12.05.2013 Views

Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...

Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...

Embriogênese Somática e Sementes Sintéticas - Laboratório de ...

SHOW MORE
SHOW LESS

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

Iniciação das culturas embriogenéticas<br />

Como já foi <strong>de</strong>scrito anteriormente, culturas embriogenéticas são geralmente iniciadas à partir <strong>de</strong><br />

explantes embrionários, juvenis ou maduros cultivados em meios semi-sólidos, contendo altos níveis<br />

das auxinas ANA, 2,4-D, e Picloran (20-100 µM) com ou sem uma das citocininas BAP, KIN,<br />

Thidiazuron (10-20 µM). Em mo<strong>de</strong>los diretos, a primeira expressão morfogenética é o surgimento <strong>de</strong><br />

estruturas globulares brancas e translúcidas que correspon<strong>de</strong>m a embriões somáticos globulares.<br />

Em mo<strong>de</strong>los indiretos, inicialmente há a diferenciação <strong>de</strong> calo e o surgimento neste <strong>de</strong> setores<br />

friáveis, normalmente brancos e translúcidos, convencionalmente <strong>de</strong>signados <strong>de</strong> massas ou<br />

complexos celulares pró-embriogenéticos, os quais divi<strong>de</strong>m-se para formar pró-embriões somáticos.<br />

Além das características morfológicas as massas calosas e pró-embrionárias po<strong>de</strong>m ser distinguidas<br />

por características citoquímicas. Células que reagem fortemente ao corante Carmin Acético e<br />

fracamente ao Azul <strong>de</strong> Evans são embriogenéticas e células com reação fraca ao primeiro e<br />

intermediária ao segundo são células calosas (Durzan, 1988).<br />

São necessários quatro ou cinco sub-cultivos em placas <strong>de</strong> petri contendo meios semi-sólidos<br />

para que ocorra a purificação e estabilizacão <strong>de</strong>stas culturas, <strong>de</strong> tal maneira que elas possam ser<br />

consi<strong>de</strong>radas linhagens celulares embriogenéticas.<br />

Manutenção, multiplicação e cultura massal<br />

A estratégia, neste caso, consiste em <strong>de</strong>terminar as condições a<strong>de</strong>quadas para o<br />

estabelecimento <strong>de</strong> ciclos repetitivos <strong>de</strong> divisão celular e o controle restrito dos processos <strong>de</strong><br />

diferenciação, <strong>de</strong> tal maneira que as culturas sejam constituídas por células pró-embrionárias ou<br />

embriões somáticos em estágios globulares iniciais <strong>de</strong> <strong>de</strong>senvolvimento. Suspensões celulares são<br />

mais a<strong>de</strong>quadas, po<strong>de</strong>ndo ser cultivadas em biorreatores ou frascos Erlenmeyers sob agitação. Um<br />

sistema simples, eficiente e <strong>de</strong> baixo custo e facilmente adaptável às condições dos laboratórios<br />

brasileiros, consiste no emprego do agitador rotatório, com as células sendo multiplicadas em balões<br />

voluméticos modificados <strong>de</strong> 1.000 ml. Esta modificação consiste na alteração das pare<strong>de</strong>s laterais do<br />

balão para a soldadura <strong>de</strong> pontas <strong>de</strong> tubos <strong>de</strong> ensaio e a formação <strong>de</strong> protuberâncias (nipple-flasks).<br />

Estes frascos são fixados por molas em uma placa <strong>de</strong> acrílico perfurada no tamanho do diâmetro do<br />

balão volumético. Cada placa contendo seis balões gira (1 rpm), em torno <strong>de</strong> um eixo horizontal<br />

levemente inclinado, que po<strong>de</strong> conter quatro <strong>de</strong>stas placas. Cada aparato completo po<strong>de</strong> conter<br />

quatro eixos, perfazendo um total <strong>de</strong> 96 balões volumétricos. Este equipamento nada mais é do que<br />

uma adaptação do sistema empregado por Steward em seus experimentos com células<br />

embriogênicas <strong>de</strong> cenoura.<br />

Para o estabelecimento <strong>de</strong> ciclos repetitivos <strong>de</strong> divisão celular e a cultura massal (scale-up)<br />

<strong>de</strong>stes complexos pró-embriogenéticos, inocula-se uma <strong>de</strong>terminada quantida<strong>de</strong> dos mesmos em<br />

frascos Erlenmeyers ou balões volumétricos <strong>de</strong> 1.000 ml, contendo 250 ml <strong>de</strong> meio <strong>de</strong> cultura. para<br />

iniciar as culturas a quantida<strong>de</strong> <strong>de</strong> 2 a 5 g ou <strong>de</strong> 5 a 10ml <strong>de</strong> volume sedimentado <strong>de</strong>stas linhagens<br />

são suficientes. A partir disto po<strong>de</strong>-se estabelecer a curva <strong>de</strong> crescimento, <strong>de</strong>terminando-se as<br />

fases lag, exponencial, linear e estacionária e, adicionalmente, po<strong>de</strong>-se <strong>de</strong>terminar o índice mitótico<br />

para cada fase <strong>de</strong>sta curva e o volume ou peso final na fase estacionária, avaliando-se também<br />

através <strong>de</strong> monitoramento histoquimico a qualida<strong>de</strong> <strong>de</strong>stas culturas. Com isto é possível <strong>de</strong>terminar o<br />

intervalo médio <strong>de</strong> sub-cultivos, que serão feitos quando as culturas estiverem no ponto mediano da<br />

fase linear da curva <strong>de</strong> crescimento e a quantida<strong>de</strong> <strong>de</strong> biomassa celular que gerará o número<br />

<strong>de</strong>sejado <strong>de</strong> embriões somáticos ao final do ciclo.<br />

O principal ponto <strong>de</strong> contrôle da manutenção das linhagens em ciclos repetitivos diz respeito à<br />

uma redução consi<strong>de</strong>rável nos níveis dos reguladores <strong>de</strong> crescimento. Nos vários sistemas em<br />

funcionamento, observa-se que as concentraçoes médias <strong>de</strong>stes reguladores nesta fase estão na<br />

faixa <strong>de</strong> 2 a 5 µM para as auxinas e <strong>de</strong> e 2 a 5 µM para as citocininas (Gupta et al., 1993).<br />

Estas culturas <strong>de</strong>verão ser mantidas no escuro, em salas <strong>de</strong> cultura com temperatura média <strong>de</strong><br />

25oC. Devido a maior possibilida<strong>de</strong> <strong>de</strong> contaminação da cultura em meio líquido, recomenda-se a<br />

manutenção <strong>de</strong> um estoque <strong>de</strong> culturas em meio semi-sólido, em placas <strong>de</strong> petri, e em estufa

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!