Validação do método Colilert-18/Quanti-Tray para contagem de E ...

Validação do método Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
para contagem de E. coli e bactérias
coliformes em água
janeiro de 2008
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Validação do método Colilert-18/Quanti-Tray
para contagem de E. coli e bactérias
coliformes em água
IDEXX LABORATORIES, INC
ONE IDEXX DRIVE
WESTBROOK, MAINE 04092
ESTADOS UNIDOS
VERSÃO FINAL CORRIGIDA, 30 de janeiro de 2008

Validação do método Colilert ® -18/Quanti-Tray ® para contagem de
E. coli e bactérias coliformes em água
1 Introdução
O método Colilert ® -18/Quanti-Tray ® é um ensaio criado especificamente para
contagem NMP de E. coli e bactérias coliformes em água, potável ou não, com ou sem
tratamento.
O Colilert-18 mede simultaneamente o total de coliformes e de E. coli em amostras de
água. A base do ensaio é a tecnologia de substrato definido (DST, sigla em inglês de
Defined Substrate Technology). O método consiste em misturar o reagente DST com
100 ml de amostra e incubar em um ensaio tipo presença/ausência (PA) ou tipo
número mais provável (NMP). A amostra adquire cor amarela quando as bactérias
coliformes metabolizam o ONPG, que serve como nutriente e indicador, e fluoresce
sob luz UV quando a E. coli metaboliza o MUG, um outro nutriente e indicador. O
Colilert-18 permite detectar essas bactérias simultaneamente à concentração de 1
ufc/100 ml em 18 horas na presença de bactérias heterotróficas em concentrações de
até 2 x 10 6 por 100 ml de amostra.
O Quanti-Tray foi projetado para produzir contagens quantitativas de bactérias de
amostras de até 100 ml usando reagentes DST. A mistura reagente-amostra é
adicionada a uma placa Quanti-Tray, que é então selada com o selador Quanti-Tray
Sealer e depois incubada. A placa é projetada de forma a conter 51 cavidades com a
mistura reagente-amostra após a selagem. O selador é uma ferramenta motorizada de
selagem por calor, projetado para selar a Quanti-Tray. Em seguida, as cavidades
positivas são contadas e os NMPs de bactérias coliformes e/ou E. coli são
determinados a partir de uma tabela.
2 Aplicações do Colilert-18/Quanti-Tray
A principal aplicação do Colilert ® -18/Quanti-Tray ® é a análise de águas, potáveis ou
não. O Colilert-18/Quanti-Tray já foi aprovado para tal aplicação na América do Norte
(EUA, Canadá e México), América do Sul (Brasil, Argentina, Chile e Colômbia), Europa
(Dinamarca, Alemanha, Hungria, Islândia, Irlanda, Itália, Noruega, Espanha e Reino
Unido) e Extremo Oriente (Japão e Coréia). Também já foi aprovado para análise de
água engarrafada pela International Bottled Water Association e de água purificada
para uso farmacêutico pela US Pharmacopeial Convention. Nos EUA, a Agência de
Proteção Ambiental (USEPA) já sancionou o Colilert-18/Quanti-Tray para pesquisa de
coliformes e E. coli em água de fontes e em águas subterrâneas e pesquisa de E. coli
em águas ambientais, águas para uso recreativo e águas residuais.
3 Identificação de organismos-alvo (ISO/TR 13843 Seções 10.2.1 e 9.2)
No método Colilert ® -18/Quanti-Tray ® , as bactérias coliformes são aquelas que
produzem coloração amarela por meio da ação da β-galactosidase sobre o
ortonitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG), e a E. coli é definida como uma bactéria
coliforme que apresenta fluorescência azul sob luz UV devido à ação da
β-glicuronidase sobre o 4-metilumbeliferil-β-D-glicuronídeo (MUG).
1

