P10607119-8 A2 - Questel

(21)P10607119-8 A2
(22) Data de Depósito: 01/02/2006
(43) Data da Publicação: 11/08/2009
(RPI 2014)
sitio poilA
região rI3-glob Pa
Remanescente ligador misc
HI3Ver,
BspI201 (3694)
pUC19
1, II II II 111,11,11911 A111
(51) Int.CI.:
A61 K 39/245 (2009.01)
A61 K 39/145 (2009.01)
A61 K 39/39 (2009.01)
A61 K 9/16 (2009.01)
C12N 15/85 (2009.01)
C12N 15/44 (2009.01)
C12N 15/38 (2009.01)
C12N 15/31 (2009.01)
C12N 15/36 (2009.01)
(54) Título: CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, (57) Resumo: CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, POPULAÇÃO
POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO
DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NIJCLEICO, SEQUENCIA
NUCLEICO, SEQÜÊNCIA PROMOTORA QUIMÉRICA
ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS,
RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM
PROMOTORA QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS
REVESTIDAS, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR
COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, E,
PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA
POR PARTÍCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,
COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, MÉTODO IN VITRO DE
MÉTODO IN VITRO DE OBTER A EXPRESSAO EM CÉLULAS DE
MAMÍFERO DE UM POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE.
Uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência
promotora quimérica e um sítio de clonagem para a inserção de uma
OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico,
DE UM POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE
INTERESSE
em que a seqUência promotora quimérica compreende: (a) uma
seqUência promotora inicial imediata de hCMV; (b) exon 1 e pelo menos
uma parte do exon 2 do gene inicial imediato maior de hCMV; e (c) um
íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron A do gene inicial
(30) Prioridade Union ista: 20/04/2005 GB 0507997.5, 01/02/2005
US 60/648,382, 19/04/2005 US 60/672,497
imediato maior de hCMV.
(73) Titular(es): Powderject Vaccines, Inc.
(72) Inventor(es): James Fuller
(74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA.
(86) Pedido Internacional: PCT GB2006000344 de 01/02/2006
(87) Publicação Internacional: WO 2006/082398de 10/08/2006
H3 HA CDS
1,903. remanescentes de caLICCK
KenR (Tn9031
,903, remanescentes de pUr.41(
Remanescente Pucl9 MCS
CMV Pra
GMV Exonla
Fusão Etam/Bgl
íntron A de Insulina de rato
5'-UTR de FIFIV pré S2
ATG-Nhe
fiel (1989)

1
Pr. o 6 o }1 19-'g
"CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, PARTÍCULAS
CARREADORAS, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
5 POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO,
SEQÜÊNCIA PROMOTORA QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA,
PARTÍCULAS REVESTIDAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,
COMPOSIÇÃO DE VACINA, USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO
NUCLEICO, DE UMA POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO
10 NUCLEICO OU DE PARTÍCULAS REVESTIDAS, E, MÉTODO IN VITRO
DE OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM
POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE"
Campo da Invenção
A invenção diz respeito aos campos da biologia molecular e
15 imunologia e no geral aos reagentes úteis nas técnicas de imunização de ácido
nucleico. Mais especificamente, a invenção diz respeito a. construções de
ácido nucleico para a expressão de polipeptídeos e em particular polipeptídeos
antigênicos, particularmente antígenos da influenza bem como a expressão de
polipeptídeos adjuvantes e às estratégias de imunização com ácido nucleico
20 usando tais reagentes.
Fundamentos da invenção
A terapia de gene e imunização com ácido nucleico são
métodos promissores para o tratamento e prevenção de doenças tanto
adquiridas quanto herdadas. Estas técnicas fornecem a transferência de um
25 ácido nucleico desejado em um indivíduo com a expressão in vivo
subseqüente. A transferência pode ser realizada pela transfecção das células
ou tecidos do indivíduo ex vivo e reintroduzir o material transformado no
hospedeiro. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo
diretamente ao receptor.

2
Cada uma destas técnicas requer a expressão eficiente do ácido
nucleico na célula transfectada, para fornecer uma quantidade suficiente do
produto de gene terapêutico ou antigênico. Diversos fatores são conhecidos
afetar os níveis de expressão obtidos, incluindo a eficiência de transcrição, e a
5 eficiência com que o gene ou a seqüência de interesse é transcrita e o mRNA
traduzido.
Vários sistemas de expressão foram descritos na técnica, cada
um dos quais tipicamente consiste de um vetor contendo um gene ou
seqüência de nucleotídeo de interesse operavelmente ligada às seqüências de
10 controle de expressão. Estas seqüências de controle incluem seqüências
promotoras transcricionais e seqüências início e terminação transcricionais.
Os promotores habitualmente usado para sistemas de expressão de célula de
mamífero incluem o promotor inicial SV40, um promotor de citomegalovírus
(CMV) tal como o promotor inicial imediato de CMV (Chapman et al (1991)
15 Nucl. Acids Res. 19: 3979-3986), o promotor de repetição de terminal longo
(LTR) do vírus do tumor mamário de camundongo, o promotor tardio maior
de adenovírus (Ad MLP) e o promotor do vírus simples do herpes (HSV),
entre outros. Os promotores não virais, tais como um promotor derivado do
gene da metalotioneína de murino também são habitualmente usados.
20 Os sistemas de expressão freqüentemente incluem elementos
moduladores transcricionais, aludidos como "realçadores". Os realçadores são
amplamente definidos como um agente que atua em cis, que quando
operavelmente ligado a uma seqüência de promotor/ gene, aumentará a
transcrição desta seqüência de gene. Os realçadores podem funcionar a partir
25 de posições que estão muito mais longe de uma seqüência de interesse do que
outros elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores), e
podem operar quando posicionados em cada orientação relativa à seqüência
de interesse (Banerji et al. (1981) Cell 27: 299-308, deVilleirs et al. (1981)
Nucl. Acids Res 9: 6251-6264). Os realçadores foram identificados a partir de

3
várias fontes virais, incluindo o vírus do polioma, vírus BK, citomegalovírus
(CMV), adenovírus, vírus símio 40 (SV40), vírus do sarcoma -de Moloney,
vírus do papiloma bovino e vírus do sarcoma de Rous (deVilleirs et al supra,
Rosenthal et al. (1983) Science 222: 749-755, Hearing et al. (1983) Cell 33:
5 695-703, Weeks et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 1222-1234, Levinson et al.
(1982) Nature 295: 568-572, e Luciw et al. (1983) Cell 33: 705-716).
Vários sistemas de expressão para a imunização com ácido
nucleico e terapia de gene fazem uso do promotor inicial imediato do hCMV.
Ver por exemplo, as Patentes US 5168062 e 5385839 concedidas a
10 Stinski, e Relatório Descritivo de Patente EP 0323997 B 1. Os vetores de
expressão usando o promotor inicial imediato do hCMV incluem por
exemplo, pWRG7128 (Roy et al, Vaccine 19, 764-778, 2001), e pBC12/CMV
e pJW4303 que são mencionados na WO 95/20660. Chapman et al (1991)
supra relatam níveis reduzidos de expressão do promotor inicial imediato do
15 hCMV na ausência de hCMV Intron A.
Sumário da invenção
Uma construção de ácido nucleico foi desenvolvido usando
seqüências de promotor/expressão viral manipulados que fornece expressão
realçada de seqüências codificadoras heterólogas em células hospedeiras. A
20 construção é adequada para a expressão eficiente de genes e em particular
genes que codificam antígeno, e portanto podem ser usados na imunização
com ácido nucleico. A construção também pode ser usada para expressar
polipeptídeos adjuvantes. A construção pode ser fornecida em partículas
carreadoras, para o uso na imunização mediada por partícula com ácido
25 nucleico. Em uma forma de realização especialmente preferida da invenção a
construção codifica um antígeno da influenza, fragmento imunogênico deste
ou uma variante imunogênica de cada um. Em uma outra forma de realização
especialmente preferida a construção codifica um polipeptídeo adjuvante.
Conseqüentemente, presente invenção fornece uma

4
construção de ácido nucleico adequada para a liberação a um indivíduo para
induzir uma resposta imune contra o antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus
da influenza, construção esta que compreende:
(i) um seqüência promotora quimérica que compreende:
5 (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
imediato maior de hCMV; e
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV;
10 (ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento;
15 (iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
promotor quimérico; e
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região 3'
20 não traduzida (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
A presente invenção também fornece uma construção de ácido
nucleico adequada para a liberação a um indivíduo para induzir uma resposta
25 imune contra antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza,
construção esta que compreende:
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial

imediato maior de hCMV; e
5
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
5 promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento.
Além disso, a presente invenção fornece uma construção de
10 ácido nucleico que compreende uma seqüência promotora quimérica e um
15
sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência codificadora em ligação
operável com o promotor quimérico, em que a seqüência promotora
quimérica compreende:
imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região do intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
Em um exemplo preferido, a construção compreende uma
20 seqüência codificadora inserida no sítio de clonagem. Assim, uma seqüência
codificadora pode ser fornecida no sítio de clonagem.
Em uma outra forma de realização preferida uma construção
da invenção pode compreender ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
25 seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV e que está em ligação operável com
o promotor quimérico; e/ou
(b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg, ou uma UTR 3' de uma

6
seqüência de gene inicial imediata de CMV símio e que está em ligação
operável com o promotor quimérico, em que a seqüência realçadora está a
jusante do sítio de clonagem.
A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico
5 que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora
operavelmente ligada ao promotor, onde a construção compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a
10 seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
3' de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene
15 inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à
20
25
seqüência realçadora 3'.
que compreende:
imediato maior de hCMV; e
A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
(ii) um sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência
codificadora em ligação operável com o promotor quimérico; e
(iii) (a) uma seqüência líder não traduzida que é
derivada da seqüência de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de
HBV ou seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação

operável com o promotor quimérico; e/ou
7
(b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg, ou uma UTR 3' de uma
seqüência de gene inicial imediata de CMV símio e que está em ligação
5 operável com o promotor quimérico, em que a seqüência realçadora está a
jusante do sítio de clonagem.
que compreende:
A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico
(i) uma seqüência promotora;
10 (ii) uma seqüência líder não traduzida derivada da seqüência
de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de
antígeno tipo 2 gD do HSV; e
(ii)
(iii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada a (i) e
15 em que a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência líder
não traduzida.
que compreende:
A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico
(i) uma seqüência promotora;
20 (ii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada à
seqüência promotora (i); e
seqüência codificadora (ii);
(iii) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
em que a seqüência realçadora (iii) é derivada de uma UTR 3'
25 de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene
inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora (ii) é heteróloga à
seqüência realçadora 3'.
A presente invenção também fornece uma construção de ácido
nucleico que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência

8
codificadora operavelmente ligada ao promotor, onde a construção
compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
5 seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
10 3' de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene
inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à
seqüência realçadora 3'.
A presente invenção adicionalmente fornece uma população de
construções de ácido nucleico onde a população compreende pelo menos duas
15 construções diferentes da invenção.
em um outro exemplo, a invenção fornece uma seqüência
promotora quimérica isolada purificada que compreende:
20 imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
A invenção também fornece
- um método de obter a expressão em células de mamífero
25 de um polipeptídeo de interesse, método este que compreende transferir para
dentro das ditas células uma construção de ácido nucleico, uma população de
construções de ácido nucleico ou partículas revestidas da invenção;
- partículas revestidas, adequadas para a liberação a partir
de um dispositivo de liberação mediada por partícula, partículas estas que

9
compreendem partículas carreadoras revestidas com uma construção de ácido
nucleico da invenção, a construção incluindo uma seqüência codificadora que
codifica o polipeptídeo;
- um receptáculo de dosagem para um dispositivo de
5 liberação mediada por partícula que compreende as partículas revestidas;
- um dispositivo de liberação mediada por partícula
carregado com as partículas revestidas;
- um método de imunização com ácido nucleico que
compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz das partículas
10 revestidas da invenção;
- uma composição farmacêutica que compreende uma
construção de ácido nucleico da invenção ou uma população de construções
de ácido nucleico da invenção juntas com um carreador ou excipiente
farmaceuticamente aceitáveis;
15 - uma composição de vacina que compreende uma
construção de ácido nucleico da invenção ou uma população de construções
de ácido nucleico da invenção ou partículas revestidas da invenção.
Também é fornecido o uso de uma construção de ácido
nucleico da invenção, uma população de construções de ácido nucleico da
20 invenção ou partículas revestidas da invenção na fabricação de um
medicamento para a imunização com ácido nucleico.
Estes e outros objetivos, aspectos, formas de realização e
vantagens da presente invenção facilmente ocorrerão àqueles de habilidade
comum na técnica em vista da divulgação aqui.
25 Descrição Resumida dos Desenhos
A Figura 1 ilustra os níveis de expressão do antígeno de
superficie do vírus da hepatite B (1-1BsAg) obtidos usando vários vetores de
expressão de plasmídeo.
A Figura 2 mostra o efeito da inclusão de intron sobre a

10
expressão do HBsAg em células SCC15 e de beta-gal em células B16 (média
de três experimentos).
A Figura 3 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da
UTR 3' do HBV sobre a expressão de beta-gal em células SCC 15 (média de
5 três experimentos).
A Figura 4 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da
UTR 3' do HBV sobre a expressão de HSVgD em células SCC 15 (média de
três experimentos).
A Figura 5 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da
10 UTR 3' do HBV sobre a expressão de SEAP em células SCC15 e B16 (três
repetições por linhagem de célula).
A Figura 6 mostra a capacidade dos peptídeos de sinal
heterólogos para direcionar a secreção de SEAP ou fragmento hFc em células
B16.
15 A Figura 7 ilustra níveis de anticorpos detectados nos soros de
camundongos imunizados com ácidos nucleicos que codificam antígeno
contidos em uma variedade de vetores de expressão de plasmídeo.
expressão pPJV.
A Figura 8 é uma representação diagramática do vetor de
20 A Figura 9 é uma representação diagramática de pPJV7389.
A Figura 10 é uma representação diagramática de pPJV7400.
A Figura 11 é uma representação diagramática de pPJV7468.
A Figura 12 é uma representação diagramática de pPJV7563.
A Figura 13 demonstra a composição base para pPJV7563.
25 A Figura 14 fornece um diagrama de fluxo da derivatização
dos plasmídeos pPJV7563 e pPJV1671.
construção de pPJV 1671.
A Figura 15 fornece mapas dos plasmídeos chave na
A Figura 16 fornece um mapa característico de pPJV1671 e

11
fornece uma comparação de seqüência das seqüências dos terminais N do
antígeno de HA, H3 Panama natural e do antígeno de HA, H3 Panama
codificado pelo pPJV1671.
A Figura 17 mostra os títulos de anticorpo da inibição da
5 hemaglutinação em porcos vacinados com pPJV 1671.
A Figura 18 mostra as reações de pele locais que segue a
liberação epidérmica mediada por partícula de pPJV1671 aos seres humanos.
A Figura 19 mostra os títulos de anticorpo da inibição da
hemaglutinação em porcos imunizados com uma vacina trivalente com base
10 na PMED. Os títulos de HI específicos para os vírus H3, H1 e B são
mostrados para dois dispositivos de PMED.
A Figura 20 é uma representação diagramática de pPML7789.
A Figura 21 mostra a seqüência anotada de pPML7789.
A Figura 22 é uma representação diagramática de pPJV2012.
15 A Figura 23 é um diagrama de fluxo para a construção de
pPJV2012.
pPJV7788.
A Figura 24 fornece a seqüência anotada de pPJV2012.
A Figura 25 é uma representação diagramática do vetor
20 A Figura 26 é uma representação diagramática do vetor
pPJV7788 mostrando sítios de restrição.
A Figura 27 é uma representação diagramática de pICP27.
A Figura 28 é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 65) de
ICP27 da cepa MS de HSV-2 com base na seqüência de nucleotídeo de
25 pICP27. A diferença de aminoácido único entre a seqüência publicada de
ICP27 da cepa MS de HSV-2 (asparagina = N) e cepa HG52 (lisina) está em
negrito. A seqüência identificada como o epítopo CD8 putativo na cepa MS
do HSV-2 está sublinhada.
A Figura 29 mostra a identificação de um epítopo ICP27

12
dominante em camundongos Balb/c. A: Células de baço (S) e linfonodo (N)
de camundongos Balb/c infectados com HSV-2 (BS e BN, respectivamente)
ou camundongos C57BL/6 (CS e CN) foram ensaiadas quanto à atividade de
IFN-y ELISPOT usando as várias reuniões de peptídeo (C1-C12, R1-R6)
5 descritas no Exemplo 22. 5 x 10 5 células foram plaqueadas em cada
reservatório e os resultados são tabulados como negativo (quadrados vazios),
fraco (25
ELISPOTs/reservatório, quadrados pretos). B: Seqüências dos dois peptídeos
(SEQ ID NOS: 66 e 67) reconhecidos pelas células de camundongos Balb/c
10 salientando um epítopo Dd do HSV-2 potencial (negrito) e uma região
(sublinhada) que corresponde a um epítopo do HSV-1 previamente
identificado (Banks et al, J. Virol. 67, 613-616, 1993).
A Figura 30 relata a caracterização da resposta de Balb/c a
ICP27 usando um ensaio IFN-y ELISPOT. As células do baço de
15 camundongos Balb/c infectados foram ensaiadas quanto a atividade de IFN-y
ELISPOT usando a reunião de peptídeo feita de todos os peptídeos de ICP27
(Reunião), ou peptídeos HGPSLYRTF individuais (P1, SEQ ID NO: 68) e
LYRTFAANPRA (P2, SEQ ID NO: 69). 5 x 10 5 células foram plaqueadas em
cada reservatório e os resultados são expressados como número de
20 ELISPOTs/reservatório. Além disso, uma aliquota da amostra de célula do
baço foi tratada com pérolas magnéticas para esgotar a amostra de células
CD8+ como descrito no Exemplo 22. A amostra original (+CD8) e amostra
esgotada (-CD8) foram ensaiadas quanto a atividade de IFN-y ELISPOT
usando a reunião de peptídeo feita de todos os peptídeos de ICP27 (Reunião).
25 A Figura 31 mostra a correlação entre a proteção contra a
inoculação de HSV-2 e a produção de citocina específica de ICP27. Grupos
de 16 camundongos receberam imunizações de PMED DNA primárias e de
reforço consistindo da vacina pICP27 DNA com e sem o vetor CT DEI
pPJV2013 (subunidade dual A+B) ou subunidade do vetor LT DEI pPJV2012

13
(dual A+B). O pICP27 para o vetor DEI foi uma razão de 9:1. Painel A: dados
de sobrevivência após a inoculação. Metade dos animais em cada grupo foram
inoculados duas semanas a seguir da segunda imunização com 50 LD 50 de
HSV-2. Painéis B e C: produção de IFN-y específico de ICP27 e TNF-a em
5 cada grupo, respectivamente. Os animais remanescentes foram sacrificados no
mesmo tempo e os esplenócitos foram coletados para a medição da produção
de citocina específica de ICP27 usando um kit de série de pérola citométrica.
A Figura 32 mostra o papel de IFN-y e TNF-a na proteção da
inoculação letal de HSV-2 — avaliação da morbidez. Grupos de 4
10 camundongos receberam imunizações primária e de reforço com a vacina
pICP27 PMED DNA com (4 grupos) ou sem (1 grupo) o vetor pPJV2012
dual A+B LT DEI. O pICP27 para o vetor DEI foi uma razão de 9:1. Os
animais foram intranasalmente inoculados duas semanas mais tarde com 50
LD50 de HSV-2. Para o esgotamento de célula T, os camundongos receberam
15 injeções intraperitoneais contendo 200 jig de anticorpo monoclonal específico
para IFN-y e/ou TNF-a nos dias -2, 0, 2, 4, 6, e 8 em relação à inoculação
viral como descrito no Exemplo 22. Os animais foram monitorados quanto a
mortalidade (% de sobrevivência) e morbidez, classificados em uma escala de
O a 4 de acordo com o seguinte programa: 4, saudável; 3, pelo eriçado,
20 espirrando; 2, feridas nos olhos ou nádegas, movimento reduzido; 1,
encurvado, pouco movimento; 0, morto.
A Figura 33 mostra o papel de populações de célula T na
proteção da inoculação letal de HSV-2. Cinco grupos de 4 camundongos
receberam imunizações primária e de reforço com a vacina pICP27 PMED
25 DNA com (+LT, 4 grupos) ou sem (-LT, 1 grupo) o vetor pPJV2012 dual
A+B LT DEI. O pICP27 para vetor DEI foi uma razão de 9:1. Os animais
foram inoculados intranasalmente com 50 LD 50 de HSV-2 duas semanas mais
tarde. Três grupos dos animais imunizados com ICP27+LT DEI foram
tratados com injeções intraperitoneais de 90 lig de anticorpos monoclonais

14
específicos de aCD4 e/ou aCD8, nos dias -2 e O em relação à inoculação
virai. De modo a manter o DNA total no grupo pICP27 sozinho (indicado
como -LT) igual aos grupos pICP27 + LT, vetor vazio foi adicionado ao
grupo pICP27 sozinho.
5 Descrição Resumida das Seqüências
A SEQ ID NO: 1 é a seqüência promotora inicial imediata de
hCMV (GenBank #M60321, X17403)
A SEQ ID NO: 2 é a seqüência dos exons 1 e 2 do gene inicial
imediato maior de hCMV (GenBank #M60321, X17403)
10 A SEQ ID NO: 3 é a seqüência do intron A da insulina de rato
(GenBank #J00748)
A SEQ ID NO: 4 é a seqüência de um promotor quimérico de
acordo com a presente invenção
A SEQ ID NO: 5 é uma seqüência líder da HBV pre S2
15 antígeno seqüência da UTR 5' do antígeno pré S2 do HBV (GenBank
#M54923)
A SEQ ID NO: 6 é uma seqüência líder da seqüência da UTR
5' do tipo 2 gD do HSV (GenBank #Z86099)
A SEQ ID NO: 7 é uma seqüência líder da seqüência da UTR
20 5' do HBV e antígeno (GenBank #M54923)
(GenBank #AF 143308)
A SEQ ID NO: 8 é a seqüência da UTR 3' de HBVenh
A SEQ ID NO: 9 é a seqüência da UTR 3' do gene inicial
imediato símio (GenBank #M16019)
25 A SEQ ID NO: 10 é a seqüência poli A da globina de coelho
(GenBank #K03256)
A SEQ ID NO: 11 é a seqüência poli A do gene inicial
imediato de sCMV símio (GenBank #M16019)
A SEQ ID NO: 12 é a seqüência poli A do gene gB do HSV2

(GenBank #Z86099)
HPV16 (GenBank #K02718)
5 pPJV
15
A SEQ ID NO: 13 é a seqüência poli A do gene inicial do
A SEQ ID NO: 14 é a seqüência do vetor de expressão de
A SEQ ID NO: 15 é o iniciador de PCR de JF93
A SEQ ID NO: 16 é o iniciador de PCR de F110
A SEQ ID NO: 17 é o iniciador de PCR de GW1
A SEQ ID NO: 18 é o iniciador de PCR de JF254
10 A SEQ ID NO: 19 é o iniciador de PCR de GW150
A SEQ ID NO: 20 é o iniciador de PCR de JF255
A SEQ ID NO: 21 é o iniciador de PCR de DS1
A SEQ ID NO: 22 é o iniciador de PCR de DA1
A SEQ ID NO: 23 é o iniciador de PCR de JF301
15 A SEQ ID NO: 24 é o iniciador de PCR de JF302
A SEQ ID NO: 25 é o iniciador de PCR de JF84
A SEQ ID NO: 26 é o iniciador de PCR de JF225
A SEQ ID NO: 27 é o iniciador de PCR de JF335
A SEQ ID NO: 28 é o iniciador de PCR de JF336
20 A SEQ ID NO: 29 é o iniciador de PCR de JF357
A SEQ ID NO: 30 é o iniciador de PCR de JF365
A SEQ ID NO: 31 é o iniciador de PCR de JF393
A SEQ ID NO: 32 é o iniciador de PCR de JF406
A SEQ ID NO: 33 é o iniciador de PCR de JF256
25 A SEQ ID NO: 34 é o iniciador de PCR de JF257
A SEQ ID NO: 35 é o iniciador de PCR de JF320
A SEQ ID NO: 36 é o iniciador de PCR de JF321
A SEQ ID NO: 37 é o iniciador de PCR de JF386
A SEQ ID NO: 38 é o iniciador de PCR de FcAS

16
A SEQ ID NO: 39 é o oligonucleotídeo JF354
A SEQ ID NO: 40 é o iniciador de PCR de JF355
A SEQ ID NO: 41 é o iniciador de PCR de JF356
A SEQ ID NO: 42 é o oligonucleotídeo JF348
5 A SEQ ID NO: 43 é o iniciador de PCR de JF349
A SEQ ID NO: 44 é o iniciador de PCR de JF350
A SEQ ID NO: 45 é o oligonucleotídeo JF351
A SEQ ID NO: 46 é o iniciador de PCR de JF352
A SEQ ID NO: 47 é o iniciador de PCR de JF353
10 A SEQ ID NO: 48 é o iniciador de PCR de JF430
15 Pseudo-raiva (PRV).
sarcoma de Rous (RSV).
A SEQ ID NO: 49 é o iniciador de PCR de JF442
A SEQ ID NO: 50 é o iniciador de PCR de JF421
A SEQ ID NO: 51 é o iniciador de PCR de JF444
A SEQ ID NO: 52 é a seqüência promotora do vírus da
A SEQ ID NO: 53 é a seqüência promotora do vírus do
A SEQ ID NO: 54 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor
pPJV1671 e a seqüência de aminoácido do antígeno H3N2 HA codificado.
20 A SEQ ID NO: 55 fornece a seqüência de aminoácido sozinha
do antígeno H3N2 HA codificado por pPJV1671.
A SEQ ID NO: 56 fornece a seqüência de aminoácido de N
terminal natural do antígeno H3 Panama HA.
A SEQ ID NO: 57 fornece a seqüência de aminoácido de
25 terminal N para o antígeno H3 Pananama HA codificado pelo pPJV 1671.
A SEQ ID NO: 58 fornece a seqüência de consenso das
seqüências das SEQ ID 1■11' 56 e 57.
A SEQ ID NO: 59 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor
pPML7789 e a seqüência de aminoácido do antígeno VN1194H5.

do antígeno VN1194H5.
pPJV2012.
17
A SEQ ID NO: 60 fornece a seqüência de aminoácido sozinha
A SEQ ID NO: 61 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor
5 A SEQ ID NO: 62 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor
PJV7788.
As SEQ ID NOS: 63 e 64 são os iniciadores 5' e 3' usados no
Exemplo 22 para amplificar o DNA da cepa MS do HSV-2.
A SEQ ID NO: 65 é a seqüência de aminoácido de ICP27 da
10 cepa MS do HSV-2 com base na seqüência de nucleotídeo de pICP27,
Exemplo 22.
As SEQ ID NOS: 66 e 67 são os peptídeos 45 e 46
reconhecidos pelas células de camundongos Balb/c no Exemplo 22.
A SEQ ID NO: 68 é uma seqüência de nove aminoácidos
15 homóloga contida nos peptídeos 45 e 46.
As SEQ ID NOS: 69 e 70 são regiões de aminoácido de HSV-
2 ICP27 e HSV-1 ICP27 que diferem em um aminoácido.
Descrição Detalhada da Invenção
Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser
20 entendido que esta invenção não é limitada às moléculas ou parâmetros do
processo particularmente exemplificados visto que tais, naturalmente, podem
variar. também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas
com o propósito de descrever as formas de realização particulares da
invenção, e não é intencionada a ser limitante. Além disso, a prática da
25 presente invenção utilizará, a menos que de outro modo indicado, métodos
convencionais de virologia, microbiologia, biologia molecular, técnicas de
DNA recombinante e imunologia todas as quais estão dentro da habilidade
comum da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura.
Ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory

18
Manual (2 a Edição, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II
(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical
Guide to Molecular Cloning (1984); e Fundamental Virology, 2 a Edição, vol.
I & II (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds.).
5 Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui
citados, seja acima ou abaixo, são aqui incorporadas por referência em sua
totalidade.
Deve ser mencionado que, como usado neste relatório
descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um," "uma" e
10 "o", "a" incluem referentes plurais a menos que o conteúdo claramente dite de
outro modo.
Em casos onde um agente particular é especificado como
compreendendo unidades particulares, em um exemplo preferido o agente
pode consistir essencialmente de tais unidades. UM.
15 A Definições
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos
e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente
entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a invenção
pertence. Embora vários métodos e materiais similares ou equivalentes
20 àqueles aqui descritos podem ser usados na prática da presente invenção, os
materiais e métodos preferidos são aqui descritos.
Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão
utilizados e são intencionados a serem definidos como indicado abaixo.
O termo "imunização com ácido nucleico" é aqui usado para
25 se referir à introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou
mais antígenos ou polipeptídeos selecionados em uma célula hospedeira para
a expressão in vivo do antígeno ou antígenos. a molécula de ácido nucleico
pode ser introduzida diretamente dentro do indivíduo receptor, tal como pela
injeção intramuscular ou intradérmica padrão; liberação de partícula

19
transdérmica; inalação; topicamente, ou pelos modos de administração oral,
intranasal ou mucósico. Em particular, o ácido nucleico pode ser administrado
por intermédio da liberação de partícula transdérmica. A molécula
alternativamente pode ser introduzida ex vivo dentro de células que foram
5 removidas de um indivíduo. Neste último caso, as células contendo a
molécula de ácido nucleico de interesse são re-introduzidas no indivíduo tal
que uma resposta imune pode ser montada contra o antígeno codificado pela
molécula de ácido nucleico. As moléculas de ácido nucleico usadas em tal
imunização são no geral aqui aludidas como "vacinas de ácido nucleico."
10 Qualquer um dos ácidos nucleicos aqui mencionados pode estar presente em
tais vacinas e em particular as construções de ácido nucleico aqui
mencionadas podem estar presentes.
O termo "adjuvante" significa um material ou composição
capaz de alterar específica ou não especificamente alterar, realçar, direcionar,
15 redirecionar, potenciar ou iniciar uma resposta imune específica de antígeno.
Assim, a co-adminisração de um adjuvante com um antígeno pode resultar em
uma dose mais baixa ou menos doses de antígeno que é necessário para se
obter uma resposta imune desejada no indivíduo ao qual o antígeno é
administrado, ou a co-administração pode resultar em uma resposta imune
20 qualitativa e/ou quantitativamente diferente no indivíduo. Em particular, a
administração do adjuvante pode resultar em uma resposta imune realçada tal
como uma de maior magnitude e/ou duração. A eficácia de um adjuvante
pode ser determinada pela administração do adjuvante com uma composição
de vacina em paralelo com uma composição de vacina sozinha aos animais e
25 comparar a imunidade mediada por anticorpo e/ou celular nos dois grupos
usando ensaios padrão tais como radioimunoensaio, ELISAs, e ensaios de
CTL. As construções da invenção podem expressar um ou mais polipeptídeos
adjuvantes.
Por "carreador de núcleo" é intencionado um carreador no qual

20
um ácido nucleico hóspede (por exemplo, DNA, RNA) é revestido de modo a
comunicar um tamanho de partícula definido bem como uma densidade
suficientemente alta para se obter a cinética requerida para a penetração da
membrana celular, tal que a molécula hóspede possa ser liberada usando
5 técnicas mediadas por partícula (ver, por exemplo, a Patente U.S. W-
5.100.792). os carreadores de núcleo tipicamente incluem materiais tais como
tungstênio, ouro, platina, ferrita, poliestireno e látex. Ver por exemplo,
Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed.,
Oxford University Press, Nova Iorque, NY páginas 10-11.
10 Por "seringa isenta de agulha" é intencionado um instrumento
que libera uma composição particulada transdermicamente sem a ajuda de
uma agulha convencional para perfurar a pele. As seringas sem agulha para o
uso com a presente invenção são aqui debatidas.
O termo liberação "transdérmica" significa administração
15 intradérmica (por exemplo, dentro da derme ou epiderme), transdérmica (por
exemplo, "percutânea") e administração transmucósica, isto é, liberação pela
passagem de um agente dentro ou através da pele ou tecido mucósico. Ver,
por exemplo, Transdermic Drug Delivery: Developmental Issues and
Research Initiatives, Hadgraft e Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989);
20 Controlled Drug Delivery: Fundamentais and Applications, Robinson e Lee
(eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); e Transdermic Delivery of Drugs, Vols. 1-
3, Kydonieus e Berner (eds.), CRC Press, (1987). Assim, o termo abrange a
liberação a partir de uma seringa isenta de agulha como descrito na Patente
U.S. N" 5.630.796, bem como a liberação mediada por partícula como
25 descrito na Patente U.S. N° 5.865.796.
Um "polipeptídeo" é usado no seu sentido mais amplo para se
referir a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidades, análogos
de aminoácido, ou outros peptidomiméticos. As subunidades podem ser
ligadas pelas ligações de peptídeo ou por outras ligações, por exemplo éster,

21
éter, etc. Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos
naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros
óticos D ou L, e análogos de aminoácido e peptidomiméticos. Um peptídeo de
três ou mais aminoácidos é habitualmente chamado um oligopeptídeo se a
5 cadeia de peptídeo é curta. Se a cadeia de peptídeo é longa, o peptídeo é
tipicamente chamado um polipeptídeo ou uma proteína.
Um "antígeno" refere-se a qualquer um agente, no geral uma
macromolécula, que possa evocar uma resposta imunológica em um
indivíduo. O termo pode ser usado para se referir a uma macromolécula
10 individual ou a uma população homogênea ou heterogênea de
macromoléculas antigênicas. Como aqui usado, "antígeno" é no geral usado
para se referir a uma molécula de proteína ou porção desta que contenha um
ou mais epítopos. Um "antígeno" pode compreender, por exemplo, um
polipeptídeo que ocorre naturalmente, um fragmento de um tal polipeptídeo
15 que seja imunogênico ou uma forma variante de cada um que retenha a
imunogenicidade. Em um exemplo preferido, onde um fragmento ou variante
é aludido, a resposta imune gerada pode ser preferivelmente capaz de
reconhecer o polipeptídeo original a partir do qual o fragmento ou variante é
derivado.
20 Para os propósitos da presente invenção, os antígenos podem
ser obtidos ou derivados de qualquer fonte apropriada. Para os propósitos da
presente invenção, um "antígeno" inclui uma proteína tendo modificações,
tais como deleções, adições e substituições (no geral conservativas por
natureza) à seqüência nativa, contanto que a proteína mantenha
25 imunogenicidade suficiente. Estas modificações podem ser deliberadas, por
exemplo através da mutagênese direcionada ao sítio, ou pode ser acidental, tal
Como através de mutações de hospedeiros que produzem os antígenos. Em
uma forma de realização particularmente preferida da invenção o antígeno
utilizado ou codificado pode ser um antígeno da influenza, um fragmento

22
imunogênico de um antígeno da influenza ou uma variante imunogênica de
cada um.
Uma "resposta imune" contra um antígeno de interesse é o
desenvolvimento em um individual de uma resposta imune humoral e/ou um
5 celular para aquele antígeno. Para os propósitos da presente invenção, uma
"resposta imune humoral" refere-se a uma resposta imune mediada por
moléculas de anticorpo, enquanto que uma "resposta imune celular" é uma
mediada pelos linfócitos T e/ou outras células sanguíneas brancas.
Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleotídeo"
10 são usados aqui intercambiavelmente e referem-se a uma forma polimérica de
nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxinibonucleotídeos ou
ribonucleotídeos, ou análogos destes. Os polinucleotídeos podem ter qualquer
estrutura tri-dimensional, e pode realizar qualquer função, conhecida ou
desconhecida. Os exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem um
15 gene, um fragmento de gene, exons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA
de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos
recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA
isolado de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de
ácido nucleico e iniciadores.
20 Um polinucleotídeo é tipicamente composto de uma seqüência
específica de quatro bases de nucleotídeo: adenina (A); citosina (C); guanina
(G); e timina (T) (uracila (U) no lugar de timina (T) quando o polinucleotídeo
é RNA). Assim, o termo seqüência de ácido nucleico é a representação
alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética
25 pode ser introduzida em bases de dados em um computador tendo uma
unidade de processamento central e usada para aplicações de bioinformáticas
tais como genômicas funcionais e pesquisa de homologia.
Um "vetor" é capaz de transferir seqüências de ácido nucleico
para alvejar células (por exemplo, vetores virais, vetores não virais,

23
carreadores particulados, e lipossomas). As células alvo podem ser
procarióticas ou eucarióticas. Tipicamente, "construção de vetor," "vetor de
expressão," e "vetor de transferência de gene," significam qualquer
construção de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de um gene de
5 interesse e que pode transferir seqüências de gene para alvejar células. Assim,
o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais.
Um "plasmídeo" é um vetor na forma de um elemento genético
extracromossômico.
Uma seqüência de ácido nucleico que "codifica" um antígeno
10 selecionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de
DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vivo ou in vitro
quando colocado sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Os
limites da seqüência codificadora são determinados por um códon de partida
no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3'
15 (carbóxi). Para os propósitos da invenção, tais seqüências de ácido nucleico
podem incluir, mas não são limitados a, cDNA a partir de mRNA viral,
procariótico ou eucariótico, seqüências genômicas de DNA ou RNA virais ou
procarióticos, e ainda seqüências de DNA sintéticas. Uma seqüência de
terminação de transcrição pode estar localizada 3' em relação à seqüência
20 codificadora.
Em alguns casos uma seqüência transcrita pode dar origem a
polipeptídeos múltiplos, por exemplo um transcrito pode conter matrizes de
leitura aberta múltiplas (ORFs) e também um ou mais Sítios de Entrada de
Ribossoma Interno (IRES) para possibilitar a tradução de ORFs depois da
25 primeira ORF. Um transcrito pode ser traduzido para dar um polipeptídeo que
é subseqüentemente clivado para dar uma pluralidade de polipeptídeos. Em
alguns casos uma construção de ácido nucleico pode dar origem a transcritos
múltiplos e por este motivo uma pluralidade de polipeptídeos.
Um "promotor" é uma seqüência de nucleotídeo que inicia e

24
regula a transcrição de um polinucleotídeo que codifica polipeptídeo. Os
promotores podem incluir promotores indutíveis (onde a expressão de uma
seqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada ao promotor é induzida
por um análito, co-fator, proteína reguladora, etc.), promotores repressíveis
5 (onde a expressão de uma seqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada
ao promotor é reprimida por um análito, co-fator, proteína regulatória, etc.), e
promotores constitutivos. É intencionado que o termo "promotor" ou
"elemento de controle" inclui regiões promotoras e segmentos funcionais de
tamanho natural (por exemplo, transcrição ou tradução de controle) destas
10 regiões.
"Operavelmente ligada" refere-se a um arranjo de elementos
em que os componentes assim descritos são configurados de modo a realizar a
sua função usual. Assim, um dado promotor operavelmente ligado a uma
seqüência de ácido nucleico é capaz de efetuar a expressão daquela seqüência
15 quando as enzimas apropriadas estão presentes. O promotor não precisa ser
contíguo com a seqüência, contanto que o mesmo funcione para direcionar a
sua expressão. Assim, por exemplo, seqüências interventoras não traduzidas
embora transcritas podem estar presentes entre a seqüência promotora e a
seqüência de ácido nucleico e a seqüência promotora pode ser ainda
20 considerada "operavelmente ligada" à seqüência codificadora.
"Recombinante" é aqui usado para descrever uma molécula de
ácido nucleico (polinucleotídeo) de origem genômica, cDNA, semissintética
ou sintética que, em virtude da sua origem ou manipulação não está associada
com toda ou uma porção do polinucleotídeo com que a mesma está associada
25 na natureza e/ou está ligada a um polinucleotídeo outro que não aquele ao
qual a mesma está ligada na natureza. Duas seqüências de ácido nucleico que
estão contidas dentro de uma molécula de ácido nucleico recombinante única
são "heterólogas" em relação uma à outra quando as mesmas não estão
normalmente associadas uma com a outra na natureza.

25
Os homólogos de polinucleotídeos são aqui aludidos.
Tipicamente um polinucleotídeo que é homólogo a um outro polinucleotídeo
é pelo menos 70% homólogo ao polinucleotídeo, preferivelmente pelo menos
75, 80 ou 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%, 97% ou 99%
5 homólogo a este. Os métodos de medir a homologia são bem conhecidos na
técnica e será entendido por aqueles de habilidade na técnica que no presente
contexto, homologia é calculada com base na identidade de ácido nucleico.
Tal homologia, por exemplo, pode existir em uma região de pelo menos 15,
preferivelmente pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou
10 mais nucleotídeos contíguos. A região de homologia pode ser acima de pelo
menos 150, preferivelmente pelo menos 200 e ainda mais preferivelmente
acima de pelo menos 300 nucleotídeos. A região de homologia pode dizer
respeito a qualquer um dos elementos aqui aludidos em relação às construções
de ácido nucleico da invenção. Em alguns casos, a região de homologia pode
15 ser acima da região inteira em questão, tal como, por exemplo, acima da
região inteira de qualquer um dos elementos aqui especificados.
Níveis equivalentes de homologia de aminoácido àqueles
aludidos em relação à homologia de nucleotídeo acima pode estar presente.
Assim, qualquer um dos níveis mencionados acima de homologia podem se
20 aplicar ao nível de aminoácido. Homologia ao nível de aminoácido, por
exemplo, pode ser acima de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25,
mais preferivelmente acima de pelo menos 50, ainda mais preferivelmente
pelo menos 75 e ainda mais preferivelmente acima de pelo menos 100
aminoácidos. A região de homologia pode estar acima do comprimento
25 inteiro do elemento em questão.
Métodos de medir a homologia ou identidade de
polinucleotídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo o Pacote UWGCG
fornece o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a homologia
(por exemplo, usado nos seus ajustes de valor padrão) (Devereux et al (1984)

26
Nucleic Acids Research 12, p387-395).
Os algoritmos de PILEUP e BLAST também podem ser
usados para calcular a homologia ou seqüências arranjadas (tipicamente nos
seus ajustes de valor padrão), por exemplo como descrito em Altschul S. F.
5 (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:
403-10.
O software para realizar a análise BLAST está publicamente
disponível através da National Centre for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) . Este algoritmo envolve primeiro identificar
10 pares de seqüência de alta classificação (HSPs) pela identificação de palavras
curtas de comprimento W na seqüência dúvida que se iguala ou satisfaz
algumas contagens de patamar de valor positivo T quando alinhada com uma
palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é
aludido como o patamar de contagem de palavra da vizinhança (Altschul et
15 al, supra). Este acerto de palavra da vizinhança inicial atua como sementes
para iniciar pesquisas para encontrar HSPs que as contenham. Os acertos de
palavra são estendidos em ambas as direções junto de cada seqüência de
modo que a contagem de alinhamento acumulativo possa ser aumentado. As
extensões para os acertos de palavra em cada direção são paradas quando: a
20 contagem de alinhamento acumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao
acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o
final de cada seqüência é atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T
e X determina a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa
BLAST usa como valores padrão um comprimento de palavra (W) de 11, os
25 alinhamentos de matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) (B) de 50, expectação
(E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambos os filamentos.
O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da
similaridade entre duas seqüências; ver por exemplo, Karlin e Altschul (1993)

27
Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Uma medida de similaridade
fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)),
que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento
entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreriam ao acaso. Por
5 exemplo, uma seqüência é considerada similar a uma outra seqüência se a
menor probabilidade de soma em comparação da primeira seqüência para a
segunda seqüência for menor do que cerca de 1, preferivelmente menor do
que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e o mais
preferivelmente menor do que cerca de 0,001.
10 Os homólogos tipicamente hibridizam com o polinucleotídeo
relevante em um nível significantemente acima do fundo. O nível de sinal
gerado pela interação entre o homólogo e o polinucleotídeo é tipicamente pelo
menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto a
"hibridização de fundo". A intensidade de interação pode ser medida, por
15 exemplo, pela radiorrotulação da sonda, por exemplo, com 32P. A hibridização
seletiva é tipicamente obtida usando condições de severidade média a alta,
(por exemplo, 0,03 M de cloreto de sódio e 0,003 M de citrato de sódio de
cerca de 50° C a cerca de 60° C.
As condições de hibridização severas podem incluir 50% de
20 formamida, 5x de Solução de Denhardt, 5x SSC, 0,1% de SDS e 100 µg/ml
de DNA de esperma de salmão desnaturado e as condições de lavagem podem
incluir 2x SSC, 0,1% de SDS a 37° C seguido por 1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°
C. Definir as condições de hibridização apropriadas está dentro da habilidade
da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra.
25 O homólogo pode diferir de uma seqüência no polinucleotídeo
relevante em menos do que 3, 5, 10, 15, 20 ou mais mutações (cada uma das
quais pode ser uma substituição, duplicação, deleção ou inserção). Estas
mutações podem ser medidas em uma região de pelo menos 30, por exemplo
pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais nucleotídeos contíguos do homólogo. Em

28
alguns casos as mutações podem ser medidas na região inteira do homólogo.
Onde um polinucleotídeo codifica um polipeptídeo, as substituições
preferivelmente criam mudanças "conservativas" no aminoácido codificado.
Estes são definidos de acordo com a Tabela 1 abaixo. Os aminoácidos no
5 mesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira
coluna podem ser substituídos no lugar de um outro nas mudanças
conservativas.
Tabela 1
ALIFÁTICO Não Polar G A P
I L V
Polar não carregado C S T M
N Q
Polar carregado D E
KR
AROMÁTICO H F W Y
O termo "fragmento" indica uma parte menor de uma entidade
10 maior. Fragmentos de elementos específicos aqui aludidos podem ser
utilizados na invenção. Em particular, tais fragmentos reterão algumas ou
todas as funcionalidades do elemento original e em particular qualquer uma
das funções aqui mencionadas. Em exemplos preferidos um fragmento de um
antígeno pode reter imunogenicidade e um fragmento de um adjuvante a
15 capacidade para atuar como um adjuvante. Em alguns exemplos, um
fragmento pode ser pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, mais
preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo menos
80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% e ainda mais
preferivelmente pelo menos 95% do comprimento do original. Um fragmento
20 pode ser igual a ou menor do que tais porcentagens do comprimento do
original.
Os termos "indivíduo" e "indivíduo" são usados
intercambialvelmente aqui para se referir a qualquer membro do subfilo

29
cordata, incluindo, sem limitação, seres humanos e outros primatas, incluindo
primatas não humanos tais como chimpanzés e outras espécies de símios e
macacos; animais criação tais como gado, ovelha, porcos, cabras e cavalos;
mamíferos domésticos tais como cães e gatos; animais de laboratório
5 incluindo roedores tais como camundongos, ratos e porquinhos da Índia bem
como porcos; pássaros, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça tais
como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos, e outros. Os
termos não denotam uma idade particular. Assim, indivíduos tanto adultos
como recém-nascidos são intencionados a serem abrangidos. Os métodos aqui
10 descritos são intencionados para o uso em qualquer uma das espécies
vertebradas acima, desde que os sistemas imune de todos estes vertebrados
operem similarmente.
Em alguns exemplos, a invenção pode ser usada para imunizar
qualquer indivíduo adequado e em particular qualquer indivíduo adequado de
15 uma dada espécie. Em um exemplo preferido, qualquer indivíduo humano
adequado pode ser imunizado. Assim, tantos indivíduos quanto possível, por
exemplo, podem ser imunizados sem ênfase em qualquer grupo particular de
indivíduos. Por exemplo, uma população de indivíduos como um todo, ou
tantos quanto possível, podem ser imunizados. Em particular, onde a invenção
20 está sendo usada para tratar influenza, e especialmente para imunizar contra
uma cepa pandêmica de influenza, as construções da invenção podem ser
usadas para imunizar qualquer indivíduo e preferivelmente tantos indivíduos
quanto possível.
Em outros casos, o indivíduo ou indivíduo podem ser um em
25 risco de infecção ou para quem a infecção seria particularmente prejudicial. A
infecção, em um exemplo preferido, pode ser uma infecção respiratória. Em
particular, onde a invenção está sendo usada para prevenir ou tratar uma
infecção respiratória e em particular contra influenza, o indivíduo pode ser um
ser humano. Em alguns casos, as construções de ácido nucleico da invenção

30
podem ser administradas de preferência, ou primeiro, em particular em grupos
de risco. Isto, por exemplo, pode ser o caso para a administração de
construções para imunizar contra cepas não pandêmicas de influenza. Em
alguns casos os indivíduos, por exemplo, podem cair em uma ou mais das
5 seguintes categorias:
um indivíduo com um distúrbio respiratório e/ou
problemas cardíacos e em particular que tenha asma, enfisema, bronquite e/ou
doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD);
- um indivíduo com uma condição médica crônica tal como
10 diabete, supressão imune, deficiência imune, doença de célula falciforme e/ou
uma doença renal;
- um indivíduo com idade de pelo menos 50 anos,
preferivelmente pelo menos 60 anos, mais preferivelmente pelo menos 65
anos, ainda mais preferivelmente pelo menos 75 anos de idade e ainda mais
15 preferivelmente pelo menos 80 anos de idade;
- uma criança com 2 anos de idade ou menos, em particular
de 6 a 23 meses, por exemplo 18 meses ou menos;
- um indivíduo em uma terapia com aspirina crônica e em
particular um com idade de 6 meses a 18 anos;
20 - uma mulher grávida e em particular uma que estará no seu
segundo ou terceiro trimestre de gravidez durante a época da influenza;
- um residente de uma casa de saúde ou instalação de
cuidados de longa duração; e/ou
- um enfermeiro para qualquer um dos acima ou alguém que
25 é provável de entrar em contato regular com eles.
B. Resumo Geral
A invenção diz respeito a construções de ácido nucleico que
possibilitem a expressão eficiente de seqüências codificadoras heterólogas, e
em particular genes que codifiquem antígeno, em células hospedeiras. As

31
construções, em alguns exemplos, podem expressar um ou mais polipeptídeos
adjuvantes. Mais especificamente, a invenção fornece construções de ácido
nucleico que compreendem, ou em algumas formas de realização, consistem
essencialmente de uma seqüência promotora quimérica e um sítio de
5 clonagem, tal que quando uma seqüência codificadora é inserida no sítio de
clonagem, a seqüência codificadora está em ligação operável com o promotor
quimérico. A invenção também fornece construções com seqüências
codificadoras inseridas no sítio ou sítios de clonagem. As seqüências
codificadoras podem codificar qualquer um dos polipeptídeos aqui aludidos e
10 em particular um antígeno e especialmente qualquer um dos antígenos e
polipeptídeos adjuvantes aqui mencionados.
Em uma forma de realização especialmente preferida as
construções compreendem uma seqüência codificadora e em particular uma
seqüência codificadora que codifica um antígeno, um fragmento imunogênico
15 deste ou uma variante imunogênica de cada um. Em uma forma de realização
especialmente preferida as seqüências codificadoras codificam um antígeno
da influenza, um fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica
de cada um. Em uma outra forma de realização preferida a seqüência
codificadora pode codificar um polipeptídeo adjuvante e em particular uma
20 subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com
atividade de adjuvante ou uma variante de cada um com atividade de
adjuvante.
O promotor quimérico compreende, ou em algumas formas de
realização consiste essencialmente de:
25 (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
imediato maior de hCMV; e
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.

compreender:
nativa;
32
A seqüência do promotor inicial imediato do hCMV (a) pode
(i) uma seqüência do promotor inicial imediato de hCMV
5 (ii) um função homólogo variante do mesmo; ou
(iii) uma função de fragmento de (i) ou (ii).
No geral a seqüência (a) compreende cerca de 100 a 600,
preferivelmente 200 a 600, por exemplo 400 a 600 nucleotídeos. Tipicamente
a seqüência (a) compreende as seqüências presentes em (i) que ligam fatores
10 de transcrição ou a RNA polimerase, ou ao invés de qualquer uma destas
seqüências, homólogos destas seqüências capazes de ligar os mesmos fatores
de transcrição e RNA polimerase. Tipicamente tais seqüências ou seus
homólogos estão presentes na seqüência promotora (a) na mesma ordem e/ou
substancialmente no mesmo espaçamento relativo como em (i).
15 No geral, (i) compreende pelo menos de nucleotídeos -100 a -
1, tipicamente -150 a -1, por exemplo -500 a -1 ou -600 a -1 do gene inicial
imediato maior de hCMV. A seqüência (i) tipicamente compreende a
seqüência promotora de núcleo do hCMV e também pode incluir um ou mais
elementos realçadores presentes no promotor inicial imediato do hCMV. Por
20 exemplo, (i) pode compreender dos nucleotídeos -118 a -1, ou -524 a -1 como
na US 6218140, ou dos nucleotídeos -62 a 1 ou -465 a -1 como na US 538
5839.
No geral (i) inclui um TATA box ou CAAT box habitualmente
encontrados nas seqüências promotoras. Preferivelmente a seqüência inclui
25 uma ou mais das seqüências de repetição no promotor inicial imediato do
hCMV.
Em uma forma de realização preferida, (i) compreende a SEQ
ID NO: 1. Em uma outra forma de realização preferida, (i) compreende os
nucleotídeos 903 a 1587 da SEQ ID NO: 54. Em uma outra forma de

33
realização (i) pode compreender os nucleotídeos de 903 a 1587 da SEQ ID
NO: 14. Em uma outra forma de realização preferida (i) pode compreender os
nucleotídeos de 1002 a 1686 ou de 2624 a 3308 da SEQ ID 1\1 2 57. Em uma
outra forma de realização preferida (i) pode compreender os nucleotídeos de
5 1815 a 1935 e/ou de 1948 a 2632 da SEQ ID 1\l' 61 e em particular os
nucleotídeos de 1948 a 2632 da SEQ ID 61. Em uma outra forma de
realização preferida os nucleotídeos de 1815 a 1935 podem ser usados.
Em uma forma de realização particularmente preferida da
invenção a seqüência do promotor inicial imediato de hCMV (a) compreende:
10 (i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No. 1, nucleotídeos
de 903 a 1587 da SEQ ID No. 54, nucleotídeos de 1815 a 1935 da SEQ ID
No: 61, nucleotídeos de 1948 a 2632 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de 1002
a 1686 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de 2624 a 3308 da SEQ ID No:
62;
15 (ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
e/ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
Em alguns exemplos, um fragmento pode compreender pelo
20 menos 300 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, mais
preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos e ainda mais preferivelmente
pelo menos 600 nucleotídeos de tais seqüências. O fragmento pode
compreender até 800, até 600 ou até 400 nucleotídeos
Uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV pode ser
25 obtida usando métodos conhecidos. Um promotor inicial imediato do hCMV
nativo pode ser isolado diretamente de uma amostra do vírus, usando técnicas
padrão. A US 5385839, por exemplo, descreve a clonagem de uma região
promotora de hCMV. A seqüência de um promotor inicial imediato do hCMV
está disponível no Genbank #M60321 (cepa Towne do hCMV) e X17403

34
(cepa Ad169 do hCMV). Uma seqüência nativa portanto pôde ser isolada pela
PCR usando iniciadores de PCR com base na seqüência conhecida. Ver por
exemplo, Sambrook et al, supra, quanto a uma descrição de técnicas usadas
para obter e isolar DNA. Uma seqüência promotora do hCMV adequada
5 também pôde ser isolada a partir de um vetor plasmídico existente. As
seqüências promotoras também podem ser sinteticamente produzidas.
Uma variante funcional (ii) ou fragmento (iii) é no geral um
que retenha e/ou complemente a atividade do promotor nativo (i).
Tipicamente a sua atividade é a capacidade para causar (incluindo iniciar e
10 regular) a transcrição de um polinucleotídeo operavelmente ligado, em
particular do gene inicial imediato maior de hCMV. Em uma forma de
realização, a variante ou fragmento seriam capazes de complementar a
atividade do promotor nativo em um vírus hCMV, por exemplo possibilitando
que o vírus retenha a capacidade para infectar e/ou replicar em células.
15 Uma variante homóloga (ii) ou fragmento (iii) podem ser
ensaiados quanto a capacidade para reter e/ou complementar a atividade de
(i). Por exemplo, uma variante ou fragmento podem ser ensaiados quanto a
capacidade para restaurar a funcionalidade (tal como a capacidade de infecção
e/ou replicação) ao hCMV mutante em que o promotor inicial imediato do
20 hCMV nativo é defeituoso.
Uma variante homóloga (ii) ou fragmento (iii) podem ser
testados quanto a utilidade usando o ensaio de Expressão Comparativa
abaixo. A seqüência promotora de teste é trocada no vetor base no lugar do
promotor inicial imediato do hCMV nativo. Tipicamente, uma variante
25 funcional ou fragmento possibilita pelo menos 50%, por exemplo, 60, 70, 80,
90% ou mais da expressão fornecida usando o vetor base. Uma variante
funcional ou fragmento podem fornecer qualquer um dos níveis de expressão
aqui aludidos. Em alguns exemplos, a variante ou fragmento podem fornecer
um nível mais alto de expressão tal como pelo menos 50%, 100%, 150%,

