Atividade enzimática extracelular de leveduras isoladas da ...

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
MARCIELLE DOS SANTOS SILVA
ATIVIDADE ENZIMÁTICA EXTRACELULAR DE
LEVEDURAS ISOLADAS DA FERMENTAÇÃO DO
CACAU
Feira de Santana, BA
2011

MARCIELLE DOS SANTOS SILVA
ATIVIDADE ENZIMÁTICA EXTRACELULAR DE
LEVEDURAS ISOLADAS DA FERMENTAÇÃO DO
CACAU
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana como
requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientadora: Dra. Rachel Passos Rezende (UESC)
Co-orientadora: Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro (UESC)
Feira de Santana, BA
2011
2

trabalho.
AGRADECIMENTOS
Deus por me guiar, e me conceder sabedoria, e a oportunidade de realizar este
Aos meus pais Osvaldo e Maria; e minha irmã Monielle, por me apoiarem,
incentivarem e auxiliarem em tudo e por todo amor, confiança e carinho incondicional.
À Prof. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro e a Profa. Dra. Rachel Passos Rezende
pela orientação concedida, pelas condições de trabalho que me proporcionaram, pela contínua
disponibilidade, pela paciência e, sobretudo, pelos valiosos ensinamentos.
À Prof. Dra. Maria Gabriela Bello Koblitz pelo auxílio e conhecimentos concedidos.
À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, tendo a frente o
Prof. Dr. Aristóteles Góes-Neto pelo apoio e auxilio em todos os momentos.
Às alunas de iniciação científica Emília Lisboa, Eleni Anjos, e Andrea Porto do
Laboratório de Tecnologia do Departamento de Tecnologia da UEFS pela colaboração na
realização dos experimentos, por me auxiliarem em todos os momentos que precisei e pelo
companheirismo durante toda a caminhada.
A minha amiga Rita pela amizade, pelo apoio, pelo convívio constante, pelos
conselhos e incentivo, e por dividir comigo todas as dificuldades e alegrias vividas.
As colegas de Pós-Graduação Cíntia Reis e Aline Costa; a aluna de iniciação científica
Larissa Costa; e a funcionária Bárbara Letícia do Laboratório de Análise Físico - Química
(LAFIQUI) do Departamento de Tecnologia da UEFS pelo auxílio nos ensaios enzimáticos.
Aos colegas de Trabalho do Laboratório de Tecnologia e do Laboratório de Pesquisa
em Microbiologia (LAPEM) do Departamento de Ciências Biológicas da UEFS em especial a
funcionária Gorette Carmo pelo companheirismo e disposição em ajudar sempre que
necessário.
A funcionária Berlene Marques pela amizade e auxílio em vários momentos e a
Fátima Albinati pela convivência e apoio.
À Helton, pelo apoio na secretaria da Pós-Graduação.
Aos professores e colegas do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, pela
contribuição ao desenvolvimento pessoal, acadêmico, profissional, principalmente aos colegas
Janaína e Vitor.
3

À Adriana Cristina Reis Ferreira da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC),
pela gentil cessão dos microrganismos utilizados.
resultados.
A Prof. Dr. Marília Cardoso e Cíntia Reis pela colaboração na análise estatística dos
À minha família pela torcida.
À Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), em especial ao Departamento
de Ciências Biológicas, pela oportunidade concedida para realização do Mestrado em
Biotecnologia com Ênfase em Recursos Naturais da Região Nordeste.
À Capes pela concessão da bolsa de mestrado.
E a todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho, meus
sinceros agradecimentos, sendo que o último citado aqui tem a mesma importância do
primeiro.
4

“Mesmo que eu tivesse o dom da profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a
ciência; mesmo que eu tivesse toda a fé, a ponto de transportar montanhas, se eu não
tiver amor, não sou nada!”.
5
I Coríntios 13:2

RESUMO
As enzimas possuem características peculiares, tais como especificidade, diversidade e
capacidade de produção em larga escala. Além disso, apresentam potencial biotecnológico
amplo, sendo um deles a obtenção de produtos através de processos fermentativos. O presente
trabalho teve como objetivo a investigação da produção de proteases, lipases, amilases,
celulases, pectinases e fosfolipases por leveduras isoladas da fermentação do cacau. A
metodologia utilizada inicialmente foi de cup plate, seguida de testes titulométricos para
lipases e espectrofotométricos para pectinases e proteases. A partir de 70 leveduras 56 (80%)
foram positivas para pelo menos uma das enzimas estudadas nos testes realizados em placa.
Treze isolados (18%) foram positivos para as amilases; 35 (50%) para as celulases; 11 (15%)
para as fosfolipases; 12 (17%) para as pectinases e 12 (17%) para proteases. Nos testes em
placa para as lipases, o substrato óleo de dendê foi o que apresentou o maior número de
isolados capazes de utilizá-lo, sendo 24 (34%) leveduras positivas para a atividade lipolítica;
10 (14%) para o óleo de mamona e 8 (11%) para manteiga de cacau. Para os testes
titulométricos todas as leveduras foram positivas nos três substratos (óleo de dendê, óleo de
mamona e manteiga de cacau), sendo os melhores resultados obtidos para as leveduras
testadas com o óleo de dendê. Nos testes quantitativos espectrofotométricos, 62 (88%)
leveduras foram positivas para proteases e 68 (97%) para pectinases. Este estudo demonstrou
que os microrganismos testados representam uma fonte potencial de enzimas extracelulares de
interesse industrial e biotecnológico.
Palavras-chave: Fungos leveduriformes. Amilases. Proteases. Pectinases. Celulases. Lipases.
Fosfolipases.
6

ABSTRACT
The enzymes have peculiar characteristics, such as specificity, diversity and capacity of large
scale production. Moreover, its potential biotechnology is great, being one of them the
obtaining of products through of the fermentative process. The present work had as objective
the investigating the production of proteases, lipases, amylases, cellulases, pectinases and
fosfolipases secreted by yeasts isolated from cocoa’s fermentation. The methodology used
initially was of the cup plate, followed of the titrimetric tests for lipases and
spectrophotometric tests for pectinases and proteases. From of 70 yeasts 56 (80%) were
positive to the secretion of at least one of the enzymes studied in tests made on board.
Thirteen strains (18%) were positive for amylase, 35 (50%) for cellulases, 11 (15%) for
fosfolipases; 12 (17%) to pectinase and (17%) for protease. Us tests on board for the lipases
the substrate palm oil was what presented largest number of strains able to use it, being 24
(34%) positive yeast for the lipase activity, 10 (14%) were positive for castor oil and 8 (11%)
for cocoa butter. For the titrimetric tests all the yeasts were positive in the three substrates
(palm oil, castor oil and cocoa butter) being the best results obtained for the yeasts tests with
palm oil. In the quantitative spectrophotometric tests, 62 (88%) of the yeasts were positive for
protease and 68 (97%) to pectinases. This study demonstrated that the microrganisms tested
represent a potential source of extracellular enzymes of industrial and biotechnological
interest.
Keywords: Yeasts fungi. Amylases. Proteases. Pectinases. Cellulases. Lipases. Fosfolipases.
7

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Figura 1 a. Equação geral para uma reação de
transesterificação. b Equação geral da transesterificação de
um triacilglicerídeo.
Figura 2. 2. a. Halos de atividade amilolítica da levedura P.
membranifaciens C-2.32/2 obtido a partir do cultivo em
meio de indução durante incubação por 48h, a 28ºC e 150
rpm, e inoculado em meio sólido a 37ºC com 24h, pH 7. b e
c representam os halos negativos das leveduras P. kluyveri
C-2.47 e P. membranifaciens C-.62, respectivamente. Todos
os testes foram realizados em triplicata.
Figura 3. b. Halos de atividade pectinolítica da levedura 1 (ainda não
identificada), em pH 7, obtido a partir do crescimento a
28ºC, durante 48 horas, em meio de indução. a e c atividade
enzimática negativa das leveduras 15 e 1.5,
respectivamente. Todos os testes foram realizados em
triplicata.
Figura 4. Halos de atividade proteolítica das leveduras ainda não
identificadas a. 1.4 b. 3.1 e c. 16 obtidos a partir de cultivo
em meio de indução durante incubação por 48h, a 28ºC e
150 rpm, e inoculado em meio sólido a 37ºC por 24h, pH 5.
Todos os testes foram realizados em triplicata.
Figura 5. a Halos de atividade lipolítica da levedura C.parapsilosis C
-2.68 sobre o substrato óleo de dendê obtido do extrato
enzimático após crescimento em meio líquido por 48 h a
28ºC. Cada poço representa uma levedura testada em
triplicata na horizontal, em pH 5. b e c. Atividade
enzimática negativa das leveduras P. membranifaciens C-
2.126 e C. krusei C-2.9, respectivamente.
28
46
50
8
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56

Figura 6.
Análise da atividade enzimática extracelular do extrato
enzimático livre de células utilizando como substrato a
manteiga de cacau, o óleo de mamona e o óleo de dendê
cujos ácidos graxos liberados foram titulados com uma
solução de NaOH (0,05M), utilizando 3 gotas de
fenolftaleína como indicador de pH e ponto de viragem
detectado pelo surgimento de uma coloração rósea no meio.
9
58

LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Porcentagem de leveduras positivas quanto à atividade
enzimática verificados pela observação de halo produzido pela
atividade do extrato obtido do cultivo a 28ºC por 48h e
caracterizado a 37ºC com 24h.
Gráfico 2. Porcentagem de leveduras positivas verificadas a partir de
testes quantitativos titulométricos nos substratos Óleo de
mamona, Óleo de dendê e Manteiga de cacau para atividade
lipolítica.
Gráfico 3. P Porcentagem de leveduras positivas verificadas a partir de
testes quantitativos espectrofotométrica sobre os substratos
Pectina cítrica e Gelatina para as atividades pectinolítica e
proteolítica, respectivamente.
10
45
59
65

LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Principais aplicações das enzimas em indústrias e os
microrganismos que as secretam.
Tabela 02. Microrganismos produtores de celulases. 31
Tabela 03. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de
amilases secretadas extracelularmente pelas leveduras
testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio
de cultura suplementado com indutor para cada enzima e
testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Tabela 04. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de
celulases secretadas extracelularmente pelas leveduras
testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio
de cultura suplementado com indutor para cada enzima e
testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Tabela 05. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de
fosfolipases secretadas extracelularmente pelas leveduras
testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio
de cultura suplementado com indutor para cada enzima e
testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Tabela 06. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de
pectinases secretadas extracelularmente pelas leveduras
testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio
de cultura suplementado com indutor para cada enzima e
testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Tabela 07. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de
proteases secretadas extracelularmente pelas leveduras
testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio
de cultura suplementado com indutor para cada enzima e
11
21
46
47
48
49
51

testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Tabela 08. R Resultados de atividade lipolítica dos extratos enzimáticos
obtidos a partir do cultivo submerso por 48h a 28ºC nos
substratos manteiga de cacau, óleo de mamona e óleo de
dendê, revelados em meio sólido sob luz ultravioleta depois
de mantidos por 24h a 37ºC.
Tabela 09. Resultados da atividade lipolítica dos extratos enzimáticos
obtidos das leveduras isoladas da fermentação do cacau nos
substratos manteiga de cacau, óleo de mamona e óleo de
dendê, obtido pela titulação dos ácidos graxos solúveis em
solução de NaOH e de fenolftaleína como indicador.
Tabela 10. Resultados das atividades de Pectina metilesterase (U/mL) e
a Atividade Específica de Proteases (U/mL) dos extratos
enzimáticos obtidos a partir do cultivo das leveduras
isoladas da fermentação do cacau em meio de indução
suplementado com pectina cítrica e gelatina,
respectivamente.
12
54
60
63

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
AE Atividade específica
ANOVA Análise de variância
CCMB Coleção de Cultura de Microrganismos da Bahia
ºC Graus Celsius
cm Centímetro
GYMP Meio composto de glicose, extrato de levedura, extrato de malte e peptona
g Gramas
g/L Relação de gramas por litro
h Hora
IE Índice Enzimático
mg Miligrama
M Molaridade
LAFIQUI Laboratório de Análise Físico-química de Alimentos
LAPEM
min Minuto
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia
mg/mL Relação entre miligrama e mililitro
mL Mililitro
MM Massa molar
mM Massa milimolar
N Normalidade
O2
Oxigênio
p/v Relação em porcentagem entre o peso do soluto e o volume da solução
pH Potencial hidrogeniônico
PME Pectina metilesterase
PPBGBiotec
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia
rpm Rotações por minuto
TCA Ácido Tricloroacético
UA Unidade de atividade
U/mL Concentração da atividade enzimática, em mililitro
13

UV Luz Ultravioleta
UV/VIS Ultravioleta/Visível
UEFS
Universidade Estadual de Feira de Santana
v/v
Relação em porcentagem entre o volume do soluto e o volume da solução
µL Microlitro
µm Micrograma
% Porcentagem
14

1INTRODUÇÃO
SUMÁRIO
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19
2.1 LEVEDURAS E SUA APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA 19
2.2 ENZIMAS
2.3 PROTEASES
2.4 AMILASES
2.5 LIPASES 26
2.6 PECTINASES 28
2.7 CELULASES
2.8 FOSFOLIPASES 31
2.9 ENZIMAS NA FERMENTAÇÃO DO CACAU
2.10 ASPECTOS BIOTECNOLÓGICOS 33
3 OBJETIVOS 35
3.1 OBJETIVO GERAL
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 35
4 MATERIAL E MÉTODOS 36
4.1 PROCEDÊNCIA DAS LINHAGENS DE LEVEDURA
4.2 REATIVAÇÃO 36
4.3 MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS
4.4 PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO
4.5 CULTIVO EM MEIO DE INDUÇÃO
4.6 ENSAIO QUALITATIVO PARA DETECÇÃO DAS ENZIMAS
4.6.1 Atividade de celulase
4.6.2 Atividade de amilase
4.6.3 Atividade de pectinase
4.6.4 Atividade de lipase
15
17
20
22
25
29
32
35
36
36
37
37
38
38
39
39
39

4.6.5 Atividade de Protease e Fosfolipase
4.7 TITULAÇÃO 40
4.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE PECTINA METILESTERASE (PME)
EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
4.8.1 Preparação das amostras para os ensaios enzimáticos
4.9 ATIVIDADE DE PROTEASES EXTRACELULARES PRODUZIDAS EM
FERMENTAÇÃO SUBMERSA
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA 43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ENSAIO QUALITATIVO PARA DETECÇÃO DAS ENZIMAS (CUP PLATE)
PECTINASES, PROTEASES, AMILASES, CELULASES E FOSFOLIPASES
5.2 ATIVIDADE DE AMILASE
5.3 ATIVIDADE DE CELULASE
5.4 ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE
5.5 ATIVIDADE DE PECTINASE
5.6 ATIVIDADE DE PROTEASE
5.7 ENSAIO QUALITATIVO DE CUP PLATE PARA DETECÇÃO DE LIPASES 52
5.8 TESTES QUANTITATIVOS DE DETECÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 57
5.8.1 Testes de Titulação
5.8.2 Testes espectrofotométricos de Pectinases e Proteases
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
6 CONCLUSÕES
16
39
41
41
42
44
44
45
47
48
49
50
58 57
7 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 68
62
66
67

