka et al., 1991) resultam, na maioria dos transformantes, na integração do vetor em sítios diferentes do locus da nitrato redutase, enquanto que G. fujikuroi (Tudzynski et al., 1996) e F. oxysporum (Diolez et al., 1993) ocorreu um número similar de integrações, dentro e fora desse locus. Um sistema de transformação com alta incidência de integração homóloga, especialmente troca gênica, pode ser utilizado para estudos de regiões importantes, tanto em nível de regulação como em nível estrutural. Assim, mutações geradas in vitro, como alteração dos sítios de ligação de proteínas reguladoras, podem ser introduzidas e avaliadas in vivo no exato local onde reside o gene. Além disso, essa alta taxa de integração homóloga é interessante em experimentos de co-transformação, pois diminui a probabilidade de integrações em sítios heterólogos que sejam importantes para o metabolismo celular e/ou de interesse biotecnológico. Vários trabalhos relatam a utilização de vetores de transformação que carregam o gene da nitrato redutase como marcadores de seleção em experimentos de co-transformação para introduzir genes de interesse biotecnológico. Por exemplo, Ribeiro (2001) relatou a obtenção de transformantes com até 89% de aumento na produção de poligalacturonase quando co-transformou um mutante nitrato redutase de P. expansum com o plasmídeo pPE 15, que carrega o gene homólogo de poligalacturonase, e o plasmídeo pNH24, contendo o gene da nitrato redutase de F. oxysporum como marcador de seleção. Linhagens transformantes de A. oryzae apresentaram a produção de poligalacturonase aumentada em até 3,2 vezes quando transformadas com um gene de poligalacturonase de Penicillium janthinellum, sendo os transformantes selecionados pela complementação de uma mutação nitrato redutase (Ishida et al. 1997). Cardoso et al. (2003) utilizaram o gene homólogo da nitrato redutase de P. griseoroseum para introduzir uma construção do gene da pectina liase e obtiveram transformantes com aumento expressivo na atividade dessa enzima. Utilização do gene da nitrato redutase como vetor de expressão Uma outra perspectiva na aplicação biotecnológica do gene da nitrato redutase é sua utilização como vetor de expressão. Isso é baseado nas análises de expressão onde são observadas grandes quantidades de transcrito do gene da nitrato redutase apenas poucos minutos após sua indução por nitrato (Okamoto et al., 1991; Haas et al., 1996), sendo esse indutor acessível e de baixo custo. Essa perspectiva é importante uma vez que muitos genes de valor biotecnológico somente são expressos na presença de um indutor específico que, muitas vezes, é oneroso e acarreta a inviabilidade da aplicação industrial. Para tanto, a região estrutural do gene de interesse pode ser clonada sob controle do promotor do gene da nitrato redutase, abrindo a possibilidade para a indução do gene por uma fonte mais acessível e apenas no momento em que o indutor estiver presente. 82 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Uso da nitrato redutase para detecção e isolamento de elementos transponíveis Elementos transponíveis são seqüências de DNA que podem se mover no genoma integrando-se em regiões não homólogas, e que constituem importantes agentes de mutação e reorganização gênica, sendo também utilizados em sistemas de inativação de genes. Assim, detectar e isolar esses elementos é um importante passo para estudos de biologia básica e aplicada em um organismo. Diferentes estratégias são empregadas para o isolamento de elementos transponíveis em fungos filamentosos. Entre essas diferentes estratégias, o método de armadilha para transposons (“transposons trapping”) é o melhor método para detecção e isolamento de elementos transponíveis ativos. Esse método requer, além de um sistema de seleção positiva de mutantes espontâneos, que o gene alvo esteja clonado e caracterizado. Conforme discutido anteriormente, um dos melhores sistemas para seleção positiva de mutantes espontâneos é o sistema nitrato redutase. Dessa maneira, esse sistema vem sendo empregado com muito sucesso para o isolamento de vários elementos transponíveis em fungos filamentosos. Os elementos Fot1, impala, Ant1, Vader, Flipper e hupfer, são exemplos de transposons clonados pela seleção de mutações espontâneas no gene da nitrato redutase em Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, A. fumigatus, Botrytis cinerea e Beauveria bassiana (Daboussi et al., 1992; Langin et al., 1995; Glayzer et al., 1995; Amutan et al., 1996; Levis et al., 1997b; Maurer et al., 1997). Para isolar esses elementos utilizando-se o sistema nitrato redutase, é necessário isolar mutantes nitrato redutase e caracterizar, por hibridização com o gene alvo, o tipo de mutação que originou o fenótipo mutante. Nos mutantes isolados podem ocorrer mutações de diferentes tipos no gene da nitrato redutase, como, por exemplo, mutações pontuais, deleções ou inversões. Além


Figura 6 - Esquema da detecção e isolamento de elementos transponíveis utilizando o gene da nitrato redutase como isca. desses tipos, também pode ocorrer a inserção de um fragmento de DNA, como a inserção de um elemento transponível. Assim, espera-se que o resultado da hibridização apresente algum mutante com o fragmento do gene alvo maior quando comparado ao tipo selvagem (Figura 6). Após a obtenção de um mutante com a inserção, pode-se fazer um teste de estabilidade plaqueando-se esporos do mutante em meio mínimo contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. Se a inserção for oriunda de um transposon ativo, esse pode saltar e reconstituir o fenótipo selvagem, apresentando maior instabilidade. O fragmento inserido, ou parte dele, pode ser recuperado por meio de bancos genômicos parciais ou de amplificação com oligonucleotídeos específicos e, então, seqüenciado e caracterizado. Mesmo que o gene da nitrato redutase não tenha sido clonado para uma espécie de interesse, há possibilidade de usar um gene heterólogo conforme realizado com sucesso por Daboussi et al. (1992). Esses autores introduziram o gene da nitrato redutase de A. nidulans em uma linhagem mutante para nitrato redutase de F. oxysporum e isolaram o elemento Fot1 inserido no gene heterólogo. Assim, a fácil seleção de mutantes nitrato redutase têm-se mostrado uma ótima ferramenta no isolamento de elementos transponíveis ativos em diferentes espécies de fungos filamentosos. Referências Bibliográficas Aberg B, 1947. On the mechanism of the toxic action of chlorates and some relates substances upon young wheat plants. Kungl. Lantbrushögskolans Ann. 15:37- 107. Amaar YG, Moore MM, 1998. Mapping of the nitrateassimilation gene cluster (crnAniiA-niaD) and characterization of the nitrite reductase gene (niiA) in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Curr. Genet. 33:206- 215. Amutan M, Nyyssönen E, Stubbs J, Dias-Torres MR, Dunn-Coleman N, 1996. Identification and cloning of a mobile transposon from Aspergillus niger var. awamori. Curr. Genet. 29:468-473. Arst HNJr, Tollervey DW, Sealy-Lewis, HM, 1982. A possibly regulatory gene for the molybdenumcontaining cofactor in Aspergillus nidulans. J. Gen. Microbiol. 128:1083-1093. Azevedo JL, Costa SOP, 1973. Exercícios práticos de genética. São Paulo: ed. Nacional, EDUSP, 288 p. Banks GR, Shelton PA, Kanuga N, Holden DW, Spanos S, 1993. The Ustilago maydis nar1 gene enconding nitrate reductase activity: sequence and transcriptional regulation. Gene 131:69-78. Brooker NL, Leslie JF, Dickman MB, 1991. Nitrate non-utilizing mutants of Colletotrichum and their use in studies of vegetative compatibility and genetic relatedness. Phytopathol. 81:672- 677. Burger G, Tilburn J, Scazzocchio C, 1991. Molecular cloning and functional characterization of the pathway-specific regulatory gene nirA, which controls nitrate assimilation in Aspergillus nidulans. Mol. Cell. Biol. 11:795- 802. Caddick MX, Peters D, Platt A, 1994. Nitrogen regulation in fungi. Antonie van Leeuwenhoek 64:169-177. Cardoso PG, Teixeira JA, Ribeiro JB, Queiroz MV, Araújo EF, 2003. Transformantes de Penicillium griseoroseum superprodutores de pectina liase. Anais do Congresso de Genética, Sociedade Brasileira de Genética, Águas de Lindóia, S.P. Chang PK, Ehrlich KC, Linz JEL, Bhatnagar D, Cleveland TE, Bennet JW, 1996. Characterization of the Aspergillus parasiticus niaD and niiA gene cluster. Curr. Genet. 30:68-75. Chang PK, Yu J, Bhatnagar D, Cleveland TE, 2000. Characterization of the Aspergillus parasiticus major nitrogen regulatory gene, areA. Biochim. Biophys. Acta 1491:263- 266. Chiang TY, Marzluf GA, 1994. DNA Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 83


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Pesquisa Carla M. Y. Lemos Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada IBILCE - UNESP, Pós Graduação em Microbiologia Aplicada IB/UNESP - Rio Claro-SP Erica Fuchs Department of Food Science and Human Nutrition Iowa State University, IA-USA Eleni Gomes Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada Departamento de Biologia IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP Roberto Da Silva Lab. de Bioquímica e Microbiologia aplicada, Departamento de Química e Ciências Ambientais, IBILCE - UNESP - São José Rio Preto-SP dasilva@qca.ibilce.unesp.br Ilustrações cedidas pelos autores Glucoamilase: Estrutura e termoestabilização 86 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Estrutura e termoestabilização de glucoamilase por técnicas moleculares Resumo A glucoamilase (GA) é uma enzima hidrolítica que catalisa a liberação sucessiva de β-D-glucose a partir do amido e oligossacarídeos relacionados. A GA catalisa eficientemente a reação de sacarificação do amido dentro de uma faixa estreita de temperatura. A sua termoestabilidade limitada afeta seu uso no processo industrial, onde a incubação prolongada em altas temperaturas é necessária. As estratégias tradicionais para melhorar a termoestabilidade da GA de Aspergillus, tais como a imobilização e modificação química têm falhado no uso industrial. Atualmente, as técnicas de evolução dirigida utilizando a biologia molecular proporcionam uma importante ferramenta para melhorar ou mesmo criar novas propriedades nas enzimas existentes, em um curto espaço de tempo. Esta revisão apresenta a importância, estrutura e função da glucoamilase e as recentes estratégias da biologia molecular como ferramenta para melhorar a termoestabilidade desta enzima. 1. Glucoamilase de Aspergillus A glucoamilase (α-1,4-glucan glucohidrolase, EC 3.2.1.3), também conhecida como amiloglucosidase, é uma enzima hidrolítica que catalisa a quebra das ligações glicosídicas α- 1,4 a partir de uma extremidade não redutora das moléculas de amilose ou amilopectina do grânulo de amido e oligossacarídeos relacionados liberando β-D-glucose. Em uma ve- locidade menor, a glucoamilase também atua hidrolisando as ligações α- 1,6 (Fleetwood e Weigel, 1962). Sugere-se, portanto, que a ação da glucoamilase ocorra através de um mecanismo multisseriado no qual a enzima atua aleatoriamente em toda a molécula de substrato (James e Lee, 1997). A glucoamilase (GA) é amplamente usada na indústria alimentícia para a produção de xaropes com alto teor de glucose e também é empregada na produção de álcool e xaropes com alto teor de frutose (1989; Brumm, 1998; Mathewson, 1998). Vários microrganismos, plantas e animais produzem glucoamilase. Estas enzimas disponíveis comercialmente são, na sua maior parte, produzidas por linhagens dos fungos Aspergillus e Rhizopus. Dentre estas, a glucoamilase de Aspergillus é a mais termoestável, apresentando a máxima atividade em torno do pH 4,5, em temperaturas de 50 a 55°C, mas ela é rapidamente inativada em temperaturas próximas a 60°C (Manjunath et al.,1983; Brumm, 1998). A glucoamilase catalisa eficientemente a reação de sacarificação dentro de um limite relativamente estreito de temperatura, porque a sua conformação cataliticamente ativa muda com o aumento da temperatura. Esta termoestabilidade limitada afeta seu uso no processo industrial, onde a atuação prolongada em altas temperaturas é necessária. Na produção de xaropes com alto teor de glucose, uma pasta de amido (30-40% BS) é primeiro liquefeita a 105°C por 5 minutos e em seguida,


Figura 1. Imagem da estrutura estendida da glucoamilase de Aspergillus niger idêntica a glucoamilase de Aspergillus awamori. No lado esquerdo o domínio catalítico (DC), ao centro o filamento ligante ou “linker” (L) e à direita o domínio de ligação ao substrato (amido) (DLS). http://nte-serveur.univ-lyon1.fr/nte/heyde/www.public.iastate.edu/_pedro/glase/glase.html (10/10/03) a 95°C por 2 horas, usando a aamilase bacteriana termoestável, em pH 6.0-6.5. Finalmente, o amido liquefeito é resfriado a 60°C e hidrolisado por mais 48 a 72 horas usando a glucoamilase (James e Lee, 1997, Brumm, 1998). Está claro que a termoestabilidade da glucoamilase determina a velocidade do processo como um todo. Trabalhar em altas temperaturas não apenas pode acelerar a taxa da reação e consequentemente diminuir o tempo do processo, como também pode prevenir a contaminação microbiológica, além de reduzir a viscosidade da mistura de reação. Portanto, o desenvolvimento de uma glucoamilase mais termoestável poderá contribuir para a otimização do processo de sacarificação do amido. Entretanto, o conhecimento da estrutura da proteína e o processo de termoinativação da enzima são necessários para elaboração de prognósticos racionais e planos efetivos de experimentos de estabilização da estrutura proteica. A glucoamilase de Aspergillus é codificada por um único gene, mas existem duas ou três formas variáveis da enzima produzidas por proteólise limitada (Svensson et al., 1986). Pazur et al (1971) constatou que as formas da glucoamilases de Aspergillus niger são glicoproteinas que possuem quantidades diferentes de glicosilações. Como em outras proteínas, após a síntese no citoplasma, a GA é transportada em um estado desdobrado através da membrana do retículo DC L DLS endoplasmático (RE). Durante o subseqüente processo de dobramento, ocorre a O-glicosilação do “linker”, filamento que liga o domínio catalítico (CD) ao domínio de ligação ao substrato (DLS), e pontes dissulfetos são formadas (Pryer et al, 1992; Gaut e Hendershot, 1993). Assim, a GA, na sua conformação nativa estendida, assume uma forma de alteres, onde dois domínios volumosos, o domínio catalítico e o domínio de ligação ao amido, estão ligados por um filamento fino como mostra a figura 1. Esta é uma imagem simplificada ilustrativa, uma vez que a estrutura real da GA completa ainda não está disponível. A organização dos domínios da molécula tem sido deduzida através das diferentes técnicas biofísicas e relatos disponíveis (Coutinho, 1997; Sauer, 2000). As inúmeras proteínas desdobradas, que entram no lúmem do RE, devem ser protegidas de quaisquer agressões e serem mantidas em um estado de dobramento-competente. Dobramentos ineficientes ou mutações em proteínas secretadas resultam em enzimas com conformação incorreta e defeito na atividade (Bonifacino e Klausner, 1994). Em Aspergillus awamori, o gene codifica uma GAI de tamanho completo contendo de 615 a 616 resíduos de aminoácidos (figura 2), bem como o peptídeo sinalizador de secreção no N-terminal. O peptídeo sinalizador é cortado após a secreção da proteína pela célula. O outro maior produto de proteólise da GAI (diz-se da GA competente) é a GAII resultante da perda do sítio de ligação ao substrato localizado na extremidade C-terminal. A GAII é uma mistura de polipeptídeos de tamanhos entre 512 e 514 resíduos de aminoácidos, com atividade catalítica normal mas sem a habilidade para se ligar ao amido no estado natural, não gelatinizado (Svensson et al., 1986). As proteínas originais de Aspergillus niger e Aspergillus awamori, cujas seqüências são idênticas (Svensson et al., 1989; Nunberg et al., 1984), consistem de três principais áreas funcionais (Coutinho e Reilly, 1994 a-b, Coutinho e Reilly, 1997): (1) o domínio catalítico, constituído dos resíduos 1 ao 440, (2) o filamento ligante, formado pelos resíduo 441 ao 512, que é altamente Oglicosilado, e (3) um domínio de ligação ao amido no estado natural na extremidade C-terminal, contendo os resíduo 513 a 616 (Svensson et al., 1986; et al., 1989). Além da região de O-glicosilação do “linker”, dois outros sítios de N-glicosilação estão localizados nos resíduos Asn 171 e Asn 395 (Svensson et al., 1989; Aleshin et al., 1992). Acredita-se que os resíduos de carboidratos desempenham uma importante função na estabilização da glucoamilase (Manjunath et al.,1983, Svensson et al.,1989; Williamson et al., 1992a). Em altas temperaturas, a GA de A. niger, quimicamente desglicosilada, (Shenoy et al., 1984) e a glucoamilase de A. awamori, geneticamente truncada, sem parte da região de O-glicosilação Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 87