35
200%, 300% ou mais de aumento na atividade. No geral a expressão é
fornecida em pelo menos um, mas preferivelmente dois, tipos de célula de
referência. Tipicamente, as células de referência são células HEK, 293T,
CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As células de referência podem
5 ser células hospedeiras SSC-15 ou B16 em alguns exemplos.
Adicional ou alternativamente, a seqüência promotora pode ser
testada no Ensaio de Imunogenicidade Comparativa abaixo. A seqüência
promotora de teste é trocada no vetor base no lugar do promotor inicial
imediato do hCMV nativo. Uma seqüência promotora funcional tipicamente
10 fornece títulos de anticorpo que são pelo menos tão altos quanto aqueles
obtidos pelo vetor base com pelo menos um, preferivelmente dois antígenos.
Preferivelmente os títulos de anticorpo são pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%
ou 40% mais altos do que com o vetor base. Em alguns casos, o nível de
títulos de antígeno pode ser qualquer um daqueles aqui aludidos. Os antígenos
15 adequados são os antígenos HBsAg, HSV 2gD e flu-M2. Os antígenos
particularmente preferidos são antígenos da influenza. Os antígenos da
influenza incluem os antígenos HA, NA, M2, NP, M1, PB1, PB2, PA, NS1 e
NS2 e em particular os antígenos HA, NA e M2. Em uma forma de realização
especialmente preferida o antígeno é HA ou um fragmento deste ou uma
20 variante de cada um. De acordo com o ensaio, uma variante homóloga
funcional (ii) ou fragmento funcional (iii) de seqüência promotora nativa (i) é
tipicamente uma que possibilite os títulos de anticorpo mais altos obtidos pela
seqüência nativa. Em alguns exemplos, o título de anticorpo pode ser
levemente mais baixo incluindo qualquer um dos níveis aqui mencionados.
25 Em exemplos onde uma construção da invenção codifica um
polipeptídeo adjuvante, o teste da imunogenicidade comparativa pode ser
utilizado com um antígeno padrão e comparando um vetor de teste que
codifica um polipeptídeo de atividade adjuvante desconhecida com um vetor
adjuvante padrão. Por exemplo, um vetor adjuvante de teste pode codificar

36
um fragmento ou variante de um polipeptídeo adjuvante conhecido e ser
comparado contra um vetor padrão que expressa o polipeptídeo adjuvante
conhecido na sua capacidade para promover uma resposta imune quando
administrado com um antígeno. Um fragmento ou variante pode ter qualquer
5 um dos níveis de atividade aqui mencionados e em particular fornecerá pelo
menos 50%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo
menos 85% e ainda mais preferivelmente pelo menos 100% da atividade
adjuvante do adjuvante padrão. Preferivelmente o vetor de teste e o vetor
padrão será idêntico, ou pelo menos substancialmente idêntico, à parte das
10 seqüências que codificam o adjuvante/polipeptídeo sob teste.
Como mencionado acima, a construção pode compreender a
seqüência de exon (b) que compreende a seqüência derivada do exon 1 e exon
2 do gene inicial imediato maior de hCMV. Os exons são seqüências
codificadoras, que na natureza são no geral separados pelos introns. No gene
15 inicial imediato maior do hCMV nativo, os exons 1 e 2 são usualmente
separados pelo intron A nativo. Na presente construção quimérica a seqüência
do exon 2 é no geral posicionada 3' da seqüência do exon 1, sem a seqüência
de intron intercalada, de modo que as seqüências do exon 1 e exon 2 são
contíguas.
20 A seqüência do exon (b) pode compreender:
(integral ou parcial);
(i) a seqüência de exon nativa, tipicamente exon 1 e exon 2
(ii) uma variante homóloga de (i) que é funcional; ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
25 A seqüência (i) pode compreender de cerca de 50 a 100% da
seqüência de exon 1 do gene inicial imediato maior do hCMV nativo, por
exemplo, 60 a 90% ou 70 a 80%. Tipicamente pelo menos 50% da seqüência
do exon 1 natural está presente, tal como 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. A
seqüência de exon (b) também compreende pelo menos uma parte da

37
seqüência do exon 2. Na seqüência (i), tipicamente 2 ou mais bases de exon 2
nativo, por exemplo 2 a 9, 2 a 7 ou 3 a 5 bases estão presentes. Até e
incluindo 100% da seqüência de exon 2 natural, por exemplo de 5 a 95%, 20 a
80% ou 40 a 60% da seqüência de exon 2 natural pode estar presente.
5 Tipicamente a variante homóloga tem qualquer um dos comprimentos acima
mencionados para a seqüência nativa.
Preferivelmente (i) compreende a SEQ ID No. 2. Em uma
outra forma de realização preferida (i) compreende os nucleotídeos de 1588 a
1718 da SEQ ID NO: 54. Em uma outra forma de realização preferida (i)
10 compreende os nucleotídeos de 1588 a 1718 da SEQ ID No. 14. Em um outro
exemplo preferido (i) compreende os nucleotídeos de 1684 a 1814 e/ou de
2633 a 2763 da SEQ ID No. 51. Em uma outra forma de realização preferida,
(i) pode compreender os nucleotídeos de 1687 a 1817 e/ou de 3309 a 3439 da
SEQ ID No: 62.
15 Assim, em uma forma de realização particularmente preferida
a seqüência de exon (b) do promotor quimérico compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No.2, a seqüência de
nucleotídeo dos nucleotídeos de 1588 a 1718 da SEQ ID No. 54, nucleotídeos
de 1684 a 1814 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de 2633 a 2763 da SEQ ID
20 No: 61, nucleotídeos de 1687 a 1817 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de
3309 a 3439 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
e/ou
25 (iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
A seqüência de exon adequada (b) pode ser obtida usando
métodos conhecidos. Ver por exemplo, Sambrook et al., supra, para uma
descrição de técnicas usadas para obter e isolar o DNA. A seqüência de gene
inicial imediata maior do hCMV nativo pode ser isolada diretamente de uma

38
amostra do vírus, usando técnicas padrão (ver por exemplo, MacLean, A
(1998) "Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus" em
Herpes Simplex Virus Protocols S. Brown, A Maclean, editores, Humana
Press, Totowa, NJ, pp. 19-26). A seqüência de um gene inicial imediato maior
5 hCMV, incluindo a localização do exon 1 e exon 2, é disponível no Genbank
#M60321, X17403. As seqüências de exon 1 e 2 nativas portanto podem ser
isoladas cortando-se a seqüência de gene maior nativa nos sítios de restrição
apropriados ou pela PCR usando iniciadores de PCR com base na seqüência
conhecida. As seqüências de exon adequadas alternativamente podem ser
10 isoladas a partir de um vetor plasmídeo existente, tal como pWRG7128. As
seqüências de exon também podem ser produzidas sinteticamente, ao invés de
clonadas. As seqüências variantes podem ser facilmente construídas pelas
metodologias de rotina tais como a mutagênese direcionada ao sítio.
No geral a seqüência de exon, quando presente na construção
15 da invenção, realçará a expressão, tipicamente causando realce comparável
para as seqüências de exon 1 e exon 2 nativas (i) mencionadas acima.
A seqüência de exon pode ser ensaiada quanto a
funcionalidade usando o Ensaio de Expressão Comparativa abaixo. A
seqüência de exon de teste é trocada no vetor base no lugar da seqüência de
20 exon já presente. No geral a seqüência de exon é funcional se a seqüência não
anula a expressão, mas preferivelmente aumenta a expressão em pelo menos
um, preferivelmente dois tipos de célula de referência quando comparado com
o vetor base. Tipicamente as células de referência são células HEK293T,
CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As células SSC15 ou B16
25 podem ser usadas. Preferivelmente a expressão aumenta em pelo menos 5%,
10%, 20%, 30% ou 40%. A expressão pode aumentar em qualquer um dos
níveis aqui mencionados. De acordo com este ensaio, uma variante homóloga
funcional (ii) ou fragmento funcional (iii) de seqüência de exon natural (i) é
uma que tipicamente possibilita pelo menos 50% da melhora da expressão

39
fornecida pela seqüência natural. Em alguns exemplos, onde o nível de
expressão é mais baixo do que aquele dado pelo nível base, a diminuição pode
ser qualquer um dos níveis aqui mencionados.
Adicional ou alternativamente, a seqüência de exon pode ser
5 testada no Ensaio de Imunogenicidade Comparativa abaixo. A seqüência de
exon de teste é trocada no vetor base no lugar da seqüência de exon já
presente. A seqüência de exon funcional fornece títulos de anticorpo que são
tipicamente pelo menos tão altos quanto ou mais altos do que aqueles obtidos
pelo vetor base com pelo menos um, preferivelmente dois antígenos.
10 Preferivelmente os títulos de anticorpo são pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%
ou 40% mais altos do que com o vetor base. O aumento pode ser qualquer um
dos níveis aqui mencionados. Os antígenos preferidos são os antígenos
HBsAg, HSV 2gD e flu-M2. Os antígenos especialmente preferidos são os
antígenos da influenza, incluindo qualquer um daqueles aqui mencionados e
15 em particular os antígenos HA, NA e M2. O uso de antígeno HA, um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica de cada um é
especialmente preferido. De acordo com este ensaio, uma variante homóloga
funcional (ii) ou fragmento funcional (iii) da seqüência de exon natural (i) é
uma que tipicamente possibilita os títulos de anticorpo mais altos obtidos pela
20 seqüência natural. Em exemplos onde o nível do título de anticorpo é
levemente mais baixo, a diminuição pode ser qualquer uma dos níveis aqui
mencionados. Os vetores adjuvantes podem ser avaliados em uma maneira
equivalente como debatido acima.
A construção de promotor quimérico compreende o intron
25 heterólogo (c) no lugar da região A do intron nativo do gene inicial imediato
maior de hCMV. Um intron é uma seqüência não codificadora que é unida a
partir do hnRNA transcrito de um gene. Um intron heterólogo é um que não
está presente na seqüência codificadora na natureza.
O intron heterólogo (c) substitui total ou parcialmente, o intron

40
A nativo do gene inicial imediato maior de hCMV. Tipicamente o intron A
nativo é ausente.
No geral o intron heterólogo (c) é 3' da seqüência de exon (b).
Tipicamente o intron heterólogo (c) compreende:
5 (i) um intron natural;
(ii) uma variante homóloga funcional de (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
O intron heterólogo (c) é no geral um intron viral ou
eucariótico. Preferivelmente o intron é um intron de mamífero, em particular
10 um intron não humano, por exemplo um intron de rato pode ser utilizado. Em
alguns exemplos, um intron de galinha pode ser utilizado. Preferivelmente o
intron é um intron A, por exemplo, intron A da insulina de rato, intron A da
queratina de galinha ou intron A da actina cardíaca de galinha. Em uma forma
de realização especialmente preferida o intron é intron A da insulina de rato.
15 Em uma forma de realização preferida o intron heterólogo (c)
compreende uma seqüência selecionada da seqüência de intron A do gene da
insulina de rato, seqüência de intron A do gene da queratina de galinha,
seqüência de intron A do gene da actina cardíaca de galinha, um fragmento
funcional de qualquer um destes ou uma variante funcional de qualquer um
20 dos precedentes.
Tipicamente o intron (c) tem um comprimento de cerca de 50
nucleotídeos a cerca de 1000 nucleotídeos, por exemplo de cerca de 100 a
cerca de 500 nucleotídeos. O intron (c) pode por exemplo, compreender de 50
a 500 nucleotídeos, tal como até 100, 200, 300 ou 400 nucleotídeos.
25 Preferivelmente o intron compreende a seqüência encontrada em torno dos
nucleotídeos de 50 a 133 do intron A da insulina de rato nativa, ou um
homólogo desta seqüência.
Preferivelmente o intron heterólogo (c) é capaz de ser unido a
partir de um RNA transcrito em uma célula hospedeira eucariótica. No geral o

41
intron compreende uma ou mais de uma seqüência doadora (tal como GT),
uma seqüência aceitadora (tal como AG), uma região rica em pirimidina 3' e
uma seqüência em ponto de ramificação. A região rica em pirimidina, se
presente, pode incluir, por exemplo pelo menos 5, 8, 10 ou mais pirimidinas.
5 Preferivelmente o intron compreende pelo menos uma seqüência doadora,
seqüência aceitadora e uma seqüência em ponto de ramificação. Tipicamente
na construção quimérica, o intron (c) compreende seqüências flanqueadoras
que não intron que são derivadas de seqüências de exon encontradas nos
limites intron/exon do intron natural (i). A seqüência de exon flanqueadora
10 pode ser a seqüência de exon nativa ou um homólogo desta seqüência que
retenha substancialmente a mesma atividade como a seqüência nativa, por
exemplo retenha a função de união. Tipicamente de 5 a 10, preferivelmente de
7 a 10 bases de seqüência de exon são incluídas em cada extremidade do
intron.
15 O intron (c) pode ser um intron artificial, contanto que o intron
seja funcional. Por exemplo, um intron recombinante ou quimérico pode ser
usado. Um tal intron pode compreender a seqüência de mais do que um intron
natural.
Tipicamente o intron (c) compreende as seqüências presentes
20 no intron A de hCMV que liga fatores de transcrição ou proteínas reguladoras
ou ao invés de qualquer uma destas seqüências, homólogos destas seqüências
capazes de ligar os mesmos fatores ou proteínas. Tipicamente tais seqüências
ou seus homólogos estão presentes no intron (c) na mesma ordem e/ou
substancialmente no mesmo espaçamento relativo como no intron A de
25 hCMV.
O intron (c) pode compreender uma variante homóloga (ii) em
que a seqüência do intron natural (i) foi modificada para remover um sítio de
restrição interno. Por exemplo, uma variante homóloga de intron A da
insulina de rato pode ser usada em que um sítio Nhel interno foi destruído.

5
42
Preferivelmente, o intron (c) compreende:
(i) A SEQ ID No. 3;
(ii) uma variante homóloga funcional de (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
Em um outro exemplo preferido, (i) pode compreender os
nucleotídeos de 1725 a 1857 da SEQ ID NO: 54 ou os mesmos nucleotídeos
da SEQ ID No. 14. Em uma outra forma de realização preferida (i) pode
compreender os nucleotídeos de 1545 a 1677 e/ou de 2770 a 2902 da SEQ ID
No: 61. Em um outro exemplo preferido, (i) pode compreender os
10 nucleotídeos de 1824 a 1956 e/ou de 3446 a 3578 da SEQ ID No: 62.
insulina de rato compreende:
Em um exemplo preferido, a seqüência de intron A do gene da
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No. 3, a seqüência
de nucleotídeo dos nucleotídeos de 1725 a 1857 da SEQ ID No. 54, os
15 nucleotídeos de 1545 a 1677 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 2770 a
20 e/ou
2902 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 1824 a 1956 da SEQ ID No: 62
e/ou os nucleotídeos de 3446 a 3578 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
A seqüência de intron (c) pode ser obtida usando técnicas de
clonagem padrão. Por exemplo, a seqüência de intron A da insulina de rato
está disponível no GenBank J00748, a seqüência de intron A da queratina de
25 galinha no GenBank J00847 e a seqüência de intron A cardíaco de galinha no
GenBank X02212. A seqüência de intron pode ser isolada a partir de fontes
naturais usando iniciadores com base na seqüência conhecida. A seqüência
pode ser preparada sinteticamente. As seqüências variantes podem ser obtidas
pela mutagênese.

43
Tipicamente uma seqüência de intron funcional, por exemplo
uma variante funcional (ii) ou um fragmento funcional (iii) é uma que tenha
substancialmente a mesma atividade como, e/ou complemente a atividade de
um intron natural (i). Em uma forma de realização a atividade é a atividade de
união.
As seqüências de intron (c) podem ser testadas quanto a
atividade de união usando um ensaio de união de rotina. No geral um
homólogo funcional (ii) ou fragmento funcional (iii) mostrarão pelo menos
50%, por exemplo 60%, 70%, 80%, 90% e até 100% ou mais da eficiência de
10 união do intron natural (i) no ensaio.
No geral a seqüência heteróloga do intron, quando presente na
construção da invenção, realçará a expressão. Tipicamente, uma intron
variante (ii) ou fragmento (iii) causará realce comparável a um intron natural
(i). Em alguns casos, uma diminuição na expressão seria observada incluindo
15 qualquer um dos níveis aqui mencionados.
A funcionalidade da seqüência de intron potencial (c) pode ser
testada usando o Ensaio de Expressão Comparativa abaixo. O intron
heterólogo é trocado no vetor base. No geral a seqüência heteróloga de intron
é funcional se a adição da seqüência aumenta a expressão em pelo menos um,
20 mas preferivelmente dois tipos de célula de referência em 25% ou mais,
comparado com o vetor base. Tipicamente as células de referência são células
HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As células SSC15
ou B16 podem ser usadas. O aumento na expressão pode ser de pelo menos
35%, 45%, 55% ou mais. O aumento pode ser qualquer um dos níveis aqui
25 mencionados. De acordo com este ensaio, uma variante funcional (i) ou
fragmento funcional (ii) de uma seqüência de intron natural (i) é tipicamente
uma que possibilite mais do que 50% da melhora na expressão obtidos pela
seqüência natural. Em casos onde uma diminuição na expressão é observada a
diminuição, por exemplo, pode ser qualquer um dos níveis aqui mencionados.

44
Uma seqüência de intron heterólogo (c), adicional ou
alternativamente pode ser testada quanto a funcionalidade usando o Ensaio de
Imunogenicidade Comparativa abaixo. A seqüência de intron (c) é adicionada
ao vetor base. Uma seqüência de intron (c) funcional fornece títulos de
5 anticorpo que são mais altos do que aqueles obtidos pelo vetor base com pelo
menos um, preferivelmente dois antígenos. Preferivelmente, os títulos de
anticorpo são pelo menos 5 ou 10%, por exemplo 20%, 30% ou 40% mais
altos do que com o vetor base. Os antígenos preferidos são os antígenos
HSV2gD e Flu-M2. Os antígenos especialmente preferidos são os
10 antígenos da influenza, incluindo qualquer um daqueles aqui mencionados e
em particular os antígenos HA, NA e M2. Em particular, o antígeno HA, um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica de cada um pode
ser utilizado. De acordo com este ensaio, uma variante funcional (ii) ou
fragmento funcional (iii) de uma seqüência de intron natural (i) é tipicamente
15 uma que possibilite os títulos de anticorpo mais altos obtidos pela seqüência
natural. Em alguns casos uma diminuição pode ser observada, os níveis, por
exemplo, podem ser qualquer um daqueles aqui mencionados. Os vetores
adjuvantes podem ser avaliados em uma maneira equivalente como aqui
debatido em outra parte.
20 A seqüência de intron heteróloga adequada pode ser obtida
usando técnicas de clonagem padrão. Por exemplo, a seqüência de intron A da
insulina de rato está disponível no GenBank J00748, o intron A de queratina
de galinha no GenBank J00847, e intron A da actina cardíaca de galinha em
X02212. A seqüência de intron pode ser isolada a partir de fontes nativas
25 usando iniciadores com base nos dados de seqüência conhecidos. A seqüência
adequada também pode ser preparada sinteticamente.
As seqüências componentes (a), (b) e (c) podem ser fornecidas
adequadamente ligadas juntas para formar um promotor quimérico usando
técnicas de clonagem ou biologia molecular padrão. Preferivelmente a

45
seqüência de intron (c) é fornecida 3' da seqüência de exon (b). a construção
de promotor quimérica é ligada a um sítio de clonagem, em um tal modo que
o promotor efetuará a expressão de uma seqüência codificadora inserida no
sítio, quando as enzimas apropriadas estão presentes. Os sítios de clonagem
5 adequados, incluindo sítios de clonagem múltipla são conhecidos na técnica,
por exemplo, os sítios de clonagem múltipla pUC19, pBC SK, pBluescript II
KS, cDNA3.1, pSP72, pGEM 7Z. Qualquer sítio de restrição adequado, por
exemplo, pode ser usado como um sítio de clonagem para inserir as
seqüências codificadoras.
10 Em uma forma de realização preferida, o promotor quimérico
utilizado compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No. 4 ou a seqüência
de nucleotídeo dos nucleotídeos de 903 a 1857 da SEQ ID No. 54;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
15 homologia de seqüência de nucleotídeo a (i); e/ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
Em um outro exemplo preferido, o promotor quimérico
utilizado pode ser um que compreende a seqüência da SEQ ID No: 14.
Tipicamente, um ácido nucleico para a inserção (ou inserida)
20 no sítio de clonagem codifica um polipeptídeo terapeuticamente relevante. É
preferido que a seqüência codificadora seja adequada para o uso na
imunização com ácido nucleico ou terapia de gene. O inserto de ácido
nucleico pode assim compreender uma seqüência capaz de fornecer
imunidade, por exemplo uma seqüência imunogênica que evoque uma
25 resposta imune humoral e/ou celular quando liberada a um indivíduo.
Alternativamente, o ácido nucleico pode compreender um ou mais genes que
codifiquem um polipeptídeo terapêutico por exemplo, uma proteína
defeituosa ou que falte de um genoma da célula alvo ou uma proteína não
nativa tendo um efeito biológico ou terapêutico desejado (por exemplo, uma

46
função antiviral). A construção pode codificar um polipeptídeo adjuvante.
Para o tratamento de distúrbios genéticos, os genes funcionais que
correspondem aos genes conhecidos como sendo deficientes no distúrbio
particular podem ser administrados a um indivíduo. Preferivelmente o ácido
5 nucleico é DNA. O ácido nucleico em alguns exemplos pode ser RNA ou
PNA.
Em alguns exemplos um RNA não codificador pode ser
expressado por uma construção da invenção. Assim o vetor pode ter inserido
no sítio de clonagem uma região que pode dar origem a um tal RNA, por
10 exemplo um RNA anti-sentido ou SiRNA. O RNA anti-sentido ou SiRNA,
por exemplo, pode inibir a expressão de qualquer um dos genes aqui
mencionados ou um gene de qualquer um dos patógenos aqui mencionados.
Entretanto, na maioria das formas de realização preferidas, um polipeptídeo é
codificado.
15 Os ácido nucleicos adequados para a inserção incluem aqueles
usados para o tratamento de doenças inflamatórias, autoimune, doenças
crônicas e infecciosas, incluindo distúrbios tais como AIDS, câncer, doenças
neurológicas, doença cardiovascular, hipercolestemia; vários distúrbios
sangüíneos incluindo várias anemias, talassemia e hemofilia; defeitos
20 genéticos tais como fibrose cística, Doença de Gaucher, deficiência na
adenosina desaminase (ADA), enfisema, etc.
As construções na invenção podem ser usadas para tratar ou
prevenir uma condição. As construções podem ser usadas para melhorar uma
condição e/ou eliminar ou reduzir um sintoma particular, ou todos, de um
25 distúrbio. Em um exemplo particularmente preferido as construções podem
ser usadas para vacinar um indivíduo contra um patógeno.
Por exemplo, em métodos para o tratamento de tumores
sólidos, genes que codificam peptídeos tóxicos (isto é, agentes
quimioterapêuticos tais como ricina, toxina da difteria e fator de veneno de

47
cobra), genes supressores de tumor tais como p53, genes que codificam
seqüências de mRNA que são anti-sentido para transformar oncogenes,
peptídeos antineoplásticos tais como fator de necrose de tumor (TNF) e outras
citocinas, ou mutantes transdominantes negativos de oncogenes
5 transformadores, podem ser inseridos para a expressão no local do tumor ou
próximo a este.
Em uma forma de realização preferida uma construção da
invenção pode codificar um polipeptídeo para tratar ou prevenir um câncer.
Em uma forma de realização particularmente preferida uma construção da
10 invenção pode codificar um antígeno de tumor. Os exemplos de antígenos
associados a tumor incluem, mas não são limitados a, antígenos de testículos
cancerosos tais como membros da família MAGE (MAGE 1, 2, 3 etc), NY-
ESO-1 e SSX-2, antígenos de diferenciação tais como tirosinase, gp100, PSA,
Her-2 e CEA, auto antígenos mutados e antígenos de tumor viral tais como E6
15 e/ou E7 de tipos HPV oncogênicos. Outros exemplos de antígenos de tumor
particulares incluem MART-1, Melan-A, p97, beta-HCG, Ga1NAc, MAGE-1,
MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18,
CEA, DDC, P1A, EpCam, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de
melanoma de peso molecular alto, K19, Tyrl, Tyr2, membros da família de
20 gene pMel 17, c-Met, PSM (antígeno de mucina da próstata), PSMA
(antígeno de membrana específico da próstata), proteína secretora da próstata,
alfa-fetoproteína, antígenos CAl25, CA19.9, TAG-72, BRCA-1 e BRCA-2.
Os exemplos de cânceres particulares que o antígeno pode ser
derivado incluem aqueles de cânceres do pulmão, próstata, mama, cólon,
25 ovário, testículo, intestino, melanoma, um linfoma e uma leucemia. As
construções da invenção também podem ser usadas para tratar ou prevenir tais
cânceres.
Similarmente, os ácido nucleicos que codificam polipeptídeos
conhecidos para demonstrar a atividade antiviral e/ou antibacteriana, ou

48
estimular o sistema imune do hospedeiro, também podem ser incluídos. O
ácido nucleico pode codificar uma das várias citocinas (ou fragmentos
funcionais destas), tais como as interleucinas, interferons e fatores
estimuladores de colônia.
5 Em um exemplo preferido, as seqüências codificadoras podem
codificar um antígeno, fragmento imunogênico deste ou variante imunogênica
de cada um. O antígeno em particular pode ser um antígeno de patógeno viral,
bacteriano, parasítico ou fúngico ou um antígeno de tumor. Em um exemplo
preferido, o antígeno é um antígeno viral, um fragmento imunogênico deste
10 ou uma variante imunogênica de cada um.
O ácido nucleico pode codificar um antígeno para o tratamento
ou prevenção de vários condições incluindo mas não limitadas ao câncer,
alergias, toxicidade e infecção por um patógeno tal como, mas não limitado a,
fungo, vírus incluindo os Vírus do Papiloma Humano (1-IPV), HIV,
15 HSV2/HSV1, vírus da influenza (tipos A, B e C), vírus da poliomielite, vírus
RSV, Rinovírus, Rotavírus, vírus da Hepatite A, Grupo do Vírus Norwalk,
Enterovírus, Astrovírus, vírus do sarampo, vírus da Para Influenza, vírus da
caxumba, vírus Varicela-Zoster, Citomegalovírus, vírus Epstein-Barr,
Adenovírus, vírus da Rubéola, vírus tipo I do Linfoma de célula T Humano
20 (HTLV-I), vírus da Hepatite B (HBV), vírus da Hepatite C (HCV), vírus da
Hepatite D, vírus Pox, Marburg e Ebola; bactérias incluindo M tuberculosis,
Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera,
Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella,
Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogaus,
25 Legionella pnumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (tipos A e B),
Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (tipo b), Toxoplama
gondii, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis, e
Actinomycosis; patógenos fúngicos incluindo Candidíase e Aspergilose;
patógenos parasíticos incluindo Tênia, Trematóides, nematelmintos,

49
Amebíase, Giardíase, Cryptosporidium, Schitosoma, Pneumocystis carinii,
Trichomoniasis e Trichinosis. O ácido nucleico também pode ser usado para
fornecer uma resposta imune adequada contra numerosas doenças
veterinárias, tais como doenças do Pé e da Boca, Coronavírus, Pasteurella
5 multocida, Helicobacter, Forteylus vulgaris, Actinobacillus
pleuropneumonia, vírus da diarréia viral bovina (BVDV), Klebsiella
pneumoniae, E. coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e
Bordetella brochiseptica. Assim em um aspecto, as construções de ácido
nucleico da presente invenção podem encontrar uso em uma vacina. As
10 vacinas da invenção podem ser usadas para vacinar contra qualquer um dos
patógenos e condições aqui mencionados. Assim, a invenção fornece uma
composição de vacina que compreende uma construção de ácido nucleico da
invenção ou uma população de construções de ácido nucleico da invenção ou
partículas revestidas da invenção.
15 Em um exemplo preferido uma construção de ácido nucleico
da invenção pode codificar um antígeno de um membro da adenoviridae
(incluindo por exemplo um adenovírus humano), herpesviridae (incluindo por
exemplo HSV-1, HSV-2, EBV, CMV e VZV), papovaviridae (incluindo por
exemplo HPV), poxviridae (incluindo por exemplo varíola e vacínia),
20 parvoviridae (incluindo por exemplo parvovírus B 19), reoviridae (incluindo
por exemplo um rotavírus), coronaviridae (incluindo por exemplo SARS),
flaviviridae (incluindo por exemplo febre amarela, vírus do Nilo Ocidental,
dengue, hepatite C e encefalite transportada por carrapato), picornaviridae
(incluindo pólio, rinovírus, e hepatite A), togaviridae (incluindo por exemplo
25 o vírus da rubéola), filoviridae (incluindo por exemplo Marburg e Ebola),
paramyxoviridae (incluindo por exemplo um vírus da parainfluenza, vírus
sincial respiratrório, cachumba e sarampo), rhabdoviridae (incluindo por
exemplo vírus da raiva), bunyaviridae (incluindo por exemplo vírus Hantaan),
orthomyxoviridae (incluindo por exemplo os vírus da influenza A, B e C),

50
retroviridae (incluindo por exemplo HIV e HTLV) e hepadnaviridae
(incluindo por exemplo hepatite B). Em um outro exemplo preferido o
antígeno pode ser de um patógeno responsável por uma doença veterinária e
em particular pode ser de um patógeno virai, incluindo, por exemplo, um
5 Reovírus (tal como doença do cavalo africano ou vírus da língua azul) e vírus
do Herpes (incluindo herpes eqüino). O antígeno pode ser um do vírus da
Doença do Pé e Boca. Em um outro exemplo preferido o antígeno pode ser de
um vírus da encefalite transportada por carrapato, vírus do dengue, SARS,
vírus do Nilo Ocidental e vírus Hantaan.
10 Em um outro caso preferido o antígeno pode ser de um
retroviradae (e.g. HTLV-I; HTLV-II; ou HIV-I (também conhecido como
HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)). Em particular do HIV e em particular os
isolados HIVIIIb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN; HIV-1CM235,
HIV-1; ou HIV-2. Em uma forma de realização particularmente preferida, o
15 antígeno pode ser um antígeno do vírus da imunodeficiência humana (HW).
Os exemplos de-antígenos -do- MV preferidos incluem, por exemplo, os
antígenos gp120, gp 160 gp41, gag tais como p24gag e p55gag, bem como
proteínas derivadas das regiões pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu ou LTR do
HIV. Em um caso particularmente preferido o antígeno pode ser HIV gp120
20 ou uma porção de HIV gp120. O antígeno pode ser de um vírus da
imunodeficiência, e, por exemplo, pode ser de SIV ou um vírus da
imunodeficiência felina.
Assim, o polipeptídeo codificado pode ser um antígeno, um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica deste. O
25 fragmento ou variante, por exemplo, pode ter qualquer um dos níveis de
homologia, proporção do comprimento do antígeno original, e funcionalidade
aqui especificados e em particular a capacidade para dar origem a uma
resposta imune. Em alguns exemplos, a seqüência codificadora da construção
de ácido nucleico pode ter sido modificada para otimizar a expressão. Por

51
exemplo, o uso de códon pode ser modificado para aquele típico do indivíduo.
Uma seqüência Kozak de consenso para o indivíduo também pode ser
substituído para a seqüência que ocorre naturalmente em torno do códon de
partida.
5 Em uma forma de realização especialmente preferida a
construção de ácido nucleico da invenção compreende uma seqüência
codificadora que codifica um antígeno da influenza, um fragmento
imunogênico deste ou uma variante imunogênica de cada um. O fragmento
e/ou variante podem ter qualquer um dos níveis de homologia de seqüência,
10 comprimentos de fragmento e/ou níveis de funcionalidade aqui especificados.
Em particular, preferivelmente uma seqüência codificadora da construção
codifica um antígeno do vírus da influenza, um fragmento imunogênico de
um antígeno do vírus da influenza ou uma variante imunogênica com 80% de
homologia de aminoácido para qualquer um dos precedentes.
15 Por exemplo o antígeno da influenza pode ser um antígeno NP
(nucleoproteína/ proteína nucleocapsídica), HA (hemaglutinina), NA
(neuraminidase), M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1 e/ou NS2 da influenza ou
pode ser um fragmento ou variante de tais antígenos. Em uma forma de
realização preferida o antígeno codificado pode ser o antígeno HA, NA e/ou
20 M2 da influenza ou um fragmento ou uma variante de tais antígenos. Em um
exemplo especialmente preferido, o antígeno codificado pode ser um antígeno
HA ou um NA ou um fragmento ou variante de tais antígenos e em particular
um antígeno HA ou um fragmento ou variante de um tal antígeno.
Assim, em uma construção especialmente preferida da
25 invenção o antígeno codificado é a hemaglutinina da influenza (HA), um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica com 80% de
homologia de seqüência de aminoácido a cada um. Em um outro exemplo
preferido o antígeno codificado é a Neuraminidase (NA) da influenza, M2,
um fragmento imunogênico de cada um ou uma variante imunogênica com

52
80% de homologia de seqüência de aminoácido a qualquer um dos
precedentes.
Em um exemplo preferido, uma construção da invenção pode
codificar mais do que um polipeptídeo e em particular mais do que um
5 antígeno da influenza, fragmento imunogênico ou variante imunogênica de
cada um. Em exemplos onde mais do que um antígeno deva ser utilizado em
um exemplo preferido os antígenos HA e NA podem ser utilizados juntos ou
um fragmento ou uma variante de tais antígenos.
Em exemplos onde uma construção da invenção expressa mais
10 do que um antígeno da influenza, fragmento imunogênico, ou variante
imunogênica de cada um, pelo menos dois dos antígenos diferentes,
fragmentos ou variantes codificados são do mesmo polipeptídeo da influenza
de cepas diferentes do vírus da influenza.
Em uma forma de realização preferida o antígeno pode ser da
15 cepa H5N1 da influenza e fragmentos imunogênicos deste e variantes de cada
um que retenham a imunogenicidade podem ser utilizados. Em particular, o
antígeno pode ser um da cepa H5N1 ou um fragmento de um tal antígeno.
Em alguns exemplos, o antígeno pode ser um fragmento ou
variante de um polipeptídeo da influenza que ocorra naturalmente. Por
20 exemplo, o antígeno pode corresponder a uma sub-região de um polipeptídeo
da influenza que ocorra naturalmente incluindo qualquer um dos vários
comprimentos de fragmento aqui aludidos. O antígeno pode ser uma variante
de um antígeno da influenza que ocorre naturalmente ou de um fragmento de
um tal antígeno. Preferivelmente tais variantes e/ou fragmentos serão capazes
25 de dar origem a uma resposta imune capaz de reconhecer o antígeno e em
particular o vírus da influenza do qual o fragmento ou variante é derivado.
O antígeno da influenza pode ser de qualquer vírus da
influenza. O antígeno pode ser do vírus da influenza A, B ou C, em particular
da influenza A e/ou B. O antígeno pode ser de uma cepa da influenza variante

53
e em particular uma cepa variante associada com infectividade ou
patogenicidade aumentadas da cepa da influenza. O antígeno, por exemplo,
pode ser de uma das cepas identificadas anualmente pela World Health
Organization para serem usadas em vacinas contra a influenza e em particular
5 pode ser um antígeno identificado pela WHO para tal uso. Em um exemplo
preferido, uma construção de ácido nucleico, população de ácidos nucleicos, a
composição farmacêutica ou vacina da invenção pode codificar um antígeno
de cada uma das três cepas da influenza e em particular as três cepas
identificadas pela WHO ou outras autoridades equivalentes em um ano
10 particular.
Em um exemplo preferido, um ou mais dos antígenos da
influenza codificados podem originar de uma cepa da influenza pandêmica.
Assim, o antígeno da influenza, fragmento ou variante imunogênicos de cada
um podem ser de uma cepa da influenza pandêmica. Uma construção que
15 codifica o antígeno da cepa pandêmica, por exemplo, pode ser administrada,
ou estar presente, por si só. Em outros, a construção também pode codificar,
ou ser administrada com outras construções que codificam, outros antígenos.
Em um caso preferido, um antígeno de uma cepa da influenza pandêmica e
um antígeno de uma cepa da influenza não pandêmica podem ser codificados
20 na mesma ou em construções separadas. Em particular, um antígeno flu
pandêmico e um antígeno de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais cepas da influenza não
pandêmicas podem ser administrados, preferivelmente um antígeno de cada
uma de 3, 4 ou 5 cepas da influenza não pandêmicas pode ser administrado e
ainda mais preferivelmente um antígeno de cada uma de 3 ou 4 cepas da
25 influenza não pandêmicas pode ser administrado.
Em alguns exemplos, a construção pode codificar mais do que
um polipeptídeo. Em particular, uma construção pode codificar mais do que
um antígeno e especialmente mais do que um antígeno da influenza. Por
exemplo, a construção pode expressar dois, três, quatro, cinco, seis ou mais

54
polipeptídeos e em particular antígenos. Em um caso preferido, a construção
pode codificar três, quatro, cinco ou mais polipeptídeos diferentes e em
particular antígenos. Em um caso ainda mais preferido a construção pode
codificar três, quatro ou cinco polipeptídeos diferentes e em particular
5 antígenos. Em um caso ainda mais preferido a construção pode codificar três
ou quatro polipeptídeos diferentes, em particular antígenos e especialmente
antígenos da influenza. Pelo menos um dos antígenos será expressado usando
o promotor quimérico da invenção e preferivelmente todos os antígenos serão
assim expressados. Tipicamente, cada antígeno pode ser expressado a partir
10 de um promotor quimérico da invenção separado. Em alguns casos, um único
promotor pode ser usado para gerar um transcrito que dê origem a um
pluralidade de polipeptídeos. Em alguns exemplos, diversos antígenos podem
ser expressados como uma proteína de fusão.
Em um exemplo preferido, uma construção da invenção
15 codifica um antígeno da influenza pandêmico, fragmento imunogênico deste,
ou variante imunogênica de cada um e um ou mais antígenos da influenza não
pandêmicos, fragmentos imunogênicos destes ou variantes imunogênicas de
cada um.
As construções de ácido nucleico da invenção podem ser
20 utilizadas em uma vacina. Assim, a invenção fornece uma composição de
vacina que compreende uma construção de ácido nucleico, uma população de
construções de ácido nucleico ou partículas carreadoras da invenção
revestidas. A vacina pode compreender um carreador ou excipiente
farmacêuticos adequados. A vacina pode compreender um adjuvante e em
25 particular uma construção adjuvante da invenção. Alternativamente, a vacina
pode ser administrada separada, seqüencial ou simultaneamente com um tal
adjuvante.
Em um exemplo preferido, a invenção fornece uma vacina
multivalente que compreende pelo menos duas construções diferentes da

55
invenção que codificam antígenos diferentes, fragmentos imunogênicos
destes, ou variantes imunogênicas de cada um. O antígeno pode ser qualquer
um daqueles aqui mencionados. Em um exemplo preferido, a invenção
fornece uma vacina multivalente que compreende pelo menos duas
5 construções diferentes da invenção que codificam antígenos diferentes da
influenza, fragmentos imunogênicos destes ou variantes imunogênicas de
cada um. Em exemplos alternativos, uma pluralidade de antígenos pode ser
expressada da mesma construção para fornecer uma vacina multivalente ou
combinações de construções que codificam antígenos isolados e plurais pode
10 ser usada.
Em um outro exemplo preferido, uma vacina multivalente da
invenção pode ser uma que seja uma vacina trivalente, tetravalente ou
pentavalente que codifique três, quatro ou cinco antígenos diferentes,
fragmentos imunogênicos ou variantes imunogênicas e em particular
15 antígenos da influenza, fragmentos ou variantes de cada um.
Em um outro exemplo preferido uma vacina da invenção,
incluindo as vacinas multivalentes, pode compreender uma construção que
codifique um antígeno da influenza pandêmico, fragmento imunogênico deste
ou variante imunogênica de cada um. Uma vacina multivalente pode codificar
20 um antígeno da influenza pandêmico, fragmento imunogênico, ou variante
imunogênica de cada um e também, por exemplo, um antígeno de cada um de
três, quatro ou cinco cepas da influenza diferentes, fragmentos imunogênicos
destas ou variantes imunogênicas de cada uma.
Um adjuvante pode estar presente em uma vacina da invenção
25 ou administrado simultânea, separada ou seqüencialmente com uma vacina da
invenção. Em particular, a invenção fornece uma vacina que compreende pelo
menos uma construção da invenção que codifica uma subunidade de toxina
bacteriana que ribosile ADP, fragmento desta com atividade adjuvante ou
variante desta com atividade adjuvante.

56
As construções de ácido nucleico que expressam mais do que
um antígeno podem ser usadas para gerar vacinas multivalentes, isto é, uma
vacina intencionada a imunizar contra uma pluralidade de antígenos
diferentes e em particular contra antígenos da influenza. Em alguns exemplos,
5 um antígeno da influenza ou antígenos e um antígeno ou antígenos de um
patógeno diferente serão fornecidos. Assim, qualquer uma das construções,
populações de construções de ácido nucleico, vacinas, composições
farmacêuticas e partículas carreadoras revestidas aqui mencionadas podem
compreender uma construção que codifique um antígeno da influenza e a
10 mesma construção, ou construções diferentes, podem codificar antígenos de
patógenos diferentes. As várias construções, populações e vacinas da
influenza multivalentes aqui mencionadas também podem codificar um
antígeno ou antígenos de um patógeno diferente.
Em alguns casos, os antígenos codificados serão do mesmo
15 patógeno. Em alguns exemplos, os antígenos diferentes todos serão do mesmo
vírus. Assim, em um exemplo preferido, todos os antígenos serão antígenos
da influenza. A pluralidade de antígenos pode vir da mesma cepa de vírus da
influenza e conseqüentemente pode ser de polipeptídeos diversos diferentes
do vírus da influenza. Alternativamente, a pluralidade de antígenos pode ser
20 de cepas diferentes de vírus e em particular do vírus da influenza. No caso de
construções e/ou vacinas multivalentes, os antígenos de pelo menos duas e
preferivelmente pelo menos três, quatro ou cinco cepas da influenza
diferentes podem ser escolhidos. Os antígenos, por exemplo, podem ser de 2,
3, 4, 5, 6 ou mais cepas diferentes, em particular antígenos de três, quatro ou
25 cinco cepas podem ser utilizados, e ainda mais preferivelmente de três ou
quatro cepas diferentes.
As vacinas multivalentes podem alternativa ou adicionalmente
compreender uma pluralidade de construções diferentes da invenção com as
construções diferentes que codificam antígenos diferentes. Por exemplo, pelo

57
menos 2, 3, 4, 5, ou 6 construções diferentes podem ser utilizadas. Em um
exemplo particularmente preferido 2, 3, 4 ou 5 construções diferentes e
especialmente três ou quatro construções podem ser utilizadas. Em um
exemplo, onde mais do que uma construção está presente, cada construção
5 codifica um antígeno singular. Em um outro exemplo, as construções podem
codificar 2, 3, 4, 5 ou mais antígenos diferentes, particularmente 3 ou 4
antígenos diferentes.
A invenção também fornece uma população de construções de
ácido nucleico onde a população compreende uma pluralidade de construções
10 da invenção e em particular qualquer uma das combinações mencionadas
acima. Assim, a invenção fornece uma população de construções de ácido
nucleico onde a população compreende pelo menos duas construções
diferentes da invenção. As construções de ácido nucleico podem estar
presentes em qualquer quantidade adequada em relação a cada uma.
15 Tipicamente, cada construção de ácido nucleico está presente em uma relação
em peso de aproximadamente 1:10 entre si.
As populações de construções de ácido nucleico podem ser
usadas para gerar vacinas multivalentes e nos vários métodos da invenção. As
vacinas multivalentes também podem ser multivalentes porque elas
20 compreendem qualquer uma das construções da invenção que codificam mais
do que um antígeno.
Em um exemplo preferido uma população de ácidos nucleicos
é fornecida onde a população compreende pelo menos duas construções
diferentes que codificam antígenos diferentes. Em particular, a invenção
25 fornece uma população que compreende pelo menos duas construções
diferentes que codificam antígenos da influenza, fragmentos imunogênicos
destes ou variantes imunogênicas de cada um. Em uma tal população de
construções de ácido nucleico preferivelmente pelo menos dois dos antígenos
diferentes podem ser do mesmo polipeptídeo da influenza, tal como HA, de

58
cepas da influenza diferentes. Em populações com pelo menos duas
construções diferentes que codificam antígenos da influenza estão presentes,
preferivelmente pelo menos dois dos antígenos, fragmentos ou variantes
diferentes são de polipeptídeos da influenza diferentes podem ser da mesma
5 cepa da influenza ou de uma diferente. Outras populações preferidas incluem
uma população de construções de ácido nucleico onde a população
compreende pelo menos três construções diferentes de modo que cada uma
codifique um antígeno de uma cepa da influenza diferente ou um fragmento
imunogênico ou variante imunogênica.
10 Em um outro exemplo preferido, a invenção fornece uma
população de construções de ácido nucleico que compreende pelo menos uma
construção que codifique um antígeno, fragmento imunogênico deste, ou uma
variante imunogênica de cada um e pelo menos uma construção que codifique
uma subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP, fragmento desta com
15 atividade adjuvante ou variante desta com atividade adjuvante. A ou cada
construção que codifica um antígeno, fragmento imunogênico ou variante
imunogênica está tipicamente presente em uma relação em peso de cerca de
10:1 a 1:10 com respeito à ou cada construção que codifique a subunidade de
toxina bacteriana que ribosila ADP, fragmento deste com atividade adjuvante
20 ou variante desta com atividade adjuvante. A relação em peso pode ser de
cerca de 10:1 a cerca de 1:1, por exemplo de cerca de 9:1.
Nos exemplos onde uma pluralidade de polipeptídeos deva ser
codificada, qualquer combinação de construções que codifique um ou mais
polipeptídeos e uma pluralidade de construções podem ser utilizadas. Por
25 exemplo, onde três antígenos devam ser codificados, uma construção pode
codificar todos os três, uma construção pode codificar dois e uma outra
construção um antígeno, ou três construções cada uma codificando um
antígeno, por exemplo, podem ser utilizadas. Em exemplos onde quatro
antígenos devam ser codificados, estes podem ser codificados por intermédio

59
de quatro, três, duas ou uma construção, com cada construção codificando
um, dois, três, ou quatro antígenos diferentes. Em um exemplo, tão poucas
construções quanto possível podem ser utilizadas, por exemplo apenas uma
ou duas construções podem ser utilizadas. A invenção também fornece
5 populações de ácidos nucleicos e vacinas que compreendem tais combinações
de construções de ácido nucleico.
Em um exemplo preferido, a invenção fornece uma vacina
multivalente ou população de ácidos nucleicos que compreendem uma
construção que codifique um antígeno de um vírus da influenza pandêmico e
10 que também codifique 3, 4 ou 5 e em particular 3 ou 4 antígenos da influenza
não pandêmicos. Os antígenos da influenza não pandêmicos podem ser
codificados na mesma construção como o antígeno da influenza pandêmico
ou em construções diferentes. Em um exemplo preferido os 3, 4 ou 5 outros
antígenos da influenza não pandêmicos podem ser codificados em uma
15 construção ou construções separadas e em particular em uma única construção
separada. em um outro exemplo, a construção que codifica o antígeno
pandêmico também pode codificar um ou mais dos outros antígenos.
Em algumas formas de realização, a construção de ácido
nucleico codificará um adjuvante ou uma construção separada pode assim
20 fazê-lo. Qualquer uma das populações, composições e vacinas da invenção
pode compreender, ou pode ser administrada simultânea, seqüencial ou
separadamente com uma tal construção adjuvante. Assim, as seqüências
inseridas no sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência codificadora
pode codificar um polipeptídeo que pode atuar como um adjuvante.
25 Assim, em um exemplo a invenção compreende uma
construção de ácido nucleico em que a seqüência codificadora codifica uma
subunidade de toxina bacteriana que ribosila ADP, um fragmento desta com
atividade adjuvante ou uma variante de cada um com atividade adjuvante que
também tenha 80% de homologia de aminoácido a qualquer um dos

60
precedentes. Em um exemplo preferido, a construção de ácido nucleico
compreende duas seqüências codificadoras que compreendem uma
subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP, fragmento desta com
atividade adjuvante ou variante de cada um com atividade adjuvante, onde
5 cada uma é ligada a um tal promotor quimérico.
As duas seqüências codificadoras que codificam uma
subunidade de toxina bacteriana que ribosila ADP, fragmento deste com
atividade adjuvante ou variante de cada um com atividade adjuvante pode
estar, em um exemplo, na orientação inversa. em um outro exemplo as duas
10 seqüências codificadoras que codificam uma subunidade de toxina bacteriana
que ribosile ADP, fragmento deste com atividade adjuvante ou variante de
cada um com atividade adjuvante podem estar na mesma orientação. Em
qualquer uma das construções da invenção que compreendem mais do que
uma seqüência codificadora ligada a um promotor quimérico, os promotores
15 podem estar na mesma orientação, em orientações diferentes ou uma mistura
dos dois onde existem três ou mais de tais promotores.
Em um exemplo preferido, o adjuvante codificado em
qualquer uma das construções adjuvantes pode ser uma toxina bacteriana que
ribosile ADP. Estes incluem a toxina da difteria (DT), toxina da coqueluche
20 (PT), toxina do cólera (CT), as toxinas instáveis ao calor da E. coli (LT1 e
LT2), endotoxina A de Pseudomonas, exotoxina S de Pseudomonas,
exoenzima de B. cereus, toxina B. sphaericus, toxinas C2 e C3 de C.
botulinum, exoenzima de C. limosum, bem como as toxinas de C. perfringens,
C. spiriforma e C. difficile e EDIN de Staphylococcus aureus. A maior parte
25 das toxinas bacterianas que ribosilam ADP contêm subunidades A B. e A
construção pode expressar a subunidade A, a subunidade B e/ou ambas as
subunidades.
Em um exemplo preferido, a construção de ácido nucleico
pode codificar a Toxina instável ao calor de E. coli e/ou toxina do cólera e em

61
particular pode expressar a toxina instável ao calor de E. coli. Uma entrada no
GenBank para as seqüências completas dos genes A e B da subunidade CT
podem ser encontrada no Local VIBCTXABB (Acesso No. D30053),
enquanto uma entrada no GenBank para as seqüências completas dos genes A
5 e B da subunidade LT pode ser encontrada no local AB0116677 (Acesso 1\1 12-
invenção pode codificar as subunidades LT A e/ou LT B codificadas pelos
vetores pPJV2012 e/ou pPJV7788 ou um fragmento de uma tal subunidade
que retenha a atividade adjuvante ou uma variante de cada um que retenha a
10 atividade adjuvante. Uma construção da invenção pode compreender as
seqüências codificadoras para as subunidades LT A e/ou LT B dos vetores
pPJV2012 e/ou pPJV7788, um fragmento deste que codifique um
polipeptídeo que tenha atividade adjuvante ou uma variante de cada um que
tenha atividade adjuvante. Em um exemplo preferido uma construção da
15 invenção tem ambas as seqüências codificadoras LT A e LT B.
Em um outro exemplo preferido, a construção pode
compreender a seqüência do vetor PJV2012 fornecida pela SEQ ID No: 61 ou
uma seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta. Em um outro
exemplo, a construção pode compreender a seqüência do vetor PJV7788
20 fornecida pela SEQ ID No: 62 ou uma seqüência com 60% de identidade de
seqüência a esta.
A construção pode expressar uma variante ou fragmento ativos
de um adjuvante particular. A variante ou fragmento serão ditos ser ativos se
eles retêm pelo menos alguma da atividade adjuvante do polipeptídeo a partir
25 do qual são derivados. Assim, a variante e/ou fragmento ainda serão capazes
de realçar uma resposta imune contra um antígeno particular em comparação
com a resposta imune observada quando nenhum adjuvante é administrado
com o antígeno. A seqüência codificada pode ser fragmentos ou variantes
ativos das subunidades CT A e/ou B e em particular podem ser fragmentos
AB011677). Em um exemplo particularmente preferido, uma construção da

62
ativos das subunidades LT A e/ou B. As variantes e fragmentos que podem
ser utilizados, por exemplo, podem ter qualquer um dos comprimentos, níveis
de homologia de seqüência ou outras características aqui mencionadas para
variantes e fragmentos. Estes, por exemplo, podem ser avaliados usando o
5 Ensaio de Imunogenicidade Comparativa usando um antígeno particular e
depois comparando os resultados observados com um vetor base adjuvante e
um vetor variante que codifique um adjuvante. Em uma forma de realização
particularmente preferida a construção pode codificar as subunidades LTA
e/ou LTB e em particular ambas. A construção, em um exemplo
10 particularmente preferido pode ser pPJV2012 ou pPJV7788 as seqüências
para os quais são aqui fornecidas.
Qualquer uma das construções adjuvantes da invenção podem
ser administradas simultânea, seqüencial ou separadamente com um antígeno
ou um ácido nucleico que codifique um antígeno. Em um exemplo preferido
15 uma construção adjuvante da invenção pode ser administrada simultânea,
seqüencial ou separadamente com uma construção da invenção que codifique
um antígeno. As composições e vacinas que compreendem uma construção
adjuvante e uma construção que codifique um antígeno são fornecidas, como
o são carreadores de núcleo revestidos com ambos os tipos de construção
20 fornecidas sobre eles ou misturas de carreadores de núcleo revestidos com
uma construção adjuvante e outros carreadores de núcleo revestidos com uma
construção que codifique um antígeno.
A subunidade de toxina pode ter tido a sua seqüência de sinal
que ocorre naturalmente deletada. As seqüências de sinal naturais das
25 exotoxinas podem ser substituídas por uma seqüência de sinal eucariótica e
em particular pelo peptídeo de sinal de lisozima de galinha. Uma subunidade
de exotoxina que ocorre naturalmente pode ter sido modificada para
destoxificar a toxina. A subunidade A pode ter sido modificada para romper
ou inativar a atividade de ADP-ribosil transferase. Em alguns casos as

63
subunidades de exotoxina podem reter a toxicidade. Assim, em alguns
exemplos as subunidades de exotoxina podem não ter sido destoxificadas.
Assim, as construções adjuvantes da invenção podem ser
usadas para realçar uma resposta imune contra um antígeno particular. A
5 resposta imune realçada pode envolver uma resposta imune de magnitude ou
duração maiores. Isto pode significar que quando o antígeno é re-encontrado a
resposta imune então é maior do que se nenhum adjuvante fosse administrado.
A resposta imune realçada pode resultar em títulos de anticorpo mais altos.
No caso de algumas construções, e em particular aquelas que expressam
10 subunidades de exotoxina, o adjuvante pode resultar em uma resposta celular
aumentada e uma resposta imune equivalente ao auxiliar T 1 contra o
antígeno em questão.
As construções de adjuvante podem ser administradas com,
estar presente em uma vacina com, ou estar presente em uma população de
15 ácidos nucleicos com qualquer uma das outras construções aqui mencionadas.
As construções adjuvantes também podem codificar, ou serem administradas
com uma construção que codifique, um antígeno ou antígeno, incluindo
qualquer um destes aqui mencionados e em particular aqueles que codifiquem
a influenza.
20 Em uma forma de realização, uma construção da invenção
pode codificar um imunoestimulador e/ou um imunossupressor. Em um
exemplo preferido uma construção pode codificar um ou mais de interferon
alfa, beta e/ou gama, interleucina-1, -2, -4, -5, -7, -10, -12, -13, -18, -23 e —24,
GM-CSF, G-CSF, TGF-beta, B7.1, B7.2, CTLA-4, ligando CD40, CD40,
25 OX40, ligando OX40, ligando Flt-3, TRAIL, TRANCE, ligando Fas, TNF
alfa, MCP-1 alfa, PF-4, SLC, MIP-3 alfa, IP-10. Em alguns casos uma tal
construção pode ser administrada simultânea, separada ou seqüencialmente
com qualquer uma de outra construção, em particular uma da invenção e
especialmente uma construção que codifique um antígeno.