1 INTRODUÇÃO
As enzimas atuam em diversas atividades industriais, como principal produto
biotecnológico nas áreas ambiental, alimentícia e da saúde que utilizam a tecnologia
enzimática e seus subprodutos em várias de suas etapas. As enzimas hidrolíticas são as mais
utilizadas nos processos industriais, sendo aplicadas na obtenção de muitos produtos
(OLIVEIRA, 2006; SILVA-NEVES et al., 2006). A tecnologia enzimática movimenta,
anualmente, bilhões de dólares (COELHO, 2001; SILVA-NEVES et al., 2006). Dessa
maneira faz-se necessário que novas espécies de microrganismos produtores de enzimas com
potencial biotecnológico sejam estudadas.
Diante da enorme diversidade de organismos sabe-se que apenas 1% dos
microrganismos existentes na terra foi identificado pelo homem e o conhecimento da
diversidade de enzimas secretadas por eles é bastante escasso. As leveduras tem sido foco
recorrente de pesquisas em busca de novos agentes biotecnológicos principalmente devido ao
fato da enorme variabilidade e diversidade que ainda não foram descobertos (SILVA, 2010).
As enzimas podem ser de origem microbiana, animal e vegetal (NETO, 2001). O uso
de microrganismos como fonte de enzimas vem sendo utilizado em escala industrial por
expressarem características desejadas para aplicação biotecnológica permitindo, não só o
aumento na produção de enzimas de aplicação conhecida em outros processamentos, mas
também a produção de novas enzimas de interesse comercial (GEHARTZ, 1990).
As enzimas são catalisadores biológicos muito eficientes, pois atuam na transformação
de moléculas orgânicas sem alterar a proporção entre os reagentes e produtos do processo e
nem interferir na constituição destes (MARZZOCO e TORRES, 1999). Além disso, são
capazes de atuar em meio extracelular eficientemente, desde que o pH, a temperatura e o
substrato estejam em condições adequadas para que ocorra a reação enzimática (COLEN,
2006). Atualmente tem sido empregado o uso de enzimas, secretadas extracelularmente ou
imobilizadas, em diversos processos (DALLA-VECCHIA, 2004; COLEN, 2006).
As enzimas são muito utilizadas nas indústrias devido ao alto grau de especificidade
das reações que catalisam, pois efetuam conversões eficientes, econômicas, podem atuar em
concentrações baixas, sob condições brandas de pH e temperatura e, principalmente, são
biodegradáveis. As amilases, celulases, pectinases, lipases e proteases são muito utilizadas em
infindáveis aplicações, sendo úteis em vários setores da economia como nos setores de
17

detergentes, fármacos, têxtil e alimentício, o que demonstra a sua importância e
potencialidade de usos (MACIEL, 2010; SILVA, 2010).
As principais vantagens de se utilizar leveduras como fontes de enzimas em grande
escala, quando comparadas aos fungos filamentosos, é a obtenção de elevadas concentrações
de enzimas através de manipulação genética e ajuste das condições de cultivo, fácil e rápida
triagem de microrganismos produtores, ciclos de fermentação curtos, uso de meios de
fermentação de baixo custo, e diversidade de enzimas que catalisam a mesma reação,
possibilitando flexibilidade nas condições de uso (REED, 1997; SILVA, 2003).
Devido aos fatores mencionados anteriormente tornou-se imprescindível a busca por
outras fontes dessas enzimas e a realização de pesquisas visando à seleção de novas linhagens
que secretem enzimas de importância biotecnológica (SILVA, 2010) e industrial (FUNGARO
et al., 1994; SILVA-NEVES et al., 2006).
O potencial das linhagens de leveduras obtidas a partir da fermentação de amêndoas
do cacau representa uma fonte ainda pouco investigada quanto à produção de enzimas
extracelulares. A microbiota que cresce nesse ambiente pode possuir peculiaridades e
características de interesse industrial que poderiam ser exploradas na seleção de leveduras que
secretem enzimas para aplicação nos mais variados processos industriais.
No presente trabalho leveduras isoladas da fermentação do cacau foram testadas
quanto à secreção das enzimas amilases, celulases, pectinases, lipases, proteases e fosfolipases
visando à seleção de microrganismos com potencial de aplicação na obtenção de produtos ou
no melhoramento de processos de importância biotecnológica.
18

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 LEVEDURAS E SUA APLICAÇÃO BIOTECNOLÓGICA
Os fungos eucariotos possuem formas leveduriformes ou filamentosas
(ALEXOPOULOS et al., 1996). As leveduras são fungos formados por uma única célula
eucarionte, em sua maioria são classificados como ascomicetos, tem forma esférica, oval ou
cilíndrica. A reprodução das leveduras pode ser assexuada por brotamento ou podem realizar
também a reprodução sexuada quando ocorre a fusão de duas células (MADIGAN et al.,
2004; GONÇALVES, 2007).
As leveduras são ubíquas, têm metabolismo peculiar que permite a utilização de
nutrientes variados e nas mais diversas condições ambientais. Crescem principalmente onde
há presença de açúcares, como frutas, flores e cascas de árvores, de nutrição quimio-
heterotrófico absorvitiva, predominantemente aeróbios, com temperatura ótima de
crescimento entre 25 a 30º C e pH de 4 a 7, sendo que algumas espécies são patogênicas ao
homem (MADIGAN et al., 2004).
Devido à sua habilidade de utilizar vários substratos para sua nutrição absortiva as
leveduras colonizam diversos nichos ecológicos. Essa característica permite que as leveduras
secretem enzimas que hidrolisam macromoléculas a moléculas menores principalmente fontes
de carbono e hidrogênio, que podem ser incorporadas e utilizadas em sua alimentação. Tem
extrema importância econômica, pois produzem bebidas fermentadas como cervejas e vinhos,
e outros alimentos, como na produção de pão e queijo cuja espécie mais importante e
conhecida é a Saccharomyces cerevisiae (ALEXOPOULOS et al., 1996; SANTOS et al.,
1996; GALVAGNO e FORCHIASSIN, 2004; MADIGAN et al., 2004).
São apropriadas para as utilidades industriais, pois podem ser identificadas de maneira
rápida devido ao seu crescimento em curto tempo, por absorverem uma enorme variedade de
substratos de baixo custo e apresentarem facilidade de recuperação do produto final devido à
rápida separação da biomassa. Além disso, são importantes em diversos setores tais como:
industrial, pela contaminação e deterioração de produtos, e na medicina, por serem a causa de
diversas doenças (SILVA-NEVES, 2006).
19

As leveduras são capazes de catabolizar diferentes compostos, orgânicos e
inorgânicos, extraindo desses nutrientes a energia necessária à sua sobrevivência, essa
característica permite sua aplicação como agente biológico na solução dos problemas gerados
pelos rejeitos lançados no meio ambiente. A diversidade de substratos nos quais os
microrganismos podem crescer resultou, então, no surgimento de enzimas aptas a transformar
moléculas orgânicas distintas das já existentes, o que sem dúvida confere algumas vantagens
adicionais às células microbianas, tais como a exploração de novos nichos ecológicos e
utilização de diferentes fontes energéticas (FUENTEFRIA, 2004).
2.2 ENZIMAS
As enzimas são moléculas de natureza protéica com atividade catalítica, embora
existam também enzimas constituídas de RNA, as ribozimas ou RNAs catalíticos
(FELLOWS, 2006). Enzimas são extremamente importantes para as reações, pois, tem a
capacidade de acelerá-las através da diminuição da energia necessária para que se iniciem, e
favorecem um aumento considerável da velocidade na qual ocorrem, pois sem a atuação
destas, muitos dos processos necessários à vida em que as enzimas atuam seriam muito lentos
ou mesmo não aconteceriam, como a respiração e a digestão animal (LENNINGHER et
al.,1985; LIMA et al., 2001; SCHMIDELL et al., 2001).
O potencial de aplicação das enzimas nas indústrias é devido as diversas vantagens
que possuem como a sua capacidade de atuar em condições brandas de pH, temperatura e
pressão atmosférica, apresentar especificidade e enantioseletividade, não causar poluição
ambiental e ser rapidamente inativadas nas reações (POROSKE, 1984; XU, 2000; VITOLO,
2001; FELLOWS, 2006).
As enzimas possuem uma enorme aplicabilidade industrial e envolvem muito
investimento e retorno financeiro com sua utilidade em indústrias, principalmente devido ao
seu potencial em substituição aos processos que utilizam catalisadores químicos
convencionais, assim tornam-se uma alternativa imprescindível ao desenvolvimento industrial
sustentável (VITOLO, 2001) Tabela 01. Além disso, as reações catalisadas com essa
tecnologia geram produtos que podem ser considerados naturais e não tóxicos devido à
possibilidade de extrair melhor as matérias primas e facilitar a manipulação dos materiais, o
20

que além de aumentar a vida de prateleira, gera melhoria das características sensoriais dos
alimentos. É por todos esses fatores que as enzimas são atualmente muito utilizadas nas mais
variadas aplicações pelas indústrias (POROSKE, 1984; XU 2000; VITOLO, 2001;
FELLOWS, 2006).
Tabela 01. Principais aplicações das enzimas em indústrias e os microrganismos que as secretam.
Enzimas Fonte Atuação nos alimentos Aplicação
α-amilase Aspergillus sp.
Bacillus sp.
Microbacterium
imperiale
Celulase Aspergillus niger
Trichoderma spp.
Lipase Aspergillus sp.
Candida sp.
Rhizomucor miehei
Rhizomucor miehei
Rhizopus sp.
Bacillus subtilis
Pectinase Aspergillus sp.
Penicillium
funiculosum
Protease Aspergillus sp.
Rhizomucor miehei
Cryphomectria
parasítica
Penicillum citrinum
Rhizopus niveus
Bacillus sp.
Fonte: Adaptado de Vitolo, 2001 e Fellows, 2006.
Hidrólise de goma de
trigo, aumento do
volume do pão
Amolecimento da massa;
auxiliar na produção de
açúcares para fermentação
Hidrólise de celulose Liquefação de frutas para
produção de sucos
Hidrólise de
triglicerídeos em ácidos
graxos e glicerol;
Hidrólise da pectina
Hidrólise de proteínas
de animais e vegetais;
hidrólise de glúten de
trigo
21
Tempero em produtos de queijo;
modificação da função da
gordura por interesterificação
Clarificação de sucos de frutas
por despectinização
Coagulação do leite para
fabricação de queijo; produção
de hidrolisados para sopas;
melhoria da massa do pão
Apesar da enorme diversidade de enzimas que foram investigadas e são conhecidas
apenas algumas podem efetivamente ser aplicadas e produzir resultados satisfatórios em
escala industrial, pois nem todas as enzimas são eficientes nas condições de processamento
em grande escala. As enzimas podem ser inativadas devido às variáveis de temperatura e pH
do processo e necessidade de co-fatores para que possam atuar. Além disso, muitas enzimas
são intracelulares, o que dificulta a eficiência do processo, pois a necessidade de separação

das enzimas dos componentes celulares encarece e torna inviável o processamento com fins
comerciais (VITOLO, 2001; LIMA et al., 2001).
Para que a secreção das enzimas seja eficiente deve-se maximizar a produção das
enzimas pelos microrganismos e minimizar os custos com substrato, meio de cultivo,
incubação, bem como procedimentos de recuperação das enzimas (VITOLO, 2001;
FELLOWS, 2006).
As enzimas microbianas têm grande potencial biotecnológico, sendo empregadas na
indústria têxtil (amilase, celulase, pectinase), de papel (lipase, xilanase, oxiredutases), de
detergentes (celulase, lipase, protease) e alimentícia (pectinase, lipase, protease) (VAN e
BEILEN, 2002; OLIVEIRA, 2006) na qual há a necessidade de que o microrganismo não
secrete micotoxinas ou outras substâncias tóxicas e nem seja patogênico (FUNGARO et al.,
1994).
A necessidade atual do mercado, dos consumidores e de órgãos governamentais por
produtos alimentícios com menos aditivos e reduzida aplicação de tratamentos químicos tem
aumentado o interesse do uso de enzimas nessas indústrias (TUNGA et al., 2003). Portanto, a
tecnologia enzimática e a biocatálise são ferramentas promissoras para a síntese de compostos
de alto valor agregado (FERNANDES, 2007).
2.3 PROTEASES
As proteases são enzimas que atuam sobre as proteínas transformando-as em peptídeos
de peso molecular menor ou em aminoácidos (LIMA et al., 2001; SCHMIDELL et al., 2001;
VITOLO, 2001). As enzimas proteolíticas catalisam a hidrólise das ligações peptídicas das
proteínas (BERG et al., 2004), e classificam-se quanto ao valor do pH no qual a sua atividade
catalítica é máxima, podendo assim ser classificadas em proteases ácidas, neutras ou alcalinas
(RAO, 1998; NELSON e COX, 2004).
As proteases alcalinas tiveram sua aplicação aumentada como catalisadores
industriais nos últimos anos por oferecerem diversas vantagens em detrimento dos
catalisadores químicos convencionais. Dentre as características vantajosas que apresentam
encontra-se a alta atividade catalítica, alto grau de especificidade pelo substrato, podem ser
22

produzidas em larga escala, são economicamente viáveis e biodegradáveis, reduzindo assim,
também a poluição ambiental (ANWAR e SALEEMUDDIN, 1998; ESPÓSITO, 2006).
São provenientes de diversas fontes naturais podendo ser de origem animal, vegetal ou
microbiana. As leveduras são as mais promissoras fontes de enzimas, pois possuem fácil
manipulação genética e grande diversidade (RODRIGUES e SANT’ANNA, 2001). As
leveduras são boas produtoras de enzimas que podem ser utilizadas inclusive na produção de
alimentos (GODFREY e WEST, 1996, RODRIGUES e SANT’ANNA, 2001; NEVES-
SOUZA et al., 2006 e SILVA, 2009; BARNETT et al., 1990).
As proteases podem ser diferenciadas de acordo com sua atuação nas cadeias
proteolíticas. As enzimas podem ser utilizadas na modificação de materiais de origem protéica
através do processo de hidrólise. Essas enzimas atuam de diversas maneiras no ataque as
cadeias protéicas e de acordo com a região em que atuam podem ser classificadas em
endopeptidases e exopeptidases (SCHMIDELL et al., 2001; LIMA et al., 2001).
Existem diversos processos em que as enzimas proteolíticas podem ser aplicadas
(NELSON e COX, 2004), principalmente na indústria alimentícia (SOARES et al., 1999;
BIAGGIO et al., 2001; SILVA-NEVES et al., 2006; SILVA et al., 2009), de maturação de
couro, química e farmacêutica (BON e PEREIRA, 1999; BIAGGIO et al., 2001; SOARES et
al., 2008; SOUZA et al., 2008; SILVA et al., 2009). Na indústria alimentícia, tem aplicação
difundida, no amaciamento de carnes, na clarificação de cervejas, produção de pães e
biscoitos, no processo industrial de produtos como óleos desidratados e leite de soja. No
processo de tenderização de carnes as proteases agem degradando as suas fibras através da
injeção de enzimas no sistema vascular do animal antes do abate. (CANILHA et al., 2006;
ZIMMER et al., 2009).
As proteases podem ser utilizadas no aumento da digestibilidade de alimentos muito
ricos em proteínas, como o farelo de soja, nos quais os complementos enzimáticos são
utilizados amplamente na indústria, para facilitar a digestão e melhorar o sabor e o valor
nutricional dos alimentos (SOARES et al., 2008; LIMA et al., 2003).
Proteínas hidrolisadas vêm sendo aplicadas e desenvolvidas com incrível sucesso na
indústria alimentícia como substitutos industriais na dieta de indivíduos que não podem
digerir a proteína intacta. São aplicados também em substitutos de produtos lácteos,
suplementos protéicos, estabilizadores de bebidas, realçadores de sabor e produtos de
23

