Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...
Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...
Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Iniciação das culturas embriogenéticas<br />
Como já foi <strong>de</strong>scrito anteriormente, culturas embriogenéticas são geralmente iniciadas à partir <strong>de</strong><br />
explantes embrionários, juvenis ou maduros cultivados em meios semi-sólidos, contendo altos níveis<br />
das auxinas ANA, 2,4-D, e Picloran (20-100 µM) com ou sem uma das citocininas BAP, KIN,<br />
Thidiazuron (10-20 µM). Em mo<strong>de</strong>los diretos, a primeira expressão morfogenética é o surgimento <strong>de</strong><br />
estruturas globulares brancas e translúcidas que correspon<strong>de</strong>m a embriões somáticos globulares.<br />
Em mo<strong>de</strong>los indiretos, inicialmente há a diferenciação <strong>de</strong> calo e o surgimento neste <strong>de</strong> setores<br />
friáveis, normalmente brancos e translúcidos, convencionalmente <strong>de</strong>signados <strong>de</strong> massas ou<br />
complexos celulares pró-embriogenéticos, os quais divi<strong>de</strong>m-se para formar pró-embriões somáticos.<br />
Além das características morfológicas as massas calosas e pró-embrionárias po<strong>de</strong>m ser distinguidas<br />
por características citoquímicas. Células que reagem fortemente ao corante Carmin Acético e<br />
fracamente ao Azul <strong>de</strong> Evans são embriogenéticas e células com reação fraca ao primeiro e<br />
intermediária ao segundo são células calosas (Durzan, 1988).<br />
São necessários quatro ou cinco sub-cultivos em placas <strong>de</strong> petri contendo meios semi-sólidos<br />
para que ocorra a purificação e estabilizacão <strong>de</strong>stas culturas, <strong>de</strong> tal maneira que elas possam ser<br />
consi<strong>de</strong>radas linhagens celulares embriogenéticas.<br />
Manutenção, multiplicação e cultura massal<br />
A estratégia, neste caso, consiste em <strong>de</strong>terminar as condições a<strong>de</strong>quadas para o<br />
estabelecimento <strong>de</strong> ciclos repetitivos <strong>de</strong> divisão celular e o controle restrito dos processos <strong>de</strong><br />
diferenciação, <strong>de</strong> tal maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou<br />
embriões somáticos em estágios globulares iniciais <strong>de</strong> <strong>de</strong>senvolvimento. Suspensões celulares são<br />
mais a<strong>de</strong>quadas, po<strong>de</strong>ndo ser cultivadas em biorreatores ou frascos Erlenmeyers sob agitação. Um<br />
sistema simples, eficiente e <strong>de</strong> baixo custo e facilmente adaptável às condições dos laboratórios<br />
brasileiros, consiste no emprego do agitador rotatório, com as células sendo multiplicadas em balões<br />
voluméticos modificados <strong>de</strong> 1.000 ml. Esta modificação consiste na alteração das pare<strong>de</strong>s laterais do<br />
balão para a soldadura <strong>de</strong> pontas <strong>de</strong> tubos <strong>de</strong> ensaio e a formação <strong>de</strong> protuberâncias (nipple-flasks).<br />
Estes frascos são fixados por molas em uma placa <strong>de</strong> acrílico perfurada no tamanho do diâmetro do<br />
balão volumético. Cada placa contendo seis balões gira (1 rpm), em torno <strong>de</strong> um eixo horizontal<br />
levemente inclinado, que po<strong>de</strong> conter quatro <strong>de</strong>stas placas. Cada aparato completo po<strong>de</strong> conter<br />
quatro eixos, perfazendo um total <strong>de</strong> 96 balões volumétricos. Este equipamento nada mais é do que<br />
uma adaptação do sistema empregado por Steward em seus experimentos com células<br />
embriogênicas <strong>de</strong> cenoura.<br />
Para o estabelecimento <strong>de</strong> ciclos repetitivos <strong>de</strong> divisão celular e a cultura massal (scale-up)<br />
<strong>de</strong>stes complexos pró-embriogenéticos, inocula-se uma <strong>de</strong>terminada quantida<strong>de</strong> dos mesmos em<br />
frascos Erlenmeyers ou balões volumétricos <strong>de</strong> 1.000 ml, contendo 250 ml <strong>de</strong> meio <strong>de</strong> cultura. para<br />
iniciar as culturas a quantida<strong>de</strong> <strong>de</strong> 2 a 5 g ou <strong>de</strong> 5 a 10ml <strong>de</strong> volume sedimentado <strong>de</strong>stas linhagens<br />
são suficientes. A partir disto po<strong>de</strong>-se estabelecer a curva <strong>de</strong> crescimento, <strong>de</strong>terminando-se as<br />
fases lag, exponencial, linear e estacionária e, adicionalmente, po<strong>de</strong>-se <strong>de</strong>terminar o índice mitótico<br />
para cada fase <strong>de</strong>sta curva e o volume ou peso final na fase estacionária, avaliando-se também<br />
através <strong>de</strong> monitoramento histoquimico a qualida<strong>de</strong> <strong>de</strong>stas culturas. Com isto é possível <strong>de</strong>terminar o<br />
intervalo médio <strong>de</strong> sub-cultivos, que serão feitos quando as culturas estiverem no ponto mediano da<br />
fase linear da curva <strong>de</strong> crescimento e a quantida<strong>de</strong> <strong>de</strong> biomassa celular que gerará o número<br />
<strong>de</strong>sejado <strong>de</strong> embriões somáticos ao final do ciclo.<br />
O principal ponto <strong>de</strong> contrôle da manutenção das linhagens em ciclos repetitivos diz respeito à<br />
uma redução consi<strong>de</strong>rável nos níveis dos reguladores <strong>de</strong> crescimento. Nos vários sistemas em<br />
funcionamento, observa-se que as concentraçoes médias <strong>de</strong>stes reguladores nesta fase estão na<br />
faixa <strong>de</strong> 2 a 5 µM para as auxinas e <strong>de</strong> e 2 a 5 µM para as citocininas (Gupta et al., 1993).<br />
Estas culturas <strong>de</strong>verão ser mantidas no escuro, em salas <strong>de</strong> cultura com temperatura média <strong>de</strong><br />
25oC. Devido a maior possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> contaminação da cultura em meio líquido, recomenda-se a<br />
manutenção <strong>de</strong> um estoque <strong>de</strong> culturas em meio semi-sólido, em placas <strong>de</strong> petri, e em estufa