64
Uma construção da invenção pode compreender um sinal de
poliadenilação. O ácido nucleico para a inserção no sítio de clonagem pode
compreender uma seqüência de poliadenilação (poliA). Uma tal seqüência
poliA é no geral nativa à seqüência codificadora. Alternativamente, uma
5 seqüência poliA heteróloga pode ser fornecida na construção de ácido
nucleico da invenção. Tipicamente a seqüência poliA será fornecida a jusante
do sítio de clonagem, tal que a mesma esteja operativamente ligada a uma
seqüência codificadora inserida no sítio de clonagem. Qualquer seqüência
poliA adequada pode ser incluída na construção usando técnicas de clonagem
10 padrão. Tais seqüências poliA são conhecidas na técnica.
A seqüência poli A pode ser:
(i) uma seqüência poli A natural;
(ii) uma variante homóloga funcional de (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
15 A seqüência poli A natural (i) pode ser, por exemplo um poli
A do gene da beta globina de coelho, poli A do gene inicial ou tardio do Vírus
do Papiloma Humano (HPV), poli A do gene HSV-2gB, uma poli A do gene
inicial imediata de CMV símio ou poli A do gene tardio gD do HSV. A
seqüência de poliadenilação pode ser derivada de uma seqüência de
20 poliadenilação de um gene selecionado daquele do gene beta-globina de
coelho, genes inicial ou tardio do vírus do papiloma humano (HPV), o gene
HSV-2gB, um gene inicial imediato de CMV símio e gene tardio de HSVgD.
Preferivelmente a seqüência natural poli A (i) é selecionada da
grupo que consiste da SEQ ID No. 10 (GenBank K03256), SEQ ID No. 11
25 (GenBank M16019), SEQ ID No. 12 (GenBank Z80699) e SEQ ID No. 13
(GenBank K02718). Uma seqüência poli A particularmente preferida
compreende os nucleotídeos de 4243 a 4373 da SEQ ID NO: 54 ou é uma
variante homóloga funcional ou fragmento desta. Uma seqüência poli A
preferida também é fornecida pelos nucleotídeos de 2556 a 2686 da SEQ ID

65
No. 14 ou um fragmento funcional ou variante de cada um também podem ser
utilizados.
Em um outro exemplo preferido, um sinal de poliadenilação
utilizado em uma construção da invenção pode compreender:
5 (i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 4243 a 4373 da
SEQ ID No: 54, nucleotídeos de 906 a 1038 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos
de 4375 a 4050 da SEQ ID No: 61, e/ou nucleotídeos de 2463 a 2593 da SEQ
ID No: 62;
10 (ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
e/ou
15 atividade de poliadenilação.
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
No geral, uma seqüência poliA funcional é uma que retêm a
Uma seqüência poli A pode ser testada quanto a capacidade
para realizar a poliadenilação de um transcrito de RNA usando um ensaio de
expressão de rotina. Uma variante homóloga funcional (ii) ou fragmento
funcional (iii) tipicamente mostram pelo menos 50%, por exemplo 60%, 70%
20 80% ou mais da atividade de poli A da seqüência natural poli A no ensaio.
No geral a seqüência poli A, quando presente na construção da
invenção, realçará a expressão, tipicamente causando realce comparável à
seqüência natural poli A (i) mencionada acima.
Uma seqüência poli A também pode ser ensaiada quanto à
25 funcionalidade usando o Ensaio de Expressão Comparativa abaixo. Uma
região poli A de teste é trocada no vetor base no lugar do RBGpA. Uma poli
A de teste é considerada funcional se a poli A não anula a expressão, mas
preferivelmente aumenta a expressão em pelo menos um mas preferivelmente
dois tipos de célula de referência, comparado com o vetor base.

66
Preferivelmente existe um aumento na expressão de pelo menos 5%, 10%,
20%, 30%, 40% ou 50% ou mais. O aumento pode ser qualquer um dos níveis
aqui mencionados. Em alguns casos uma diminuição pode ocorrer, incluindo
qualquer um dos níveis aqui mencionados. Os tipos de célula preferidos são
5 células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As células
SSC15 ou B16 também podem ser utilizadas. De acordo com o ensaio,
tipicamente uma variante homóloga (ii) ou fragmento (iii) são funcionais se
os mesmos possibilitem mais do que 50% da melhora na expressão obtidos
pela seqüência poli A natural (i).
10 Alternativa ou adicionalmente, as seqüências poli A podem ser
testadas quanto a atividade no Ensaio de Imunogenicidade Comparativa
abaixo. A seqüência poli A é trocada no vetor base no lugar de RBGpA. Uma
seqüência poli A funcional fornece títulos de anticorpo que são pelo menos
tão altos quanto ou mais altos do que aqueles obtidos pelo vetor base com
15 pelo menos um, preferivelmente dois antígenos. Preferivelmente os títulos de
anticorpo são pelo menos 5%, 10%, por exemplo 20%, 30% ou 40% mais
altos do que aqueles obtidos com o vetor base. Em alguns exemplos qualquer
um dos aumentos ou diminuições aqui mencionados podem ser observados.
Os antígenos preferidos são HBsAg, HSV2gD e Flu-M2. Os antígenos
20 especialmente preferidos são os antígenos da influenza, incluindo qualquer
um daqueles aqui mencionados e em particular antígenos HA, NA e M2. Em
particular, antígeno HA, ou um fragmento imunogênico deste ou uma variante
imunogênica de cada um pode ser utilizado. Uma variante homóloga (ii) ou
fragmento (iii) são tipicamente funcionais se os mesmos possibilitem os
25 títulos de anticorpo mais altos obtidos pela seqüência natural poli A (i).
A construção de ácido nucleico pode compreender seqüências
de controle adicionais que influenciam a expressão de uma seqüência
codificadora inserida no sítio de clonagem. A construção pode incluir uma
seqüência líder não traduzida. A seqüência é fornecida na construção em

67
ligação operável com o promotor quimérico, e portanto também com uma
seqüência codificadora inserida no sítio de clonagem. O líder fornece um sítio
de início de tradução para a expressão de uma seqüência codificadora inserida
e tipicamente inclui uma seqüência Kozak.
5 Tipicamente a seqüência líder não traduzida compreende:
(i) uma seqüência líder não traduzida natural;
(ii) uma variante homóloga funcional de (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
Tipicamente a seqüência líder compreende seqüências
10 presentes em (i) que ligam componentes de transcrição ou proteínas
reguladoras, ou homólogos destas seqüências que são capazes de ligar os
mesmos componentes ou proteínas. Tipicamente tais seqüências ou seus
homólogos estão presentes na seqüência líder na mesma ordem e/ou
substancialmente no mesmo espaçamento relativo como em (i). No geral a
15 seqüência líder compreende um sítio de início de tradução para a expressão de
uma seqüência codificadora inserida. Tipicamente a seqüência líder inclui
uma seqüência Kozak.
No geral a seqüência líder não traduzida tem um comprimento
de cerca de 10 a cerca de 200 nucleotídeos, por exemplo de cerca de 15 a 150
20 nucleotídeos, preferivelmente de 15 a cerca de 130 nucleotídeos. As
seqüências líder que compreendem, por exemplo, 15, 50, 75 ou 100
nucleotídeos podem ser usadas.
No geral uma seqüência líder não traduzida funcional é uma
que é capaz de fornecer um sítio de início traducional para a expressão de
25 uma seqüência codificadora em ligação operável com a seqüência líder.
Tipicamente uma variante funcional (ii) ou fragmento (iii) têm
substancialmente a mesma atividade como e/ou complementa a atividade da
seqüência natural (i), usualmente na facilitação ou realce da expressão de uma
seqüência codificadora em ligação operável com a seqüência.

68
Uma variante (ii) ou fragmento (iii) podem ser testados quanto
a atividade como uma seqüência líder não traduzida em relação à seqüência
líder natural usando protocolos padrão. Por exemplo, vetores de expressão
podem ser preparados de modo que compreendam uma seqüência líder natural
5 (i) operavelmente ligada à sua seqüência codificadora nativa, e a expressão
monitorada em células hospedeiras adequadas por exemplo, células HEK
293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. As construções de teste
podem ser preparadas em que a seqüência líder natural é substituída por uma
variante ou fragmento homólogos e a expressão é monitorada mais uma vez
10 nas mesmas células hospedeiras. No geral, uma variante (ii) ou fragmento (iii)
fornecem pelo menos 50%, tal como 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% ou mais
da expressão fornecida pela seqüência natural. Em alguns casos qualquer um
dos aumentos ou diminuições na expressão aqui mencionados podem ser
observados.
15 Uma seqüência líder potencial também pode ser testada quanto
a utilidade no Ensaio de Expressão Comparativa abaixo. Uma seqüência líder
de teste é trocada no vetor base no lugar do HBV pre S2 5' UTR. Uma
seqüência líder funcional não anula a expressão mas preferivelmente aumenta
a expressão em pelo menos um mas preferivelmente dois tipos de célula de
20 referência, comparada com o vetor base. No geral a expressão é aumentada
em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%. Os tipos de célula
preferidos são células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de
mamífero. De acordo com o ensaio, uma variante homóloga (ii) ou fragmento
(iii) são tipicamente funcionais se os mesmos possibilitem mais do que 50%
25 da melhora na expressão obtida pela seqüência líder natural.
Alternativa ou adicionalmente, uma seqüência líder pode ser
testada quanto a atividade no Ensaio de Imunogenicidade Comparativa
abaixo. Uma seqüência líder é trocada no vetor base no lugar do HBV pre S2
UTR 5'. Uma seqüência líder funcional fornece títulos de anticorpo que são

69
pelo menos tão altos quanto ou mais altos do que aqueles obtidos pelo vetor
base, com pelo menos um preferivelmente dois antígenos. Preferivelmente os
títulos de anticorpo são pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% mais altos
do que com o vetor base. Os antígenos preferidos são os antígenos HBsAg,
5 HSV 2gD e Flu-M2. Os antígenos especialmente preferidos são antígenos da
influenza, incluindo qualquer um daqueles aqui mencionados e em particular
antígenos HA, NA e M2. Em particular, o antígeno HA, ou um fragmento ou
variante deste podem ser utilizados. Uma variante homóloga (ii) ou fragmento
(iii) é tipicamente funcional se os mesmos possibilitem os títulos de anticorpo
10 mais altos possibilitados pela seqüência líder natural (i). Entretanto, em
alguns exemplos um dos níveis diminuídos de expressão aqui mencionados
podem ser observados.
A seqüência líder adequada pode ser obtida usando protocolos
padrão. Por exemplo, a seqüência de antígeno preS2 de HBV, a seqüência de
15 antígeno e de HBV e a seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV estão
disponíveis no GenBank M54923, M54923 e Z86099 respectivamente. Os
iniciadores podem ser planejados com base nesta seqüência conhecida e
usados para isolar seqüências homólogas. As seqüências líder podem ser
sintetizadas com base nas seqüências conhecidas.
20 No geral a seqüência natural (i) é uma seqüência eucariótica
ou uma seqüência viral, em particular, de um vírus que infecte um eucariota.
Preferivelmente a seqüência natural (i) é a seqüência de HBV ou HSV, por
exemplo a seqüência de antígeno preS2 de HBV, a seqüência de antígeno e de
HBV, ou a seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV. De modo
25 particularmente preferivelmente, (i) é selecionada do grupo que consiste da
SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 e SEQ ID No. 7. Em um outro exemplo
preferido, a seqüência líder não traduzida compreende os nucleotídeos de
1864 a 1984 da SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID No. 14. Os fragmentos funcionais
ou variantes de qualquer uma destas seqüências também podem ser utilizados.

70
Em um exemplo, a seqüência líder não traduzida compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No 5, Seq ID No: 6,
Seq ID No: 7 ou nucleotídeos de 1864 a 1984 da SEQ ID No. 54.
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
5 homologia de seqüência de nucleotídeo com (i); e/ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
Uma tal seqüência líder não traduzida pode ser utilizada em
qualquer uma das construções da invenção.
A construção de ácido nucleico pode compreender uma
10 seqüência realçadora. Uma seqüência realçadora é tipicamente fornecida 3' do
sítio de clonagem, em ligação operável tanto com o promotor quimérico e
uma seqüência codificadora inserida, e atua para aumentar a transcrição da
seqüência inserida.
No geral o realçador compreende:
15 (i) um realçador natural;
(ii) uma variante homóloga funcional de (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
A seqüência realçadora no geral compreende de cerca de 50 a
cerca de 850 nucleotídeos, por exemplo de cerca de 75 a cerca de 500
20 nucleotídeos. Os realçadores de cerca de 100, 200, 300 ou 400 nucleotídeos
podem ser usados.
Tipicamente (i) é um realçador eucariótico ou viral, em
particular, de um vírus que infecta eucariotas. Usualmente tais realçadores
ocorrem na região não traduzida 3' (UTR 3') de um gene. Preferivelmente (i)
25 é um realçador de HBV ou um de CMV, por exemplo um HBs Ag UTR 3' ou
um gene UTR 3' inicial imediato de CMV símio. Preferivelmente (i)
compreende a SEQ ID No. 8 ou SEQ ID No. 9. Preferivelmente (i) pode
compreender os nucleotídeos de 3699 a 4231 da SEQ ID NO: 54. Em um
outro exemplo preferido (i) pode compreender os nucleotídeos de 2012 a

71
2544 da SEQ ID No. 14. Os fragmentos funcionais ou variantes de qualquer
uma destas seqüências podem ser utilizados.
No geral, o realçador na construção compreende seqüências
encontradas em (i) que ligam os componentes de transcrição ou proteínas
5 reguladoras, por exemplo fatores de transcrição, ou homólogos destas
seqüências que ligam os mesmos componentes ou proteínas. Preferivelmente
estas seqüências estão presentes no realçadores na mesma ordem e/ou
substancialmente o mesmo espaçamento relativo como em (i).
No geral um realçador funcional é um que realça ou aumenta a
10 expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, uma seqüência codificadora,
que é operavelmente ligada à seqüência realçadora. Tipicamente uma variante
homóloga funcional (ii) ou fragmento (iii) tem substancialmente a mesma
atividade (por exemplo, realce de expressão) como e/ou complementa a
atividade do realçador natural (i).
15 A atividade realçadora pode ser ensaiada usando um ensaio de
aprisionamento de realçador. Os protocolos são conhecidos na técnica. Uma
variante homóloga funcional (ii) ou fragmento (iii) preferivelmente fornece
pelo menos 50% da atividade realçadora mostrada pelo realçador natural em
tal ensaio. Tipicamente a atividade é pelo menos 60%, 70%, 80%, 90, 100%
20 ou mais da atividade do realçador natural. No geral, uma variante funcional
(ii) ou fragmento (iii) é capaz de complementar a atividade do realçador
natural (i) no ensaio. Qualquer um dos aumentos ou diminuições aqui
aludidos, por exemplo, podem ser observados.
25 compreende:
Em um exemplo preferido, a seqüência realçadora
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No: 8, SEQ ID No:
9, nucleotídeos de 3699 a 4231 da SEQ ID No. 54, nucleotídeos de 3831 a
4363 da SEQ ID No: 61 e/ou de 4507 a 5038 da SEQ ID No: 62.
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de

72
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
e/ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
A utilidade de realçador também pode ser testada usando o
5 Ensaio de Expressão Comparativa apresentada abaixo. Uma seqüência de
teste da UTR 3' é trocada no vetor base. Uma UTR 3' tem utilidade se não
anula a expressão, mas preferivelmente aumenta a expressão em pelo menos
um mais preferivelmente dois tipos de célula de referência comparada com os
vetores base no ensaio. Preferivelmente a expressão é aumentada em pelo
10 menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ou 50%. Os tipos de célula preferidos são
as células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. De
acordo com este ensaio, uma variante homóloga (ii) ou fragmento (iii) são
tipicamente funcionais se os mesmos possibilitem mais do que 50% de
melhora na expressão obtida pela seqüência natural realçadora (i).
15 Adicional ou alternativamente, as seqüências realçadoras
podem ser testadas quanto a atividade no Ensaio de Imunogenicidade
Comparativa abaixo. Uma UTR 3' é trocada no vetor base. Uma seqüência
realçadora funcional fornece títulos de anticorpo que são pelo menos tão altos
quanto ou mais altos do que aqueles obtidos pelo vetor base com pelo menos
20 um, preferivelmente dois antígenos. Preferivelmente os títulos de anticorpo
são pelo menos 5%, 10%, 20%, 30% ou 40% mais altos do que com o vetor
base. Os antígenos preferidos são os antígenos HBsAg, HSV2gD e Flu-M2.
Os antígenos especialmente preferidos são os antígenos da influenza,
incluindo qualquer um daqueles aqui mencionados e em particular os
25 antígenos HA, NA e M2. Em particular, HA pode ser utilizado ou um
fragmento ou variante deste. Uma variante homóloga (ii) ou fragmento (iii)
são funcionais se os mesmos possibilitem o título de anticorpo mais alto
permitido pela seqüência natural realçadora (i).
A seqüência realçadora adequada pode ser obtida usando

73
métodos de clonagem padrão. Por exemplo, a seqüência HBsAg da UTR 3',
ou a seqüência de gene inicial imediata de CMV símio da UTR 3' podem ser
acessadas no GenBank AF143308 e M16019. Os iniciadores podem ser
planejados com base nesta seqüência conhecida e usados para isolar
5 seqüências homólogas.
Em alguns exemplos, onde uma pluralidade de polipeptídeos é
codificada por uma única construção, pode ser desejável omitir seqüências
particulares para reduzir o tamanho da construção. Em particular, uma
construção pode carecer de um realçador e/ou região que codifique uma
10 seqüência líder não traduzida operavelmente ligada à seqüência ou seqüências
que codifiquem o polipeptídeo a ser expressado. Este, por exemplo, pode ser
o caso onde três, quatro, cinco ou mais polipeptídeos são expressados a partir
da mesma construção e particularmente três, quatro ou cinco polipeptídeos
são expressados a partir da mesma construção.
15 Em uma forma de realização preferida, a construção de ácido
nucleico compreende uma seqüência poliA heteróloga, uma seqüência líder
heteróloga e um realçador heterólogo, todos em ligação operável com o
promotor quimérico, para a expressão eficiente de uma seqüência
codificadora inserida.
20 Em um outro aspecto, a presente invenção também fornece
uma construção de ácido nucleico que compreende, ou algumas vezes
consiste essencialmente de:
(i) uma seqüência promotora
(ii) uma seqüência líder não traduzida derivada da seqüência
25 de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de
antígeno tipo 2 gD do HSV; e
(iii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada a (i) e
em que a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência líder

não traduzida.
74
Tipicamente a seqüência promotora (i) é derivada de uma
seqüência promotora virai ou eucariótica. A seqüência promotora pode ser
uma seqüência natural promotora, um homólogo funcional da seqüência
5 natural ou um fragmento funcional de cada um. Os promotores naturais
adequados incluem, por exemplo, o promotor inicial imediato do hCMV, o
promotor do vírus da Pseudo-raiva (PRV) ou promotor do vírus do sarcoma
de Rous (RSV). Preferivelmente o promotor natural compreende a SEQ ID
NO: 52 ou SEQ ID NO: 53.
10 Uma construção promotora artificial, tal como o promotor
quimérico descrito acima, pode ser usado, contanto que o promotor seja
funcional.
Uma seqüência promotora funcional é no geral uma que é
capaz de causar (incluindo iniciar e regular) a transcrição de uma seqüência
15 codificadora operavelmente ligada em uma célula hospedeira adequada.
Uma seqüência promotora pode ser testada quanto a atividade
promotora usando um ensaio de expressão de rotina. Um homólogo ou
fragmento funcionais de uma seqüência natural promotora tipicamente
fornece pelo menos 50%, por exemplo, ou no mínimo 60, 70, 80 ou 90% da
20 expressão fornecida pela seqüência natural em um tal ensaio.
A seqüência líder não traduzida (ii) é como descrita acima. As
seqüências codificadoras (iii) adequadas incluem aquelas já descritas em
relação à construção promotora quimérica. Entretanto, no presente aspecto da
invenção, a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência líder não
25 traduzida. A presente construção tipicamente inclui uma seqüência poli A,
que como já descrito, pode ser nativa à seqüência codificadora, ou fornecida
como uma seqüência poli A heteróloga na construção. As seqüências poli A
adequadas já foram descritas. A construção pode adicionalmente incluir uma
seqüência realçadora 3' da seqüência codificadora. As seqüências realçadoras

75
adequadas são descritas acima em relação à construção promotora quimérica.
Em um outro aspecto, a invenção fornece uma construção de
ácido nucleico que compreende, ou em algumas formas de realização consiste
essencialmente de:
5 (i) uma seqüência promotora;
seqüência promotora (i) e;
seqüência codificadora (ii);
(ii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada à
(iii) uma seqüência realçadora 3' de e operavelmente ligada à
10 em que a seqüência realçadora (iii) é derivada de uma UTR 3'
de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene
inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora (ii) é heteróloga à
seqüência realçadora.
A construção pode incluir uma seqüência líder não traduzida
15 tal como aquela já descrita em relação à construção promotora quimérica.
Tipicamente a seqüência promotora (i) é derivada de uma
seqüência promotora viral ou eucariótica. A seqüência promotora pode ser
uma seqüência promotora natural, um homólogo funcional da seqüência
natural ou um fragmento funcional de cada uma. Os promotores naturais
20 adequados incluem, por exemplo, o promotor inicial imediato do hCMV, o
promotor do vírus da pseudo-raiva (PRV) ou o promotor do vírus do sarcoma
de Rous (RSV). Preferivelmente o promotor natural compreende as SEQ ID
NO: 52 ou SEQ ID NO: 53.
Uma construção promotora artificial, tal como o promotor
25 quimérico descrito acima, pode ser usada, contanto que o promotor seja
funcional.
Uma seqüência promotora funcional é no geral uma que é
capaz de causar (incluindo iniciar e regular) a transcrição de uma seqüência
codificadora operavelmente ligada em uma célula hospedeira adequada.

76
Uma seqüência promotora pode ser testada quanto a atividade
promotora usando um ensaio de expressão de rotina. Os homólogos ou
fragmentos funcionais de uma seqüência promotora natural tipicamente
fornecer pelo menos 50%, por exemplo, ou no mínimo 60, 70, 80 ou 90% ou
5 a expressão fornecida pela seqüência natural em um tal ensaio.
As seqüências codificadoras (ii) adequadas incluem aquelas já
mencionadas em relação à construção promotora quimérica. Entretanto, no
presente aspecto, a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência
realçadora 3'. A seqüência realçadora (iii) da construção é descrita acima. A
10 presente construção também tipicamente inclui uma seqüência poli A. Como
no caso da construção promotora quimérica, esta região poli A pode ser nativa
à seqüência codificadora (ii) ou pode ser fornecida como um componente poli
A heterólogo na construção.
Uma construção de acordo com qualquer aspecto da presente
15 invenção pode compreender uma seqüência de peptídeo de sinal. Assim, uma
construção de ácido nucleico pode compreender uma seqüência de
nucleotídeo que codifique um peptídeo de sinal que seja operavelmente ligado
à seqüência codificadora. A seqüência de peptídeo de sinal é inserida em
ligação operável com o promotor tal que o peptídeo de sinal seja expressado e
20 facilite a secreção de um polipeptídeo codificado pelo seqüência codificadora
também em ligação operável com o promotor.
Tipicamente uma seqüência de peptídeo de sinal codifica um
peptídeo de 10 a 30 aminoácidos por exemplo de 15 a 20 aminoácidos.
Freqüentemente, os aminoácidos são predominantemente hidrofóbicos. Em
25 uma situação típica, um peptídeo de sinal alveja uma cadeia de polipeptídeo
em crescimento que porta o peptídeo de sinal para o retículo endoplasmático
da célula sob expressão. O peptídeo de sinal é separado por clivagem no
retículo endoplasmático, possibilita a secreção do polipeptídeo por intermédio
do complexo de Golgi.

compreender:
5 peptídeo de sinal; ou
peptídeo de sinal.
77
Um peptídeo de sinal para o uso na invenção pode
(i) uma seqüência de peptídeo de sinal natural;
(ii) uma variante homóloga de (i) que retenha a atividade do
(iii) um fragmento de (i) ou (ii) que retenha a atividade do
A seqüência (i) pode ser por exemplo o peptídeo de sinal
ativador de plasminogênio de tecido humano (hTPAsp) (GenBank L00141), o
10 peptídeo de sinal da aprotinina (GenBank AAD13685), peptídeo de sinal da
extensina do tabaco (GenBank JU0465), ou peptídeo de sinal da lisozima de
galinha (GenBank AF410481).
Um peptídeo de sinal, adequado para o uso na presente
invenção, é um que possibilitará a secreção de proteínas heterólogas. Um
15 peptídeo de sinal funcional pode ser identificado em um ensaio que compare o
efeito de um peptídeo de sinal de teste com o efeito de um peptídeo de sinal
conhecido - por exemplo, peptídeo de sinal ativador de plasminogênio de
tecido humano (hTPAsP) - e com o efeito de não ter nenhum peptídeo de
sinal. O Ensaio de Expressão Comparativa apresentado abaixo pode ser usado
20 mas com as seguintes modificações. Os vetores de expressão de secreção são
construídos contendo o vetor base com o peptídeo de sinal de teste, hTPAsp
ou nenhum peptídeo de sinal. As seqüências codificadoras para polipeptídeos
destituídos de seus peptídeos de sinal que ocorrem naturalmente são inseridos
nos vetores e os vetores transformados nas células hospedeiras de referência.
25 Preferivelmente as células são células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou
COS de mamífero. O meio de célula é analisado quanto aos níveis de
expressão de polipeptídeo. Um peptídeo de sinal funcional possibilita a
secreção do polipeptídeo em um nível mais alto do que um vetor que carece
de um peptídeo de sinal com pelo menos um, preferivelmente dois

78
polipeptídeos. Tipicamente, a secreção é 5% mais alta, ou mais
preferivelmente 10% mais alta ou mais, por exemplo 20 ou 50% mais alta ou
mais. Tipicamente, os níveis de secreção são comparáveis àqueles obtidos
usando hTPAsp. Em alguns casos, qualquer um de aumento ou diminuição
5 aqui aludido pode ser observado.
Em um exemplo preferido, o peptídeo de sinal é selecionado
de peptídeo de sinal de ativador de plasminogênio de tecido humano
(hTPAsp), peptídeo de sinal de aprotinina, peptídeo de sinal de extensina do
tabaco e peptídeo de sinal de lisozima de galinha.
10 Possibilitar a secreção de proteína codificada fora de uma
célula em expressão pode ter várias vantagens, em particular onde a proteína é
um antígeno. Por exemplo, a secreção de antígeno aumentada possibilitaria
maior captação de antígeno e resposta pelas células imunes (macrófagos,
células de Langerhan, células B, células T, etc), possibilitaria a capacidade do
15 antígeno para atingir a corrente sangüínea e as células de sinal (citocinas),
possibilitaria que um antígeno encontrasse ligandos celulares e efetuasse uma
função (anticorpos, toxinas tais como a toxina do cólera, LT de E. coli) e
participariam em processos bioquímicos celulares normais (receptores
celulares).
20 Uma construção da invenção pode estar na forma de um
plasmídeo. Uma construção de ácido nucleico da invenção pode estar na
forma de um vetor de expressão plasmídico. Em um exemplo preferido, uma
construção da invenção pode ser uma construção de DNA. Em exemplos
alternativos, a construção pode ser uma construção de RNA ou PNA.
25 O vetor pode depois incluir elementos adicionais, tais como
uma origem de replicação, ou genes seletores. Tais elementos são conhecidos
na técnica e podem ser incluídos usando técnicas padrão. Em uma forma de
realização, o vetor plasmídico tem a seqüência na SEQ ID NO: 14.
Alternativamente, a construção pode ser incluída em uma construção de vetor

viral.
79
Em algumas formas de realização, a construção de ácido
nucleico da invenção pode compreender dois ou mais dos promotores
quiméricos aqui definidos. Assim, a construção pode compreender uma
5 pluralidade de promotores quiméricos e em particular a construção pode ter
dois, três, quatro, cinco ou mais promotores quiméricos. Os promotores
quiméricos preferivelmente serão cada um de modo separadamente operável
ligados a um sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência
codificadora. Assim, a construção pode expressar duas, três, quatro, cinco ou
10 mais seqüências codificadoras. As seqüências codificadoras expressadas
podem ser qualquer uma daquelas aqui especificadas. Em um exemplo
preferido, a construção tem dois promotores quiméricos com cada um tendo
uma seqüência codificadora operavelmente ligada a eles. Em particular, os
dois promotores podem ser transcritos separadamente um do outro. Em outras
15 formas de realização, os promotores podem ser transcritos próximos um do
outro. Assim, os promotores podem estar na orientação invertida ou em
alguns casos na mesma orientação.
Em particular, as construções com dois promotores podem
expressar as subunidades A e B de uma toxina bacteriana que ribosila ADP,
20 incluindo qualquer uma daquelas aqui mencionadas e preferivelmente uma
subunidade A e B de LT. Entretanto, as construções com promotores
múltiplos podem expressar qualquer combinação das seqüências
codificadoras aqui mencionadas. Em um outro aspecto preferido, as
construções com promotores múltiplos podem expressar uma pluralidade de
25 antígenos da influenza, incluindo combinações de qualquer um dos antígenos
da influenza aqui mencionados. Em um outro aspecto preferido, uma
construção pode expressar um antígeno da influenza pandêmico, um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica de cada um e
uma ou mais de qualquer uma das seqüências codificadoras aqui

mencionadas.
80
Em casos onde a construção tem promotores quiméricos
múltiplos cada um pode compreender, ou ser operavelmente ligado a,
qualquer uma das seqüências aqui mencionadas. Em um exemplo
5 particularmente preferido, o intron heterólogo de um ou mais dos promotores
pode ser a seqüência de intron A do gene da insulina de rato. Um ou mais dos
promotores quiméricos também podem preferivelmente compreender a UTR
5' de HBVpre-S2. Um ou mais dos promotores podem compreender a
seqüência de poli adenilação do gene da beta globina de coelho.
10 Em um caso preferido, a construção de ácido nucleico da
invenção pode compreender duas seqüência promotoras quiméricas, com cada
seqüência promotora sendo operavelmente ligada a um sítio de clonagem que
tenha uma seqüência codificadora inserida nele, onde cada promotor
quimérico compreende:
15 (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
imediato maior de hCMV; e
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
20 Com a seqüência codificadora operavelmente ligada a um
promotor quimérico que codifique uma subunidade LTA e a seqüência
codificadora ligada ao outro que codifica uma subunidade LTB. A construção
portanto pode expressar ambas as subunidades. Preferivelmente:
25 intron A do gene da insulina de rato;
- o intron heterólogo de cada promotor é a seqüência de
- a seqüência que codifica cada subunidade LT é
operavelmente ligada à UTR 5' de HBV pre-S2; e/ou
- uma seqüência codificadora de LT é operavelmente ligada
à seqüência de poliadenilação do gene da beta globina de coelho.

81
Em um exemplo especialmente preferido, um ou mais dos
elementos dos vetores pPJV7563 e/ou pPJV1671 podem ser utilizados em
uma construção de ácido nucleico da invenção. Fragmentos funcionais ou
variantes de tais elementos podem ser utilizados. Em particular, qualquer um
5 dos elementos de pPJV1671 especificados na Tabela 3, variantes funcionais
de tais elementos ou fragmentos funcionais de cada um podem ser utilizados.
Similarmente, qualquer um dos elementos de pPJV7563 especificados no
Exemplo 5, variantes funcionais de tais elementos ou fragmentos funcionais
de cada um pode ser utilizado. Preferivelmente, as seqüências de um ou mais
10 daqueles elementos dos próprios pPJV7563 e/ou pPJV1671 podem ser
utilizadas. Em uma outra forma de realização preferida os elementos
correspondentes da construção pPML7789 podem ser utilizados e a
localização destes é indicada em particular na Figura 21 e na listagem de
seqüência aqui fornecida. Em outros exemplos preferidos, os elementos
15 correspondentes dos vetores pPJV2012 e pPJV7788 podem ser utilizados e
em particular aqueles elementos indicados nas Tabelas 6 e 8 podem ser
utilizados. Os Fragmentos funcionais e variantes dos elementos dos vetores
pPML7789, pPJV2012 e pPJV7788 também podem ser utilizados nas
construções da invenção.
20 Em um exemplo preferido, uma construção da invenção
compreende:
No: 14;
25 seqüência de (i),
(i) a seqüência do vetor pPJV7563 fornecida como SEQ ID
(ii) uma seqüência com 60% de identidade de seqüência com a
à parte da inserção da seqüência que codifica o antígeno da influenza, um
fragmento imunogênico ou variante imunogênica na seqüência de (i) ou (ii)
de modo que a mesma seja operavelmente ligada ao promotor quimérico. Em
um exemplo preferido, uma seqüência codificadora de uma tal construção

82
codifica um antígeno HA, uma variante imunogênica deste ou um fragmento
imunogênico de cada um.
Em outros exemplos preferidos da invenção uma construção é
fornecida onde o vetor compreende a seqüência do vetor pPJV1671 fornecido
5 como a SEQ ID No: 54 ou uma seqüência com 60% de identidade de
seqüência a esta. Em um outro exemplo preferido, o vetor compreende a
seqüência do vetor pPML7789 fornecida como a SEQ ID No: 59 ou uma
seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta.
Em um exemplo preferido, o promotor de CMV, a seqüência
10 líder não traduzida, o intron A da insulina de rato, a seqüência líder não
traduzida, o realçador de HBV e/ou a seqüência poli A de coelho de
pPJV7563 e/ou pPJV1671 são utilizados ou uma variante funcional ou
fragmento de tais seqüências. Em um exemplo especialmente preferido o
intron A da insulina de rato e/ou o realçador de HBV de pPJV7563 e/ou
15 pPJV1671 são utilizados ou um fragmento funcional ou variante de tais
seqüências. Em particular, tanto o intron A da insulina de rato quanto o
realçador de HBV são utilizados ou um fragmento funcional ou variante de
tais seqüências são utilizados. Em um outro exemplo preferido as seqüências
correspondentes de pPML7789, pPJV2012, pPJV7788, fragmentos funcionais
20 de tais seqüências ou variantes de tais seqüências podem ser utilizados.
Em exemplos onde a construção codifica diversos
polipeptídeos e em particular antígenos, seqüências particulares podem ser
omitidas para reduzir o tamanho da construção. Por exemplo, as construções
pode carecer de um realçador e/ou uma seqüência líder não traduzida,
25 particularmente onde três, quatro, cinco ou mais antígenos são codificados.
Em outras construções que codificam o mesmo número de antígenos estas
seqüências ainda podem estar presentes.
Em um exemplo particularmente preferido, o vetor pPJV7563
é usado para clonar as seqüências codificadoras desejadas e em particular as

83
seqüências codificadoras para um antígeno tais como, por exemplo, qualquer
um dos antígenos aqui mencionados. Em um exemplo preferido um antígeno
da influenza desejado, fragmento ou variante deste é clonado no vetor. As
modificações em alguns casos podem ser feitas a pPJV7563. Por exemplo, o
5 gene da resistência à canamicina pode ser trocado por um gene alternativo e
em particular um marcador selecionável ou triável alternativo. Qualquer uma
das construções de ácido nucleico da invenção pode compreender marcadores
selecionáveis. A cadeia principal do plasmídeo pUC19 de pPJV7563 pode ser
modificada ou substituída com uma cadeia principal de plasmídeo diferente.
10 Os elementos específicos de pPJV7563, por exemplo, podem ser trocados
com qualquer um dos elementos que satisfazem a mesma função e em
particular variantes funcionais ou fragmentos das seqüências em pPJV7563.
Em alguns exemplos pPJV7563 pode ser modificado pela substituição de um
elemento particular com qualquer um dos elementos aqui aludidos que têm a
15 mesma função como o elemento a ser substituído. As modificações similares
podem ser para pPJV1671 quando este está sendo utilizado. Modificações
similares também podem ser feitas a qualquer um dos vetores aqui
mencionados e em particular pPML7789, pPJV2012 e pPJV7788. As
seqüências codificadoras de pPML7789, pPJV2012 e pPJV7788 podem ser
20 trocadas por qualquer uma das seqüências codificadoras aqui mencionadas.
No caso de pPJV2012 e pPJV7788 uma ou ambas as seqüências codificadoras
do vetor podem ser trocadas.
Em uma forma de realização preferida uma construção de
ácido nucleico da invenção compreende:
25 (i) a seqüência do vetor pPJV7563 fornecida como a SEQ ID
No: 14;
seqüência de (i),
(ii) uma seqüência com 60% de identidade de seqüência à
à parte da inserção das seqüências codificadoras desejadas de modo que elas

84
sejam operavelmente ligadas ao promotor quimérico. Em um exemplo
preferido, as seqüências codificadoras codificam um antígeno. Em particular,
uma seqüência codificadora que codifique um antígeno da influenza, um
fragmento imunogênico ou variante imunogênica é inserido na seqüência de
5 (i) ou (ii) de modo que este esteja operavelmente ligado ao promotor
quimérico.
A construção pode ter 60% de identidade de seqüência à
seqüência de (i) levando-se em conta as seqüências codificadoras inseridas ou
desconsiderando-as. A construção pode ter qualquer um dos valores da
10 identidade de seqüência aqui especificados e em particular, pelo menos 70%,
preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e
ainda mais preferivelmente pelo menos 95%. Em uma forma de realização
preferida a construção é pPJV7563 à parte da inserção das seqüências
codificadoras.
15 As seqüências adicionais podem ser adicionadas à seqüência
de pPJV7563 para gerar outras construções da invenção. Por exemplo, um ou
mais promotores quiméricos da invenção podem ser adicionados juntos com
qualquer uma das seqüências aqui mencionadas que podem estar em ligação
operável a um tal promotor. O sítio de clonagem de pPJV7563 pode ser
20 modificado para possibilitar a clonagem de fragmentos de restrição diferentes
e em particular a clonagem das seqüências codificadoras como fragmentos
diferentes. Modificações similares podem ser feitas a qualquer um dos vetores
aqui mencionados e em particular ao pPML7789, pPJV2012 e pPJV7788.
Em um outro exemplo preferido, uma construção da invenção
25 pode ser fabricada substituindo-se alguma ou todas das seqüências
codificadoras de pPJV1671 que codifique um antígeno com seqüências que
codifiquem um antígeno diferente. Mais uma vez, qualquer uma das
modificações debatidas acima em relação a pPJV7563 também podem ser
feitas para modificar pPJV 1671. Tais modificações também podem ser feitas

85
ao pPML7789. As seqüências codificadoras de pPJV2012 e pPJV7788
também podem ser substituídas com outras seqüências codificadoras
desejadas e em particular aquelas que codifiquem um antígeno.
5 compreende a:
10
Em outros exemplos preferidos, a construção da invenção
- seqüência do vetor pPJV1671 fornecida como a SEQ ID
No: 54 ou uma seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta;
- seqüência do vetor pPML7789 fornecida como a SEQ ID
No: 59 ou uma seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta;
- seqüência do vetor pPJV2012 fornecida pela SEQ ID No:
61 ou uma seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta;
seqüência do vetor pPJV7788 fornecida pela SEQ ID No:
62 ou uma seqüência com 60% de identidade de seqüência a esta.
Em tais exemplos, a construção pode ter qualquer uma das
15 identidades de seqüência percentual aqui especificadas e em particular
aquelas especificadas acima em relação a pPJV7563.
Uma construção da invenção pode compreender qualquer um
dos elementos especificados nas Tabelas aqui e em particular aquelas
especificadas nas Tabelas 3, 6 e 8. Os fragmentos funcionais de tais
20 seqüências e variantes de tais seqüências e seus fragmentos também podem
ser utilizados. Em um exemplo preferido, onde o vetor é um vetor adjuvante
um ou mais dos elementos especificados pelas Tabelas 6 e/ou 8 podem estar
presentes ou um fragmento ou variante de uma tal seqüência.
A invenção também fornece um método para gerar uma
25 construção da invenção que compreende inserir seqüências codificadoras para
um polipeptídeo e em particular um antígeno em um vetor da invenção que
careça de tais seqüências. As seqüências codificadoras podem codificar
qualquer um dos antígenos aqui mencionados. Em um exemplo preferido, a
invenção fornece um tal método que compreende inserir as seqüências

86
codificadoras escolhidas em pPJV7563, pPJV1671 ou uma das versões
modificadas dos vetores aqui debatidos. Estes podem ser inseridos no
pPML7789, pPJV2012 e/ou pPJV7788 e em particular pPML7789. Em
alguns casos uma seqüência codificadora adicional pode ser inserida e/ou uma
5 seqüência codificadora já presente pode ser substituída com uma seqüência
10
15
codificadora diferente.
A invenção também fornece uma seqüência promotora e uma
seqüência codificadora operavelmente ligada ao promotor, onde a construção
compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' de e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
3' de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene
inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à
seqüência realçadora 3'.
20 Os vários elementos do vetor podem ser qualquer um daqueles
aqui especificados. Em um exemplo, a seqüência promotora (i) é selecionada
da seqüência do promotor inicial imediato do hCMV, seqüência promotora do
vírus da pseudo-raiva e seqüência promotora do vírus do sarcoma de Rous.
Em uma outra, o promotor é um dos promotores quiméricos aqui debatidos.
25 Em um outro exemplo, a invenção fornece um promotor
quimérico purificado, isolado onde o promotor quimérico é qualquer um
daqueles aqui definidos.
Uma construção de polinucleotídeo da invenção pode ser
substancialmente isento de ou associado com células ou com material celular.

87
Esta pode estar na forma substancialmente isolada, ou pode estar na forma
substancialmente purificada, caso este em que no geral compreenderá pelo
menos 90% por exemplo, pelo menos 95%, 98% ou 99% do polinucleotídeo
ou massa seca na preparação.
5 As presentes moléculas de ácido nucleico podem ser liberadas
às células hospedeiras adequadas, para a expressão de um polinucleotídeo em
ligação operável com o promotor. Preferivelmente as célula hospedeiras são
células de mamífero, em particular células humanas. Os métodos adequados
para a liberação de ácidos nucleicos a tais células são conhecidos na técnica e
10 incluem, por exemplo, a transfecção mediada com dextrano, precipitação com
fosfato de cálcio, eletroporação e microinjeção direta nos núcleos. Assim, a
invenção fornece uma transformação de célula com um vetor da invenção.
Como descrito acima, uma seqüência de ácido nucleico
codificadora em uma construção pode codificar um polipeptídeo
15 terapeuticamente relevante. As presentes construções portanto podem ser
usadas para a imunização com ácido nucleico ou terapia de gene usando
protocolos de liberação de gene padrão. Os métodos adequados para a
liberação de, gene são conhecidos na técnica, como debatido abaixo. As
moléculas de ácido nucleico podem ser liberadas diretamente a um indivíduo,
20 ou alternativamente, liberadas ex vivo às células derivadas do indivíduo
depois do que as células são reimplantadas no indivíduo. Em um exemplo
preferido, as construções são liberadas diretamente ao indivíduo onde o
polipeptídeo codificado é um antígeno, particularmente um antígeno da
influenza. Qualquer uma das vias de liberação aqui mencionadas podem ser
25 utilizadas e em particular a liberação transdérmica. As construções adjuvantes
da invenção podem ser administradas para realçar uma resposta imune contra
um antígeno e em particular contra um antígeno expressado a partir de uma
construção da invenção.
A invenção também fornece o uso de uma construção de ácido

88
nucleico da invenção ou uma população de construções de ácido nucleico da
invenção ou partículas revestidas da invenção na fabricação de um
medicamento para a imunização com ácido nucleico. O medicamento pode
ser um que deva ser liberado por injeção, liberação de partícula transdérmica,
5 inalação, tópica, oral, intranasal ou transmucosicamente. Em um exemplo
preferido, o medicamento deve ser liberado pela injeção isenta de agulha.
Para o uso em imunização com ácido nucleico ou terapia de
gene, as construções de ácido nucleico podem ser formuladas como
preparações farmacêuticas convencionais. Isto pode ser feito usando as
10 químicas e metodologias da formulação farmacêutica padrão, que estão
disponíveis àqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, composições
contendo uma ou mais seqüência de ácido nucleicos (por exemplo, presentes
em uma forma de vetor adequada tal como um plasmídeo de DNA) pode ser
combinado com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente
15 aceitáveis para fornecer uma preparação líquida. Assim também é fornecida
uma composição farmacêutica que compreende uma construção de ácido
nucleico da invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente
aceitáveis. Em um exemplo preferido uma composição farmacêutica pode
compreender uma pluralidade de construções da invenção ou uma população
20 de construções da invenção incluindo qualquer uma daquelas aqui
mencionadas.
As substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou
emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e outras, podem estar
presentes no excipiente ou veículo. Estes excipientes, veículos e substâncias
25 auxiliares são no geral agentes farmacêuticos que podem ser administrados
sem a toxicidade indevida e que, no caso de composições de vacina não
induzirão uma resposta imune no indivíduos que recebe a composição. Os
excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a,
líquidos tais como água, solução salina, polietileno glicol, ácido hialurônico,

89
glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser
incluídos nesse ponto, por exemplo, os sais de ácido mineral tais como
cloridretos, bromidretos, fosfatos, sulfatos, e outros; e os sais de ácidos
orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e outros.
5 Também é preferido, embora não requerido, que a preparação conterá um
excipiente farmaceuticamente aceitável que serve como um estabilizador,
particularmente para peptídeo, proteína ou outras moléculas semelhantes se
estas devam ser incluídas na composição. Os exemplos de carreadores
adequados que também atuam como estabilizadores para os peptídeos
10 incluem, sem limitação, graus farmacêuticos de dextrose, sacarose, lactose,
trealose, manitol, sorbitol, inositol, dextrano e outros. Outros carreadores
adequados incluem, mais uma vez sem limitação, amido, celulose, fosfatos de
sódio ou cálcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietileno glicóis de
peso molecular alto (PEGs), e combinação destes. Um debate completo de
15 excipientes, veículos e substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis
está disponível em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES
(Mack Pub. Co., N. J. 1991), aqui incorporado por referência.
Certos facilitadores da captação e/ou expressão de ácido
nucleico ("agentes que facilitam a transfecção") também podem ser incluídos
20 nas composições, por exemplo, facilitadores tais como bupivacaína,
cardiotoxina e sacarose, e veículos que facilitam a transfecção tais como
preparações lipossômicas ou lipídicas que são rotineiramente usados para
liberar moléculas de ácido nucleico. os lipossomas aniônicos e neutros são
amplamente disponíveis e bem conhecidos para a liberação de moléculas de
25 ácido nucleico (ver, por exemplo, Liposomes: A Practical Approach, (1990)
RPC New Ed., IRL Press). As preparações lipídicas catiônicas também são
veículos bem conhecidos para o uso na liberação de moléculas de ácido
nucleico. as preparações lipídicas adequadas incluem DOTMA (cloreto de N-
[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio), disponível sob a marca

90
Lipofectin , e DOTAP (1,2-bis(oleilóxi)-3-(trimetilamônio)propano), ver, por
exemplo, Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7416;
Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081; Patente US
1\122 5.283.185 e 5.527.928, e Publicações Internacionais 1\1 2 - WO 90/11092,
5 WO 91/15501 e WO 95/26356. Estes lipídeos catiônicos podem ser
preferivelmente usados em associação com um lipídeo neutro, por exemplo
DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina). Além disso, as composições que
facilitam a transfecção que podem ser adicionadas às preparações de lipídeo
ou lipossoma acima incluem derivados de espermina (ver, por exemplo, a
10 Publicação Internacional WO 93/18759) e compostos permeabilizantes de
membrana tais como GALA, Gramicidina S e sais biliares catiônicos (ver, por
exemplo, a Publicação Internacional NP- WO 93/19768).
Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da presente
invenção podem ser encapsuladas, absorvidas ou associadas com carreadores
15 particulados. Os carreadores particulados adequados incluem aqueles
derivados de polímeros de metacrilato de polimetila, bem como
micropartículas de PLG derivados de poli(lactídeos) e poli(lactídeo-co-
glicolídeos). Ver, por exemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10: 362-368.
Outros sistemas particulados e polímeros também podem ser usados, por
20 exemplo, polímeros tais como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina,
espermidina, bem como conjugados destas moléculas. Em uma forma de
realização preferida, as construções da invenção são precipitadas em
carreadores na presença de um agente de condensação de ácido nucleico e um
agente quelador de íon metálico. Os agentes de condensação preferidos
25 incluem polímeros catiônicos, em particular poliaminas, e em particular uma
poliarginina ou um polilisina. Em um exemplo preferido a poliamina é (Arg)4
ou (Arg)6. Referência pode ser feita às técnicas debatidas na WO
2004/208560 que podem ser utilizadas para gerar partículas carreadoras
revestidas da invenção.

91
Uma vez formuladas, as composições podem ser liberadas a
um indivíduo in vivo usando uma variedade de vias e técnicas conhecidas. Por
exemplo, as preparações líquidas podem ser fornecidas como uma solução,
suspensão ou emulsão injetáveis e administradas por intermédio da injeção
5 parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa usando uma
agulha e seringa convencionais, ou usando um sistema de injeção de jato
líquido. As preparações líquidas também podem ser administradas
topicamente à pele ou tecido mucósico, ou fornecidas como uma pulverização
finamente dividida adequada para a administração respiratória ou pulmonar.
10 Outros modos de administração incluem a administração oral, supositórios, e
técnicas de liberação transdérmica ativas ou passivas.
Alternativamente, as composições podem ser administradas ex
vivo, por exemplo a liberação e reimplantação de células transformadas em
um indivíduo são conhecidas (por exemplo, a transfecção mediada por
15 dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, e microinjeção
direta nos núcleos).
As composições são administradas a um indivíduo em uma
quantidade que seja compatível com a formulação de dosagem e que será
profilática e/ou terapeuticamente eficaz. Uma quantidade eficaz apropriada
20 cairá em uma faixa relativamente ampla mas pode ser facilmente determinada
por uma pessoa de habilidade na técnica pelos testes de rotina. O "Physicians
Desk Reference" e "Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of
Therapeutics" são úteis para os propósitos de determinar a quantidade
necessária. Por exemplo, é no geral esperado que uma dose eficaz do
25 polinucleotídeo cairá dentro de uma faixa de cerca de 0,001 a 1000 In,
preferivelmente de 0,001 a 100 lig, mais preferivelmente de 0,01 a 10,0 lig.
Em alguns exemplos a dose pode ser de 0,1 a 100 pg, preferivelmente de 0,5
a 25 Em casos onde a dose é administrada por intermédio da injeção
isenta de agulha, a dose em alguns casos pode ser de 0,1 a 25 pg,

92
preferivelmente de 0,5 a 10 pg e mais preferivelmente de 1 a 5 pg. Em
particular, a dose pode ser de 4 pg. Em alguns casos, a dose pode ser dada por
intermédio de uma pluralidade de injeções isentas de agulha tais como, por
exemplo, em uma, duas, três, quatro ou cinco injeções isentas de agulha.
5 Em alguns casos depois de uma administração inicial, uma
administração subseqüente da construção pode ser realizada. Em particular, a
seguir de uma imunização inicial um indivíduo pode ser administrado com
uma imunização de reforço. A imunização de reforço pode ser, por exemplo,
uma dose escolhida de qualquer uma daquelas aqui mencionadas. A
10 administração ao indivíduo, por exemplo, pode ser em pelo menos uma
semana, duas semanas, um mês, dois meses ou seis meses depois da
administração inicial.
Em um exemplo, uma construção de ácido nucleico da
invenção pode ser usada em conjunção com uma outra construção de ácido
15 nucleico. Em um caso, a construção de ácido nucleico pode ser uma daquela
aqui descrita para a expressão de um adjuvante e a outra construção pode ser
uma construção que codifique um ou mais antígenos. Em um caso preferido,
ambas as construções podem utilizar os promotores quiméricos da invenção.
Onde dois ou mais agentes são aqui dados eles podem ser em particular
20 administrados separada, simultânea ou seqüencialmente.
No caso onde uma construção expresse um adjuvante e a outra
um antígeno ou antígenos, os antígenos em particular podem ser de HSV,
HPV, ou do vírus da Hepatite (particularmente do vírus da Hepatite B). Os
antígenos em particular podem ser os antígenos HSV ICPO, ICP4, ICP 22
25 e/ICP 27 e preferivelmente todos os quatro. Em um caso especialmente
preferido, os antígenos podem ser um antígeno da influenza incluindo
qualquer um daqueles aqui mencionados e em particular HA, NA e/ou M2 e
em particular HA e NA e especialmente HA. Em casos onde tais antígenos
são expressados, a construção de adjuvante em particular expressará LTA

93
e/ou LTB e em particular ambos. Qualquer uma das construções de adjuvante
aqui mencionadas pode ser utilizada simultânea, separada ou seqüencialmente
com qualquer uma das construções que codifiquem um antígeno.
Qualquer uma de duas entidades da invenção pode ser
5 administrada separada, seqüencial ou simultaneamente. As duas construções
podem ser administradas separada, simultânea ou seqüencialmente. As duas
podem ser administradas na mesma ou em composições diferentes. Em
particular, onde uma construção tem um efeito adjuvante as duas serão
liberadas de modo que um efeito adjuvante seja observado, isto é a resposta
10 imune gerada será maior e/ou por um período mais longo do que se o
adjuvante não fosse administrado com o antígeno. Em um exemplo preferido,
as duas construções podem ser liberadas na mesma composição,
preferivelmente nas mesmas partículas carreadoras. Em outros casos as
partículas carreadoras que carregam uma construção podem ser misturadas
15 com partículas carreadoras que carregam uma outra construção. Qualquer um
de tais esquemas de administração pode ser utilizado para qualquer uma das
combinações de uma pluralidade de construção aqui debatidas.
Em uma forma de realização preferida, as construções de ácido
nucleico da invenção são liberadas para alvejar as células usando uma técnica
20 de liberação mediada por partícula. Os métodos mediados por partícula para a
liberação de preparações de ácido nucleico são conhecidos na técnica.
Assim, em um exemplo preferido a invenção fornece
partículas revestidas que compreendem partículas carreadoras revestidas com
uma construção de ácido nucleico da invenção ou uma população de
25 construções de ácido nucleico da invenção. Em particular, as partículas
revestidas são adequadas para a liberação a partir de um dispositivo de
liberação mediada por partícula.
As partículas para a liberação mediada por partícula podem ser
formadas revestindo-se as presentes moléculas de ácido nucleico sobre

94
partículas carreadoras (por exemplo, carreadores de núcleo) usando uma
variedade de técnicas conhecidas no ramo. As partículas carreadoras são
selecionadas de materiais que tenham uma densidade adequada na faixa de
tamanhos de partícula tipicamente usados para a liberação intracelular a partir
5 de um dispositivo de liberação mediada por partícula. Tipicamente as
10
partículas carreadoras têm um diâmetro de 0,1 a 5 iam, por exemplo de 0,5 a 3
gm, preferivelmente de 1 a 2 gm. Em alguns casos, as partículas podem ter
um diâmetro de 1 a 3 .trri. O tamanho de partícula do carreador ótimo,
naturalmente, dependerá do diâmetro das células alvo.
Usualmente as partículas carreadoras são selecionadas de
metais inertes. Os metais são inertes em que eles não são fisiologicamente
ativos. Para os propósitos da invenção Ferro, Cobalto, Níquel, Cobre, Prata,
Cádmio, Háfnio, Tantálio, Tungstênio, Platina, Ouro, e Aço Inoxidável, por
exemplo podem ser usados e em particular partículas carreadoras de
15 tungstênio, ouro, platina e irídio podem ser usadas. As partículas de
tungstênio e ouro são preferidas. Assim, em um exemplo preferido, a
invenção fornece partículas carreadoras revestidas que são de ouro ou
tungstênio. As partículas de tungstênio são facilmente disponível em
tamanhos médios de 0,5 a 2,0 pm no diâmetro. Embora tais partículas tenha
20 densidade ótima para o uso em métodos de liberação de aceleração de
partícula, e possibilitam revestimento altamente eficiente com DNA, o
tungstênio pode ser potencialmente tóxico para certos tipos de célula. As
partículas de ouro ou ouro microcristalino (por exemplo, pó de ouro A1570,
disponível da Engelhard Corp., East Newark, NJ) também encontrarão uso
25 com os presentes métodos. As partículas de ouro fornecem uniformidade no
tamanho (disponível da Alfa Chemicals em tamanhos de partícula de 1 a 3
gm, ou disponíveis da Degussa, South Plainfield, NJ em uma faixa de
tamanhos de partícula incluindo 0,95 gm) e toxicidade reduzida. O ouro
microcristalino fornece uma distribuição de tamanho de partícula diversa,

95
tipicamente na faixa de 0,1 a 5 gm. Entretanto, a área de superfície irregular
de ouro microcristalino fornece revestimento altamente eficiente com ácidos
nucleicos.
Vários métodos são conhecidos e foram descritos para revestir
5 ou precipitar DNA ou RNA sobre partículas de ouro ou tungstênio. A maioria
de tais métodos no geral combinam uma quantidade pré determinada de ouro
ou tungstênio com DNA plasmídico, CaC1 2 e espermidina. A solução
resultante é turbilhonada continuamente durante o procedimento de
revestimento para garantir uniformidade da mistura de reação. Depois da
10 precipitação do ácido nucleico, as partículas revestidas podem ser transferidas
para membranas adequadas e deixadas secar antes do uso, revestidas em
superfícies de uma amostra módulo ou cassete, ou carregado em um cassete
de liberação para o uso em particular na liberação mediada por instrumentos
de partícula.
15 Como uma alternativa, os polinucleotídeos da invenção podem
ser formulados como uma composição particulada. A formulação pode ser
realizada usando as químicas da formulação farmacêutica padrão descritas
acima. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser combinados com um ou
mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis para fornecer uma
20 composição adequada. As composições formuladas são depois preparadas
como partículas usando técnicas padrão tais como pela evaporação simples
(secagem ao ar), secagem a vácuo, secagem por pulverização, secagem por
congelamento (liofilização), secagem por pulverização-congelamento,
revestimento por pulverização, precipitação, formulação de partícula de fluido
25 super crítico e outros. Se desejado, as partículas resultantes podem ser
densificadas usando as técnicas descritas na Publicação Internacional de
propriedade comum N'WO 97/48485, incorporada aqui por referência.
Estes métodos podem ser usados para se obter partículas de
ácido nucleico tendo um tamanho variando de cerca de 0,01 a cerca de 250

5
96
gm, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 150 gm, e o mais
preferivelmente de cerca de 20 a cerca de 60 Jim; e uma densidade de
partícula variando de cerca de 0,1 a cerca de 25 g/cm 3, e uma densidade
volumétrica de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 g/cm 3, ou maior.
Uma vez formadas, as partículas que compreendem as
moléculas de ácido nucleico podem ser empacotadas em dosagens unitárias
isoladas ou recipientes de dose múltipla. A invenção portanto também fornece
um receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação mediada por
partícula que compreende partículas revestidas da invenção. Tais recipientes
10 podem compreender um recipiente hermeticamente selado incluindo uma
quantidade adequada das partículas. As partículas podem ser embaladas como
uma formulação estéril, e o recipiente hermeticamente selado pode ser assim
planejado para preservar a esterilidade da formulação até o uso na liberação a
um indivíduo. Os recipientes são preferivelmente adaptados para o uso direto
15 em um dispositivo de liberação mediada por partícula. Tipicamente tais
recipientes tomam a forma de cápsulas, bolsas de folha metálica, sachês,
cassetes e outros. Os dispositivos de liberação de partícula também podem ser
fornecidos em uma condição pré carregada contendo uma dosagem adequada
das partículas. O dispositivo pré carregado também pode ser depois pré
20 empacotado em um recipiente hermeticamente selado.
O recipiente em que as partículas são empacotadas pode ser
ainda rotulado para identificar a composição e fornecer informação de
dosagem relevante. Além disso, o recipiente pode ser rotulado com uma
informação na forma prescrita por uma agência governamental, por exemplo,
25 a Food and Drug Administration, em que a informação indica a aprovação
pela agência sob Lei Federal da fabricação, uso ou venda da preparação de
ácido nucleico aí contida para a administração humana.
A invenção também fornece um dispositivo de liberação
mediada por partícula carregado com partículas revestidas da invenção.