confeitaria, sendo bastante difundida sua aplicação também nos produtos de pesca
(NASCIMENTO et al., 2007).
Na indústria de panificação o uso de proteases melhora as características como a
elasticidade e a textura do glúten. Essas enzimas são adicionadas durante a fermentação, o que
fornece um maior contato com o glúten e atuam hidrolisando a cadeia protéica e reduzindo-a
através do realinhamento da molécula, o que torna a massa mais fácil de ser manuseada,
reduzindo o tempo de mistura e com isso gera economia de material, equipamento e energia o
que reduz o valor do produto final (KOBLITZ et al., 2008).
As proteases são aplicadas na indústria farmacêutica em medicamentos como
digestivos e também no tratamento de ferimentos. Têm uso terapêutico como anticancerígeno,
antifúngico, vermífugo, antiinflamatório e anticoagulante (MARQUARDT, 2003).
A hidrólise de proteínas pode ser realizada através de aplicações de métodos químicos
convencionais ou através da aplicação de enzimas possibilitando o controle da hidrólise, o que
gera melhoria das características do produto final a ser obtido. Além disso, o processo de
hidrólise enzimática é mais simples, eficiente e envolve condições que não destroem as
proteínas recuperadas (NERY et al., 2000).
Dessa forma, as proteases podem ser aplicadas em diferentes finalidades como na
hidrólise de proteínas de origem animal ou vegetal como na remoção de carnes dos ossos de
animais abatidos tornando-a matéria-prima para produção de gelatina, que é muito utilizada
em produtos dietéticos; além de essas enzimas atuarem também na produção de substâncias
que intensificam o sabor de alimentos produzidos nas indústrias como o ácido glutâmico
(CARVALHO et al., 2009).
A produção dessas enzimas foi verificada por diversos autores por alguns
microrganismos como Thermomyces lanuginosus (JENSEN et al., 2002; LI et al., 1997),
Aspergillus sp. (CORAL et al., 2003; TUNGA et al., 2003), Penicillium sp. (GERMANO et
al., 2003; HASHEM, 2000), Mucor spp. (MAHESHWARI et al., 2000) e Rhizopus oryzae
(KUMAR et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2002). Buzzini e Martini (2002) verificaram a
atividade enzimática proteolítica extracelular de microrganismos leveduriformes como
Pseudozyma Antartica e fungos filamentosos.
24

2.4 AMILASES
Amilases são carboidrases e tem a função de hidrolisar as ligações glicosídicas dos
monossacarídeos de carboidratos, sobre as ligações α-1,4 e α-1,6 que estão presentes no
amido e no glicogênio (OBATA et al., 1977; KOBLITZ, 2008). Representam importantes
enzimas industriais, de grande importância biotecnológica, tais como aplicações nas indústrias
têxteis, de cervejas, bebidas destiladas, panificação, liquefação e sacarificação do amido,
ração animal, indústria química e farmacêutica (GUPTA et al., 2003; PANDEY et al., 2000;
OLIVEIRA, et al, 2010).
Dentre as amilases fúngicas, as que apresentam maior interesse industrial são as α-
amilase, β-amilase e amiloglucosidase (HARGER et al., 1982; OLIVEIRA, 2010).
Existem diversas aplicações para as amilases nos mais variados setores. Uma
aplicação frequente ocorre na indústria têxtil, na qual a resistência dos fios de tecidos é
minimizada com a aplicação de goma de amido que é posteriormente eliminada, e para que o
tecido não seja prejudicado durante esse processo utiliza-se a aplicação de uma amilase de
origem bacteriana, que atua em altas temperaturas (105-110°C) (WISEMAN, 1985). Além
disso, na indústria alimentícia eliminam a turbidez produzida pelos amidos e reduzem a
viscosidade dos sucos de frutas e do amido de cacau, transformando-o em dextrinas,
melhoram a textura da massa de panificação, acelerando a fermentação realizada pelas
leveduras (OLIVEIRA, 2010).
As α-amilases atuam sobre o amido gelatinizado e formam como resultado as
dextrinas que são então hidrolisadas pelas β-amilases. No processamento da massa de pães a
presença de açúcares na massa melhora as características do produto final influenciando a
textura e o sabor da massa além da qualidade de tostagem do pão, o que pode ser obtido com
a adição de enzimas amilolíticas na massa, principalmente porque não é usual a adição de
açúcar nestes processos. As características favorecidas neste processo são a viscosidade e
maciez da massa, além de conferir ao miolo um ótimo volume final, sedosidade e textura
macia (VITOLO, 2001; PASTOR et al., 2001; KOBLITZ, 2008).
Devido à produção em larga escala surgiu a necessidade de um processamento de
frutos comestíveis em grande quantidade e a realização do armazenamento destes por longos
períodos em baixas temperaturas e com isso faz-se necessário o emprego de enzimas
25

amilolíticas para que não ocorra problemas de turvação ou gelatinização durante o
processamento (NEVES-SOUZA et al., 2005).
Podem ser produzidas por diversos microrganismos como bactérias e fungos, porém,
as enzimas amilolíticas mais conhecidas são aquelas produzidas por fungos filamentosos,
principalmente do gênero Aspergillus e Rhizopus (PANDEY, 1999 e SOARES, 2010).
Embora sejam diversos os microrganismos produtores de amilases destacando-se as
espécies dos gêneros Aspergillus, Rhizopus, Bacillus que têm sido empregadas em processos
industriais na literatura científica são escassos trabalhos que estudem e verifiquem a secreção
de amilases por leveduras por outros pesquisadores. (COSTA, 1996; PANDEY et al., 2000).
2.5 LIPASES
As lipases são triacilglicerol éster hidrolases (EC 3.1.1.3) que catalisam a hidrólise,
principalmente de triglicerídeos, principais componentes de óleos e gorduras, e atuam muito
melhor em substratos insolúveis em água, liberando ácidos graxos livres, diacilgliceróis,
monoacilgliceróis e glicerol, além de exercerem papel fundamental no metabolismo dos
lipídeos presentes nos seres vivos, como as enzimas digestivas (VITOLO, 2001; KOBLITZ,
2008).
As lipases atuam na maturação de queijos liberando ácidos graxos que garantem as
características organolépticas do produto final, reduzindo o tempo necessário para maturação
do queijo e consequentemente reduzem o tempo e custos com o processo, fatores que se
refletem no produto final (WHITAKER, 1994; ANDRADE, et al., 2002).
Atuam também na fabricação de pães light, pois a ação das lipases é capaz de
modificar os próprios lipídeos da massa, sem a complementação da produção com gorduras
adicionais. A hidrólise de triglicerídeos da massa favorece a capacidade de retenção de ar por
esta, o que produz um pão com textura mais macia e fornece uma capacidade de retenção de
água à massa, prolongando a vida de prateleira do produto.
(GACESA e HUBBLE, 1990).
As lipases também são aplicadas na produção de margarinas por meio da
interesterificação de um óleo e devido à mistura de ácidos graxos saturados com insaturados
nos triglicerídeos resultantes fornecem um produto com a textura desejada a uma margarina
26

de boa qualidade, que é o espalhamento eficaz em temperatura de refrigeração e cremosidade
(BEISSON, et al., 2000; CONESA, et al., 2002).
A aplicação de lipases na indústria de detergentes é bastante difundida, pois estas
moléculas aplicadas nas formulações de sabões e detergentes reduzem o tempo e a
temperatura da lavagem dos tecidos, resultando em um processo com menores gastos de
energia. Além de serem também aplicadas no tratamento de efluentes de indústrias reduzindo
a camada lipídica superficial que fica sobre o efluente e dificulta a aeração nos tanques
(GANDHI, 1997).
As lipases também são aplicadas na indústria de alimentos sintetizando aromas a partir
de um álcool e de um ácido originando o butirato de etila responsável pelo aroma de morango
e acetato de isoamila, que é o aroma de banana (KOBLITZ, 2008).
As lipases de origem microbiana são muito utilizadas devido às características de
estabilidade e crescimento rápido dos microrganismos e devido a esses fatores têm despertado
interesse de diversos pesquisadores em descobrir novas fontes através da seleção de
microrganismos (GONÇALVES, 2007).
Recentemente, as lipases estão sendo muito estudadas devido ao seu potencial de
aplicação na produção de biodiesel através de sua capacidade de realizar reações de
transesterificação (Figura 1). A utilização de biodiesel como fonte de bicombustível em
substituição ou adição aos combustíveis de origem fóssil tornou-se obrigatória a partir da Lei
nº 11.097, publicada em 13/01/2005, e desde 1º de julho de 2008, o percentual de biodiesel
adicionado ao óleo diesel comercializado em todo o Brasil aumentou de 2% para 3%, regra
estabelecida pela Resolução nº 2 do Conselho Nacional de Política Energética (CNPE). Na
tentativa de produzir um combustível mais sustentável, pesquisas vêm sendo feitas no sentido
de viabilizar a transesterificação enzimática em escala industrial a partir dessa enzima através
da seleção de microrganismos bons produtores destas, pois originam um produto de alta
pureza, de fácil recuperação e de fácil separação do glicerol (PINTO et al. 2005; FALCONE,
2009).
27

Figura 1: a. Equação geral para uma reação de transesterificação b. equação geral da transesterificação de um
triacilglicerídeo.
Fonte: adaptado de Geris, 2007.
Diversos pesquisadores têm realizado o isolamento e seleção de microrganismos
produtores de lipases das mais variadas fontes, dentre os fungos, os reportados como
melhores produtores são os dos gêneros Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Mucor,
Penicillium, Rhizomucor, Theromyces (GONÇALVES, 2007).
Dentre as leveduras, tem-se o registro de algumas preconizadas como boas secretoras
de lipases, sendo elas pertencentes ao gênero Candida, e dentre elas as mais importantes,
descritas como de grande aplicação industrial por produzir em grandes quantidades esta
enzima são as Candida rugosa e Candida antarctica (GACESA e HUBBLE, 1990; COLEN,
2006).
2.6 PECTINASES
As pectinases, exceto as pectinametil-esterases, são enzimas que atuam sobre as
ligações do tipo α-1,4 do ácido galacturônico. As células das plantas vegetais superiores são
constituídas de carboidratos poliméricos coloidais denominados de substâncias pécticas e
formadas por unidades de acido galacturônico (VITOLO, 2001).
28

Pectinases são utilizadas frequentemente na indústria de sucos de frutas e fabricação
de vinho, tendo como principal fonte o fungo filamentoso Aspergillus niger (OLIVEIRA,
2006). A adição de pectinases no processamento de sucos contribui para redução da
viscosidade e aumento da quantidade de sólidos solúveis presentes no produto final
(GODFREY e REICHELT, 1983; PZSCZOLA, 2001). As polpas de frutas são difíceis de ser
prensadas e a adição destas enzimas na polpa dissolve a pectina e facilita o rompimento das
paredes celulares, o que aumenta o rendimento da extração do suco e torna o processo muito
mais eficiente (PEREIRA, 2002; MARQUARDT, 2003).
As antocianinas, pigmentos que conferem a coloração avermelhada das frutas, são
substâncias difíceis de ser removidas. A adição de pectinases realiza a hidrolise da parede
celular e libera esses compostos muito utilizados na fabricação do vinho tinto, o que diminui
consideravelmente o tempo de maceração da casca no mosto (VITOLO, 1981;
VENDRUSCOLO, 2005). Outro processo em que as enzimas atuam é o descascamento
enzimático com a hidrólise de frutas cítricas, que atua principalmente entre a casca e a polpa
separando as porções da fruta, que após a reação de hidrólise podem ser utilizadas para
produção de sucos ou vendidas como produtos minimamente processados por diversas
indústrias (VITOLO, 2001).
Bastos et al. (2002) também avaliaram a capacidade das leveduras secretarem enzimas
pectinolíticas, objetivando sua aplicação na melhoria da qualidade da extração da polpa de
cupuaçu e observaram que o rendimento com adição da preparação enzimática comercial de
pectinases foi superior de 43 a 60% quando comparado a extração da polpa sem o preparado
comercial. Sanchez et al., (1984), estudaram a atividade pectinolítica de leveduras isoladas na
Costa do Marfim durante a fermentação do cacau. Biely e Sláviková (1994) identificaram os
gêneros: Ambrosiozyma, Aureobasidium, Bullera, Candida, Cryptococcus, Georrichum,
Klyuveromyces, Leucosporidium, Rhodosporidium, Saccharomycopsis, Strephanoascus,
Trichosporon e Ustilago como produtores destas enzimas. Além disso, as pectinases podem
ser também produzidas por bactérias, fungos filamentosos, insetos, nematóides e protozoários
(HOONDAL et al, 2002).
2.7 CELULASES
29

Celulases são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas β-1,4 entre unidades de
glicose. As celulases podem romper as ligações glicosídicas da celulose, liberando
oligossacarídeos e glicose (VITOLO, 2001). Podem ser aplicadas nas indústrias de alimentos,
fármacos, cosméticos, detergentes e tecidos. Dentre suas aplicações nas indústrias têxteis,
destacam-se a bioestonagem e o biopolimento, melhorando a qualidade do tecido (CALADO
et al., 2007). São aplicadas também na indústria de sucos, na liquefação do tecido vegetal e na
extração de pigmentos de frutos que normalmente é muito difícil por estarem concentrados
nos tecidos epiteliais mais complicados de se desintegrar do que a polpa devido à baixa
permeabilidade das membranas e das paredes celulares (VITOLO, 2001; KOBLITZ, 2008).
A remoção dos pigmentos também pode ser realizada com a utilização das enzimas
celulolíticas que além de obter um suco facilmente separado dos componentes celulares
agindo diretamente sobre o tecido vegetal dispensa os processos de prensagem e separação do
suco (MACIEL 2006). Outra etapa em que essas enzimas atuam no processamento de sucos é
na clarificação destes no intuito de reduzir a sua viscosidade, permitindo assim que as
substancias insolúveis tornem-se solúveis (SHARROCK, 1988).
O estudo de Ruegger e Tauk-Tornisielo (2004) identificaram a secreção dessas
enzimas pelos microrganismos do gênero Trichoderma. Além disso, espécies dos gêneros
Aspergillus e Penicillium também têm sido citadas como boas produtoras destas enzimas.
Os fungos filamentosos com capacidade de atividade celulolítica podem ser isolados
de diversas fontes desde manguezais (SOUZA et al., 2009), até mesmo a partir do isolamento
da microbiota de invertebrados marinhos (SILVA, 2010) e do solo (RUEGUER e TAUK-
TORNISIELO, 2004) Tabela 02. As enzimas podem ser obtidas a partir do cultivo submerso
(CALADO et al., 2004) ou de substrato sólido. Isso demonstra a grande variabilidade de
microrganismos com potencial para secreção dessas enzimas uma vez que diferentes espécies
apresentaram atividade celulolítica.
30