3.1 Teste em cultura pura (ISO/TR 13843 Seção 10.2.1)
As definições das reações promovidas por bactérias-alvo e por outras bactériasforam
confirmadas testando o Colilert-18/Quanti-Tray com culturas puras de cepas de
referência de E. coli, bactérias Gram-negativas coliformes e não-coliformes obtidasda
American Type Culture Collection. A Tabela 1 mostra as reações típicas dessas cepas
de referência, que são usadas pela IDEXX para controle de qualidade de rotina do
Colilert-18/Quanti-Tray.
Tabela 1 Cepas de referência de E. coli, bactérias coliformes e outras bactérias
Gram-negativas para confirmação das reações positivas e negativas
típicas na placa Colilert ® -18/Quanti-Tray ® .
Bactéria Nº. ATCC* Reação no Colilert-18
Escherichia coli 25922
Forte coloração amarela
Forte fluorescência azul sob UV
Citrobacter freundii 8090
Forte coloração amarela
Não fluoresce sob UV
Klebsiella pneumoniae 31488
Forte coloração amarela
Não fluoresce sob UV
Enterobacter aerogenes 13048
Forte coloração amarela
Não fluoresce sob UV
Pseudomonas aeruginosa 10145
Não cresce
Sem coloração amarela
Não fluoresce sob UV
Aeromonas hydrophila 35654
Não cresce
Sem coloração amarela
Não fluoresce sob UV
* American Type Culture Collection (coleção de cepas bacterianas)
3.2 Estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade (ISO/TR 13843 Seção
9.2)
A ISO/TR 13843 define essas características dos métodos microbiológicos da seguinte
forma:
Sensibilidade:
Fração dos positivos que foi corretamente classificada na contagem
presuntiva;
Especificidade: Fração dos negativos que foi corretamente classificada na contagem
presuntiva;
Seletividade:
Relação entre o número de colônias-alvo e o total de colônias no
volume da amostra.
No Colilert-18/Quanti-Tray, essas características dizem respeito ao número de
cavidades positivas para coliformes ou E. coli que realmente continham as bactérias
procuradas e com o número de cavidades negativas que realmente não continham as
bactérias procuradas. A sensibilidade, a especificidade e a seletividade do
Colilert-18/Quanti-Tray foram avaliadas identificando-se isolados positivos para
β-galactosidase e β-glicuronidase em cavidades positivas produzidas usando-se
amostras naturais obtidas pelo repique de água potável declorada com água de rios.
Foram usadas três fontes de água de superfície — dois rios e um reservatório de água
de superfície — para se obter um litro de amostras de água potável declorada
2

epicada. Após a incubação, foram escolhidas 100 cavidades amarelas e nãofluorescentes
de 30 amostras (3 a 5 de cada amostra), selecionadas de forma a
garantir que todas as intensidades de amarelo encontradas estivessem presentes. Da
mesma forma, foram selecionadas 100 cavidades amarelas e fluorescentes, de modo
a abranger todos os níveis de fluorescência encontrados. Das 30 amostras, apenas 54
cavidades negativas estavam disponíveis, sendo que duas delas apresentaram
proliferação com turbidez. As reações positivas e/ou negativas para β-galactosidase ou
β-glicuronidase foram confirmadas e os isolados identificados usando painéis de
identificação miniatura BBL Crystal E/NF (Becton, Dickinson and Company, Sparks,
MD, EUA).
3.2.1 Cálculo da sensibilidade, especificidade, seletividade e taxas de falsos
positivos e falsos negativos
Para cada parâmetro, os dados de identificação foram divididos em quatro categorias:
a = número de cavidades positivas que continham coliformes ou E. coli (positivos
verdadeiros)
b = número de cavidades negativas que continham coliformes ou E. coli (falsos
negativos)
c = número de cavidades positivas que não continham coliformes ou E. coli (falsos
positivos)
d = número de cavidades negativas que apresentaram proliferação e não continham
coliformes ou E. coli (negativos verdadeiros).
A sensibilidade, especificidade, seletividade e as taxas de falsos positivos e falsos
negativos foram calculadas pelas seguintes equações:
Sensibilidade = a / (a+b)
Especificidade = d / (c+d)
Seletividade = log 10 [(a+c) / (a+b+c+d)]
Taxa de falsos positivos = c / (a+c)
Taxa de falsos negativos = b / (b+d)
Foi calculado ainda um outro parâmetro, a eficiência (E), definido como a fração de
cavidades classificadas corretamente, pela fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d).
3.2.2 Coliformes não-E. coli
Foram obtidos isolados para β-galactosidase de todas as 100 cavidades amarelas sem
fluorescência que foram subcultivadas. Nenhuma dessas placas apresentou reação de
β-glicuronidase. O Apêndice A1 apresenta as reações de oxidase e indol, perfis BBL
Crystal E/NF e identificação desses isolados. Todos foram identificados como positivos
para β-galactosidase, e os negativos para β-glicuronidase são outras
Enterobacteriaceae que não E. coli. Ao todo, foram identificadas 23 espécies de E. coli
(Tabela 2).
3.2.3 E. coli
Os isolados de ß-galactosidase foram obtidos de todas as 100 cavidades amarelas
sem fluorescência que foram subcultivadas. O Apêndice A1 apresenta as reações
de oxidase e indol, perfis BBL Crystal E/NF e identificação desses isolados.
3