97
Preferivelmente, o dispositivo de liberação é uma seringa isenta de agulha. Os
dispositivos de aceleração de partícula, adequados para a liberação mediada
por partícula são conhecidos na técnica. Por exemplo, os dispositivos de
pistola de gene correntes utilizam um explosivo, descarga elétrica ou gasosa
5 para impelir as partículas carreadoras revestidas na direção das células alvo.
As partículas carreadoras revestidas podem ser liberavelmente ligadas a uma
placa carreadora móvel, ou removivelmente ligadas a uma superfície ao longo
da qual uma corrente de gás passa, levantando as partículas da superfície e
acelerando-as na direção do alvo. Um exemplo de um dispositivo de descarga
10 gasosa está descrito na Patente U.S. -9- N5.204.253.
Um dispositivo tipo
explosivo é descrito na Patente U.S. l\P 4.945.050. Um exemplo de um
aparelho de descarga elétrica adequado para o uso aqui é descrito na Patente
U.S. 1\12 5.120.657. Um outro aparelho de descarga elétrica é descrito na
Patente US 1\1 -' 5.149.655. A divulgação de todas estas patentes é aqui
15 incorporada por referência em suas totalidades.
As partículas também podem ser administradas usando um
dispositivo de seringa isenta de agulha, tal como aquele descrito na Patente
U.S. 5.630.796 concedida a Bellhouse et al ("the PowderJect® needleless
syringe device") e na Publicação Internacional IV WO 94/24263, WO
20 96/04947, WO 96/12513 e WO 96/20022, todas as quais são aqui
incorporadas por referência.
Dispositivos tais como aquele descrito na Patente US 1\1 12
contendo, em ordem linear movendo-se do topo para o fundo, um cilindro de
25 gás, um cassete ou pacote de partículas, e um bocal supersônico com um meio
silenciador associado. As partículas são fornecidas dentro de um recipiente
adequado, por exemplo, um cassete formado por duas membranas poliméricas
rupturáveis que são seladas por calor a um espaçador na forma de lavador
para formar uma unidade selada auto-contida. Os materiais de membrana
5.630.796 podem ser fornecidos como um instrumento na forma de caneta

98
podem ser selecionados para se obter um modo específico de abertura e
pressão de estouro que ditam as condições nas quais o fluxo supersônico é
iniciado.
Em operação, o dispositivo é atuado para liberar o gás
5 comprimido do cilindro em uma câmara de expansão dentro do dispositivo. O
gás de liberação contata o cassete de partícula e, quando pressão suficiente é
desenvolvida, repentinamente rompe as membranas do cassete varrendo as
partículas para dentro do bocal supersônico para a liberação subseqüente. O
bocal é planejado para se obter uma velocidade de gás específica e padrão de
10 fluxo para liberar uma quantidade de partículas a uma superfície alvo de área
pré definida. O silenciador é usado para atenuar o ruído produzido pelo fluxo
de gás supersônico.
O sistema de liberação descrito na Publicação Internacional Ni'
WO 96/20022 também usa a energia de uma fonte de gás comprimido para
15 acelerar e liberar composições em pó. Entretanto, é distinguido do sistema da
Patente US NP- 5.630.796 no seu uso de uma onda de choque ao invés de fluxo
de gás para acelerar as partículas. Mais particularmente, um aumento da
pressão instantânea fornecida por uma onda de choque gerada por detrás de
uma cúpula flexível golpeia a parte de trás da cúpula, causando uma eversão
20 súbita da cúpula flexível na direção de uma superfície alvo. Esta eversão
súbita catapulta uma composição em pó (que está localizada no lado externo
da cúpula) em uma velocidade suficiente, deste modo cinética, para penetrar o
tecido alvo, por exemplo, tecido mucósico oral. A composição em pó é
liberada no ponto da eversão da abóbada completa. A abóbada também serve
25 para conter completamente o fluxo de gás em alta pressão que portanto não
entra em contato com o tecido. Porque o gás não é liberado durante esta
operação de liberação, o sistema é inerentemente imóvel. Este planejamento
pode ser usado em outras aplicações fechadas ou de outro modo sensíveis por
exemplo, para liberar partículas aos sítios cirúrgicos minimamente invasivos.

99
As partículas podem ser liberadas in vivo diretamente a um
indivíduo, ou ex vivo às células tiradas de um indivíduo, as células
transformadas sendo depois reimplantadas no indivíduo. Para a liberação in
vivo, a injeção de partícula é tipicamente subcutânea, epidérmica,
5 intradérmica, intramucósica (por exemplo, nasal, retal e/ou vaginalmente),
intraperitonealmente, intravenosamente, oralmente ou intramuscularmente.
Preferivelmente, a liberação é às células terminalmente diferenciadas;
entretanto, as partículas também podem ser liberadas às células não
diferenciadas, ou parcialmente diferenciadas tais como as células tronco do
10 sangue e fibroblastos da pele. Mais preferivelmente, a liberação é às células
epidérmicas da pele.
As partículas são administradas a um indivíduo em uma
maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que
será profilática e/ou terapeuticamente eficaz. Uma "quantidade
15 terapeuticamente eficaz" das presentes composições particuladas será
suficiente para realizar tratamento ou prevenção de sintomas de doença ou
condição, e cairá, em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada
pelos testes de rotina. No geral as partículas são liberadas em uma quantidade
de 0,001 a 1000 iig, mais preferivelmente de 0,01 a 10,0 pg de ácido nucleico
20 por dose. Entretanto, a quantidade exata necessária variará dependendo da
idade e condição geral do indivíduo que é tratado e da seqüência de
nucleotídeo particular selecionada, bem como de outros fatores. Uma
quantidade eficaz apropriada pode ser facilmente determinada através de
testes clínicos. O "Physicians Desk Reference" e "Goodman e Gilman's The
25 Pharmacological Basis of Therapeutics" são úteis para os propósitos de
determinar a quantidade necessária.
Ensaios
Ensaio de Expressão Comparativa
Um teste adequado para utilidade do elemento determina o

100
efeito que o elemento tem sobre a expressão de um polipeptídeo. Em um
exemplo preferido o polipeptídeo pode ser um antígeno da influenza, variante
deste ou fragmento de cada um. A base de comparação para testar a utilidade
dos elementos é um 'vetor base', no geral (a menos que de outro modo
5 mencionado) um plasmídeo com um promotor de hCMV, exon 1 de hCMV, 9
bases de exon 2 de hCMV, a UTR 5' de HBV preS2 e a região de
poliadenilação de beta-globina de coelho, posicionado para direcionar a
expressão de uma seqüência codificadora. Tipicamente, o vetor base é
pPJV7384, pRIV7401, pPJV7450 ou pPJV7533. Em alguns exemplos,
10 qualquer um dos vetores aqui mencionados com os elementos acima
mencionados pode ser utilizado como um vetor base. Em um exemplo,
pPJV1671 pode ser utilizado como um vetor base. pPJV2012, pPJV7788 e
pPML7789 também podem ser utilizados como vetores base.
O vetor básico, introns heterólogos e UTRs 3' são adicionados,
15 ou seqüências promotoras, exons, UTRs 5' e sítios poliA são trocados nos
vetores base para criar vetores de expressão de teste. Qualquer um dos
elementos dos vetores aqui debatidos podem ser trocados com uma seqüência
de teste e comparados com uma seqüência de base. Assim, variantes
funcionais ou fragmentos podem ser testados.
20 Os vetores base e vetores de teste são transformados em
células hospedeiras adequadas e as células analisadas quanto aos níveis de
expressão de polipeptídeo. Preferivelmente, as células hospedeiras de
mamífero são usadas. As células adequados incluem as células HEK 293T,
CHO, HeLa, BHK, 3T3 ou COS de mamífero. Em alguns exemplos, células
25 SSC15 ou B16 podem ser utilizadas.
Tipicamente, um elemento funcional causa a expressão que é
comparável ao vetor base, por exemplo pelo menos a mesma como ou maior.
Preferivelmente a expressão é testada em mais do que um tipo de célula e com
mais do que uma seqüência codificadora. Em alguns exemplos, um elemento

101
funcional pode causar a expressão que é levemente menor do que o vetor base
tal como, por exemplo, pelo menos 25%, em particular pelo menos 50%,
preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%,
ainda mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo
5 menos 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 90% da expressão do
vetor base. Tipicamente, uma variante ou fragmento de um elemento
particular pode ser ainda considerado representar uma variante funcional ou
fragmento de um elemento particular se este mostra tais níveis de expressão.
Entretanto, preferivelmente variante e fragmentos funcionais darão origem à
10 expressão mais alta do que o vetor base como debatido acima. O aumento
percentual, por exemplo, pode ser qualquer uma das porcentagens
mencionadas acima.
Os protocolos experimentais adequados são fornecidos, por
exemplo, nos Exemplos de 1 a 18 abaixo.
15 Ensaio de Imunogenicidade Comparativa
Onde o polipeptídeo a ser expressado é um antígeno, um outro
teste pode ser realizado para identificar elementos de construção funcional ou
particularmente preferidos. Em particular, um tal teste pode ser realizado onde
o antígeno é, por exemplo, um antígeno da influenza, fragmento deste ou
20 variante de cada um. No ensaio, o efeito de um elemento na resposta imune é
determinado depois da liberação de um vetor de expressão a um organismo de
teste. Os níveis de anticorpo contra o antígeno são o modo mais fácil para
julgar a resposta imune. Grupos de camundongos são vacinados com os
vetores base ou vetores de teste construídos como acima. Os soros são
25 coletados depois de uma quantidade apropriada de tempo e analisados quanto
aos níveis de anticorpo.
Este experimento é realizado duas vezes, e os níveis de
anticorpo de todos os grupos em ambos os experimentos são plotados. Os
elementos funcionais tipicamente darão origem a títulos de anticorpo pelo

102
menos tão altos quanto ou mais altos em ambos os experimentos para um
antígeno particular do que o vetor base. Preferivelmente, o resultado será
observado com mais do que um antígeno para demonstrar a extensão de
utilidade do(s) elemento(s) naquele painel de expressão. Em alguns exemplos,
5 um elemento funcional pode dar origem a um título de anticorpo que é
levemente menor do que aquele observado com o vetor base tal como, por
exemplo, pelo menos 25%, em particular pelo menos 50%, preferivelmente
pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais
preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos
10 90% e ainda mais preferivelmente pelo menos 90% do título de anticorpo
observado com o vetor base. Tipicamente, uma variante ou fragmento de um
elemento particular pode ser ainda considerado representar uma variante ou
fragmento funcionais de um elemento particular se estes dão origem a um tal
título de anticorpo. Entretanto, preferivelmente variantes e fragmentos
15 funcionais darão origem a títulos mais altos do que o vetor base como
debatido acima. O aumento percentual, por exemplo, pode ser qualquer uma
das porcentagens mencionadas acima.
Os vetores adjuvantes também podem ser ensaiados pela
comparação de um vetor adjuvante de teste com um padrão adjuvante com
20 ambos sendo administrados com o mesmo antígeno. Uma comparação do
efeito adjuvante de ambos os vetores é feita usando o antígeno administrado
sozinho como um controle. Qualquer um dos vetores adjuvantes aqui
mencionados pode ser utilizado como um padrão. O aumento ou diminuição
percentuais no efeito adjuvante pode ser qualquer um daqueles níveis aqui
25 mencionados.
Os protocolos experimentais adequados são fornecidos por
exemplo, no Exemplo 14 abaixo. Os protocolos adequados também são
descritos nos Exemplos 15 a 18 abaixo.

C. Experimental
103
Abaixo estão os exemplos de formas de realização específicas
para realizar a presente invenção. Os exemplos são oferecidos apenas com
propósitos ilustrativos, e não são intencionados a limitar o escopo da presente
5 invenção de nenhum modo.
Esforços foram feitos para garantir a precisão com respeito aos
números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas alguns
erros e desvios experimentais, naturalmente, devem ser permitidos.
Métodos
10 Condições de PCR Padrão
As condições de PCR padrão usadas para a construção de
vetores foram como segue: 1 x tampão de núcleo de PCR com 1,5 mM de
MgC12 (Promega Corporation, Madison, WI), 0.400 gM cada de cada
iniciador, 200 gM de cada dNTP (USB, Inc, Cleveland, OH), 2,5 g de Taq
15 polimerase (Promega Corporation, Madison, WI), 1,0 ng de DNA padrão,
água até 100 gl, e uma cobertura de óleo mineral (Aldrich Chemical, Inc,
Milwaukee, WI). O termociclador PTC-200 (MJ Research, Inc, Waltham,
MA) foi programado para funcionar na seguinte rotina: 4' @ 95° C, 30 ciclos
de (1' @ 95° C/ 1'15" @ 55° C/ 1' @ 72° C), 10' @ 72° C, contensão a 4° C).
20 Os produtos de amplificação foram removidos da reação de PCR usando-se o
Kit de Purificação de PCR QlAquick (Qiagen Inc, Valencia, CA) antes de
cortar com enzimas de restrição (New England Biolabs, Beverly, MA).
Todos os produtos de PCR foram seqüenciados depois da
clonagem para garantir a fidelidade da amplificação.
25 Exemplo 1. Construção de painéis vetoriais do antígeno de superfície do vírus
da hepatite B (HBsAg)
para a expressão de HBsAg.
Vários vetores de expressão de plasmídeo foram construídos

Materiais de partida
104
(i) pWRG7128 (Roy, M, et al. Vaccine (2001) 19: 764-778),
que contém a seqüência do promotor inicial imediato do hCMV, o primeiro
exon, primeiro intron, e um segundo exon parcial do gene inicial imediato
5 maior de hCMV, a seqüência codificadora HBsAg com regiões flanqueadoras
(seqüência derivada HBV preS2 UTR 5' e elemento de resposta 3' pós
transcricional) e a região de poliadenilação do hormônio do crescimento
bovino (BGHpA)
(ii) pPJV7284, um derivado de pWRG7128 que troca a região
10 de poliadenilação de globina de coelho (RBGpA) por BGHpA.
RBGpA)
(a) pPJV7384 (CMV (nenhum intron), HBV preS2 UTR 5' e
pWRG7128 foi amplificado pela PCR com JF93 (SEQ ID NO:
15) e F110 (SEQ ID NO: 16) usando condições padrão e cortados com SalI e
15 BamHI para isolar um fragmento de inserto contendo o promotor de CMV,
exon 1 e parte da seqüência do exon 2. pAM6 (ATCC, Marmassas, VA) foi
cortado com BamHl e BstXl para isolar um fragmento de inserto que
contivesse a UTR 5' de HBsAg, e aproximadamente 70% da região
codificadora de HBsAg. pJV7284 foi cortado com Sall e BstXl para gerar
20 um fragmento de vetor no qual os dois fragmentos de inserto foram ligados,
resultando em pJV7293.
pWRG7128 foi amplificado pela PCR com iniciadores GW1
(SEQ ID NO: 17) e JF254 (SEQ ID NO: 18) e cortados com BstXl e Bg12
para isolar um fragmento de inserto que contivesse a extremidade 3' da região
25 codificadora de HBsAg. pPJV7293 foi cortado com BstXl e Bg12 para gerar
um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando
no vetor pPJV7384.
preS2 UTR 5' e RBGpA)
(b) pPJV7382 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 3', HBV

105
pPJV7293 foi cortado com Xho 1 e Xbal para gerar um
fragmento de inserto contendo o promotor/exons de CMV e a UTR 5' com a
extremidade 5' da seqüência codificadora de HBsAg. pWRG7128 foi cortado
com Xbal e Bcl 1 para gerar um fragmento de inserto contendo a maioria da
5 seqüência codificadora de HBsAg e a UTR 3'. pPJV7284 foi cortado com
Xho 1 e Bg12 para gerar um fragmento de vetor no qual os dois fragmentos de
inserto foram ligados, resultando em pPJV7382.
5' e RBGpA)
(c) pPJV7389 (CMV (RIA), HBsAg UTR 3', HBV preS2 UTR
10 O intron A da insulina de rato (RIA) foi amplificado pela PCR
sem plasmídeo p5'rIns com iniciadores GW150 (SEQ ID NO: 19) e JF255
(SEQ ID NO: 20). O produto de PCR foi cortado com BamHl e inserido no
pPJV7382 linearizado com BamHl, resultando em pPJV7389.
(d) pPJV7387 (CMV( RIA), HBV preS2 UTR 5' e RBGpA)
15 pPJV7384 foi cortado com BstXl e EcoR1 para gerar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' da região codificadora de
HBsAg e RBGpA. pPJV7389 foi cortado com BstXl e EcoR1 para gerar um
fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no
pPJV7387.
20 Exemplo 2. Construção de painéis vetoriais de antígeno da glicoproteína D do
vírus simples do herpes (HSVgD)
para a expressão de HSVgD.
Materiais de partida
Vários vetores de expressão de plasmídeo foram construídos
25 (a) pPJV7334, um derivado de pWRG7284 (pPJV 7284) que
substitui a seqüência codificadora de HBsAg com um Nhel na matriz
diretamente a jusante do códon de partida ATG, seguido por um fragmento
vedador com um BamHl imediatamente 5' do HBV Enh (Realçador).
(b) pWRG7202, um derivado de pGem3Z (Promega) com um

106
fragmento vedador que possibilite a fusão de uma seqüência codificadora ao
peptídeo de sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (TPA) a
jusante de um sítio Nhel.
5 UTR 5' e RBGpA)
(a) pPJV7392(CMV (intron nativo), HBsAg UTR 3', HBsAg
A região codificadora para HSV2 gD foi amplificada pela PCR
sem um estoque de DNA virai (Advanced Biotech, Inc, Columbia, MD)
usando iniciadores DS1 (SEQ ID NO: 21) e DA1 (SEQ ID NO: 22) e foi
cortado com Nhel e EcoR1 para gerar um fragmento de inserto. pWRG7202
10 foi cortado com Nhel e EcoR1 para gerar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando em pPJV7391.
pPJV7391 foi cortado com Nhel e Bg12 para gerar um
fragmento de inserto contendo a seqüência codificadora de HSV2 gD.
pPJV7334 foi cortado com Nhel e BamHl para gerar um fragmento de vetor
15 no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7392. Este vetor
consiste dos seguintes elementos de expressão: a seqüência do promotor
inicial imediato do hCMV, o primeiro exon, primeiro intron, e um segundo
exon parcial do gene inicial imediato maior de hCMV, a UTR 5' de HBsAg, a
seqüência codificadora para o gene HSV2 gD, a UTR 3' de HBsAg, e
20 RBGpA.
UTR 5' e RBGpA)
(b) pPJV7399 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 3' HBsAg
Uma versão isenta de intron de pPJV7392 foi construída como
segue. pPJV7384 foi cortado com HindIII e Ndel para isolar um fragmento
25 de inserto contendo as extremidades 5' do gene de resistência à canamicina e
o promotor de CMV. pPJV7384 foi cortado com Ndel e Sspl para isolar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, o
exon1/2 de CMV e a extremidade 5' da UTR 5' de HBsAg. Estes fragmentos
de inserto foram inseridos no pPJV7392 a partir do qual que o fragmento

107
Hind3-Sspl foi removido, resultando no pPJV7399.
RBGpA)
(c) pPJV7400 (CMV(RIA), HBsAg UTR 3', HBsAg UTR 5' e
Uma versão RIA de pPJV7392 foi construída como segue.
5 pPJV7384 foi cortado com HindIII e Nde 1 para isolar um fragmento de
inserto contendo as extremidades 5' do gene de resistência à canamicina e
promotor de CMV. pPJV7387 foi cortado com Nde 1 e Ssp 1 para isolar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, o
exon1/2(parcial) de CMV, RIA, e a extremidade 5' da UTR 5' de HBsAg.
10 Estes fragmentos de inserto foram inseridos no pPJV7392 a partir do qual o
fragmento Hind3-Sspl foi removido, resultando no pPJV7400.
RBGpA)
(d) pPJV7401 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 5' e
Uma versão isenta de UTR 3' de pPJV7399 foi construída
15 como segue. pPJV7391 foi cortado com Bsp120I e Bg12 para isolar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do gene HSV2 gD.
pPJV7284 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar o sinal RBGpA. Estes
fragmentos de inserto foram inseridos no pPJV7399 a partir do qual o
fragmento Bsp120I-EcoR1 foi removido, resultando no pPJV7401.
20 (e) pPJV7402 (CMV(RIA), HBsAg UTR 5' e RBGpA)
Uma versão isenta de UTR 3' de pPJV7400 foi construída
como segue. pPJV7391 foi cortado com Bsp120I e Bg12 para isolar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do gene HSV2 gD.
pPJV7284 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar o sinal RBGpA. Estes
25 fragmentos de inserto foram ligados no pPJV7400 a partir do qual o
fragmento Bsp120I-EcoR1 foi removido, resultando no pPJV7402.
Exemplo 3. Construção de painéis vetoriais de antígeno Flu M2
(a) pPJV7450 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 5' e RBGpA)
Uma região codificadora para Flu M2 foi amplificada pela

108
PCR sem plasmídeo pFL-M2 (Joel Haynes, pPJV) usando os iniciadores
JF301 (SEQ ID NO: 23) e JF302 (SEQ ID NO: 24) e foi cortado com Nhel e
Bg12 para gerar um fragmento de inserto. pPJV7401 foi cortado com Nhel e
Bg12 para gerar um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi
5 ligado, resultando no pPJV7450.
(b) pPJV7452 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 3', HBsAg UTR 5' e
RBGpA)
Um fragmento UTR 3' foi amplificado pela PCR sem
pPJV7389 com os iniciadores JF84 (SEQ ID NO: 25) e JF225 (SEQ ID NO:
10 26) foi cortado com Bsp120I, enchido com T4 DNA polimerase, e ligado com
ligadores Bg12 (cat# 1036, New England Biolabs). O fragmento foi depois
cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar um fragmento de inserto contendo a
UTR 3' de HBsAg e a região RBGpA. pPJV7450 foi cortado com Bg12 e
EcoR1 para gerar um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi
15 ligado, resultando no pPJV7452
(c) pPJV7458 (CMV(RIA) HBsAg UTR 5' e RBGpA)
Uma versão de pPJV7450 contendo o RIA foi construído
como segue: pPJV7389 foi cortado com BamHl para isolar um fragmento de
inserto contendo RIA. pPJV7450 foi cortado com BamHl para gerar um
20 fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no
pPJV7458.
(d) pPJV7468 (CMV(RIA), HBsAg UTR 3',HBsAg UTR 5' e RBGpA)
Uma versão de pPJV7458 contendo a UTR 3' de HBsAg foi
construída como segue: pPJV7452 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para
25 produzir um fragmento de inserto contendo a UTR 3' de HBsAg e RBGpA.
pPJV7458 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para gerar um fragmento de vetor
no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7468.
Exemplo 4. Construção de painéis vetoriais de Beta-gal
(a) pPJV7488 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 3', HBsAg UTR 5' e

RBGpA)
109
CMV-beta (Clontech) foi amplificado pela PCR com
iniciadores JF335 (SEQ ID NO: 27) e JF336 (SEQ ID NO: 28) e cortado com
Nhel e Bg12 para isolar um fragmento de inserto que codifique a beta-
5 galactosidase. pPJV7452 foi cortado com Nhe 1 e Bg12 para gerar um
fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no
pPJV7488.
(b) pPJV7533 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 5' e RBGpA)
pPJV7450 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar um
10 fragmento de inserto contendo o RBGpA. pPJV7488 foi cortado com Bg12 e
EcoR1 para gerar um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi
ligado, resultando no pPJV7533.
(c) pPJV7551(CMV(RIA/NheI), HBsAg UTR 3', HBsAg UTR 5' e RBGpA)
pPJV7530 (ver o Exemplo 5) foi cortado com Xhol e BamHl
15 para isolar um fragmento de inserto contendo o promotor de CMV até o RIA.
pPJV7488 foi cortado com Xhol e BamHl para gerar um fragmento de vetor
no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7551.
(d) pPJV7552(CMV(RIA/NheI), HBsAg UTR 5' e RBGpA)
pPJV7530 foi cortado com Xhol e BamHl para isolar um
20 fragmento de inserto contendo o promotor de CMV até o RIA. pPJV7533 foi
cortado com Xhol e BamHl para gerar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7552.
Exemplo 5. Construção da Expressão de pPJV (pPJV7563)
(a) pPJV7496
25 pPJV7389 foi amplificado pela PCR com os iniciadores JF357
(SEQ ID NO: 29) e JF365 (SEQ ID NO: 30), tratado com T4 DNA
polimerase para tornar as extremidades abruptas, e cortado com Sal 1 para
isolar um fragmento de inserto que codifique a resistência à canamicina.
pPJV7389 foi cortado com Aval, tratado com T4 DNA polimerase para

110
tornar as extremidades abruptas, e cortado com Sal l para isolar um fragmento
de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7496.
(b) pPJV7530
pPJV7389 foi amplificado pela PCR com iniciadores JF393
5 (SEQ ID NO: 31) e JF406 (SEQ ID NO: 32) e cortado com Bg12 e BamHl
para isolar um fragmento de inserto contendo o RIA destituído de um sítio
Nhel interno. pPJV7496 foi cortado com BamHl para preparar um fragmento
de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7530.
(c) pPJV7549
10 pPJV7468 foi cortado com BamHl e EcoR5 para isolar um
fragmento de inserto contendo M2 e parte do HBV 3' ENH. pPJV7530 foi
cortado com BamHl e EcoR5 para preparar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7549.
(d) pPJV7563
15 Os iniciadores JF256 (SEQ ID NO: 33) e JF257 (SEQ ID NO:
34) foram recozidos para preparar um fragmento de inserto consistindo de um
sítio de clonagem múltiplo. pPJV7549 foi cortado por Nhel e Bg12 para
preparar um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado,
resultando no pPJV7563. Um mapa plasmídico de pPJV7563 é fornecido na
20 Figura 12. A composição base para o plasmídeo pPJV7563 é fornecida na
Figura 13. Os componentes e a sua posição no plasmídeo pPJV7563 são como
segue:
1-44 Seqüências de Transposon 903
45-860 Seqüência codificadora da resistência à canamicina do
25 Transposon 903
861-896 Seqüências do Transposon 903
897-902 sítio Sall
903-1587 Promotor CMV
1588-1718 seqüência líder não traduzida do gene imediato inicial de CMV

111
1719-1724 Fusão das enzimas de restrição BamH1 e BglII
1725-1857 Intron A da insulina de rato
1858-1863 sítio BamH1
1864-1984 antígeno de superfície do líder não traduzido 5'
5 1985-1993 Códon de partida sintético/ sítio de clonagem Nhel
1994-2011 Sítios de clonagem sintéticos
2012-2544 Realçador do HBV
2545-2555 Seqüência de vetor velha. Nenhum acerto contra as bases de
dados da NCBI
10 2556-2686 Região de poliadenilação da beta-globina de coelho
2687-3759 Seqüência de vetor pUC19
Exemplo 6. Construção de Painéis de Expressão de Peptídeo de Sinal usando
a Fosfatase Alcalina Secretada Humana (SEAP) e Fragmento Fc de IgG
Humano (hFc) como Antígenos Modelo
15 (i) pPJV7507 (hTPAsp e SEAP)
pSEAP-Basic (Clontech) foi amplificado pela PCR com
iniciadores JF320 (SEQ ID NO: 35) e JF321 (SEQ ID NO: 36) depois cortado
com Nhel e Bg12 para isolar um fragmento de inserto consistindo do
fragmento SEAP humano. pPJV7079 (Macklin, et al.) foi cortado com Nhel e
20 Bg12 para preparar um fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi
ligado, resultando no pPJV7507.
(ii) pPJV7508 (hTPAsp e hFc)
O DNA humano foi amplificado pela PCR com iniciadores
JF386 (SEQ ID NO: 37) e FcAS (SEQ ID NO: 38) depois cortado com Nhel
25 e Bg12 para isolar um fragmento de inserto consistindo do fragmento Fc de
IgG humana. pPJV7079 foi cortado com Nhel e Bg12 para preparar um
fragmento de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no
pPJV7508.
(iii) Preparação da Seqüência Codificadora do Peptídeo de Sinal de

Aprotinina
112
O oligo JF354 sintético (SEQ ID NO: 39) foi amplificado pela
PCR com iniciadores JF355 (SEQ ID NO: 40) e JF356 (SEQ ID NO: 41) para
gerar a seqüência codificadora para o peptídeo de sinal de aprotinina.
5 (iv) Preparação de Seqüência Codificadora do Peptídeo de Sinal da Extensina
do Tabaco
O oligo JF348 sintético (SEQ ID NO: 42) foi amplificado pela
PCR com iniciadores JF349 (SEQ ID NO: 43) e JF350 (SEQ ID NO: 44) para
gerar a seqüência codificadora para o peptídeo de sinal da extensina de
10 tabaco.
(v) Preparação da Seqüência Codificadora do Peptídeo de Sinal da Lisozima
de Galinha
O oligo JF351 sintético (SEQ ID NO: 45) foi amplificado pela
PCR com iniciadores JF352 (SEQ ID NO: 46) e JF353 (SEQ ID NO: 47) para
15 gerar a seqüência codificadora para o peptídeo de sinal da lisozima de
galinha.
(a) Painéis de Peptídeo de Sinal do Antígeno Flu M2
aprotinina s.p.)
pPJV7499 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA.
20 pPJV7497 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
extensina do tabaco s.p.)
lisozima de galinha s.p.)
PPJV7500 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
As seqüências codificadoras para os peptídeos de sinal foram
25 cortadas com Spel e Nhel para isolar fragmentos de inserto. pPJV7450 foi
cortado com Nhe 1 para preparar um fragmento de vetor no qual os
fragmentos de inserto foram ligados, resultando no pPJV7499 (aprotinina),
pPJV7497 (extensina do tabaco), e pPJV7500 (lisozima de galinha).
(b) Painéis de peptídeo de sinal de SEAP

5
10
aprotinina s.p.)
extensina do tabaco sp.)
lisozima de galinha s.p.)
113
pPJV7513 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
pPJV7512 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
pPJV7510 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
pPJV7499, 7497, e 7500 foram cortados com Xhol e Nhel
para isolar um fragmento de inserto consistindo do promotor de CMV até a
seqüência de peptídeo de sinal codificadora dos plasmídeos. pPJV7507 foi
cortado com Xhol e Nhel para preparar um fragmento de vetor no qual os
fragmentos de inserto foram ligados, resultando no pPJV7513 (aprotinina),
pPJV7512 (extensina do tabaco), e pPJV7510 (lisozima de galinha).
(c) Painéis de peptídeo de sinal de hFc
15 aprotinina s.p.)
extensina do tabaco s.p.)
pPJV7524 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
pPJV7525 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
pPJV7526 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA,
peptídeo de sinal da lisozima de galinha)
20 pPJV7499, 7497, e 7500 foram cortados com Xho 1 e Nhel
para isolar um fragmento de inserto consistindo do promotor de CMV até a
seqüência de peptídeo de sinal codificadora dos plasmídeos. pPJV7508 foi
cortado com Xhol e Nhel para preparar um fragmento de vetor no qual os
fragmentos de inserto foram ligados, resultando no pPJV7524 (aprotinina),
25 pPJV7525 (extensina do tabaco), e pPJV7526 (lisozima de galinha).
Exemplo 7. Construção de painéis de Fosfatase Alcalina Secretada Humana
(SEAP)
(a) pPJV7531 (CMV (nenhum intron), HbsAg UTR 5', RBGpA, lisozima de
galinha s.p.)

114
pPJV7510 foi cortado com Sal 1 e Bg12 para isolar um
fragmento de inserto contendo o promotor de CMV até o peptídeo de sinal da
lisozima. pPJV7450 foi cortado com Sall e Bg12 para gerar um fragmento de
vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7531.
5 (b) pPJV7554 (CMV(RIA/NheI), HbsAg UTR 5', RBGpA, lisozima de
galinha s.p.)
pPJV7530 foi cortado com Xhol e BamH1 para isolar um
fragmento de inserto contendo o promotor de CMV até RIA. pPJV7531 foi
cortado com Xhol e BamH1 para gerar um fragmento de vetor no qual o
10 fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7554.
(c) pPJV7568 (CMV (nenhum intron), HBsAg UTR 3', HbsAg UTR 5',
RBGpA, lisozima de galinha s.p.)
pPJV7563 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar um
fragmento de inserto contendo a UTR 3' de HBV e RBGpA. pPJV7531 foi
15 cortado com Bg12 e EcoR1 para gerar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7568.
(d) pPJV7572 (CMV(RIA/NheI), HBsAg UTR 3', HbsAg UTR 5', RBGpA,
lisozima de galinha s.p.)
pPJV7563 foi cortado com Bg12 e EcoR1 para isolar um
20 fragmento de inserto contendo the UTR 3' de HBV e RBGpA. pPJV7554 foi
cortado com Bg12 e EcoR1 para gerar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7572.
Exemplo 8. Construção de Vetores Beta-gal e HBsAg Usando os Introns da
Queratina de Galinha e da Actina Cardíaca de Galinha
25 (a) pPJV7557 (Beta-gal, CMV(cA intron), HbsAg UTR 3', HbsAg UTR 5' e
RBGpA)
O DNA de galinha foi amplificado pela PCR com iniciadores
JF430 (SEQ ID NO: 48) e JF442 (SEQ ID NO: 49) e cortado com Bg12 e
BamH1 para isolar um fragmento de inserto consistindo do intron e das

115
seqüências de exon flanqueadoras da actina cardíaca de galinha. pPJV7488
foi cortado com BamHl para preparar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7557.
(b) pPJV7558 (Beta-gal, CMV(cK intron), HbsAg UTR 3', HbsAg UTR 5' e
5 RBGpA)
O DNA de Galinha foi amplificado pela PCR com iniciadores
JF421 (SEQ ID NO: 50) e JF444 (SEQ ID NO: 51) e cortado com Bg12 e
BamHl para isolar um fragmento de inserto consistindo do intron e
seqüências de exon flanqueadoras do gene da queratina de galinha. pPJV7488
10 foi cortado com BamHl para preparar um fragmento de vetor no qual o
fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7558.
(c) pPJV7578 (HBsAg, CMV(cA intron), HbsAg UTR 3', HbsAg UTR 5' e
RBGpA)
pPJV7557 foi cortado com Sall e BamHl para isolar um
15 fragmento de inserto consistindo do promotor de CMV até as regiões de
intron. pPJV7496 foi cortado com Sall e BamHl para preparar um fragmento
de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7558.
(d) pPJV7579 (HBsAg, CMV(cK intron), HbsAg UTR 3', HbsAg UTR 5' e
RBGpA)
20 pPJV7558 foi cortado com Sall e BamHl para isolar um
fragmento de inserto consistindo do promotor de CMV até as regiões de
intron. pPJV7496 foi cortado com Sall e BamHl para preparar um fragmento
de vetor no qual o fragmento de inserto foi ligado, resultando no pPJV7579.
Exemplo 9. Análise In Vitro da Expressão de Antígeno pelos Painéis
25 Vetoriais de HBsAg
No dia um, as células SCC15 (ATCC) ou B16 (origem
desconhecida, versões disponíveis na ATCC) foram plaqueadas em placas de
cultura de tecido de 6 reservatórios de 20 a 40% de confluência, e deixadas
cultivar durante a noite em uma incubadora. As células hospedeiras foram

116
propagadas em meio recomendado pela ATCC.
No dia dois, a reação de transfecção foi realizada. Para cada
vetor a ser testado, 20 gl de reagente Lipofectin® (Life Technologies Inc,
Grand Island, NY) foram adicionados a 180 gl de meio Optimem® (Life
5 Technologies, Grand Island, NY), e deixados incubar na temperatura
ambiente por 45 minutos. Para cada vetor a ser testado, 2 pg de vetor foram
misturados em 200 gl de Optimem® em 40 minutos. Em 45 minutos, o vetor
e as soluções de Lipofectin® foram misturadas entre si e deixadas repousar na
temperatura ambiente por um adicional de 10 minutos. Durante esta
10 incubação final, as células hospedeiras plaqueadas foram removidas da
incubadora e lavadas duas vezes com meio Optimem®. Em 10 minutos, 1,6
ml de Optimem® foi adicionado à mistura de Lipofectin® / vetor, e 1 ml da
mistura resultante foi adicionado a cada um dos dois reservatórios de célula.
As células hospedeiras foram retornadas para a incubadora e deixadas
15 repousar imperturbáveis por 5 horas, ponto no qual a mistura de
Lipofectin®/vetor foi removida e substituída por meio de manutenção de
célula padrão.
De 18 a 24 horas depois da troca do meio, os 50 a 100 gl de
meio de manutenção de célula foram removidos das placas de cultura de
20 tecido e analisados quanto a expressão de antígeno colocando-se as amostras
em vasos de reação fornecidos no kit de Diagnóstico Monoclonal
AUSZYNIE® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). O volume das amostras
de teste foi levado a um volume de 200 p1 com PBS, depois 50 vil de
conjugado e uma pérola de reação foram adicionados a cada amostra. O vaso
25 é incubado por 80 minutos a 40° C, depois do que os reservatórios foram
lavados limpos de todos os componentes de reação líquidos. As pérolas foram
transferidas para novos tubos depois que 300 gl de tampão de
desenvolvimento de cor foram adicionados. Em 30 minutos, a reação de
desenvolvimento de cor foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 1 M, e

117
a absorbância da reação foi medida a 490 nm. Os dados mostrados na Figura
1 são as leituras da absorbância média dos reservatórios em duplicata de dois
experimentos.
Como mostrado na Figura 1, a adição de RIA, do UTR 3' de
5 HBV ou ambos elementos a um vetor base (promotor de CMV, exon e região
de poliadenilação) aumentou a expressão do HBsAg em células SCC15.
Como mostrado na Figura 2, a adição de cada um dos introns de queratina de
galinha ou da actina cardíaca de galinha a um vetor base (promotor de CMV,
exon, UTR 3' de HBV e região de poliadenilação) aumentou a expressão de
10 HBsAg em células SCC15.
Exemplo 10. Análise In Vitro da Expressão de Antígeno pelos Painéis
Vetoriais de Beta-gal
como descrito no Exemplo 9.
As células hospedeiras SSC-15 ou B16 foram transfectadas
15 De dezoito a quarenta horas depois da troca do meio, os
sobrenadantes do meio foram removidos e as células foram lavadas com PBS.
Depois da remoção da lavagem, as células foram lisadas incubando-se as
células em 500 1.11 de tampão de lise (50 mM de NaPO 4, 0,1% de Triton X-
100, pH 7) por 5 minutos, seguido pela raspagem física das células fora da
20 placa plástica. Os lisados foram microcentrifugados por dois minutos para
remover os fragmentos de célula, e 10 a 25 jal do lisado clarificado foram
adicionados a 500 gl de tampão de reação (80 µg/ml de o-nitrofenil
galactopiranosida, 50 mM de NaPO 4, pH 7) e incubadas a 37° C por 10 a 20
minutos. A reação foi interrompida pela adição de 500 1.11 de Na 2CO3 1 M e
25 lida a 405 nm. Os dados estão apresentados como a razão da expressão de
vetor (contendo um intron, HBVenh, ou ambos) realçada a um vetor base.
A adição de RIA, a UTR 3' de HBV ou ambos os elementos a
um vetor base (promotor de CMV, exon e região de poliadenilação) aumentou
a expressão de beta-gal em ambas as linhagens de célula. Os resultados para

118
as células SCC15 são mostrados na Figura 3. A adição de cada um dos introns
da queratina de galinha ou da actina cardíaca de galinha a um vetor base
(promotor de CMV, exon, a UTR 3' de HBV e a região de poliadenilação)
aumentou a expressão de beta-gal em ambas as linhagens de célula. Os
5 resultados para as células B 16 são mostradas na Figura 2.
Exemplo 11. Análise In Vitro da Expressão de Antígeno pelo Painel Vetorial
de HSV gD
As células hospedeiras SCC15 ou B16 foram transfectadas
como descrito no Exemplo 9. Dezoito horas após a transfecção, as placas
10 foram colocadas em gelo por 15 minutos. Cada reservatório foi depois lavado
com 2 ml de PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD). As células foram fixadas
com 0,05% de glutaraldeído (Polisciences Inc, Warrington, PA) diluídas em
PBS e incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Todas as
incubações subseqüente duraram 1 hora na temperatura ambiente e as
15 lavagens entre cada incubação foram como estabelecido acima. As placas
foram bloqueadas com 2 ml de leite em pó a 5% (Bio Rad Laboratories,
Melville, NY) em PBS. As incubações com 1 ml de uma diluição 1:1000 de
anti-gD monoclonal (ABI, Columbia, MD) em 2% de leite em pó / PBS /
0,05% de Tween-20® (Sigma, St. Louis, MO) e 1 ml de uma diluição de
20 1:2500 de HRP anti-camundongo de cabra (KPL, Gaithersburg, MD) em PBS
/ 0,1% de Tween-20 ® seguido. A cor foi desenvolvida usando 1 ml de
substrato de micro-reservatório TMB (BioFX, Owings Mills, MD). As
reações foram interrompidas com H 2SO4 1 M, o líquido foi transferido para
cubetas plásticas e a densidade ótica lifa a 450 nm. Os dados estão
25 apresentados como a razão da expressão de vetor (contendo um intron,
HBVenh, ou ambos) realçada a um vetor base.
A adição de RIA com ou sem a UTR 3' de HBV a um vetor
base (promotor de CMV, exon e região de poliadenilação) aumentou a
expressão de HSV gD em ambas as linhagens de célula. Os resultados para as

119
células SC15 são mostrados na Figura 4.
Exemplo 12. Análise In Vitro da Expressão de Antígeno pelos Painéis
Vetoriais de SEAP
As células hospedeiras SCC 15 ou B 16 foram transfectadas
5 como descrito no Exemplo 9. em dezoito a quarenta horas depois da troca de
meio, os sobrenadantes do meio foram removidos e aquecidos a 70° C por 30
minutos. 10 a 25 gl dos sobrenadantes inativados por calor foram incubados
por 5 minutos com 1/10 ° do volume de 1-homoarginina 100 mM. 500 gl de
tampão de reação de fosfatase alcalina (cat # 172-1063, Bio-Rad, preparado
10 de acordo com as instruções) foram adicionados aos lisados e incubados a 37°
C por 10 a 20 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 500 gl de
NaOH 1 M e lida a 405 nm. Os dados estão apresentados como a razão da
expressão de vetor (contendo um intron, HBVenh, ou ambos) realçada a um
vetor base, ou a razão da expressão dos peptídeos de sinal experimental para o
15 vetor de peptídeo de sinal de TPA humano.
Como mostrado na Figura 5, a adição de RIA, da UTR 3' de
HBV ou de ambos os elementos a um vetor base (promotor de CMV, exon e
região de poliadenilação) aumentou a expressão de SEAP em células B16.
Inesperadamente, apenas a adição da UTR 3' de HBV a um vetor base
20 (promotor de CMV, exon e região de poliadenilação) aumento a expressão de
SEAP em células SCC15.
A adição de peptídeos de sinal da aprotinina bovina, lisozima
de galinha, ou extensina do tabaco ao terminal N de SEAP madura
possibilitou a secreção eficiente de SEAP nos sobrenadantes de meio de
25 célula de ambas as linhagens de célula. Os resultados para as células B 16 são
mostradas na Figura 6.
Exemplo 13. Análise In Vitro da Expressão de Antígeno pelo Painel de
Peptídeo de Sinal de Fragmento Fc da IgG Humana
As células hospedeiras SCC15 ou B16 foram transfectadas

120
como descrito no Exemplo 9. Os sobrenadantes do meio foram removidos de
dezoito to quarenta horas depois da troca de meio.
As placas de ELISA (Costar) foram incubadas durante a noite
a 4° C com 100 µ1 de IgG anti-humano de cabra (Sigma #I3382, diluição
5 1/1000 em tampão de revestimento de carbonato) por reservatório. Todas as
incubações subseqüentes duraram 1 hora na temperatura ambiente com
lavagens (10 mM de Tris, 150 mM de NaC1, 0,1% de Brij-35, pH 8,0) entre
cada incubação. Os reservatórios foram depois bloqueados com 100 gl de 5%
de seco em PBS, seguido por incubação com sobrenadantes de meio diluído
10 em série em tampão de diluição (2% de leite em pó, PBS, 0,05% de Tween-
20®). Isto foi seguido pela incubação com 100 gl de IgG anti-humano de
cabra/HRP (Sigma #A6029, diluição 1/5000 em tampão de diluição) por
reservatório, seguido pelo desenvolvimento de cor usando 100 gl de substrato
de micro-reservatório TMB. As reações foram interrompidas com 100 gl de
15 2SO4 H1
M, e lidas a 450 nm. Os dados estão apresentados como a razão da
expressão dos peptídeos de sinal experimentais para o vetor de peptídeo de
sinal de TPA humano.
A adição de peptídeos de sinal de aprotinina bovina, lisozima
de galinha, ou extensina do tabaco ao terminal N do fragmento Fc humano
20 possibilitou a secreção eficiente de hFc em sobrenadantes de meio de célula
de ambas as linhagens de célula. Os resultados para as células B 16 são
mostrados na Figura 6.
Exemplo 14. Uso dos vetores de expressão de plasmídeo HBsAg, HSVgD e
Flu-M2 para a imunização de camundongos
25 (a) Preparação de cartuchos de imunização
Para cada plasmídeo a ser testado, 25 mg de pó de ouro de 2
mícrons foram pesados em um tubo de microcentrífuga. Depois da adição de
uma alíquota de 250 gl de espermidina 50 mM (Aldrich Chemical, Inc,
Milwaukee, WI), o tubo foi turbilhonado e ligeiramente sonificado. O ouro foi

121
separado por microcentrifugação, e a espermidina substituída por uma
alíquota de 100 µl fresca. O ouro foi recolocado em suspensão por
turbilhonamento, depois que 25 In de DNA foram adicionados ao tubo e
misturado. Enquanto que o tubo foi levemente turbilhonado, 100 µl de CaCl 2
5 a 10% (Fujisawa USA, Inc, Deerfield, IL) foi adicionado para precipitar o
DNA sobre as pérolas de ouro. A reação de precipitação foi deixada processar
por 10 minutos na bancada, depois que o ouro foi coletado por um breve giro
de microcentrífuga e lavado três times com etanol absoluto (Spectrum Quality
Products, Inc, Gardena, CA) para remover os reagentes de precipitação em
10 excesso. O complexo de ouro/DNA lavado foi depois recolocado em
suspensão em 3.6 ml de 0,05 mg/ml de polivinilpirrolidona (360KD,
Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA) em etanol absoluto. Esta pasta
fluida foi depois injetada em um tubo Tefzelâ (McMaster-Carr, Chicago, IL)
localizado em um torno de tubo (PowderJect Vaccines) que reveste o interior
15 do tubo Tefzelâ com o complexo de ouro/DNA. Depois que o procedimento
de girar o tubo foi completado, o tube foi cortado em "projéteis" de 0,5" (1,27
cm) de vacina que foram carregados no dispositivo XR1 (PowderJect
Vaccines) para a liberação aos camundongos.
(b) Procedimento de Vacinação
20 Camundongos de quatro a seis semanas de idade foram
anestesiados com uma mistura de Ketasetâ (Fort Dodge) e Rompunâ (Bayer).
Os ventres foram raspados com um par de tesouras elétricas para remover o
pelo, e dois "projéteis" não sobrepostos de vacina foram liberados por
intermédio do dispositivo XR1 (450 psi (3105 kPa)) à área raspada. Os
25 animais foram retornados para asa suas gaiolas e sangrados em seis semanas
após a vacinação. Os camundongos Balb/c foram usados para avaliar os
vetores de expressão de HBsAg, e camundongos Swiss Webster foram usados
para avaliar os vetores de expressão HSV-gD e Flu M2.

122
Análise de Soros quanto a Anticorpos Anti-HBsAg
Em seis semanas, as amostras de sangue foram colhidas de
animais vacinados. Um volume de soro isolado destas amostras foi colocado
em reservatórios de um vaso de reação fornecido com o kit AUSAB ® EIA
5 Diagnostic (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). O volume de soros
adicionados dependeu do título de anticorpo da amostra, e a amostra foi
diluída com tampão de diluição de amostra para cair dentro dos valores
obteníveis com um painel de quantificação. 200 pl de cada frasco do Painel
de Quantificação AUSAB ® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) foram
10 adicionados aos reservatórios do vaso de reação. A cada reservatório uma
pérola foi adicionada, depois que o vaso foi selado e incubado por duas horas
a 40° C. Os reservatórios foram depois lavados de todos os componentes da
reação líquida. A cada reservatório lavado foram adicionados 200 pl de
mistura conjugada, depois que o vaso foi selado e incubado por duas horas a
15 40° C. Os reservatórios foram depois lavados de todos os componentes de
reação líquidos. As pérolas foram transferidas para novos tubos depois que
300 gl de tampão de desenvolvimento de cor foram adicionados. Em 30
minutos, a reação de desenvolvimento de cor foi interrompida pela adição de
ácido sulfúrico 1 M, e a absorbância das reações foi medida a 490 nm em um
20 espectrofotômetro Quantum II ® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Este
espectrofotômetro calcula os níveis de anticorpo de uma amostra pela
comparação da absorbância da amostra com uma curva padrão gerada com o
painel de quantificação. Estes níveis de anticorpo foram depois corrigidos
quanto aos fatores de diluição. Os dados mostrados na Figura 7 são os títulos
25 da média geométrica de todos os animais vacinados com um vetor particular.
Análise de Soros quanto aos Anticorpos de Antígeno Anti-Flu M2
Placas de ELISA de ligação de meio Costar de 96
reservatórios (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) foram revestidas com um
peptídeo Flu M2 sintético (QCB/Biosource, Hopkinton, MA) a uma

123
concentração de 1 gg/m1 em PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) e
incubadas durante a noite a 4° C. As placas foram lavadas três vezes com 10
mM de Tris (Sigma, St. Louis, MO)/150 mM de NaC1 (Fisher
Scientific)/0,1% de Brij-35 (Sigma), depois bloqueado com 5% de leite em pó
5 (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) em PBS por 1 hora na temperatura
ambiente. Todas as incubações subseqüentes foram na temperatura ambiente
por uma hora e as lavagens entre cada incubação foram como estabelecido
acima. A amostra de soro de camundongo, um controle padrão (título alto,
soros de camundongo anti-M2) e um negativo (soro de camundongo anti-
10 HBsAg) foram diluídos em 2% de leite em pó/PBS/0,05% de Tween-20 ®
IgG anti-camundongo de cabra (H+L) (Southern Biotechnology Associate,
Birmingham, AL) diluído 1:8000 em 2% de leite em pó/ PBS/0,05% de
Tween-20 ® e conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano (Southern
15 Biotechnology) diluído 1:8000 em PBS/0,1% de Tween-20 seguido. A cor foi
desenvolvida usando substrato de TMB (BioFX, Owings Mills, MD). As
reações foram interrompidas com H 2SO4 1 M e as placas lidas a 450 nm com
uma leitora de placa Emax precision (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O
software SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) foi usado para calcular os
20 títulos no ponto final usando uma análise de quatro parâmetros. Os títulos
foram normalizados ao soro padrão, que teve um título pré determinado, para
minimizar a variação de ensaio para ensaio e de placa para placa. Os
resultados são mostrados na Figura 7.
Análise de Soros quanto aos Anticorpos de Antígeno Anti-gD de HSV
25 Placas de ELISA de ligação de meio Costar de 96
reservatórios (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) foram revestidas com a
proteína gD de HSV (Virai Therapeutics, Ithaca, NY) a uma concentração de
1 gg/m1 em PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) e incubados durante a noite
a 4° C. As placas foram lavadas três vezes com 10 mM de Tris (Sigma, St.
(Sigma) e incubados nas placas de ELISA. Anticorpo conjugado a biotina de

124
Louis, MO)/150 mIVI de NaC1 (Fisher Scientific)/0,1% de Brij-35 (Sigma),
depois bloqueado com 5% de leite em pó (Bio Rad Laboratories, Melville,
NY) em PBS por 1 hora na temperatura ambiente. Todas as incubações
subseqüentes foram na temperatura ambiente por uma hora e as lavagens
5 entre cada incubação foram como estabelecido acima. As amostras de soro de
camundongo, um controle padrão (título alto, soro de camundongo anti-gD) e
um negativo (soro de camundongo anti HiBsAg) foram diluídos em 2% de
leite em pó/PBS/0,05% de Tween-20 (Sigma) e incubados nas placas de
ELISA. o anticorpo conjugado a biotina IgG anti-camundongo de cabra
10 (H+L) (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL) diluído 1:8000
em 2% de leite em pó/PBS/0,05% de Tween-20 e conjugado de
estreptavidina-peroxidase de rábano (Southern Biotechnology) diluído 1:8000
em PBS/0,1% de Tween-20 seguido. A cor foi desenvolvida usando substrato
TMB (BioFX, Owings Mills, MD). As reações foram interrompidas com
15 H2SO4 1 M e as placas lidas a 450 nm com uma leitora de placa Emax
precision (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O software SoftMax Pro 4.1
(Molecular Devices) foi usado para calcular os títulos de ponto final usando
uma análise de quatro parâmetros. Os títulos foram normalizados ao soro
padrão, que teve um título pré determinado, para minimizar a variação de
20 ensaio para ensaio e de placa para placa. Os resultados são mostrados na
Figura 7.
Exemplo 15. Construção de Plasmídeo pPJV1671, Vetor da Vacina de DNA
contra a Influenza
O plasmídeo pPJV1671 foi construído de modo que codifique
25 e possa expressar o antígeno da Hemaglutinina (HA) da influenza
A/Panama/2007/99 (H3N2).
principais:
A construção de pPJV1671 é melhor descrita em três estágios
(i) Clonar o gene de expressão;

125
(ii) Engendrar a cadeia principal de vetor; e
(iii) Engendrar o plasmídeo final.
Clonagem do Gene de Expressão
A seqüência codificadora para a influenza HA foi obtida por
5 uma técnica de clonagem da transcriptase reversa-reação da cadeia da
polimerase padrão (RT-PCR) usando uma amostra de vírus A/Panama/
2007/99 obtida da Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA)
como uma fonte de ácido ribonucleico padrão (RNA).
10 expressão, HA:
As seguintes etapas foram utilizadas na clonagem do gene de
A produção pela RT-PCR de fragmento dsDNA de RNA
segmento 4 de A/Panama/2007/99 (H3N2);
Propagação de clone de DNA do segmento 4 de RNA em
um vetor com base em pUC 19 padrão na E. coli;
15 Análise de seqüência da seqüência codificadora de H3
Panama HA dentro do clone do segmento 4 de RNA; e
uma segunda reação de PCR para gerar um fragmento de
DNA contendo a seqüência codificadora H3 Panama HA (sem o seu códon
ATG) com extremidades compatíveis com o vetor "vazio" de vacina de DNA
20 pPJV7563 (Me I e Bsp 1201).
Engendramento da Cadeia Principal do Vetor, pPJV7563
A cadeia principal de plasmídeo para pPJV1671 é pPJV7563.
A maioria das seqüências de cadeia principal de plasmídeo em pPJV7563
também são encontrados em pWRG7128, um vetor de vacina de DNA que foi
25 avaliado em diversos testes clínicos humanos. Esta seção fornece uma sinopse
30
da construção de pPJV7563. Um diagrama de fluxo detalhado é fornecido na
Figura 14 da construção de pPJV7563 e pPJV1671, e uma comparação tabular
abaixo (Tabela 2) de elementos chave em plasmídeos pWRG7128 e
pPJV1671 é fornecida. O mapa de pPJV1671 é mostrado na Figura 16.