Tabela 02. Microrganismos produtores de celulases.
Microrganismos Referências
Fungos filamentosos Rueguer e Tauk- Tornisielo (2004)
Humicola grisea Calado et al. (2004)
Fungos filamentosos isolados de
manguezais
Souza et al. (2008)
Aspergillus Soares et al. (2010)
Fungos, filamentosos e leveduriformes,
provenientes do isolamento a partir de
invertebrados marinhos
2.8 FOSFOLIPASES
Silva (2010)
As fosfolipases são enzimas hidrolíticas que tem a capacidade de atuar sobre um ou
mais ésteres ligados a glicerofosfolipídios e se diferenciam pelas ligações éster específicas
que hidrolisam no substrato. A secreção dessas enzimas em grande quantidade pelos
microrganismos geralmente está associada com a patogenicidade destes, pois estas moléculas
conferem um fator de virulência aos fungos (COSTA, 2006). Essas enzimas atuam sobre
membranas celulares e realizam o rompimento dos fosfolipídios em ácidos graxos e
lisofosfolipídeos e são diferenciadas pelo sitio de hidrólise no qual atuam (SANTOS, 2009).
De acordo com Komiyama et al., (2007) a produção dessas enzimas representa
importante mecanismo de patogenicidade nas espécies de Candida albicans, possivelmente
por facilitar sua penetração nos tecidos através da clivagem dos fosfolipídeos, que destrói a
estabilidade da membrana e causa a lise celular. Diversos trabalhos têm verificado a produção
dessas enzimas. Price et al. (1982); Saramanayake et al. (2002) e Costa (2006) identificaram
dentro do gênero outras espécies patogênicas como Candida tropicalis, C. glabrata e C.
parapsilosis como bons produtores de fosfolipases.
31

Além disso, as fosfolipases podem ser aplicadas em diversas áreas na indústria de
alimentos como emulsificantes e também em reações de interesterificação de fosfolipídeos,
além de serem utilizadas em produtos para panificação, no processamento de gorduras e óleos
e na extração de componentes vegetais (FELLOWS, 2006).
2.9 ENZIMAS NA FERMENTAÇÃO DO CACAU
Durante o processo fermentativo as amêndoas são empilhadas em caixas e ocorre a
separação da polpa mucilaginosa, rica em açúcar, que é consumida pelas leveduras liberando
álcool etílico, em seguida as leveduras sofrem autólise, liberando as enzimas que atuam no
processo. O etanol produzido é oxidado a ácido acético com o auxílio das bactérias acéticas
que tornam o tegumento permeável, fazendo com que as amêndoas sofram a ação das enzimas
que são responsáveis pelas características que compõem o flavor do produto final
(OETERRER et al., 1996; FELLOWS, 2006; AFOAKWA et al., 2009). Para que as
amêndoas de cacau possam originar o sabor e o aroma característico de um chocolate de
excelente qualidade é imprescindível que sejam fermentadas, secas e torradas num processo
de complexas reações enzimáticas e químicas como a hidrólise de açúcares e proteínas,
liberação de enzimas, difusão de compostos fenólicos e morte do embrião (FORSYTH e
QUESNEL, 1957).
As enzimas atuam neste processo de diversas maneiras, como as polifenoloxidases que
oxidam os polifenóis presentes nas sementes em quinonas proporcionando o escurecimento
enzimático (BRITO, 2000; EFRAIM, 2010). A fermentação completa das sementes é
diretamente proporcional à qualidade do chocolate. O aroma e sabor característicos são
obtidos pela formação dos precursores químicos do flavor, pois as sementes não fermentadas
geralmente são amargas e adstringentes, e as parcialmente fermentadas são amargas
(KATTENBERG e KEMMINK, 1993; CALIGIANI et al., 2007). O escurecimento não
enzimático é proveniente da acumulação de compostos insolúveis como polifenóis, 60%
desses compostos são flavanóis (BRITO, 2000). Na fermentação completa do cacau a
secreção de algumas enzimas por microrganismos é muito útil como a produção de enzimas
pectinolíticas que, em contato com o substrato, podem melhorar a aeração da massa; enzimas
amilolíticas, que produzem o aumento da concentração de açúcares redutores pela hidrólise do
32

amido e as enzimas proteolíticas que geram a melhor concentração de aminoácidos livres.
Todas estas enzimas são requeridas para a formação do flavor do cacau (AMIN et al., 1998;
SCHWAN, 1998).
Depois de fermentadas, as amêndoas são secas e torradas a 7% de umidade, o que
estabiliza o sabor e produz o aroma e a cor característicos do chocolate, pois muitas das
reações bioquímicas iniciadas na fermentação continuam na secagem como as reações de
oxidação que proporcionam redução da acidez das amêndoas, além do escurecimento dos
cotilédones (ROHAN e STEWART, 1967; LOPEZ e QUESNEL, 1973; BECKETT, 1994),
redução do teor de compostos fenólicos que são responsáveis pelo amargor e adstringência ao
sabor (OETERRER et al., 1996; FELLOWS, 2006; DOMINGUES, 2010) e remoção de
compostos indesejáveis formados durante a fermentação, como por exemplo, o ácido acético.
A secagem não deve ser lenta para evitar o crescimento de fungos contaminantes, que podem
originar um sabor desagradável ou gerar toxinas no produto final (GARCIA, 1985).
Todas essas etapas são essenciais para que ocorra a obtenção dos precursores do sabor
característico dos produtos do cacau (OETERRER et al., 1996; FELLOWS, 2006;
AFOAKWA et al., 2008; EFRAIM et al., 2010; DOMINGUES, 2010). A aplicação de
inóculos iniciadores, uma ou mais linhagens de microrganismos com características
desejáveis, no início da fermentação aliado ao uso de matéria-prima de qualidade é uma
ferramenta que garante o controle da qualidade e valoriza o produto final (SCHWAN, 1998).
2.10 ASPECTOS BIOTECNOLÓGICOS
Diante das inúmeras vantagens do uso de enzimas mencionadas anteriormente, muitas
pesquisas vêm sendo realizadas no sentido de viabilizar o processo de produção destas em
escala industrial, principalmente no que diz respeito à redução do custo de sua aplicação.
(JAEGER e EGGERT, 2002).
As enzimas provenientes de microrganismos podem ser obtidas por fermentação,
submersa ou por fermentação em substrato sólido, seguidas de processos posteriores de
recuperação e purificação do produto. As enzimas utilizadas em indústrias são
preferencialmente imobilizadas devido à capacidade de reutilização desta pela fácil separação,
33

maior estabilidade, fatores que reduzem os custos de utilização de enzimas nas indústrias
(JESUS et al., 1997). A imobilização pode ser realizada em suporte por adsorção e
encapsulação (PINHEIRO et al., 2005).
Dessa maneira, é recorrente a busca pelos pesquisadores atualmente por novas fontes
de microrganismos com alta atividade enzimática e que produzam moléculas com diferentes
propriedades e especificidades, visando à redução dos custos na aplicação de enzimas em
tecnologias industriais por meio de novos processos de produção ou adaptando os já
existentes, o que agrega alto valor comercial a essas moléculas (KAMINI et al., 2000).
34

3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Prospecção da atividade enzimática extracelular de importância industrial de leveduras
isoladas da fermentação do cacau
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Reativar as amostras de leveduras previamente isoladas que foram testadas no
trabalho;
Verificar a viabilidade e pureza das amostras por meio da observação em microscopia
óptica;
Observar a produção de enzimas extracelulares como proteases, lipases, amilases,
celulases e pectinases de interesse industrial secretadas por leveduras isoladas da
fermentação do cacau de municípios de Ilhéus e Una/BA, pela metodologia de cup
plate;
Verificar a produção de enzimas extracelulares, por meio de testes titulométricos e
espectrofotométricos.
Contribuir com informações biotecnológicas com o acervo de leveduras da CCMB
(Coleção de Cultura de Microrganismos da Bahia/UEFS).
35

4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 PROCEDÊNCIA DAS LINHAGENS DE LEVEDURA
As linhagens de leveduras utilizadas neste estudo foram isoladas por Ferreira (2007) a
partir de fermentações de cacau do sul da Bahia. As linhagens foram depositadas na Coleção
de Culturas de Microrganismos da Bahia (CCMB). Os experimentos foram realizados no
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) do Departamento de Ciências
Biológicas da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS).
4.2 REATIVAÇÃO
Setenta linhagens de levedura foram inoculadas separadamente em placas contendo
ágar Sabouraud (20g/L de glicose, 5g/L extrato de levedura, 10g/L de peptona e 20g/L de
ágar) para obtenção de colônias isoladas. As placas foram incubadas a 28º C (±1ºC) por 48 h.
As colônias obtidas foram avaliadas macroscopicamente através da morfologia. Para a
avaliação microscópica foram preparadas e observadas lâminas coradas pelo método de
Gram. As linhagens que não cresceram em ágar Sabouraud foram inoculadas em meio líquido
GYMP (2g de glicose, 0,5g de extrato de levedura, 1g de extrato de malte, 0,2g de fosfato de
sódio em 100 mL de água deionizada) e incubadas a 28ºC sob agitação constante de 200 rpm
por 24 horas e, em seguida, estas linhagens foram semeadas em placas contendo ágar extrato
de malte e incubadas a 28º C por 48 horas.
4.3 MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS
As linhagens de leveduras consideradas puras estão sendo mantidas a – 80°C em tubos
criogênicos de 1,5 mL contendo meio GYMP adicionado de 10% de glicerol.
36

4.4 PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO
Para a padronização do inóculo, as leveduras foram cultivadas em ágar Sabouraud e
incubadas a 28°C por 24 h. Os inóculos das leveduras foram padronizados em solução salina
estéril a 0,45% na escala 3 de McFahrland (Colorímetro VITEK, bioMérieux), quantificando
aproximadamente a 5 X 10 5 células mL.
4.5 CULTIVO EM MEIO DE INDUÇÃO
Após padronização, 50 µL da suspensão microbiana (conforme descrito anteriormente)
foram transferidos separadamente para tubos de ensaio contendo 5 mL do meio de indução
composto de fosfato de amônio (7 g/L), fosfato dibásico de potássio (1,5 g/L), sulfato de
magnésio (0,5 g/L), cloreto de cálcio (0,3 g/L), solução de elementos traços 2,5 m.L/L (0,1 g
de sulfato ferroso; 0,1 g de cloreto manganoso; 0,1 g de sulfato de zinco em 100 mL de água
destilada) e pH 7. A este meio foram adicionados separadamente carboximetilcelulose (1 g/L)
para a verificação da produção de celulase; amido (1 g/L) para a produção de amilase; pectina
cítrica (1 g/L) para pectinases; gelatina e caseína (1 g/L) para as proteases; gema de ovo e
água em uma mistura proporcional de 0,5 mL de cada, totalizando 1 mL/L para as
fosfolipases; óleo de mamona, óleo de dendê e manteiga de cacau (1 g/L) para lipases. Os
tubos foram incubados sob agitação constante a 150 rpm a 28º C por 48 horas.
37

4.6 ENSAIO QUALITATIVO PARA DETECÇÃO DAS ENZIMAS
O ensaio qualitativo para detecção das enzimas (Cup Plate), metodologia modificada
de Dingle et al. (1953) foi realizado em meio sólido de caracterização. A composição dos
substratos para atividade enzimática adicionados nos meios de caracterização foram os
mesmos acrescentados nos meio de indução com exceção da produção da enzima protease
onde foi necessário adicionar leite em pó desnatado a 1%.
Os meios de caracterização foram adicionados de ágar a 2% e calibrados para os
valores de pH 5, 7 e 9 antes da autoclavagem. Após o plaqueamento foram feitas perfurações
circulares, com diâmetro de 6 mm. Um mililitro do cultivo em meio de indução foi
centrifugado a 3500 rpm por 20 minutos sob refrigeração a 4°C para separação da biomassa e
150 uL do sobrenadante foram transferidos para cada perfuração. As placas foram incubadas a
37°C por 24h. Após este período foi realizada a visualização dos resultados. A produção de
enzimas se evidenciou pelo surgimento de halos ao redor do ponto de aplicação. A atividade
enzimática obtida pela reação em placa foi determinada semi quantitativamente através da
média do diâmetro dos halos degradativos mensurados com o auxílio de uma régua
milimetrada. Desta forma, quanto maior o halo degradativo maior o índice enzimático e,
portanto, consequentemente, maior a atividade enzimática. Todos os testes foram realizados
em triplicata.
4.6.1 Atividade de celulase
Para análise da atividade celulase foi adicionado 10 mL de vermelho congo (0,1 g/100
mL), pH 8,0 sobre as placas como revelador. Após 30 minutos este foi desprezado e sobre a
placa foram adicionados 5 mL de uma solução de NaCl (0,5M) pH 8,0 que após 5 minutos foi
descartada. O resultado da reação enzimática positiva foi identificado pela formação de um
halo translúcido, ao redor do cup plate.
38

4.6.2 Atividade de amilase
Para análise da atividade amilolítica foram adicionados 3 mL de solução de iodo (0,1
g/100 mL) e a leitura foi realizada logo em seguida. O resultado da reação enzimática positiva
foi identificado pela formação de um halo amarelado ao redor do cup.
4.6.3 Atividade de pectinase
Para análise da atividade pectinase foi dispensado sobre o ágar uma solução de 3 mL
de ácido clorídrico a 5N. O resultado da reação enzimática positiva foi identificado pela
formação de um halo translúcido ao redor da perfuração.
4.6.4 Atividade de lipase
Para determinação da atividade lipase adicionou-se antes de distribuir o meio na placa
uma solução de rodamina B (0,3 mL/100 mL) obtida da solução diluída de 1 g para 50 mL de
água destilada estéril e previamente esterilizada através de filtração em membrana (poro 45
µm). A revelação foi realizada em transiluminador de luz UV a 310 nm. Como resultado
positivo foi possível observar a mudança de coloração, tornando-se alaranjado fluorescente,
quando irradiadas com luz ultravioleta, ao redor do ponto de aplicação.
4.6.5 Atividade de protease e fosfolipase
39