Noventa e nove isolados foram identificados como E. coli e o isolado restante, que
apresentou reação positiva para β-glicuronidase no painel Crystal E/NF, foi
caracterizado como Klebsiella oxytoca.
3.2.4 Cavidades negativas
Cinqüenta e quatro cavidades negativas foram subcultivadas e houve crescimento em
duas delas, com produção de colônias negativas para β-galactosidase e
β-glicuronidase, positivas para oxidase e negativas para indol (Apêndice A3). Ambas
foram classificadas como Shewanella putrefaciens pelo sistema BBL Crystal E/NF.
Não houve crescimento em nenhuma das outras 52 cavidades.
Tabela 2 Identificação pelo sistema Colilert ® -18/Quanti-Tray ® de bactérias
coliformes (número de isolados) obtidas de cavidades positivas para
coliformes não-E. coli
Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata (12)
Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera cryocrescens (3)
Citrobacter freundii (10) Leclercia adecarboxylata (1)
Enterobacter aerogenes (1) Pantoea agglomerans (9)
Enterobacter asburiae (1) Serratia fonticola (1)
Enterobacter cancerogenus (1) Serratia liquefaciens (3)
Enterobacter cloacae (25) Serratia marcescens (1)
Enterobacter sakazakii (7) Serratia odorifera (1)
Escherichia vulneris (4) Serratia plymuthica (4)
Hafnia alvei (1) Serratia rubidea (1)
Klebsiella oxytoca (4) Serratia spp (1)
Klebsiella pneumoniae (6)
3.3 Determinação das características relacionadas à sensibilidade e à
especificidade
3.3.1 Bactérias coliformes
No sistema Colilert-18/Quanti-Tray, os coliformes são microrganismos que produzem
coloração amarela (com ou sem fluorescência) e os resultados dos parâmetros
calculados foram:
Sensibilidade = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1
Especificidade = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1
Seletividade = log 10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 10 [(200+0) / (200+0+0+2)] = -0,004
Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0
Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0
Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1
3.3.2 E. coli
No sistema Colilert-18/Quanti-Tray, a E. coli é o microrganismo que produz coloração
amarela e fluorescência. Os resultados dos parâmetros calculados foram:
Sensibilidade = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1
Especificidade = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99
Seletividade = log 10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 10 [(99+1) / (99+0+1+102)] = -0,305
4

Taxa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01
Taxa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0
Eficiência (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995
As análises dos dados mostraram que, para as bactérias coliformes, o método Colilert-
18/Quanti-Tray tem alta sensibilidade e especificidade, com zero de falsos positivos e
falsos negativos. A seletividade também é elevada: o valor encontrado de -0,004 é
muito superior ao valor de referência -1 sugerido pelo ISO/TR 13843 para métodos de
contagem de colônias. Como sua eficiência é igual a 1, o método pode ser
considerado altamente eficiente para bactérias coliformes. Os dados de identificação
mostraram que o Colilert-18/Quanti-Tray permite detectar uma ampla variedade de
bactérias coliformes.
O Colilert-18/Quanti-Tray também é altamente sensível e específico para E. coli: a
seletividade (-0,305) é inferior à observada para bactérias coliformes, mas essa
diferença é esperada porque o teste tem natureza dual, ou seja, a E. coli é um subtipo
de bactéria coliforme. Apesar disso, a seletividade é superior ao valor de referência
estipulado pela norma ISO/TR 13843. O método é altamente eficiente (E = 0,995) para
detecção de E. coli.
4 Incerteza na contagem (ISO 13843 Seção 10.2.1 e Anexo B)
A repetibilidade e a reprodutibilidade são duas variáveis que estimam a confiabilidade
de um método analítico. Pode-se medi-las em um método como um todo por meio de
testes em amostras naturais apropriadas ou observando-se a incerteza na contagem
durante a leitura dos resultados do método em questão. Os resultados produzidos por
qualquer método dependem da facilidade com que o operador consegue contar as
colônias ou reações de NMP positivo. Esses fatores são influenciados pelas diferenças
na morfologia das colônias dos microrganismos (procurados ou não) durante a
contagem em placas de ágar e pela clareza das reações positivas e negativas em
testes NMP em caldos de cultura. Portanto, as medições das incertezas associadas à
contagem podem indicar possíveis problemas associados à adoção disseminada do
método.
As definições de repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R) são:
Repetibilidade:
Grau de concordância dos resultados de medições sucessivas do
mesmo objeto, realizadas sob condições idênticas de medição
Reprodutibilidade: Grau de concordância dos resultados de medições do mesmo
objeto, realizadas sob condições diferentes de medição
Na contagem de colônias microbiológicas em placas de ágar ou reações positivas em
testes NMP, a 'condição' que varia ou permanece a mesma é o indivíduo que faz a
contagem. Nesse contexto, portanto, a repetibilidade é a obtenção de contagens
idênticas quando um operador conta mais de uma vez, e a reprodutibilidade é a
obtenção de contagens semelhantes quando dois ou mais operadores fazem a
contagem. De modo geral, a avaliação da reprodutibilidade é mais informativa que o
estudo da repetibilidade.
O Anexo B da ISO/TR 13843 dá orientações sobre o uso de desvios padrão relativos
(DPR) para avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade das contagens. Também
recomenda que o valor ideal do DPR com o uso de culturas puras seja inferior a 0,02,
ou seja, o desvio padrão máximo não deve superar 2%. Os analistas da IDEXX
fizeram estudos de incerteza das contagens, cujos resultados são apresentados no
5