Tabela 2
126
Comparação de Elementos nas cadeias Principais de Vetor:
Plasmídeos WRG7128 (HBsAg) e pPJV1671 (Influenza HA)
Descrição da Mudança Razão ou Propósito para a
Mudança
O fragmento de gene de
resistência à canamicina
em pPJV1671 é 354 bases
menor do que aquele usado
em pWRG7128.
O ligador Sphl-Pstl a
montante do promotor de
CMV em pWRG7128 foi
removido.
O intron A de CMV foi
removido e em pPJV1671,
o CMV exonl foi fundido
às 9 bases remanescentes
do exon2 de CMV.
O intron A do gene da
insulina de rato foi
inserido entre os exons de
CMV fundidos e a UTR 5'
de HBsAg.
A região de poliadenilação
foi trocada do hormônio de
crescimento bovino para
beta-globina de coelho.
Para remover seqüências
estranhas do vetor
Para remover seqüências
estranhas do vetor.
Possibilita que estes sítios
de restrição sejam mais
eficazmente utilizados em
construções de vacinas
futuras.
Os exons de CMV foram
fundidos para recriar UTR
5' de transcrito pWRG7128
unido.
Para substituir a seqüência
do intron A de CMV com
uma alternativa funcional.
Para utilizar um sinal de
poliadenilação alternativo
Engendramento do Plasmídeo Final, pPJV1671
Efeito Biológico ou
Significância ou Efeito
Possível da Mudança
Nenhuma mudança negativa
para a eficácia ou segurança
da vacina prevista
Nenhuma mudança negativa
para a eficácia ou segurança
da vacina prevista
A fusão dos exons de CMV
não devem mudar o perfil
de eficácia ou segurança da
vacina.
A adição do intron A da
insulina de rato nos vetores
de vacina mostrou aumentar
a expressão de antígeno e
subseqüente respostas de
anticorpo.
Nenhuma mudança negativa
para a eficácia ou segurança
da vacina prevista.
5 Duas etapas principais foram envolvidas no engendramento do
plasmídeo final, pPJV1671, a partir da cadeia principal, pPJV7563 (como
ilustrado na Figura 14) estas são:
deleção do sítio Nhel-Bgl II de pPJV7563; e
inserção da seqüência codificadora de H3 Panama HA no
10 pPJV7563 produzindo o vetor de vacina de DNA de pPJV1671 final, H3
Panama HA.

127
Uma análise de seqüência completa de pPJV1671 confirmou
todas as cadeias principais de vetor e as seqüências codificadoras de HA que
são listadas abaixo na Tabela 3.
Comparação de pWRG7 128 e pPJV1671
5 As diferenças principais nas cadeias principais de vetor entre o
pWRG7128 clinicamente testado que codifica HBsAg e o vetor pPJV1671 da
vacina da influenza que codifica H3 Panama HA são mostradas acima na
Tabela 2. Estas incluem o uso do intron A da insulina de rato no lugar do
elemento de intron A de Citomegalovírus humano (hCMV) e o uso da
10 seqüência de poliadenilação da 0-globina de coelho no lugar da seqüência de
poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Estudos em animal
extensivos com pPJV1671 descritos demonstraram bom desempenho da
vacina de DNA contra a influenza tanto em animais pequenos quanto grandes.
O plasmídeo pPJV1671 também desempenha bem em seres humanos
15 seguindo PMED desta vacina de DNA como debatido abaixo no Exemplo 16.
Característica e Mapa Funcional de pPJV1671
O mapa funcional de pPJV1671 é mostrado na Figura 16. As
características deste mapa estão listadas na Tabela 3. O plasmídeo pPJV1671
utiliza o promotor inicial imediato do hCMV e as seqüência não codificadoras
20 5' de exons 1 e 2. Este promotor é ligado ao intron A da insulina de rato e o
gene UTR 5' do HBV pre-S2. A tradução da seqüência codificadora H3
Panama HA começa em um códon ATG que é fixado no vetor no contexto de
uma seqüência de início de tradução Kozak de consenso. A seqüência
codificadora HA é seguida por um realçador transcricional de HBV
25 (HBVenh). Finalmente, a terminação de transcrição é facilitada por um sítio
de poliadenilação de 0-globina de coelho.
Por causa do códon de início de tradução ATG natural do gene
HA de A/Panama/2007/99 (H3N2) não se conforma à seqüência de consenso
Kozak para o início de tradução, foi escolhido usar o elemento ATG

128
fornecido pelo vetor de vacina de DNA pPJV7563 para o início de tradução.
A expressão de antígeno a partir de vetores de vacina de DNA é realçada
usando códons ATG que se conformem com o consenso de Kozak. O uso do
códon ATG fornecido pelo vetor (por intermédio de inserção no sítio Nhe I)
5 resulta em uma inserção de 2-aminoácidos menor no término amino da
seqüência codificadora do gene HA como representado na Figura 16.
Origem da Seqüência de Nucleotídeos em pPJV167 1
A história de construção detalhada e relatos de
seqüenciamento para pPJV1671 possibilita a designação da origem de todas
10 as posições de nucleotídeo dentro deste plasmídeo. Os alinhamentos de
BLAST entre as seqüências componentes do vetor e as bases de dados do
GenBank foram realizados para verificar que designações de componente
corretas de fato foram feitas.
Tabela 3
15 Identificação de Componentes Que Compreendem Plasmídeo pPJV 1671
Números de Base Identificação de Componente
1-896
Gene de resistência à canamicina, flanqueado pelas
seqüências tn903 (Tn903, pUC4K remanescentes 1-44 e
861-896)
897-902 sítio de clonagem Sal 1 /pUC 19 MCS
903-1587 promotor de CMV
1588-1718 Fusão de exon 1/ 2 de CMV
1719-1724 Fusão BamHl/ Bg12
1725-1857 Intron A da insulina de rato
1858-1863 sítio de clonagem de BamHl
1864-1984 Região preS2 não codificadora de HbsAg
1985-1987 Códon de início ATG
1988-1993 sítio de clonagem Nhel
1994-3688 seqüência codificadora H3N2 HA
3689-3691 Códon de parada
3692 nucleotídeo G de H3 Panama UTR 3'
3693-3698 sítio de clonagem Bsp 1201
3699-4231 Realçador HBV
4232-4242 Artefato de clonagem. Origem desconhecida
4243-4373 região de poliadenilação de beta-globina de coelho
4374-4379 sítio de clonagem EcoR1
4380-5446 Vetor PUC19

129
Seqüência de pPJV1671 (Banco de Célula Mestra)
O seqüenciamento foi realizado pela PowderJect Research
Department usando Qiagen Megaprep DNA preparado a partir do plasmídeo
pPJV 1671 recém construído. Os dados de seqüência reais estavam em 100%
5 de acordo com a seqüência teórica prognosticada para pPJV1671. O
seqüenciamento durante o processo de fabricação também mostrou que a
seqüência de plasmídeo também estava em 100% de acordo com as
seqüências teóricas e de pesquisa. Os vários elementos e posições de
plasmídeo na seqüência são fornecidos na Tabela 3 acima.
10 Exemplo 16. Avaliação Não Clinica de pPJV1671: Imunogenicidade da
Vacina de DNA da Influenza Monovalente pPJV1671 em um Modelo de
Animal Grande
O modelo de porco doméstico foi usado para investigar a
imunogenicidade de pPJV1671 a geração do qual é descrita acima no
15 Exemplo 15. Porcos brancos domésticos de oito semanas de idade (porcos
castrados e leitoas) foram utilizados neste estudo. Os títulos de anticorpo da
inibição da hemagluttinação (HI) foram medidos para os animais de estudo
candidatos e foram

130
que a vacina de DNA pPJV1671 induziu títulos de anticorpo HI significantes
em 100% dos animais de teste com reservatórios de títulos de anticorpo HI
médios em excesso de 1:40 do título de anticorpo HI substituto para a
proteção contra a influenza em seres humanos.
5 Exemplo 17. Testes Clínicos que Avaliam o a construção de vacina de DNA
da influenza em seres humanos
Introdução
Um estudo clínico escalar de dose de fase I foi realizado para
avaliar a segurança e imunogenicidade da vacina de DNA pPJV 1671 que é
10 uma vacina de DNA da influenza PMED monovalente contendo o gene de
HA (hemaglutinina) de A/Panama/2007/99 (H3N2). A segurança foi avaliada
monitorando-se eventos adversos locais e sistêmicos da vacinação até a
conclusão do estudo. A imunogenicidade foi avaliada medindo-se os níveis de
anticorpo da hemaglutinação-inibição (HI) séricas.
15 Três grupos de 12 indivíduos adultos saudáveis receberam
uma dose única no dia O de cada 1, 2 ou 4 l.tg de vacina de DNA, liberada
como 1, 2 ou 4 administrações de PMED. A vacina de DNA da influenza
PMED evocou as respostas de anticorpo de hemaglutinação-inibição (Hl)
séricas em todos os 3 níveis de dose, com as respostas mais altas e mais
20 consistentes em indivíduos vacinados com o nível de dose mais alto. As
respostas de anticorpo foram maiores no último ponto do tempo testado, dia
56. A reatogenicidade relacionada com o tratamento foi limitada a reações de
pele de branda a moderada no local da vacina, que foram primariamente auto-
limitantes. Estes resultados fornecem uma indicação da segurança e
25 imunogenicidade da vacina de DNA para a influenza gerada.
Materiais e Métodos
Vacina e sistemas de liberação
Para o plasmídeo clínico, a seqüência codificadora de HA foi
obtida por uma técnica de clonagem pela transcriptase reversa - reação da

131
cadeia da polimerase (RT-PCR) padrão usando uma amostra de vírus
A/Panama/2007/99 como uma fonte de RNA padrão (o vírus foi um presente
de J. Katz, Centers for Disease Control and Prevention). A seqüência
codificadora de H3 Panama HA foi inserida no vetor pPJV7563 como
5 descrito acima no Exemplo 15 produzindo o vetor de vacina de DNA
pPJV1671 H3 Panama HA final. A análise de seqüência completa de
pPJV1671 confirmou todas as cadeias principais de vetor e as seqüências
codificadoras de HA.
O plasmídeo pPJV1671 foi fabricado sob boas práticas de
10 fabricação na Strathman GmbH (Hannover, Alemanha). O DNA plasmídico
foi revestido em partículas de ouro de 1 a 3 gm, e formulado para PMED
usando o dispositivo PowderJect XR-1, usando os métodos anteriormente
descritos (Roy et al., (2001) Vaccine 19: 764-78). Cada dose conteve um
valor nominal de 1 pg de DNA revestido em 0,5 mg de ouro. Os parâmetros
15 de qualidade de vacina analisados incluíram a quantidade de ouro e DNA,
expressão in vitro, imunopotência em camundongos, e ausência de biocarga e
endotoxina.
População e conversão de indivíduo
A fase clínica do estudo foi conduzida na MDS Pharma
20 Services, Lincoln, NE, e foi aprovada pelo Institutional Review Board local.
Trinta e seis (36) voluntários adultos foram alistados (Tabela 4).
Tabela 4: Demográficos da população de estudo
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Número por grupo 12 12 12
Idade média (anos) 31 31 32
Faixa de idade (anos) 20-48 20-50 21-49
Homem: Mulher 7: 5 4: 8 5: 7
Pré vacinação
HAI GMT (faixa)
16 (5-40) 17 (5-40) 12 (5-40)
Os indivíduos foram considerado elegíveis se eles foram
saudáveis, de idade de 19 a 50, não grávidos ou lactentes, capazes de fornecer
25 Consentimento Informado por escrito, e com títulos de inibição da

132
hemaglutinação (HI) na pré vacinação à influenza A/Panama de e 40.
As razões para a exclusão incluíram terapia imunossupressiva
nos últimos 6 meses, história de doença de pele, cicatriz, verrugas, cortes ou
tatuagens no local de imunização, alergia a ouro, história de crisoterapia,
5 recebimento de vacina contra a influenza nos últimos 12 meses, sintomas
equivalentes à influenza ou influenza diagnosticada na estação corrente, ou
presença de qualquer condição médica onde a vacinação contra a influenza
não é recomendada.
Todos os indivíduos completaram o estudo e foram avaliados
10 quanto a segurança e imunogenicidade, com a exceção de dois indivíduos.
Um indivíduo foi perdido de seguimento e um outro indivíduo não foi
condescendente. Entretanto, conforme todos os 36 indivíduos forneceram uma
amostra de pré vacinação, receberam a vacinação, e foram avaliados pelo
menos uma vez após a vacinação quanto a segurança e imunogenicidade, os
15 dados foram disponíveis para a avaliação de segurança e imunogenicidade em
todos os indivíduos. Todos os procedimentos de estudo foram de acordo com
a Declaração de Helsinki de 1975, com as últimas emendas Edinburgh,
Scotland (2000) e a International Conference on Harmonization guidelines on
Good Clinical Practice (Etapa 4, 1 de maio de 1996).
20 Planejamento de Estudo Clínico
Os indivíduos foram designados a três grupos de tratamento,
12 por grupo, em uma base seqüencial. Cada administração de vacina de
DNA de PMED liberou 1 In de DNA, plasmídeo pPJV1671 (H3 Panama) em
0,5 mg de ouro. O primeiro grupo receberam uma única administração de
25 vacina no aspecto interno do braço superior no dia 0. Indivíduos no grupo 2
receberam duas imunizações de vacina no dia 0, para um total de 2 pg de
DNA, administrado aos sítios adjacentes no braço superior interno. Os
indivíduos no grupo 3 receberam 4 administrações no dia 4, para um total de
4 lag de DNA. As vacinas foram administradas usando o dispositivo

133
PowderJect XR-1 em uma pressão de hélio de 500 psi (3450 kPa), uma
pressão mostrada ser bem tolerada em estudos mais no princípio (Roy et al.
(2001) Supra, Rottinghaus et al. (2003) Vaccine 21(31): 4604-8 e Tacket et
al. (1999) Vaccines 17(22): 2826-9).
5 Segurança Clínica e Avaliações de Imunogenicidade
A segurança foi avaliada monitorando-se as reações no sítio de
vacinação e registrando a incidência de eventos adversos locais e sistêmicos
durante o estudo. Todos os indivíduos foram avaliados quanto a segurança da
vacina e tolerabilidade local no momento da imunização, 1 hora e 2 horas
10 após a imunização. Os indivíduos foram ainda avaliados quanto a
tolerabilidade local nos dias 3, 7, 14, 21, 28, 56, e 180. Os eventos adversos
sistêmicos foram monitorados pela examinação física, sinais vitais, testes de
segurança de laboratório, e testes de anticorpo anti DNA de filamento duplo.
Estes testes foram conduzidos antes e depois da imunização.
15 A imunogenicidade de cada vacina foi determinada pela coleta
de amostras de sangue no dia O (pré imunização), e nos dias 14, 21, e 56 após
a imunização para a determinação de títulos de HAI contra
A/Panama/2007/99, usando uma modificação de um método previamente
descrito (Kendal, et al (1982) Concepts and procedures for laboratory-based
20 influenza surveillance. US Department of Health and Human Services, Public
Health Service, Centers for Disease Control: B17-35).
Análise de dados clínicos
Os dados de segurança foram tabulados. Cada título de HI foi
reportado como a média geométrica (GMT) de duas determinações
25 independentes, que usualmente produziram os mesmos ou resultados
similares. Um título de 5 foi designado se a amostra teve um título abaixo de
10, o limite de detecção do ensaio. Para cada grupo, a GMT em cada ponto de
tempo e 95% de Intervalo de Confidência (CI) foram calculados usando
títulos logaritmicamente transformados. Para cada ponto de tempo, a razão de

134
GMT da referência para cada grupo de dosagem foi comparada pelos testes de
chi-quadrado usando procedimentos CATMOD em SAS. As diferenças na
GMT entre os três grupos também foram comparadas.
A taxa de soroconversão (porcentagem de indivíduos com >_4-
5 vezes de aumento no título de HAI em relação ao título na pré imunização), e
a taxa de soroproteção (a proporção de indivíduos que alcançam um título na
pós imunização 40) foram calculadas e comparadas entre os grupos pelo
teste de chi-quadrado usando o procedimento CATMOD em SAS para
comparar a% de resta com a função de ligação de resposta logit.
10 Resultados
Segurança e Reatogenicidade
As reações locais foram avaliadas para todos os 84 locais de
administração de vacina (Figura 18). As contagens de reação de pele de todos
os três grupos (84 locais de vacinação totais) foram calculados em média. As
15 reações de pele foram classificadas de acordo com os seguintes critérios:
sol branda; 3 = vermelhão.
- Eritema: O = nenhum; 1 = vermelhidão; 2 = queimadura de
- Edema: O = nenhum; 1 = um pouco mais espesso; 2 =
notavelmente mais espesso; 3 = agrupamento firme grande.
20 - Descoloração: O = nenhum; 1 = pouco observável; 2 =
notavelmente descolorido; 3 = graxa de sapato marrom.
- Floculação: O = nenhuma; 1 = como caspa branca fina; 2 =
descascando como queimadura de sol; 3 = mais espessa, amarela, com crosta.
- Coceira/desconforto: O = nenhuma; 1 = coceira branda ou
25 levemente sensível ao toque; 2 = coceira ou sensibilidade moderadas
Como esperado com base em estudos anteriores (Roy et al.
(2001), Rottinghaus et al. (2003) e Tacket et al. (1999) todos supra), os
indivíduos experienciaram reações dérmicas locais, entretanto nenhuma
reação local na faixa severa (classificação = 3) ocorreu. Não houve registros

135
de hemorragia ou dano à pele. A reação local típica foi caracterizada por
eritema, edema, e descoloração de pele de brandas a moderadas, e
ocasionalmente coceira/desconforto, seguido pela floculação de pele
superficial branda.
5 Reações locais infreqüentes incluíram petéquias (2/84 locais),
contusões menores (2/84 locais) e cicatrizes menores (15/84 locais). Embora
o edema no geral desaparecesse em 14 dias após a vacinação, o eritema e a
descoloração de pele persistiram até 28 dias. Dos 84 locais de vacinação
totais, a descoloração de pele branda estava ainda presente em 30 nos dias 56
10 e 21 nos dias 180 após a vacinação. Um indivíduo também teve contusão
detectável em 2 locais no Dia 180.
Os eventos adversos sistêmicos observados durante o estudo
foram brandos e considerados não relacionados com o tratamento. Os eventos
reportados de 7 a 56 dias após a imunização incluíram dor de cabeça (11
15 eventos em 10 indivíduos), fadiga (4 eventos em 3 indivíduos), mialgia (3
eventos em 1 indivíduo), febre (2 eventos em 2 indivíduos), sensação de frio
nas mãos (2 eventos em 2 indivíduos), dor nas costas (2 eventos em 1
indivíduo) e náusea, artralgia, rigidez muscular, calafrio, hipertensão
intermitente, e hipotensão intermitente (1 evento de cada em 1 indivíduo).
20 Nenhum anticorpo anti-DNA de filamento duplo foi detectado. De ponta a
ponta o perfil de evento adverso local e sistêmico para todos os grupos de
estudo forneceu uma indicação da segurança da vacina de DNA contra a
influenza liberada por PMED.
Respostas de Anticorpo
25 Os indivíduos foram pré triados quanto aos títulos de 1-11 para
Influenza A/Panama de 10 e .40, já alguns indivíduos tiveram títulos de 5_10
no dia da vacinação. Os títulos de HI de referência foram todos

136
A imunização resultou em aumentos significantes nos títulos
médios geométricos (GMT) em todos os pontos de tempo em todos os três
grupos (como mostrado na Tabela 5 abaixo).
Tabela 5:
5 Respostas de anticorpo sérico, taxas de soroconversão e soroproteção
Grupo Dia Soroconversão a
(%)
Soroproteção b
(%)
Aumento de GMT
médio (vezes)
1 0
17 (2/12)
14 8 (1/12)
42 (5/12)
1,4
21 17 (2/12) 33 (4/12)
1,7
56 33 (4/12) 58 (7/12) 2,8`
2 O 33 (4/12) -
14 17 (2/12) 50 (6/12) 1,7
21 8 (1/12) 58 (7/12) 2,1
56 67 (8/12) 92 (11/12) 3,9
3 O 8 (1/12) -
14 17 (2/12) 25 (3/12) 1,8
21 33 (4/12) 67 (8/12) 3,4
56 64 (7/11) 100 (11/11) 8,1
a A soroconversão é definida como um título de pré vacinação negativo
(5_10) a um título pós vacinação ou um aumento significante no título de
anticorpo, isto é, pelo menos um aumento de quatro vezes entre os títulos de
pré e pós vacinação onde o título de pré vacinação é ?..1 O
10 b A taxa de soroproteção é definida como a proporção de indivíduos que
alcançam um título de pós imunização
c Os valores que atingem os critérios CPMP estão negrito
Embora houvesse uma tendência voltada para títulos de HI
mais altos e% de soroconversão mais alta em uma maneira de dose-resposta,
15 não houve nenhuma diferença estatística na GMT,% de soroproteção ou% de
soroconversão entre os três grupos. Para todos os três níveis de dose de
vacina, GMT,% de soroconversão e% de soroproteção aumentaram como
uma função do tempo após a vacinação, com os títulos mais altos no dia 56
(ver a Tabela 5). No grupo 1, 33% dos indivíduos foram soroconvertidos no
20 dia 56, com 58% obtendo títulos HAI soroprotetores, e um aumento de GMP
de 2,8 vezes. No grupo 2, a taxa de soroconversão no dia 56 foi de 67%, com

137
92% dos indivíduos soroprotegidos e um aumento de GMT de 3,9 vezes. Os
títulos mais altos e mais consistentes foram observados para o grupo 3 no dia
56, onde 100% de soroproteção foram observados, e GMT aumentou 8,1
vezes em relação à referência. Neste grupo, a soroconversão foi menor do que
5 100%, porque alguns indivíduos soroprotegidos não mostraram um aumento
de vezes no título, devido aos títulos HAI de referência relativamente
altos.
Debate
O trabalho descrito no presente Exemplo fornece a primeira
10 geração bem sucedida de uma resposta de anticorpo anti-influenza que é
prognosticada ser eficaz para a profilaxia da influenza.
A análise imunológica demonstrou que todas os níveis de dose
produziram respostas de anticorpo anti-influenza. A comparação contra as
diretrizes da CPMP (Committee for Proprietary Medical Products) para o
15 licenciamento anual de vacinas Flu mostrou que o grupo de dose de 1 vig
atingiu os critérios no dia 56 no Título Médio Geométrico (GMT), o grupo de
dose de 2 gg atingiu os critérios no dia 56 em todos os três critérios
(soroconversão, soroproteção e GMT) e o grupo de dose de 4 pg atingiu os
critérios no dia 21 para a GMT e no dia 56 em todos os outros critérios.
20 Um total de 320 eventos adversos emergentes do tratamento
(AEs), incluindo as reações no local da vacina, foram reportados por 34
(94%) dos 36 indivíduos dosados. Houve 1 SAE reportado durante o estudo —
uma fratura de pé — considerada improvável de estar relacionada com a vacina
em estudo. Sete (7) indivíduos experienciaram AEs reportáveis ao FDA que
25 foram todos considerados improváveis de estarem relacionados com a vacina
em estudo. A maioria (71%) dos AEs foram brandos na severidade. O AE
mais comum reportado foi dor de cabeça (53% de todos os indivíduos).
Nenhum indivíduo descontinuou o estudo devido a um AE. Um total de 89
Aes relacionados com o local da vacinação foram reportados por 27 dos 36

138
indivíduos dosados com a dor branda no local da aplicação sendo o AE local
mais comum, reportado por 12 indivíduos (33%). Nenhuma medida de
reatogenicidade local foi avaliada como Grau 3 (severa) e portanto
consideradas eventos adversos. As reações no local da vacinação típicas
5 incluem vermelhidão/eritema, edema, floculação, descoloração e formação de
crosta/cicatriz.
Em conclusão, a administração de pPJV1671 foi bem tolerada
em todos os indivíduos, e evocaram respostas de anticorpo anti-influenza
potentes. A dose de topo de 4 vig atingiu os critérios em 21 dias estabelecido
10 pelo CPMP para o licenciamento de vacinas flu anual.
Exemplo 18. Avaliação não clínica de vacina de DNA trivalente em porcos.
Três vetores de vacina de DNA que codifica as moléculas de
HA das três cepas da vacina da influenza 2001-2002 foram construídos para
avaliar a imunogenicidade de uma vacina de DNA da influenza trivalente
15 humana candidata em um modelo de animal relevante. Historicamente, o
porco doméstico foi usado como um modelo para as vacinas de DNA na
PMED em seres humanos devido às similaridades próximas nas arquiteturas
da pele humana e de porco. A relevância do modelo de porco como um
prognosticador do desempenho de vacina de DNA na PMED em seres
20 humanos foi demonstrado por um teste clínico humano de fase I de uma
vacina de DNA de antígeno de superfície da hepatite B em que o bom
desempenho da vacina em porcos foi espelhado em seres humanos.
As amostras de três cepas de vacina da influenza humana
2001-2002 (A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), e
25 BNictoria/5/00) foram obtidos do Centers for Disease Control (CDC) e
usadas em experimentos da transcriptase reversa/reação da cadeia da
polimerase (RT-PCR) para gerar fragmentos de DNA que codifiquem os
antígenos de HA correspondentes. As seguintes etapas foram utilizadas no
desenvolvimento dos três vetores de vacina de DNA HA finais:

139
A produção pela RT-PCR de fragmentos de dsDNA de
segmento #4 de RNA de A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New
Caledonia/20/99 (H1N1), e BNictoria/5/00.
Propagação de clones de DNA do segmento #4 de RNA
5 em um vetor com base em pUC 19 padrão na E. coli.
Análise de seqüência da seqüência codificadora de HA
dentro dos clones do segmento #4 de RNA.
Uma segunda série de reações de PCR (com base nos
dados de seqüência de gene de HA real) para gerar fragmentos de DNA de
10 cada vírus contendo a seqüência codificadora de HA (sem códons de ATG)
com as extremidades compatíveis com o vetor de expressão da vacina de
DNA pPJV7563 (Nhe I e Bsp 1201).
Inserção dos três fragmentos de seqüência codificadora de
HA no vetor de vacina de DNA clínico pPJV7563 produzindo os três vetores
15 de vacina de DNA finais.
Análise de seqüência de seqüências codificadoras HA em
todos os três vetores confirmando que nenhuma mutação ocorreu.
Os vetores resultantes utilizam promotores quiméricos da
invenção. Assim, os vetores utilizam o promotor inicial imediato de
20 citomegalovírus humano (hCMV) e as seqüências não codificadoras 5' de
exons iniciais imediatos 1 e 2. Este promotor está ligado ao intron A da
insulina de rato e a região não traduzida 5' (UTR) do gene pre-S2 do vírus da
hepatitis B (HBV). A tradução da seqüência codificadora HA começa em um
códon ATG que é fixado no vetor no contexto de uma seqüência de início de
25 tradução Kozak de consenso. A seqüência codificadora HA é seguido por um
realçador transcricional de HBV (HBVenh). Finalmente, a terminação da
transcrição é facilitada por um sítio de poliadenilação de 0-globina de coelho.
Como os códons de início de tradução ATG naturais de genes
HA não se conformam à seqüência de consenso de Kozak para o início de

140
tradução, o elemento ATG fornecido pelo vetor de vacina de DNA pPJV7563
foi usado para o início de tradução. A expressão de antígeno a partir de
vetores de vacina de DNA é no geral realçada usando códons ATG que se
conformam com o consenso Kozak. O uso do códon ATG fornecido pelo
5 vetor (por intermédio de inserção no sítio Nhe I) resulta em uma inserção de
dois aminoácidos menores no terminal amino da seqüência codificadora do
antígeno HA.
A imunogenicidade destes vetores foi avaliada em uma
formulação trivalente no modelo de porco doméstico. Os três vetores foram
10 misturados 1:1:1 e formulados em partículas de ouro a uma taxa de 2 gg de
DNA total /mg de ouro, usando 0,5 mg de ouro por administração. Cada
imunização consistiu de duas administrações na PMED em tandem
totalizando 2µg de DNA e 1 mg de ouro. O regime de vacinação envolveu
duas de tais imunizações espaçadas quatro semanas. Os porcos ingênuos em
15 influenza foram divididos em dois grupos de imunização com base no
dispositivo de liberação real utilizado. Um grupo de animais receberam
vacinações de DNA da influenza trivalentes usando o dispositivo PMED de
"pesquisa" reutilizável que foram usados com sucesso para induzir respostas
imunes a numerosos antígenos em uma variedade de animais. O segundo
20 grupo de animais receberam imunizações usando o dispositivo clínico que foi
usado para vacinar com sucesso seres humanos usando uma vacina de DNA
de HBV. Este último dispositivo difere do dispositivo de pesquisa em que o
mesmo utiliza um bocal plástico descartável de "tiro único" no lugar do bocal
reutilizável de 12 tiros associado com o dispositivo de pesquisa.
25 Duas semanas a seguir da segunda imunização, as amostras de
soro foram coletadas e os títulos de anticorpo de inibição da hemaglutinação
(HI) específicos para os vírus homólogos H3, H1 e B foram medidos. Estes
dados são mostrados na Figura 19. 100% de soroconversão foram observados
para os antígenos H3 e B usando ambos os dispositivos com reservatório de

141
títulos de HI médios geométricos em excesso do nível substituto de 1:40
habitualmente acreditado ser requerido para a imunogenicidade para
influenza. Os dados obtidos indicam que esta plataforma de tecnologia será
capaz para evocar respostas significantes em seres humanos.
5 As respostas imunes específicas de H1 foram mais baixas. Isto
foi mais tarde determinado ser devido a um rearranjo no gene HA de H1 que
ocorreu no vetor de vacina de DNA de H1 durante a produção de plasmídeo.
Estes rearranjos não foram detectados na análise inicial do DNA antes da
formulação e vacinação, mas seriam detectados por uma análise mais
10 rigorosa. Com base nos resultados usando os vetores H3 e B, é provável que
as respostas específicas de H1 tenham sido acentuadamente maiores tiveram
um plasmídeo funcional sendo utilizado.
Exemplo 19. Construção de pPJV2012 plasmídico
O pPJV2012 plasmídico foi construído. pPJV2012 expressa as
15 subunidades A B da e toxina instável ao calor (LT) de Escherichia coli
enterotoxigênica. A expressão de toxin LT funcional de pPJV2012 in vivo
pode ser usada para realçar a resposta imune a outras proteínas expressadas a
partir de plasmídeos co-administrados com pPJV2012.
LT é uma proteína multimérica de 84 kD composta de uma
20 única subunidade A e um pentâmero de subunidades B idênticas. LT é
expressado e secretado de E. coli e liga-se a gangliosídeo GM1 nas células
intestinais por intermédio do pentâmero de subunidades B. A toxina é
internalizada e a subunidade A então ativa a produção de cAMP excessivo e o
rompimento do equilíbrio eletrolítico através do lúmen intestinal (Tauschek,
25 et al (2002) Proc Natl Acad Sci, USA 99: 7066-7071). Assim para a atividade
biológica de LT expressado in vivo a produção tanto de subunidade A quanto
B é requerida junto com sinais que medeiem a secreção a partir da qual
células de expressão. Os vetores plasmídicos que codificam as subunidades A
e B de LT mostraram to aumentar a resposta imune induzida a diversos

142
antígenos virais quando co-liberadas usando a liberação epidérmica mediada
particular (Arrington et al (2002) J Virol 76 (9): 4536-46).
Além das seqüências codificadoras para as subunidades A e B
da toxina LT, pPJV2012 também incorpora as seqüências promotoras
5 quiméricas da invenção para garantir a expressão de gene eficaz, um
seqüência poli A de beta globina de coelho, seqüências de sinal para mediar a
secreção a partir da qual células expressam, um gene de resistência à
canamicina e uma origem bacteriana de replicação. O plasmídeo é mostrado
na Figura 22.
10 O plasmídeo pPJV2012 foi construído por intermédio das
seguintes etapas:
Amplificação pela PCR da seqüência codificadora A de
LT de DNA genômico de E. coli e inserção em um plasmídeo intermediário;
Excisão da seqüência codificadora A de LT e inserção em
15 um plasmídeo "Aceitador" sob o controle do promotor de CMV.
A amplificação pela PCR da seqüência codificadora B de
LT a partir do DNA genômico de E. coli e inserção em um plasmídeo
intermediário sob o controle de um promotor truncado de CMV.
Excisão do cassete de expressão A de LT.
20 O plasmídeo resultante, pPJV2012, a expressão de ambas as
subunidades de LT em células de mamífero.
Promotor e seqüências realçadoras em pPJV2012
A subunidade A de LT é expressada a partir de um promotor
Inicial Imediato de CMV (IE). A subunidade B de LT é expressada a partir de
25 um promotor IE de CMV truncado. As seqüências adicionais são incluídos
para ambos os genes para melhorar a expressão, especificamente a HBV pre-
S2 UTR 5' (Moriarty et al (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 2606-2610),
exon 'A de CMV (consistindo dos dois primeiros exons IE de CMV unidos
juntos pela deleção do intron natural), intron A da insulina de rato (Lomedico

143
et al (1979) Cell 2: 545-558) e poli A de beta globina de rato (rGpA). Para
garantir a secreção das células de expressão o peptídeo de sinal da lisozima de
galinha (CLSP; número de acesso no Genbank CR390743) foi inserido a
ambas as subunidades LT. Além disso, o realçador env do HBV (Vannice e
5 Levinson (1988) J Virol. 62: 1305-1313) foi inserido depois da subunidade A
para melhorar a expressão.
Clonagem das subunidades A e B de LT
A cepa E078 da E. coli: H11 foi obtida da ATCC (catálogo
#35401), e as subunidades A e B foram amplificadas pelas reações de PCR
10 separadas usando iniciadores homólogos para as extremidades 5' e 3',
planejadas pela referência ao arquivo de acesso no GenBank AB011677. As
seqüências codificadoras geradas para ambas as subunidades não incluem as
seqüências que codificam os peptídeos de sinal bacterianos encontrados nos
términos amino. Os fragmentos de subunidade A e B foram separadamente
15 ligados no plasmídeo WRG7054.
Construção de pPJV2012
A seqüência codificadora A de LT foi excisada e ligada com a
cadeia principal de vetor de pPJV7592 e um fragmento derivado de
pPJV7572 que incluiu o promotor de CMV, as regiões não traduzidas 5' e
20 CLSP. O plasmídeo resultante foi designado Al. Al foi cortado e ligado com
um fragmento de pPJV7592 para recriar um sítio de clonagem múltiplo, e o
plasmídeo resultante foi designado Aceitador; isto forneceu o componente A
de LT de pPJV2012.
A seqüência codificadora B de LT foi excisada e ligada com a
25 cadeia principal de vetor de pPJV7591 e a um fragmento derivado de
pPJV7572 que continha a extremidade 3' das regiões não traduzidas e o
CLSP. O plasmídeo resultante foi designado Doador e forneceu o componente
B de LT de pPJV2012.
Para gerar pPJV2012 um fragmento de Doador contendo o

144
cassete de expressão B de LT foi ligado com um fragmento de vetor derivado
de Aceitador. O plasmídeo resultante expressa tanto A quanto B de LT em
células de mamífero.
Origem das seqüências de nucleotídeo em pPJV2012
5 pPJV2012 foi totalmente seqüenciado e alinhado com bases de
dados para designar a origem de cada seqüência. As seqüências derivadas,
mostradas na Tabela 6 abaixo, foram como esperadas.
Tabela 6: Identificação de Componentes Que compreendem Plasmídeo
pPJV2012
Números de base Identificação do Componente
1-905
Seqüências derivadas de pUC4K incluindo o gene de resistência à
canamicina
906-1038 poli A de beta globina de coelho
1039-1351 seqüência codificadora da subunidade B de LT
1352-1357 Seqüência ligadora
1358-1417 seqüência de sinal da lisozima de galinha
1418-1538 UTR 5' de HBV pre-S2
1539-1544 Seqüência ligadora
1545-1677 Intron A de rato
1678-1683 Seqüência ligadora
1684-1814 exon 1 / 2 de CMV
1815-1935 Promotor IE de CMV truncado
1936-1947 Seqüência ligadora
1948-2632 promotor de CMV
2633-2763 CMV exon 1 / 2
2764-2769 Seqüência ligadora
2770-2902 Intron A da insulina de rato
2903-2908 Seqüência ligadora
2909-3029 UTR 5' de HBV pre-S2
3030-3089 Peptídeo de sinal da lisozima de galinha
3090-3095 Seqüência ligadora
3096-3818 seqüência codificadora A de LT

145
Números de base Identificação do Componente
3819-3830 Seqüência ligadora
3831-4363 seqüência realçadora HBV env
4364-4374 Seqüência desconhecida
4375-4050 poli A de beta globina de coelho
4051-5578 Seqüência derivada de pUC19
Além disso, uma pesquisa BLAST foi realizada para
homologias de seqüência para o genoma humano inteiro, procurando
similaridades de seqüência em trechos tão curtos quanto 19 bases. Não foram
"encontradas nenhuma similaridade significante"; o maior grau de homologia
5 foi com uma seqüência de 68 bases de rGpA, embora o trecho mais longo de
seqüência idêntica foi apenas de 18 bases.
Comparação de seqüência de pPJV2012 com pPJV1671
A seqüência de pPJV2012 foi comparada com aquela de
pPJV 1671. Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo.
10 Tabela 7: Comparação da seqüência de pPJV2012 com pPJV1671
Números de base da seqüência em
pPJV2012
1-896
897-905
906-1038
1039-1351
1352-1357
1358-1417
1418-1538
1539-1544
1545-1677
1678-1683
1684-1814
1815-1935
1936-1947
Seqüência também presente na vacina
de DNA contra a influenza de
pPJV1671?
Sim
Não
Sim
Não
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim

Números de base da seqüência em
pPJV2012
1948-2632
2633-2763
2764-2769
2770-2902
2903-2908
2909-3029
3030-3089
3090-3095
3096-3818
3819-3824
3825-3830
3831-4363
4364-4374
4375-4505
4512-5578
146
Seqüência também presente na vacina
de DNA contra a influenza de
pPJV1671?
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Sim
Não
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
A análise demonstra que 4418 dos 5578 pares de base (79%)
em pPJV2012 também estão presentes na vacina de DNA contra a influenza
de pPJV1671. Exclusivo das seqüências codificadoras para as subunidades A
e B de LT, 4418 dos 4544 pares de base (97%) de pPJV2012 também estão
5 presentes em pPJV 1671.
Observe que pPJV1671 tem passado pelos estudos de
biodistribuição/integração e em cada caso nenhuma evidência de integração
foi encontrada.
Exemplo 20 - Construção do plasmídeo pPJV7788 um plasmídeo que
10 expressa as subunidades LT da E. coli em células de mamífero
plasmídeos:
O plasmídeo pPJV7788 foi gerado usando os seguintes
pPJV7563 e pPJV7592 que são plasmídeos derivados de
pPJV7275, pPJV7284, pPJV7389, pPJV7586 e pPJV7293.

147
pPJV7590 que é um derivado de pPJV7389 que inclui um sítio
de clonagem múltiplo (MCS) imediatamente a montante do promotor de
CMV.
pPJV7572 que é um derivado de pPJV7389 que contêm a
5 seqüência codificadora para o peptídeo de sinal da lisozima de galinha
(CLSP) diretamente a montante do antígeno codificado. Isto possibilita a
secreção extracelular de antígenos fundidos no terminal C.
(i) Construção de pPJV7785 (Plasmídeo Aceitador LTA)
pPJV7563 foi cortado com Sal 1 , com extremidade abrupta e
10 cortado com Nde 1 para criar um fragmento de vetor. pPJV7590 foi cortado
com Sphl, com extremidade abrupta, e cortado com Ndel para criar um
fragmento de inserto contendo um MCS e as cinco extremidades de iniciador
do promotor de CMV. Estes fragmentos foram ligados para gerar pPJV7592.
pPJV7592 foi cortado com Nco 1 e Bg12 para criar um
15 fragmento de vetor. pPJV7572 foi cortado com Ncol e Nhel para criar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, as
regiões não traduzidas 5', e o CLSP. pPJV2004 foi cortado com Nhe 1 e
BamHl para criar um fragmento de inserto contendo a subunidade LTA.
Estes fragmentos foram ligados para gerar o plasmídeo pPJV7785.
20 (ii) Construção de pPJV7787 (Plasmídeo Doador LTB)
pPJV7389 foi cortado com Ncol e EcoR1 para criar um
fragmento de vetor. pPJV7572 foi cortado com Nco 11 e Nhe 1 para criar um
fragmento de inserto contendo a extremidade 3' do promotor de CMV, a
região não traduzida 5', e o CLSP. pPJV2005 foi cortado com Nhel e BamH1
25 para criar um fragmento de inserto contendo a subunidade LTB. pPJV7586
foi cortado com Bg12 e EcoR1 para criar um fragmento de inserto contendo a
região de poliadenilação de beta-globina de coelho. Estes fragmentos foram
ligados para gerar pPJV7787.
(iii) Construção de pPJV7788

148
pPJV7785 foi cortado com Xho 1 e Mfe 1 para criar um
fragmento de vetor contendo o cassete de expressão LTA. pPJV7787 foi
cortado com Xho 1 e EcoR1 para criar um fragmento de inserto contendo o
cassete de expressão LTB. Estes fragmentos foram ligados para gerar
5 pPJV7788 que expressará as subunidades LTA e LTB quando introduzidas
em células de mamífero.
na construção pPJV7788.
A Tabela 8 abaixo fornece a localização dos vários elementos
Tabela 8: Componente ID para pPJV7788
Números de Base Componente
1-44 Tn903, remanescentes de pUC4K
45-860 KanR (Tn903)
861-983 Tn903, remanescentes de pUC4K
984 —1001 pUC19 MCS
1002 -1686 CMV Pro
1687-1817 Exon 1/2 de CMV
1818-1823 fusão Bam/Bgl
1824-1956 Intron A da insulina de rato
1857-1962 sítio BamHl
1963-2083 UTR 5' de HBV pre-S2
2084-2143 Lisozima SP
2144-2149 Sítio Nhel
2150-2462 LTB
2463-2593 RBGpA
2594-2623 Sítio de Clonagem Múltipla
2624-3308 CMV Pro
3309-3439 Exon 1/2 de CMV
3440-3445 fusão Bam/Bgl
3446-3578 Ins IntA de Rato

3579-3584 BamH1
149
3585-3705 UTR 5' de HBV pre-S2
3706-3765 Lisozima SP
3766-3671 sítio Nhel
3772-4494 LTA
4495-4506 Poliligador
4507-5039 HBVenh
5040-5050 Origem desconhecida.
5051-5181 rGlob pA
5182-5187 sítio EcoR1
5188-6254 pUC19
Exemplo 21 - Construção de pPML7789, um Plasmídeo que Expressa a
Proteína de Hemaglutinina H5/ VN1194 em células de mamífero
Uma outra construção, pPML7789, capaz de expressar a
Proteína de Hemaglutinina H5/ VN1194 utilizando um promotor quimérico
5 da invenção foi gerado.
A construção pPJV7563 descrita no Exemplo 5 foi usada como
a cadeia principal para a construção pPML7789.
Um plasmídeo que abriga a seqüência codificadora para o gene
HA de H5/VN1194 foi usado como o padrão para a PCR. Os iniciadores de
10 PCR foram planejados com sítios nas extremidades cinco e três do iniciador
para permitir a inserção no pPJV7563. O pPJV7563 foi cortado com Nhel e
Bsp120I para gerar um fragmento de vetor. O fragmento de PCR amplificado
a partir do padrão H5/VN1194 foi cortado com as mesmas enzimas para gerar
um fragmento de inserto. Estes dois fragmentos foram ligados para produzir
15 pPML7789. As seqüências codificadoras e flanqueadoras foram verificadas
pelo seqüenciamento.
As posições de nucleotídeo dos vários elementos em
pPML7789 são indicados na Tabela 9 abaixo.

150
Tabela 9: Componentes de construção pPML7789
Posição de Nucleotídeo Elemento
Início: 1 Fim: 44 Tn903, remanescentes de pUC4K
Início: 45 Fim: 860 KanR (Tn903)
Início: 861 Fim: 896 Tn903, remanescentes de pUC4K
Início: 897 Fim: 902 pUC19 MCS
Início: 903 Fim: 1587 CMV Pro
Início: 1588 Fim: 1718 Exon 1/2 de CMV
Início: 1719 Fim: 1724 Fusão Bam/Bgl
Início: 1725 Fim: 1857 Ins IntA de Rato
Início: 1858 Fim: 1863 Sítio BamHl
Início: 1864 Fim: 1984 UTR 5' de HBV pre-S2
Início: 1985 Fim: 1993 ATG-Nhe
Início: 1994 Fim: 3699 VN1194H5
Início: 3700 Fim: 3705 Sítio Bsp120I
Início: 3706 Fim: 4238 HBVenh
Início: 4239 Fim: 4249 Seqüência ligadora desconhecida
Início: 4250 Fim: 4380 rGlob pA
Início: 4341 Fim: 4341 Sítio PoliA
Início: 4381 Fim: 4386 Sítio EcoR1
Início: 4387 Fim: 5453 pUC19
Exemplo 22. Respostas imunes celulares protetoras potentes geradas pela
5 Vírus
imunização de DNA com HSV-2 ICP27 e toxina instável ao calor de E. coli
Materiais e Métodos
Os vírus HSV-2 (cepa MS, ATCC VR-540 e cepa HG52 G
presentes de Nancy Sawtell, University of Cincinnati) foram cultivados em
células VERO (ATCC CCL-81) e purificados em gradientes de sacarose antes
do uso.
10 Vacina de DNA e vetores DEI
O plasmídeo que codifica ICP27 do HSV-2 (Fig. 27) foi
gerado pela inserção de um fragmento de PCR que incorpora o gene ICP27
inteiro (UL54) no pTarget (Promega, Madison WI). O fragmento de PCR foi
amplificado a partir de DNA genômico purificado da cepa MS de HSV-2
15 usando iniciadores 5' (GCCACTCTCTTCCGACAC, SEQ ID NO: 63) e 3'
(CAAGAACATCACACGGAAC, SEQ ID NO: 64). As seqüências
amplificadas correspondem aos nucleotídeos 114,523 a 116,179 da seqüência

151
de genoma publicada do clone HG52 de HSV-2 (número de acesso no
GenBank NC 001798). O pICP27 foi seqüenciado na sua totalidade pela
DNA Sequencing Core Facility na University of Wisconsin, Madison.
O plasmídeo PJV2012 codifica tanto a subunidade A quanto B
5 de LT a partir de um vetor único e é mostrado na Figura 22. A construção de
pPJV2012 é descrita no Exemplo 19. Em pPJV2012, o gene da subunidade A
de LT é expressado a partir de uma unidade de transcrição consistindo dos
seguintes componentes: o promotor inicial imediato de citomegalovírus
humano (hCMV), exons 1 e 2 fundidos de hCMV (não codificador), intron A
10 da insulina de rato, região não codificadora 5' do gene pre-S2 do vírus da
hepatite B (HBV), códon ATG, seqüência de peptídeo de sinal codificadora
de lisozima, seqüência codificadora da subunidade LT A, região realçadora
transcricional do HBV não codificadora 3', e a seqüência de poliadenilação de
beta globina de coelho.
15 pPJV2012 também codifica o produto da subunidade LT B de
uma segunda unidade de transcrição que funciona na direção oposta (Figura
22). A unidade de transcrição LT B é similar àquela que codifica o produto
LT A mas não contém cópias adicionais do hCMV e elementos realçadores
transcricionais de HBV. Os elementos realçadores de hCMV e HBV
20 localizados na unidade de transcrição LT A também serve a unidade de
transcrição LT B.
O plasmídeo PJV2013 (não mostrado) é similar a pPJV2012
mas codifica os produtos tanto da subunidade A quanto da B de toxina do
cólera de um vetor único. O mapa funcional de pPJV2013 é idêntico àquele
25 mostrado para pPJV2012 na Figura 22.
A vacinação de DNA por intermédio da liberação epidérmica mediada por
partícula (PMED)
A vacinação de DNA na PMED de camundongos Balb/c
fêmeas de 6 a 8 semanas de idade foi como anteriormente descrito (Arrington

152
et al, J. Virol. 76, 4536-4546, 2002) exceto que cada imunização consistiu de
uma liberação em PMED única à pele abdominal ventral em que cada
liberação conteve 0,5 mg de ouro revestido com um total de 0,5 gg da vacina
de DNA / formulação de vetor DEI. Duas de tais imunizações de "tiro único"
5 foram administradas 4 semanas separadamente e os animais foram
sacrificados ou inoculados 2 semanas seguintes à segunda imunização ou de
"reforço".
Reuniões de peptídeo e peptídeos
A seqüência de aminoácido derivada para ICP27 do vírus da
10 cepa MS foi usada como um padrão para a biblioteca. A proteína ICP27 é
altamente conservada entre a seqüência HG52 e MS (ver a Figura 28 e a SEQ
ID NO: 65) assim a biblioteca seria capaz de detectar respostas para ambas as
cepas. Uma biblioteca de peptídeo foi sintetizada (Mimotopes, Fisher
Scientific) para transpor a seqüência inteira de ICP27 usando peptídeos de 18
15 aminoácidos no comprimento que tiveram uma sobreposição de 11
aminoácidos com o peptídeo adjacente. Um total de 72 peptídeos foram
fabricados.
Para facilitar a identificação de peptídeos positivos a biblioteca
foi dividida em reuniões de peptídeo usando a estratégia descrita por Tobery
20 et al J. Immunol. Methods 254, 59-66, 2001. As reuniões de peptídeo foram
geradas usando o padrão mostrado na Tabela 10. Houve 12 reuniões
(chamadas C 1-C12) com 6 peptídeos por reunião e 6 reuniões (R1-R6) com
12 peptídeos por reunião. Os peptídeos contendo reuniões #45 e #46 estão em
negrito.
25 Tabela 10: Composições de Reunião de Peptídeo
Cl C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 CIO
RI 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19
R2 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43
R3 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67
R4 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
R5 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
R6 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70

C11 C12
R1 21 23
R2 45 47
R3 69 71
R4 24 26
R5 48 50
R6 72 2
Ensaios de ELISPOT
153
Os ensaios de ELISPOT IFN-y foram realizadas em
esplenócitos frescos e as células de linfonodo como anteriormente descrito
exceto os antígenos para a estimulação foram peptídeos únicos ou reuniões de
5 peptídeo como definido para cada experimento na seção resultados. Em
alguns exemplos, antes do ensaio ELISPOT, as populações de célula T foram
esgotadas pelas pérolas magnéticas (Dynal) que seguem as instruções do
fabricante.
Ensaios de série de pérola citométrica (CBA)
10 Esplenócitos frescos foram coletados duas semanas a seguir da
segunda imunização e recolocados em suspensão a 1 x 10 7 células por ml em
SM (meio RPMI + 10% de soro bovino fetal suplementado com MEM
piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais e 2-mercaptoetanol (Invitrogen,
Carlsbad, CA)). As amostras de célula foram plaqueadas a 1 x 10 6 células
15 (100 1_11) por reservatório em placas de fundo chato de 96 reservatórios. Os
esplenócitos foram tratados com alíquotas de 100 vil do peptídeo ICP27 em
SM ou apenas meio. A concentração de peptídeo final foi de 10 -8 M. Os
esplenócitos de controle de animais ingênuos foram também plaqueados com
e sem peptídeo e com e sem Con-A (concentração final de 2,5 mg/ml) para
20 servir como controles negativo e positivo, respectivamente.
As placas foram incubadas a 37° C por 48 horas e depois 160
gl de cada amostra foram coletados e armazenados a -20° C até ensaiados
usando o kit BD Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Thl/Th2 (BD
Biosciences, San Jose, CA (cat. #551287)). Em resumo, este kit usa 5

154
populações de pérola com intensidades de fluorescência distintas revestidas
com anticorpos de captura específicos para IL-2, IL-4, IL-5, INF-y, e TNF-a
de camundongo. As cinco populações de pérola são misturadas juntas para
formar a série que é resolvida no canal FL3 do citômetro de fluxo BD
5 FACSCalibur. As pérolas de captura de citocina são misturadas com os
anticorpos de detecção conjugados a PE e depois incubados com padrões ou
amostras de teste para formar complexos intercalados. O Software de análise
BD CBA foi usado para gerar os resultados depois da aquisição da amostra. A
intensidade da amostra para cada citocina é comparada com as curvas padrão
10 para facilitar a quantificação de concentrações de citocina. As amostras foram
conduzidas puras ou em uma diluição de 1:10 de acordo com as instruções do
fabricante.
Inoculação de vírus do HSV-2
Os camundongos Balb/c anestesiados foram intranasalmente
15 inoculados com 30 pl de PBS contendo aproximadamente 50LD 50 (2 x 10 6
depois da infecção e classificados quanto a morbidez e mortalidade. A
morbidez foi classificada em uma escala de O a 4 de acordo com o seguinte
programa: 4, saudável; 3, pelo eriçado, espirrando; 2, feridas nos olhos ou
20 anca, movimento reduzido; 1, encurvado, pouco movimento; 0, morto. Os
camundongos que foram tratados com anticorpos monoclonais específicos de
IFN-y (Bioscience, San Diego, CA (cat. # 16-7311) e/ou de TNF-a (cat. # 16-
7332) perto do tempo de inoculação receberam injeções intraperitoneais
contendo 90 lig de anticorpo nos dias -2, 0, 2, 4, 6, e 8 em relação à
25 inoculação viral. Nos experimentos de esgotamento de célula T, os
camundongos receberam injeções intraperitoneais contendo 200 lig de
anticorpo específico para as populações de CD4 ou CD8 nos dias -2 e O em
relação à inoculação viral (Functional Grade purified anti-mouse CD4,
eBioscience Cat#: 16-0041; Functional Grade purified anti-mouse CD8,
PFU) da cepa MS do HSV. Os camundongos foram seguidos por 20 dias

eBioscience; Cat#: 16-0081).
Resultados
155
Identificação de um epítopo CD8 forte em camundongos Balb/c.
Para identificar respostas de célula T contra a proteína ICP27,
5 um ensaio ELISPOT de IFN-y foi realizado nas células recuperadas de
camundongos Balb/c e C57B1/6 infectadas com uma cepa atenuada de HSV-2
(HG52 cepa G). Uma biblioteca de peptídeo composta de peptídeos que
transpõem o comprimento inteiro da seqüência codificadora ICP27 foi usada
para estimular as células T. Os peptídeos foram 18 aminoácidos no
10 comprimento e peptídeos vizinhos sobrepostos por 11 aminoácidos. As
reuniões de peptídeo foram compostas de cada 6 peptídeos (Reuniões C 1-
C12) ou 12 peptídeos (Reuniões R1-R6) como descrito em Materials and
Methods e Tabela 10, uma configuração que facilitou a identificação de
peptídeos positivos dentro da biblioteca. As células de baço e linfonodo
15 recuperadas de camundongos Balb/c 7 dias depois da infecção mostraram
respostas muito fortes aos peptídeos dentro das reuniões C10, C11, R2 e R5
(Figura 29A) com respostas mais fracas em diversas outras reuniões. apenas
respostas fracas foram detectadas nas células recuperadas de camundongos
C57B1/6. O padrão de respostas positivas foi descoberto ser similar nas
20 populações de célula do baço e linfonodo ensaiadas.
Com base nos resultados de ELISPOT de IFN-y, dois
peptídeos adjacentes (#45, #46) foram prognosticados conter o epítopo de
célula T dominante. Isto foi confirmado testando-se cada peptídeo
individualmente (dados não mostrados). Os peptídeos 45 e 46 estimularam
25 secreção de IFN-y forte e contiveram uma seqüência homóloga de nove
aminoácidos HGPSLYRTF (Fig 29B, SEQ ID NO: 68) que é prognosticada
para ligar o alelo Dd. De maneira interessante, o peptídeo 46 também contêm
uma região que corresponde a um epítopo previamente descrito em
camundongos Balb/c para ICP27 de HSV-1 (Banks et al, J. Virol. 67, 613-