Para avaliação da atividade protease e fosfolipase foi considerada positiva a
visualização de um halo translúcido ao redor do ponto de aplicação depois de decorrido o
tempo de reação, sem a necessidade de adição de revelador.
4.7 TITULAÇÃO
A atividade lipolítica em fermentação submersa foi analisada sobre manteiga de cacau,
óleo de mamona e óleo de dendê, onde 1 g de cada substrato foi introduzido em frascos
Erlenmeyer de 125 mL contendo 4 mL de água destilada e 10 pérolas de vidro. Em seguida
foram adicionados 1 mL do extrato enzimático livre de células. Os frascos foram incubados a
50°C em banho-maria sob agitação a 150 rpm por 30 min. Então a reação foi interrompida
pela adição de 10 mL de uma solução de acetona/etanol (1:1 v/v). Os ácidos graxos liberados
foram, então, titulados com uma solução de NaOH (0,05 M), utilizando 3 gotas de
fenolftaleína como indicador de pH cujo ponto de viragem foi detectado pelo surgimento de
uma coloração rósea no meio. O volume de solução de NaOH gasto em cada titulação foi
anotado. O controle (branco) foi preparado diferenciando-se pela adição de 1 mL de água
destilada no lugar da amostra. Os testes foram realizados em triplicata para cada
microrganismo obtendo-se a média aritmética para cálculo da atividade lipolítica.
Uma unidade de atividade lipolítica (UA) foi definida como a quantidade de enzima
capaz de liberar 1 µmol de ácidos graxos por minuto de reação, utilizando a seguinte equação:
Onde lê-se:
UA é o número de unidades de enzima no volume testado (1 mL) expresso em
µ moles de ácido graxo/tempo de reação,
Va – Vb é o volume (mL) de solução necessária para titular os ácidos graxos
da solução enzimática menos o volume gasto para titular os ácidos graxos contidos no
branco da amostra,
UA = (Va – Vb) * 1000 * M NaOH
t(min) * Valíquota
M NaOH é a normalidade da solução de NaOH utilizada,
40

t é o tempo de reação, em minutos,
V volume de inóculo (mL) utilizado na reação enzimática.
4.8 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DE PECTINA METILESTERASE (PME) EM
FERMENTAÇÃO SUBMERSA
4.8.1 Preparação das amostras para os ensaios enzimáticos
O processo de fermentação submersa foi realizado no Laboratório de Tecnologia do
Departamento de Engenharia da UEFS. Para se efetuar as fermentações, 5 mL do meio de
indução das leveduras contendo células metabolicamente ativas, padronizados conforme item
4.4, foram incubados em agitador rotatório a 150 rpm, a 28ºC, durante 48 h. Logo após a
fermentação, as amostras foram transferidas assepticamente para tubos de polipropileno de
1,5 mL. A mistura foi centrifugada a 3.500 rpm por 20 min a 4ºC. O sobrenadante foi então
homogeneizado e transferido para outros tubos de polipropileno de 1,5 mL e conservados em
freezer a -1°C até o momento da análise, não ultrapassando o período de 7 dias. Todos os
ensaios enzimáticos foram realizados em duplicata. A determinação da unidade de atividade
da pectina metilesterase foi adaptada de Zocca et al. (2007) e Tiwari et al. (2009) com base na
taxa de proteínas formados, os quais absorvem a 620 nm. Preparou-se, inicialmente, uma
solução de pectina cítrica a 0,5% (p/v), pH 7,5 e uma solução de azul de bromotimol a 0,04%
em tampão fosfato 0,01M pH 7,5, acrescido de NaCl a 0,15M.
A reação constitui-se de 2 mL da solução de pectina, 0,75 mL de água destilada, 0,15
mL da solução de azul de bromotimol, e 0,1 mL da solução de extrato enzimático da amostra
adicionados em tubos de ensaio num volume final de 3,5 mL que foi misturado e
homogeneizado. A mistura então foi incubada a 45° C em banho-maria por 24 h. Logo após
este período foi realizada a leitura a 620 nm em espectrofotômetro UV (Varian, Cary 50)
contra um branco. O branco foi realizado com extrato enzimático fervido por 10 minutos.
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a redução de 0,001 unidades de
absorbância por minuto de reação.
41

Onde lê-se:
A unidade de atividade da pectina metilesterase foi obtida através da seguinte fórmula:
UA é o número de unidades de enzima no volume testado (1 mL) expresso em
µ moles de ácido graxo/tempo de reação,
B é branco do teste,
X é a média dos testes expressa pelo valor da absorbância definido no
espectrofotômetro.
4.9 ATIVIDADE DE PROTEASES EXTRACELULARES PRODUZIDAS EM
FERMENTAÇÃO SUBMERSA
Para a determinação da atividade de protease em fermentação submersa foi utilizado o
meio reacional composto de uma solução de caseína a 2%. Para a reação foram adicionados
1,5 mL de solução de caseína em 1 mL de tampão fosfato pH 7. Todos os tubos de ensaio
foram incubados a 40°C por 15 minutos em banho-maria. Em seguida, a cada tubo de ensaio
foi adicionado 0,5 mL de solução enzimática e após 30 minutos de incubação, foi adicionado
3 mL de uma solução de ácido tricloroacético (TCA) a 0,4 M para interromper a reação
enzimática. Então, o extrato enzimático foi centrifugado durante 15 minutos a 10.000 rpm e o
sobrenadante transferido para outros frascos estéreis e armazenado em freezer a -1°C até a
leitura em espectrofotômetro sob luz UV a 280 nm, não ultrapassando o período de 7 dias.
Os testes foram realizados em duplicata para cada microrganismo. O branco foi
preparado com adição de água ao invés do extrato enzimático. A leitura foi obtida a 280 nm,
sob luz UV no qual a cada aumento de 0, 001 na absorbância por minuto de reação
correspondeu a uma unidade da enzima.
UA = [(B - X)]X1000/0,1
42

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística das atividades enzimáticas foi realizada de acordo com um
delineamento experimental completamente casualizado, com duas ou três repetições,
aplicando-se o teste de Tukey a 5% de probabilidade, com o programa estatístico de análise
de variância ANOVA para comparar as médias dos tratamentos.
43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ENSAIO QUALITATIVO PARA DETECÇÃO DAS ENZIMAS (CUP PLATE)
PECTINASES, PROTEASES, AMILASES, CELULASES E FOSFOLIPASES
Setenta linhagens de leveduras foram testadas quanto à secreção de enzimas
extracelulares, e dentre estas, 56 (80%) apresentaram resultados positivos para a secreção de
pelo menos uma enzima em um dos valores de pH testados e 14 (20%) apresentaram
resultados negativos para todas as enzimas (Gráfico 1). A ausência de atividade pode ser
atribuída à incapacidade de secreção; ao direcionamento da produção ao metabolismo
intracelular ou à insuficiência dos métodos de detecção (VASCONCELOS et al., 2003). O
halo para ser visualizado depende de diversos fatores: além dos parâmetros físicos e químicos
há a interferência da presença de outras substâncias presentes no meio que podem originar
resultados positivos pela reação com os corantes, ou negativos, por precipitar o corante e
ainda por inibir a ligação da enzima com o substrato (NEIROTTI e AZEVEDO, 1988;
COLEN, 2006). Além disso, a atividade enzimática dos microrganismos pode sofrer
interferência tanto dos fatores biológicos bem como físico-químico como pH e temperatura
(SANOMIYA e NAHAS, 2003; MACCHERONI et al., 2004)
De acordo com Giongo et al. (2006) e Gonçalves et al. (2007), a difusão da enzima e,
consequentemente, o tamanho do halo hidrolítico é influenciado pelo peso molecular que a
enzima possui que pode a impedir de difundir pelo ágar e dessa forma, a atividade pode ser
considerada inexistente mesmo havendo a secreção da enzima e presença dela em grande
quantidade no extrato enzimático extraído devido somente a dificuldade da difusão desta.
44

Gráfico 1. Porcentagem de leveduras positivas quanto à atividade enzimática verificados pela observação de
halo produzido pela atividade do extrato obtido do cultivo a 28ºC por 48h e caracterizado a 37ºC com 24h.
5.2 ATIVIDADE DE AMILASE
Atividade enzimática
Foram obtidas a melhor atividade amilolítica para 13 leveduras (18,57%) testadas, o
que pode ser visualizados na Tabela 03 e Gráfico 1. Os melhores resultados de halos
amilolíticos foram obtidos para a linhagem P. membranifaciens C-2.32/2 que apresentou
halos de 1,8 mm em pH 5; 1,5 mm para pH 7 e 1,9 mm em pH 9 (Figura 2). Em relação ao pH
não foi detectado nenhum que demonstrasse ser melhor para as atividades uma vez que todas
secretaram enzimas nos três valores de pH. A atividade amilolítica do presente trabalho foi
também encontrada por Bastos (2005) em isolados de Moniliophtora perniciosa, quanto à
capacidade de produção desta enzima. Na literatura científica são escassos os trabalhos que
encontraram atividade amilolítica positiva secretada por leveduras que foi positiva neste

estudo para 13 leveduras o que demonstra o grande potencial, ainda pouco explorado, das
leveduras em secretar essas enzimas.
Tabela 03. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de amilases secretadas extracelularmente
pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio de cultura suplementado com
indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Linhagem/pH 5 7 9
P. membranifaciens
C - 2. 32/2
Total de Linhagens
positivas
1,8 mm 1,5 mm 1,9 mm
9 6 3
Souza et al. (2008) detectaram a presença desta atividade para fungos
basidiomicéticos, sendo que foram positivos para 40% dos microrganismos testados. De
acordo com Soares et al. (2010) as fontes de carbono obtidas dos substratos amido de farinha
são as mais eficazes para a expressão de amilases.
Figura 2. a. Halos de atividade amilolítica da linhagem P. membranifaciens C-2.32/2 obtido a partir do cultivo
em meio de indução durante incubação por 48h, a 28ºC e 150 rpm, e inoculado em meio sólido a 37ºC por 24h,
46

pH 7. b e c representam a ausência de atividade amilolítica das linhagens P. kluyveri C - 2. 47 e P.
membranifaciens C - 2. 62, respectivamente. Todos os testes foram realizados em triplicata.
5.3 ATIVIDADE DE CELULASE
Dentre todas as enzimas secretadas pelas leveduras a celulase foi a que apresentou
melhor resultado quantitativamente, sendo que das 70 leveduras testadas 35 (50%) foram
positivas para esta atividade (Tabela 04 e Gráfico 1). As melhores atividades, demonstradas
pelos maiores halos, foram encontradas em C. krusei C – 2. 17 de halo 1,4 mm em pH 5; C.
krusei C - 2. 7 e C. gropegiesseri similar C - 1. 33/2 de halos 1,3 mm em pH 7 e halo de 1,2
mm para as linhagens de C. krusei C - 1. 155, C - 2. 91, e C - 2. 75; e para as linhagens de P.
membranifaciens C - 2. 62 e C - 2. 75/2 em pH 9.
Tabela 04. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de celulases secretadas extracelularmente
pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio de cultura suplementado com
indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Linhagem/pH 5 7 9
C. krusei C - 2. 17 1,4 mm - -
C. krusei C - 2. 7
C. gropegiesseri similar
C. krusei C - 1. 155,
C - 2. 91, e C - 2. 75
P. membranifaciens
C - 2. 62 e C - 2. 75/2
- 1,3 mm -
- - 1,2 mm
Total de Linhagens positivas 17 22 20
47

A atividade celulolítica encontrada no presente trabalho foi similar a encontrada por
Costa (1996), para Aspergillus cuja atividade é influenciada por diversos fatores como pH
inicial, tempo de cultivo, concentração do substrato, agitação, concentração do inóculo,
temperatura e tipo de substrato usado no meio de indução da atividade enzimática. Bocchini et
al. (2002), Alam et al. (2008) e Martins et al. (2008), também descrevem essas variáveis como
essenciais para que a produção dessa enzima por microrganismos seja eficiente.
5.4 ATIVIDADE DE FOSFOLIPASE
Para as fosfolipases, 11 (15,71%) leveduras foram positivas. Os melhores halos para
esta enzima foram obtidos de Starmerella sp.2 C - 1. 19/3 com 1,4 mm em pH 5 e no pH 7
para o isolado 1,3 de 2,7 mm de diâmetro. Quanto ao pH não foi detectada nenhuma atividade
no pH 9, enquanto que para os demais valores obteve-se algumas leveduras positivas,
demonstrando a diversidade de enzimas secretadas por esses microrganismos (Tabela 05 e
Gráfico 1). Vasconcelos et al. (2003) constataram que amostras de fungos filamentosos
apresentaram capacidade de produção de fosfolipases.
Tabela 05. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de fosfolipases secretadas extracelularmente
pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio de cultura suplementado com
indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Linhagem/pH 5 7 9
Starmerella sp.2
C - 1. 19/3
1,4 mm - -
1,3 - 1,4 mm -
Total de Linhagens
positivas
6 6 -
48

5.5 ATIVIDADE DE PECTINASE
Foram positivas dentre as leveduras 12 (17,14%) para a atividade pectinolítica (Tabela
06 e Gráfico 1).
Tabela 06. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de pectinases secretadas extracelularmente
pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio de cultura suplementado com
indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Linhagem/pH 5 7 9
P. membranifaciens
C - 1. 78
Candida sp. 4
C - 1. 83/2
Total de Linhagens
positivas
- 3,8 mm -
- - 3,3 mm
- 8 10
Após analisados o tamanho (≥ 2,0 cm) dos halos degradativos percebeu-se que os
melhores resultados foram em relação à esta atividade, atingindo no máximo o tamanho de
3,8 cm, apresentado pela levedura P. membranifaciens C-1.78, que obteve o melhor resultado
para a secreção dessa enzima seguido de P. membranifaciens C-2.94 com halo de 3,5 mm; o
isolado C-1.30 com 3,1 mm; C. gropegiesseri similar C - 1. 33/2 Candida sp. 4 C - 1. 83/2,
com 3,0 mm e Kloeckera apis C - 2. 85 de halo 2,6 mm; todas em pH 7; Candida sp. 4 C -1.
83/2 com halo de 3,3 mm e as linhagens 1,5 e 15 de halo 3,1 mm foram positivas para pH 9
(Figura 3). Os halos degradativos dentre todas as enzimas testadas foram com maior extensão
para esta enzima. Embora em geral o pH ótimo dessa enzima seja 5, neste trabalho não foi
49

detectada nenhuma atividade neste valor, possivelmente devido ao fato de não apresentarem
atividade nos parâmetros que foram testados.
Figura 3. b. Halos de atividade pectinolítica da levedura 1 (ainda não identificada), em pH 7, obtido a partir do
crescimento a 28ºC, durante 48 horas, em meio de indução. a e c Ausência de atividade enzimática pectinolítica
das leveduras 15 e 1.5, respectivamente. Todos os testes foram realizados em triplicata.
Sanchez et al. (1984) analisaram e verificaram que leveduras isoladas da Costa do
Marfim da fermentação do cacau secretaram enzimas pectinolíticas capazes de hidrolizar a
pectina do meio de cultura. Bastos et al. (2005) também avaliaram a capacidade das leveduras
secretarem enzimas pectinolíticas.
Buzzini e Martini (2002) investigaram a atividade pectinolítica extracelular de
microrganismos leveduriformes, e identificaram que isolados de Aureobasidium pullulans e
Pseudozyma antarctica demonstraram capacidade de hidrolisar a pectina, sendo estes isolados
de solo, água, inseto e materiais vegetais coletadas em florestas do Brasil.
Strauss et al. (2001) demonstraram que alguns isolados de Kloeckera apiculata
poderiam ser aplicadas na produção de vinho devido a sua capacidade pectinolítica devido a
formação de halo de degradação bem evidente. Essas leveduras poderiam ser selecionadas
para fermentação de uvas, originando uma melhor clarificação no processo (OLIVEIRA,
2007).
5.6 ATIVIDADE DE PROTEASE
50