(Evans et al, 1990), deterioraram-se mais rapidamente do que as suas formas selvagens. Além disso, a GAII em que falta apenas do domínio de ligação ao substrato, tem termoestabilidade similar a da GAI (Svensson et al., 1986), enquanto que uma glucoamilase especial (GAI’), na qual faltam parte da região O-glicosilada e o domínio de ligação ao amido, é menos estável do que a sua forma original (Hayashida et al., 1989). A região de O-glicosilação também facilita a secreção de GA (Evans et al., 1990). A estrutura da GA nativa é muito difícil de determinar em função do alto grau de glicosilação. Aleshin et al (1992) determinou a estrutura cristalina de uma GA muito próxima da forma nativa denominada A. awamori var. X100 (GA’) (figura 3), a qual foi obtida por proteólise limitada com subtilisina e apresenta os primeiros 470 resíduos de aminoácidos da proteína original. Esta seqüência de aminoácidos da GA’ é 99,4% similar a GAI de A. niger e A. awamori, com uma deleção no resíduo 102 (Aleshin et al, 1992, 1994a). Assim, o estudo desta estrutura cristalina elucidou a conformação do domínio catalítico completo e a conformação da primeira metade N-terminal da região Oglicosilada da glucoamilase de Aspergillus. A estrutura cristalina da GA de A. awamori var. X100 mostrou que o domínio catalítico consiste de treze a-hélices que compreendem cerca de 51% dos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo total, e regiões menores de β filamentos antiparalelos. Doze das α-hélices estão arranjadas dentro de uma estrutura denominada barril α/α, consistindo de seis α-hélices externas e seis internas que envolvem o sítio catalítico em forma de funil, constituído por seis segmentos α/α altamente conservados (Sauer, 2000). O sítio catalítico da GA possui uma barreira de resíduos hidrofóbicos no centro, os quais separam o núcleo em duas regiões de volume morto (void), contendo apenas água. Uma serve como o sítio ativo propriamente dito e a outra, tem uma função ainda não conhecida (Aleshin et al., 1994a). O sítio ativo contém Glu179 e Glu400 como os dois resíduos de aminoácidos catalíticos localizados no fundo do sítio (Harris et al., 1993; Sauer, 2000). A estrutura em barril α/α do DC da GA de A. awamori, A. niger e de Saccharomyces fibuligera são similares, sendo que esta última apresenta 14 α-hélices, 12 das quais estão na conformação barril α/α (Sevcik et al, 1998; Sauer et al, 2000). Esta conformação contrasta com a topologia de organização em barril α/β encontrada em outras enzimas amilolíticas tais como α e β-amilases (Buisson et al., 1987; e Mikami et al., 1993) e ciclodestrina glucosiltransferases (Klein e Schulz, 1991). Observou-se uma pequena similaridade entre a estrutura da GA e proteínas transportadoras de glucose. Assim, a organização das hélices na GA pode ser relevante para a conformação de proteínas que transportam glucose (Aleshin et al, 1994a). O segmento O-glicosilado está numa conformação de cinto estendido em torno do barril α/α catalítico. Isto sugere que este segmento serve como um elo de ligação estrutural entre o domínio catalítico e o domínio de ligação. A primeira parte (aminoácidos 441 a 471) desta região Oglicosilada possui cerca de 10 resíduos de manoses expostos, que juntos 88 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 2. Seqüência de aminoácidos (1 letra) da GA de A. niger. Letras vermelhas: αhelice; letras azuis: fita-β; C dentro dos retângulos: resíduos de cisteínas envolvidos em pontes dissulfetos; N dentro dos retângulos: sitios N-glicosilados; T e S dentro dos retângulos: sítios O-glicosilados; E dentro dos retângulos: resíduos dos aminoácidos catalíticos glutâmico 179 e 400; seqüências sombreadas: regiões conservadas S1 a S5; seqüência sublinhada: sitio de ligação ao substrato. Fonte: Flory, 1993. com 2 unidades de glucoses ligadas N-glicosidicamente nos resíduos Asn 171 e Asn 395, formam um cinto de glicosilações ao redor do domínio catalítico (Aleshin et al, 1992). Foi sugerido que a outra parte altamente O-glicosilada (aminoácidos de 472 a 512) envolva o domínio catalítico como uma continuação do resíduo 471, fazendo com que o domínio de ligação ao amido fique próximo ao sítio ativo (Sauer et al, 2000). O segmento C-terminal do “linker” contém cerca de 30 aminoácidos, principalmente serina e treonina, sendo, portanto, muito O-glicosilado. A esta parte particular do linker tem sido atribuída papéis na estabilidade, secreção e na digestão do amido cru (Libby et al, 1994; Sauer et al, 2000). Embora algumas características como a compactação da conformação do barril α/α, a proteção dos carboidratos e a região O-glicosilada, façam a GA de Aspergillus mais estável do que algumas proteínas, uma maior estabilidade ainda é requerida para os processos industriais, como explicado anteriormente. O domínio de ligação ao amido possui este nome por causa da sua capacidade de se ligar ao grânulo de amido nativo e permitir sua digestão pelo domínio catalítico (Svensson et


Figura 3. Esquema da glucoamilase (GA’) de Aspergillus awamori var. X100 (Aleshin et al., 1992). α- hélices (H1 a H13) são simbolizadas por cilindros, sítios de Oglicosilação são representados por hexágonos simples, e sítios de N-glicosilação são simbolizados por cadeias de três hexágonos. al., 1983). Este domínio parece ter a capacidade de ligar a GA à parede da célula isto porque tem afinidade por α-1,4 e α-1,6 glucanos que pertencem à parede celular. Esta afinidade aumenta a concentração de GA próxima da micromembrana da célula (Neustroev et al., 1993). A GAII, na qual faltam os resíduos 513 a 616, tem uma habilidade semelhante a GAI para digerir amido solúvel, mas possui uma habilidade drasticamente reduzida para se ligar e hidrolisar o amido nativo (Svensson et al., 1989). Recentemente, foi demonstrado que o DLS isolado, atuando em grânulos de amido juntamente com a GAII, apresentaram um efeito sinergístico na degradação do substrato insolúvel, sugerindo que o domínio de ligação ao substrato se liga ao amido como uma porção individual e rompe a compacta estrutura do grânulo de amido facilitando a hidrólise pelo domínio catalítico (Southall et al, 1999; Sauer et al, 2000). O domínio de ligação ao amido da GA possui uma significante similaridade de seqüência de aminoácidos com o domínio de ligação ao amido da ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) (Svensson et al., 1989). A estrutura tridimensional da CGTase é globular, contendo de 6 a 8 fitas β (Klein e Schulz, 1991). A estrutura do domínio de ligação ao amido da GA revela uma estrutura bem definida em fitas β consistindo de um par paralelo e 6 pares antiparalelos que formam um barril β aberto na lateral. Dois sítios de ligação para outros ligantes foram encontrados neste domínio, sendo cada um no final da molécula em faces opostas (Sorimachi et al., 1996). O mecanismo proposto de ligação deste domínio aos grânulos de amido, parece envolver a formação de um complexo de inclusão entre os resíduos hidrofóbicos do domínio de ligação e os grânulos de amido (Goto et al., 1994). Existem quatro pontes dissulfetos na GA, das quais três estão no domínio catalítico e uma no domínio de ligação. No domínio catalítico, as pontes estão entre os resíduos 210 e 213 (conectando o N-terminal com o meio da hélice 7), 262 e 270 (contendo um filamento β antiparalelo) e 222 e 449 (associando o trigésimo resíduo O-glicosilado do “cinto” com o domínio catalítico) (Aleshin et al., 1992). Experimentos sugerem que existe uma ligação dissulfeto entre os resíduos 509 e 604 que conecta o Nterminal com o C-terminal do domínio de ligação ao substrato (Coutinho e Reilly, 1994 b). Existem dois resíduos N-glicosilados (Asn 171 e Asn 395) na GA, nos arredores do sítio ativo. Em cada caso, o N da Asn está ligado à posição C1 do primeiro resíduo de açúcar (Nacetil-D-glucosamina), que está ligado por β (1→4) ao segundo (Nacetil-D-glucosamina) que por sua vez se liga ao terceiro resíduo (Dmanose) (Aleshin et al., 1992). O número total de resíduos de açúcares para formar a cadeia glicosil ligada a Asn 171 e Asn 395 é 5 e 8 respectivamente (Aleshin et al., 1994 a). A mutação Asn 395→ Gln que removeu o sítio de N- glicosilação no resíduo 395, diminuiu drasticamente tanto a secreção como a termoestabilidade, mas não alterou a atividade específica (Chen et al., 1994 b). Embora a GA de A. awamori primariamente catalise a clivagem hidrolítica de ligações a (1,4) com liberação de β-glucose a partir de uma extremidade não redutora da cadeia de amido e oligossacarídeos, ela também cliva ligações glicosídicas a (1,6) com uma eficiência catalítica (Kca t / Km) por volta de 500 vezes menor do que para as ligações a (1,4) (Fleetwood e Weigel, 1962). 2. Termoestabilização da Glucoamilase 2.1. Estratégias tradicionais A modificação química e a imobilização são as duas principais estratégias tradicionais que têm sido exploradas para melhorar a termoestabilidade da GA. Modificação química: altera um grupo funcional específico nas proteínas, tal como um grupo carboxila, por reação química. Embora esta técnica tenha aumentado a estabilização da a α-quimotripsina em 1000 vezes (Moshaev et al., 1988), ela geralmente tem um rendimento negativo ou relativamente muito pequeno na termoestabilização da GA (Sinitsyn et al.,1978; Munch e Tritsch, 1990). Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 89


Imobilização: geralmente resulta em alguma perda da atividade enzimática (Lee et al., 1976; Svensson e Ottesen, 1981; Lenders e Crichton, 1988), mas apesar disso, foi usada em GA porque ela permite o processo contínuo de operação. Embora muitas GAs imobilizadas tenham melhor estabilidade do que as formas solúveis, elas ainda não substituíram estas últimas no uso industrial, isto porque as GAs imobilizadas devem ser usadas em temperaturas operacionais baixas a fim de serem preservadas por vários meses, e continuarem viáveis (Lee et al., 1976). Desde que a energia de ativação para a atividade enzimática deva ser menor do que para a inativação da enzima, uma temperatura de 38 a 40°C é recomendada para a GA imobilizada. Entretanto, o decréscimo na temperatura operacional resulta numa baixa taxa de reação e em contaminação microbiológica, que é menos facilmente controlado em fábricas do que em laboratório. Lee et al., (1976) relataram que a GA imobilizada rendeu xaropes com teores mais baixo de glucose, 1,0-1,5%, e de Dextrose Equivalente (DE), 1,0-1,5 unidades, do que aqueles produzidos por enzimas solúveis. Isto é atribuído a limitação da difusão de partículas de glucose, que resulta em um gradiente de concentração de glucose e, consequentemente, leva a uma maior incidência de reações reversíveis do que se o gradiente não estivesse presente (Lee et al., 1980). Além disso, numa aplicação real, as altas concentrações do substrato estabilizam tão bem a GA que o aumento da termoestabilização proporcionado pela imobilização torna-se relativamente insignificante (Klesov e Gerasimas, 1979). 2.2. Estratégias moleculares (Evolução Dirigida de Enzimas) O advento da engenharia de proteínas, empregando técnicas de biologia molecular, proporcionou novas estratégias para a termoestabilização de enzimas. O gene da GA de A. awamori foi clonado e expressado em Saccharomyces cerevisiae (Innis et al., 1985) e em Pichia pastoris (Fierobe et al. 1997), o que permitiu o emprego da manipulação genética como uma maneira de modificar a enzima para melhorar suas propriedades catalíticas ou físicas. Estas estratégias para criar novas ou melhoradas propriedades em enzimas, atualmente podem ser separadas em duas estratégias complementares 1) desenho racional e 2) evolução dirigida. O desenho racional de proteínas é baseado no conhecimento detalhado da seqüência primaria, estrutura, função e mecanismo de catálise. Através destes conhecimentos, alterações são introduzidas, principalmente, por mutação sitio dirigida, como será discutido abaixo. A evolução dirigida, (Zhang, 1997) não exige conhecimento da relação estrutura-função da enzima. A evolução dirigida é também chamada de biotecnologia evolutiva (Arnold e Volkov, 1999; Reetz e Jaeger, 1999; Sutherland,2000). O termo evolução dirigida subtende uma série de experimentos que reproduzem, de forma acelerada e em tubos de ensaios, a evolução da diversidade natural e adaptação ambiental. Mutações e recombinações são feitas dando ao processo uma direção no sentido de atingir a otimização de uma propriedade específica (Lehman e Wyss, 2001). Muitas pistas de como melhorar enzimas vêm dos estudos de como as enzimas evoluem na natureza. Assim, esta poderosa técnica objetiva otimizar o processo de melhoramento das enzimas utilizando mecanismos envolvidos na evolução natural (mutação, recombinação e seleção natural). Entretanto, a evolução dirigida difere do processo natural no sentido em que são os pesquisadores que definem as propriedades a serem otimizadas e o processo biotecnológico acontece em um período curto de tempo (semanas ou meses) (Reetz, 1999). Num experimento de evolução dirigida, primeiramente é induzida uma alteração no DNA visando uma resposta específica. Isto resulta em uma biblioteca de populações com diferentes graus de possíveis respostas, incluindo ou não a resposta esperada. O próximo passo é encontrar 90 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 dentre as milhões de possibilidades, a solução ou as soluções corretas, ou seja, a enzima que exibe a propriedade desejada (Arnold, 1996). Em suma, este processo consiste na combinação de técnicas da biologia molecular apropriadas para a mutação e expressão do gene, acopladas a um eficiente e rápido sistema de seleção. (Reetz e Jaeger, 2000). A idéia é partir de uma enzima selvagem, realizar a mutagênese no gene que codifica a enzima e selecionar os melhores mutantes de acordo com a característica fenotípica desejada (Zhang, 1997). Após a seleção dos mutantes, segue-se novos ciclos de mutações buscando melhores mutantes. Quando a taxa de mutação, tamanho da biblioteca e o processo de seleção são adequados, o fenótipo desejado de uma enzima geralmente aumenta a cada ciclo de mutações (Zhang, 1997). Existe um grande número de diferentes estratégias de mutagênese para criar diversidade de seqüências, tais como a mutação pontual ao acaso por PCR mutagênico (error-prone PCR), e o embaralhamento de DNA (DNA shuffling). Combinações destas técnicas também vêm sendo utilizadas. Tais estratégias serão discutidas a seguir: 2.2.1 Mutação Sítio Dirigida (MSD) É uma poderosa técnica na qual apenas um ou poucos aminoácidos específicos são substituídos por outros aminoácidos, por alteração nos correspondentes nucleotídeos no gene codificador da proteína. Quando realizada com sucesso, ela tem a vantagem de melhorar a característica desejada da enzima sem afetar outras propriedades e até mesmo de criar mutantes carregando várias características melhoradas. Nesta ferramenta, as mudanças precisas, efetuadas na seqüência dos aminoácidos, são baseadas no conhecimento detalhado da estrutura da proteína, função e mecanismo (Chen, 1999). Por exemplo, um resíduo particular de aminoácido pode ser identificado como sendo importante para


a atividade catalítica da enzima (Reetz, 1999), sendo assim, uma substituição individual deste aminoácido poderia provocar mudanças na estrutura secundária resultando em enzimas com características desejáveis (Chen, 1999). Entretanto, seria impossível predizer qual dos 19 aminoácidos remanescentes seria o melhor alvo para a mutação que resultaria em subsequente melhoria da propriedade procurada (Reetz, 1999). Muitas tentativas para alterar especificamente algumas das propriedades das enzimas através desta técnica falharam, isto porque a introdução de aminoácidos substitutos têm efeitos inesperados na estrutura e função da enzima. (Kikuchi, 1999). Além disso, tem sido observado que em muitos estudos de mutação sítio dirigida, o aumento da termoestabilidade está vinculada ao decréscimo da atividade catalítica (Carrea e Colombo, 2000). As falhas também podem ser porque este processo requer conhecimento de detalhes da estrutura tridimensional da enzima, de seu mecanismo de catálise, bem como um certo grau de intuição na escolha do aminoácido a ser substituído (Reetz, 1997). Em muitos casos, estas substituições foram feitas sem levar em consideração as propriedades estruturais da proteína (Chen, 1999). 2.2.2. PCR mutagênico (Errorprone PCR): A introdução de mutações através desta técnica envolve uma modificação no protocolo de PCR (Jaeger e Reetz, 2000). Uma reação de PCR é normalmente realizada de modo a amplificar qualquer dado DNA com alta fidelidade. A atividade de correção de erro 3’ → 5’ da DNA polimerase assegura que a amplificação do DNA siga de maneira precisa. Ocasionalmente, nucleotídeos errados são incorporados durante a amplificação levando a mutações com uma freqüência de 0,1 a 2x 10 -4 por nucleotídeo para a DNA polimerase termoestável do Thermus aquaticus (Taq polimerase). Esta baixa taxa de erro pode ser aumentada para 7x 10 -3 por nucleotídeo através de um ou mais dos seguintes procedimentos: aumento da concentração de MgCl 2 , adição de MnCl 2 , aumento na concentração de dCTP e dTTP e aumento na quantidade taq polimerase. Para o propósito de evolução dirigida de enzima, estas condições devem ser modificadas a fim de se obter uma taxa média de 1 a 2 nucleotídeos mutados por gene, levando a uma mudança média de 1 aminoácido por enzima mutante (Reetz, 1999). A vantagem de tal processo é que pode ser realizado rapidamente envolvendo qualquer proteína, mesmo sem o conhecimento preciso de sua estrutura (Zhang et al, 1997 e Jaeger e Reetz, 2000). 2.2.3. Embaralhamento de DNA (DNA shuffling) Este poderoso processo de evolução dirigida, que gera diversidade por recombinação, é baseado na combinação de mutações úteis de genes individuais. Bibliotecas de genes quiméricos podem ser geradas por fragmentação aleatória de um gene, seguido por recombinação dos fragmentos em uma reação de PCR (Crameri, 1998). O embaralhamento de DNA combinado com uma seleção para a atividade pode acelerar a evolução dirigida das características desejadas. Nesta técnica, a diversidade é introduzida a partir de uma biblioteca de mutações pontuais aleatórias (Christians et al, 1999). Os genes selecionados podem ser submetidos a mais ciclos de mutações (reembaralhamento) e melhorar ainda mais a sua mutação benéfica original (Stemmer, 1994a) simulando de forma acelerada, o processo natural de recombinação sexual (Christians et al, 1999). A técnica consiste basicamente na fragmentação de um gene com diferentes mutações pontuais por DNAse I. A recombinação dos fragmentos aleatoriamente resulta em moldes trocados e recombinados. Um gene recombinante contendo 4 “crossovers” pode ser selecionado da biblioteca de recombinantes baseado na função melhorada. O conjunto selecionado promove o ponto de partida para outro ciclo de mutações e recombinações. Este processo iso- lado causa um baixo número de mutações pontuais, mas se for desejado, mutações adicionais podem ser incorporadas por PCR mutagênico ou mutagênese por UV no “pool” de genes (Stemmer, 1994a). A técnica de embaralhamento pode ser realizada com mutantes do mesmo gene e também com genes homólogos de diferentes espécies (family shuffling) (Reetz e Jaeger, 1999). Esta recente adaptação permite que duas ou mais seqüências que ocorram naturalmente sejam usadas como material genético iniciador. Neste método, genes similares são misturados, fragmentados aleatoriamente e recombinados sob condições que permitam o anelamento e a extensão de fitas complementares não idênticas (Christians et al, 1999). A recombinação que ocorre nesta técnica é causada pela incorporação de um fragmento derivado de uma seqüência dentro de outra, baseado na homologia. Análises evolutivas de famílias de enzimas sugerem que mudanças drásticas na função da enzima exigem uma considerável mudança na seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo. Tais mudanças provavelmente não ocorrem durante o processo de evolução in vitro, no qual as enzimas são principalmente melhoradas por mutações de ponto com uma tendência a transições e transversões limitando o acesso a um amplo espectro de substituições. Em contraste, a mutação natural, tipicamente resultante de recombinação sexual ou homóloga, gera deleções, inserções, duplicações ou fusões. Neste último processo, tais mutações alteram o espaçamento entre os resíduos de aminoácidos e segmentos de cadeias de polipeptídeos e pode resultar em mudanças na especificidade e novas atividades catalíticas (Chen, 2001). “Screening” e Seleção: Grandes bibliotecas de mais de 10 10 genes mutantes podem facilmente ser criadas usando as técnicas acima. Portanto, o desenvolvimento de um sistema apropriado de seleção é de importância chave no processo de evolução dirigida de enzimas (Reetz, 1999). Seleções efetivas, nas quais Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 91