156
616, 1993). A comparação de seqüências ICP27 no HSV-1 e HSV-2 mostrou
que a região difere em um único aminoácido; o resíduo de alanina (A) no
ICP27 de HSV-2 (LYRTFAANPRA, SEQ ID NO: 69) é substituído por uma
glicina (G) no HSV-1 (LYRTFAGNPRA, SEQ ID NO: 70). A região,
5 entretanto, não está presente no peptídeo 45 embora este peptídeo estimule
uma resposta extremamente forte.
Para determinar a importância relativa dos dois epítopos
potencial no peptídeo 46 no ensaio de IFN-y ELISPOT, os peptídeos
LYRTFAANPRA e o HGPSLYRTF foram sintetizados e testado. As células
10 de baço isoladas de camundongos infectados responderam fortemente ao
peptídeo HGPSLYRTF, mas nenhuma resposta acima do fundo foi detectada
para a seqüência LYRTFAANPRA. Usando pérolas magnéticas para esgotar
as populações de célula T antes do ensaio de IFN-y ELISPOT, resultou em
uma resposta de CD8+ ICP27 forte. Os dados indicam que uma resposta de
15 CD8 forte é gerada em camundongos Balb/c contra a proteína ICP27 do HSV-
2 que é específica para a seqüência HGPSLYRTF.
Respostas imunes in vitro para a vacina ICP27
Uma vacina de DNA, "pICP27", foi gerada usando seqüências
ICP27 da cepa MS de HSV-2 (Fig. 27). A construção seqüenciada teve apenas
20 duas diferenças de nucleotídeo da seqüência de gene de HG52 ICP27
publicada (Figura 28). Houve uma mudança de G para A no nucleotídeo 57
que pode ser silenciosa, e uma mudança de A para C no 484 pode mudar uma
lisina na cepa HG52 para uma asparagina na versão MS. Assim, a proteína
ICP27 cepa MS expressada da vacina de DNA podem ser quase idênticos à
25 versão da cepa HG52 da proteína sem nenhuma diferença na região do
epítopo CD8 putativo.
A vacina de DNA de pICP27 foi usada para imunizar
camundongos Balb/c e C57B1/6 pela PMED. As células de esplenócitos e
linfonodos foram testadas no ensaio IFN-y ELISPOT contra o painel de

157
reuniões descrito na Figura 29. O padrão de respostas positiva para os
peptídeos ICP27 encontrados nos camundongos imunizados com DNA foram
os mesmos como aqueles encontrados nos camundongos infectados (dados
não mostrados).
5 Respostas in vivo para a vacina ICP27
A atividade in vivo de respostas imunes geradas pela
vacinação de DNA de pICP27 foi estudada em um modelo de infecção
intranasal profilática em camundongos Balb/c. A infecção com várias doses
da cepa MS de HSV-2 em camundongos Balb/c de 12 semanas de idade
10 estabeleceu uma LD 50 de aproximadamente 3 x 10 4 PFU (dados não
mostrados). Em experimentos de proteção de DNA, uma dose de inoculação
virai de 50 LD 50 foi usada porque esta dose consistentemente resultou em
100% de mortalidade em animais ingênuos.
Uma série de experimentos mostrou que a imunização com
15 DNA de pICP27 sozinho (iniciador e reforço) teve capacidade limitada para
proteger camundongos. Portanto, para melhorar a proteção vetores DEI que
codificam a toxina do cólera (CT) ou a toxina instável ao calor de E. coli (LT)
foram co-liberadas com a vacina de DNA ICP27. As subunidades de toxina A
e B foram expressadas a partir do mesmo plasmídeo para cada uma das duas
20 toxinas.
Os camundongos foram imunizados com a vacina de DNA de
ICP27, sozinha, ou suplementada com vetores CT ou LT DEI a uma razão de
9:1 (0,45 gg de DNA antígeno + 0,05 pg de DNA de vetor DEI). Um total de
16 animais por grupo de imunização foram utilizados, metade dos quais foram
25 inoculados com vírus e a outra metade sacrificada no momento da inoculação
para a produção de citocina específica de ICP27.
Os resultados deste estudo são mostrados na Figura 31. Os
resultados mostram que a imunização com as formulações ICP27 + CT e
apenas ICP27 forneceram proteção parcial e nenhuma proteção,

158
respectivamente, ao passo que 100% de proteção foi observada para a
formulação de ICP27 + LT (Figura 31 A). Estes resultados confirmam que a
co-liberação de vetores DEI com o vetor ICP27 realçam a proteção e reforçam
a superioridade de LT em relação a CT como um imunoestimulador na
5 imunização de DNA. A quantificação da produção de citocina que segue a
estimulação in vitro com o peptídeo de epítopo CD8 usando o kit CBA
demonstrou uma boa correlação entre a sobrevivência na inoculação e os
níveis da produção tanto de INF-y (Figura 31 B) quanto de TNF-a (Figura
31C).
10 O papel de citocinas e populações de célula T
O papel da produção específica de ICP27 de IFN-y ou TNF-a
na proteção de animais inoculados foi avaliada. Os animais vacinados com
pICP27 + pPJV2012 (LT) foram tratados com anticorpos monoclonais
específicos para INF-y e/ou TNF-a por diversos dias próximos do momento
15 da inoculação para neutralizar estas citocinas in vivo. Os dados de morbidez
são mostrados na Figura 32. Como antes, os animais que receberam duas
vacinações ICP27 + LT DEI foram completamente protegidos da inoculação e
exibiram apenas uma morbidez transitória branda (eriçamento do pelo em 1
de 4 animais) enquanto 100% de camundongos ingênuos ou camundongos
20 imunizados apenas com o vetor pICP27 sucumbiram à inoculação. Nos
grupos imunizados com a formulação ICP27 + LT DEI e subseqüentemente
tratado com anti-TNF-a, uma morte foi observada imediatamente depois da
inoculação intranasal devido a complicações da anestesia. Importantemente,
os três camundongos remanescentes mostraram apenas eriçamento do pelo
25 transitório e recuperaram completamente indicando que a produção de TNF-a
provavelmente não contribui significantemente para a proteção. Ao contrário,
os dois grupos de camundongos imunizados com ICP27+LT DEI que
receberam anti-IFN-y ou anti-IFN-y + anti-TNF-a no momento da inoculação
tornaram-se intensamente mórbidos e 7 de 8 animais morreram,

159
demonstrando claramente a importância de IFN-y como um mediador
essencial de proteção.
Para examinar o papel das populações CD4 e CD8 na
proteção, anticorpos para CD4 ou CD8 foram usados para esgotar estas
5 populações antes da inoculação infecciosa (Fig. 33). Quando camundongos
foram seguidos quanto a mortalidade em 20 dias um padrão interessante
surgiu. Como esperado, os camundongos administrados com pICP27 com
vetor vazio não foram significantemente protegidos da infecção. A vacinação
com pICP27+LT DEI forneceu 100% de sobrevivência, ao passo que, a
10 remoção das células tanto CD4 quanto CD8 de camundongos similarmente
imunizados anulou os efeitos protetores de vacinação e tornou os
camundongos suscetíveis a cerca do mesmo nível como camundongos
ingênuos. Em camundongos imunizados com a vacina pICP27+LT DEI, o
esgotamento da população CD8 antes da infecção fazendo com que os
15 camundongos sucumbissem à infecção indicando um papel importante destas
células na proteção da infecção ou encefalite. Nos camundongos vacinados
com pICP27+LT DEI, o esgotamento da população CD4 introduziu uma
demora de nove dias (em relação aos camundongos ingênuos) antes que estes
camundongos também se tornassem doentes e morressem, sugerindo um
20 papel para as células T CD4 para a sobrevivência de longa duração.
Exemplo 23: Imunogenicidade da vacina de DNA H5N1 da Influenza em
camundongos
Materiais e Métodos
O DNA plasmídico pPML7789 (Exemplo 21, Figura 20) que
25 codifica o vírus FIA da Influenza A/Vietnam/1194/2004 [H5N1] foi
precipitado sobre partículas de ouro e liberadas a camundongos pela liberação
epidérmica mediada por partícula (PMED) usando a tecnologia de liberação
patenteada da PowderMed. A liberação foi efetuada com ou sem, como um
adjuvante, um plasmídeo pPJV2012 adicional (Exemplo 19, Figura 22) que

160
codifica as subunidades A e B da toxina instável ao calor da E. coli. Quando
pPJV2012 está presente, este plasmídeo adicional e o plasmídeo pPML7789
foram precipitados sobre as mesmas partículas de ouro. Isto foi obtido pré
misturando-se primeiro pPJV2012 e pPML7789 na forma líquida na relação
5 em peso de 1:9 e depois co-precipitando os plasmídeos sobre uma população
de partículas de ouro. Como um controle negativo, as partículas de ouro nas
quais nenhum plasmídeo foi precipitado foram liberadas pelo PMED. Os
camundongos foram como segue:
10 Número: 36
Cepa: camundongos Balb/C
Gênero: Fêmea
Faixa de peso: 15,0 a 19,6 g (no dia do primeiro procedimento)
Idade: 42 a 49 dias (no dia da chegada)
Dieta: RM1 pelotizada
15 Fornecedor: Charles River UK Ltd
Os camundongos foram divididos em seis grupos como
mostrado na Tabela 11 abaixo. Os procedimentos realizados nos
camundongos e os dias em que os procedimentos ocorreram são mostrados na
Tabela 12 abaixo. Um ensaio HAI foi realizado nos soros de acordo com
20 procedimentos padrão.

161
Tabela 11: Designação de Grupo de Tratamento para os Animais
Grupo
#
Via de
administração
# de animais em
cada grupo
1 Epidermicamente 6
2 Epidermicamente 6
3 Epidermicamente 6
4 Epidermicamente 6
5 Epidermicamente 6
6 Epidermicamente 6
Tratamento
Controle Negativo
1 dose
Sangria Dia -1, sangria e separação
Dia 14
Controle Negativo
2 doses
Sangria Dia —1 e 21, sangria e
separação Dia 36
pPML7789
1 dose
Sangria Dia —1, sangria e separação
Dia 14
pPML7789
2 doses
Sangria Dia —1 e 21, sangria e
separação Dia 36
pPML7789 + pPJV2012
1 dose
Sangria Dia —1, sangria e separação
Dia 14
pPML7789 + pPJV2012
2 doses
Sangria Dia —1 e 21, sangria e
separação Dia 36
Tabela 12: Os Seguintes Procedimentos foram Realizados nos Dias
Marcados X
Dia do estudo O 14 21 35
Implante de transponder X
Peso do corpo X X Xb Xb
Vacinação X Xb
Classificação da saúde X X Xb Xb
Soro para anticorpo X X' X" Xb
Coleta de baços Xa Xb
Culling X' X b
a Grupos 1, 3 & 5 apenas
5 b Grupos 2, 4 & 6 apenas
Resultados
Os títulos HAI contra o vírus NIBRG-14 [H5N11 foram determinados
Todos os controles foram observados estar dentro dos limites
aceitáveis. O artigo de controle negativo (vírus NIBRG-14 [H5N1]) foi
10 negativo em todas as placas. O artigo de controle positivo (células sangüíneas
vermelhas de peru) foi positivo em todas as placas. O segundo artigo de

162
controle positive (soro contendo anticorpos para vírus da Influenza
A/Galinha/Scotland/59 [H5N1]) conduzido em todas as placas a uma média
geométrica de 28, 40, 56 ou 80 HAIU (dentro de limites aceitáveis de 40
HAIU +/- 2 vezes).
5 Todas as amostras nos dias 0, 14 e 21 foram

163
Conseqüentemente, novas construções de ácido nucleico,
composições que compreendem várias construções, e técnicas de imunização
com ácido nucleico usando estas construções foram descritos. Embora as
formas de realização preferidas da presente invenção fossem descritas em
5 alguns detalhes, é entendido que variações podem ser feitas sem divergir do
espírito e do escopo da invenção.

1
LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS
POWDERJECT VACCINES, INC;
POWDERMED LIMITED
CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO
N93730C GCW
UK 0507997.5
2005-04-20
US 60/672,479
2005-04-19
US 60/648,382
2005-02-01
70
Patentln versão 3.1
1
685
DNA
Citomegalovirus humano
1
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 300
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt 360
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac 420
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 480
tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 540
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 600
cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 660
ataagcagag ctcgtttagt gaacc 685
2
131
DNA
Citomegalovirus humano
2
gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 60
gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg 120
actcaccgtc c 131
3
135
DNA
Rattus rattus
3
atcagcaagc aggtatgtac tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg 60
gatttgaggg acgctgtggg ctcttctctt acatgtacct tttgctagcc tcaaccctga 120
ctatcttcca ggtca 135
4
955
DNA
Seqüência artificial
Seqüência de promotor quimérica
4
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 300
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt 360
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac 420
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 480

2
tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 540
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 600
cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 660
ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt 720
gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg gtgcattgga 780
acgcggattc cccgtgccaa gagtgactca ccgtccggat ctcagcaagc aggtatgtac 840
tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg gatttgaggg acgctgtggg 900
ctcttctctt acatgtacct tttgcttgcc tcaaccctga ctatcttcca ggtca 955
5
121
DNA
Vírus de hepatite B
5
cagagtcagg ggtctgtatt ttcctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgc 60
tccgaatatt gcctctcaca tctcgtcaat ctccgcgagg actggggacc ctgtgacgaa 120
c 121
6
57
DNA
Vírus de herpes simplex
6
ataagctgca ttgcgaacca ctagtcgccg tttttcgtgt gcatcgcgta tcacggc 57
7
48
DNA
Vírus de hepatite B
7
ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgttca ccagcacc 48
8
533
DNA
Vírus de hepatite B
8
taacaaaaca aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg 60
ggggacattg ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc 120
tgtaaacagg cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc 180
tgctccattt acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc 240
taaacaggct ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa 300
cctttacccc gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc 360
cactggctgg ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct 420
gccgatccat actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa 480
gctcatagga actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttc 533
9
158
DNA
Citomegalovírus de macaco
9
gtcagacaga cagacagtta tatgggctgg tccctataac tctgccattg taaccccata 60
tagccagaca gttagcattg catctattga tgatgtacta atgtattgta acccccccta 120
tgccattgtc taactgtact aatgtatgat attatacc 158
10
131
DNA
Oryctolagus cuniculus
10
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120
tcactcggaa g 131
11
204
DNA
Citomegalovírus de macaco
11

3
atatatactc tatgttatac tctatgatat acaatatata ctcatgaaca ctatgtactt 60
ggtgtatgac tcattattgt ctgggacttg gttgggactt ggttggttgg gaagaatgtt 120
gtgcctgtac ttgtgctgtg ctgtggatct caataaatgt gactatgttc aaaacactaa 180
gtgcccccgt gtcttcttta acta 204
12
163
DNA
Vírus de herpes simplex 2
12
gaagacgagc tctaagggag gggaggggag ctgggcttgt gtataaataa aaagacaccg 60
atgttcaaaa atacacatga cttctggtat tgttttgcct tggtttttat ttgggggggg 120
gggggcgtgt gactagaaaa acaaatgcag acatgtgcta acg 163
13
191
DNA
Papilomavírus tipo 16 humano
13
aattgttaca tataattgtt gtataccata acttactatt ttttcttttt tattttcata 60
tataattttt ttttttgttt gtttgtttgt tttttaataa actgttatta cttaacaatg 12
cgacacaaac gttctgcaaa acgcacaaaa cgtgcatcgg ctacccaact ttataaaaca 180
tgcaaacagg c 191
14
3759
DNA
Seqüência artificial
Vetor de expressão pJV
Intron
(1725)..(1857)
Rat Ins IntA
misc aspecto
(1).(44)
Tn903, pUC4K Restantes
< .221> misc aspecto
(861T.(896)
Tn903, pUC4K Restantes
misc aspecto
(897T.(902)
pUC19 MCS
Sinal polyA
(2556T.(2686)
rGLOB pA
Sitio polyA
(2647T.(2647)
Sitio_polyA_1
promotor
(903)..(1587)
CMV Pro
3'UTR
(2012)..(2544)
HBVenh
5'UTR
(1864)..(1984)
5'-UTR of HBV pre-S2

4
misc aspecto
(1719)..(1724)
Fusão Bam/Bgl
misc aspecto
(198)..(1987)
ATG-Nhe
misc aspecto
(198)..(2011)
CDS insertion site
misc aspecto
(254 -5-)..(2555)
unknown
exon
(1588)..(1718)
CMV Exon 1/2
misc aspecto
(2695)..(3759) -
pUCl9
misc_aspecto
(45)..(860)
Complemento KanR (Tn903)
14
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaacc gtc aga tcg cct gga gac gcc atc cac
Val Arg Ser Pro Gly Asp Ala Ile His
1614
1 5
gct gtt ttg acc tcc ata gaa gac acc ggg acc gat cca gcc tcc gcg
Ala Val Leu Thr Ser Ile Glu Asp Thr Gly Thr Asp Pro Ala Ser Ala
1662
10 15 20 25
gcc ggg aac ggt gca ttg gaa cgc gga ttc ccc gtg cca aga gtg act
Ala Gly Asn Gly Ala Leu Glu Arg Gly Phe Pro Val Pro Arg Val Thr
1710

5
30 35 40
cac cgt cc ggatctcagc aagcaggtat gtactctcca gggtgggcct ggcttcccca 1768
His Arg
gtcaagactc cagggatttg agggacgctg tgggctcttc tcttacatgt accttttgct 1828
tgcctcaacc ctgactatct tccaggtcag gatcccagag tcaggggtct gtattttcct 1888
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgctccga atattgcctc tcacatctcg 1948
tcaatctccg cgaggactgg ggaccctgtg acgaacatgg ctagcgggcc cagatctggg 2008
ccctaacaaa acaaaaagat ggggttattc cctaaacttc atgggttacg taattggaag 2068
ttgggggaca ttgccacaag atcatattgt acaaaagatc aaacactgtt ttagaaaact 2128
tcctgtaaac aggcctattg attggaaagt atgtcaaagg attgtgggtc ttttgggctt 2188
tgctgctcca tttacacaat gtggatatcc tgccttaatg cctttgtatg catgtataca 2248
agctaaacag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc tttctaagta aacagtacat 2308
gaacctttac cccgttgctc ggcaacggcc tggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac 2368
ccccactggc tggggcttgg ccataggcca tcagcgcatg cgtggaacct ttgtggctcc 2428
tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagcc ggtctggagc 2488
aaagctcata ggaactgaca attctgtcgt cctctcgcgg aaatatacat cgtttcgatc 2548
tacgtatgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca 2608
tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt 2668
gtgtctctca ctcggaagga attctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 2728
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 2788
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 2848
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2908
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2968
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 3028
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 3088
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 3148
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 3208
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 3268
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 3328
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 3388
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 3448
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 3508
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 3568
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 3628
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 3688
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3748
ttgcctgact c 3759
15
42
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
15
ggaggatccg gacggtgagt cactcttggc acggggaatc cg 42
16
21
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
16
ggtgaatatg gctcataaca c . 21
17
23
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
17
ccgccgaaca tggagaacat cgc 23
18

6
33
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
18
cacagatctt ttgttagggt ttaaatgtat acc 33
19
29
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
19
ggaggatcct gacctggaag atagtcacc 29
20
26
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
20
ggaggatcca tcagcaagca ggtatg 26
21
33
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
21
ggagctagcg ggcgtttgac ctccggcgtc ggg 33
22
37
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
22
ggagaattca gatctcctct agtaaaacaa tggctgg 37
23
25
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
23
ggagctagcc ttctaaccga ggtcg 25
24
30
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
24
ggaagatctc cttactccag ctctatgctg 30
25
27
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
25
ggcgaattcc ttccgagtga gagacac 27

26
43
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
26
ggagtataca tttaaagggc cctaacaaaa caaaaagatg ggg
27
31
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
27
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g
28
36
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
28
ggaagatctc cttatttttg acaccagacc aactgg
29
29
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
29
ggagtcgacc tgtctgctta cataaacag
30
26
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
30
cgtaatgctc tgccagtgtt acaacc
31
20
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
31
gaaagatctc agcaagcagg
32
47
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
32
ggaggatcct gacctggaag atagtcaggg ttgaggcaag caaaagg
33
12
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
33

ctagcgggcc ca 12
34
12
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
34
gatctgggcc cg 12
35
28
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
35
ggagctagca tcatcccagt tgaggagg 28
36
28
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
36
ggtagatctc ctcatgtctg ctcgaagc 28
37
29
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
37
ccaagctagc gacaaaactc acacatgcc 29
38
45
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
38
ggaagatctc gtttacccct gtcatttacc cggagacagg gagag 45
39
57
DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo
39
aagatgtcca gactctgtct ctccgtggcc ctcctcgtgc tcctcgggac actcgcc 57
40
24
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
40
ggaactagta agatgtccag actc 24
41
25
DNA
Seqüência artificial
Iniciador

9
41
ggaagctagc ggcgagtgtc ccgag 25
42
75
DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo
42
ggaaagatgg ccagcctctt tgccacattt ctcgtggtgc tcgtgagcct cagcctcgcc 60
agcgaaagca gcgcc 75
43
24
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
43
ggaactagtg gaaagatggc cagc 24
44
26
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
44
ggaagctagc ggcgctgctt tcgctg 26
45
51
DNA
Seqüência artificial
Oligonucleotídeo
45
aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg g 51
46
24
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
46
ggaactagta ggtctttgct aatc 24
47
25
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
47
ggaagctagc ccccagagca gccag 25
48
31
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
48
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 31
49
25
DNA
Seqüência artificial

1 0
Iniciador
49
ggaagatctc cggtgagtgg tgctg
25
50
32
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
50
gcaggatcca gtagacctgg agagaggaca ag 32
51
29
DNA
Seqüência artificial
Iniciador
51
ggaagatcta caaggtgagc tgctgtggc 29
52
490
DNA
Vírus de pseudo raiva
52
tggccgcaga gcgggccggg catgcaaatc agaggcgcgc gggagacgcc tccgcgcgcc 60
cattggcccg ggcgagccga gatggccgcc gcgggggccg gacatgcaaa gtagacgcga 120
gaggaagtag ggagagaaat cccattggcc gtcgaggggc caagatggcg ccctcggggc 180
cggacatgca aagtagacgc gagaggaagt gggcgagaga aatcccattg gccgtcgatg 240
gggcaagatg gccgccgcgg gggccgggca tgcaaatggt cctcgcgagg aagttcctcg 300
cgaaatccca ttggccggcg gccgccatct tgggccgggc atgcaaagca gacggcagag 360
gaagcgggcg agaaaaatcc cattggccgg ccgtcgggga agtccgcggc gaaaatcggc 420
cattggtccg cttacctggg ggcgggctct cctcggggcg cttataagcg cggtctccat 480
cgtagcactt 490
53
495
DNA
Vírus de sarcoma Rous
53
ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca 60
acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg 120
ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg tgtgtttagg 180
cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagttccc tcaggatata gtagtttcgc 240
ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct tgcaacatgg 300
taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg 360
tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt ctgacatgga 420
ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc ctagctcgat 480
acaataaacg ccatt 495
54
5446
DNA
Seqüência artificial
Gene de reistência a canamicina flanqueado por seqüências Tn903
(1)..(896)
Sítio de clonagem Sal I
(897)..(902)
Promotor CMV
(903)..(1587)

11
Fusão 1/2 de exon CMV
(1588)..(1718)
Fusão Bam Hl/Bgl 2
(1719)..(1724)
Intron A de insulina de rato
(1725)..(1857)
Sítio de clonagem Bam Hl
(1858)..(1863)
Região pre S2 de não codificação de HBsAg
(1864)..(1984)
CDS
(1985)..(3691)
Nucleotídeo G de H3 Panama 3" UTR
(3692)..(3692)
Sítio de clonagem Bsp1201
(3693)..(3698)
Melhorador HBV
(3699)..(4231)
Região de poliadenilação de beta globina de coelho
(4243)..(4373)
Sítio de clonagem Eco RI
(4374)..(4379)
Seqüências da estrutura dorsal do vetor PUC 19
(4380)..(5446)
54
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta - 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620

12
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740
actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800
ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860
tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920
tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980
gaac atg gct agc aag act atc att gct ttg agc tac att tta tgt ctg 2029
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu
1 5 10 15
gtt ttc gct caa aaa ctt ccc gga aat gac aac agc acg gca acg ctg 2077
Val Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu
20 25 30
tgc ctg ggg cac cat gca gtg tca aac gga acg cta gtg aaa aca atc 2125
Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile
35 40 45
acg aat gac caa att gaa gtg act aat gct act gag ctg gtt cag agt 2173
Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser
50 55 60
tcc tca aca ggt aga ata tgc gac agt cct cac caa atc ctt gat gga 2221
Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly
65 70 75
gaa aac tgc aca cta ata gat gct cta ttg gga gac cct cat tgt gat 2269
Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp
80 85 90 95
ggc ttc caa aat aag gaa tgg gac ctt ttt gtt gaa cgc agc aaa gcc 2317
Gly Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala
100 105 110
tac agc aac tgt tac cct tat gat gtg ccg gat tat gcc tcc ctt agg 2365
Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg
115 120 125
tca cta gtt gcc tca tcc ggc aca ctg gag ttt aac aat gaa agc ttc 2413
Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe
130 135 140
aat tgg act gga gtc gct cag aat gga aca agc tct gct tgc aaa agg 2461
Asn Trp Thr Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg
145 150 155
aga tct aat aaa agt ttc ttt agt aga ttg aat tgg ttg cac caa tta 2509
Arg Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu
160 165 170 175
aaa tac aaa tat cca gca ctg aac gtg act atg cca aac aat gaa aaa 2557
Lys Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys
180 185 190
ttt gac aaa ttg tac att tgg ggg gtt ctc cac ccg agt acg gac agt 2605
Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Leu His Pro Ser Thr Asp Ser
195 200 205
gac caa atc agc cta tat gct caa gca tca ggg aga gtc aca gtc tct 2653
Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser
210 215 220
acc aaa aga agc caa caa act gta atc ccg aat atc gga tct aga ccc 2701
Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro
225 230 235
tgg gta agg ggt gtc tcc agc aga ata agc atc tat tgg aca ata gta 2749
Trp Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val
240 245 250 255
aaa ccg gga gac ata ctt ttg att aac agc aca ggg aat cta att gct 2797
Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala
260 265 270
cct cgg ggt tac ttc aaa ata cga agt ggg aaa agc tca ata atg agg 2845
Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg
275 280 285
tca gat gca ccc att ggc aaa tgc aat tct gaa tgc atc act cca aat 2893
Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn
290 295 300

13
gga agc att ccc aat gac aaa cca ttt caa aat gta aac agg atc aca 2941
Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr
305 310 315
tat ggg gcc tgt ccc aga tat gtt aag caa aac act ctg aaa ttg gca 2989
Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala
320 325 330 335
aca ggg atg cgg aat gta cca gag aaa caa act aga ggc ata ttc ggc 3037
Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly
340 345 350
gca atc gcg ggt ttc ata gaa aat ggt tgg gag gga atg gtg gac ggt 3085
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly
355 360 365
tgg tac ggt ttc agg cat caa aat tct gag ggc aca gga caa gca gca 3133
Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala
370 375 380
gat ctt aaa agc act caa gca gca atc aac caa atc aac ggg aaa ctg 3181
Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu
385 390 395
aat agg tta atc gag aaa acg aac gag aaa ttc cat caa att gaa aaa 3229
Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys
400 405 410 415
gaa ttc tca gaa gta gaa ggg aga att cag gac ctc gag aaa tat gtt 3277
Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val
420 425 430
gag gac act aaa ata gat ctc tgg tcg tac aac gcg gag ctt ctt gtt 3325
Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
435 440 445
gcc ctg gag aac caa cat aca att gat cta act gac tca gaa atg aac 3373
Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn
450 455 460
aaa ctg ttt gaa aga aca aag aag caa ctg agg gaa aat gct gag gat 3421
Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp
465 470 475
atg ggc aat ggt tgt ttc aaa ata tac cac aaa tgt gac aat gcc tgc 3469
Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys
480 485 490 495
ata ggg tca atc aga aat gga act tat gac cat gat gta tac aga gac 3517
Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp
500 505 510
gaa gca tta aac aac cgg ttc cag atc aaa ggt gtt gag ctg aag tca 3565
Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser
515 520 525
gga tac aaa gat tgg atc cta tgg att tcc ttt gcc ata tca tgc ttt 3613
Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe
530 535 540
ttg ctt tgt gtt gtt ttg ctg ggg ttc atc atg tgg gcc tgc caa aaa 3661
Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys
545 550 555
ggc aac att agg tgc aac att tgc att tga ggggccctaa caaaacaaaa 3711
Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
560 565
agatggggtt attccctaaa cttcatgggt tacgtaattg gaagttgggg gacattgcca 3771
caagatcata ttgtacaaaa gatcaaacac tgttttagaa aacttcctgt aaacaggcct 3831
attgattgga aagtatgtca aaggattgtg ggtcttttgg gctttgctgc tccatttaca 3891
caatgtggat atcctgcctt aatgcctttg tatgcatgta tacaagctaa acaggctttc 3951
actttctcgc caacttacaa ggcctttcta agtaaacagt acatgaacct ttaccccgtt 4011
gctcggcaac ggcctggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac tggctggggc 4071
ttggccatag gccatcagcg catgcgtgga acctttgtgg ctcctctgcc gatccatact 4131
gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agccggtctg gagcaaagct cataggaact 4191
gacaattctg tcgtcctctc gcggaaatat acatcgtttc gatctacgta tgatcttttt 4251
ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4311
taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4371
aggaattctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 4431

14
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 4491
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 4551
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 4611
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 4671
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 4731
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 4791
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 4851
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 4911
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 4971
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 5031
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 5091
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 5151
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5211
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5271
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 5331
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 5391
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactc 5446
55
568
PRT
Seqüência artificial
55
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val
1 5 10 15
Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys
20 25 30
Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr
35 40 45
Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser
50 55 60
Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu
65 70 75 80
Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly
85 90 95
Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr
100 105 110
Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser
115 120 125
Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn
130 135 140
Trp Thr Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg
145 150 155 160
Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu Lys
165 170 175
Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe
180 185 190
Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Leu His Pro Ser Thr Asp Ser Asp
195 200 205
Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr
210 215 220
Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp
225 230 235 240
Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys
. 245 250 255
Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro
260 265 270
Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser
275 280 285
Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly
290 295 300
Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr

325 330 335
Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala
340 345 350
Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp
355 360 365
Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp
370 375 380
Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn
385 390 395 400
Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu
405 410 415
Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu
420 425 430
Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala
435 440 445
Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys
450 455 460
Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met
465 470 475 480
Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile
485 490 495
Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu
500 505 510
Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly
515 520 525
Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu
530 535 540
Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly
545 550 555 560
Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565
56
63
PRT
Seqüência artificial
N terminal peptide of H3 Panama HA influenza antigen
56
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
35 40 45
Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser
50 55 60
57
65
PRT
Seqüência artificial
Seqüência N terminal do antígeno H3 Panama HA codificado por
pPJV1671
57
Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val
1 5 10 15
Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys
20 25 30
Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr
35 40 45
Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser
50 55 60
Ser
15

16
65
58
62
PRT
Seqüência artificial
Consenso of antígenos naturais and pPJV1671 N terminal H3 Panama HÁ
58
Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala Gln
1 5 10 15
Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His
20 25 30
His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln
35 40 45
Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser
50 55 60
59
5453
DNA
Seqüência artificial
Gene de reistência a canamicina flanqueado por seqüências Tn903
(1)..(896)
Sítio de clonagem Sal I
(897)..(902)
Promotor CMV
(903)..(1587)
Fusão 1/2 de exon CMV
(1588)..(1718)
Fusão Bam Hl/Bgl 2
(1719)..(1724)
Intron A de insulina de rato
(1725)..(1857)
Sítio de clonagem Bam H1
(1858)..(1863)
Região pre S2 de não codificação de HBsAg
(1864)..(1984)
CDS
(1985)..(3697)
Sítio de clonagem Bsp1201
(3700)..(3705)
Melhorador HBV
(3706)..(4238)
Região de poliadenilação de beta globina de coelho
(4250)..(4380)
Sítio de clonagem Eco RI
(4381)..(4386)
Seqüências da estrutura dorsal do vetor PUC 19
(4387)..(5453)
59

17
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560
atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620
ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680
gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740
actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800
ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860
tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920
tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980
gaac atg gct agc gag aaa ata gtg ctt ctt ttt gca ata gtc agt ctt
Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu
2029
1 5 10 15
gtt aaa agt gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca
Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr
2077
20 25 30
gag cag gtt gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc
Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala
2125
35 40 45
caa gac ata ctg gaa aag aca cac aat ggg aag ctc tgc gat cta gat
Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp
2173
50 55 60
gga gtg aag cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc
Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu
2221
65 70 75
ctc gga aac cca atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct
Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser
2269
80 85 90 95
tac ata gtg gag aag gcc aat cca gtc aat gac ctc tgt tac cca ggg
Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly
2317
100 105 110
gat ttc aat gac tat gaa gaa ttg aaa cac cta ttg agc aga ata aac
Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn
2365
115 120 125
cat ttt gag aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc agt cat
His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His
2413
130 135 140
gaa gcc tca ttg ggg gtg agc tca gca tgt cca tac cag gga aag tcc
Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser
2461
145 150 155

18
tcc ttt ttc aga aat gtg gta tgg ctt atc aaa aag aac agt aca tac
Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr
2509
160 165 170 175
cca aca ata aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg
Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu
2557
180 185 190
gta ctg tgg ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aag
2605
Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys
195 200 205
ctc tat caa aac cca acc acc tat att tcc gtt ggg aca tca aca cta
Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu
2653
210 215 220
aac cag aga ttg gta cca aga ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg
Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly
225 230 235
caa agt gga agg atg gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat
Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp
240 245 250 255
gca atc aac ttc gag agt aat gga aat ttc att gct cca gaa tat gca
Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala
260 265 270
tac aaa att gtc aag aaa ggg gac tca aca att atg aaa agt gaa ttg
Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu
275 280 285
gaa tat ggt aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata
Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile
290 295 300
aac tct agc atg cca ttc cac aat ata cac cct ctc acc atc ggg gaa
2701
2749
2797
2845
2893
Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu
305 310 315
tgc ccc aaa tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc
Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu
2989
320 325 330 335
aga aat agc cct caa aga gag aga aga aga aaa aag aga gga tta ttt
Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe
3037
340 345 350
gga gct ata gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp
3085
355 360 365
ggt tgg tat ggg tac cac cat agc aac gag cag ggg agt ggg tac gct
Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala
3133
370 375 380
gca gac aaa gaa tcc act caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag
Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys
3181
385 390 395
gtc aac tcg att att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga
Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly
3229
400 405 410 415
agg gaa ttt aac aac tta gaa agg aga ata gag aat tta aac aag aag
2941
3277
Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys
420 425 430
atg gaa gac ggg ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt cta 3325
Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
435 440 445
gtt ctc atg gaa aac gag aga act cta gac ttt cat gac tca aat gtc 3373
Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val
450 455 460
aag aac ctt tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag 3421
Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys
465 470 475
gag ctg ggt aac ggt tgt ttc gag ttc tat cat aaa tgt gat aat gaa 3469
Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu
480 485 490 495

19
tgt atg gaa agt gta aga aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca
Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser
3517
500 505 510
gaa gaa gca aga cta aaa aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa
Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu
3565
515 520 525
tca ata gga att tac caa ata ttg tca att tat tct aca gtg gcg agc
Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser
3613
530 535 540
tcc cta gca ctg gca atc atg gta gct ggt cta tcc tta tgg atg tgc
Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys
3661
545 550 555
tcc aat ggg tcg tta caa tgc aga att tgc att taa atgggcccta
Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
3707
560 565 570
acaaaacaaa aagatggggt tattccctaa acttcatggg ttacgtaatt ggaagttggg 3767
ggacattgcc acaagatcat attgtacaaa agatcaaaca ctgttttaga aaacttcctg 3827
taaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc aaaggattgt gggtcttttg ggctttgctg 3887
ctccatttac acaatgtgga tatcctgcct taatgccttt gtatgcatgt atacaagcta 3947
aacaggcttt cactttctcg ccaacttaca aggcctttct aagtaaacag tacatgaacc 4007
tttaccccgt tgctcggcaa cggcctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 4067
ctggctgggg cttggccata ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg gctcctctgc 4127
cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagccggtct ggagcaaagc 4187
tcataggaac tgacaattct gtcgtcctct cgcggaaata tacatcgttt cgatctacgt 4247
atgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4307
cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4367
tctcactcgg aaggaattct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 4427
cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 4487
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 4547
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 4607
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4667
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4727
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4787
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 4847
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4907
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4967
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5027
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 5087
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 5147
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 5207
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5267
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 5327
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 5387
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 5447
tgactc
60
570
PRT
Seqüência artificial
Construção sintética
60
Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val
5453
1 5 10 15
Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln
35 40 45
Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly
50 55 60
Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu
65 70 75 80
Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr

85 90 95
Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp
100 105 110
Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His
115 120 125
Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu
130 135 140
Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser
145 150 155 160
Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro
165 170 175
Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val
180 185 190
Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu
195 200 205
Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn
210 215 220
Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln
225 230 235 240
Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala
245 250 255
Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr
260 265 270
Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu
275 280 285
Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn
290 295 300
Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly
340 345 350
Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly
355 360 365
Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala
370 375 380
Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val
385 390 395 400
Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg
405 410 415
Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met
420 425 430
Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val
435 440 445
Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys
450 455 460
Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys
485 490 495
Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu
500 505 510
Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser
515 520 525
Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser
530 535 540
Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser
545 550 555 560
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
565 570
61
5578
20

21
DNA
Construção artificial
Construção PJV2012 contendo seqüência de codificação de LTA e TLB
61
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900
acaattcctt ccgagtgaga gacacaaaaa attccaacac actattgcaa tgaaaataaa 960
tttcctttat tagccagaag tcagatgctc aaggggcttc atgatgtccc cataattttt 1020
ggcagaggga aaaagatccc tagttttcca tactgattgc cgcaattgaa ttgggggttt 1080
tattattcca tacacataat ttatcaattt tggtctcggt cagatatgtg attcttaatg 1140
tgtccttcat cctttcaatg gctttttttt gggagtctat atgttgactg cccgggactt 1200
cgacctgaaa tgttgcgccg ctcttaaatg taatgataac catttctctt ttgcctgcca 1260
tcgattccgt atatgatagt atcttgtcat ttatcgtata tatttgtgtg ttgcgatatt 1320
ccgaacatag ttctgtaata gactggggag cgctagcccc cagagcagcc aggggcagga 1380
agcaaagcac caagattagc aaagacctac tagccatgtt cgtcacaggg tccccagtcc 1440
tcgcggagat tgacgagatg tgagaggcaa tattcggagc agggtttact gttcctgaac 1500
tggagccacc agcaggaaaa tacagacccc tgactctggg atcctgacct ggaagatagt 1560
cagggttgag gcaagcaaaa ggtacatgta agagaagagc ccacagcgtc cctcaaatcc 1620
ctggagtctt gactggggaa gccaggccca ccctggagag tacatacctg cttgctgaga 1680
tccggacggt gagtcactct tggcacgggg aatccgcgtt ccaatgcacc gttcccggcc 1740
gcggaggctg gatcggtccc ggtgtcttct atggaggtca aaacagcgtg gatggcgtct 1800
ccaggcgatc tgacggttca ctaaacgagc tctgcttata tagacctccc accgtacacg 1860
cctaccgccc atttgcgtca acggggcggg gttattacga cattttggaa agtcccgttg 1920
attttggtgc tcgacctgca ggtcgacaat attggctatt ggccattgca tacgttgtat 1980
ctatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa tatgaccgcc atgttgacat 2040
tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 2100
atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 2160
ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc 2220
cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 2280
tatcatatgc caagtccgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 2340
tatgcccagt acatgacctt acgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc 2400
atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacacca atgggcgtgg atagcggttt 2460
gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac 2520
caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aataaccccg ccccgttgac gcaaatgggc 2580
ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc 2640
gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc 2700
ctccgcggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc gtgccaagag tgactcaccg 2760
tccggatctc agcaagcagg tatgtactct ccagggtggg cctggcttcc ccagtcaaga 2820
ctccagggat ttgagggacg ctgtgggctc ttctcttaca tgtacctttt gcttgcctca 2880
accctgacta tcttccaggt caggatccca gagtcagggg tctgtatttt cctgctggtg 2940
gctccagttc aggaacagta aaccctgctc cgaatattgc ctctcacatc tcgtcaatct 3000
ccgcgaggac tggggaccct gtgacgaaca tggctagtag gtctttgcta atcttggtgc 3060
tttgcttcct gcccctggct gctctggggg ctagcaatgg cgacaaatta taccgtgctg 3120
actctagacc cccagatgaa ataaaacgtt ccggaggtct tatgcccaga gggcataatg 3180
agtacttcga tagaggaact caaatgaata ttaatcttta tgatcacgcg agaggaacac 3240
aaaccggctt tgtcagatat gatgacggat atgtttccac ttctcttagt ttgagaagtg 3300
ctcacttagc aggacagtct atattatcag gatattccac ttactatata tatgttatag 3360
cgacagcacc aaatatgttt aatgttaatg atgtattagg cgtatacagc cctcacccat 3420
atgaacagga ggtttctgcg ttaggtggaa taccatattc tcagatatat ggatggtatc 3480

22
gtgttaattt tggtgtgatt gatgaacgat tacatcgtaa cagggaatat agagaccggt 3540
attacagaaa tctgaatata gctccggcag aggatggtta cagattagca ggtttcccac 3600
cggatcacca agcttggaga gaagaaccct ggattcatca tgcaccacaa ggttgtggaa 3660
attcatcaag aacaattaca ggtgatactt gtaatgagga gacccagaat ctgagcacaa 3720
tatatctcag gaaatatcaa tcaaaagtta agaggcagat attttcagac tatcagtcag 3780
aggttgacat atataacaga attcgggatg aattatgagg atctgggccc taacaaaaca 3840
aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg ggggacattg 3900
ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc tgtaaacagg 3960
cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc tgctccattt 4020
acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc taaacaggct 4080
ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa cctttacccc 4140
gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 4200
ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct gccgatccat 4260
actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa, gctcatagga 4320
actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttcgatctac gtatgatctt 4380
tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc 4440
taataaagga aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc 4500
ggaaggaatt ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 4560
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 4620
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 4680
aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 4740
ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 4800
gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 4860
cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 4920
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 4980
tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 5040
cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 5100
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 5160
gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 5220
agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 5280
cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 5340
tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 5400
tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 5460
ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 5520
cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactc
62
6254
DNA
Seqüência artificial
Construção PJV7788
62
5578
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt 900
attgttcatg atgatatatt tttatcttgt gcaatgtaac atcagagatt ttgagacaca 960
acgtggcttt cccccccccc ccggcatgcc tgcaggtcga caatattggc tattggccat 1020
tgcatacgtt gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac 1080
cgccatgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 1140
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 1200
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 1260

23
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 1320
cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 1380
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttacggga ctttcctact tggcagtaca 1440
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc 1500
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 1560
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt 1620
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 1680
tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 1740
gggaccgatc cagcctccgc ggccgggaac ggtgcattgg aacgcggatt ccccgtgcca 1800
agagtgactc accgtccgga tctcagcaag caggtatgta ctctccaggg tgggcctggc 1860
ttccccagtc aagactccag ggatttgagg gacgctgtgg gctcttctct tacatgtacc 1920
ttttgcttgc ctcaaccctg actatcttcc aggtcaggat cccagagtca ggggtctgta 1980
ttttcctgct ggtggctcca gttcaggaac agtaaaccct gctccgaata ttgcctctca 2040
catctcgtca atctccgcga ggactgggga ccctgtgacg aacatggcta gtaggtcttt 2100
gctaatcttg gtgctttgct tcctgcccct ggctgctctg ggggctagcg ctccccagtc 2160
tattacagaa ctatgttcgg aatatcgcaa cacacaaata tatacgataa atgacaagat 2220
actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg gttatcatta catttaagag 2280
cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat atagactccc aaaaaaaagc 2340
cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg accgagacca aaattgataa 2400
attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg gcaatcagta tggaaaacta 2460
gggatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 2520
cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 2580
tctcactcgg aaggaattga gggccggccc tctgcaggtc gacaatattg gctattggcc 2640
attgcatacg ttgtatctat atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaatatg 2700
accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 2760
agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 2820
ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 2880
gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 2940
ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tccgccccct attgacgtca atgacggtaa 3000
atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttacgg gactttccta cttggcagta 3060
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg 3120
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 3180
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc 3240
gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 3300
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 3360
ccgggaccga tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc 3420
caagagtgac tcaccgtccg gatctcagca agcaggtatg tactctccag ggtgggcctg 3480
gcttccccag tcaagactcc agggatttga gggacgctgt gggctcttct cttacatgta 3540
ccttttgctt gcctcaaccc tgactatctt ccaggtcagg atcccagagt caggggtctg 3600
tattttcctg ctggtggctc cagttcagga acagtaaacc ctgctccgaa tattgcctct 3660
cacatctcgt caatctccgc gaggactggg gaccctgtga cgaacatggc tagtaggtct 3720
ttgctaatct tggtgctttg cttcctgccc ctggctgctc tgggggctag caatggcgac 3780
aaattatacc gtgctgactc tagaccccca gatgaaataa aacgttccgg aggtcttatg 3840
cccagagggc ataatgagta cttcgataga ggaactcaaa tgaatattaa tctttatgat 3900
cacgcgagag gaacacaaac cggctttgtc agatatgatg acggatatgt ttccacttct 3960
cttagtttga gaagtgctca cttagcagga cagtctatat tatcaggata ttccacttac 4020
tatatatatg ttatagcgac agcaccaaat atgtttaatg ttaatgatgt attaggcgta 4080
tacagccctc acccatatga acaggaggtt tctgcgttag gtggaatacc atattctcag 4140
atatatggat ggtatcgtgt taattttggt gtgattgatg aacgattaca tcgtaacagg 4200
gaatatagag accggtatta cagaaatctg aatatagctc cggcagagga tggttacaga 4260
ttagcaggtt tcccaccgga tcaccaagct tggagagaag aaccctggat tcatcatgca 4320
ccacaaggtt gtggaaattc atcaagaaca attacaggtg atacttgtaa tgaggagacc 4380
cagaatctga gcacaatata tctcaggaaa tatcaatcaa aagttaagag gcagatattt 4440
tcagactatc agtcagaggt tgacatatat aacagaattc gggatgaatt atgaggatct 4500
gggccctaac aaaacaaaaa gatggggtta ttccctaaac ttcatgggtt acgtaattgg 4560
aagttggggg acattgccac aagatcatat tgtacaaaag atcaaacact gttttagaaa 4620
acttcctgta aacaggccta ttgattggaa agtatgtcaa aggattgtgg gtcttttggg 4680
ctttgctgct ccatttacac aatgtggata tcctgcctta atgcctttgt atgcatgtat 4740
acaagctaaa caggctttca ctttctcgcc aacttacaag gcctttctaa gtaaacagta 4800
catgaacctt taccccgttg ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc 4860
aacccccact ggctggggct tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtggc 4920
tcctctgccg atccatactg cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca gccggtctgg 4980
agcaaagctc ataggaactg acaattctgt cgtcctctcg cggaaatata catcgtttcg 5040

24
atctacgtat gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga 5100
gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt 5160
tttgtgtctc tcactcggaa ggaattctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5220
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5280
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 5340
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5400
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 5460
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5520
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 5580
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 5640
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5700
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5760
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5820
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 5880
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 5940
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6000
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6060
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6120
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6180
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6240
tagttgcctg actc 6254
63
18
DNA
Seqüência artificial
63
gccactctct tccgacac 18
64
19
DNA
Seqüência artificial
64
caagaacatc acacggaac 19
65
512
PRT
Vírus de herpes simplex 2
65
Met Ala Thr Asp Ile Asp Met Leu Ile Asp Leu Gly Leu Asp Leu Ser
1 5 10 15
Asp Ser Glu Leu Glu Glu Asp Ala Leu Glu Arg Asp Glu Glu Gly Arg
20 25 30
Arg Asp Asp Pro Glu Ser Asp Ser Ser Gly Glu Cys Ser Ser Ser Asp
35 40 45
Glu Asp Met Glu Asp Pro Cys Gly Asp Gly Gly Ala Glu Ala Ile Asp
50 55 60
Ala Ala Ile Pro Lys Gly Pro Pro Ala Arg Pro Glu Asp Ala Gly Thr
65 70 75 80
Pro Glu Ala Ser Thr Pro Arg Pro Ala Ala Arg Arg Gly Ala Asp Asp
85 90 95
Pro Pro Pro Ala Thr Thr Gly Val Trp Ser Arg Leu Gly Thr Arg Arg
100 105 110
Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro His Gly Gly Lys Val Ala Arg Ile Gln
115 120 125
Pro Pro Ser Thr Lys Ala Pro His Pro Arg Gly Gly Arg Arg Gly Arg
130 135 140
Arg Arg Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Asp Ser Thr Pro
145 150 155 160
Asn Pro Arg Arg Arg Val Ser Arg Asn Ala His Asn Gln Gly Gly Arg
165 170 175
His Pro Ala Ser Ala Arg Thr Asp Gly Pro Gly Ala Thr His Gly Glu
180 185 190

Ala Arg Arg Gly Gly Glu Gln Leu Asp Val Ser Gly Gly Pro Arg Pro
195 200 205
Arg Gly Thr Arg Gln Ala Pro Pro Pro Leu Met Ala Leu Ser Leu Thr
210 215 220
Pro Pro His Ala Asp Gly Arg Ala Pro Val Pro Glu Arg Lys Ala Pro
225 230 235 240
Ser Ala Asp Thr Ile Asp Pro Ala Val Arg Ala Val Leu Arg Ser Ile
245 250 255
Ser Glu Arg Ala Ala Val Glu Arg Ile Ser Glu Ser Phe Gly Arg Ser
260 265 270
Ala Leu Val Met Gln Asp Pro Phe Gly Gly Met Pro Phe Pro Ala Ala
275 280 285
Asn Ser Pro Trp Ala Pro Val Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Phe Asp
290 295 300
Ala Glu Thr Arg Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro
305 310 315 320
Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala Ala Ser Thr Ala
325 330 335
Lys Ala Met Arg Asp Cys Val Leu Arg Gln Glu Asn Leu Ile Glu Ala
340 345 350
Leu Ala Ser Ala Asp Glu Thr Leu Ala Trp Cys Lys Met Cys Ile His
355 360 365
His Asn Leu Pro Leu Arg Pro Gln Asp Pro Ile Ile Gly Thr Ala Ala
370 375 380
Ala Val Leu Glu Asn Leu Ala Thr Arg Leu Arg Pro Phe Leu Gln Cys
385 390 395 400
Tyr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Cys Gly Leu Asp Asp Leu Cys Ser Arg
405 410 415
Arg Arg Leu Ser Asp Ile Lys Asp Ile Ala Ser Phe Val Leu Val Ile
420 425 430
Leu Ala Arg Leu Ala Asn Arg Val Glu Arg Gly Val Ser Glu Ile Asp
435 440 445
Tyr Thr Thr Val Gly Val Gly Ala Gly Glu Thr Met His Phe Tyr Ile
450 455 460
Pro Gly Ala Cys Met Ala Gly Leu Ile Glu Ile Leu Asp Thr His Arg
465 470 475 480
Gln Glu Cys Ser Ser Arg Val Cys Glu Leu Thr Ala Ser His Thr Ile
485 490 495
Ala Pro Leu Tyr Val His Gly Lys Tyr Phe Tyr Cys Asn Ser Leu Phe
500 505 510
66
18
PRT
Vírus de herpes simplex 2
66
Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg
1 5 10 15
Thr Phe
67
18
PRT
Vírus de herpes simplex 2
67
Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg
1 5 10 15
Ala Ala
68
9
PRT
Seqüência artificial
68
His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe
1 5
25

26
69
11
PRT
Vírus de herpes simplex 2
69
Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala
1 5 10
70
11
PRT
Vírus de herpes simplex 1
70
Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Gly Asn Pro Arg Ala
1 5 10

1
REIVINDICAÇÕES
1. Construção de ácido nucleico adequada para a liberação a
um indivíduo para induzir uma resposta imune contra antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, caracterizada pelo fato de que
5 compreende:
imediato maior de hCMV; e
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
10 (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV;
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
15 ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento;
(iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
20 promotor quimérico; e
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
25 2. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
1, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora codifica mais do
que um dito HA, fragmento ou variante imunogênica.
3. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
2, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora codifica um dito

2
HA, fragmento ou variante de cada uma de três a cinco cepas da influenza
diferentes.
4. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
3, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora codifica um dito
5 HA, fragmento ou variante de cada um de três ou quatro cepas da influenza
não pandêmicas.
5. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a seqüência
codificadora codifica um dito HA, fragmento ou variante de uma cepa da
10 influenza pandêmica.
6. Partículas carreadoras, caracterizadas pelo fato de que são
revestidas com uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações precedentes.
7. Partículas carreadoras, caracterizadas pelo fato de serem
15 revestidas com pelo menos duas construções diferentes de ácido nucleico
como definida na reivindicação 1, em que cada dita construção codifica um
dito HA, fragmento ou variante de uma cepa da influenza diferente.
8. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 7,
caracterizadas pelo fato de que são revestidas com três a cinco das ditas
20 construções diferentes.
9. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 8,
caracterizadas pelo fato de que três ou quatro das ditas construções codificam
um dito HA, fragmento ou variante de cepas diferentes da influenza não
pandêmicas.
25 10. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 7 a 9, caracterizadas pelo fato de que são revestidas com
uma dita construção que codifica um dito HA, fragmento ou variante de uma
cepa da influenza pandêmica.
11. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das

3
reivindicações de 6 a 10, caracterizadas pelo fato de que também são
revestidas com uma construção de ácido nucleico que compreende uma
seqüência promotora e uma seqüência codificadora em ligação operável com
o promotor, onde a seqüência codificadora codifica uma subunidade de toxina
5 bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade adjuvante ou
uma variante de cada uma destas tendo atividade adjuvante e tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido com a dita subunidade ou
fragmento.
12. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 11,
10 caracterizadas pelo fato de que a seqüência promotora é uma seqüência
promotora quimérica que compreende:
imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
15 (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
13. Partículas carreadoras de acordo com as reivindicações 11
ou 12, caracterizadas pelo fato de que a subunidade de toxina bacteriana que
ribosila ADP é selecionada da subunidade A da toxina do cólera, subunidade
20 B da toxina do cólera, subunidade A da toxina instável ao calor da E. coli e
subunidade B instável ao calor da E. coli.
14. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 11 a 13, caracterizadas pelo fato de que a construção de
ácido nucleico compreende duas seqüência codificadoras cada uma
25 compreendendo uma dita subunidade, fragmento ou variante diferentes.
15. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 14,
caracterizada pelo fato de que as duas seqüência codificadoras que codificam
a subunidade A da toxina do cólera e a subunidade B da toxina do cólera
respectivamente ou a subunidade A da toxina instável ao calor da E. coli e a

subunidade B instável ao calor da E. coli respectivamente.
4
16. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 11 a 15, caracterizadas pelo fato de que a construção de
ácido nucleico compreende ainda:
5 (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
promotor quimérico; e
(b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
10 não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
15 ouro.
gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
17. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 6 a 16, caracterizadas pelo fato de que são partículas de
18. Receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação
mediada por partícula, caracterizado pelo fato de que compreende partículas
revestidas como definidas em qualquer uma das reivindicações de 6 a 17.
19. Dispositivo de liberação mediada por partícula,
20 caracterizado pelo fato de que é carregado com partículas revestidas como
definidas em qualquer uma das reivindicações de 6 a 17.
20. Dispositivo de liberação mediada por partícula de acordo
com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que é uma seringa isenta de
agulha.
25 21. Construção de ácido nucleico adequada para a liberação a
um indivíduo para induzir uma resposta imune contra antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, caracterizada pelo fato de que
compreende:
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:

imediato maior de hCMV; e
5
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
5 A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
promotor quimérico,
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
10 ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento.
22. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende ainda:
(iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
15 seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
promotor quimérico; ou
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
20 gene inicial imediato de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
23. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que a seqüência
codificadora codifica mais do que um do dito HA, fragmento ou variante
25 imunogênica.
24. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora
codifica um dito HA, fragmento ou variante de cada um de três a cinco cepas
da influenza diferentes.