Apêndice B. As contagens foram feitas sem que os analistas soubessem os valores
obtidos pelos outros analistas. Os NMPs foram anotados como números inteiros nãofracionários.
Os DPRs relativos dos NMPs em um sistema Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
inoculado com um coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186) e E. coli
(ATCC 25922) foram:
Klebsiella pneumoniae Repetibilidade = 0,022
Reprodutibilidade = 0,020
Escherichia coli Repetibilidade = 0,000
Reprodutibilidade = 0,007
Os valores para o coliforme típico são da ordem do valor de referência de

O meio Colilert-18 armazenado a 4–25°C tem uma vida de prateleira de 12 meses. Os
dados para as três bactérias testadas com a mesma amostra de meio de cultura
armazenado a 25ºC não mostraram diferença no desempenho após armazenagem por
até 541 dias, uma durabilidade muito superior ao período de um ano estipulado pela
norma. Para esse teste, foi escolhida uma temperatura de armazenagem mais
elevada, pois ela seria mais passível de desestabilizar o meio de cultura Colilert-18
que em temperaturas de refrigeração.
6 Limite superior das contagens (ISO/TR 13843 Seções 10.2.4 e 6.3.3)
O Colilert ® -18/Quanti-Tray ® é um método NMP com intervalo de contagem arbitrário
entre 0 e 201, definido pelo número de cavidades na placa Quanti-Tray. Segundo a
Seção 6.3.3 da ISO/TR 13843, não se pode, por motivos práticos e estatísticos, definir
um limite superior para métodos NMP, "pois não existe uma relação simples entre a
precisão e o número de partículas introduzidas no sistema de detecção".
7 Precisão (ISO/TR 13843 Seções 10.2.5 e 9.5.5)
A precisão dos métodos NMP é descrita pelos intervalos de 95% de confiança
calculados para cada valor de NMP (ISO/TR 13843 Seção 9.5.5). O Apêndice D
mostra os intervalos de confiança para contagens obtidas com o Colilert ® -18/Quanti-
Tray ® , calculadas usando o programa do Bacteriological Analytical Manual (BAM) da
US Food and Drug Administration (FDA), disponibilizado on-line em
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl.
É possível calcular um valor teórico para a repetibilidade de um NMP a partir dos
valores do NMP e de seus intervalos de confiança. O Apêndice D também mostra os
valores relativos de incerteza para cada NMP (log 10 SD, calculado a partir do intervalo
de 95% de confiança para NMP) e de repetibilidade (incerteza padrão relativa) na
forma de coeficientes de variação (CV%). Esses valores de Poisson servem como
indicadores de precisão mínima, podendo ser associados a outros dados disponíveis
em um laboratório (p.ex. variabilidade na decantação do volume de teste ou incertezas
na contagem) para se obter uma estimativa total da repetibilidade para cada NMP.
8 Bibliografia
8.1 Normas ISO
ISO 9308-1:2000 Qualidade da água: Detecção e contagem de Escherichia coli e
bactérias coliformes. Parte 1: Método de filtração por membrana. Genebra:
International Organisation for Standardization.
ISO/TR 13843:2000(E) Qualidade da água: Orientação sobre a validação de métodos
microbiológicos. Genebra: International Organisation for Standardization.
7