apenas aqueles clones carregando a característica desejada sobrevivam ou cresçam mais rápido são raras (Arnold e Volkov, 1999). No caso do emprego de vetores (plasmídios), o “screening” é feito para obter os mutantes que incorporaram o vetor contendo o gene desejado. O vetor geralmente carrega um gene para resistência a algum antibiótico, por isso utiliza-se o plaqueamento das linhagens submetidas ao processo de mutagênese em um meio contendo o antibiótico. As colônias que crescerem neste meio, certamente incorporaram o vetor e podem ser escolhidas para a próxima etapa. Em outros casos, a mutação positiva resulta em reparo de algum defeito que poderá ser usado como ferramenta para a seleção. Por exemplo, a recuperação da habilidade de produção de enzimas formadoras de halos na placa de seleção. A etapa seguinte é a escolha de colônias que tenham a característica desejada, por exemplo, o aumento na termoestabilidade enzimática. Assim, as enzimas das colônias positivas no “screening” serão submetidas a testes de termoinativação a fim de se isolar as colônias produtoras de enzimas termoestáveis. 2.3. Enzimas termoestabilizadas por estratégias moleculares Akanuma et al (1998) introduziram o gene leuB (que codifica para a 3-isopropilmalato desidrogenase envolvida na biossíntese de leucina) no microrganismo termofílico Thermus thermophilus usando técnicas de evolução dirigida de enzimas. Após mutação no gene da enzima, eles obtiveram uma variante termoestável. A estabilidade térmica da enzima mutante foi 10°C acima da observada na enzima selvagem. A técnica da evolução dirigida foi aplicada à kanamicina nucleotidiltransferase (KNTase), uma enzima que confere resistência ao antibiótico kanamicina. Variantes desta enzima apresentaram resistência a kanamicina a uma temperatura de 63°C e foram produzidas por dois ciclos seguidos de mutações resul- tando em duas substituições de aminoácidos (Reetz e Jaeger, 1999). Kikuchi et al (1999) aplicaram esta técnica nos genes xylE e nahH que codificam para a enzima catecol 2,3-dioxigenase. Mais de 2000 clones híbridos foram criados e posteriormente selecionados para estabilidade térmica. A melhor enzima quimérica selecionada foi testada a 50°C e a vida média foi de 70 min, muito maior do que a enzima codificada pelos genes selvagens xylE (2,7min) e nahH (5,4min). Yang et al (2000) criaram um mutante para o gene da subtilisina E através da técnica de PCR mutagênico. Análises do seqüenciamento revelaram apenas uma substituição (A→G). O tempo de vida médio da atividade da enzima mutante, quando encubada a 65°C, foi de aproximadamente 80 min enquanto que uma outra linhagem mutante (mutante original usado no PCR mutagênico) e a linhagem selvagem apresentaram um tempo de 13 e 15 min respectivamente. Miyazaki et al (2000) usaram a técnica de embaralhamento de DNA em uma subtilisina S41 psicrofílica com o objetivo de aumentar sua termoestabilidade e atividade. Após a terceira geração de bibliotecas criadas por PCR mutagênico, três variantes termoestáveis foram identificadas. Das três, uma enzima mutante em particular teve a maior atividade residual após incubação a 70°C. Esta subtilisina S41 variante contém 7 substituições de aminoácidos, todas contribuindo para o aumento da sua termoestabilidade. A temperatura ótima da lipase foi aumentada em até 15°C através da mutagênese aleatórea utilizando a técnica de PCR com tendência ao erro (Kohno et al, 2001). Utilizando-se da técnica de embaralhamento de DNA Hayashi et al. (2001), obtiveram quimeras de βglucosidase com a termoestabilidade aumentada em até 16°C quando comparadas com a enzima original. A evolução dirigida foi também usada para melhorar a termoestabilidade da galactose oxidase (Sun et al, 2001). Foi observado que as enzimas mutantes obtidas, mantinham a atividade enzimática e a 92 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 especificidade pelo substrato semelhantes às da enzima selvagem, entretanto, a termoestabilidade foi aumentada. O T 50 (temperatura na qual as enzimas perdem 50% da sua atividade) foi aumentado para 67°C para os dois mutantes mais termoestáveis enquanto que a selvagem não ultrapassou 63°C. Experimentos com a GA usam na sua grande maioria a MSD como ferramenta para a obtenção de características desejadas melhoradas, uma boa revisão neste assunto foi apresentada por Ford (1999). Várias abordagens preconizadas para estabilização podem ser acessadas pela MSD, como por exemplo, as substituições dos resíduos flexíveis de glicina em α-helices, substituições de seqüências susceptíveis a desamidação e quebra Asn-Gly, alterações em ligações frágeis como Asp-X, introdução de prolina que reduz o número de conformações no estado desdobrado, acréscimo cisteínas para aumentar o número de pontes dissulfetos, além de combinações destas abordagens em mutantes múltiplos etc. (Ford, 1999; Sauer, 2000). Libby et al (1994) testaram o efeito de deleções de aminoácidos na região O-glicosilada da GA de Aspergillus awamori. Foram feitas deleções para remover os resíduos de 466 a 512 (GAI), de 485 a 512 (GAII) e de 466 a 483 (GAIII). Analisando as frações intracelulares e extracelulares, observou-se que a região deletada da GAIII afetou a secreção enquanto que a deleção da GAII contribuiu para a produção e uma estrutura estável da proteína. Para todos os mutantes foram encontradas atividades catalíticas similares à selvagem indicando que as deleções não afetaram o sítio catalítico. Chen et al. (1994) substituíram a seqüência susceptível a desamidação, Asn182-Gly, por Ala182-Gly, o que resultou em decréscimo de 2,5 vezes na taxa de termoinativação a 60 e 65°C. O efeito da substituição de resíduos flexíveis de glicina por alanina em quatro diferentes α-hélices na GA de Aspergillus awamori foram estudados (Chen et al, 1996). Substituições simples de Gly137 e Gly139 e


no mutante múltiplo contendo ambas as mutações estabilizaram a GA contra a termoinativação irreversível. Com o objetivo de estudar o papel das regiões conservadas na GA de Aspergillus awamori, Sierks et al (1993) realizaram substituições nos resíduos de Leu177, Trp178 e Asn182 por His, Arg e Ala, respectivamente. Quando se substituiu Leu177 por His houve um grande aumento na energia de ativação para substratos com ligação α(1→4) e α(1→6); na substituição Trp178 por Arg, a energia aumentou para substratos com ligações α(1→6), mas não para α(1→4). Estas substituições indicaram que os resíduos de aminoácidos Leu177 e Trp178 estão localizados no subsítio 1 e 2 respectivamente. Por outro lado, a substituição Asn182 por His não alterou os valores de energia de ativação para nenhum tipo de ligação do substrato, sugerindo que este resíduo não é crucial para o mecanismo catalítico da GA. Fiorobe et al. (1996) substituiram Ala246 por Cys, criando mais uma ponte dissulfeto entre este resíduo e o resíduo Cys320. O mutante apresentou maior atividade residual e atividade catalítica por 15 minutos comparado a linhagem selvagem. Fiorobe et al. (1998) produziram um mutante substituindo o Glu 400 por Cys. A atividade do mutante, após oxidação da cisteina para acido cisteinosulfínico, elevou a atividade do mutante para 160% em relação a linhagem selvagem. Entretanto, não houve ganho de termoestabilidade. Uma ponte dissulfeto foi criada substituindo Asn20 e Ala27 por Cys na GA de Aspergillus awamori e observou-se um aumento na termoestabilidade de 1,2 kJ/mol a 65°C (Li et al, 1998). Mutantes contendo prolina em substituição a vários aminoácidos foram estudados por Allen et al. (1998). O maior sucesso com mutação simples foi obtido no mutante Ser30→Pro, resultando em um aumento da energia livre de termoinativação de 1,6 kJ/ mol a 65°C. Os autores ainda combinaram diferentes mutações termoestáveis e obtiveram um triplo mutante contendo Gly137→Ala, Ser30→Pro e Asn20→Cys/Ala27→Cys que apresen- tou aumento cumulativo de termoestabilidade de 4,4 kJ/mol. Estes experimentos, embora tenham como objetivo principal a melhora em propriedades da enzima, paralelamente desempenham um papel de extrema importância, o de elucidar as funções de inúmeros segmentos da cadeia polipeptídica da proteína. 3. Conclusão e perspectivas futuras As técnicas de evolução dirigida disponíveis, associadas a considerações teóricas e às várias experiências relatadas de sucesso ou não, disponíveis na literatura, têm levado a uma crescente seleção de mutações bem sucedidas para termoestabilização da GA. Todavia, este sucesso ainda não refletiu significativamente na produção de enzima industrialmente satisfatória, deixando o campo ainda aberto para novas experiências. Os organismos atualmente disponíveis para clonagem e expressão da GA são mesofílicos, criando dificuldades para a seleção de enzimas mais termoestáveis. Além disso as linhagens de E. coli utilizadas são deficientes em glicosilação e formação de pontes dissulfetos, essenciais para a GA ativa. Pesquisas com bacterias termofílicas e/ou bacterias competentes para a clonagem e expressão da GA estruturalmente ativa, podem ser alternativas viáveis para reduzir tempo e manipulação. A maior parte das informações sobre seqüências de GA são dos fungos mesofílicos, A. niger e A. awamori. Informações de seqüências de GAs termoestáveis, seriam importantes para orientação racional de desenhos de experimentos de evolução dirigida. Entretanto, poucas GAs termoestáveis de fungos termofílicos foram relatadas. Dentre estes estão Humicola grisea var. thermoidea (Tosi et al. 1993), Aspergillus fumigatus (Brandani e Peralta, 1998) e Thermomyces lanuginosus (Li et al 1998). Informações sobre seqüências genéticas são ainda mais raras. A procura por novas fontes de GAs termoestáveis, bem como informações sobre a proteína e seu gene codificador são um campo aberto e com enormes perspectivas futuras. Bibliografia Akanuma, S.; Yamagishi, A.; Tanaka, N.; Oshima, T. Protein science, v.7, p. 698-705, 1998. Aleshin, A.; Golubev, A.; Firsov, l. M.; Honzatko, R. B. J. Biol. Chem, v. 267, p. 19291-19298, 1992. Aleshin, A. E.; Hoffman, C.; Firsov, l. M.; Honzatko, R. B. J. Mol. Biol., V. 238, p. 575-591, 1994a. Arnold, F.H.; Volkov, A. A. Current opinion in chemical biology, v. 3, p. 54-59, 1999. Arnold, F. H. Chemical engineering science, v. 51, n. 23, p. 5091- 5102, 1996. Brandani, W;. Peralta, R.M. Can. J. Microbiol. v. 44, p. 493-497, 1998. Bonifacino, J. S.; Klausner, R. D. Celular proteolytic systems., A. Ciechanover and a. L. Schwartz, eds (wiley – liss, new york), v.15, p. 137 – 160, 1994. Brumm, p. J. Cereal food world, v. 43, p. 804 – 807, 1998. 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Pesquisa Valdir Marcos Stefenon Biólogo – Mestre em Biotecnologia Depto. de Ciências Biológicas e da Saúde – UNIPLAC gene_mol@hotmail.com Rubens Onofre Nodari Eng. Agrônomo – Doutor em Genética Departamento de Fitotecnia – CCA – UFSC Ilustrações cedidas pelos autores Marcadores Moleculares no Melhoramento Genético de Araucária Caracterização da diversidade genética em Araucaria angustifolia Introdução A exploração florestal foi uma importante alavanca para o desenvolvimento econômico do Sul do Brasil desde o início do século XX, com intensidade crescente nas décadas de 1950 a 1970 (Guerra et al., 2002). A principal espécie explorada nesse ciclo foi a Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze., única representante da Família Araucariaceae no Brasil e principal espécie que compõe a floresta ombrófila mista ou mata de araucária (Guerra et al., 2002). No Brasil, a distribuição natural dessa espécie se dá em amplas áreas nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, e em alguns pontos mais elevados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais (Reitz e Klein, 1966). Todavia, a alta qualidade de sua madeira para os mais diversos fins, desde a construção civil até a produção de celulose e de papel, fez com que essa espécie fosse exaustivamente explorada, tendo como conseqüência uma drástica redução das grandes reservas de A. angustifolia no sul do país. Além dessa exploração desordena-da, o avanço das fronteiras agrícolas foi outro fator responsável pela redução das populações naturais dessa importante espécie florestal. Em função desses acontecimentos, a araucária encontra-se hoje na Lista Oficial de Flora Ameaçada de Extinção (IBAMA, 2002) e os remanescentes de floresta ombrófila mista estão reduzidos a fragmentos isolados de diversos tamanhos. Em alguns desses fragmentos, estima-se que grande parte da diversidade genética tenha sido perdida (Schögl, 2000; Auler et al., 2002), fato que inviabiliza a regeneração natural da espécie, devido à endogamia acentuada e à redução do fluxo gênico entre suas populações. Nos últimos anos, diversas discussões a respeito desse tema vêm apontando para a necessidade de se desenvolver o melhoramento genético dessa conífera, com vista a regenerar a Floresta de Araucária e disciplinar os plantios com finalidade lucrativa, seja pela exploração da madeira, seja pela venda das sementes comestíveis ou de outros subprodutos. Entretanto, antes de os programas de melhoramento genético serem implementados, é necessário que se conheça a diversidade genética existente entre as populações remanescentes e dentro delas. Esses estudos são importantes para que se interprete o efeito da fragmentação dos remanescentes sobre a estrutura genética das populações: informação essencial para o planejamento de programas de melhoramento. Esse conhecimento, além de reduzido, tem sido produzido basicamente a partir de marcadores morfológicos (Shimizu e Higas, 1980; Monteiro e Spelz, 1980; Kageyama e Jacob, 1980) e isoenzimas (Shimizu et al., 2000; Auler et al., 2002; Mantovani et al., 2002). Considerando a utilização de marcadores RAPD (Williams et al., 1990; Welsh e McClelland, 1990) e AFLP (Vos et al., 1995) para estudos genéticos em diversas espécies florestais, o objetivo deste estudo foi determinar a capacidade informativa desses marcadores para a caracterização da diversidade genética de populações naturais de A. angustifolia. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 95