6
25. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora
codifica um dito HA, fragmento ou variante de cada um de três ou quatro
cepas da influenza não pandêmicas.
5 26. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 21 a 25, caracterizada pelo fato de que a seqüência
codificadora codifica um dito HA, fragmento ou variante de uma cepa da
influenza pandêmica.
27. Partículas carreadoras, caracterizadas pelo fato de que são
10 revestidas com uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações de 21 a 26.
28. Partículas carreadoras, caracterizadas pelo fato de serem
revestidas com pelo menos duas construções diferentes de ácido nucleico de
acordo com a reivindicação 21, em que cada dita construção codifica um dito
15 HA, fragmento ou variante de uma cepa da influenza diferente.
29. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 28,
caracterizadas pelo fato de que são revestidas com três a cinco das ditas
construções diferentes.
30. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 29,
20 caracterizadas pelo fato de que três ou quatro das ditas construções codificam
um dito HA, fragmento ou variante de cepas diferentes da influenza não
pandêmicas.
31. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 28 a 30, caracterizadas pelo fato de que são revestidas com
25 uma dita construção que codifica um dito HA, fragmento ou variante de uma
cepa da influenza pandêmica.
32. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 27 a 31, caracterizadas pelo fato de que também são
revestidas com uma construção de ácido nucleico que compreende uma

7
seqüência promotora e uma seqüência codificadora em ligação operável com
o promotor, onde a seqüência codificadora codifica uma subunidade de toxina
bacteriana que ribosila ADP, um fragmento desta com atividade adjuvante ou
uma variante de cada um destes tendo atividade adjuvante e tendo pelo menos
5 80% de homologia de aminoácido com a dita subunidade ou fragmento.
33. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 32,
caracterizadas pelo fato de que a seqüência promotora é uma seqüência
promotora quimérica que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
10 (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
imediato maior de hCMV; e
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
34. Partículas carreadoras de acordo com as reivindicações 32
15 ou 33, caracterizadas pelo fato de que a subunidade de toxina bacteriana que
ribosila ADP é selecionada da subunidade A da toxina do cólera, subunidade
B da toxina do cólera, subunidade A da toxina instável ao calor da E. coli e
subunidade B instável ao calor da E. coli.
35. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
20 reivindicações de 32 a 34, caracterizadas pelo fato de que a construção de
ácido nucleico compreende duas seqüência codificadoras cada uma
compreendendo uma dita subunidade, fragmento ou variante diferentes.
36. Partículas carreadoras de acordo com a reivindicação 35,
caracterizadas pelo fato de que as duas seqüências codificadoras codificam a
25 subunidade A da toxina do cólera e a subunidade B da toxina do cólera
respectivamente ou a subunidade A da toxina instável ao calor da E. coli e a
subunidade B instável ao calor da E. coli respectivamente.
37. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 32 a 36, caracterizadas pelo fato de que a construção de

ácido nucleico compreende ainda:
8
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
5 promotor quimérico; e/ou
(b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
10 38. Partículas carreadoras de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 27 a 37, caracterizadas pelo fato de que são partículas de
ouro.
39. Receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação
mediada por partícula, caracterizado pelo fato de que compreende partículas
15 revestidas como definidas em qualquer uma das reivindicações de 27 a 38.
40. Dispositivo de liberação mediada por partícula,
caracterizado pelo fato de que é carregado com partículas revestidas como
definidas em qualquer uma das reivindicações de 27 a 38.
41. Dispositivo de liberação mediada por partícula de acordo
20 com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que é uma seringa isenta de
agulha.
42. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de
que compreende uma seqüência promotora quimérica e uma seqüência
codificadora em ligação operável com o promotor quimérico, onde a
25 seqüência codificadora codifica um antígeno do vírus da influenza, um
fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica do dito antígeno
ou fragmento tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido ao dito
antígeno ou fragmento e a seqüência promotora quimérica compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;

imediato maior de hCMV; e
9
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
5 43. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o antígeno codificado é a
hemaglutinina da influenza (HA), um fragmento imunogênico deste ou uma
variante imunogênica com pelo menos 80% de homologia de seqüência de
aminoácido a cada um.
10 44. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o antígeno codificado é a
neuraminidase da influenza (NA), M2, um fragmento imunogênico de cada
um ou uma variante imunogênica tendo pelo menos 80% homologia de
seqüência de aminoácido a qualquer um dos ditos NA, M2 ou fragmento.
15 45. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 44, caracterizada pelo fato de que o antígeno da
influenza, fragmento imunogênico ou variante é de uma cepa da influenza
pandêmica.
46. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
20 das reivindicações de 42 a 45, caracterizada pelo fato de que a construção
codifica mais do que um antígeno da influenza, fragmento imunogênico ou
variante imunogênica.
47. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a construção codifica um
25 antígeno da influenza pandêmico, fragmento imunogênico deste ou variante
imunogênica do dito antígeno ou fragmento e um ou mais antígenos da
influenza não pandêmicos, fragmento(s) imunogênico(s) deste ou variante(s)
imunogênica(s) do(s) dito(s) antígeno(s) ou fragmento(s).
48. Construção de ácido nucleico de acordo com as

10
reivindicações 46 ou 47, caracterizada pelo fato de que pelo menos dois dos
antígenos, fragmentos ou variantes diferentes codificados são do mesmo
polipeptídeo da influenza de cepas diferentes de vírus da influenza.
49. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de
5 que compreende uma seqüência promotora quimérica e uma seqüência
codificadora em ligação operável com o promotor quimérico, onde a
seqüência codificadora codifica uma subunidade de toxina bacteriana que
ribosile ADP, um fragmento deste com atividade adjuvante ou uma variante
de cada um destes tendo atividade adjuvante e tendo pelo menos 80% de
10 homologia de aminoácido com a dita subunidade ou fragmento e a seqüência
promotora quimérica compreende:
imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
15 (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
50. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a subunidade de toxina
bacteriana que ribosila ADP é selecionada da subunidade A da toxina do
20 cólera, subunidade B da toxina do cólera, subunidade A da toxina instável ao
calor da E. coli e subunidade B instável ao calor da E. coli.
51. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 49 ou 50, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido
nucleico compreende duas seqüência codificadoras cada uma compreendendo
25 uma dita subunidade, fragmento ou variante diferentes e cada uma das quais
está operavelmente ligada a um dito promotor quimérico.
52. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que as duas seqüências
codificadoras codificam a subunidade A da toxina do cólera e a subunidade B

11
da toxina do cólera respectivamente ou a subunidade A da toxina instável ao
calor da E. coli e a subunidade B instável ao calor da E. coli respectivamente.
53. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que as ditas duas
5 seqüências codificadoras estão na orientação inversa.
54. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 51 ou 52, caracterizada pelo fato de que as ditas duas
seqüências codificadoras estão na mesma orientação.
55. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
10 das reivindicações de 42 a 54, caracterizada pelo fato de que a seqüência do
promotor inicial imediato do hCMV (a) compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, nucleotídeos
de 903 a 1587 da SEQ ID NO: 54, nucleotídeos de 1815 a 1935 da SEQ ID
NO: 61, nucleotídeos de 1948 a 2632 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de
15 1002 a 1686 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de 2624 a 3308 da SEQ ID
No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
ou
20 (iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
56. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 55, caracterizada pelo fato de que a seqüência de
exon (b) compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No.2, a seqüência de
25 nucleotídeo dos nucleotídeos de 1588 a 1718 da SEQ ID No. 54, nucleotídeos
de 1684 a 1814 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de 2633 a 2763 da SEQ ID
NO: 61, nucleotídeos de 1687 a 1817 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de
3309 a 3439 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de

12
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
OU
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
57. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
5 das reivindicações de 42 a 56, caracterizada pelo fato de que o intron
heterólogo (c) compreende uma seqüência selecionada da seqüência de intron
A do gene da insulina de rato, seqüência de intron A do gene da queratina de
galinha, seqüência de intron A do gene da actina cardíaca de galinha, um
fragmento funcional de qualquer um destes ou uma variante funcional de
10 qualquer um dos precedentes.
58. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que a seqüência de intron A do
gene da insulina de rato compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3, a seqüência
15 de nucleotídeo dos nucleotídeos de 1725 a 1857 da SEQ ID No. 54,
nucleotídeos de 1545 a 1677 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 2770 a
2902 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 1824 a 1956 da SEQ ID No: 62
e/ou os nucleotídeos de 3446 a 3578 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
20 homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
OU
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
59. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 58, caracterizada pelo fato de que a seqüência
25 promotora quimérica compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No. 4 ou a seqüência
de nucleotídeo dos nucleotídeos de 903 a 1857 da SEQ ID No. 54;
(ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a (i); ou

13
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
60. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 59, caracterizada pelo fato de que compreende
ainda:
5 (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
promotor quimérico; e/ou
(b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
10 não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediata de CMV símio e que está em ligação operável com o
promotor quimérico, em que a seqüência realçadora está a jusante do sítio de
clonagem.
61. Construção de ácido nucleico de acordo com a
15 reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende:
No: 14, ou
seqüência à seqüência de (i);
(i) a seqüência do vetor pPJV7563 fornecida como SEQ ID
(ii) uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de
20 e a seqüência que codifica o dito antígeno, fragmento ou
variante é fornecida nas ditas seqüências (i) ou (ii) de modo que a mesma
esteja operavelmente ligada ao promotor quimérico.
62. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a seqüência codificadora
25 codifica um antígeno de HA, uma variante imunogênica deste ou um
fragmento imunogênico de cada um.
63. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência do
vetor pPJV1671 fornecida como a SEQ ID No: 54 ou uma seqüência com

14
pelo menos 60% de identidade de seqüência a esta.
64. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência do
vetor pPML7789 fornecida como a SEQ ID No: 59 ou uma seqüência com
5 pelo menos 60% de identidade de seqüência a esta.
65. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência do
vetor pPJV2012 fornecida pela SEQ ID No: 61 ou uma seqüência com pelo
menos 60% de identidade de seqüência a esta.
10 66. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência do
vetor pPJV7788 fornecida pela SEQ ID NO: 62 ou uma seqüência com pelo
menos 60% de identidade de seqüência a esta.
67. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de
15 que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora
operavelmente ligadas ao promotor, onde a seqüência codificadora codifica
um antígeno do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste ou uma
variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo menos 80%
de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento e a construção
20 compreende ainda:
25 e/ou
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
3' de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata
de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência

ealçadora 3'.
15
68. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o antígeno codificado é a
hemaglutinina da influenza (HA), um fragmento imunogênico deste ou uma
5 variante imunogênica com pelo menos 80% de homologia de seqüência de
aminoácido a cada uma.
69. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que o antígeno codificado é a
neuraminidase da influenza (NA) ou M2, um fragmento imunogênico de cada
10 um ou uma variante imunogênica com pelo menos 80% de homologia de
seqüência de aminoácido à dita NA, M2 ou fragmento.
70. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 67 a 69, caracterizado pelo fato de que o antígeno da
influenza codificado, fragmento imunogênico deste, ou variante imunogênica
15 de cada um é de uma cepa da influenza pandêmica.
71. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 67 a 70, caracterizada pelo fato de que a construção
codifica mais do que um antígeno da influenza, fragmento imunogênico ou
variante imunogênica.
20 72. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que a construção codifica um
antígeno de uma cepa da influenza pandêmica, um fragmento imunogênico
deste ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento e um ou
mais antígenos de uma cepa da influenza não pandêmica, fragmento(s)
25 imunogênico(s) destes ou variante(s) imunogênica(s) do dito antígeno(s) ou
fragmento(s).
73. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 71 ou 72, caracterizada pelo fato de que pelo menos dois dos
antígenos diferentes, fragmentos ou variantes são do mesmo polipeptídeo da

16
influenza de cepas diferentes do vírus da influenza.
74. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de
que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora
operavelmente ligadas ao promotor, onde a seqüência codificadora codifica
5 uma subunidade de toxina bacteriana que ribosila ADP, um fragmento desta
com atividade adjuvante ou uma variante de cada um destes tendo atividade
adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido com a dita
subunidade ou fragmento e a construção compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
10 seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
15 seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
3' de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata
de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência
realçadora 3'.
75. Construção de ácido nucleico de acordo com a
20 reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que a subunidade de toxina
bacteriana que ribosila ADP é selecionada da subunidade A da toxina do
cólera, subunidade B da toxina do cólera, subunidade A da toxina instável ao
calor da E. coli e subunidade B instável ao calor da E. coli.
76. Construção de ácido nucleico de acordo com as
25 reivindicações 74 ou 75, caracterizada pelo fato de que a construção de ácido
nucleico compreende duas seqüência codificadoras cada uma compreendendo
uma dita subunidade, fragmento ou variante diferentes e cada uma das quais
está ligada ao dito promotor quimérico.
77. Construção de ácido nucleico de acordo com a

17
reivindicação 76, caracterizada pelo fato de que as duas seqüências
codificadoras codificam a subunidade A da toxina do cólera e a subunidade B
da toxina do cólera respectivamente ou a subunidade A da toxina instável ao
calor da E. coli e a subunidade B instável ao calor da E. coli respectivamente.
5 78. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 76 ou 77, caracterizada pelo fato de que as ditas duas
seqüências codificadoras estão na orientação inversa.
79. Construção de ácido nucleico de acordo com as
reivindicações 76 ou 77, caracterizada pelo fato de que as ditas duas
10 seqüências codificadoras estão na mesma orientação.
80. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 67 a 79, caracterizada pelo fato de que o promotor é
selecionado da seqüência do promotor inicial imediato do hCMV, seqüência
promotora do vírus da pseudo-raiva e seqüência promotora do vírus do
15 sarcoma de Rous.
81. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 67 a 80, caracterizada pelo fato de que a seqüência líder
não traduzida compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
20 6, SEQ ID NO: 7 ou nucleotídeos de 1864 a 1984 da SEQ ID NO: 54;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
82. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
25 das reivindicações de 67 a 81, caracterizada pelo fato de que a seqüência
realçadora compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
9, nucleotídeos de 3699 a 4231 da SEQ ID NO: 54, nucleotídeos de 3831 a
4363 da SEQ ID NO: 61 e/ou de 4507 a 5038 da SEQ ID NO: 62;

18
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma dita seqüência (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
83. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
5 das reivindicações de 42 a 82, caracterizada pelo fato de que compreende
ainda uma seqüência de poliadenilação.
84. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que a seqüência de poliadenilação
é uma seqüência de poliadenilação de um gene selecionado do gene da beta-
10 globina de coelho, genes inicial e tardio do vírus do papiloma humano (HPV),
o gene HSV-2gB, um gene inicial imediato de CMV símio e o gene tardio
HSVgD.
85. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 83, caracterizada pelo fato de que a seqüência de poliadenilação
15 é selecionada da:
(i) seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 4243 a 4373 da SEQ
ID No: 54, nucleotídeos de 906 a 1038 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de
4375 a 4050 da SEQ ID NO: 61, ou nucleotídeos de 2463 a 2593 da SEQ ID
20 NO: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma dita seqüência (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
86. Construção de ácido nucleico de acordo com a
25 reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência da
SEQ ID NO: 14.
87. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 86, caracterizada pelo fato de que compreende
ainda uma seqüência de nucleotídeo que codifique um peptídeo de sinal que é

19
operavelmente ligado à seqüência que codifica o antígeno, subunidade de
exotoxina, fragmento ou variante.
88. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 87, caracterizada pelo fato de que o peptídeo de sinal é
5 selecionado do peptídeo de sinal de ativador de plasminogênio de tecido
humano (hTPAsp), peptídeo de sinal da aprotinina, peptídeo de sinal da
extensina do tabaco e peptídeo de sinal da lisosima de galinha.
89. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações de 42 a 88, caracterizada pelo fato de que é um plasmídeo.
10 90. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
pelo fato de que compreende pelo menos duas construções diferentes como
definidas em qualquer uma das reivindicações de 42 a 89.
91. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
pelo fato de que compreende pelo menos duas construções diferentes como
15 definidas em qualquer uma das reivindicações de 42 a 48, 61 a 64 e 67 a 73
que codifique antígenos da influenza diferentes, fragmentos imunogênicos
destes ou variantes imunogênicas dos ditos antígenos ou fragmentos.
92. População de construções de ácido nucleico de acordo com
a reivindicação 91, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos
20 três construções diferentes cada uma codificando um antígeno da influenza
diferente, fragmento imunogênico ou variante imunogênica.
93. População de construções de ácido nucleico de acordo com
as reivindicações 91 ou 92, caracterizada pelo fato de que pelo menos dois
dos antígenos diferentes são do mesmo polipeptídeo da influenza de cepas da
25 influenza diferentes.
94. População de construções de ácido nucleico de acordo com
qualquer uma das reivindicações de 91 a 93, caracterizada pelo fato de que
pelo menos dois dos antígenos, fragmentos ou variantes diferentes são de
polipeptídeos da influenza diferentes da mesma ou de uma cepa da influenza

diferente.
20
95. População de construções de ácido nucleico de acordo com
qualquer uma das reivindicações de 90 a 94, caracterizada pelo fato de que
compreende pelo menos uma construção de acordo com qualquer uma das
5 reivindicações de 49 a 54, 65, 66 e 74 a 79 que codifique uma dita subunidade
de toxina bacteriana que ribosile ADP, fragmento desta ou variante desta.
pelo fato de que:
96. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
(i) pelo menos uma construção codifica uma subunidade de
10 toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
adjuvante ou uma variante de cada uma destas tendo atividade adjuvante e
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou
fragmento; e
15 simples do herpes (HSV);
(ii) pelo menos uma construção codifica um antígeno do vírus
onde a seqüência que codifica a dita subunidade, fragmento ou
variante e/ou o antígeno do HSV estão operavelmente ligados a um promotor
quimérico que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
20 (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
imediato maior de hCMV; e
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV.
25 pelo fato de que:
97. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
(i) pelo menos uma construção codifica uma subunidade de
toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
adjuvante ou uma variante de cada uma desta tendo atividade adjuvante e
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou

fragmento; e
21
(ii) pelo menos uma construção codifica um antígeno de HSV,
onde pelo menos uma das ditas construções compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que seja derivada da
5 seqüência de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV, que esteja em ligação operável com
a seqüência codificadora da dita construção e um promotor que seja
heterólogo à seqüência codificadora; e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
10 seqüência codificadora da dita construção, onde a seqüência realçadora é
derivada de uma UTR 3' de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência
de gene inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é
heteróloga à seqüência realçadora 3'.
15 pelo fato de que compreende:
98. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
(i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreenda
uma seqüência promotora quimérica e uma seqüência codificadora em ligação
operável com o promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica
uma subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta
20 com atividade adjuvante ou uma variante de cada uma desta tendo atividade
adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita
subunidade ou fragmento e a seqüência promotora quimérica compreende:
25 imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron
A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
(ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
pelo menos um antígeno do HSV.

pelo fato de que compreende:
22
99. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
(i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreende
uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora operavelmente
5 ligadas ao promotor, onde a seqüência codificadora codifica uma subunidade
de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
adjuvante ou uma variante de cada uma destas tendo atividade adjuvante e
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou
fragmento e a construção compreende ainda:
10 (a) uma seqüência líder não traduzida que seja derivada da
seqüência de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
15 (b) uma seqüência realçadora 3' de e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde o realçador é derivado de uma UTR 3' de uma
seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV
símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência realçadora 3'.
20 pelo menos um antígeno do HSV.
(ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
100. População de construções de ácido nucleico de acordo
com a reivindicação 99, caracterizada pelo fato de que compreende:
(i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreenda
a seqüência do vetor pPJV2012 fornecida pela SEQ ID NO: 61 ou uma
25 seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a esta; e
um antígeno de HSV.
(ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
101. Seqüência promotora quimérica isolada purificada,
caracterizada pelo fato de que a seqüência promotora quimérica está de

acordo com qualquer uma das reivindicações de 42 e 55 a 57.
23
102. Partículas revestidas, caracterizadas pelo fato de que
compreendem partículas carreadoras revestidas com uma construção de ácido
nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações de 42 a 89 ou
5 uma população de construções de ácido nucleico como definidas em qualquer
uma das reivindicações de 90 a 100.
103. Partículas revestidas de acordo com a reivindicação 102,
caracterizadas pelo fato de que as partículas carreadoras são partículas de
ouro.
10 104. Receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação
mediada por partícula, caracterizado pelo fato de que compreende partículas
revestidas como definidas nas reivindicações 102 ou 103.
105. Dispositivo de liberação mediada por partícula,
caracterizado pelo fato de que é carregado com partículas revestidas como
15 definidas nas reivindicações 102 ou 103.
106. Dispositivo de liberação mediada por partícula de acordo
com a reivindicação 105, caracterizado pelo fato de que é uma seringa isenta
de agulha.
107. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que
20 compreende uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações de 42 a 89 ou uma população de construções de ácido
nucleico como definidas em qualquer uma das reivindicações de 90 a 100
juntas com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
108. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que
25 compreende uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações de 42 a 89 ou uma população de construções de ácido
nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações de 90 a 100.
109. Composição de vacina de acordo com a reivindicação
108, caracterizada pelo fato de que é um vacina multivalente que compreende

24
pelo menos duas construções diferentes como definidas em qualquer uma das
reivindicações de 42 a 48, 61 a 64, e 67 a 73 que codifique antígenos da
influenza diferentes, fragmentos imunogênicos destes ou variantes
imunogênicas de cada um destes.
5 110. Composição de vacina de acordo com a reivindicação
109, caracterizada pelo fato de que é uma vacina da influenza trivalente,
tetravalente ou pentavalente.
111. Uso de uma construção de ácido nucleico como definida
nas qualquer uma das reivindicações de 42 a 89, de uma população de
10 construções de ácido nucleico como definidas em qualquer uma das
reivindicações de 90 a 95 ou de partículas revestidas como definidas nas
reivindicações 102 ou 103, caracterizado pelo fato de ser empregado na
fabricação de um medicamento para a prevenção da influenza.
112. Uso de acordo com a reivindicação 111, caracterizado
15 pelo fato de que o medicamento deve ser liberado pela injeção, liberação de
partícula transdérmica, inalação, tópica, oral, intranasal ou
transmucosicamente.
113. Uso de acordo com as reivindicações 111 ou 112,
caracterizado pelo fato de que o medicamento deve ser liberado pela injeção
20 isenta de agulha.
114. Método in vitro de obter a expressão em células de
mamífero de um polipeptídeo da influenza de interesse, caracterizado pelo
fato de que compreende transferir para dentro das ditas células uma
construção de ácido nucleico como definida em qualquer uma das
25 reivindicações de 42 a 89, de uma população de construções de ácido nucleico
como definida em qualquer uma das reivindicações de 90 a 95 ou partículas
revestidas como definidas nas reivindicações 102 ou 103.

a expressão de HBsAg
ron e/ou HBV3'- UTR par
Co ntribu ição de i
....à.: ...;.::::,-,,,,;,.:;;:.::;.:;; ,. ....:,:.... ,,, ::,..;:.„,,..-.;:.;iã .;.,::::::::.;:.-R-...:!:,i, ,.;:-.1-..:,-....,:: :::
Eleme ntos prese ntes

0.2
o
RIA
parou
ül
2/51
Efeito da inclusão de intron na expressão de antígeno
(média de três experimentos)
Figura 2
BetaGalIB15)
Hessi (ssc

3/51
Efeito de RIA, ENH sobre a expressão de beta-gal
(média de três experimentos)
Base RIA ENH RIAIEHH
Vetor
Figura 3
!rimos'

4/51
Efeito de intron RIA e inclusão de Enh do HBV na expressão
de gD do HSV (média de 3 experimentos)
Base Enh RIA R.Les/Ee
Elemento adicionado ao vetor base
Figura 4

MA
Enh
5/51
- Efeito de RIA, ENH sobre a expressão
(duas linhas, três reps por linha)
Elementos de vetor
R1A/Enh
Figura 5
t2SSC 1 II B16
í
Razão para vetor base

6/51
Capacidades dos peptideos de sinal heterólogos para
secretar SEAP ou fragmento hFc
Peptideo de sinal
Figura 6

w
5
i
g
-a
o
o o
.
'Mu/mi ou título de ponto final
1 ID +
0 0 0 0 0
M
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pUC19
rGlab pA
desconhecido;
HBVenh
sítios de inserção CDS
ATG-Nhe
UTR 5' de HBV pré S2
8/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
Figura 8
Tn903, remanescentes de pUC4K
pUC19 MCS
CMV Pro
CMV Exonl/2
Fusão Bam/BgI
Rat Ins IntA

pUC19
Origem Rep 1
sítio EcoR1
RBGpA
Origem desconhecida
HBsAg
Figura 9
9/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
Tn903, remanescentes de pUC4K
pUC19 MCS
CMV Pro
CMV Exon1/2
Intron da insulina de rato
UTR 5' de HBV pré S2

RBGpA
HBVenh
FISVgD
PJV7400
5299 pb
Figura 10
10/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
pUCI9 MCS
CMVpro
Exon1/2
intron da insulina de rato
HBV pre-S2

Glob pA
pUC19
pUC OR
HB Venh
11/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
pUC19 MCS
CMV Pro
M2
UTR 5' de HBV pré S2 CMV Exonl /2
intron da insulina de rato
Figura 11

Glob pA
HBVenh
Bsp 1201 (200
Bg11.1 (2001
Bsp 1201 (1995
Mrel (19852
sítios de inserção de CDS
ATG-Nhe
UTR 5' de HBV pré S2
12/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
/
CMV Exon1/2
intron da insulina de rato
Figura 12
Tn903, remanescentes de pUC4K

opu2loo042-elnooren2p4M312
plu2oReolomopuo22224.2rolmoZjnoonSeve2401224ortm2u2TeTeltnStmeloweoyezeppan21
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24334orrre~loromeoluRentozi2unto;r2 -enotookirae2222242n221.TerlEon422ffTeol.ion
repooge14222,92rantmeognueorepooMp;r2 -n0322232t1.322Teon2or21.92oom22224.an22E2o
SoNoireol2NoTraeoploo93.mtg2oopZi000terlanon22E349noni.o22120pOpoupOp;2222col
r2roapp2SuoinnoopomouSloontmopo2no214parpgreounoionop22212p0ou222 -e2nre222uo
NorRevorp000no22p32221.222 -cooppti2m.22-eareanoppnoni2oueopu24.2t2reool.2000
opm22o2aeffinuo2Oon222ooffioSooloo2roareSoonSnooenr2reantooloae2314.191ootoowo
o2ou2rfOloo2ol-egeol2pour2".1.32oTo2n2roOrtin-op422-E222422otn.212o25-6122off292retofi'au2
42oopo20000merl2pAwvernoupB222ouninntreomo22442m2t222pro;03224 -eomonooplge
toowe2222molor21422o2m222123222wepaeorAvo221.4322o2p2Opoounmoffowo;ailm3ffon
plrogiffronporpomor222an,not2NorjeopapirogSpo2aoo22;grelnon24. -Brol2onOpul000
oa2polgurooOppow-4.2 -~2orwei2u224222moi.93eanunoupe222
necoo2our42-emoo122m2orSItre/nagbeku0002oopoodotnaoo2oorEionloog000nTern2So
no-ce4e3ungoZoopRenTe;rpopoStyengeuro2292orp.nope42n -etwan2-epuSueue2wor.2112;
roo2oorãworooi2juoloWnumggor421.tivewomnoje -424.12ucoo2p.roonnnoSSpeNtor2a43ffro
ESeaungpm243 -e4-601.p000totm.231022~24_12opoingogEtnoffE2oloo223234~224gpoo
'co2rolreeTeTeono~aoa&232owgeong000514uSpouo2o;2nrOup2oinori:e0004o2S2oTeo2o
022olotn~uop324-coo2pposloZorronweoporm2ppopleo9B2p}22 -ffigtooge9120~4e32
Se2runni221-e24021remenoti2-enuol-eoreaSTeopeAM1224aeo2222000m424oSire221.00
weE434.1.01.~22-eowu2pouonunitnaceopo2o2roo2prrenrAnnooreoSpEgoweSagoccezeu
rro-enrunp..2p2op2o2orwerOot2 -e232t2po2o2gE242ouromilboveroospopo2opeojtionolz
oi2op2orproo2noon -evenon2no-e2gooppppo2TegoS-ereepSZTen2r2125733.4rtãlve2m2.2v2;r0-3
BoltnE22212replennunurertal2op000m-ernuposrenirroTeageool2oloapone2o2pfflow4"
ooTarro221E2RevepopSuonr2oaeopreedu22re2~42332 -euere2AnupoouyenoTeuv23
meogenpro2prer2lrecopoWompuretn2r4n2plwepaup.rroonon242 -epoOploSlen9322
19/£1
£1, ein6u

WRG7284
Fusão
Deleta
Promotor
Introns, HBsAg
3'UTR
PJV7382
deleta 5'UTR
HBsAg e 5'
de 3'UTR
WRG7074
deleta *----"}WR Ár RBGpA
BGHpA
deleta longo ArV
gene KanR
P 7530
G7128 3'HBsAg/ 3'UTR
promotor WRG7293/exons/5'HBsAg
PJV7389 PCR gene KanR curto de pPJV7389
P3V7496
deleta Nhel PCR destituída de RA de Nhel de pPJB7389
contendo
RIA
deleta gene M2
deleta Ár"
Nhel-Bg12
PJV7549
PJV7563
PJV1671
gene M2, 5' de 3'UTR de pPJV7468
oligos para poliligador
PCR seqüência codificadora de DNA H3 Panama HA
Figura 14

Eco RJ (468L
região BGHpA
BOI (43
HBV, Nef Seq
HBVenh
HBsAg
5' -UTR de HBV pré S2
CMV Exon2
F.mIL1145.10
rGlob pA
llsal (438
HBV, Nef Seq
HBVenh
pLIC19
5590 Pb
15/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
Ikin(24 rGlob 1:04 6.4e1 dm)
HBsAg
5'-UTR de HBV pré S2
CMV Exon2
intob pp
136 bp
Figura 15a
,,, CMV Exonl
Infron A
Tn903, remanescentes de pUC4K
intron
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exonl

pUC19
rGlob pA
HBV, Nef Seq PJV72134
5590 pb
HBVenh
HBsAg
5'-UTR de HBV pré S2
iH1(2904, 904,
CMV Exon2
Tn903, remanescentes de pUC4K
nor (losl
rGlob pA
HBV, Nef Seq
pUC19
HBVenh
HBsAg
PJV7293
4759 pb
16/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
intron A
Xhol (1011)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exonl
fragmento de WRG7128
1050 pares de base (molécula 4759 pares de base)
Figura 15b
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
CMV Pro
CMV Exon1
C Exon2
Bornal (2073)
5'-UTR de HBV pré S2
CMV Exonl
CMV Exon2
Baor Hl (2073)
noi (0001)
Tn903, remanescentes de pUC4K

Glob pA
sgm(43 ,37)
1-18V, Nef Seq
HBVenh
HBsAg
5'-UTR de HBV pré S2
CMV Exon2
Tn903, remanescentes de pUC4K CMV Pro
A7.7~
rGlob pA
pUC19
HBVenh
HBsAg
17/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Intron A
27,01(Imn)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exonl
CMV Exonl
CMV Exon2
Tn903, remanescentes de pUC4K
Xba 1 (2292)
KanR (Tn903)
)3zal (1081)
5'-(1TR of HBV pre-S2
.17.1am)
fragmento de WRG7293
1050 pares de base (molécula 4759 pares de base)
HBVenh
xm 1 01221 HBsAg 8d1 (423BI
fragmento de WRG7128
1050 pares de base (molécula 4759 pares de base)
Figura 15c
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exon1/2
5'-UTR de HBV pré S2

HBVenh
HBVenh
Scalt)1 (2873)
HBsAg
18/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CfINV Exon1/2
&mu (1720)
intron de insulina de rato
Mirei (1829)
Eacial (1861)
RIA Olhe BgllBam
145 bp
Figura 15e
5'-UTR de HBV pré S2
Tn903, remanescentes de pUC4K
/
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
MV Pro
CMV Exon 1/2
Bam/Bgl fusion
intron de insulina de rato
.9.+131 (1359)
5'-UTR de HBV pré S2

GIob pA
pUC19
HBVenh
B^HI R)
RBGpA
HBVenh
pUC19
HBsAg
HBsAg
Tn903, remanescentes de pUC4K
19/51
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exon1/2
ast}11 Mrril
5'-UTR de HBV pré S2
RIA
Rins hdron A
147 bp
KanR (Tn903)
Dam Hl 0 431
.4.01 ern Tn903, remanescentes de pUC4K
maio
Tn903, rernanéscentes de pUC4K
&mus»
CMV Pro
CMV Exon1/2
non
intron de insulina de rato
0.1 RIM
Dm Hl C1214)
5'-UTR de HBV pré S2
P.)/73119
875 bp
Tn903, remanescentes de pUC4K
Figura 15d
10.
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
kal (553)
Mal caro
Tn903, remanescentes de pUC4K
San MC)
CMV Pro
CMV Exon1/2
intron de insulina de rato
Nhd oco
5'-UTR de HBV pré S2

Giob pA
pUC19
HBV Enh
EcoRV (2499)
rGlob pA
HBVenh
Bsp 1201 (200
BOI (2001
Bgi II (2285)
M2
PJV7549
4043 pb
20/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Tn903, remanescentes de pUC4K
CMV Pro
CMV Exon1/2
intron de insulina de rato
BamHl (1859)
5'-UTR de HBV pré S2
ATG-Nhe
Miei (1789)
Tn903, remanescentes de pUC4K
Bsp1201 (199 CMV Exon112
Nliel (1989 ' intron de insulina de rato
sítios de inserção de CDA
ATG-Nhe
5'-UTR de HBV pré S2
Tn903, remanescentes de pUC4K
NU (2) H3N2 Ru, 1201 (2060)
H3N2
2064 pb
Figura 15f

sítio poliA
região rB-glob Pa
21/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Remanescente ligador misc. CMV Pro
Bsp1201 (3694)
H3 HA CDS
Tn903, remanescentes de pUC4K
Remanescente Pucl9 MCS
CMV Exon1/2
Fusão Bam/BgI
intron A de insulina de rato
5'-UTR de HBV pré S2
ATG-Nhe
NheI (1939)
(1) 1 10 20 30 ,40 ,50 65
H3 PanarrB HA Natural Sequence (1) ,-1„c1,V.F.'NICLPG1,1bPS,T.471.4.0.111AVSPGTINKTI irN EiQIEVTNATELVOSSS
H3 Panam) HA Enccded by pRIV1671 (1) MAS Wftiã.s^ãiÉIM:nia",~4±..AT-Lei.47álAçisitt...vriabumawsTELNQsss
Consensos (1) KTIIALSYILCPFAMPGNENSTATLCIGHHAVSNGÉNkTiTNI±QtEVTNATELVQSSS

pPJV1671 XR-1
pesquisa de pPJB1671
22/51
0 50 100
Título de Hl
Figura 17
150 200

23/51
—0— Vermelhidão
_ Inchaço
Descoloração
Floculação
X Coceira/desconforto
Dia o 20
40
60
Figura 18

Clínico
Pesquisa
Clinico
Pesquisa
Clinico
-;13/11:1-4
24/51
H3
o 100 200 300 400 500
B
o 60 100 160 200
". -Yr.-
Pesquisa .s'
-; 4 ;
H1
5 10 15 25
Título de Hl
Figura 19

VN1194H5
25/51
25/51
Figura 20
KanR (Tn903)
CMV Pro
CMV Exon1/2
Intron A de insulina de rato
5'-UTR de HBV pré S2

Tn903, Remanescentes de pUC4K
26/51
1 GGCGTAATGC TCTGCCAGTG TTACAACCAA TTAACCAATT CTGATTAGAA
CCGCATTACG AGACGGTCAC AATGTTGGTT AATTGGTTAA GACTAATCTT
KanR (Tn903)
51 AAACTCATCG AGCATCAAAT GAAACTGCAA TTTATTCATA TCAGGATTAT
TTTGAGTAGC TCGTAGTTTA CTTTGACGTT AAATAAGTAT AGTCCTAATA
KanR (Tn903)
101 CAATACCATA TTTTTGAAAA AGCCGTTTCT GTAATGAAGG AGAAAACTCA
GTTATGGTAT AAAAACTTTT TCGGCAAAGA CATTACTTCC TCTTTTGAGT
KanR (Tn903)
151 CCGAGGCAGT TCCATAGGAT GGCAAGATCC TGGTATCGGT CTGCGATTCC
GGCTCCGTCA AGGTATCCTA CCGTTCTAGG ACCATAGCCA GACGCTAAGG
KanR (Tn903)
201 GACTCGTCCA ACATCAATAC AACCTATTAA TTTCCCCTCG TCAAAAATAA
CTGAGCAGGT TGTAGTTATG TTGGATAATT AAAGGGGAGC AGTTTTTATT
KanR (Tn903)
251 GGTTATCAAG TGASAAATCA CCATGAGTGA CGACTGAATC CGGTGAGAAT
CCAATAGTTC ACTCTTTAGT GGTACTCACT GCTGACTTAG GCCACTCTTA
HindIII
Nsil
KanR (Tn903)
301 GGCAAAAGCT TATGCATTTC TTTCCAGACT TGTTCAACAG GCCAGCCATT
CCGTTTTCGA ATACGTAAAG AAAGGTCTGA ACAAGTTGTC CGGTCGGTAA
KanR (Tn903)
351 ACGCTCGTCA TCAAAATCAC TCGCATCAAC CAAACCGTTA TTCATTCGTG
TGCGAGCAGT AGTTTTAGTG AGCGTAGTTG GTTTGGCAAT AAGTAAGCAC
KanR (Tn903)
401 ATTGCGCCTG AGCGAGACGA AATACGCGAT CGCTGTTAAA AGGACAATTA
TAACGCGGAC TCGCTCTGCT TTATGCGCTA GCGACAATTT TCCTGTTAAT
KanR (Tn903)
451 CAAACAGGAA TCGAATGCAA CCGGCGCAGG AACACTGCCA GCGCATCAAC
GTTTGTCCTT AGCTTACGTT GGCCGCGTCC TTGTGACGGT CGCGTAGTTG
KanR (Tn903)
501 AATATTTTCA CCTGAATCAG GATATTCTTC TAATACCTGG AATGCTGTTT
TTATAAAAGT GGACTTAGTC CTATAAGAAG ATTATGGACC TTACGACAAA
XmaI
KanR (Tn903)
SmaI NsiI
551 TCCCGGGGAT CGCAGTGGTG AGTAACCATG CATCATCAGG AGTACGGATA
AGGGCCCCTA GCGTCACCAC TCATTGGTAC GTAGTAGTCC TCATGCCTAT
Figura 21a
■

27/51
KanR (Tn903)
601 AAATGCTTGA TGGTCGGAAG AGGCATAAAT TCCGTCAGCC AGTTTAGTCT
TTTACGAACT ACCAGCCTTC TCCGTATTTA AGGCAGTCGG TCAAATCAGA
KanR (Tn903)
651 GACCATCTCA TCTGTAACAT CATTGGCAAC GCTACCTTTG CCATGTTTCA
CTGGTAGAGT AGACATTGTA GTAACCGTTG CGATGGAAAC GGTACAAAGT
KanR (Tn903)
701 GAAACAACTC TGGCGCATCG GGCTTCCCAT ACAATCGATA GATTGTCGCA
CTTTGTTGAG ACCGCGTAGC CCGAAGGGTA TGTTAGCTAT CTAACAGCGT
KanR (Tn903)
751 CCTGATTGCC CGACATTATC GCGAGCCCAT TTATACCCAT ATAAATCAGC
GGACTAACGG GCTGTAATAG CGCTCGGGTA AATATGGGTA TATTTAGTCG
KanR (Tn903)
XhoI
801 ATCCATGTTG GAATTTAATC GCGGCCTCGA GCAAGACGTT TCCCGTTGAA
TAGGTACAAC CTTAAATTAG CGCCGGAGCT CGTTCTGCAA AGGGCAACTT
KanR (Tn903)
Tn9 O 3 , Remanescentes de pUC4K
pUC19 MCS
SalI
AccI
851 TATGGCTCAT AACACCCCTT GTATTACTGT TTATGTAAGC AGACAGGTCG
ATACCGAGTA TTGTGGGGAA CATAATGACA AATACATTCG TCTGTCCAGC
pUC19 MCS
SalI
AccI
CMV Pro
901 ACAATATTGG CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCTATA TCATAATATG
TGTTATAACC GATAACCGGT AACGTATGCA ACATAGATAT AGTATTATAC
CMV Pro
951 TACATTTATA TTGGCTCATG TCCAATATGA CCGCCATGTT GACATTGATT
ATGTAAATAT AACCGAGTAC AGGTTATACT GGCGGTACAA CTGTAACTAA
CMV Pro
SpeI
1001 ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC GGGGTCATTA GTTCATAGCC
TAACTGATCA ATAATTATCA TTAGTTAATG CCCCAGTAAT CAAGTATCGG
Figura 21b

28/51
CMV Pro
1051 CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC
GTATATACCT CAAGGCGCAA TGTATTGAAT GCCATTTACC GGGCGGACCG
CMV Pro
1101 TGACCGCCCA ACGXCCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC
ACTGGCGGGT TGCTGGGGGC GGGTAACTGC AGTTATTACT GCATACAAGG
CMV Pro
1151 CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT
GTATCATTGC GGTTATCCCT GAAAGGTAAC TGCAGTTACC CACCTCATAA
CMV Pro
NdeI
1201 TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT
ATGCCATTTG ACGGGTGAAC CGTCATGTAG TTCACATAGT ATACGGTTCA
CMV Pro
1251 CCGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC
GGCGGGGGAT AACTGCAGTT ACTGCCATTT ACCGGGCGGA CCGTAATACG
CMV Pro
1301 CCAGTACATG ACCTTACGGG ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC ATCTACGTAT
GGTCATGTAC TGGAATGCCC TGAAAGGATG AACCGTCATG TAGATGCATA
CMV Pro
NcoI
1351 TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA CACCAATGGG
ATCAGTAGCG ATAATGGTAC CACTACGCCA AAACCGTCAT GTGGTTACCC
CMV Pro
1401 CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA
GCACCTATCG CCAAACTGAG TGCCCCTAAA GGTTCAGAGG TGGGGTAACT
CMV Pro
1451 CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT
GCAGTTACCC TCAAACAAAA CCGTGGTTTT AGTTGCCCTG AAAGGTTTTA
CMV Pro
1501 GTCGTAATAA CCCCGCCCCG TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG
CAGCATTATT GGGGCGGGGC AACTGCGTTT ACCCGCCATC CGCACATGCC
Exon 1/2 de CMV
CMV Pro
Saci
1551 TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG
ACCCTCCAGA TATATTCGTC ICGAGCAAAT CACTTGGCAG TCTASCGGAC
CMV Exon1/2
1601 GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA TAGAAGACAC CGGGACCGAT
CTCTGCGGTA GGTGCGACAA AACTGGAGGT ATCTTCTGTG GCCCTGGCTA
Figura 21c

Eagl
29/51
Exon 1/2 de CMV
1651 CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GAACGCGGAT TCCCCGTGCC
GGTCGGAGGC GCCGGCCCTT GCCACGTAAC CTTGCGCCTA AGGGGCACGG
Bam/Bgl fusion
Exon 1/2 de CMV Intron A da insulina de rato
1701 AAGAGTGACT CACCGTCCGG ATCTCAGCAA GCAGGTATGT ACTCTCCAGG
TTCTCACTGA GTGGCAGGCC TAGAGTCGTT CGTCCATACA TGAGAGGTCC
Intron A da insulina de rato
1751 GTGGGCCTGG CTTCCCCAGT CAAGACTCCA GGGATTTGAG GGACGCTGTG
CACCCGGACC GAAGGGGTCA GTTCTGAGGT CCCTAAACTC CCTGCGACAC
Intron A da insulina de rato
1801 GGCTCTTCTC TTACATGTAC CTTTTGCTTG CCTCAACCCT GACTATCTTC
CCGAGAAGAG AATGTACATG GAAAACGAAC GGAGTTGGGA CTGATAGAAG
Rat Ins IntA 5'-UTRdeHBVpré-S2
BaraH I
1851 CAGGTCAGGA TCCCAGAGTC AGGGGTCTGT ATTTTCCTGC TGGTGGCTCC
GTCCAGTCCT AGGGTCTCAG TCCCCAGACA TAAAAGGACG ACCACCGAGG
5'-UTR de HBV pré-S2
1901 AGTTCAGGAA CAGTAAACCC TGCTCCGAAT ATTGCCTCTC ACATCTCGTC
TCAAGTCCTT GTCATTTGGG ACGAGGCTTA TAACGGAGAG TGTAGAGCAG
ATG—Nhe
5'-UTR de HBV pré-S2 VN1194H5
NheI
E K I
1951 AATCTCCGCG AGGACTGGGG ACCCTGTGAC GAACATGGCT AGCGAGAAAA
TTAGAGGCGC TCCTGACCCC TGGGACACTG CTTGTACCGA TCGCTCTTTT
VN1194115
. VLL FAI VSLV K S D Q I C
2001 TAGTGCTTCT TTTTGCAATA GTCAGTCTTG TTAAAAGTGA TCAGATTTGC
ATCACGAAGA AAAACGTTAT CAGTCAGAAC AATTTTCACT AGTCTAAACG
VN1194H5
IGYH ANN STE QVDT IME.
2051 ATTGGTTACC ATGCAAACAA CTCGACAGAG CAGGTTGACA CAATAATGGA
TAACCAATGG TACGTTTGTT GAGCTGTCTC GTCCAACTGT GTTATTACCT
VN1194H5
KNV TVTH A Q D I L E KTHN
2101 AAAGAACGTT ACTGTTACAC ATGCCCAAGA CATACTGGAA AAGACACACA
TTTCTTGCAA TGACAATGTG TACGGGTTCT GTATGACCTT TTCTGTGTGT
Figura 21d

XbaI
30/51
VN1194H5
G K L CDL D G V K PLI L R D
2151 ATGGGAAGCT CTGCGATCTA GATGGAGTGA AGCCTCTAAT TTTGAGAGAT
TACCCTTCGA GACGCTAGAT CTACCTCACT TCGGAGATTA AAACTCTCTA
VN1194H5
EcoRI
C S V A GWL LGN PMCD E F I
2201 TGTAGTGTAG CTGGATGGCT CCTCGGAAAC CCAATGTGTG ACGAATTCAT
ACATCACATC GACCTACCGA GGAGCCTTTG GGTTACACAC TGCTTAAGTA
VN1194H5
NVP E W S Y IVE KAN PVND.
2251 CAATGTGCCG GAATGGTCTT ACATAGTGGA GAAGGCCAAT CCAGTCAATG
GTTACACGGC CTTACCAGAA TGTATCACCT CTTCCGGTTA GGTCAGTTAC
VN1194H5
LCY P G D FNDY EEL KHL
2301 ACCTCTGTTA CCCAGGGGAT TTCAATGACT ATGAAGAATT GAAACACCTA
TGGAGACAAT GGGTCCCCTA AAGTTACTGA TACTTCTTAA CTTTGTGGAT
VN1194H5
LSRI N H F E K I QIIP K S S
2351 TTGAGCAGAA TAAACCATTT TGAGAAAATT CAGATCATCC CCAAAAGTTC
AACTCGTCTT ATTTGGTAAA ACTCTTTTAA GTCTAGTAGG GGTTTTCAAG
VN1194H5
Saci
WSS HEAS L G V S S A C P Y Q
2401 TTGGTCCAGT CATGAAGCCT CATTGGGGGT GAGCTCAGCA TGTCCATACC
AACCAGGTCA GTACTTCGGA GTAACCCCCA CTCGAGTCGT ACAGGTATGG
VN1194H5
G. K S S . FF R N V V W L I K K N
2451 AGGGAAAGTC CTCCTTTTTC AGAAATGTGG TATGGCTTAT CAAAAAGAAC
TCCCTTTCAG GAGGAAAAAG TCTTTACACC ATACCGAATA GTTTTTCTTG
VN1194H5
BglII
---
S T Y P TIKRSY NNTN Q E D
2501 AGTACATACC CAACAATAAA GAGGAGCTAC AATAATACCA ACCAAGAAGA
TCATGTATGG GTTGTTATTT CTCCTCGATG TTATTATGGT TGGTTCTTCT
VN1194H5
Figura 21e

BglII
31/51
LLV L W G I HHP NDA AEQT
2551 TCTTTTGGTA CTGTGGGGGA TTCACCATCC TAATGATGCG GCAGAGCAGA
AGAAAACCAT GACACCCCCT AAGTGGTAGG ATTACTACGC CGTCTCGTCT
VN1194H5
KLY Q N P T T Y I S V G T S T
2601 CAAAGCTCTA TCAAAACCCA ACCACCTATA TTTCCGTTGG GACATCAACA
GTTTCGAGAT AGTTTTGGGT TGGTGGATAT AAAGGCAACC CTGTAGTTGT
VN1194H5
L N Q R LVP RIA T R S K V N G
2651 CTAAACCAGA GATTGGTACC AAGAATAGCT ACTAGATCCA AAGTAAACGG
GATTTGGTCT CTAACCATGG TTCTTATCGA TGATCTAGGT TTCATTTGCC
VN1194H5
QSG RMEF F W T I L K P N D A
2701 GCAAAGTGGA AGGATGGAGT TCTTCTGGAC AATTTTAAAA CCGAATGATG
CGTTTCACCT TCCTACCTCA AGAAGACCTG TTAAAATTTT GGCTTACTAC
VN1194H5
NsiI
INF ESN G N F I APE YAY
2751 CAATCAACTT CGAGAGTAAN GGAAATTTCA TTGCTCCAGA ATATGCATAC
GTTAGTTGAA GCTCTCATTA CCTTTAAAGT AACGAGGTCT TATACGTATG
VN1194H5
KIVK K G D STI MKSE LEY
2801 AAAATTGTCA AGAAAGGGGA CTCAACAATT ATGAAAAGTG AATTGGAATA
TTTTAACAGT TCTTTCCCCT GAGTTGTTAA TACTTTTCAC TTAACCTTAT
VN1194H5
GNC N T K C QTP M G A INSS.
2851 TGGTAACTGC AACACCAAGT GTCAAACTCC AATGGGGGCG ATAAACTCTA
ACCATTGACG TTGTGGTTCA CAGTTTGAGG TTACCCCCGC TATTTGAGAT
VN1194H5
SphI
MPF H N I HPLT I G E C P K
2901 GCATGCCATT CCACAATATA CACCCTCTCA CCATCGGGGA ATGCCCCAAA
CGTACGGTAA GGTGTTATAT GTGGGAGAGT GGTAGCCCCT TACGGGGTTT
VN1194H5
YVKS NRL VLA T G L R N S P
2951 TATGTGAAAT CAAACAGATT AGTCCTTGCG ACTGGGCTCA GAAATAGCCC
ATACACTTTA GTTTGTCTAA TCAGGAACGC TGACCCGAGT CTTTATCGGG
VN1194H5
QRE RRRK KRG L F G AIAG
3001 TCAAAGAGAG AGAAGAAGAA AAAAGAGAGG ATTATTTGGA GCTATAGCAG
AGTTTCTCTC TCTTCTTCTT TTTTCTCTCC TAATAAACCT CGATATCGTC
VN1194H5
Figura 21f

32/51
FIE GGW QGMV DGW Y G Y
3051 GTTTTATAGA GGGAGGATGG CAGGGAATGG TAGATGGTTG GTATGGGTAC
CAAAATATCT CCCTCCTACC GTCCCTTACC ATCTACCAAC CATACCCATG
VN1194H5
PstI
HMSN E Q G S G Y AADK EST
3101 CACCATAGCA ACGAGCAGGG GAGTGGGTAC GCTGCAGACA AAGAATCCAC
GTGGTATCGT-TGCTCGTCCC CTCACCCATG CGACGTCTGT TTCTTAGGTG
VN119455
QKA IDGV T N K V N S IIDK
3151 TCAAAAGGCA ATAGATGGAG TCACCAATAA GGTCAACTCG ATTATTGACA
AGTTTTCCGT TATCTACCTC AGTGGTTATT CCAGTTGAGC TAATAAGTGT
VN1194H5
MNT Q F E A V G R E F N N L E
3201 AAATGAACAC TCAGTTTGAG GCCGTTGGAA GGGAATTTAA CAACTTAGAA
TTTACTTGTG AGTCAAACTC CGGCAACCTT CCCTTAAATT GTTGAATCTT
VN1194H5
RR,IE N L N KKMEDGF LDV
3251 AGGAGAATAG AGAATTTAAA CAAGAAGATG GAAGACGGGT TCCTAGATGT
TCCTCTTATC TCTTAAATTT GTTCTTCTAC CTTCTGCCCA AGGATCTACA
VN1194145
WTY NAEL LVL MEN E R T L
3301 CTGGACTTAT AATGCTGAAC TTCTAGTTCT CATGGAAAAC GAGAGAACTC
GACCTGAATA TTACGACTTG AAGATCAAGA GTACCTTTTG CTCTCTTGAG
VN1194H5
XbaI
DFH D S N V K N L Y D K V R L
3351 TAGACTTTCA TGACTCAAAT GTCAAGAACC TTTACGACAA GGTCCGACTA
ATCTGAAAGT ACTGAGTTTA CAGTTCTTGG AAATGCTGTT CCAGGCTGAT
VN1194H5
QLRD NAK ELG N G C F EFY
3401 CAGCTTAGGG ATAATGCAAA GGAGCTGGGT AACGGTTGTT TCGAGTTCTA
GTCGAATCCC TATTACGTTT CCTCGACCCA TTGCCAACAA AGCTCAAGAT
VN119455
HKC DNEC MES VRN G T Y D
3451 TCATAAATGT GATAATGAAT GTATGGAAAG TGTAAGAAAC GGAACGTATG
AGTATTTACA CTATTACTTA CATACCTTTC ACATTCTTTG CCTTGCATAC
VN1194H5
YPQ YSE EARL KRE EIS
3501 ACTACCCGCA GTATTCAGAA GAAGCAAGAC TAAAAAGAGA GGAAATAAGT
TGATGGGCGT CATAAGTCTT CTTCGTTCTG ATTTTTCTCT CCTTTATTCA
VN119455
Figura 21g
XbaI