Para as proteases 12 linhagens (17,14%) foram positivas (Tabela 07 e Gráfico 1). Os
halos foram de 2,1 mm de diâmetro para o isolado 16 em pH 5; C. krusei C - 2. 42 e o isolado
1,4 formaram halos de 1,6 mm de diâmetro em pH 7 e 9, respectivamente.
Tabela 07. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de proteases secretadas extracelularmente
pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por 48 h, em meio de cultura suplementado com
indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5; 7 e 9).
Linhagem/pH 5 7 9
16 2,1 mm - -
C. krusei C - 2. 42 - 1,6 mm 1,6 mm
1,4 - 1,6 mm 1,6 mm
Total de Linhagens
positivas
5 4 7
Esta atividade foi detectada para fungos filamentosos por Vasconcelos et al. (2003).
Buzzini e Martini (2002) identificaram que Candida magnoliae e Pichia anomala
apresentaram o máximo de atividade proteolítica em pH 6,5; enquanto que a espécie
Pseudozyma sp. demonstrou ótimo de atividade em condições ácidas, no pH abaixo de 1,
resultados que diferenciam-se dos obtidos no presente estudo em que no pH 9 houve o maior
numero de leveduras que secretaram a enzima (Figura 4).
51

Figura 4. Halo de atividade proteolítica das linhagens a. 1.4 b. 3.1 e c. 16 obtidos a partir de cultivo em meio de
indução durante incubação por 48h, a 28ºC e 150 rpm, e inoculado em meio sólido a 37ºC por 24h, pH 5. Todos
os testes foram realizados em triplicata.
5.7 ENSAIO QUALITATIVO DE CUP PLATE PARA DETECÇÃO DE LIPASES
A atividade lipásica em meio solido contendo o substrato específico detectou a
formação de halo quando corantes reagiram com os ácidos graxos liberados, indicando
atividade lipásica (GONÇALVES, 2007). Em relação à atividade de lipase em ensaio
qualitativo foi observado que diversas leveduras foram secretoras de lipases extracelulares
através da metodologia do cup plate com revelação sob luz ultravioleta a 310 nm, onde a
coloração alaranjada fluorescente foi adquirida devido à constituição de complexos que
surgem no ágar formados pelos ácidos graxos que sofreram a hidrólise pela ação da lipase e a
rhodamina B presente no meio de cultura (LOCK, 2007).
As linhagens que mais se destacaram neste teste como boas secretoras de lipases
extracelulares foram as que utilizaram óleo de dendê como substrato. Na Tabela 08
encontram-se os resultados dos testes revelando que 24 (34,28%) linhagens foram positivas
para óleo de dendê; 10 (14,28%) para óleo de mamona e 8 (11,42%) para manteiga de cacau.
Estes resultados podem indicar que os ácidos graxos produzidos pela hidrólise da lipase com
o óleo de mamona e a manteiga de cacau não foram identificados pela especificidade da
52

enzima com o substrato óleo de dendê, ou não originaram um complexo com o corante, ou
ainda, por se depositarem e não conseguirem atravessar a malha do ágar (LOCK, 2007).
No presente trabalho foram utilizados três substratos para a secreção das lipases em
meio de cultivo sólido, outros autores também empregaram diferentes fontes de substratos a
fim de verificar a melhor fonte para a secreção das lipases e constataram que é necessário
padronizar a composição do meio de cultivo e os melhores parâmetros físico-químicos, pois
estes irão interferir diretamente na produção das lipases (LOCK, 2007; COLLEN, 2006;
ROVEDA et al., 2010).
53

Tabela 08. Resultados de atividade lipolítica dos extratos enzimáticos obtidos a partir do cultivo submerso por
48h a 28ºC nos substratos manteiga de cacau, óleo de mamona e óleo de dendê, revelados em meio sólido sob
luz ultravioleta depois de mantidos por 24h a 37ºC.
Código Identificação Cacau Dendê Mamona
pH 5 7 9 5 7 9 5 7 9
1 * - - + - - - - - -
1,1 * - - - - - - - - -
1,11 * - - - - - - - - -
1,12 * - - - - - - - - -
1,2 * - - - - - - - - -
1,3 * - - - + - - - - -
1,4 * - - - - - - - - -
1,5 * - - - - - - - - -
3,1 * - - - - - - - - -
3,2 * - - - - - - - - -
4,2 * - - - - - - - - -
6,1 * - - - + - - - - -
8 * - - - - - - - - -
12 * - - - + - - - - -
14,1 * - - - - - - - - -
15 * - - - - - - - - -
16 * - - - - - - - - -
C - 1. 47/2 C. krusei - - - + - - - - -
C - 1. 72 C. krusei - - - - + - + - +
C - 1. 142 C. krusei - - - - + - - - -
C - 1. 155 C. krusei - - - - - - - - -
C - 1. 182/1 C. krusei - - - - - - - - -
C - 1. 184 C. krusei - - - - - - + - +
C - 2. 7 C. krusei - - - - - - - - -
C - 2. 9 C. krusei - - - - - - - - -
C - 2. 17 C. krusei - - - - - - - - -
C - 2. 45 C. krusei - - - + - + + - -
C - 2. 51 C. krusei - - - - - - - - -
C - 2. 91 C. krusei - - - - - - - - +
C - 2. 102 C. krusei - - - + - - - - -
C - 2. 108 C. krusei - - - - - - - - -
C - 2. 118 C. krusei - - - - + - - - -
C - 2. 121 C. krusei - - - + - - - - -
C - 2. 42 C. krusei - - - - + - - - -
C - 1. 33/2 C. gropegiesseri similar - - + + - - - - +
C - 2. 68 C.parapsilosis - - - + - + - - -
C - 1. 34/3 Candida sp. 7 - - - - - - - - -
54

C - 1. 83/2 Candida sp. 4 - - - + - - - - -
C - 2. 2/2 Cryptococcus sp. - - - - - - + - -
C - 2. 4/2 K. apis - - - + - - - - -
C - 2. 85 K. apis - - - + - - - - -
C - 1. 27/2 K. marxianus - - - + - + - - -
C - 2. 47 P. kluyveri - - - - - - - - -
C - 2. 41 P. kluyveri - - - - - - - - -
C - 1. 78 P. membranifaciens - - - + - - - - -
C - 1. 161 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 1. 167 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 11 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 25 P. membranifaciens - - - - + - - - -
C - 2. 26 P. membranifaciens - - + - - - - - -
C - 2. 32/2 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 40 P. membranifaciens - - - - - - + - -
C - 2. 61 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 62 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 63 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 71 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 73 P. membranifaciens - - - - - - - - -
C - 2. 75/2 P. membranifaciens + - - - - + + - +
C - 2. 82 P. membranifaciens + - - - - - - - -
C - 2. 93/2 P. membranifaciens - - - - + - - - -
C - 2. 94 P. membranifaciens - - - + - - - - -
C - 2. 101/1 P. membranifaciens - - - - - - + - +
C - 2. 126 P. membranifaciens + - - - - - - - -
C - 2. 21/1 S. exigus - - + - - - - - -
C - 1. 19/3 Starmerella sp.2 - - - - - - + - +
C - 1. 18/1 * + - - - - - - - -
C - 1. 30 * - - - + - - - - -
C - 1. 156 * - - - - - - - - -
C - 2. 168 * - - - - - - - - -
C - 1. 186 *
N° total
Total de
linhagens
70 70 70 70 70 70 70 70 70
positivas 4 - 4 16 6 5 8 - 7
% de linhagens
positivas
5,71% 0 5,71% 22,85% 8% 7,14% 11,42% 0 10%
(*) Leveduras que ainda não foram identificadas (+) Atividade positiva (-) Ausência de atividade enzimática C.
krusei = Candida krusei, K.apis = Kloeckera apis, P. membranifaciens = Pichia membranifaciens, K. marxianus
= Kluyveromices marxianus, C. parapsilosis = Candida parapsilosis, C. gropegiesseri similar = Candida
gropegiesseri similar, P. kluyveri = Pichia kluyveri, S. exigus = Saccharomyces exigus
+
55

Neste experimento, a avaliação qualitativa da atividade lipolítica foi obtida pela
visualização de halos alaranjados fluorescentes pela irradiação de luz UV na presença de
corante rodamina B ao redor dos pontos de aplicação em meio sólido formados pela presença
das enzimas e, nesta metodologia, o corante pode influenciar diretamente nos resultados
(Figura 5). Maciel et al. (2010) verificaram que a concentração do corante interferiu
diretamente na obtenção dos resultados nos testes em placa. Esses pesquisadores verificaram
que a concentração de 0,007% (m/v) foi a mais eficiente para detectar a atividade enzimática,
o que contrapõe os resultados encontrados no presente trabalho, no qual foram observados
halos lipolíticos numa concentração menor, de 0,00006% (m/v) de rodamina B.
Figura 5. a Halos de atividade lipolítica da levedura C. parapsilosis C -2.68 sobre o substrato óleo de dendê
obtido do extrato enzimático após crescimento em meio líquido por 48 h a 28ºC, em pH 5. Cada poço representa
uma levedura testada em triplicata na horizontal. b e c. Ausência de atividade enzimática lipolítica das leveduras
P. membranifaciens C - 2. 126 e C. krusei C - 2. 9, respectivamente.
No trabalho de Lock (2007) dentre 56 amostras que foram testadas, 7 (26%) foram
positivas quanto a produção de lipase extracelular pela formação de um precipitado composto
de sais de ácido graxo. Nos resultados do presente trabalho a atividade lipolítica foi melhor
nos valores de pH 5 e 7. Outros autores como, Kamini et al. (2000), Abbas et al. (2002),
Fickers et al. (2006), Lock (2007) também detectaram pH 7 como o ideal para a atividade
lipolítica de microrganismos.
De acordo com Shelley et al. (1987), a taxa de difusão no ágar depende diretamente da
concentração da enzima. Portanto, o resultado do halo de atividade lipolítica produzido por
uma enzima difundida no ágar em relação à outra é proveniente da concentração da proteína
56

no ponto de aplicação e não necessariamente de sua atividade enzimática. Segundo Thompson
et al. (1999) e Collen (2006) os ácidos graxos liberados pela atividade das lipases podem ser
de cadeia longa ou curta, sendo assim os ácidos graxos de cadeia longa não se difundem no
ágar e formam halos mais definidos e próximos a colônia devido à pouca solubilidade em
água, enquanto que os de cadeia curta por se difundirem na malha do ágar, não são tão bem
definidos, possuindo tonalidade mais opaca e difusa.
Além desses fatores, a seleção de microrganismos produtores de lipases depende de
outras variáveis que se relacionam como as condições de crescimento da cepa, produção da
enzima, bem como a especificidade desta pelo substrato utilizado no experimento, e os
parâmetros definidos no teste devem contemplar a condição ótima de atuação de todos estes
fatores. Portanto os testes em placa de detecção da enzima não devem ser utilizados para
comparações quantitativas, e essas interferências podem ser eliminadas com a padronização
das condições de crescimento e dos parâmetros físico-químicos do teste (COLLEN, 2006).
5.8 TESTES QUANTITATIVOS DE DETECÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
5.8.1 Testes de Titulação
Os testes titulométricos são baseados na verificação da presença de ácidos graxos em
solução de NaOH pela reação da enzima com o substrato, na presença de fenolftaleína como
indicador. Os íons de hidrogênio são liberados pela dissociação dos ácidos graxos pela ação
das lipases sobre as moléculas do triglicerídeo. É uma técnica muito utilizada pela sua
simplicidade, precisão e reprodutibilidade (COLLEN, 2006; GONÇALVES, 2007; LOCK,
2007; FARIA, 2010) (Figura 6). A obtenção da enzima envolve a interação de diversas
variáveis como a composição do meio (fonte de carbono, fonte de nitrogênio, sais e
indutores), condições operacionais como pH, temperatura, agitação e aeração (FEITOSA,
2010).
Apesar das lipases serem solúveis em água, catalisam reações de hidrólise sobre
substratos insolúveis, os triglicerídeos, agindo na interface entre o substrato lipídico e a água.
57

Assim que as reações ocorrem o substrato é consumido e formam-se os produtos da hidrólise,
modificando a composição da interface óleo-água. Dessa forma, a atividade catalítica é
influenciada tanto pela concentração do substrato como pela área de interface do substrato
com a água (WATANABE et al., 1977; FARIA, 2010).
Figura 6. Análise da atividade enzimática extracelular do extrato enzimático livre de células utilizando como
substrato a manteiga de cacau, o óleo de mamona e o óleo de dendê cujos ácidos graxos liberados foram
titulados com uma solução de NaOH (0,05M), utilizando 3 gotas de fenolftaleína como indicador de pH e ponto
de viragem detectado pelo surgimento de uma coloração rósea no meio.
No presente trabalho foram utilizados três substratos para a secreção das lipases em
meio de cultivo líquido (Gráfico 2), outros autores também empregaram diferentes fontes de
substratos a fim de verificar a melhor fonte para a produção das lipases e constataram que é
necessário padronizar a composição do meio de cultivo, pois este irá interferir diretamente na
produção das lipases (COLLEN, 2006; LOCK, 2007; ROVEDA et al., 2010).
58

40
35
30
25
20
15
10
5
0
14,28
34,28
11,42
Substratos
Óleo de mamona Óleo de dendê Manteiga de cacau
Gráfico 2. Porcentagem de leveduras positivas verificadas a partir de testes quantitativos titulométricos nos
substratos óleo de mamona, óleo de dendê e manteiga de cacau para atividade lipolítica.
Neste experimento os resultados utilizando o substrato óleo de dendê foram mais
expressivos, pois 23 (32,85%) dos isolados apresentaram resultados maiores que 1,0 U/mL,
sendo que destacaram-se o isolado C - 1. 156 que apresentou 2,25 U/mL de atividade e Pichia
membranifaciens C - 1. 161 com 2,21 U/mL (Tabela 09). Nos isolados testados com o óleo de
mamona apenas 3 leveduras apresentaram valores de atividade enzimática maiores que 1,0
U/mL enquanto que utilizando a manteiga de cacau foi possível observar que nenhum dos
isolados apresentou resultado de atividade enzimática maior que 1,0 U/mL. Roveda (2010)
analisou 21 fungos para esta atividade pertencentes aos gêneros Aspergillus e Penicilium, e
verificou que as atividades lipolíticas máximas foram de 1,250 U, 2,042 U e 2,250 U.
Óleos e gorduras diferenciam-se pelas suas propriedades físicas e quanto à
composição de ácidos graxos em suas moléculas. Óleos são líquidos em temperatura ambiente
enquanto gorduras são sólidas (25ºC). Os óleos e gorduras vegetais consistem de moléculas
de triacilglicerídeos, as quais são constituídas de três ácidos graxos de cadeia longa ligados na
forma de ésteres e uma molécula de glicerol. Em óleos, os ácidos graxos de suas cadeias
carbônicas são formados predominantemente por ligações insaturadas e as gorduras são
formadas principalmente por ligações saturadas. Esses ácidos graxos variam na extensão da
cadeia carbônica, no número, orientação e posição das ligações duplas (GERIS et al.,2007).
59