Apêndice A
Dados de estudos de sensibilidade, especificidade e seletividade
(ver Seção 3.2)
Apêndice A1
Identificação de isolados de cavidades amarelas e nãofluorescentes
no sistema Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Isolado ref. Oxidase Indol Perfil Crystal E/NF Identificação Confiança
Y1 - + 5765637153 Enterobacter sakazakii 0,5861
Y2 - - 4764417153 Pantoea agglomerans 0,7217
Y3 - + 4724477151 Kluyvera cryocrescens 0,9829
Y4 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962
Y5 - + 4764477151 Kluyvera cryocrescens 0,6287
Y6 - - 4724467153 Pantoea agglomerans 0,7127
Y7 - + 5764475555 Klebsiella oxytoca 0,9825
Y8 - - 4760427053 Pantoea agglomerans 0,9481
Y9 - - 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9264
Y10 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y11 - - 7424676151 Citrobacter freundii 0,9335
Y12 - - 7764672153 Enterobacter cloacae 0,8268
Y13 - - 7764476157 Enterobacter sakazakii 0,6102
Y14 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925
Y15 - + 5765677151 Kluyvera ascorbata 0,8702
Y16 - - 4764627151 Escherichia vulneris 0,5764
Y17 - - 7734457051 Pantoea agglomerans 0,9932
Y18 - + 5765477157 Klebsiella oxytoca 0,8524
Y19 - - 7766276157 Serratia liquefaciens 0,5712
Y20 - - 5764476153 Enterobacter cloacae 0,8943
Y21 - - 3764217153 Cedecea lapagei 0,9835
Y22 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y23 - + 7764637157 Enterobacter sakazakii 0,9734
Y24 - + 5764627452 Leclercia adecarboxylata 0,999
Y25 - - 7764627555 Klebsiella pneumoniae 0,9154
Y26 - - 0764437152 Pantoea agglomerans 0,8776
Y27 - - 7765275557 Serratia rubidaea 0,9942
Y28 - - 4760056153 Enterobacter asburiae 0,9504
Y29 - - 5765276157 Serratia liquefaciens 0,5545
Y30 - + 5764617151 Kluyvera ascorbata 0,982
Y31 - + 5764677557 Klebsiella oxytoca 0,9555
Y32 - - 7564677151 Enterobacter cloacae 0,9987
Y33 - - 4560477153 Enterobacter cloacae 0,9961
Y34 - - 5464454151 Citrobacter freundii 0,9998
Y35 - - 5464654155 Citrobacter freundii 0,9994
Y36 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y37 - - 5664456055 Citrobacter freundii 0,9973
Y38 - - 4764475555 Klebsiella pneumoniae 0,9241
Y39 - + 5760467555 Klebsiella pneumoniae 0,9413
Y40 - - 4764627051 Escherichia vulneris 0,9475
Y41 - - 5764677150 Enterobacter cloacae 0,8043
Y42 - - 4760473151 Enterobacter cloacae 0,9673
Y43 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925
8