Material e Métodos: Material vegetal e Extração de DNA O material vegetal utilizado neste estudo foi composto por amostras foliares de trinta indivíduos adultos de uma população natural do Parque Ecológico Municipal de Lages, Estado de Santa Catarina, coletados e acondicionados em sacos plásticos que continham sílica gel. Inicialmente, foram testados sete protocolos para extração de DNA vegetal com base na utilização do detergente CTAB. Com esses testes, chegou-se à conclusão de que era necessário otimizar um protocolo específico para a espécie, a fim de eliminar os compostos contaminantes do DNA presentes nas folhas de araucária (principalmente proteínas e polifenóis) e a fim de evitar a liofilização do material vegetal. Aproximadamente 150 mg de folhas foram congeladas em nitrogênio líquido e maceradas completamente em gral de porcelana. Ao pó resultante, acrescentou-se 1,5 mL de tampão de extração [CTAB 2%; NaCl 1,5 M; EDTA 20 mM; Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM; PVP 2%; 2-mercaptoetanol 1%]. O material foi transferido para tubos eppendorf de 2 mL e mantido em banho-maria (60°C) por 40 min. A cada 15 minutos, o material foi homogeneizado por inversão. Após essa etapa, o material foi deixado sobre a bancada até alcançar a temperatura ambiente, quando lhe foram acrescidos, em cada tubo, 600 µL de CIA [clorofórmio: álcool isoamílico 24:1]. O material foi homogeneizado durante três minutos, por inversão, e centrifugado a 13.000 RPM, por 5 min. A porção aquosa que continha o DNA foi transferida para dois novos tubos e foram acrescidos a ela 5 µL de RNAse A (10 µg/mL). Após 40 min, a 34°C, realizou-se uma segunda extração orgânica com CIA. Após a centrifugação (13.000 RPM, por 5 min), a porção aquosa foi transferida para novos tubos, aos quais adicionaram-se 50 µL de solução de CTAB 10% [CTAB 10%; NaCl 1,4 M], a 60°C. Após a homogeneização, realizou-se uma terceira extração orgânica com CIA. A porção aquosa foi transferida para novos tubos e o DNA foi precipitado pela adição de 2/3 do volume de álcool isopropílico gelado(-20°C). O material foi mantido por 30 min a - 20°C e, posteriormente, centrifugado a 7.000 RPM, por 5 min . O álcool isopropílico foi descartado e o DNA desidratado novamente com 1 mL de álcool etílico 95%. O material permaneceu por 10min a -20°C e centrifugado a 8.000 RPM, por 5 min. O álcool etílico foi descartado e deixou-se o precipitado secar a temperatura ambiente. O DNA foi diluído em 100 µL de TE, a temperatura ambiente, por um período de 12 a 16 horas, e armazenado a -20°C. A concentração de DNA foi determinada pela comparação com quantidades conhecidas de DNA de fago lambda (20, 50, 100 e 200 ng/µL), após eletroforese em gel de 0,8% de agarose, corado com solução de 0,02% de brometo de etídio. A leitura espectrofotométrica da razão OD260/OD280 foi utilizada para determinar a pureza das amostras frente à contaminação por proteínas. Reações RAPD Para reações RAPD, foram utilizados seis iniciadores comercializados pela Operon Technologies ® (OPA04, OPA09, OPA17, OPC06, OPF16, OPAN15). O coquetel da reação constou de tampão de PCR 1X, 3,8 mM de MgCl 2 , 0,4 mM de dNTPs, 0,4 µM de iniciadores, 1 U de Taq DNA polimerase e 1,5 ng/ µL de DNA. As reações de PCR foram desenvolvidas em termociclador PTC-100 (MJ Research Inc.) em um volume de 13 µL. O programa utilizado foi composto de uma etapa inicial de desnaturação (4 min. a 92°C), seguida de 35 ciclos de amplificação (45 s. a 92°C; 45 s. a 35°C; 1 min e 15 s. a 72°C), e terminada com uma etapa final de elongação das cadeias de DNA (3 min a 72°C). Os produtos amplificados foram separados por eletroforese horizontal submersa em tampão TBE 1X, em gel de 1,5% de agarose, corado com solução de 0,02% de brometo de etídio. As bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta e os géis fotografados com filme Polaroid preto e branco. 96 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 1: Polimorfismo revelado em marcadores RAPD em A. angustifolia, entre os trinta indivíduos da população do Parque Ecológico Municipal de Lages, utilizando o iniciador OPA04. Linhas 1 a 30: indivíduos da população. M= marcador de peso molecular 1kb. Reações AFLP Sete combinações de iniciadores para reações AFLP foram selecionadas aleatoriamente no kit AFLP ® Analysis System I / Life Technologies ® (E- ACG+M-CAC, E-ACT+M-CAA, E- ACA+M-CTT, E-ACG+M-CAG, E- AAG+M-CTG, E-ACC+M-CAT e E- ACC+M-CAC) e as reações foram desenvolvidas de acordo com o protocolo de Vos et al. (1995), com pequenas modificações. Inicialmente, realizou-se a restrição do DNA com as enzimas EcoRI e MseI, durante duas horas, a 36°C. A ligação dos oligonucleotídeos adaptadores foi realizada por 2 horas, a 20°C, em um volume de 25 µL. Na etapa seguinte (pré-amplificação), o DNA foi amplificado com a utilização de iniciadores com uma base seletiva (EcoRI-A e MseI-C). O DNA pré-amplificado foi diluído em uma razão de 1:25 e amplificado novamente, utilizando-se iniciadores com três bases seletivas (EcoRI- ANN e MseI-CNN). As etapas de restrição enzimática, de ligação dos adaptadores e de amplificações foram realizadas em termociclador PTC-100 (MJ Research Inc.). Os produtos amplificados foram separados por eletroforese vertical em tampão TBE 1X, em gel de 6% de poliacrilamida. As bandas foram visualizadas após coloração com nitrato de prata. Para a coloração, os géis foram fixados com solução de 0,5% de ácido acético + 5% de etanol, por 10 min., e com solução de 1% de ácido nítrico, por três minutos. Posteriormente, foram impregnados com solução de nitrato de prata 0,2%, durante trinta minutos. Após esse tempo, uma solução de 3% de carbonato de sódio + 0,2% de formaldeído foi utilizada para a revelação das bandas, durante o tempo necessário. As revelações foram finalizadas com a utilização de uma solução de 5% de ácido acético. Após cada


etapa, os géis foram lavados durante 20 segundos com água destilada. Todos os tratamentos foram realizados sob leve agitação. Após a secagem dos géis em temperatura ambiente, as bandas foram visualizadas sob luz branca e os géis fotografados com máquina digital. Caracterização da Diversidade Genética e Capacidade Informativa Os índices de diversidade estimados foram: a similaridade genética, o número médio de bandas, a porcentagem de bandas polimórficas e a diversidade genética. Os padrões de bandas obtidos com os marcadores RAPD e AFLP foram analisados e para eles construiu-se uma matriz binária, que identificava sua presença ou sua ausência, codificadas por 1 ou 0, respectivamente. A partir dessa matriz de dados, com o auxílio do software NTSYS-pc 2.02 (Rohlf, 1990), foi determinado o índice de similaridade genética de Jaccard entre os indivíduos e pelo método de agrupamento UPGMA (método das médias das distâncias), foram gerados, separadamente e de maneira agrupada, os dendrogramas para marcadores RAPD e AFLP. Para determinação da diversidade genética, foi utilizado o índice de Shannon, dado pela fórmula H= - Σ pi ln(pi), onde pi corresponde à freqüência de cada alelo (Lewontin, Figura 2: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD (r=0,83). 1970). Como ambos os marcadores apresentam característica dominante, considerou-se cada banda amplificada como sendo um loco com dois alelos, presente ou ausente no gel. Para determinar a capacidade informativa dos marcadores RAPD e AFLP, foram utilizados para a comparação dados gerados a partir de marcadores isoenzimáticos (Auler et al., 2002) e PCR-RFLP (Schögl, 2000) provenientes da mesma população. Devido à diferente natureza dos marcadores, o índice de diversidade de Shannon foi determinado para todos os dados e usado como parâmetro de comparação. Resultados e Discussão: A partir dos seis iniciadores utilizados para as reações RAPD, foram obtidos dezoito marcadores polimórficos, de um total de 62 bandas amplificadas, com uma média de 11,16 bandas amplificadas por iniciador. A média de bandas polimórficas foi de 3,0 por iniciador, com uma porcentagem média de 26,9%. O índice de diversidade de Shannon foi igual a 0,53 (Tabela 1). A figura 1 apresenta o padrão de bandas obtido com o iniciador OPA04, para reações RAPD. As sete combinações empregadas para as reações AFLP revelaram 62 Tabela 1: Iniciadores utilizado s nas reações RAPD e respectivo s índices de diversid ade genética para a população de A. angustifo lia do Parque Ecológico Municipal de Lages. Iniciadores Número total de bandas Bandas polifórmicas Q uantidad e % Índice de diversid ade ( H) OPA4 12 0 3 25, 0% 0, 58 OPA9 13 0 2 15, 4% 0, 59 OPA17 06 0 1 16, 7% 0, 58 OPC6 09 0 3 33, 3% 0, 52 OPF16 13 0 5 38, 5% 0, 56 OPAN15 09 0 4 44, 4% 0, 43 Médias para marcadores RAPD 11, 16 3 , 0 26, 9 % 0, 53 Tabela 2: Combinaçõ es de iniciadores utilizado s nas reações AFLP e respectivo s índices de diversid ade genética para a população de A. angustifo lia do Parque Ecológico Municipal de Lages. Iniciadores Número total de bandas Bandas polimórficas Q uantidad e % Índice de diversid ade ( H) E-AGC + M-CAC 90 4 4, 4% 0, 65 E-ACT + M-CAA 100 1 0 10, 0% 0, 45 E-ACA + M-CTT 60 3 5, 0% 0, 68 E-ACG + M-CAG 100 2 1 21, 0% 0, 55 E-AAG + M-CTG 80 6 7, 5% 0, 56 E-ACC + M-CAT 105 7 6, 6% 0, 55 E-ACC + M-CAC 90 1 1 12, 2% 0, 50 Médias para marcadores AFLP 89, 3 8 , 8 9, 8% 0, 54 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 97


marcadores polimórficos, em um total de 625 bandas amplificadas. A média de bandas totais amplificadas foi de 89,3 e de bandas polimórficas foi de 8,8 por combinação de iniciadores. A porcentagem média de bandas polimórficas foi de 9,8%. Para marcadores AFLP, o índice de diversidade de Shannon foi de 0,54 (Tabela 2). Quando os dois tipos de marcadores foram analisados conjuntamente, o total de bandas amplificadas foi de 687, com 80 bandas polimórficas, que correspondiam a 11,6%. As médias de bandas totais e polimórficas amplificadas foram de 52,8 e 6,15 por iniciador, respectivamente. A diversidade genética determinada pelo índice de Shannon foi de 0,54 (Tabela 3). Marcadores isoenzimáticos (Auler et al., 2002) empregados na mesma população acessaram uma diversidade genética de Shannon de H=0,29, ao passo que marcadores PCR-RFLP de DNA de cloroplastos (Schögl, 2000) detectaram um único haplótipo na população, correspondendo a uma diversidade virtualmente inexistente. Nesse caso, marcadores RAPD e AFLP mostraram-se altamente eficientes, detectando uma diversidade genética quase duas vezes maior (1,8 x) que aquela determinada por isoenzimas. Apesar de caracterizar-se pela análise da molécula de DNA da mesma forma que as técnicas RAPD e AFLP, a técnica PCR-RFLP aplicada a genomas de cloroplastos não possibilitou a detecção de diversidade nesta população. Já as técnicas RAPD e AFLP não demonstraram limitações para acessar a diversidade genética em populações altamente exploradas, como a utilizada nesta pesquisa. Quando os valores obtidos no presente trabalho são comparados a outros estudos que utilizaram as técnicas RAPD e AFLP, estes podem ser considerados baixos. Contudo, há de se considerar que os estudos com isoenzimas e PCR-RFLP utilizados como parâmetro para a comparação também apresentaram valores baixos para essa população, quando comparados a ou- tras populações de A. angustifolia analisadas antes. Por outro lado, uma criteriosa seleção de combinações de iniciadores permite que a técnica AFLP apresente um polimorfismo muito maior (Stefenon, 2003). A similaridade genética foi analisada em função dos três dendrogramas gerados: um, a partir dos 18 marcadores RAPD polimórficos (Figura 2), o segundo, a partir dos 62 marcadores AFLP polimórficos (Figura 3) e o terceiro, a partir dos 80 marcadores RAPD e AFLP polimórficos agrupados (Figu- 98 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 3: Dendrograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages, gerado a partir de 64 marcadores AFLP (r=0,83). Figura 4: Dendograma de similaridade genética entre indivíduos, estimado pelo índice de Jaccard para a população de A. angustifolia do Parque Ecológico Municipal de Lages, gerado a partir de 18 marcadores RAPD e 62 marcadores AFLP agrupados (r=0,80). ra 4). A maior similaridade genética entre indivíduos foi de 86% (indivíduos L11 e L13), com marcadores RAPD; 81 % (indivíduos L5 e L26), com marcadores AFLP e 71% (indivíduos L6 e L7), com o agrupamento dos dois tipos de marcadores. Nesse ponto, percebe-se que o maior número de marcadores permite uma maior discriminação entre os indivíduos analisados. A comparação entre os três dendrogramas permite ainda perceber que, no agrupamento dos marcadores, o maior número de bandas Tabela 3: Médias para os índices de diversid ade genética estimados para a população de A. angustifo lia do Parque Ecológico Municipal de Lages, a partir de marcadores RAPD e AFLP. Marcadores Número total de bandas Bandas polimórficas Q uantidad e % Índice de diversid ade ( H) Médias para marcadores RAPD 11, 16 3 , 0 26, 9% 0, 53 Médias para marcadores AFLP 89, 3 8 , 8 9, 8% 0, 54 Médias RAPD + AFLP 52, 8 6 , 15 11, 6% 0, 54


AFLP fez com que o dendrograma ficasse muito semelhante ao gerado unicamente dos marcadores AFLP. Utilizando-se um valor máximo de 50% para a similaridade genética entre os indivíduos, o dendrograma gerado a partir de marcadores RAPD (Figura 2) dividiu-se em doze grupos. A maior similaridade genética foi observada entre os indivíduos L11 e L13, com 86% de similaridade e o ponto de união de todos os grupos apresenta 30,5% de similaridade. O dendrograma gerado de marcadores AFLP (Figura 3) dividiu-se em quinze grupos, utilizando-se 50% como similaridade máxima; o ponto de união de todos os grupos apresenta 24% de similaridade. Com esses marcadores, a similaridade genética entre pares de indivíduos variou de 24% a 81%. Deve-se considerar que existe uma relação entre o número dado a cada planta e sua proximidade geográfica, sendo mais próximos geograficamente os indivíduos cujos números são mais próximos. Dessa forma, pode-se observar que os argumentos de plantas são aleatórios, formados por indivíduos dispersos pelo Parque, em uma área de 2,34 km 2 . Esse dado sugere que indivíduos geograficamente, os quais podem ser aparentados, não apresentam grande similaridade genética. Considerações Finais Um aspecto importante a ser considerado é que a A. angustifolia provavelmente possuía uma grande diversidade genética antes da exploração ocorrida durante o ciclo da madeira no sul do Brasil (Auler et al., 2002). Dessa forma, antes de qualquer previsão de melhoramento genético é essencial conhecer a diversidade genética existente nas populações remanescentes, para possibilitar a seleção de plantas e sementes a serem utilizadas, tanto para a produção de mudas, quanto para cruzamentos controlados. A exemplo do ocorrido no Parque Ecológico Municipal de Lages, durante o ciclo da madeira, a seleção promovida pelo homem até o momento, foi a retirada dos melhores fenótipos, em detrimento dos demais. Devido ao acesso aleatório a amplas regiões genômicas praticamente livres da ação da seleção natural, as técnicas RAPD e AFLP geram um gran- de número de marcadores virtualmente neutros. Neste caso, dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que essas técnicas apresentam-se como poderosas ferramentas para a caracterização da diversidade genética dos remanescentes de A. angustifolia, com vistas ao melhoramento genético da espécie. Agradecimentos Ao CNPq, UNIPLAC e FUNCITEC pelo apoio financeiro e à Prefeitura do Município de Lages, pelo apoio na obtenção do material vegetal. Referências Bibliográficas AULER, N.M.F.; REIS, M.S.; GUERRA, M.P.; NODARI, R.O. The genetics conservation of Araucaria angustifolia: I: genetic structure and diversity of natural populations by means of nonadaptative variation in the state of Santa Catarina, Brazil. Genetics and Molecular Biology, 25 (3):329-338, 2002. GUERRA, M.P.; SILVEIRA, V.; REIS, M.S.; SCHNEIDER, L. 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Pesquisa Monita Fiori de Abreu Acadêmica do curso de Agronomia, Bolsista PIBIC/BIP/CNPq - Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal - CCA/UFSC. monitaf@yahoo.com Enio Luiz Pedrotti Ph.D., Prof. Adjunto IV , Departamento de Fitotecnia - Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal -CCA/UFSC. pedrotti@cca.ufsc.br Ilustrações cedidas pelos autores Micropropagação de Macieira Introdução A cultura da macieira possui papel de destaque no cenário frutícola brasileiro. Atualmente, a área cultivada no Brasil está estimada em 30 mil hectares, com uma produção aproximada de 967 mil toneladas (ABPM, 2003). Visando atender às demandas de mudas da pomicultura nacional, faz-se necessária a aplicação de métodos eficientes para garantir grande quantidade de material vegetal de alta qualidade genética e fitossanitária. A produção de mudas da macieira tradicionalmente é efetuada através de técnicas de propagação vegetativa, como a enxertia de cultivares copa sobre um porta-enxerto. Tradicionalmente a muda é obtida através de mergulhia de cepa (Driessen & Souza Filho, 1986). Porém, esse método restringe o número de mudas obtidas, requer muito tempo, além de poder resultar em mudas de baixa qualidade fitossanitária. Diante da problemática relacionada às técnicas convencionais de propagação, a biotecnologia através do aperfeiçoamento das técnicas de cultivo in vitro, tem sido uma excelente opção para a multiplicação desta frutífera (Figura 1). Possibilita a produção de mudas de alta qualidade sanitária oriundas da cultura de meristemas livres de vírus, evitando, desta forma, os problemas de disseminação de vírus e outros patógenos durante a fase de propagação. Diversos trabalhos vêm sendo conduzidos no Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal (CCA/UFSC) a partir de projetos fi- 100 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Avanços nos protocolos de micropropagação nanciados pelo CNPq e FINEP. As principais linhas de pesquisa foram no sentido de desenvolver metodologias que abrangem desde o isolamento e inoculação in vitro de meristemas, até a aclimatização das plantas micropropagadas. Metodologia 1 - Isolamento e Inoculação in vitro A introdução e o estabelecimento de meristemas in vitro é uma das fases mais delicadas da micropropagação. O isolamento de meristemas é um processo oneroso (Nunes et al., 1999) mas é primordial, pois é uma condição que garante a produção de brotações livres de patógenos. A oxidação e a contaminação provocam grandes perdas do material. Os meristemas extraídos das gemas apicais apresentam taxas de oxidação acima de 40%. A percentagem de contaminação é constatada em cerca de 35% dos explantes. Num trabalho conduzido com o porta-enxerto M.9, todos os tubos de ensaio com meio de cultura contaminado apresentaram oxidação (Tabela 1). Os agentes contaminantes como fungos e bactérias liberam compostos que causam a oxidação. O estabelecimento in vitro é executado segundo metodologias consideradas clássicas para esta fase (Pedrotti, 1993; Nunes et al. 1999). As gemas são extraídas com o auxílio de um bisturi e estas, são submetidas à lavagem com água destilada/ autoclavada e detergente Tween