Tabela 09. Resultados da atividade lipolítica dos extratos enzimáticos obtidos das leveduras isoladas da
fermentação do cacau nos substratos manteiga de cacau, óleo de mamona e óleo de dendê, obtido pela titulação
dos ácidos graxos solúveis em solução de NaOH e de fenolftaleína como indicador.
Código Identificação
Mamona
(U/mL)**
Dendê
(U/mL)**
Cacau
(U/mL)**
1 * 0,22 1,43 0,37
1,1 * 0,3 0,75 0,22
1,11 * 0,22 0,5 0,12
1,12 * 0,23 1,33 0,22
1,2 * 0,27 0,56 0,25
1,3 * 0,2 0,7 0,15
1,4 * 0,27 0,83 0,28
1,5 * 0,3 0,75 0,35
3,1 * 0,23 1,11 0,35
3,2 * 0,25 1,1 0,4
4,2 * 0,21 0,76 0,22
6,1 * 0,23 1,16 0,31
8 * 0,25 2,05 0,4
12 * 0,31 1,33 0,28
14,1 * 1,25 2,25 0,52
15 * 0,38 0,83 0,11
16 * 0,3 0,86 0,51
C - 1. 47/2 C. krusei 0,23 0,8 0,28
C - 1. 72 C. krusei 0,26 0,65 0,43
C - 1. 142 C. krusei 0,23 0,85 0,43
C - 1. 155 C. krusei 0,21 0,91 0,48
C - 1. 182/1 C. krusei 0,23 0,78 0,5
C - 1. 184 C. krusei 0,42 0,7 0,23
C - 2. 7 C. krusei 0,3 0,86 0,48
C – 2. 9 C. krusei 0,26 1 0,28
C - 2. 17 C. krusei 0,21 1,16 0,28
C - 2.45 C. krusei 0,3 0,91 0,21
C - 2. 51 C. krusei 0,26 0,76 0,38
C - 2. 91 C. krusei 0,28 0,83 0,4
C - 2. 102 C. krusei 0,25 0,86 0,38
C - 2. 108 C. krusei 0,13 1,05 0,35
C - 2. 118 C. krusei 0,23 2 0,23
C - 2. 121 C. krusei 0,25 1 0,11
C - 2. 42 C. krusei 0,28 0,86 0,38
C - 1. 33/2 C. gropegiesseri similar 1,75 2,38 0,25
C - 2. 68 C.parapsilosis 0,2 1,08 0,36
C - 1. 34/3 Candida sp. 7 0,25 0,96 0,28
60

C - 1. 83/2 Candida sp. 4 0,2 0,8 0,15
C - 2. 2/2 Cryptococcus sp. 0,25 1,1 0,23
C - 2. 4/2 K. apis 0,25 0,66 0,31
C - 2. 85 K. apis 0,16 1,38 0,26
C - 1. 27/2 K. marxianus 0,3 1,36 0,23
C - 2. 47 P. kluyveri 0,18 0,83 0,11
C - 2. 41 P. kluyveri 0,18 1,48 0,6
C - 1. 78 P. membranifaciens 0,23 1,38 0,33
C - 1. 161 P. membranifaciens 0,23 2,21 0,51
C - 1. 167 P. membranifaciens 0,18 1 0,36
C - 2. 11 P. membranifaciens 0,25 0,33 0,28
C - 2. 25
P. membranifaciens
C - 2. 26 P. membranifaciens
0,283 0,71 0,4
0,23 0,78 0,4
C - 2. 32/2 P. membranifaciens 0,23 0,63 0,36
C - 2. 40 P. membranifaciens 0,2 0,75 0,43
C - 2. 61 P. membranifaciens 0,36 0,88 0,38
C - 2. 63 P. membranifaciens 0,23 0,78 0,28
C - 2. 71 P. membranifaciens 0,28 1,63 0,23
C - 2. 73 P. membranifaciens 0,25 0,95 0,4
C - 2. 75/2 P. membranifaciens 0,33 0,71 0,36
C - 2. 82 P. membranifaciens 0,23 0,25 0,517
C - 2. 93/2 P. membranifaciens 0,18 0,63 0,26
C - 2. 94 P. membranifaciens 1,75 0,66 0,35
C - 2. 101/1 P. membranifaciens 0,15 0,75 0,28
C - 2. 126 P. membranifaciens 0,25 0,83 0,36
C - 2. 21/1 P. membranifaciens 0,41 1,35 0,15
C - 1. 19/3 S. exigus 0,28 0,78 0,43
C - 1. 18/1 Starmerella sp.2 0,3 0,85 0,26
C - 1. 30 * 0,25 0,63 0,41
C - 1. 156 * 0,28 2,25 0,23
C - 2. 168 * 0,16 1,35 0,31
C - 1.186 * 0,21 0,68 0,1
N° total * 70 70 70
Total de linhagens
positivas
% de linhagens
positivas
70 70 70
100% 100% 100%
(*) Leveduras que ainda não foram identificadas (**) Os resultados representam a média de três repetições.
C. krusei = Candida krusei, K.apis = Kloeckera apis, P. membranifaciens = Pichia membranifaciens, K.
marxianus = Kluyveromices marxianus, C. parapsilosis = Candida parapsilosis, C. gropegiesseri similar =
Candida gropegiesseri similar, P. kluyveri = Pichia kluyveri, S. exigus = Saccharomyces exigus
61

As lipases possuem a propriedade de hidrolisar um grupo de substratos específico
(especificidade de substrato), em geral relacionado ao tamanho da cadeia carbônica, à
insaturação e a posição desta no triglicerídeo. Óleo de dendê é composto de proporções iguais
de ácidos graxos saturados C16:0 palmítico (44%) e C18:0 esteárico (5%) e insaturados
C18:1 oléico (40%) e C18:2 linoléico (10%), cujo ácido graxo principal é o palmítico
formado de C16:0 átomos de carbonos. O óleo de mamona contém 90% de ácido graxo
ricinoléico em sua constituição que é insaturado formado de 18:1 carbonos, possui uma
hidroxila (OH) no carbono 12 e uma ligação dupla cis entre carbonos 9 e 10 (FAGUNDES et
al., 2005; FALCONE, 2009). A manteiga de cacau é formada de ácidos palmítico C16:0
(25,65 a 35,33%), oléico C18:1 (32,64 a 34,74 %) e esteárico C18:0 (29,69 e 37,24%)
(FACIOLI e GONÇALVES, 1998). Sendo assim, pode-se inferir que as lipases produzidas
pelos microrganismos deste estudo agiram mais especificamente sobre o substrato óleo de
dendê. Isto ocorre devido à estrutura e a forma do sítio ativo da enzima que provavelmente
reage melhor com esses ácidos graxos (BORZANI, 2001).
De acordo com Falcone et al. (2009) a produção de lipases por fungos filamentosos é
influenciada pelo tipo e concentração de fontes de C e N, pelo pH do meio de cultivo, pela
temperatura de crescimento e pela concentração de oxigênio dissolvido. As fontes de carbono
lipídicas, como ácidos graxos, são eficientes para estimular a secreção de lipases embora
alguns microrganismos não dependam de substratos indutores para secretar extracelularmente
essas enzimas, estes compostos podem aumentar a quantidade desta (TAN et al., 2003).
5.8.2 Testes espectrofotométricos de Pectinases e Proteases
Nos testes quantitativos realizados com as linhagens de leveduras foram positivas 68
(97%) para pectinases e 62 (88%) para as proteases. Estes resultados diferiram dos obtidos
nos testes em placa (Tabela 10 e Gráfico 3).
62

Tabela 10. Resultados das atividades de Pectina metilesterase (U/mL) e a Atividade de Proteases (U/mL) dos
extratos enzimáticos obtidos a partir do cultivo das leveduras isoladas da fermentação do cacau em meio de
indução suplementado com pectina cítrica e gelatina, respectivamente.
Leveduras Identificação UA PME (U/mL) Leveduras Identificação UA P (U/mL)
C - 2. 102 C. krusei 1960±0,007 abcdef ** C - 2. 121 C. krusei 6735,84±0,043 ab**
C - 1. 156 * 1890±0,0 abcdef C - 1. 72 C. krusei 4029,41±0,040 ab
C - 2. 118 C. krusei 1740±0,009 abcdef 12 * 3946,96±0,062 ab
C - 2. 61 P. membranifaciens 1740±0,0 a C - 2. 63 P. membranifaciens 3393,93±0,04 ab
C - 2. 51 C. krusei 1690±0,003 abcd C - 1. 19/3 Starmerella sp.2 2711,86±0,00 a
C - 2. 63 P. membranifaciens 1680±0,003 abc C - 2. 25 P. membranifaciens 2621,21±0,038 ab
C - 2. 71 P. membranifaciens 1660±0,005 abcdefg C - 2. 61 P. membranifaciens 2423,07±0,021 ab
C - 2. 25 P. membranifaciens 1655±0,004 abcdef C - 2. 85 K. apis 1988,88±0,025 ab
1,12 * 1640±0,002 abcdef C - 1. 34/3 Candida sp. 7 1867,34±0,033 ab
1,2 * 1625±0,005 abcdefg C - 1. 155 C. krusei 1720,43±0,062 ab
C - 2. 21/1 S. exigus 1610±0,013 abc C - 2. 71 P. membranifaciens 1566,26±0,014 ab
16 * 1530±0,009 abcdef C - 2. 11 P. membranifaciens 1563,73±0,007 ab
C - 2. 62 P. membranifaciens 1535±0,009 ab C - 2. 68 C.parapsilosis 1469,13±0,031 b
C - 1. 155 C. krusei 1505±0,001 abcdef 1,12 * 1360,46±0,080 ab
1,1 * 1480±0,010 abcdef C - 1. 83/2 Candida sp. 4 1291,66±0,016 ab
1,4 * 1445±0,011 abcdef C - 2. 108 C. krusei 1239,58±0,031 ab
1,11 * 1410±0,011 bcdfg C - 2. 4/2 K. apis 1194,17±0,044 ab
C - 1. 182/1 C. krusei 1410±0,005 abcdef 3,1 * 1092,3±0,039 ab
C - 1. 34/3 Candida sp. 7 1350±0,013 abcdef C - 2. 82 P. membranifaciens 1089,96±0,018 ab
C - 1. 27/2 K. marxianus 1350±0,013 abcdefg C - 2. 7 C. krusei 1044,11±0,039 ab
1,3 * 1310±0,013 abcdef 16 * 1000±0,044 ab
C - 2. 91 C. krusei 1270±0,008 bcdefg 1,5 * 1000±0,023 ab
C - 2. 42 C. krusei 1260±0,029 abcdef C - 2. 9 C. krusei 898,14±0,019 ab
C - 2. 85 K. apis 1260±0,029 abcdef C - 2. 21/1 S. exigus 887,82±0,007 ab
C - 1. 78 P. membranifaciens 1255±0,007 bcdefg 3,2 * 797,87±0,033 ab
C - 2. 73 P. membranifaciens 1250±0,006 abcdef C - 1. 156 * 797,61±0,000 ab
C - 2. 82 P. membranifaciens 1240±0,013 bcdefg C - 2. 126 P. membranifaciens 788,88±0,039 a
3,2 * 1235±0,011 abcdef C - 2. 42 C. krusei 786,72±0,014 ab
C - 2. 2/2 Cryptococcus sp. 1230±0,028 abcdef C - 1. 182/1 C. krusei 760,68±0,00 ab
C - 1. 167 P. membranifaciens 1210±0,008 abcdefg C - 2. 168 * 750,85±0,013 ab
C - 2. 108 C. krusei 1195±0,007 abcdef C - 1. 27/2 K. marxianus 720,27±0,073 ab
C-1. 72 C. krusei 1180±0,005 abcdefg 1,11 * 712,32±0,004 ab
12 * 1170±0,003 a 4,2 * 650,19±0,051 ab
C - 1. 184 C. krusei 1060±0,009 abcdef C - 1. 142 C. krusei 628,2±0,136 ab
C - 1. 186 * 1160±0,002 a bcdef C - 1. 18/1 * 606,06±0,013 a
C - 2. 45 C. krusei 1160±0,001 abcdef C - 2. 41 P. kluyveri 553,71±0,004 ab
15 * 1150±0,001 abcdefg 14,1 * 535,39±0,005 ab
C - 1. 19/3 Starmerella sp.2 1140±0,014 abcde C - 2. 40 P. membranifaciens 517,73±0,036 ab
63