Y44 - - 5766476156 Enterobacter sakazakii 0,8111
Y45 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416
Y46 - + 5774677153 Kluyvera ascorbata 0,9439
Y47 - - 7775677555 Klebsiella pneumoniae 0,9853
Y48 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416
Y49 - - 5464477553 Enterobacter cloacae 0,9999
Y50 - - 7775637153 Enterobacter cancerogenus 0,5033
Y51 - + 4774437151 Kluyvera cryocrescens 0,8422
Y52 - - 5764677557 Enterobacter aerogenes 0,8747
Y53 - - 5464457051 Citrobacter freundii 0,9962
Y54 - - 7764272153 Enterobacter cloacae 0,8189
Y55 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y56 - - 5764476152 Enterobacter cloacae 0,9048
Y57 - - 5764256057 Serratia plymuthica 0,8677
Y58 - + 5764676557 Serratia odorifera 0,7963
Y59 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y60 - - 5766476152 Enterobacter cloacae 0,6927
Y61 - - 5470473153 Enterobacter cloacae 0,9996
Y62 - + 5774637151 Kluyvera ascorbata 0,9864
Y63 - + 5764676153 Kluyvera ascorbata 0,9308
Y64 - - 4764476057 Enterobacter sakazakii 0,7089
Y65 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618
Y66 - - 7765671151 Enterobacter cloacae 0,937
Y67 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962
Y68 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302
Y69 - - 4675477153 Enterobacter cloacae 0,9921
Y70 - - 5765276057 Serratia plymuthica 0,6877
Y71 - - 5624657151 Citrobacter freundii 0,996
Y72 - - 5725654447 Serratia fonticola 0,9933
Y73 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886
Y74 - - 5764477555 Klebsiella pneumoniae 0,9919
Y75 - - 5724627052 Escherichia vulneris 0,9987
Y76 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618
Y77 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y78 - - 7767276157 Serratia liquefaciens 0,6819
Y79 - - 5420444051 Citrobacter freundii 0,9799
Y80 - - 7764276557 Serratia marcescens 0,9547
Y81 - - 5766477153 Enterobacter cloacae 0,9872
Y82 - - 5423614153 Hafnia alvei 0,9847
Y83 - + 5764627151 Kluyvera ascorbata 0,9942
Y84 - + 5765677557 Klebsiella oxytoca 0,9715
Y85 - - 5765476553 Enterobacter cloacae 0,9226
Y86 - - 5767476152 Enterobacter cloacae 0,7434
Y87 - + 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9876
Y88 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302
Y89 - + 5664677151 Kluyvera ascorbata 0,9349
Y90 - - 4464654141 Citrobacter freundii 0,999
Y91 - - 5764627051 Escherichia vulneris 0,6454
Y92 - - 5764455555 Klebsiella pneumoniae 0,9504
Y93 - - 5765647151 Pantoea agglomerans 0,6856
Y94 - - 7765256157 Serratia spp. 0,9846
9

Y95 - - 5765477153 Enterobacter cloacae 0,9957
Y96 - + 5464654151 Citrobacter freundii 0,9771
Y97 - + 5765637151 Kluyvera ascorbata 0,8306
Y98 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613
Y99 - - 5764077153 Enterobacter cloacae 0,9948
Y100 - - 5420656050 Citrobacter freundii 0,994
10

Apêndice A2
Identificação de isolados de cavidades amarelas e fluorescentes
no sistema Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Isolado ref. Oxidase Indol Perfil Crystal E/NF Identificação Confiança
F1 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F2 - + 5461444171 Escherichia coli 0,9737
F3 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F4 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F5 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F6 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F7 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F8 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F9 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F10 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F11 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F12 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F13 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F14 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F15 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F16 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F17 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F18 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F19 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F20 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F21 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F22 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F23 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F24 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976
F25 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976
F26 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F27 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945
F28 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F29 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F30 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F31 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F32 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F33 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F34 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F35 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F36 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F37 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F38 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F39 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F40 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F41 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F42 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F43 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F44 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F45 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F46 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
11

F47 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962
F48 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F49 - + 5465404171 Escherichia coli 0,9314
F50 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F51 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F52 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F53 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F54 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F55 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F56 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F57 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F58 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F59 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F60 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F61 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F62 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F63 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F64 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F65 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F66 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962
F67 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F68 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F69 - + 5435444171 Escherichia coli 0,9803
F70 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F71 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F72 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813
F73 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F74 - + 5724444571 Escherichia coli 0,9999
F75 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F76 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F77 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F78 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F79 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F80 - - 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F81 - + 5424444061 Escherichia coli 0,8035
F82 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999
F83 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945
F84 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F85 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F86 - + 5564044171 Escherichia coli 0,9911
F87 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F88 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F89 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F90 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F91 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F92 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F93 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997
F94 - + 5420444571 Escherichia coli 0,9983
F95 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679
F96 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F97 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
12

F98 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998
F99 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991
F100 - + 5765475577 Klebsiella oxytoca 0,7486
13