Tabela 1. Contaminação, oxidação, números de gemas e brotos e percentual de calos no porta-enxerto de macieira 'M-9' ( Malus p umilla M. ) , a partir da cultura de meristemas e gemas axilares. Parâmetro s Analisados Meristemas Tratamen tos G emas CV ( % ) Conta mina ção ( % ) 38, 6 a 32, 2 a 14, 1 Oxidaç ão ( % ) 42, 3 b 58, 4 a 12, 5 Nº médi o de gema s por brot o 3, 0 b 5, 0a 12, 6 Nº médi o de brot os form ados 3, 0 a 4, 0 a 9, 6 Calos ( % ) 62, 3 a 12, 4 b 14, 1 Figura 1: Frascos do cultivo in vitro de macieira 20®por 20 minutos. Em seguida, as gemas são imersas em solução de Anfotericina B®(25 mg.L -1 ) por 10 minutos. Em câmara de fluxo laminar, as gemas são imersas em etanol 70% por 1 minuto, seguida de solução de hipoclorito de sódio 4%, por 10 minutos. Durante este processo os frascos são mantidos sob agitação contínua. Posteriormente, faz-se uma tríplice lavagem com água destilada/autoclavada e as gemas permanecem em uma solução de ácido ascórbico 15% por 10 minutos até serem inoculadas em sais e vitaminas de MS (Murashige e Skoog, 1962), sacarose (30 g.L -1 ), ágar (6 g.L -1 ) sem suplementação de fitorreguladores (Souza et al.,2003). As gemas axilares introduzidas in vitro têm apresentado oxidação acima de 50%, enquanto que os meios de cultura contaminados com fungos e bactérias são normalmente acima de 30% (Tabela 1). Da mesma forma, todos os tubos contendo meio de cultura contaminados apresentaram oxidação. Quando os explantes não apresentam oxidação nem contaminação, são transferidos de tubos de ensaio com novos meios de cultura para eliminar resíduos fenólicos liberados pelas plantas no meio de cultura inicial (Zanol, 1996). Nos tra- balhos conduzidos no laboratório, após a transferência dos meristemas provenientes de gemas apicais e segmentos nodais com gemas axilares, não ocorrem mais problemas de contaminação nem oxidação. O crescimento e desenvolvimento dos meristemas e gemas axilares são normalmente lentos até 30 dias após a inoculação, não sendo observado o crescimento de brotações. Aos 60 dias, é possível observar o desenvolvimento de brotações. Para o porta-enxerto M.9, os meristemas e gemas axilares introduzidos in vitro, formam um número médio de 3 e 5 gemas por broto, respectivamente (Tabela 1). As diferenças observadas na introdução in vitro e multiplicação podem ser consequência do estado fisiológico das plantas matrizes, onde foram coletados os explantes como salientaram Grattapaglia & Machado (1990). Quando material vegetal coletado é retirado das matrizes no final do verão, possivelmente, as gemas já iniciam o processo de entrada em dormência, o que diminui a sobrevivência dos meristemas e gemas introduzidos in vitro. Desta forma, a época mais interessante para a introdução in vitro é aquela que corresponde a um intenso crescimento vegetativo nas condições naturais. 2 - Multiplicação do material vegetal A composição salina mais utilizada nos meios de cultura é a MS (Murashige & Skoog, 1962), geralmente suplementada com reguladores de crescimento que permitem direcionar as respostas morfogenéticas (George, 1996). Para a fase de multiplicação in vitro da macieira, Ribas & Zanette (1992) Tabela 2. Efeito de diferentes concentraçõ es de BAP em meio de cultura MS sobre a resposta de na fase de multiplicação i n vitro de macieira ( M alus platycarpa) após 45 dias de cultura. Concentraç ão de BAP Nº de brotações por explante Altura das brotações ( cm) Comprimento dos entrenós ( cm) Vitrificação ( % ) 0, 00 µ M 1, 0 c 2, 3 a 0, 59 b 42, 0 a 1, 11 µ M 2, 0 b 2, 6 a 0, 59 b 18, 0 c 2, 22 µ M 3, 0 a 2, 6 a 0, 54 c 18, 0 c 4, 44 µ M 2, 0 b 2, 9 a 0, 65 a 24, 0 b CV ( % ) 14, 2 15, 3 13, 3 18, 9 Médias seguid as de mesm a letra na verti cal não difere m signi ficati vament e entre si, ao nível de 5% de prob abilid ade, pelo teste de Duncan. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 101


utilizaram o meio MS suplementado com 1,0 mg.L -1 de BAP e 1,0 mg.L -1 de tiamina, e Modgil et al. (1999) obtiveram a maior taxa de multiplicação de brotações da cultivar Tydeman´s Early Worcester adicionando ao meio de cultura 4,4 µM de BAP e 5,0 µM de KIN. Para o porta-enxerto Marubakaido Nunes et al. (1999) utilizaram concentrações de BAP entre 1,11 e 4,44 µM. Quando se pretende estudar o comportamento de um novo genótipo, os explantes são repicados para tubos de ensaio (2,5 x 15,0 cm) contendo 15 mL de sais e vitaminas de MS, suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP) (0; 0,25; 0,50 e 1.0 mg.L -1 ), 30,0g.L -1 de sacarose, 6,0 g.L -1 de ágar. Para um genótipo usado com planta indicadora de viroses, é possível verificar que as concentrações de BAP influenciam sua resposta in vitro (Tabela 2). O material é mantido no escuro por 48 horas, após este período, é transferido para a sala de crescimento sob fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25 ± 2°C e 40 µmol.m -2 .s -1 de radiação luminosa, fornecidas por lâmpadas fluorescentes Phillips® Super 84. 3 - Microenxertia Tendo em vista as características da cultura, a associação das técnicas de micropropagação e microenxertia permite combinar as vantagens da rápida multiplicação in vitro, com a união de dois genótipos diferentes: um clone copa, selecionado para produzir frutos de alta qualidade, e um clone de porta-enxerto, que confere à cultivar copa características relevantes, como: vigor, produtividade, qualidade de frutos, resistência a fatores adversos como a patógenos do solo, além de realizar funções básicas de suporte da planta, fornecimento de água e nutrientes e a adaptação às condições de solo, clima e doenças. A micronexertia foi inicialmente desenvolvida por Murashige et al. (1972) e posteriormente melhorada por Navarro et al.(1975), buscando a produção de citrus livres de viroses. Esta técnica permite a obtenção de plantas livres de patógenos, aplica- Figura 2: Fenda do microenxerto de macieira., início de brotação na copa, 30 dias após a microenxertia. ção de quarentena em espécies vegetais cuja disponibilidade seja de apenas algumas gemas vegetativas, separação entre viroses e outras doenças, além de estudos fisiológicos, histológicos e histoquímicos nas enxertias. Porem ainda é um desafio promover com sucesso a enxertia de um material tão pequeno e frágil como aquele proveniente de plantas produzidas in vitro. (Obeidy & Smith, 1991). Para garantir a viabilidade do microenxerto é necessário que as células da base do microenxerto da cultivar copa, entrem novamente em divisão, pois são diferenciadas, ou seja, já deixaram o ciclo celular e não sofrem mais desdiferenciação. Na retomada do ciclo celular é possível induzir novas competências e diferenciar para estabelecer os tecidos estruturais e condutores (Taiz & Zeiger, 1991). O estabelecimento de novos tecidos condutores é o resultado do sucesso do método. Nos trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal, como modelo, foram utilizados dois porta-enxertos (M9 e Marubakaido) e uma cultivar copa (Gala) de macieira. O portaenxerto M9 (Malus pumila Mill.) é o mais utilizado no sul do Brasil, tendo como característica principal diminuir o vigor da planta. Além de redu- 102 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Figura 3: Detalhes dos pontos de conexão observados no corte histológico do microenxerto de macieira, 90 dias após a microenxertia. zir o porte da planta, o M9 aumenta a precocidade e é um dos poucos porta-enxertos que apresenta boa resistência à podridão do colo (Phytophthora cactorum) (Barrit, 1999). O porta-enxerto Marubakaido (Malus prunifolia Borkh.) é de origem japonesa, sendo bastante utilizado como porta-enxerto comercial no Japão, Europa bem como no Brasil (Bessho et al., 1993). É vigoroso, apresenta resistência à podridão-docolo, relativa resistência a Rosellinia sp. e é muito sensível a viroses (Denardi, 1986). A culitvar copa Gala (Malus domestica Borkh.) é a primeira em volume de produção no Brasil, apresenta frutificação precoce, alta produtividade e boa adaptação a altitudes superiores a 1000m (Denardi, 1986). 4 - Estudos histológicos A microenxertia é realizada em fenda simples conforme a metodologia proposta por Hartmann et al. (1990). Em câmara de fluxo laminar, a parte apical das plântulas dos porta-enxertos é retirada e a altura das plantas uniformizada em 5 cm de altura. Para a variedade copa Gala sãopreparados microgarfos com uma única gema lateral. Através de um corte em fenda simples


Tabela 3. Número e comprimento de raízes em plantas micropropagad as dos porta-enxertos de macieira M. 7, M. 9 e Marubakaido, submetidos a diferentes concentraçõ es e formas de aplicação de Ácido Indolbutírico ( AIB) e ao crescimento das raízes em diferentes substrato s. N úmero de raízes Comprimento das raízes ( cm) T ratamento s " M. 7" " M. 9" " Marubakaido" " M. 7" " M. 9" " Marubakaido" 1 4, 0 ± 1, 0 c 5, 0 ± 1, 0 a 10, 0 ± 2, 0 a 1, 7 ± 0, 1 b 2, 7 ± 0, 5 a 1, 8 ± 0, 4 b 2 6, 0 ± 0, 5 b 3, 0 ± 1, 0 b 3, 0 ± 1, 0 b 1, 9 ± 0, 1 ab 0, 5 ± 0, 2 c 0, 5 ± 0, 3 c 3 8, 0 ± 1, 0 a 0, 0 ± 0, 0 c 2, 0 ± 0, 5 c 2, 2 ± 0, 2 a 0, 0 ± 0, 0 d 0, 4 ± 0, 3 c 4 9, 0 ± 1, 0 a 5, 0 ± 1, 0 a 13, 0 ± 2, 0 a 2, 2 ± 0. 2 a 1, 6 ± 0, 2 b 3, 4 ± 0, 5 a Médias na coluna seguid as da mesm a letra não difere m estat isti camen te entre si, ao nível de 5 % de prob abilid ade, pelo teste de Tukey. Trata ment os: 1 - Induçã o in vitro em 1. 5 µ M de AIB em ágar e cres cime nto das raíz es i n vitro em ágar; 2 - Induçã o in vitro em 1. 5 µ M de AIB em ágar e cres cime nto das raíz es i n vitro em subst rato mine ral; 3 - Induçã o in vitro com 0, 49 M de AIB e cres cime nto i n vitro em subst rato mine ral; 4 - Induçã o ex vitro com 0, 49 M de AIB e cres cime nto das raíz es em subst rato mine ral conco mita nte com a fase de aclima tizaçã o. Tabela 4. Enraizamen to, número e comprimento de raízes de microestacas do porta-enxerto de macieira M. 9 ( Malus pumila) , tratadas com AIB e submetidas ao enraizamen to ex vitro, em substrato de casca de arroz carbonizad a e vermiculita 1: 1 ( v/ v) , por um período de 30 dias. A IB( mg/ L) Enraizamen to( % ) N úmero deraízes Comprimento das raízes ( cm) 0 64 b 3, 5 b 3, 5 a 500 82 a 6, 0 a 4, 1 a 1000 84 a 6, 0 a 4, 5 a 1500 30 c 7, 5 a 4, 7 a * Médias seguid as de mesm as letra s nas coluna s não difere m signi ficati vament e pelo teste de Duncan a 5% . ns - não signi ficati vo. realizado nas plântulas dos portaenxertos, e um corte em bisel no minigarfo da cultivar copa, é realizada a enxertia com o auxílio de duas pinças. Os microenxertos são então inoculados em frascos com meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) e transferidos para a sala de crescimento, com temperatura de 25±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e luminosidade de 40 µmol.m - 2 .s -1 , onde permanecem até as coletas dos segmentos. Para os estudos histológicos, de ambas as combinações enxerto-porta-enxerto, Gala sobre Marubakaido e Gala sobre M9, são realizadas 120 microenxertias, o que diminuem os erros experimentais. O material vegetal coletado é fixado em glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato de sódio 0,1M – pH7,2, desidratado em série etílica e emblocado em parafina (Johansen, 1940). Os cortes são corados com azul de toluidina e montados, entre lâmina e lamínula, com bálsamo do Canadá. A análise dos cortes histológicos é feita em microscopia óptica e em lupa, 30 e 90 dias após a microenxertia (Figuras 2 e 3). A conexão dos microenxertos é vizualizada a partir de duas etapas. O primeiro momento se dá em poucos dias e é caracterizado pela morte de camadas celulares da interface do enxerto e pela formação de células parenquimáticas que preenchem o ponto de enxertia, resultando no desenvolvimento de uma camada necrótica na fenda. Na segunda etapa, ocorre a proliferação de um calo em associação com a região vascular da copa e do portaenxerto, formando uma ponte na interface do enxerto. Posteriormente, há a diferenciação de algumas células do calo em novas células cambiais. Ocorre, então, a união entre os tecidos afins da copa e do porta-enxerto resultando no estabelecimento de uma conexão cambial contínua. Na última fase, a continuidade da epiderme no ponto de enxertia é restaurada. O posterior desenvolvimento da copa pelo alongamento e desenvolvimento de brotações caracteriza o sucesso da microenxertia, observado em até 30 dias em macieira (Abreu et al., 2003). 5 - Enraizamento de plantas micropropagadas O enraizamento de microestacas é considerado por vários autores um dos estágios mais críticos do processo de propagação massal de plantas perenes (Wang, 1991), pois depende do genótipo e de sua condição fisiológica no momento da indução ao enraizamento (Martins & Pedrotti, 2001). A emissão de raízes por uma microestaca pode ser dividida em três fases, que compreendem a desdiferenciação celular, a indução e a organização dos primórdios radiculares (Hartmann et al., 1997; Blakesley et al., 1991). Na maioria dos protocolos estabelecidos para a micropropagação de plantas, o enraizamento é induzido in vitro, utilizando meios de cultura contendo uma auxina (Harbage & Stimart, 1996; Deklerk et al., 1997; Ferri et al., 1998). Para a maioria das espécies, a auxina é necessária na fase de indução das raízes enquanto que, na fase de diferenciação dos primórdios e no crescimento das raízes, a presença de auxinas no meio de cultura pode Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 103


inibir o processo (Deklerk et al.,1995). A concentração de auxina a ser adicionada ao meio de cultura para o estágio de indução, depende da concentração endógena deste hormônio em cada genótipo utilizado (Blakesley et al., 1991), sendo que altas concentrações, por períodos de exposição prolongados, podem determinar a formação de calos na base das microestacas. Para Pasqual & Ishida (1992), o melhor enraizamento in vitro foi obtido em meio MS, geleificado, contendo 1 mg/L de AIB. As condições de temperatura, a luminosidade da câmara de crescimento e a disponibilidade de oxigênio junto à base das microestacas, além de fatores anatômicos inerentes ao genótipo, podem inibir a evolução do processo morfogenético induzido pelas auxinas. Apesar de Harbage & Stimart (1996), Deklerk et al. (1997) e outros autores utilizarem o processo de indução e crescimento das raízes in vitro, McClelland et al. (1990) ressaltam que as raízes produzidas in vitro não são funcionais quando transferidas para a fase de aclimatização. Para garantir a sobrevivência nesse estágio, é necessário que a planta produza novas raízes, o que demanda um grande consumo de reservas que deveriam ser utilizadas para o crescimento da parte aérea. Além disto, Debergh & Maene (1981) salientam a necessidade de desenvolver sistemas de indução que permitam a produção de raízes funcionais para o processo de aclimatização e para o aumento da qualidade das plântulas. 5.1 - Enraizamento in vitro Os resultados obtidos com a indução in vitro de raízes em portaenxertos de macieira, mostraram diferenças em relação aos parâmetros avaliados, em função do genótipo e da concentração e forma de aplicação da auxina (Martins & Pedrotti, 2001). (Tabela 3). Resultados semelhantes foram obtidos com macieira por Harbage et al. (1998), os quais concluíram que a capacidade de emitir raízes e de estabelecer um sistema radicular, é uma condição intrínseca de cada genótipo No caso do porta-enxerto M.7, o enraizamento realizado in vitro em ágar apresentou resultados inferiores quanto ao número de raízes. Provavelmente as concentrações de AIB utilizadas não possibilitaram a indução do mesmo número de raízes que foi observado para o ‘Marubakaido’, já que as respostas são dependentes do genótipo (Blakesley et al., 1991). É possível que, para este porta-enxerto, o pH do meio de cultura não tenha favorecido a absorção de auxinas pelas células da base da microestaca, tendo em vista que a penetração de auxinas nas células depende do equilíbrio entre ácidos livres e formas aniônicas, que são dependentes do pH (Harbage et al., 1998). O maior número de raízes obtido para as microestacas do ‘M.9’ e do ‘Marubakaido (Tabela 4), induzidas ex vitro com o AIB dissolvido em água e transferidas diretamente para o substrato mineral para a aclimatização, reforça as conclusões emitidas por Rogers & Smith, (1992). Estes autores aumentaram a eficiência no enraizamento de roseiras quando utilizaram substratos minerais para o crescimento das raízes, comparados com meios de cultura geleificados. Estes resultados abrem perspectivas concretas para o uso de substratos porosos para o enraizamento in vitro, o que diminui os custos de produção de plantas micropropagadas. Com esta metodologia é possível substituir os meios de cultura contendo ágar por substratos minerais, o que diminui custos e produz raízes de melhor qualidade do que as produzidas in vitro. Figura 4 : Crescimento de raízes em porta-enxertos de macieira, após indução ao enraizamento 104 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 5.2 - Enraizamento ex vitro Em função dos custos da fase de enraizamento e aclimatização das plantas micropropagadas, uma série de trabalhos foram conduzidos no Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal (Pedrotti & Voltolini, 2001). Os principais objetivos foram de induzir o enraizamento ex vitro em substratos porosos que servem apenas de suporte para as plântulas como acontece na estaquia tradicionalmente usada para a propagação de várias espéceis. Para isto, são utilizadas miniestacas do porta-enxerto M.9, de 2 a 2,5 cm de comprimento, com dois pares de folhas, preparadas a partir de brotações micropropagadas. A indução ao enraizamento é efetuada submergindo 10mm da base das miniestacas durante 10 segundos em diferentes concentrações de ácido indolbutírico (0, 500, 1000, ou 1500 mg/L ). Em seguida, as miniestacas são transferidas para bandejas alveoladas contendo o substrato terra roxa e casca de arroz carbonizada 1:1 (v/v.). As bandejas são então colocadas dentro de caixas plásticas com uma lâmina de água de 5 mm para manter a umidade relativa elevada. As caixas são cobertas com uma lâmina de vidro, conforme metodologia descrita por Pedrotti (1993). Durante 30 dias essas caixas são mantidas em câmara de aclimatização com temperatura de 27±2 °C, fotoperíodo de 16 horas com intensidade luminosa de 30 µmol.m -2 .s -1 . Após esse período, as plantas são avaliadas quanto ao percentual de enraizamento, número e comprimento das raízes emitidas. As maiores percentagens de enraizamento com 82 e 84 % são observadas nas miniestacas tratadas com 500 e 1000 mg/L de AIB, respectivamente O menor percentual de enraizamento (29,6%) é obtido com 1500 mg/L de AIB. As microestacas-controle produzem em média 3,4 raízes. Estes valores são inferiores àqueles observados nos tratamentos com AIB. Para os níveis de AIB de 500, 1000 e 1500 mg/L, o resultado é a produção de 5,6 a 7,6 raízes respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si.