C - 2. 121 C. krusei
1140±0,001 abcdefg C - 1. 33/2 C. gropegiesseri
similar
508,26±0,035 ab
14,1 * 1120±0,022 a C - 1. 167 P. membranifaciens 507,37±0,019 ab
C - 2. 68 C.parapsilosis 1120±0,0005 bcdef C - 1. 47/2 C. krusei 474,02±0,036 ab
C - 2. 126 P. membranifaciens 1110±0,024 abcdef C - 2. 73 P. membranifaciens 469,05±0,025 b
6,1 * 1100±0,016 abcdef C - 2. 2/2 Cryptococcus sp. 465,47±0,063 ab
C - 2. 41 P. kluyveri 995±0,015 bcdef C - 2. 118 C. krusei 462,36±0,015 ab
C - 2. 40 P. membranifaciens 980±0,025 abcdefg C - 2. 62 P. membranifaciens 450,51±0,040 a
C - 2. 4/2 K. apis 980±0,006 bcdefg C - 1. 78 P. membranifaciens 439,02±0,017 ab
C - 2. 17 C. krusei 980±0,001 abcdef C - 2. 47 P. kluyveri 422,22±0,036 ab
C - 1. 47/2 C. krusei 980±0,001 defg 8 * 410,13±0,044 ab
4,2 * 970±0,012 bcdfg C - 2. 94 P. membranifaciens 399,14±0,016 ab
C - 2. 9 C. krusei 920±0,008 bcdef C - 2. 93/2 P. membranifaciens 371,64±0,048 ab
C - 2. 7 C. krusei 910±0,037 abcdefg C - 2. 45 C. krusei 351,51±0,044 ab
C - 1. 83/2 Candida sp. 4 910±0,001 bcdef 15 * 351,56±0,013 a
C - 1. 142 C. krusei 910±0,001 bcdefg 1,3 * 335,82±0,004 ab
1 * 880±0,001 abcdefg C - 2. 51 C. krusei 325,24±0,033 ab
C - 1. 33/2 C. gropegiesseri
similar
850±0,001 abcdefg C - 2. 32/2 P. membranifaciens 291,26±0,019 ab
C - 2. 32/2 P. membranifaciens 850±0,001 cdefg C - 2. 75/2 P. membranifaciens 259,54±0,000 ab
C - 1. 30 * 810±0,022 a 6,1 * 233,67±0,00 ab
3,1 * 780±0,011 cdfg C - 2.26 P. membranifaciens 229,16±0,000 ab
C - 1. 161 P. membranifaciens 770±0,03 gh 1 * 226,13±0,056 ab
C - 2. 11 P. membranifaciens 740±0,025 bcdef C - 2. 91 C. krusei 201,63±0,00 ab
C - 2. 94 P. membranifaciens 730±0,009 bcdef C - 1. 184 C. krusei 115,38±0,039 ab
C - 2. 168 * 710±0,024 defg C - 1. 161 P. membranifaciens 19,04±0,036 ab
C - 2. 101/1 P. membranifaciens 710±0,011 efg 1,1 * 0
1,5 * 710±0,002 bcdfg 1,2 * 0
C - 1. 18/1 * 670±0,012 bcdefg 1,4 * 0
C - 2. 47 P. kluyveri 440±0,009 bcdef C - 2. 17 C. krusei 0
C - 2. 93/2 P. membranifaciens 440±0,009 efg C - 2. 102 C. krusei 0
C - 2. 26 P. membranifaciens 360±0,006 h C - 2. 101/1 P. membranifaciens 0
8 * 0 C - 1. 30 * 0
C-2. 75/2 P. membranifaciens 0 C - 1. 186 * 0
N° total 70 70
Total de
linhagens
positivas
% de linhagens
positivas
68 62
97,14% 88,57%
UAPME = Atividade enzimática de Pectina metilesterase UA P = Atividade enzimática de Protease (*) Leveduras
que ainda não foram identificadas. (**) Os resultados representam média de duas repetições. Resultados de
média ± desvio padrão. Médias seguidas de letras diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) pelo teste
de Tukey. C. krusei = Candida krusei, K.apis = Kloeckera apis, P. membranifaciens = Pichia membranifaciens,
64

K. marxianus = Kluyveromices marxianus, C. parapsilosis = Candida parapsilosis, C. gropegiesseri similar =
Candida gropegiesseri similar, P. kluyveri = Pichia kluyveri, S. exigus = Saccharomyces exigus. As amostras
em negrito foram as que apresentaram resultado positivo quando avaliados com a metodologia de cup plate.
Os valores obtidos neste estudo para a atividade enzimática podem ser originados do
fato de os parâmetros de temperatura e pH testados não serem os valores ótimos de atividade
dessas enzimas, ou mesmo o tempo requerido para a atividade, o pH e a temperatura
estabelecidos não serem os valores ótimos para a estabilidade dessas enzimas (MASOUDE e
JEPPERSEN, 2006). Oliveira et al. (2006) preconizaram que os halos de degradação em placa
não representam obrigatoriamente a atividade pectinolítica de Saccharomyces cerevisiae.
98
96
94
92
90
88
86
84
82
97
88
Pectina cítrica Gelatina
Gráfico 3. Porcentagem de leveduras positivas verificadas a partir de testes quantitativos espectrofotométricos
sobre os substratos Pectina cítrica e Gelatina para as atividades pectinolítica e proteolítica, respectivamente.
No presente estudo os maiores valores encontrados para atividade de pectina
metilesterase foram de 1960 U/mL para C. krusei C - 2.102 e de 1890 U/mL para o isolado
não identificado C - 1. 156. Domingues (2010) analisou 35 leveduras isoladas da fermentação
de amêndoas de cacau pertencentes aos gêneros Kluyveromyces, Candida, Phiccia, e dentre
estas 62% apresentaram resultados positivos para a atividade pectinolítica, embora essas
espécies tenham sido negativas para a produção de pectina metilesterase. Masoude e
65

Jeppersen (2006) também não encontraram atividade de pectina metilesterase em linhagens de
leveduras como Pichia anomala, Pichia kluyveri e Hanseniaspora. Este resultado ressalta o
potencial das leveduras do presente trabalho em secretarem estas pectinases.
A fermentação é fundamental para a produção das características sensoriais do
chocolate, e a sucessão de microrganismos na polpa mucilaginosa que envolve as amêndoas
do cacau poderia promover a redução da quantidade de pectina e conduzir para uma
degradação mais eficiente da mucilagem se houver a presença de microrganismos
pectinolíticos. Dessa maneira um inóculo iniciador com leveduras pectinolíticas pode render
um chocolate de melhor qualidade, também originando uma melhoria no processamento
(SCHWAN e WHEALS, 2004; OLIVEIRA, 2007).
No que se refere às proteases, as melhores atividades proteolíticas foram observadas
em C. krusei C - 2.121 com 3946,96 U/mL e pela linhagem 12 de 6735,84 U/mL. Silva-
Neves et al. (2006) analisaram 50 leveduras e Candida intermedia foi a que demonstrou
maior atividade proteolítica por meio da fermentação submersa. Fleuri (2008) também
detectou a secreção de proteases pela linhagem fúngica de Cellulosimicrobium cellulans. Os
valores para a atividade proteolítica verificados neste estudo para algumas leveduras foram
superiores aos valores obtidos pelos pesquisadores referidos anteriormente, o que demonstra o
grande potencial destas leveduras no que se refere à secreção desta enzima.
5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na análise estatística da atividade pectinolítica e proteolítica foram considerados os 2
valores de atividade encontrados para cada levedura (Tabela 05). A comparação de médias
feita pela análise de variância com intervalo de confiança de 95% indicou que as atividades
obtiveram diferença significativa entre grupos (p

6 CONCLUSÕES
Todas as leveduras analisadas no presente estudo foram reativadas, purificadas e
depositadas na CCMB (Coleção de Cultura de Microrganismos da Bahia) e os resultados
obtidos quanto à secreção extracelular de enzimas complementaram as informações
biotecnológicas destas leveduras depositadas no acervo.
Exceto para as pectinases no pH 5 e fosfolipases nos pH 5 e 7, as leveduras testadas
secretaram amilases, celulases, proteases e lipases extracelulares sob condições básicas,
ácidas e neutras para todas as enzimas que foram testadas pela metodologia do cup plate. O
substrato óleo de dendê foi o melhor para detecção das lipases tanto em testes em meio sólido
quanto nos testes titulométricos. As leveduras demonstraram atividade pectinolítica com halos
de degradação de maior extensão, em comparação com as demais enzimas testadas. Os testes
quantitativos demonstraram que as linhagens estudadas são boas produtoras de enzimas
pectinolíticas e proteolíticas.
O presente estudo verificou que as leveduras isoladas da fermentação do cacau para
produção do chocolate por secretarem as enzimas em tempo curto de crescimento e
fermentação em caldo de cultura de custo baixo e em diferentes valores de pH, podem ser
uma fonte promissora de enzimas extracelulares de interesse e aplicação industrial e
biotecnológica, principalmente naqueles processos que envolvem o processamento de
alimentos.
67

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78

APÊNDICE
79

Tabela 01. Medida dos halos de degradação (em mm) da atividade de enzimas secretadas extracelularmente pelas leveduras testadas obtidas após crescimento a 28ºC, por
48 h, em meio de cultura suplementado com indutor para cada enzima e testada a 37ºC por 24 h, em três valores de pH (5,0; 7,0 e 9,0).
pH
Linhagem Identificação
Amilases** Celulases** Fosfolipases** Pectinases ** Proteases**
5 7 9 5 7 9 5 7 9 5 7 9 5 7 9
* 1±0,05 1,2±0,0 - - - - - 1,1±0,058 - - 1± 0,1 2,8±0,1 1,7±0,15 - -
1,1 * - - - - - - - 1±0,0 - - - - - - -
1,11 * - - - - - - - - - - - - - - -
1,12 * - - - - - - - 1,1±0,0 - - - - - - -
1,2 * - - - - - - 1,3±0,05 1,4±0,0 - - - - - - -
1,3 * - - - - - - - 2,7±0,11 - - - - - - -
1,4 * 1,1±0,05 - - - - - - - - - - - 1,7± 0,1 - 1,6±0,058
1,5 * - - - - - - - - - - - 3,1±0,10 - - 1,2±0,153
3,1 * 0,5±0,05 - - - - - - - - - - - 1,8 ± 0,05 - -
3,2 * - - - - - - - - - - - 1,9±0,1 - - -
4,2 * - - - - - - - - - - - - - - -
6,1 * 1,1±0,1 - - - - - - - - - - - 1,2±0,058 - -
8 * - - - - - - - 0,9±0,05 - - - - - - -
12 * - - - - - - 1±0,0 - - - - - - - -
14,1 * - - - - - - - - - - - 2,1±0,1 - - -
15 * - - - - - - - - - - - 3,1±0,1 - - 1±0,0
16 * 1,2±0,058 - - - - - - - - - - - 2,1±0,1 - -
C - 1. 47/2 C. krusei - - - 0,9±0,05 - 0,9±0,0 1,3±0,1 - - - - - - - -
C - 1.72 C. krusei - - - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 142 C. krusei - - - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 155 C. krusei - - - - - 1,2±0,2 - - - - - - - - -
C – 1. 82/1 C. krusei - - - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 184 C. krusei - - - 0,9±0,1
C - 2. 7 C. krusei - - - 0,9±0,05
1±0,0 1±0,0
1,3±0,2
- - - - - - - - -
- - - - - - - - - -

C - 2. 9 C. krusei - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 17 C. krusei 1±0,1 1,2±0,0 - 1,4±0,1
1,1±0,2
1,1±0,05 - - - - - - - - -
C - 2. 45 C. krusei - - - - 1±0,05 1,1±0,1 - - - - - - - 1±0,1 1,3±0,1
C - 2. 51 C. krusei - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 91 C. krusei - - - - - 1,2±0,2 - - - - - - - - -
C - 2. 102 C. krusei - - - 1,1±0,05 1,2±0,1 - - - - - - - -
C - 2. 108 C. krusei - - -
C - 2. 118 C. krusei - - -
C - 2. 121 C. krusei - -
1,1±0,05
1,2±0,2 - 1,2±0,1
1,1±0,05 1±0,0
1,2±0,1 1,2±0,1 - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - -
C - 2. 42 C. krusei - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 33/2
C. gropegiesseri
similar
- - - -
C - 2. 68 C.parapsilosis - - - -
1,3±0,05
1±0,0
- - - - -
3±0,05 1,2±0,1
1,6±0,05 1,3±0,1
- - -
- - - - - - - - - -
C - 1. 34/3 Candida sp. 7 - - - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 83/2 Candida sp. 4 - - - - - - - - - - 3±0,1 3,3±0,1 - - -
C - 2. 2/2 Cryptococcus sp. - - 1,1±0,2 1±0,0
C - 2. 4/2 K. apis - - - -
1,1±0,1
1,1±0,05 0,9±0,1
- - - - - - - - - -
- - - - - - - - -
C - 2. 85 K. apis - - - - - - - - - - 2,6±0,3 2,9±0,05 - - -
C - 2. 27/2 K. marxianus - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 47 P. kluyveri - - -
1,1±0,1 1±0,05
- - - - - 1±0,1 - - - -
C - 2. 41 P. kluyveri - - - - - - - - - - - - - - -
C - 1. 78 P. embranifaciens - - - - - - - - - - 3,8±0,1 2±0,05 - - -
C - 1. 161 P. membranifaciens - - - - - -
1,2±0,1
- - - - - - - -
81

C - 1. 167 P. membranifaciens - - -
1,1±0,05
- -
1,3±0,1
- - - - - - - -
C - 2. 11 P. membranifaciens - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 25 P. membranifaciens - - -
C - 2. 26 P. membranifaciens - - - -
1,1±0,05 0,9 ±0,1
1,1±0,1
- - - - - - - - - -
- - - - - - - - - 1±0,1
C - 2. 32/2 P. membranifaciens 1,8±0,05 1,5±0,1 1,9±0,2 1,2±0,1 1,1±0,05 - - - - - - - - - -
C - 2. 40 P. membranifaciens
C - 2. 61 P. membranifaciens
1,2±0,2
1,3±0,1
- - - - - - - - - - - - - -
1,3±0,1 - - -
C - 2. 62 P. membranifaciens - - - - 1,1±0,05
C - 2. 63 P. membranifaciens - - - -
C - 2. 71 P. membranifaciens -
1±0,1 -
-
1±0,0
1,2±0,1
1±0,0 1,1±0,1
1,1±0,1 0,9±0,2
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
C - 2. 73 P. membranifaciens - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 75/2 P. membranifaciens - - - - -
1,2±0,1
- - - - - - - - -
C - 2.82 P. membranifaciens - - - - - - - - - - - - - - -
C - 2. 93/2 P. membranifaciens - - -
C - 2. 94 P. membranifaciens - - -
1±0,1 1,1±0,1 1±0,0
1,2±0,1
C - 1. 101/1 P. membranifaciens - - - -
-
0,9±0,05
C - 2. 126 P. membranifaciens - - - - -
C - 2. 21/1 S. exigus - - - 1±0,0 -
1,1±0,05
- - - - - - - - -
- - - -
3,5±0,05
- - - -
- - - - - - - - - -
0,9±0,1
1,1±0,0
C - 1. 19/3 Starmerella sp.2 - - - - 1,1±0,1 1,1±0,05
- - - - - - - - -
- - - - - - - 0,9±0,0 -
1,4±0,1
- - - - - - - -
C - 1. 18/1 * - - - 0,9±0,1 - - - - - - - - - - -
82

C - 1. 30 * - - - 1±0,05 1,1±0,05 - - - - - 3,1±0,1 2,5±0,1
C - 1. 156 * - 0,9±0,3 - 1±0,0 -
C - 2. 168 * - - - - -
(*) Leveduras que ainda não foram identificadas (**) Os resultados representam média de três repetições. Resultados de média ± desvio padrão. C. krusei = Candida krusei, K.apis = Kloeckera
apis, P. membranifaciens = Pichia membranifaciens, K. marxianus = Kluyveromices marxianus, C. parapsilosis = Candida parapsilosis, C. gropegiesseri similar = Candida gropegiesseri
similar, P. kluyveri = Pichia kluyveri, S. exigus = Saccharomyces exigus
1±0,1
1±0,2
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
C - 1. 186 * - - - - - - - - - - - - - - -
N° total
Total de
linhagens
positivas
% de
linhagens
positivas
70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70
9 6 3 17 22 20 6 6 - - 8 10 5 4 7
12,85% 8,57% 4,28% 24,28% 31,42% 28,57% 8,57% 8,57% 0% 0% 11,42% 14,28% 7,14% 5,71% 10%
83