Apêndice A3
Identificação de isolados em cavidades negativas no sistema
Colilert ® -18/Quanti-Tray ®
Isolado
Perfil Crystal
β-Gal β-Glic Oxidase Indol
ref.
E/NF
Identificação Confiança
N1
NÃO CRESCE
N2
NÃO CRESCE
N3
NÃO CRESCE
N4 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994
N5
NÃO CRESCE
N6
NÃO CRESCE
N7
NÃO CRESCE
N8
NÃO CRESCE
N9
NÃO CRESCE
N10
NÃO CRESCE
N11
NÃO CRESCE
N12
NÃO CRESCE
N13
NÃO CRESCE
N14
NÃO CRESCE
N15
NÃO CRESCE
N16
NÃO CRESCE
N17 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994
N18
NÃO CRESCE
N19
NÃO CRESCE
N20
NÃO CRESCE
N21
NÃO CRESCE
N22
NÃO CRESCE
N23
NÃO CRESCE
N24
NÃO CRESCE
N25
NÃO CRESCE
N26
NÃO CRESCE
N27
NÃO CRESCE
N28
NÃO CRESCE
N29
NÃO CRESCE
N30
NÃO CRESCE
N31
NÃO CRESCE
N32
NÃO CRESCE
N33
NÃO CRESCE
N34
NÃO CRESCE
N35
NÃO CRESCE
N36
NÃO CRESCE
N37
NÃO CRESCE
N38
NÃO CRESCE
N39
NÃO CRESCE
N40
NÃO CRESCE
N41
NÃO CRESCE
N42
NÃO CRESCE
N43
NÃO CRESCE
N44
NÃO CRESCE
N45
NÃO CRESCE
N46
NÃO CRESCE
14

N47
N48
N49
N50
N51
N52
N53
N54
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
NÃO CRESCE
15

Apêndice B Dados de estudos de incerteza de contagem (ver Seção 4)
Apêndice B1
Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e nãofluorescentes
no Colilert ® -18/Quanti-Tray ® inoculadas com
Klebsiella pneumoniae ATCC 33186
* Número mais provável, registrado como inteiro não fracionário
Analista
A
Leitura
1
Analista
A
Leitura
2
Analista
B
Leitura
Analista
C
Leitura
Amostra NMP NMP NMP NMP Média
Repetibilidade
Desv.
pad
DPR ao
quadrad
o
Reprodutibilidade
Média
Desv.
pad
DPR ao
quadrad
o
1 2 2 2 2 2,00 0,0000 0,0000 2,00 0,0000 0,0000
2 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000
3 19 19 19 19 19,00 0,0000 0,0000 19,00 0,0000 0,0000
4 18 18 18 18 18,00 0,0000 0,0000 18,00 0,0000 0,0000
5 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000
6 34 34 34 36 34,00 0,0000 0,0000 34,67 1,1547 0,0011
7 31 31 31 31 31,00 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000
8 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000
9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000
11 41 41 41 41 41,00 0,0000 0,0000 41,00 0,0000 0,0000
12 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000
13 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
14 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000
15 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
16 66 70 70 70 68,00 2,8284 0,0017 68,67 2,3094 0,0011
17 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
18 78 89 89 89 83,50 7,7782 0,0087 85,33 6,3509 0,0055
19 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
20 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
21 95 101 101 101 98,00 4,2426 0,0019 99,00 3,4641 0,0012
22 83 89 89 89 86,00 4,2426 0,0024 87,00 3,4641 0,0016
23 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
24 101 101 109 109 101,00 0,0000 0,0000 106,33 4,6188 0,0019
25 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
26 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
27 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000
28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
29 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
30 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000
Soma DPR 0,0147 Soma DPR 0,0125
DPRc 0,0221 DPRc 0,0204
16

Apêndice B2
Incerteza de contagem para NMPs* de cavidades amarelas e
fluorescentes no Colilert ® -18/Quanti-Tray ® inoculadas com E. coli
ATCC 25922
* Número mais provável, descrito como inteiro não fracionário
Analista
Analista A Analista A
B
Leitura 1 Leitura 2
Leitura
Analista
C
Leitura
Repetibilidade
Reprodutibilidade
Desv.
Amostra NMP NMP NMP NMP Média Amostra NMP NMP NMP
pad
1 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000
2 11 11 11 11 11,00 0,0000 0,0000 11,00 0,0000 0,0000
3 9 9 9 9 9,00 0,0000 0,0000 9,00 0,0000 0,0000
4 29 29 29 29 29,00 0,0000 0,0000 29,00 0,0000 0,0000
5 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000
6 21 21 21 21 21,00 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000
7 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000
8 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000
9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000
11 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000
12 45 45 45 48 45,00 0,0000 0,0000 46,00 1,7321 0,0014
13 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
14 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000
15 66 66 66 66 66,00 0,0000 0,0000 66,00 0,0000 0,0000
16 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
17 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
18 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
19 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000
20 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000
21 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000
22 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
23 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000
24 74 74 74 74 74,00 0,0000 0,0000 74,00 0,0000 0,0000
25 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
26 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000
27 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
29 118 118 118 118 118,00 0,0000 0,0000 118,00 0,0000 0,0000
30 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000
Soma DPR 0,0000 Soma DPR 0,0014
DPRc 0,0000 DPRc 0,0069
17