Considerando que o porta-enxerto M.9 é de difícil enraizamento é possível sugerir que o mesmo necessite de níveis maiores de auxinas ou outros coofatores para aumentar o enraizamento, já que James & Thurnbon (1981) só obtiveram 45% de enraizamento com este porta-enxerto quando adicionaram fluoroglucinol no meio de cultura. Possivelmente as condições de indução in vitro, utilizadas por estes autores dificultaram a absorção da auxina, como constatado por Harbage et al. (1998). Além disto, a intensidade luminosa da câmara de crescimento pode ter contribuído para inativar parte da auxina aplicada. Khosh-khui & Sink (1982) obtiveram aumento no enraizamento de roseira com o sombreamento da base das estacas. Valores mais elevados no enraizamento de pereira (Wang, 1991) e em macieira (Fortes & Leite,1993) foram obtidos com a manutenção das plantas no escuro. A maior porosidade e aeração dos substratos utilizados também podem favorecer a indução e o crescimento de raízes, como foi observado por Jay- Allemand et al. (1992). Os níveis de AIB superiores a 500 mg/L não aumentam a percentagem de enraizamento do porta-enxerto M.9. Estes resultados podem estar relacionados com os teores endógenos de auxinas produzidas por gemas e folhas jovens, como sugerem Hartmann et al. (1997), pois mesmo sem aplicação de AIB, as percentagens de enraizamento do porta-enxerto M.9 foram de 63,5 %. A exposição das miniestacas ao AIB por 10 segundos é suficiente para a indução de primórdios radiculares e o desenvolvimento e crescimento posteriores das raízes (Figura 4). Jarvis et al. (1983) observaram um aumento na síntese de RNA 20 horas após a aplicação de auxina o que corresponde às primeiras divisões celulares. 6 - Aclimatização Durante a fase de aclimatização, as plantas micropropagadas devem se adaptar a um ambiente completamente diferente das condições em que ela foi produzida in vitro. Durante este período a planta deve compor uma estrutura anatômica e fisiológica capaz de suportar as condições de alta demanda evaporativa da atmosfera e de alta radiação luminosa. Quando transferidas para condições ex vitro, as mudas normalmente apresentam altas taxas de transpiração, em função da alta condutividade hidráulica de suas folhas e a funcionalidade dos estômatos (Brainerd & Fuchigami, 1981; Schakel et al., 1990), o que, na maioria das situações, provoca elevado déficit hídrico, podendo provocar a morte das mudas (Díaz- Pérez et al., 1995). Apesar dos avanços nos protocolos de multiplicação in vitro, poucos trabalhos foram realizados no sentido de elucidar problemas ligados à aclimatização das plantas (Avanzato & Cherubini, 1993). Para Ziv (1995), a aclimatização pode comprometer o processo de micropropagação por envolver a neoformação de um sistema radicular e a passagem para condições de cultivo ex vitro. Durante a fase de multiplicação das brotações in vitro, os estômatos apresentam-se com formas e estruturas anormais (Blanke & Belcher, 1989) e a densidade pode ser diferente das folhas de plantas cultivadas ex vitro (Cappelades et al., 1990; Sciutti & Morini, 1993). Para diver- Figura 5.: Desenho esquemático da metodologia de aclimatização de plantas micropropagadas (Pedrotti, 1993). A e B: Indução ao enraizamento in vitro. C: Indução ao enraizamento ex vitro. D: Início do processo de aclimatização. E: Plantas sendo mantidas em sala com nebulização. F: Fotoperíodo sendo mantido em 16 horas de luz para evitar a entrada em dormência. G e H: Plantas transferidas à campo para completar o crescimento. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 105


Figura 6: Crescimento e desenvolvimento de mudas de macieira após aclimatização. sos autores, (Pospisilova et al., 1997), os estômatos in vitro não são funcionais, permanecem contentemente abertos ou fechados e são insensíveis aos estímulos habituais de escuro, alta concentração de CO 2 , ABA e potencial hídrico. Desta forma, a grande transpiração pode causar dificuldades durante o processo de aclimatização. A metodologia recomendada por Pedrotti (1993) (Figura 5) e utilizada no LMBV por Pedrotti & Voltolini (2001), possibilitou bons resultados para vários genótipos de macieira. Neste processo, as plantas são induzidas ao enraizamento ex vitro e transferidas para bandejas alveoladas. As bandejas são colocadas em caixas plásticas cobertas com uma placa de vidro transparente. Esta condição, permite a manutenção da umidade relativa em 100%. Com esta metodologia, a sobrevivência das plantas situa-se entre 70 e 95% (Tabela 5). No que concerne à matéria seca produzida pelas raízes e parte aérea das plantas, os maiores valores são obtidos quando as plantas receberam 1000 mg/L de AIB na fase de indução ao enraizamento. A aclimatização pode ser efetuada em câmaras de nebulização que mantém alta umidade relativa, o que diminuem as possibilidades de desidratação e morte das plantas. Neste sentido, Maciel et al. (2002) demostraram que é possível obter altos índices de sobrevivência de plantas do porta-enxerto M.7. Neste processo, as bandejas são transferidas para diretamente para a câmara de nebulização. Aos 30 dias após a transferência ex vitro, a percentagem de enraizamento é maior nas mudas que foram aclimatizadas no substrato composto por casca de arroz carbonizada, já que esta aumenta o espaço poroso como foi observado por Lê & Collet (1991) e por Avanzato & Cherubini (1993). As altas percentagens de enraizamento coincidem com as de sobrevivência, pois todas as plantas que enraizaram sobreviveram, e co- 106 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 incidem com os de crescimento das mudas (Figura 6). Maciel et al. (2002) sugerem que a umidade relativa no ambiente utilizado garantiu as condições adequadas para a aclimatização das mudas. Esta hipótese é corroborada por Campostrini & Otoni (1996), pois plântulas produzidas in vitro não estão adaptadas ao novo ambiente, pois não possuem mecanismos de proteção contra a desidratação, já que seus estômatos geralmente se encontram abertos (Schackel et al., 1990). No entanto, segundo Pospíslová et al.(1997) e Bolar et al. (1998), durante a aclimatização as mudas ativam os mecanismos que permitem sua sobrevivência após a transferência para a casa de vegetação. Possivelmente as condições de aclimatização utilizadas neste trabalho possibilitaram a sobrevivência da planta até a entrada em funcionamento dos estômatos, o que permitiu um maior controle sobre as perdas de água, o que está de acordo com Sutter (1988). Considerações Finais Os resultados obtidos nesse laboratório corroboram com aqueles que foram publicados por vários grupos de pesquisa nacionais e estrangeiros. As metodologias desenvolvidas permitem a produção comercial de mudas de porta-enxertos e copa de macieira micropropagados. Em que pese as peculiaridades de cada genótipo a grande maioria dos clones utilizados atualmente podem ser produzidos seguindo protocolos semelhantes. A perspectiva do uso da indução ao enraizamento realizado simultaneamente à aclimatização das plantas ex vitro pode diminuir em até 50% o custo de produção de uma Tabela 5. Sobrevivên cia, número e comprimento de raízes altura e número de folhas de miniestacas do porta-enxerto de macieira M. 9 ( Malus pumila) , submetidas ao enraizamen to ex vitro, em diferentes concentraçõ es de AIB, 45 dias após a repicagem para substrato mineral. AIB Sobrevivênciadas Número de Comprimen to das Comprimen to das Número de ( mg/ L) plantas ( % ) raízes raízes ( cm) brotações ( cm) folhas 0 85 b 10, 1 ns 12, 0 ns 5, 3 ns 7, 5 ns 500 95 a 11, 5 12, 5 6, 3 8, 0 1000 70 c 16, 0 11, 6 6, 9 7, 5 1500 73 c 20, 0 11, 3 6, 9 7, 8 * Médias seguid as de mesm as letra s nas coluna s não difere m signi ficati vament e pelo teste de Duncan a 5% . ns - não signi ficati vo


muda micropropagada, o que torna viável o uso comercial da micropropagação. A produção de mudas de alta qualidade genética e sanitária é um fator de extrema importância para a garantia da competitividade da pomicultura nacional. Neste sentido, a aplicação das técnicas aqui abordadas abrem perspectivas para a instalação de laboratórios comerciais para atender à demanda de mudas para a renovação de pomares pouco produtivos e a implantação de novos pomares com alta densidade. Referências Bibliográficas ABPM. Produção, exportação, importação, empregos gerados. Disponível em: http.www.abpm.org. acesso em: 18 de agosto de 2003. ABREU, M.F.; NUNES, J.C.O.; SANTOS, M.; PEDROTTI, E.L. Estudos histológicos preliminares da microenxertia de plantas micropropagadas de macieira. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal , v.25, n.1, p.195-196, 2003. AVANZATO, D.; CHERUBINI, S. Potenzialitá di radicazione diretta e ambientamento di microtalee di portinnesti di melo moltiplicati in vitro. 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Pesquisa Adriano Luiz Tonetti Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP atonetti@fec.unicamp.br Bruno Coraucci Filho, Dr Professor Associado da Faculdade de Engenharia Civil - UNICAMP Alexandre Patto Kanegae Mestre em Saneamento e Ambiente - UNICAMP Ronaldo Stefanutti, Dr Doutor pelo CENA-USP Ilustrações cedidas pelos autores Método Alternativo de Tratamento de Esgotos Reator anaeróbio com recheio de bambu associado com filtros biológicos de areia Resumo ste artigo apresenta os resultados encontrados para o estudo de um sistema alternativo de tratamento de esgotos constituído por reator anaeróbio com recheio de bambu associado a um filtro biológico de areia. Tal combinaçaão possui baixo custo e busca minimizar o sério problema de saneamento pelo qual o Brasil passa. O reator anaeróbio foi alimentado com uma vazão de 2 l/min e seu efluente era aplicado em cinco cargas hidráulicas (20, 40, 60, 80 e 100 l/m 2 ) sobre a superfície de quatro filtros de areia com diferentes profundidades de leitos (25, 50, 75 e 100 cm). Devido à ação dos microrganismos anaeróbios e aeróbios, que aderem à superfície do bambu e da areia, obteve-se uma excelente remoção de matéria orgânica do esgoto que, caso fosse lançada em um corpo de água antes do processo de tratamento, levaria ao consumo de oxigênio e a uma mortandade da fauna e flora aquáticas. Quanto ao nitrogênio, ocorreu uma grande transformação da sua parte orgânica em nitrato, demonstrando a grande adaptação das bactérias responsáveis por esta reação bioquímica ao meio formado pela areia. Os organismos patogênicos foram em grande medida removidos, adequando o efluente a alguma prática de reuso. Palavras-chave: filtro de areia, pós-tratamento, efluente anaeróbio, baixo custo. Introdução O Brasil é um dos países que possuem o maior fluxo interno de água. Porém, há uma enorme disparidade na distribuição deste recurso entre suas diferentes regiões. Enquanto que no norte existe uma abundância hídrica, no sul e sudeste, industrializados e populosos, ocorre a escassez causada pelo elevado consumo e grande poluição dos rios, resultante da precária situação do saneamento básico. Este quadro alarmante acarreta sérios problemas à saúde pública e ao meio ambiente levando a mortandade de um grande número de espécies. Portanto, um dos desafios atuais para a melhoria desta situação é o desenvolvimento de sistemas de tratamento simples, eficientes e adaptáveis às condições econômicas e estruturais do nosso país. O Tratamento Anaeróbio O tratamento anaeróbio depende dos microrganismos que agem na ausência de oxigênio, transformando os dejetos gerados pela ação humana em produtos mais simples como metano, gás carbônico e água (METCALF e EDDY, 1991). Estes compostos mais simples podem retornar ao meio ambiente sem comprometer o planeta e seu ecossistema. Apesar da boa eficiência deste sistema, entre 10 e 30% da matéria orgânica não é degradada, o que impede que seu efluente atenda à Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 109


Figura 1: Filtro anaeróbio de fluxo ascendente. legislação brasileira quanto a este parâmetro, havendo necessidade de um pós-tratamento. O reator anaeróbio é caracterizado pela presença de um material de recheio estacionário e inerte no interior de um tanque fechado. O esgoto penetra pela parte inferior e flui até a sua saída na área superior. No decorrer do escoamento, o esgoto entra em contato com este material. Sobre a superfície deste recheio ocorre a formação natural de um biofilme que degrada o substrato contido no fluxo de esgoto (Figura 1). O material de recheio no qual os microrganismos aderem deve ter as seguintes características: estrutura resistente, ser biológica e quimicamente inerte, leveza, porosidade elevada e preço reduzido. Tal sistema possui a vantagem de consumir pouca energia e produzir uma quantidade mínima de lodo, além de não depender da utilização de complexos equipamentos mecânicos. Pesquisadores da UNICAMP diagnosticaram que o uso de anéis de bambu poderia satisfazer a tais prérequisitos (CAMARGO, 2000). Este material apresenta a vantagem de possuir um baixo custo e ser facilmente encontrado no Brasil. Desta forma, construíram e operaram quatro reatores que possuíam o bambu como recheio e obtiveram uma remoção média de matéria orgânica (DBO) superior a 75%. Quanto ao nitrogênio orgânico, somente uma parcela de sua concentração foi transformada em amônia. Pode-se concluir ao final deste trabalho inicial que, apesar dos bons resultados, havia a necessidade de se realizar um pós-tratamento do efluente anaeróbio gerado pelo reator de bambu, pois ele não se adequava à legislação brasileira. Assim, buscando manter as características de um tratamento alternativo e barato decidiu-se aplicar o efluente gerado sobre a superfície de filtros biológicos de areia. A associação do reator anaeróbio com filtros biológicos de areia seria uma alternativa que preservaria o baixo custo total. Outro item importante seria a possibilidade de dispor o efluente gerado diretamente sobre os cursos d’água, ou reutilizá-lo na irrigação, ou no consumo não-humano, seguindo a orientação da Organização Mundial de Saúde (OMS, 1989). No Brasil, esta combinação seria aplicável nas pequenas cidades, em bairros isolados e condomínios fechados das metrópoles, onde a instalação de uma rede coletora de esgotos apresentaria custo elevado. Filtros Biológicos de Areia O filtro biológico de areia é um método de tratamento bastante antigo, inicialmente adotado na remoção de turbidez da água potável. A partir do século XIX, na Europa e nos Estados Unidos, passou a ser aproveitado na depuração de esgotos (MICHELS, 1996). 110 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 O funcionamento deste sistema baseia-se na aplicação de afluente intermitentemente sobre a superfície de um leito de areia. Durante a infiltração do líquido ocorre a purificação por mecanismos físicos, químicos e biológicos. O tratamento físico é resultante do peneiramento e o químico ocorre pela adsorsão de determinados compostos. A purificação depende principalmente da oxidação bioquímica que ocorre no contato do afluente com a cultura biológica. Devido a esta característica, Jordão e Pessoa (1995) afirmam que este tipo de sistema é incorretamente chamado de filtro, pois seu funcionamento não possui como explicação primordial o peneiramento ou a filtragem. Neste mesmo sentido, KRISTIANSEN (1981) sustenta que o leito de areia, em conjunto com os microrganismos, forma um filtro vivo. Material e Métodos Este projeto de pesquisa está instalado em uma área experimental situada na Estação de Tratamento de Efluentes Graminha, na cidade de Limeira, Estado de São Paulo. O esgoto bruto é originário de um bairro residencial denominado Graminha. Inicialmente esta água residuária passa por um tratamento preliminar composto por grades de retenção e caixa de areia e em seguida, uma pequena Figura 2: Vistas externa (esquerda) e interna (direita) dos reatores anaeróbios.