33/51
G V K L ESI G I Y Q I L S I Y S
3551 GGAGTAAAAT TGGAATCAAT AGGAATTTAC CAAATATTGT CAATTTATTC
CCTCATTTTA ACCTTAGTTA TCCTTAAATG GTTTATAACA GTTAAATAAG
VN1194H5
SacI
TVA SSLA LAI MVA G L S L
3601 TACAGTGGCG AGCTCCCTAG CACTGGCAAT CATGGTAGCT GGTCTATCCT
ATGTCACCGC TCGAGGGATC GTGACCGTTA GTACCATCGA CCAGATAGGA
VN1194H5
WMC S N G S L Q C RICI
3651 TATGGATGTG CTCCAATGGG TCGTTACAAT GCAGAATTTG CATTTAAATG
ATACCTACAC GAGGTTACCC AGCAATGTTA CGTCTTAAAC GTAAATTTAC
HBVenh
Bsp120I
3701 GGCCCTAACA AAACAAAAAG ATGGGGTTAT TCCCTAAACT TCATGGGTTA
CCGGGATTGT TTTGTTTTTC TACCCCAATA AGGGATTTGA AGTACCCAAT
HBVenh
3751 CGTAATTGGA AGTTGGGGGA CATTGCCACA AGATCATATT GTACAAAAGA
GCATTAACCT TCAACCCCCT GTAACGGTGT TCTAGTATAA CATGTTTTCT
HBVenh
3801 TCAAACACTG TTTTAGAAAA CTTCCTGTAA ACAGGCCTAT TGATTGGAAA
AGTTTGTGAC AAAATCTTTT GAAGGACATT TGTCCGGATA ACTAACCTTT
HBVenh
3851 GTATGTCAAA GGATTGTGGG TCTTTTGGGC TTTGCTGCTC CATTTACACA
CATACAGTTT CCTAACACCC AGAAAACCCG AAACGACGAG GTAAATGTGT
HBVenh
NsiI
EcoRV AccI
3901 ATGTGGATAT CCTGCCTTAA TGCCTTTGTA TGCATGTATA CAAGCTAAAC
TACACCTATA GGACGGAATT ACGGAAACAT ACGTACATAT GTTCGATTTG
HBVenh
3951 AGGCTTTCAC TTTCTCGCCA ACTTACAAGG CCTTTCTAAG TAAACAGTAC
TCCGAAAGTG AAAGAGCGGT TGAATGTTCC GGAAAGATTC ATTTGTCATG
HBVenh
4001 ATGAACCTTT ACCCCGTTGC TCGGCAACGG CCTGGTCTGT GCCAAGTGTT
TACTTGGAAA TGGGGCAACG AGCCGTTGCC GGACCAGACA CGGTTCACAA
Figura 21h
Bsp120I

34/51
HBVenh
SphI
4051 TGCTGACGCA ACCCCCACTG GCTGGGGCTT GGCCATAGGC CATCAGCGCA
ACGACTGCGT TGGGGGTGAC CGACCCCGAA CCGGTATCCG GTAGTCGCGT
HBVenh
SphI
4101 TGCGTGGAAC CTTTGTGGCT CCTCTGCCGA TCCATACTGC GGAACTCCTA
ACGCACCTTG GAAACACCGA GGAGACGGCT AGGTATGACG CCTTGAGGAT
HBVenh
4151 GCCGCTTGTT TTGCTCGCAG CCGGTCTGGA GCAAAGCTCA TAGGAACTGA
CGGCGAACAA AACGAGCGTC GGCCAGACCT CGTTTCGAGT ATCCTTGACT
Unknown
HBVenh rGlob pA
4201 CAATTCTGTC GTCCTCTCGC GGAAATATAC ATCGTTTCGA TCTACGTATG
GTTAAGACAG CAGGAGAGCG CCTTTATATG TAGCAAAGCT AGATGCATAC
rGlob pA
4251 ATCTTTTTCC CTCTGCCAAA AATTATGGGG ACATCATGAA GCCCCTTGAG
TAGAAAAAGG GAGACGGTTT TTAATACCCC TGTAGTACTT CGGGGAACTC
PolyA Site_l
rGlob pA
4301 CATCTGACTT CTGGCTAATA AAGGAAATTT ATTTTCATTG CAATAGTGTG
GTAGACTGAA GACCGATTAT TTCCTTTAAA TAAAAGTAAC GTTATCACAC
rGlob pA pUC19
EcoRI
4351 TTGGAATTTT TTGTGTCTCT CACTCGGAAG GAATTCTGCA TTAATGAATC
AACCTTAAAA AACACAGAGA GTGAGCCTTC CTTAAGACGT AATTACTTAG
pUC19
4401 GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT CTTCCGCTTC
CCGGTTGCGC GCCCCTCTCC GCCAAACGCA TAACCCGCGA GAAGGCGAAG
pUC19
4451 CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT
GAGCGAGTGA CTGAGCGACG CGAGCCAGCA AGCCGACGCC GCTCGCCATA
pUC19
4501 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC
GTCGAGTGAG TTTCCGCCAT TATGCCAATA GGTGTCTTAG TCCCCTATTG
pUC19
4551 GCAGGAAAGA ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA
CGTCCTTTCT TGTACACTCG TTTTCCGGTC GTTTTCCGGT CCTTGGCATT
pUC19
Figura 21i

35/51
4601 AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC
TTTCCGGCGC AACGACCGCA AAAAGGTATC CGAGGCGGGG GGACTGCTCG
pUC19
4651 ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC GACAGGACTA
TAGTGTTTTT AGCTGCGAGT TCAGTCTCCA CCGCTTTGGG CTGTCCTGAT
pUC19
4701 TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT
ATTTCTATGG TCCGCAAAGG GGGACCTTCG AGGGAGCACG CGAGAGGACA
pUC19
4751 TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA
AGGCTGGGAC GGCGAATGGC CTATGGACAG GCGGAAAGAG GGAASCCCTT
pUC19
4801 GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG
CGCACCGCGA AAGAGTATCG AGTGCGACAT CCATAGAGTC AAGCCACATC
1=19
4851 GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA
CAGCAAGCGA GGTTCGACCC GACACACGTG CTTGGGGGGC AAGTCGGGCT
pUC19
4901 CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC
GGCGACGCGG AATAGGCCAT TGATAGCAGA ACTCAGGTTG GGCCATTCTG
pUC19
4951 ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG
TGCTGAATAG CGGTGACCGT CGTCGGTGAC CATTGTCCTA ATCGTCTCGC
pUC19
5001 AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG
TCCATACATC CGCCACGATG TCTCAAGAAC TTCACCACCG GATTGATGCC
pUC19
5051 CTACACTAGA AGAACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA
GATGTGATCT TCTTGTCATA AACCATAGAC GCGAGACGAC TTCGGTCAAT
pUC19
5101 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT
GGAAGCCTTT TTCTCAACCA TCGAGAACTA GGCCGTTTGT TTGGTGGCGA
pUC19
5151 GGTAGCGGTG GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA
CCATCGCCAC CAAAAAAACA AACGTTCGTC GTCTAATGCG CGTCTTTTTT
pUC19
5201 AGGATCTCAA GAAGATCCTT TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT
TCCTAGAGTT CTTCTAGGAA ACTAGAAAAG ATGCCCCAGA CTGCGAGTCA
Figura 21j

36/51
pUC19
5251 GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG TCATGAGATT ATCAAAAAGG
CCTTGCTTTT GAGTGCAATT CCCTAAAACC AGTACTCTAA TAGTTTTTCC
pUC19
5301 ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA AATCAATCTA
TAGAAGTGGA TCTAGGAAAA TTTAATTTTT ACTTCAAAAT TTAGTTAGAT
pUC19
5351 AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG
TTCATATATA CTCATTTGAA CCAGACTGTC AATGGTTACG AATTAGTCAC
pUC19
5401 AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA
TCCGTGGATA GAGTCGCTAG ACAGATAAAG CAAGTAGGTA TCAACGGACT
pUC19
5451 CTC
GAG
Figura 21k

Sítio poliAl
rGlob pA
Desconhecido
HBVenh
pUC19
37/51
LTA CDS 4\1111111% -_,... .~-7-
Lysozyme SP
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
49"INN
W3.11/2012
5578 pb
N
Tn903, remanescentes de pUC4K
LTB CDS
,Lisozima SP
5'-UTR de HBV p ré-S
Intron A da insulina de rato
'P,' Fusão oBame 1n d CMV v
.4'-
-_--- ,.--g) Exon
mCMVpro
CMV Pro
5'-UTR de HBV pré-S Exon 1/2 de CMV
Intron A da insulina de rato Fusão Bam/BgI
Figura 22
RBGpA

inserto LT A
inserto CMV pro
regiões não traduzidas, CLSP
recriar MCS
recriar MCS
PJV7592
Al
aceitador
PJV2012
38/51
v
Figura 23
PJV7591
doador
inserto LT B
inserto 3' de regiões não
traduzidas, CLSP
ligar o cassete de expressão LT B e
fragmento de vetor aceitador

1 GGCGTAATGC TCTGCCASTG TTACAACCAA TTAACCAATT CTGATTAGAA AAACTCATCG AGCATCAAAT GAAACTGCAA TTTATTCATA TCAGGATTAT
CCGCATTACG AGACGGTCAC AATGTTGGTT AATTGGTTAA GACTAATCTT TTTGAGTAGC TCGTAGTTTA CTTTGACGTT AAATAAGTAT AGTCCTAATA
KanR (Tn903)
101 CAATACCATA TTTTTGAAAA AGCCGTTTCT GTAATGAAGG AGAAAACTCA CCGAGGCAGT TCCATAGGAT GGCAAGATCC TGGTATCGGT CTGCGATTCC
GTTATGGTAT AAAAACTTTT TCGGCAAAGA CATTACTTCC TCTTTTGAGT GGCTCCGTCA AGGTATCCTA CCGTTCTAGG ACCATAGCCA GACGCTAAGG
KanR (Tn903)
201 GACTCGTCCA ACATCAATAC AACCTATTAA TTTCCCCTCG TCAAAAATAA GGTTATCAAG TGAGAAATCA CCATGAGTGA CGACTGAATC CGGTGAGAAT
CTGAGCAGGT TGTAGTTATG TTGGATAATT AAAGGGGAGC AGTTTTTATT CCAATAGTTC ACTCTTTAGT GGTACTCACT GCTGACTTAG GCCACTCTTA
HindIII
KanR (Tn903)
301 GGCAAAAGCT TATGCATTTC TTTCCAGACT TGTTCAACAG GCCAGCCATT ACGCTCGTCA TCAAAATCAC TCGCATCAAC CAAACCGTTA TTCATTCGTG
CCGTTTTCGA ATACGTAAAG AAAGGTCTGA ACAAGTTGTC CGGTCGGTAA TGCGAGCAGT AGTTTTAGTG AGCGTAGTTG GTTTGGCAAT AAGTAAGCAC
KanR (Tn903)
401 ATTGCGCCTG AGCGAGACGA AATACGCGAT CGCTGTTAAA AGGACAATTA CAAACAGGAA TCAAATGCAA CCGGCGCAGG AACACTGCCA GCGCATCAAC
TAACGCGGAC TCGCTCTGCT TTATGCGCTA GCGACAATTT TCCTGTTAAT GTTTGTCCTT AGTTTACGTT GGCCGCGTCC TTGTGACGGT CGCGTAGTTG
KanR (Tn903)
501 AATATTTTCA CCTGAATCAG GATATTCTTC TAATACCTGG AATGCTGTTT TCCCGGGGAT CGCAGTGGTG AGTAACCATG CATCATCAGG AGTACGGATA
TTATAAAAGT GGACTTAGTC CTATAAGAAG ATTATGGACC TTACGACAAA AGGGCCCCTA GCGTCACCAC TCATTGGTAC GTAGTAGTCC TCATGCCTAT
KanR (Tn903)
601 AAATGCTTGA TGGTCGGAAG AGGCATAAAT TCCGTCAGCC AGTTTAGTCT GACCATCTCA TCTGTAACAT CATTGGCAAC GCTACCTTTG CCATGTTTCA
TTTACGAACT ACCAGCCTTC TCCGTATTTA AGGCAGTCGG TCAAATCAGA CTGGTAGAGT AGACATTGTA GTAACCGTTG CGATGGAAAC GGTACAAAGT
KanR (Tn903)
701 GAAACAACTC TGGCGCATCG GGCTTCCCAT ACAATCGATA GATTGTCGCA CCTGATTGCC CGACATTATC GCGAGCCCAT TTATACCCAT ATAAATCAGC
CTTTGTTGAG ACCGCGTAGC CCGAAGGGTA TGTTAGCTAT CTAACAGCGT GGACTAACGG GCTGTAATAG CGCTCGGGTA AATATGGGTA TATTTAGTCG
KanR (Tn903)
801 ATCCATGTTG GAATTTAATC GCGGCCTCGA GCAAGACGTT TCCCGTTGAA TATGGCTCAT AACACCCCTT GTATTACTGT TTATGTAAGC AGACAGGTCG
TAGGTACAAC CTTAAATTAG CGCCGGAGCT CGTTCTGCAA AGGGCAACTT ATACCGAGTA TTGTGGGGAA CATAATGACA AATACATTCG TCTGTCCAGC
KanR (Tn903)
901 ACAATTCCTT CCGAGTGAGA GACACAAAAA ATTCCAACAC ACTATTGCAA TGAAAATAAA TTTCCTTTAT TAGCCAGAAG TCAGATGCTC AAGGGGCTTC
TGTTAAGGAA GGCTCACTCT CTGTGTTTTT TAAGGTTGTG TGATAACGTT ACTTTTATTT AAAGGAAATA ATCGGTCTTC AGTCTACGAG TTCCCCGAAG
Figura 24a

1001 ATGATGTCCC CATAATTTTT GGCAGAGGGA AAAAGATCCC TAGTTTTCCA TACTGATTGC CGCAATTGAA TTGGGGGTTT TATTATTCCA TACACATAAT
TACTACAGGG GTATTAAAAA CCGTCTCCCT TTTTCTAGGG ATCAAAAGGT ATGACTAACG GCGTTAACTT AACCCCCAAA ATAATAAGGT ATGTGTATTA
LTB CDS
1101 TTATCAATTT TGGTCTCGGT CAGATATGTG ATTCTTAATG TGTCCTTCAT CCTTTCAATG GCTTTTTTTT GGGAGTCTAT ATGTTGACTG CCCGGGACTT
AATASTTAAA ACCAGAGCCA GTCTATACAC TAAGAATTAC ACAGGAAGTA GGAAAGTTAC CGAAAAAAAA CCCTCAGATA TACAACTGAC GGGCCCTGAA
LTB CDS
1201 CGACCTGAAA TGTTGCGCCG CTCTTAAATG TAATGATAAC CATTTCTCTT TTGCCTGCCA TCGATTCCGT ATATGATAGT ATCTTGTCAT TTATCGTATA
GCTGGACTTT ACAACGCGGC GAGAATTTAC ATTACTATTG GTAAAGAGAA AACGGACGGT AGCTAAGGCA TATACTATCA TAGAACAGTA AATAGCATAT
LTB CDS
1301 TATTTGTGTG TTGCGATATT CCGAACATAG TTCTGTAATA GACTGGGGAG CGCTAGCCCC CAGAGCAGCC AGGGGCAGGA AGCAAAGCAC CAAGATTAGC
ATAAACACAC AACGCTATAA GGCTTGTATC AAGACATTAT CTGACCCCTC GCGATCGGGG GTCTCGTCGG TCCCCGTCCT TCGTTTCGTG GTTCTAATCG
LTB CDS
1401 AAAGACCTAC TAGCCATGTT CGTCACAGGG TCCCCAGTCC TCGCGGAGAT TGACGAGATG TGAGAGGCAA TATTCGGAGC AGGGTTTACT GTTCCTGAAC
TTTCTGGATG ATCGGTACAA GCAGTGTCCC AGGGGTCAGG AGCGCCTCTA ACTGCTCTAC ACTCTCCGTT ATAAGCCTCG TCCCAAATGA CAAGGACTTG
BamHI
NheI
5'-UTR de HBV pré-S2
1501 TGGAGCCACC AGCAGGAAAA TACAGACCCC TGACTCTGGG ATCCTGACCT GGAAGATAGT CAGGGTTGAG GCAAGCAAAA GGTACATGTA AGAGAAGAGC
ACCTCGGTGG TCGTCCTTTT ATGTCTGGGG ACTGAGACCC TAGGACTGGA CCTTCTATCA GTCCCAACTC CGTTCGTTTT CCATGTACAT TCTCTTCTCG
5'-UTR of HBV pre-S2
1601 CCACAGCGTC CCTCAAATCC CTGGAGTCTT GACTGGGGAA GCCAGGCCCA CCCTGGAGAG TACATACCTG CTTGCTGAGA TCCGGACGGT GAGTCACTCT
GGTGTCGCAG GGAGTTTAGG GACCTCAGAA CTGACCCCTT CGGTCCGGGT GGGACCTCTC ATGTATGGAC GAACGACTCT AGGCCTGCCA CTCAGTGAGA
1701 TGGCACGGGG AATCCGCGTT CCAATGCACC GTTCCCGGCC GCGGAGGCTG GATCGGTCCC GGTGTCTTCT ATGGAGGTCA AAACAGCGTG GATGGCGTCT
ACCGTGCCCC TTAGGCGCAA GGTTACGTGG CAAGGGCCGG CGCCTCCGAC CTAGCCAGGG CCACAGAAGA TACCTCCAGT TTTGTCGCAC CTACCGCAGA
1801 CCAGGCGATC TGACGGTTCA CTAAACGAGC TCTGCTTATA TAGACCTCCC ACCGTACACG CCTACCGCCC ATTTGCGTCA ACGGGGCGGG GTTATTACGA
GGTCCGCTAG ACTGCCAAGT GATTTGCTCG AGACGAATAT ATCTGGAGGG TGGCATGTGC GGATGGCGGG TAAACGCAGT TGCCCCGCCC CAATAATGCT
PstI
1901 CATTTTGGAA AGTCCCGTTG ATTTTGGTGC TCGACCTGCA GGTCGACAAT ATTGGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CTATATCATA ATATGTACAT
GTAAAACCTT TCAGGGCAAC TAAAACCACG AGCTGGACGT CCAGCTGTTA TAACCGATAA CCGGTAACGT ATGCAACATA GATATAGTAT TATACATGTA
2001 TTATATTGGC TCATGTCCAA TATGACCGCC ATGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT
AATATAACCG AGTACAGGTT ATACTGGCGG TACAACTGTA ACTAATAACT GATCAATAAT TATCATTAGT TAATGCCCCA GTAATCAAGT ATCGGGTATA
Figura 24b

2101 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG
TACCTCAAGG CGCAATGTAT TGAATGCCAT TTACCGGGCG GACCGACTGG CGGGTTGCTG GGGGCGGGTA ACTGCAGTTA TTACTGCATA CAAGGGTATC
2201 TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTCCGCC
ATTGCGGTTA TCCCTGAAAG GTAACTGCAG TTACCCACCT CATAAATGCC ATTTGACGGG TGAACCGTCA TGTAGTTCAC ATAGTATACG GTTCAGGCGG
2301 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ACGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC
GGGATAAcTG CAGTTACTGC CATTTACCGG GCGGACCGTA ATACGGGTCA TGTACTGGAA TGCCCTGAAA GGATGAACCG TCATGTAGAT GCATAATCAG
2401 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACACCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA
TAGCGATAAT GGTACCACTA CGCCAAAACC GTCATGTGGT TACCCGCACC TATCGCCAAA CTGAGTGCCC CTAAAGGTTC AGAGGTGGGG TAACTGCAGT
2501 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT AATAACCCCG CCCCGTTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA
TACCCTCAAA CAAAACéGTG GTTTTAGTTG CCCTGAAAGG TTTTACAGCA TTATTGGGGC GGGGCAACTG CGTTTACCCG CCATCCGCAC ATGCCACCCT
2601 GGTCTATATA AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTGTTTTGAC CTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC
CCAGATATAT TCGTCTCGAG CAAATCACTT GGCAGTCTAG CGGACCTCTG CGGTAGGTGC GACAAAACTG GAGGTATCTT CTGTGGCCCT GGCTAGGTCG
2701 CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG CGGATTCCCC GTGCCAAGAG TGACTCACCG TCCGGATCTC AGCAAGCAGG TAXGTACTCT.CCAGGGTGGG
GAGGCGCCGG CCCTTGCCAC GTAACCTTGC GCCTAAGGGG CACGGTTCTC ACTGAGTGGC AGGCCTAGAG TCGTTCGTCC ATACATGAGA GGTCCCACCC
2801 CCTGGCTTCC CCAGTCAAGA CTCCAGGGAT TTGAGGGACG CTGTGGGCTC TTCTCTTACA TGTACCTTTT GCTTGCCTCA ACCCTGACTA TCTTCCAGGT
GGACCGAAGG GGTCAGTTCT GAGGTCCCTA AACTCCCTGC GACACCCGAG AAGAGAATGT ACATGGAAAA CGAACGGAGT TGGGACTGAT AGAAGGTCCA
5'-UTR of HBV pre-S2
BamHI
2901 CAGGATCCCA GAGTCAGGGG TCTGTATTTT CCTGCTGGTG GCTCCAGTTC AGGAACAGTA AACCCTGCTC CGAATATTGC CTCTCACATC TCGTCAATCT
GTCCTAGGGT CTCAGTCCCC AGACATAAAA GGACGACCAC CGAGGTCAAG TCCTTGTCAT TTGGGACGAG GCTTATAACG GAGAGTGTAG AGCAGTTAGA
5'-UTR de HBV pré-S2
LTA CDS
3001 CCGCGAGGAC TGGGGACCCT GTGACGAACA TGGCTAGTAG GTCTTTGCTA ATCTTGGTGC TTTGCTTCCT GCCCCTGGCT GCTCTGGGGG CTAGCAATGG
GGCGCTCCTG ACCCCTGGGA CACTGCTTGT ACCGATCATC CAGAAACGAT TAGAACCACG AAACGAAGGA CGGGGACCGA CGAGACCCCC GATCGTTACC
LTA CDS
3101 CGACAAATTA TACCGTGCTG ACTCTAGACC CCCAGATGAA ATAAAACGTT CCGGAGGTCT TATGCCCAGA GGGCATAATG AGTACTTCGA TAGAGGAACT
GCTGTTTAAT ATGGCACGAC TGAGATCTGG GGGTCTACTT TATTTTGCAA GGCCTCCAGA ATACGGGTCT CCCGTATTAC TCATGAAGCT ATCTCCTTGA
LTA CDS
3201 CAAATGAATA TTAATCTTTA TGATCACGCG AGAGGAACAC AAACCGGCTT TGTCAGATAT GATGACGGAT ATGTTTCCAC TTCTCTTAGT TTGAGAAGTG
GTTTACTTAT AATTAGAAAT ACTAGTGCGC TCTCCTTGTG TTTGGCCGAA ACAGTCTATA CTACTGCCTA TACAAAGGTG AAGAGAATCA AACTCTTCAC
LTA CDS
Figura 24c
NheI

3301 CTCACTTAGC AGGACAGTCT ATATTATCAG GATATTCCAC TTACTATATA TATGTTATAG CGACAGCACC AAATATGTTT AATGTTAATG ATGTATTAGG
GAGTGAATCG TCCTGTCAGA TATAATAGTC CTATAAGGTG AATGATATAT ATACAATATC GCTGTCGTGG TTTATACAAA TTACAATTAC TACATAATCC
LTA CDS
3401 CGTATACAGC CCTCACCCAT ATGAACAGGA GGTTTCTGCG TTAGGTGGAA TACCATATTC TCAGATATAT GGATGGTATC GTGTTAATTT TGGTGTGATT
GCATATGTCG GGAGTGGGTA TACTTGTCCT CCAAAGACGC AATCCACCTT ATGGTATAAG AGTCTATATA CCTACCATAG CACAATTAAA ACCACACTAA
LTA CDS
3501 GATGAACGAT TACATCGTAA CAGGGAATAT AGAGACCGGT ATTACAGAAA TCTGAATATA GCTCCGGCAG AGGATGGTTA CAGATTAGCA GGTTTCCCAC
CTACTTGCTA ATGTAGCATT GTCCCTTATA TCTCTGGCCA TAATGTCTTT AGACTTATAT CGAGGCCGTC TCCTACCAAT GTCTAATCGT CCAAAGGGTG
LTA CDS
HindIII
3601 CGGATCACCA AGCTTGGAGA GAAGAACCCT GGATTCATCA TGCACCACAA GGTTGTGGAA ATTCATCAAG AACAATTACA GGTGATACTT GTAATGAGGA
GCCTAGTGGT TCGAACCTCT CTTCTTGGGA CCTAAGTAGT ACGTGGTGTT CCAACACCTT TAAGTAGTTC TTGTTAATGT CCACTATGAA CATTACTCCT
LTA CDS
EcoRI
3701 GACCCAGAAT CTGAGCACAA TATATCTCAG GAAATATCAA TCAAAAGTTA AGAGGCAGAT ATTTTCAGAC TATCAGTCAG AGGTTGACAT ATATAACAGA
CTGGGTCTTA GACTCGTGTT ATATAGAGTC CTTTATAGTT AGTTTTCAAT TCTCCGTCTA TAAAAGTCTG ATAGTCAGTC TCCAACTGTA TATATTGTCT
LTA CDS
CJI
s,
EcoRI
3801 ATTCGGGATG AATTATGAGG ATCTGGGCCC TAACAAAACA AAAAGATGGG GTTATTCCCT AAACTTCATG GGTTACGTAA TTGGAAGTTG GGGGACATTG
TAAGCCCTAC TTAATACTCC TAGACCCGGG ATTGTTTTGT TTTTCTACCC CAATAAGGGA TTTGAAGTAC CCAATGCATT AACCTTCAAC CCCCTGTAAC
3901 CCACAAGATC ATATTGTACA AAAGATCAAA CACTGTTTTA GAAAACTTCC TGTAAACAGG CCTATTGATT GGAAAGTATG TCAAAGGATT GTGGGTCTTT
GGTGTTCTAG TATAACATGT TTTCTAGTTT GTGACAAAAT CTTTTGAAGG ACATTTGTCC GGATAACTAA CCTTTCATAC AGTTTCCTAA CACCCAGAAA
4001 TGGGCTTTGC TGCTCCATTT ACACAATGTG GATATCCTGC CTTAATGCCT TTGTATGCAT GTATACAAGC TAAACAGGCT TTCACTTTCT CGCCAACTTA
ACCCGAAACG ACGAGGTAAA TGTGTTACAC CTATAGGACG GAATTACGGA AACATACGTA CATATGTTCG ATTTGTCCGA AAGTGAAAGA GCGGTTGAAT
4101 CAAGGCCTTT CTAAGTAAAC AGTACATGAA CCTTTACCCC GTTGCTCGGC AACGGCCTGG TCTGTGCCAA GTGTTTGCTG ACGCAACCCC CACTGGCTGG
GTTCCGGAAA GATTCATTTG TCATGTACTT GGAAATGGGG CAACGAGCCG TTGCCGGACC AGACACGGTT CACAAACGAC TGCGTTGGGG GTGACCGACC
4201 GGCTTGGCCA TAGGCCATCA GCGCATGCGT GGAACCTTTG TGGCTCCTCT GCCGATCCAT ACTGCGGAAC TCCTAGCCGC TTGTTTTGCT CGCAGCCGGT
CCGAACCGGT ATCCGGTAGT CGCGTACGCA CCTTGGAAAC ACCGAGGAGA CGGCTAGGTA TGACGCCTTG AGGATCGGCG AACAAAACGA GCGTCGGCCA
4301 CTGGAGCAAA GCTCATAGGA ACTGACAATT CTGTCGTCCT CTCGCGGAAA TATACATCGT TTCGATCTAC GTATGATCTT TTTCCCTCTG CCAAAAATTA
GACCTCGTTT CGAGTATCCT TGACTGTTAA GACAGCAGGA GAGCGCCTTT ATATGTAGCA AAGCTAGATG CATACTAGAA AAAGGGAGAC GGTTTTTAAT
Figura 24d

4401 TGGGGACATC ATGAAGCCCC TTGAGCATCT GACTTCTGGC TAATAAAGGA AATTTATTTT CATTGCAATA GTGTGTTGGA ATTTTTTGTG TCTCTCACTC
ACCCCTGTAG TACTTCGGGG AACTCGTAGA CTGAAGACCG ATTATTTCCT TTAAATAAAA GTAACGTTAT CACACAACCT TAAAAAACAC AGAGAGTGAG
EcoRI
4501 GGAAGGAATT CTGCATTAAT GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG
CCTTCCTTAA GACGTAATTA CTTAGCCGGT TGCGCGCCCC TCTCCGCCAA ACGCATAACC CGCGAGAAGG CGAAGGAGCG AGTGACTGAG CGACGCGAGC
4601 GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG
CAGCAAGCCG ACGCCGCTCG CCATAGTCGA GTGAGTTTCC GCCATTATGC CAATAGGTGT CTTAGTCCCC TATTGCGTCC TTTCTTGTAC ACTCGTTTTC
4701 GCCAGCAAAA GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA
CGGTCGTTTT CCGGTCCTTG GCATTTTTCC GGCGCAACGA CCGCAAAAAG GTATCCGAGG CGGGGGGACT GCTCGTAGTG TTTTTAGCTG CGAGTTCAGT
4801 GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC
CTCCACCGCT TTGGGCTGTC CTGATATTTC TATGGTCCGC AAAGGGGGAC CTTCGAGGGA GCACGCGAGA GGACAAGGCT GGGACGGCGA ATGGCCTATG
4901 CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG
GACAGGCGGA AAGAGGGAAG CCCTTCGCAC CGCGAAAGAG TATCGAGTGC GACATCCATA GAGTCAAGCC ACATCCAGCA AGCGAGGTTCGACCCGACAC
5001 TGCACGAACC CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC
ACGTGCTTGG GGGGCAAGTC GGGCTGGCGA CGCGGAATAG GCCATTGATA GCAGAACTCA GGTTGGGCCA TTCTGTGCTG AATAGCGGTG ACCGTCGTCG
5101 CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGAAC AGTATTTGGT
GTGAcCATTG . TCCTAATCGT CTCGCTCCAT ACATCCGCCA CGATGTCTCA AGAACTTCAC CACCGGATTG ATGCCGATGT GATCTTCTTG TCATAAACCA
5201 ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA
TAGACGCGAG ACGACTTCGG TCAATGGAAG CCTTTTTCTC AACCATCGAG AACTAGGCCG TTTGTTTGGT GGCGACCATC GCCACCAAAA AAACAAACGT
5301 AGCAGCAGAT TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT (J.)
TCGTCGTCTA ATGCGCGTCT TTTTTTCCTA GAGTTCTTCT AGGAAACTAG AAAAGATGCC CCAGACTGCG AGTCACCTTG CTTTTGAGTG CAATTCCCTA
5401 TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT
AAACCAGTAC TCTAATAGTT TTTCCTAGAA GTGGATCTAG GAAAATTTAA TTTTTACTTC AAAATTTAGT TAGATTTCAT ATATACTCAT TTGAACCAGA
5501 GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTC
CTGTCAATGG TTACGAATTA GTCACTCCGT GGATAGAGTC GCTAGACAGA TAAAGCAAGT AGGTATCAAC GGACTGAG
Figura 24e

sítio poliAl
rGlob pA
origem desconhecida
HBVenh
LTA
lisozima SP
5'-UTR de HBV pré-S
intron A da insulina de rato
fusão Bam/Bgl
exon 1/2 de CMV
44/51
Tn903, remanescentes de pUC4K
KanR (Tn903)
Figura 25
remanescentes de pUC4K
pLIC19 MCS
CMV Pro
exon 1/2 de CMV
fusão Bam/Bgl
intron A da insulina de rato
5'-UTR de HBV pré-S
lisozima SP
LTB
origem desconhecida
RBGpA
sítio poliA
CMV Pra

pUC1 9
SapI (5247)
EcaRI (5183
sítio poliAl
rGtob pA
origem desconhecida.
SphI (4904
HBVenh .
Ácc1 (473
Nsil (473
EcoRV (471
Ápal (45
Bsp 1201 (450
EcoRI (447
Eam 11051 (44
ifindll (42
il .
\,. ,----
vat , ,. ,----
\,,,,, , k, , ,
LT
NdeI (4096 "
1\ ,
\
Aca(408. ' .,, i
Se.a) (386D L.
nal (380D) 1
Figura 26
Nhel (3767) 10,
lisozima SP
5'-UTR de HBV pré-S
Bam133 (3580
SapI (3531
intron A da insulina de rato
, fusão Bam/Bgl
Eam11051 (343'4
exon 1/2 de CMV
Bsm131 (3317)
45/51
PJV7788
6254 pb
Tn903, remanescentes de pUC4K
Hin6111 (307)
Nsil (317)
Bsm B1 (409)
KanR (Tn903)
)5na1 (553)
ma (583)
XhoI (827)
Tn903, Remanescentes de pUC4K
UC1 9 MCS
Sph I (989)
PstI (995)
Sal' (997)
/Icei (998)
Spel (1105)
el (1340)
CMV Pro
Ncor (1466)
BunB1 (1695)
exon 1/2 de CMV
Eam11051 (1812)
fusão Bam/Bgl
intron A da insulina de rato
SapI (1909)
Bam13:1 (1958)
5'-UTR de HBV pré-S2
Lisozima SP
miei (2145)
LTB
Xotai (2306)
(cl (2434)
origem desconhecida
RBGpA
sítio poliA
.rt 1 (2617)
atI (2619)
ÁccI (2620)
SpeI (2727)
der (2962)
CMV Pro
NcoI (3088)

AmpR
neomicina
46/51
Figura 27
promotor CMV
ntron
gene ICP27
polIA de SV40

47/51
MATDIDMLID LGLDLSDSEL EEDALERDEE GRRDDPESDS SGECSSSDED
MEDPCGDGGA EAIDAAIPKG PPARPEDAGT PEASTPRPAA RRGADDPPPA
TTGVWSRLGT RRSASPREPH GGKVARIQPP STKAPHPRGG RRGRRRGRGR
YGPGGADSTP NPRRRVSRNA HNQGGRHPAS ARTDGPGATH GEARRGGEQL
DVSGGPRPRG TRQAPPPLMA LSLTPPHADG RAPVPERKAP SADTIDPAVR
AVLRSISERA AVERISESFG RSALVMQDPF GGMPFPAANS PWAPVLATQA
GGFDAETRRV SWETLVAHGP SLYRTFAANP RAASTAKAMR DCVLRQENLI
EALASADETL AWCKMCIHHN LPLRPQDPII GTAAAVLENL ATRLRPFLQC
YLKARGLCGL DDLCSRRRLS DIKDIASFVL VILARLANRV ERGVSEIDYT
TVGVGAGETM HFYIPGACMA GLIEILDTHR QECSSRVCEL TASHTIAPLY
VHGKYFYCNS LF
A
CO Z CO
02 CO C.)
CN
6
Figura 28
Cl C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
i::
CN
U) Z CD
02 CD O
,.....ki.
R1 R2 R3 R4 'F15 R6
#45 RVSWETLVAHGPSLYRTF (SEQ ID NO:66)
#46 VAHGPSLYRTFAANPRAA (SEQ ID NO:67)
Figura 29

48/51
Pool P1 P2 reunião reunião
+CD8 -CD8
Figura 30

C
>
—
>
8
Ingênuo
ICP27+1-7 (9:1)
ICP27+CT (9:1)
1CP27
2 4 6 8 10 12
Dias após a inoculação
49/51
❑ ❑ ❑
14 16
Figura 31
20000
-"r 16000 -
E
to
D.
—9) 10000
u-
5000
2000
1500
E
-6)
1000
z soo
o
44
'10

50/51
O 2 4 6 8 10 12 14 16
Dias após a inoculação ingênuo
Figura 32
—1CP27 +LT
""-- ICP27 + LT+ aTNF
— ICP27 + LT + alFN
,...- ICP27 + LT + alFN + aTNF

a 80
C
a)
>
.> 60 -a)
Is
o
o
a)
,se
40 -
51/51
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Dias após a inoculação
Figura 33

1
RESUMO
"CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, PARTÍCULAS
CARREADORAS, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM
DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
5 DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA,
POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO,
SEQÜÊNCIA PROMOTORA QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA,
PARTÍCULAS REVESTIDAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,
COMPOSIÇÃO DE VACINA, USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO
10 NUCLEICO, DE UMA POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO
NUCLEICO OU DE PARTÍCULAS REVESTIDAS, E, MÉTODO IN VITRO
DE OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM
POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE"
Uma construção de ácido nucleico que compreende uma
15 seqüência promotora quimérica e um sítio de clonagem para a inserção de
uma seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico,
em que a seqüência promotora quimérica compreende: (a) uma seqüência
promotora inicial imediata de hCMV; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do
exon 2 do gene inicial imediato maior de hCMV; e (c) um intron heterólogo
20 fornecido no lugar da região de intron A do gene inicial imediato maior de
hCMV.

fe,,ijo OafffV,1-
1 PI cio 7r -- .19
"CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, POPULAÇÃO DE
CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO, SEQÜÊNCIA PROMOTORA
QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS,
RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM DISPOSITIVO DE
5 LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE
LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, MÉTODO IN VITRO
DE OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM
POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE"
10 Campo da Invenção
A invenção diz respeito aos campos da biologia molecular e
imunologia e no geral aos reagentes úteis nas técnicas de imunização de ácido
nucleico. Mais especificamente, a invenção diz respeito a construções de
ácido nucleico para a expressão de polipeptídeos e em particular polipeptídeos
15 antigênicos, particularmente antígenos da influenza bem como a expressão de
polipeptídeos adjuvantes e às estratégias de imunização com ácido nucleico
usando tais reagentes.
Fundamentos da invenção
A terapia de gene e imunização com ácido nucleico são
20 métodos promissores para o tratamento e prevenção de doenças tanto
adquiridas quanto herdadas. Estas técnicas fornecem a transferência de um
ácido nucleico desejado em um indivíduo com a expressão in vivo
subseqüente. A transferência pode ser realizada pela transfecção das células
ou tecidos do indivíduo ex vivo e reintroduzir o material transformado no
25 hospedeiro. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo
diretamente ao receptor.

1
REIVINDICAÇÕES
1. Construção de ácido nucleico adequada para a liberação a
um indivíduo para induzir uma resposta imune contra antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, caracterizada pelo fato de que
5 compreende:
imediato maior de hCMV; e
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
10 (c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron
A do gene inicial imediato maior de hCMV;
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
15 ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento;
(iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
20 promotor quimérico; e
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
25 2. Construção de ácido nucleico adequada para a liberação a
um indivíduo para induzir uma resposta imune contra antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, caracterizada pelo fato de que
compreende:
(i) uma seqüência promotora quimérica que compreende:

imediato maior de hCMV; e
2
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron
5 A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
promotor quimérico,
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de
hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste
10 ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo
menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento.
3. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
2, caracterizada pelo fato de que compreende ainda:
(iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
15 seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o
promotor quimérico; e/ou
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
20 gene inicial imediato de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
4. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que
compreende uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora em
ligação operável com o promotor, onde a seqüência codificadora codifica:
25 - um antígeno do vírus da influenza, um fragmento
imunogênico deste ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou
fragmento tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido ao dito
antígeno ou fragmento; e/ou
- uma subunidade de toxina bacteriana que ribosila ADP, um

3
fragmento desta com atividade adjuvante ou uma variante de cada um com
atividade adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido
com dita subunidade ou fragmento,
onde:
5 (A) o promotor é um promotor quimérico, a seqüência
promotora quimérica compreendendo:
imediato maior de hCMV, e
(i) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(ii) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
10 (iii) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de
íntron A do gene inicial imediato maior de hCMV; e/ou
(B) a construção compreende:
(i) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
15 seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(ii) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR
20 3' de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata
de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência
realçadora 3'.
5. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
4, caracterizada pelo fato de que o antígeno influenza codificado é:
25 (a) hemaglutinina da influenza (HA), um fragmento
imunogênico deste ou uma variante imunogênica com pelo menos 80% de
homologia de seqüência de aminoácido a cada um; e/ou
(b) neuraminidase da influenza (NA), M2, um fragmento
imunogênico de cada um ou uma variante imunogênica tendo pelo menos

4
80% homologia de seqüência de aminoácido a qualquer um dos ditos NA, M2
ou fragmento.
6. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a seqüência
5 codificadora codifica um antígeno influenza, fragmento deste ou variante de
uma cepa da influenza pandêmica.
7. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação
6, caracterizada pelo fato de que codifica um antígeno da influenza
pandêmico, fragmento imunogênico deste ou variante imunogênica do dito
10 antígeno ou fragmento e um ou mais antígenos da influenza não pandêmicos,
fragmento(s) imunogênico(s) deste ou variante(s) imunogênica(s) do(s)
dito(s) antígeno(s) ou fragmento(s).
8. Construção de ácido nucléico de acordo com qualquer uma
das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que:
15 (i) a seqüência codificadora codifica mais do que um antígeno
da influenza, fragmento ou variante imunogênica;
(ii) a seqüência codificadora codifica mais do que um antígeno
da influenza e pelo menos dois dos antígenos, fragmentos ou variantes
diferentes codificados são do mesmo polipeptídeo da influenza de cepas
20 diferentes de vírus da influenza;
(iii) a seqüência codificadora codifica um HA da influenza,
fragmento ou variante de cada um de três a cinco cepas da influenza
diferentes; e/ou
(iv) a seqüência codificadora codifica um HA da influenza,
25 fragmento ou variante de cada um de três ou quatro cepas da influenza não
pandêmicas.
compreender:
9. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de
(i) a seqüência promotora quimérica compreendendo:

imediato maior de hCMV; e
5
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron
5 A do gene inicial imediato maior de hCMV;
(ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o
promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica uma subunidade
de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
adjuvante ou uma variante de cada uma destas tendo pelo menos 80% de
10 homologia de aminoácido com a dita subunidade ou fragmento e tendo
atividade adjuvante;
(iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da
seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2gD de H SV e que está em ligação operável com
15 um promotor quimérico; e
(iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região
não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de
gene inicial imediato de CMV símio, que está em ligação operável com o
promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora.
20 10. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 4 ou 9, caracterizada pelo fato de que a subunidade de toxina
bacteriana que ribosile ADP é selecionada da subunidade A da toxina do
cólera, subunidade B da toxina do cólera, subunidade A da toxina instável ao
calor da E. coli e subunidade B instável ao calor da E. coli.
25 11. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 4, 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que compreende duas
seqüências codificadoras cada uma compreendendo uma dita subunidade,
fragmento ou variante diferentes e cada qual se liga a dito promotor
quimérico.

6
12. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as duas seqüências
codificadoras codificam subunidade A da toxina do cólera e subunidade B da
toxina do cólera ou subunidade A da toxina instável ao calor da E. coli e
5 subunidade B instável ao calor da E. coli, respectivamente.
13. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações 4 e 9 a 12, caracterizada pelo fato de que
inversa; ou
(i) as ditas duas seqüências codificadoras estão na orientação
10 (ii) as ditas duas seqüências codificadoras estão na mesma
orientação.
14. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende
um promotor quimérico como definido na reivindicação 1, onde:
15 (A) a seqüência do promotor inicial imediato do hCMV (a)
compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, nucleotídeos
de 903 a 1587 da SEQ ID NO: 54, nucleotídeos de 1815 a 1935 da SEQ ID
NO: 61, nucleotídeos de 1948 a 2632 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de
20 1002 a 1686 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de 2624 a 3308 da SEQ ID
No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
ou
25 (iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii);
(B) a seqüência de exon (b) compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No.2, a seqüência de
nucleotídeo dos nucleotídeos de 1588 a 1718 da SEQ ID No. 54, nucleotídeos
de 1684 a 1814 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de 2633 a 2763 da SEQ ID

5 ou
7
NO: 61, nucleotídeos de 1687 a 1817 da SEQ ID No: 62 e/ou nucleotídeos de
3309 a 3439 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii);
(C) o íntron heterólogo é uma seqüência de íntron A do gene
da insulina de rato e compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 3, a seqüência
10 de nucleotídeo dos nucleotídeos de 1725 a 1857 da SEQ ID No. 54,
nucleotídeos de 1545 a 1677 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 2770 a
2902 da SEQ ID No: 61, os nucleotídeos de 1824 a 1956 da SEQ ID No: 62
e/ou os nucleotídeos de 3446 a 3578 da SEQ ID No: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
15 homologia de seqüência de nucleotídeo a uma ou mais das seqüências de (i);
OU
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii);
(D) a seqüência promotora quimérica compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No. 4 ou a seqüência
20 de nucleotídeo dos nucleotídeos de 903 a 1857 da SEQ ID No. 54;
(ii) uma variante funcional de (i) que tem pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii); e/ou
(E) o íntron heterólogo (c) compreende uma seqüência
25 selecionada da seqüência de íntron A do gene da insulina de rato, seqüência
de íntron A do gene da queratina de galinha, seqüência de íntron A do gene da
actina cardíaca de galinha, um fragmento funcional de qualquer um destes ou
uma variante funcional de qualquer um dos precedentes.
15. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma

das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que
(A) a construção compreende uma seqüência realçadora como
definida na reivindicação 1, a seqüência realçadora compreendendo:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
5 9, nucleotídeos de 3699 a 4231 da SEQ ID NO: 54, nucleotídeos de 3831 a
4363 da SEQ ID NO: 61 e/ou de 4507 a 5038 da SEQ ID NO: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma dita seqüência (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii);
10 (B) a construção compreende uma seqüência líder não
traduzida como definida na reivindicação 1, em que a seqüência líder não
traduzida compreende:
(i) a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
6, SEQ ID NO: 7 ou nucleotídeos de 1864 a 1984 da SEQ ID NO: 54;
15 (ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii);
(C) a construção é um plasmídeo;
(D) a construção compreende um sinal de poliadenilação; e/ou
20 (E) a construção compreende ainda uma seqüência de
nucleotídeo que codifique um peptídeo de sinal que é operavelmente ligado à
seqüência que codifica o antígeno, subunidade de exotoxina, fragmento ou
variante.
16. Construção de ácido nucléico de acordo com a
25 reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que:
(A) o peptídeo de sinal é selecionado do peptídeo de sinal de
ativador de plasminogênio de tecido humano (hTPAsp), peptídeo de sinal da
aprotinina, peptídeo de sinal da extensina do tabaco e peptídeo de sinal da
lisosima de galinha;

(B) a seqüência de poliadenilação é uma seqüência de
poliadenilação de um gene selecionado do gene da beta-globina de coelho,
genes inicial e tardio do vírus do papiloma humano (HPV), o gene HSV-2gB,
um gene inicial imediato de CMV símio e o gene tardio HSVgD; e/ou
5 (C) a seqüência de poliadenilação é selecionada da:
(i) seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 4243 a 4373 da SEQ
ID No: 54, nucleotídeos de 906 a 1038 da SEQ ID No: 61, nucleotídeos de
4375 a 4050 da SEQ ID NO: 61, ou nucleotídeos de 2463 a 2593 da SEQ ID
10 NO: 62;
(ii) uma variante funcional de (i) que tenha pelo menos 80% de
homologia de seqüência de nucleotídeo a uma dita seqüência (i); ou
(iii) um fragmento funcional de (i) ou (ii).
17. Construção de ácido nucléico de acordo com qualquer uma
15 das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende:
No: 14, ou
seqüência à seqüência de (i);
(i) a seqüência do vetor pPJV7563 fornecida como SEQ ID
(ii) uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de
20 e a seqüência que codifica o dito antígeno, fragmento ou
variante é fornecida nas ditas seqüências (i) ou (ii) de modo que a mesma
esteja operavelmente ligada ao promotor quimérico.
18. Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma
das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que compreende:
25 (a) a seqüência do vetor pPJV1671 fornecida como a SEQ ID
No: 54 ou uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a
esta;
(b) a seqüência do vetor pPML7789 fornecida como a SEQ ID
No: 59 ou uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a

esta;
10
(c) a seqüência do vetor pPJV2012 fornecida pela SEQ ID No:
61 ou uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a esta;
(d) a seqüência do vetor pPJV7788 fornecida pela SEQ ID
5 NO: 62 ou uma seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a
esta.
19. Construção de ácido nucleico de acordo com a
reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado da
seqüência do promotor inicial imediato do hCMV, seqüência promotora do
10 vírus da pseudo-raiva e seqüência promotora do vírus do sarcoma de Rous.
20. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
pelo fato de que compreende pelo menos duas construções diferentes como
definidas em qualquer uma das reivindicações precedentes.
21. População de construções de ácido nucléico de acordo com
15 a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende:
(i) pelo menos duas construções diferentes como definidas em
qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 e 14 a 19 que codifique antígenos da
influenza diferentes, fragmentos imunogênicos destes ou variantes
imunogênicas dos ditos antígenos ou fragmentos; e/ou
20 (ii) pelo menos uma construção como definida em qualquer
uma das reivindicações 4 e 9 a 19 codificando uma subunidade de toxina
bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta ou uma variante desta.
22. População de construções de ácido nucleico de acordo com
a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que
25 (a) pelo menos dois dos antígenos diferentes são do mesmo
polipeptídeo da influenza de cepas da influenza diferentes; e/ou
(b) pelo menos dois dos antígenos, fragmentos ou variantes
diferentes são de polipeptídeo de influenza diferentes de uma cepas de
influenza igual ou diferente.

11
23. População de construções de ácido nucleico de acordo com
qualquer uma das reivindicações de 20 a 22, caracterizada pelo fato de que
compreende pelo menos três construções diferentes cada uma codificando um
antígeno da influenza diferente, fragmento imunogênico ou variante
5 imunogênica.
pelo fato de que:
24. População de construções de ácido nucleico, caracterizada
(A) (i) pelo menos uma construção codifica uma subunidade de
toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
10 adjuvante ou uma variante de cada uma destas tendo atividade adjuvante e
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou
fragmento; e
(ii) pelo menos uma construção que codifica um antígeno do
vírus simples do herpes (HSV);
15 onde a seqüência que codifica a dita subunidade, fragmento ou
variante e/ou o antígeno do HSV estão operavelmente ligados a um promotor
quimérico que compreende:
20 imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron
A do gene inicial imediato maior de hCMV,
(B) (i) pelo menos uma construção codifica uma subunidade de
toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
25 adjuvante ou uma variante de cada uma desta tendo atividade adjuvante e
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou
fragmento; e
(ii) pelo menos uma construção codifica um antígeno de HSV,
onde pelo menos uma das ditas construções compreende ainda:

12
(a) uma seqüência líder não traduzida que seja derivada da
seqüência de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou
seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV, que esteja em ligação operável com
a seqüência codificadora da dita construção e um promotor que seja
5 heterólogo à seqüência codificadora; e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à
seqüência codificadora da dita construção, onde a seqüência realçadora é
derivada de uma UTR 3' de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência
de gene inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é
10 heteróloga à seqüência realçadora 3',
(C) (i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreenda
uma seqüência promotora quimérica e uma seqüência codificadora em ligação
operável com o promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica
uma subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta
15 com atividade adjuvante ou uma variante de cada uma desta tendo atividade
adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita
subunidade ou fragmento e a seqüência promotora quimérica compreende:
20 imediato maior de hCMV; e
(a) uma seqüência promotora inicial imediata de hCMV;
(b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial
(c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron
A do gene inicial imediato maior de hCMV; e
(ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
pelo menos um antígeno do HSV, e/ou
25 (D) (i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreende
uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora operavelmente
ligadas ao promotor, onde a seqüência codificadora codifica uma subunidade
de toxina bacteriana que ribosile ADP, um fragmento desta com atividade
adjuvante ou uma variante de cada uma destas tendo atividade adjuvante e

13
tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido à dita subunidade ou
fragmento e a construção compreende ainda:
(a) uma seqüência líder não traduzida que seja derivada da
seqüência de antígeno preS2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou
5 seqüência de antígeno tipo 2 gD do HSV, que está em ligação operável com a
seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora;
e/ou
(b) uma seqüência realçadora 3' de e operavelmente ligada à
seqüência codificadora, onde o realçador é derivado de uma UTR 3' de uma
10 seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV
símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência realçadora 3';
(ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
pelo menos um antígeno do HSV.
25. População de construções de ácido nucleico de acordo com
15 qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizada pelo fato de que
compreende:
(i) uma primeira construção de ácido nucleico que compreenda
a seqüência do vetor pPJV2012 fornecida pela SEQ ID NO: 61 ou uma
seqüência com pelo menos 60% de identidade de seqüência a esta; e
20 (ii) uma segunda construção de ácido nucleico que codifique
um antígeno de HSV.
26. Seqüência promotora quimérica isolada purificada,
caracterizada pelo fato de que a seqüência promotora quimérica está de
acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 25.
25 27. Partículas revestidas, caracterizada pelo fato de que
compreendem partículas carreadoras revestidas com uma construção de ácido
nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 ou uma
população de construções de ácido nucleico como definidas em qualquer uma
das reivindicações de 20 a 25.

caracterizada pelo fato de que
14
28. Partículas revestidas de acordo com a reivindicação 27,
(A) as partículas são revestidas com pelo menos duas
construções diferentes de ácido nucleico como definida na reivindicação 1,
5 em que cada dita construção codifica um dito HA, fragmento ou variante de
uma cepa da influenza diferente;
construções diferentes;
(B) as partículas são revestidas com três a cinco das ditas
(C) três ou quatro das ditas construções codificam um dito HA,
10 fragmento ou variante de cepas diferentes da influenza não pandêmicas;
(D) são revestidas com uma dita construção que codifica um
dito HA, fragmento ou variante de uma cepa da influenza pandêmica;
(E) as partículas também são revestidas com uma construção
de ácido nucleico que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência
15 codificadora em ligação operável com o promotor, onde a seqüência
codificadora codifica uma subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP,
um fragmento desta com atividade adjuvante ou uma variante de cada uma
destas tendo atividade adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de
aminoácido com a dita subunidade ou fragmento;
20 (F) as partículas também são revestidas com uma construção
de ácido nucleico que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência
codificadora em ligação operável com o promotor, onde a seqüência
codificadora codifica uma subunidade de toxina bacteriana que ribosile ADP,
um fragmento desta com atividade adjuvante ou uma variante de cada uma
25 destas tendo atividade adjuvante e tendo pelo menos 80% de homologia de
aminoácido com a dita subunidade ou fragmento, onde o promotor é um
promotor quimérico como definido na reivindicação 1, as subunidades são
como definidas em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, a construção
compreendendo uma seqüência líder não traduzida como definida na

eivindicação 1 e/ou um realçador como definido na reivindicações 1; e/ou
15
(G) as partículas carreadoras são partículas de ouro.
29. Receptáculo de dosagem para um dispositivo de liberação
mediada por partícula, caracterizado pelo fato de que compreende partículas
5 revestidas como definidas na reivindicação 27 ou 28.
30. Dispositivo de liberação mediada por partícula,
caracterizado pelo fato de que é carregado com partículas revestidas como
definidas na reivindicação 27 ou 28.
31. Dispositivo de liberação mediada por partícula de acordo
10 com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é uma seringa isenta de
agulha.
32. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que
compreende uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações de 1 a 19 ou uma população de construções de ácido
15 nucleico como definidas em qualquer uma das reivindicações de 20 a 25
juntas com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
33. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que
compreende uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer
uma das reivindicações de 1 a 19 ou uma população de construções de ácido
20 nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações de 20 a 25.
34. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 33,
caracterizada pelo fato de que é um vacina multivalente que compreende pelo
menos duas construções diferentes que codificam antígenos da influenza
diferentes, fragmentos imunogênicos destes ou variantes imunogênicas de
25 cada um destes.
35. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 34,
caracterizada pelo fato de que é uma vacina da influenza trivalente,
tetravalente ou pentavalente.
36. Construção de ácido nucleico como definida nas qualquer

16
uma das reivindicações de 1 a 19, de uma população de construções de ácido
nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações de 20 a 25 ou de
partículas revestidas como definidas nas reivindicações 27 ou 28,
caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção da influenza.
5 37. Construção de ácido nucléico, população ou partículas
revestidas de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a
construção de ácido nucléico, população ou partículas revestidas é/são
liberadas por injeção isenta de agulha.
38. Método in vitro de obter a expressão em células de
10 mamífero de um polipeptídeo da influenza de interesse, caracterizado pelo
fato de que compreende transferir para dentro das ditas células uma
construção de ácido nucleico como definida em qualquer uma das
reivindicações de 1 a 19, uma população de construções de ácido nucleico
como definida em qualquer uma das reivindicações de 20 a 25 ou partículas
15 revestidas como definidas nas reivindicações 27 ou 28.

1
RESUMO
/2/060 /' ,92 - (12
"CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, POPULAÇÃO DE
CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO, SEQÜÊNCIA PROMOTORA
QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS,
5 RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM DISPOSITIVO DE
LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE
LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, MÉTODO IN VITRO
DE OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM
10 POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE"
Uma construção de ácido nucleico que compreende uma
seqüência promotora quimérica e um sítio de clonagem para a inserção de
uma seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico,
em que a seqüência promotora quimérica compreende: (a) uma seqüência
15 promotora inicial imediata de hCMV; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do
exon 2 do gene inicial imediato maior de hCMV; e (c) um íntron heterólogo
fornecido no lugar da região de íntron A do gene inicial imediato maior de
hCMV.