Apêndice C
Contagens replicadas de suspensões de E. coli, Klebsiella
pneumoniae e Citrobacter freundii no sistema
Colilert ® -18/Quanti-Tray ® após 18 horas e 22 horas de incubação
usando Colilert-18 armazenado a 25 °C por até 541 dias (ver
Seção 5)
Dias após
fabricação
8 2
4
7
15 9
16
8
24 14
9
10
30 13
17
11
36 8
13
14
44 8
5
9
56 13
4
4
84 10
8
8
111 9
5
21
138 3
2
9
175 7
11
12
205 10
8
14
269 8
10
10
319 13
18
13
367 2
11
Número de cavidades positivas
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii
18h 22h
%
%
%
18h 22h
18h 22h
variação
variação
variação
2 0 12 12 0 11 11 0
4 0 11 11 0 14 14 0
7 0 15 15 0 16 16 0
9
16
8
14
9
10
13
17
11
8
13
14
8
5
9
13
4
4
10
8
8
9
5
21
3
2
9
7
11
12
10
8
14
8
10
10
13
18
13
2
11
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
18
9
19
13
14
12
16
18
16
13
18
13
17
24
14
19
10
16
14
14
16
19
20
12
12
14
15
12
15
20
22
17
20
18
13
26
19
15
17
11
12
21
9
19
13
14
12
16
18
16
13
18
13
17
24
14
19
10
16
14
14
16
19
20
12
12
14
15
12
16
20
22
17
20
18
13
26
19
15
17
11
12
21
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+7%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
5
7
14
16
18
18
18
8
16
15
16
11
16
10
6
7
11
11
8
12
20
17
17
8
10
13
16
20
30
18
18
22
14
17
14
4
13
13
17
20
3
5
7
14
16
18
18
18
8
16
15
16
12
18
11
7
14
11
11
8
12
20
17
17
9
10
13
16
21
30
18
18
22
14
17
14
5
15
14
17
20
+50%
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
+9%
+13%
+10%
+17%
+100%
0
0
0
0
0
0
0
+13%
0
0
0
+5%
0
0
0
0
0
0
0
+25%
+15%
+8%
0
0

541 7
10
9
10 10 0 20 20 0 21 21 0
7 0 13 13 0 11 11
10 0 17 17 0 11 12
9 0 16 16 0 8 9
0
+9%
+13%
19

Apêndice D
Intervalos de 95% de confiança e repetibilidade teóricas para
cada valor de NMP no Colilert ® -18/Quanti-Tray ® de 51 cavidades
(ver Seção 7)
Nº. de
cavidades
com reação
positiva
NMP por
amostra de
100 ml
Intervalos de 95%
de confiança
Repetibilidade teórica
Desvio padrão
Inferior
da
Superior
repetibilidade
Log 10 SD
0

36 62,4 44,6 88,8 0,0770 17,7
37 65,9 47,2 93,7 0,0765 17,6
38 69,7 50,0 99,0 0,0761 17,5
39 73,8 53,1 104,8 0,0758 17,4
40 78,2 56,4 111,2 0,0756 17,4
41 83,1 59,9 118,3 0,0756 17,4
42 88,5 63,9 126,2 0,0757 17,4
43 94,5 68,2 135,4 0,0761 17,5
44 101,3 73,1 146,0 0,0768 17,7
45 109,1 78,6 158,7 0,0778 17,9
46 118,4 85,0 174,5 0,0794 18,3
47 129,8 92,7 195,0 0,0819 18,9
48 144,5 102,3 224,1 0,0859 19,8
49 165,2 115,2 272,2 0,0929 21,4
50 200,5 135,8 387,6 0,1094 25,2
51 >200,5 146,1 infinito - -
21