Tabela 1: Denominação dos filtros biológico s e profund idades do leito de areia. Profund idade do Leito Filtro ( centímetros) F 5 F 0 F 5 F 0 025 050 075 100 porção do seu fluxo é direcionada até quatro reatores anaeróbios com recheio de bambu. Cada reator possui volume de 500 l e foi construído em aço inox tendo formato cilíndrico e fundo cônico, que funcionou como um compartimento para a distribuição do esgoto (Figura 2). O meio suporte foi constituído de anéis de bambu da espécie Bambusa tuldoides. O caule do bambu foi cortado em pedaços de aproximadamente 5 cm (CAMARGO, 2000). Estes reatores anaeróbios foram operados com fluxo ascendente, tendo uma vazão de 2 l/min e tempo de detenção hidráulica de 3 horas, controlados diariamente. Filtros de Areia Na construção do leito dos filtros foram empregadas três camadas posicionadas a partir da base. A primeira foi constituída por brita e pos- Figura 3: Esquema dos filtros de areia. 2 5 7 10 suía 20 cm de profundidade. Logo acima estava a camada formada por pedregulho, com 10 cm de profundidade, que objetivava sustentar a areia, impedindo que suas partículas fossem arrastadas para fora da estrutura do sistema. Quanto à camada de areia, buscando-se determinar qual era a espessura ideal para a realização do tratamento, empregou-se quatro filtros com diferentes profundidades de leito, conforme apresentado na Tabela 1. A areia empregada foi a popularmente denominada de grossa comercial, possuindo um diâmetro efetivo (D ) de 0,093 mm. Salienta-se 10 que estes materiais foram os mais comumente encontrados na região de desenvolvimento do projeto. Na construção dos filtros, foi utilizada uma caixa cilíndrica com estrutura de fibra de vidro e diâmetro de 100 cm. Na Figura 3 há um esquema da disposição das diferentes camadas que compõem os filtros. Para a distribuição uniforme do afluente sobre o leito dos filtros, empregou-se uma placa quadrada de 20 cm de comprimento, feita de madeira e posicionada no centro da camada superficial (Figura 4). Após o lançamento do afluente pela tubulação de distribuição, existe o choque do líquido com esta placa, distribuindo as gotículas sobre a superfície. Buscando-se determinar a capacidade de tratamento dos filtros biológicos de areia, foram aplicadas as cargas hidráulicas de 20, 40, 60, 80 e 100 l/m 2 de efluente proveniente dos reatores anaeróbios sobre as superfícies. Cada carga hidráulica foi empregada pelo período de um mês entre as segundas e sextas-feiras. Na Figura 5 está apresentado de forma esquemática o fluxograma de funcionamento deste sistema de tratamento em estudo. As seguintes amostras foram obtidas semanalmente: esgoto bruto, efluente dos reatores anaeróbios com recheio de bambu e efluentes dos filtros de areia. Todas as análises foram baseadas no Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (AWWA/ANHA/WEF, 1999). Os parâmetros físicos, químicos e biológicos analisados foram os seguintes: pH, demanda bioquímica de oxigênio (DBO), série do nitrogênio (nitrogênio orgânico e amoniacal, nitrito e nitrato) e coliformes totais. Resultados Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 111 pH O estudo deste parâmetro é de extrema importância em um sistema biológico. Isto porque os microrganismos responsáveis pelo tratamento dos esgotos necessitam de um pH que varie entre 4 e 8. Caso contrário existe o impedimento da formação do biofilme responsável pela depuração do efluente. De acordo com a Figura 6 podese fazer uma divisão dos valores de


pH encontrados para os filtros biológicos de areia em dois grupos básicos. O primeiro engloba os pHs encontrados nas cargas hidráulicas de 20, 40 e 60 l/m 2 onde houve tendência para valores superiores a 7. No segundo grupo, constituído pelas cargas de 80 e 100 l/m 2 nota-se valores inferiores ao pH neutro. A característica encontrada para o primeiro grupo não se adequa aos Figura 4: Vista externa (esquerda) e superior (direita) de um filtro de areia, tendo ao centro a placa de distribuição de afluente. resultados esperados. De acordo com a análise dos compostos nitrogenados, esperava-se que a transformação dos nitrogênios orgânico e amoniacal em nitrato causasse a redução do pH. Tal fato ocorreria devido à redução de alcalinidade provocada pelas bactérias aeróbias no processo metabólico da degradação da matéria orgânica. Uma possível explicação para esta característi- Figura 5: Fluxograma do sistema de tratamento em estudo. Figura 6: Variação do pH durante as semanas de coleta. 112 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 ca pode ser a formação de um sistema tampão químico pela areia. Assim, apesar do consumo de compostos alcalinos, haveria o impedimento da queda do pH do efluente dos filtros de areia. A formação do sistema tampão pelo leito de areia pode ser comprovada pelo fato do filtro F025, que possui o menor volume de areia, possuir tendência aos menores pHs e também por ter sido o primeiro a apresentar os valores mais baixos. O filtro de 100 cm manteve valores altos de pH ate o final da aplicação da carga de 100 l/m 2 . Vê-se também que o sistema, mesmo sob condições temporárias de aplicações de pHs bastante anormais, conforme encontrado na sexta semana, mostrou-se capaz de amortecê-los. Isso também pode ser notado nas duas últimas semanas de aplicação da carga de 100 l/ m 2 , quando houve a geração de um efluente ácido pelos reatores anaeróbios de bambu. Observa-se que nesta situação os efluentes dos quatro filtros não tiveram uma tendência a acompanhá-lo nesta queda brusca. Quando se comparam os valores encontrados para o pH com aqueles exigidos pela legislação brasileira (CONAMA 20/86), que permite a emissão de um efluente cujo pH varie entre 4 e 9, nota-se que o sistema propiciou valores bastante satisfatórios. Demanda Bioquímica de Oxigênio - DBO Caso seja lançado em um corpo de água uma grande quantidade de matéria orgânica, haverá o consumo parcial dela pelos microrganismos presentes no meio. Como conseqüência desta degradação, esta colônia formada consome grande quantidade de oxigênio, levando à morte diversas espécies da fauna e da flora. No que se refere a DBO, parâmetro que determina a quantidade de matéria orgânica, os reatores


Tabela 2: Remoção média de DBO no sistema de tratamento nas cargas hidráulicas aplicadas. Ponto de Remoção média de DBO ( % ) Coleta 20 l/ m2 40 l/ m2 60 l/ m2 80 l/ m2 100 l/ m2 F025 95, 3 97, 3 93, 7 95, 8 91, 3 F050 98, 0 98, 9 98, 7 96, 5 94, 9 F075 97, 5 98, 9 98, 8 98, 3 97, 0 F100 97, 6 98, 8 99, 4 99, 3 98, 7 Figura 7: DBO média para cada uma das cargas hidráulicas aplicadas. Figura 8: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no esgoto bruto e efluente dos reatores de bambu em cada carga hidráulica. anaeróbios propiciaram uma remoção média de aproximadamente 48%. Este resultado está de acordo com as possibilidades dos microrganismos anaeróbios e com os dados encontrados para materiais de recheio normalmente empregados em estações de tratamento de grande porte. Quanto aos filtros de areia, vêse pela Figura 7 a excelente remoção de DBO. O maior valor encontrado foi de somente 29 mg/l, obtido no efluente do filtro com 25 cm de profundidade, durante a aplicação da maior carga hidráulica. Este resultado está muito abaixo do máximo permitido pela legislação brasileira, que é de 90 mg/l. Outra característica observada é que quanto mais profundo o leito de areia, melhores foram os resultados. Isto pode ser explicado pelo fato de que quanto maior a profundidade, maior a quantidade de areia revestida com biofilme. Assim existe uma ampla possibilidade de contato do material orgânico com os microrganismos. Quando se observa a Tabela 2, que apresenta os percentuais de remoção da DBO em todo o sistema, observa-se o valor mínimo de 91,3%. O filtro com 100 cm de profundidade nunca removeu menos que 97,6%, independente da carga de aplicação. Nitrogênio A remoção dos compostos nitrogenados presentes no esgoto é de extrema importância. Caso isto não ocorra tem-se o lançamento de um efluente tóxico que pode levar à morte de micro e macrorganismos. Tal fato ocorre devido ao nitrogênio amoniacal ou devido à eutrofização, que acaba por criar um meio propício à floração de algas. Pela Figura 8 percebe-se que tanto o esgoto bruto como o efluente dos reatores de bambu eram constituídos de compostos nitrogenados pouco degradados (nitrogênio orgânico e amoniacal). Assim, desde a produção dos Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 113


Figura 9: Média para a concentração dos compostos nitrogenados no filtro F025 e F050 em cada carga hidráulica. dejetos pelo ser humano até a chegada à estação de tratamento ocorreram poucas transformações em sua composição. Isto ocorre principalmente devido ao fato de os organismos responsáveis pela decomposição dos compostos nitrogenados agirem somente em presença de oxigênio. Ao comparar-se o esgoto bruto com o efluente dos reatores de bambu, nota-se que apesar da sua característica anaeróbia, a amônia na maioria das situações superava o valor de nitrogênio orgânico. Quanto às concentrações de nitrato e nitrito, observa-se que foram muito pequenas para estes dois pontos de coleta. Pelas Figuras 9 e 10, nota-se que o efluente dos reatores anaeróbios de recheio de bambu ao infiltrar-se através do leito de areia dos filtros biológicos sofreu grandes alterações no que se refere aos compostos nitrogenados. Ou seja, existiu uma grande transformação do nitrogênio orgânico e do amoniacal para nitrato, independente da carga que era empregada. Tal modificação é resultante das nitrobactérias, que em ambientes aerados levam tais compostos à sua forma mais oxidada. Para os filtros F025 e F050, a partir da carga de 60 l/m 2 passa a haver um aumento da concentração de nitrogênio amoniacal, que foi ampliada na de 80 l/m 2 . Este aumento pode ser explicado pelo acréscimo de carga, que acarretou na diminuição do tempo de contato entre o líquido que se infiltrava e a cultura biológica aderida à areia. Quanto maior era a profundidade do leito, maior era o processo de nitrificação, ou seja, de transformação do nitrogênio orgânico em nitrato. Assim, de acordo com a Figura 10, nota-se que o filtro com 100 cm de profundidade de leito propiciava uma 114 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 completa nitrificação. Assim, a somatória das concentrações de todos os compostos nitrogenados era muito semelhante à de nitrato. Coliformes Totais Os coliformes totais são uma classe de organismos adotada pela engenharia sanitária como um indicador da presença de organismos patogênicos. Assim, caso esteja em pequenas quantidades, pode-se supor que a água também não conterá seres vivos que possam causar algum dano a saúde. Ao analisar-se as concentrações de coliformes totais pela Figuras 11, vê-se que o afluente sempre possuía valores superiores a 10 6 NMP/100 ml, chegando em alguns casos a superar 10 9 NMP/100 ml. Desta forma, podese constatar que os reatores anaeróbios com recheio de bambu realmente não removem estes organismos, conforme afirma a literatura. Quanto aos filtros de areia, nas baixas cargas o F025 já apresentava valores mais altos que os outros três, e no decorrer do desenvolvimento do projeto, sempre possuía as maiores concentrações. Por outro lado, o filtro com 100 cm de profundidade chegava a gerar um efluente capaz de atender à legislação brasileira para a água potável quanto a coliformes totais. Ao observar-se a comparação entre o afluente e o efluente do filtro de areia apresentada na Tabela 3, percebe-se a grande remoção de coliformes totais que este sistema propiciou. O filtro com menor profundidade de leito, o F025, apresentou altos percentuais, sendo no mínimo igual a 84%. Os dois filtros mais profundos tiveram valores superiores a 99% em praticamente todas as situações em estudo. Conclusões A análise destes resultados demonstra a grande viabilidade deste sistema biológico para o tratamento de efluente de pequenas comunidades, utilizando materiais presentes nas próprias comunidades.


Figura 10: Concentração dos compostos nitrogenados nos filtros F075 e F100. Figura 11: Concentração de coliformes totais. Tabela 3: Remoção média da concentração de Coliformes Totais nos filtros biológico s de areia em cada carga hidráulica. Ponto de Remoção dos Coliformes Totais ( % ) Coleta 20 l/ m2 40 l/ m2 60 l/ m2 80 l/ m2 100 l/ m2 F025 97, 5 89, 8 84, 8 84, 9 87, 0 F050 99, 9 99, 2 98, 0 87, 4 96, 3 F075 100, 0 99, 9 99, 4 99, 5 97, 0 F100 100, 0 100, 0 99, 9 99, 9 99, 9 O efluente gerado estava em conformidade com o exigido pela legislação brasileira para a emissão em um corpo receptor, sendo compatível com aqueles produzidos nas grandes estações de tratamento existentes nas grandes cidades brasileiras. Outro ponto é a possibilidade do reuso deste líquido em alguma atividade humana, resguardando os mananciais naturais para usos mais nobres. Agradecimentos A FAPESP, CNPq, FINEP, Caixa Econômica Federal e PROSAB pelo apoio e financiamento na construção do projeto e em sua manutenção. Referências Bibliográficas AWWA/ANHA/WEF. Standard methods for the examination of water and wastewater. 19 a edição. Nova Iorque: American Public Health Association, 1999. CAMARGO, S. A. R. Filtro anaeróbio com enchimento de bambu para tratamento de esgotos sanitários: avaliação da partida e operação. Campinas: Faculdade de Engenharia Civil, UNICAMP, 2000. Dissertação de Mestrado. JORDÃO, E. P.; PESSOA, C. A. Tratamento de esgotos domésticos. 3 a edição. Rio de Janeiro: ABES, 1995. KRISTIANSEN, R. Sand-filter trenches for purification of septic tank effluent: III. The micro flora, Journal of Environmental Quality, n. 10, p. 361–364, 1981c. METCALF e EDDY. Wastewater engineering, treatment, disposal and reuse. 3 a edição. Nova Iorque: McGraw - Hill, International Editions, 1991. MICHELS, C. J. System suited for small communities. Water Environmental & Technology, n. 8, v. 7, p. 45-48, 1996. OMS - ORGANIZAÇÃO MUN- DIAL DE SAÚDE. Directrices sanitárias sobre el uso de águas residuales en agricultura e aquicultura. Séries de reportagens técnicas. N 778. OMS, Genebra, 1989. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 115


Pesquisa Soraya Cristina Leal-Bertioli - PhD Pesquisadora EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, soraya@cenargen.embrapa.br Patrícia Messenberg Guimarães - PhD Pesquisadora EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, messenbe@cenargen.embrapa.br Alessandra Pereira Fávero - MsC Pesquisadora EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, favero@cenargen.embrapa.br Márcio de Carvalho Moretzsohn - MsC Pesquisador EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, marciocm@cenargen.embrapa.br Karina Proite - MsC Estudante de doutorado da UnB, proite@cenargen.embrapa.br David John Bertioli - PhD Pesquisador Universidade Católica de Brasília david@pos.ucb.br Ilustrações cedidas pelos autores Amendoim Selvagem amendoim cultivado, Arachis hypogaea, é uma das leguminosas produtoras de grãos mais plantada em todo o mundo, devido ao seu alto conteúdo de proteína e óleos insaturados. É cultivado extensivamente na China, Índia e Estados Unidos, além de diversos países da América Latina e África (Conab, 2002). Os principais problemas da cultura estão relacionados ao ataque de fungos da parte aérea e nematóides, necessitando periodicamente da utilização de defensivos agrícolas (Hagan, 1998 ; Subrahmanyam et al., 1983; Bailey, 2002). Espécies silvestres de Arachis têm-se mostrado altamente promissoras como fonte de resistência a diversas pragas que atingem o amendoim e outras culturas, sendo que já foram identificadas algumas espécies com resistência a três fungos foliares (Cercospora arachidicola, Cercosporidium personatum e Puccinia arachidis) e ao nematóide das galhas (Meloidogyne spp.). Busca-se, agora, desenvolver ferramentas para a utilização destas espécies silvestres em programas de melhoramento genético, visando à obtenção de cultivares de amendoim com resistência mais duradoura (Fig.1). O projeto “Identificação de resistências a stress biótico em Arachis selvagem e desenvolvimento de ferramentas para o melhoramento genético através de mapeamento e genômica comparativa” combina esforços e habilidades de pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, IBONE (Instituto Botanico del Nordeste, Argentina), Universidade de Aarhus (Di- 116 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Uma fonte de resistência a pragas foto ilustrativa namarca) e Sainsbury’s Laboratories (Inglaterra) na busca de genes de resistência a fungos e nematóides patogênicos ao amendoim, e no desenvolvimento de um mapa genético para Arachis que possibilite a utilização destes genes. Produção de um mapa genético para facilitar a seleção assistida Espécies silvestres de Arachis possuem alta diversidade genética e constituem uma rica fonte de genes de resistência. Diversos trabalhos têm mostrado que as espécies silvestres são muito mais resistentes a doenças do que a espécie cultivada (Arachis hypogaea) (Holbrook et al., 2000). O amendoim cultivado é tetraplóide (tem quatro conjuntos de cromossomos, dois conjuntos do chamado genoma A e dois conjuntos do genoma B), enquan


to que a maioria das espécies silvestres é diplóide (apenas dois conjuntos de cromossomos). Esta diferença de ploidia dificulta a introgressão de genes dos parentes silvestres, uma vez que os híbridos obtidos de maneira tradicional são triplóides estéreis. Por isso, para obter híbridos férteis, necessita-se fazer cruzamentos entre espécies silvestres com genomas AA e BB. Os híbridos obtidos (AB) são então submetidos a tratamento com colchicina para duplicar o número de cromossomos, obtendo-se, assim, anfidiplóides sintéticos (AABB), que, em princípio, são compatíveis com o amendoim cultivado. Estes híbridos são então cruzados com A. hypogaea dando continuidade ao programa de pré-melhoramento de Arachis. Tradicionalmente, nos programas de melhoramento de plantas que envolvem hibridações seguidas de retrocruzamentos, grande parte do genoma da parental doadora é incorporada ao genoma da planta receptora e, por isso, são necessárias várias gerações para a eliminação gradual dos genes indesejáveis, enquanto o genótipo do Fig.1 - Sementes de diferentes espécies de Arachis parental recorrente é mantido para os demais locos. Em cada geração são selecionadas as plantas que apresentam a característica de interesse a ser introgredida, e as demais características do parental recorrente. Este processo de seleção, após a introgressão, pode ser otimizado através da construção de mapas genéticos e da identificação de marcadores moleculares fortemente associados aos genes de interesse. Desta forma, é possível, em cada fase de seleção, a escolha dos indivíduos que contenham o máximo de características do parental recorrente, diminuindo assim o tempo do processo de melhoramento. Isso é particularmente importante em programas que visam à introgressão de genes de resistência a pragas. Neste caso, a seleção indireta através de marcadores moleculares possibilita, além da redução de tempo, a identificação e seleção de genótipos resistentes na ausência do patógeno e a transferência e manutenção de mais de um gene de resistência principal durante a seleção (piramidização de genes de resistência). Para a implementação de um esquema efetivo de seleção assistida por marcadores em programas de melhoramento genético, três requerimentos são essenciais: (1) alguns marcadores devem estar fortemente ligados aos genes que controlam as características de interesse; (2) os marcadores devem estar facilmente disponíveis para a análise de grandes populações e (3) as técnicas utilizadas devem ser reproduzíveis entre laboratórios e com baixo custo. Mapeamento comparativo: Um atalho para um mapa genético Espécies de Arachis têm genomas muito grandes. O genoma haplóide de Arachis hypogaea tem aproximadamente 1,74 x 10 9 pares de bases. Isto dificulta a identificação e o mapeamento direto de genes de interesse. Uma outra espécie da família das leguminosas, Lotus japonicus, tem um genoma bem menor, tem um mapa genético de alta resolução já disponível e os projetos de seqüenci- Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 117


Fig.2 - Exemplo de estudo de sintenia: Marcadores moleculares (M1 a M4) em posições colineares nos genomas de Lotus e Arachis. amento de ESTs (expressed sequenced tags) e do genoma estrutural estão quase completos (Asamizu et al., 2000; Sato et al., 2001). Por isso, L. japonicus tem sido considerada uma plantamodelo para todas as leguminosas, auxiliando no entendimento de outras espécies de genomas mais complexos. A comparação entre estes dois gêneros e a análise da ordem dos genes nos cromossomos possibilita a identificação de regiões correlatas entre os dois genomas (chamada sintenia), ou seja, o mapeamento comparativo. Neste processo, são identificados marcadores moleculares comuns aos diversos genomas, chamados marcadores-âncoras. Como exemplo de transferência de informação da planta modelo para leguminosas cultivadas pode-se citar o caso dos fenótipos mutantes: uma vez que o gene responsável por um fenótipo mutante seja clonado em Lotus, a análise fenotípica comparativa e a informação do mapa podem ser utilizadas como base para identificar genes candidatos para o gene correspondente em outras leguminosas. No caso específico de Arachis, a análise genômica comparativa poderá auxiliar no desenvolvimento de marcadores para o melhoramento genético da cultura, o que certamente facilitará a clonagem de genes de interesse. A exploração da colinearidade entre genes de Arachis e Lotus buscando a identificação entre as duas espécies e a identificação de regiões cromossômicas ortólogas (genes homólogos localizados em genomas de diferentes organismos) tem sido realizada através do desenvolvimento de um banco de ESTs de Arachis (Guimarães et al., 2003 ). Este banco de dados deverá acelerar o mapeamento do genoma de Arachis, a identificação de resistências e o desenvolvimento de marcadores a serem utilizados nos programas de melhoramento. Um benefício adicional do projeto é o desenvolvimento de um sistema genético unificado para a família das leguminosas, pois trabalhando com Lotus que é considerado um dos gêneros mais adaptados desta família e Arachis que é considerado um dos mais primitivos, qualquer região de similaridade encontrada provavelmente existirá em todas as leguminosas. Até o momento, já foram encontradas homologias entre Lotus e Arachis em vários genes que codificam para enzimas envolvidas em importantes cadeias metabólicas, além da homologia entre genes envolvidos na simbiose destas plantas com bactérias fixadoras de nitrogênio estarem sendo estudadas (Sandal, et al., 2003) (Fig. 2). A identificação de tais regiões pode facilitar o isolamento de genes envolvidos neste processo, possibilitando o desenvolvimento de variedades de Arachis com maior capacidade de fixação de nitrogênio, o que resultaria na redução da utilização de fertilizantes nitrogenados, contribuindo para uma produção de alimentos mais sustentável. 118 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Estudos de expressão gênica O estudo da expressão gênica tem demonstrado ser uma importante ferramenta no entendimento dos processos biológicos em nível molecular. Por exemplo, estes estudos podem ser utilizados na identificação de uma rede de genes expressos de fundamental importância no desenvolvimento de uma determinada estrutura, ou na resposta de um organismo a um estímulo externo. O estudo da expressão gênica diferencial pode contribuir para a caracterização de resistências, pois possibilita a identificação de genes–chave desta rede através da comparação da expressão gênica durante o desenvolvimento de uma estrutura sob condições normais e em organismos carregando uma mutação ou submetidos a algum tipo de stress. Através do acúmulo de dados da expressão diferencial de vários genes sob diferentes condições, pode-se reconstruir as vias reguladas por estes genes, predizer onde eles atuam e identificar novos genes associados ao processo. Para o entendimento da função de um gene, é fundamental o estudo de onde e quando ele é expresso. Recentemente, várias estratégias foram desenvolvidas para permitir o estudo da função de vários genes simultaneamente, entre elas: a genética reversa (geração de mutações específicas em genes de interesse), screens mutagênicos (geração de mutações randômicas e screening de um pool de mutantes para se identificar fenótipos de interesse) e bioinformática (a análise dos dados gerados por todas as estratégias acima). As estratégias acima, associadas aos projetos genoma, que têm como objetivo o sequenciamento do genoma inteiro de vários organismos, têm possibilitado o estudo sistemático da expressão diferencial de genes em nível de genoma como um todo. A análise da expressão diferencial de genes em resposta ao ataque de um patógeno constitui, portanto, uma ferramenta importante no isolamento de genes de resistência ou de fatores envolvidos com a interação patógeno-hospedeiro. Neste projeto, a identificação de genes expressos diferencialmente em germoplasma resistente de Arachis está sendo realizada através da análise de ESTs e de microarranjos. Para tal, várias bibliotecas de cDNA foram construídas a partir de Arachis stenosperma submetido a diferentes situações de stress (inoculado com nematóides e fungos) as quais estão


sendo seqüenciadas de forma massal visando à construção de um banco de dados de ESTs e dos chips de DNA. Uma vez isolados e confirmada sua função, estes genes podem ser introgredidos para o amendoim cultivado ou transferidos a outras plantas de interesse econômico, que sejam atingidas pelas mesmas pragas, como a soja e feijão, para as quais já existem disponíveis métodos de transformação. O impacto da utilização destas novas técnicas no cultivo do amendoim O Brasil produz atualmente aproximadamente 170 mil toneladas de amendoim, sendo o maior produtor o estado de São Paulo, com aproximadamente 60 mil ha plantados e 80-90% da produção do país (Conab, 2002). Um dos principais problemas dos produtores de amendoim deste estado é o ataque de doenças fúngicas de parte aérea, como a mancha barrenta (Didymella arachidicola), mancha castanha (Cercospora arachidicola), mancha preta (Cercosporidium personatum), ferrugem (Puccinia arachidis) e verrugose (Sphaceloma arachidis). A principal cultivar plantada no país é a cv. Tatu, com aproximadamente 80% da área plantada e é altamente susceptível às doenças acima citadas. A última cultivar de A. hypogaea lançada pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), a IAC-Caiapó, é de ciclo longo (com 130 dias) e possui resistência moderada às cercosporioses, à mancha barrenta e a ferrugem (Conab, 2002). As espécies silvestres da secção Arachis têm sido utilizadas no melhoramento do amendoim na Índia, Argentina, Estados Unidos e Brasil. Várias das espécies, que, na maioria, são brasileiras, possuem níveis de resistência a pragas e doenças superiores aos encontrados em acessos de A. hypogaea (Stalker & Moss, 1987; Fávero et al., 2000 e 2001). A falta de informações sobre o potencial destas espécies para o melhoramento de cultivares é a principal barreira para seu uso. As 69 espécies silvestres de Arachis descritas e existentes são restritas ao Brasil, Bolívia, Paraguai, Argentina e Uruguai, sendo 57 endêmicas ao Brasil. As expedições de coleta realizadas desde 1959 têm permitido a preservação de mais de 1600 acessos no banco de germoplasma, localizado na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, através de seu curador e principal coletor, Dr. José Francisco M. Valls. Neste banco de germoplasma, há acessos que representam todas as espécies de Arachis, exceto uma, Arachis martii, considerada extinta. A identificação de espécies resistentes a doenças e pragas e a localização de marcadores associados aos genes de interesse auxiliarão sobremaneira a seleção de plantas com resistência, desde as primeiras fases do programa de melhoramento, até a obtenção de novas cultivares. Acredita-se que a possibilidade da piramidização de genes tornará as novas cultivares com resistências mais duradouras do que se fosse utilizada apenas a seleção baseada em avaliação agronômica e fitopatológica das plantas, pois será possível a identificação de marcadores moleculares ligados a genes de resistência localizados nos genomas A e B oriundos de espécies silvestres e incorporados ao amendoim cultivado. O projeto irá propiciar o diálogo mais intenso entre os parceiros na cooperação científica e tecnológica entre a União Européia e América Latina. Isto também beneficiará o treinamento de jovens pesquisadores em tecnologias de ponta em genômica e citogenética. Os mapas genéticos gerados e o mapeamento comparativo entre os genomas de Arachis e Lotus poderão facilitar o melhoramento de amendoim e, possivelmente, os programas de melhoramento de outras leguminosas. O desenvolvimento de variedades melhoradas de amendoim adaptadas à América Latina auxiliará na redução do uso de defensivos agrícolas e poluição associada, sem perdas na produtividade, contribuindo para o desenvolvimento sustentável da agricultura. Bibliografia Citada Asamizu, E., Nakamara, Y., Sato, S., e Tabata, S. (2000). Generation of 7137 non-redundant expressed sequence tags from a legume, Lotus japonicus. DNA research 7 127-130. Bailey, J. (2002). Peanut Disease Management. North Carolina Peanut Production Guide. Chapter 6. 19 pp. Conab (2002). Conjuntura Semanal. Especiais 16-2009. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento . Companhia Nacional de Abastecimento-Conab. Fávero, A. P.; Moraes, S. A.; Vello, N. A.; Valls, J. F. M. Caracterização de acessos de germoplasma de espécies silvestres de Arachis (Secção Arachis) resistentes à ferrugem (Puccinia arachidis). Anais do 46 o Congresso Nacional de Genética, 19 a 23 de setembro de 2000 - Águas de Lindóia- SP, p.533-534 Fávero, A. P.; Moraes, S. A.; Vello, N. A.; Valls, J. F. M. Caracterização de espécies silvestres de amendoim quanto à resistência à mancha castanha visando à introgressão de genes ao amendoim cultivado. Anais do I Congresso de Melhoramento de Plantas, 03 a 06 de abril de 2001 - Goiânia, GO. Guimaraes, P.M., Leal-Bertioli, S., Seijo, G., Parniske, M., Stougaard, J., Bertioli, D. (2003). The identification of resistances to biotic stress in wild Arachis germplasm, and the development of tools for breeding by genetic mapping and comparative genomics. Annals of the 7 th Congress of Plant Molecular Biology, Barcelona, 2003. Hagan, A (1998). Foliar diseases of peanuts. Alabama Cooperative Extension System. ANR-369. (http// www. Aces.edu /department/ extcomm/publications/anr/anr- 369.html) Holbrook, C.C., Stephenson, M.G. e Johnson, A.W. (2000). 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Phytopathology 73 (2) 253-256. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 119


Pesquisa Ana Paula Pacheco Clemente Bióloga, Especialista em Bioética, Direito e aplicações, coordenadora e professora dos cursos de pós-graduação lato sensu e extensão em Bioética da PUCMinas e UFLA, e do curso de extensão em Tanatologia e Bioética do IEC-PUC Minas, membro da diretoria do Capítulo de Bioética da SBCM, consultora da Comissão de Bioética e Biodireito da OAB-MG, membro fundador e da Diretoria Executiva da Sociedade Brasileira de Bioética Regional Minas Gerais. paulaclemente@bioconsulte.bio.br; paulaclemente@bol.com.br Bioética A área das ciências biológicas é a que mais privilegia o conceito de Bioética da forma como foi concebido inicialmente. Ela possui um campo muito vasto de atuação para o profissional que transita entre a área da saúde e a do meio ambiente. Segundo Potter, criador do termo, que era biólogo e oncologista, a atuação da Bioética seria buscar a boa qualidade de vida, pela interação do ser humano com o meio ambiente. Esse conceito foi adaptado pelo Instituto Rose e Kennedy de Reprodução Humana e Bioética, que tornou assim a Bioética voltada para a biomedicina e a biotecnologia. A Bioética tradicional, dos EUA, é baseada em quatro princípios fundamentais, que são: Autonomia: direito do paciente de participar ativamente de seu tratamento, refutando, concordando, discutindo e decidindo junto com o médico a melhor conduta a ser tomada. Esse conceito vem da filosofia, uma vez que o termo supramencionado significa autogoverno. Entretanto, para que tal aconteça, o sujeito (paciente) deve receber informações claras e precisas sobre seu quadro clínico, diagnóstico, tratamento e prognóstico. Beneficência e não-maleficência, as quais possuem origem hipocrática. A primeira pugna por sempre buscar o bem do paciente; já a segunda determina que, existindo dúvida quanto ao bem a ser ofertado ao paciente e sobre os seus efeitos 120 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 Pluralidade e transdisciplinaridade colaterais, ou seja, se estes forem maiores que aqueles, o médico não deve atuar, uma vez que a atuação médica deve sempre buscar o bem do paciente. O princípio da justiça prega o livre acesso de todos a um tratamento médico de qualidade, e a livre distribuição dos progressos da medicina para todos os seres humanos. Deve-se ressaltar a existência, antes de Potter, dos movimentos pré-bioéticos, tais como o Código de Nuremberg, o qual estabeleceu regras mínimas para pesquisas clínicas em seres humanos, e a Declaração Universal dos Direitos Humanos, que estipula direitos e garantias mínimos de respeito à vida humana. Ambos buscaram impedir reincidências das atrocidades cometidas pela humanidade nas duas grandes guerras mundiais. Hodiernamente, bioética é a parte da ética que cuida das questões referentes à vida humana, à saúde, aos avanços da biotecnologia e aos efeitos destes sobre o homem. Busca sempre o bom e o melhor para o ser humano, possuindo, desta forma, um caráter antropocentrista bastante acentuado, que busca privilegiar a interação homem/meio ambiente. A atuação do biólogo no meio ambiente busca a proteção da biodiversidade, a manutenção de espécies em vias de extinção, a preservação do meio ambiente e da qualidade de vida. O licenciamento ambiental e o relatório de impacto ambiental de


responsabilidade técnica do biólogo é de extrema importância para evitar acidentes ecológicos. O Brasil possui uma legislação ambiental que regulamenta as atividades dos profissionais que atuam na área. A Bioética influencia nas decisões à medida que analisa a interação do ser humano com o ambiente e os reflexos causados pelas ações propostas pelo homem. Mais recentemente temos tido discussões sobre transgênicos e OGMs, não só na área de meio ambiente, mas também na área médica, com a produção de animais transgênicos para transplante de órgãos, vacinas e medicamentos manipulados geneticamente. Temos também biotecnologia na formação de biomateriais, reprodução humana assistida, que gera grandes polêmicas por causa da doação de sêmen, óvulo, útero de substituição, que muda os pilares de filiação, trazendo gêmeos em idades diferentes, crianças com até cinco pais, crianças com material genético de três pais em resultado de exame de DNA com técnica de rejuvenescimento de óvulo; gestação após a morte dos pais biológicos, mudança de paradigma quanto à filiação, privilegiando a paternidade e maternidade sócio-afetivas. O Projeto Genoma Humana com a descoberta de todos os genes humanos , trará benefícios e proporcionará, daqui a alguns anos, a cura para várias doenças. Nesse âmbito haverá um avanço na medicina preditiva que, através da avaliação genética, pode fazer o diagnóstico de várias doenças que poderiam se manifestar ou não no futuro. Hoje já é possível fazer o diagnóstico de algumas doenças, porém não é possível curá-las, os benefícios são apresentados na melhoria da qualidade de vida e da adaptação do paciente. Já há algumas décadas, a medicina fetal proporciona, através do diagnóstico pré-natal, a possibilidade de diagnóstico de doenças cromossômicas, como a síndrome de Down. Hoje, contamos com a biotecnologia por meio do diagnóstico ge- nético pré-implantação; podemos fazer a análise genética retirando um blastômero do embrião, ou seja, uma célula totipotente, que poderá virar outro ser humano idêntico ao da célula de onde foi retirado. Dessa forma, o diagnóstico é realizado no embrião, não havendo necessidade de retirar nenhum material biológico após a implantação, para não correr o risco de um aborto. Com a descoberta de doenças genéticas pela micromanipulação de embriões, é possível descartar esses embriões “anormais” pondo em prática a chamada Eugenia doce, que seria o descarte de embriões e fetos com defeitos congênitos. Aí surge a discussão sobre o que é normal e o que é anormal. Caso do casal surdomudo que recorreu ao banco de sêmen para buscar um doador de sêmen surdo para ter seu bebê. A terapia gênica vai proporcionar através da utilização de vetores, como vírus e bactérias, a cura das doenças das quais forem localizados os genes que as causam, removendo ou acrescentando o gene saudável à pessoa. Outra questão discutida pela Bioética é o direito à identidade genética nos casos em que a criança foi adotada ou tenha nascido por intermédio de material genético doado, o que não desfaz o vínculo de paternidade; direito não para fins de herança nem tampouco para negatória de paternidade, mas, simplesmente, pelo direito de conhecer suas origens. O advento do exame de DNA trouxe a certeza biológica, mas muitos têm utilizado tal exame de forma errônea. Deve-se ter sempre o exame de DNA como mais uma prova judicial a ser juntada aos autos do processo, a fim de preservar a dignidade e a privacidade humanas. Ninguém é obrigado a fornecer prova contra si mesmo. A banalização do exame de DNA tem trazido conseqüências indesejáveis não só para o Direito de Família e de Sucessões, mas também para a Criminalística, porque ainda existem peritos despreparados para coletar o material biológico na cena do crime. É preciso seriedade e responsabilida- de para utilizar tal prova; deve-se evitar contaminação do material, armazená-lo de forma adequada, ter uma cadeia de custódia, solicitar autorização por escrito nos casos de investigação de paternidade ou de maternidade. Assim, as questões da bioética podem ser classificadas como emergentes, aquelas advindas do avanço da biotecnologia e da biociência, e persistentes as que possuem suas origens na má distribuição de recursos e em um sistema econômico excludente. Por esse motivo, a bioética deve recortar seu sujeito de trabalho por etnia, raça, sexo e condição econômica, uma vez que a busca do que é bom e melhor varia de acordo com essas características. Devido à complexidade dos valores envolvidos em sua atuação, esse campo de discussão revela-se como a ciência da composição, ou seja, todos os assuntos dentro do âmbito de atuação da bioética atingem toda a sociedade, logo, as decisões sobre eles devem ser tomadas com a participação de todas as partes envolvidas. A Bioética busca uma reflexão da biotecnologia apresentada pelas ciências biomédicas para que elas possam ser utilizadas em benefício da sociedade. Busca o melhor para a coletividade, fazendo interagir o homem com o meio ambiente, com vistas a propiciar a ele uma melhor qualidade de vida. O trabalho transdisciplinar faz-se necessário a fim de proporcionar um atendimento mais humanizado e justo na área das ciências da vida. Dessa forma, buscam-se soluções novas para conflitos novos. Destarte, a bioética representa a ciência do diálogo transdisciplinar, ou melhor, propõe a composição possível com os vários estranhos morais, pois um médico para atuar bioeticamente deve respeitar a individualidade de seu paciente e o advogado que abraçar causa tão apaixonante deve conhecer biomedicina e os avanços biotecnológicos. Assim como cada profissional, na sua área de atuação, deve buscar essa composição. Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 31 - julho/dezembro 2003 121

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