QUANTA Lite® Scl-70 ELISA 708580 - inova

QUANTA Lite® Scl-70 ELISA 708580
Para utilização em diagnóstico In Vitro
Complexidade CLIA: Elevada
Aplicação Diagnóstica
QUANTA Lite® Scl-70 é um ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção semi-quantitativa de
anticorpos Scl-70 no soro humano. A presença de anticorpos Scl-70 pode ser utilizada em conjunto com as
conclusões clínicos e outros testes de laboratório para ajudar no diagnóstico de esclerodermia.
Resumo e Explicação do teste
Os anticorpos antinucleares (ANA) podem ser encontrados numa grande variedade de doenças do tecido
conjuntivo e representam um ensaio sensível de rastreio. 1 Embora o teste ANA seja um excelente teste de
rastreio para o SLE (um resultado negativo elimina virtualmente a possibilidade do SLE activo) 2 , não é de
modo algum um teste específico. Os anticorpos anti antigénio Scl-70, também designados
DNA-topoisomerase-1, constituem um marcador específico da esclerodermia. 1,2,3 Até 60% dos doentes com
esclerodermia são Scl-70 positivos. 2,3,4,5 Contudo, os doentes com esclerodermia com uma forma mais ligeira
ou limitada da doença ou com síndroma de CREST tendem a ser positivos quanto à presença de anticorpos
anti centrómero. 5,6
Foi utilizada uma variedade de métodos para detectar os anticorpos anti Scl-70, incluindo a dupla difusão de
Ouchterlony e a aglutinação passiva. Também foram desenvolvidos testes ELISA para detectar anticorpos
anti-Scl-70, uteis clinicamente. A técnica ELISA aplicada nestes ensaios é objectiva, semi-quantitativa e
pode ser convenientemente empregue para testar um grande número de doentes.
Princípio do método
O antigénio Scl-70 purificado é ligado aos poços de uma placa de micropoços de poliestireno, sob condições
que vão preservar o antigénio no seu estado nativo. Os controlos pré-diluídos e o soro diluído dos doentes
são adicionados aos diferentes poços, permitindo que quaisquer anticorpos Scl-70 presentes se liguem ao
antigénio imobilizado. A amostra não ligada é lavada e adiciona-se um conjugado IgG anti-humano marcado
a cada poço. Uma segunda incubação permite ao conjugado enzimático ligar-se a quaisquer anticorpos de
doentes que tenham ficado agarrados aos micropoços. Depois da segunda lavagem para retirar o excesso
de conjugado, a restante actividade das enzimas é medida adicionando um substrato cromogénico e
medindo a intensidade da cor que se desenvolve. O ensaio pode ser avaliado por espectrofotometria,
medindo e comparando a intensidade da cor desenvolvida nos poços do doente com a cor dos poços de
controlo.
Reagentes
1. Placa ELISA de micropoços de poliestireno revestidos com antigénios purificados de Scl-70 (12-1 x 8
poços), com suporte em embalagem de protecção com dessecantes
2. Controlo negativo ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservante e soro humano sem
anticorpos humanos anti Scl-70, pré-diluído, 1,2 ml
3. Positivo baixo ELISA Scl-70 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano
com anticorpos anti Scl-70, pré-diluído, 1,2 ml
4. Positivo alto ELISA Scl-70 ELISA, 1 frasco de solução tampão com conservantes e soro humano
com anticorpos anti Scl-70, pré-diluído, 1,2 ml
5. Diluente da amostra HRP, 1 frasco cor de rosa, contém solução tampão salina Tris, Tween 20,
estabilizadores proteicos e conservante, 50 ml
6. Solução de lavagem HRP, 1 frasco 40x concentrado, de cor vermelha com solução tampão salina
Tris e Tween 20, 25 ml. As instruções de diluição encontram-se na Secção Método.
7. Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humana, 1 frasco – de cor azul com solução tampão,
estabilizadores proteicos e conservante, 10 ml
8. Cromogénio TMB, 1 frasco com estabilizadores, 10 ml
9. Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344M, 1 frasco – incolor, 10 ml
Advertências
1. ADVERTÊNCIA: Este produto contém um químico (0,02% cloranfenicol) no diluente da amostra, nos
controlos e no conjugado, considerado como cancerígeno no Estado da Califórnia.
2. Todo o material de origem humana utilizado na preparação dos controlos deste produto foi testado e
deu resultados negativos para métodos aprovados pela FDA para anticorpos anti HIV, HBsAg e
HCV. Contudo, nenhum teste pode garantir com certeza absoluta a ausência de HIV, HBV, HCV ou
outros agentes infecciosos. Assim, o Positivo baixo ELISA Scl-70, o Positivo alto ELISA Scl-70 e o
Controlo negativo ELISA devem ser manipulados como se fossem material potencialmente
infeccioso. 7
3. A azida de sódio é utilizada como conservante. Este produto é venenoso e pode ser tóxico se for
ingerido ou absorvido pela pele ou pelos olhos. A azida de sódio pode reagir com componentes de
chumbo ou cobre das canalizações formando azidas metálicas explosivas. Por esta razão, ao deitar
fora os restos de reagentes é necessário deixar correr água em quantidade abundante para evitar a
formação destas substâncias.
4. O conjugado HRP contém um químico diluído venenoso/corrosivo, que pode ser tóxico quando
ingerido em grandes quantidades. Evitar o contacto com a pele e os olhos para prevenir a ocorrência
de queimaduras químicas.
1

5. O cromogénio TMB contém um produto irritante, que pode ser prejudicial quando inalado, ingerido ou
absorvido pela pele. De modo a evitar lesões, evitar inalar, ingerir ou o contacto com a pele ou olhos.
6. A solução de paragem HRP consiste numa solução de ácido sulfúrico diluído. Evitar a exposição a
bases, metais ou outros componentes que possam reagir com ácidos. O ácido sulfúrico é venenoso
e corrosivo e pode ser tóxico se ingerido. Evitar o contacto com a pele ou os olhos para prevenir a
ocorrência de queimaduras químicas.
7. Usar equipamento de protecção apropriado para trabalhar com os reagentes.
8. Os salpicos de reagentes devem ser limpos imediatamente. Observar todas as regulamentações
ambientais nacionais e locais relativas à eliminação de resíduos.
Precauções
1. Utilizar somente para diagnóstico In Vitro.
2. A substituição de componentes do dispositivo por outros que não pertençam a este sistema pode
originar resultados inconsistentes.
3. Uma lavagem incompleta ou inadequada e a aspiração insuficiente dos líquidos dos poços ELISA
pode dar origem a imprecisão e/ou a uma elevada interferência de fundo.
4. A adaptação, total ou parcial, deste teste para processadores automatizados e outros aparelhos de
processamento de líquidos pode dar origem a diferenças nos resultados obtidos nos testes por
técnica manual. É da responsabilidade de cada laboratório garantir que o seu procedimento
automático dá origem a resultados dentro dos limites aceitáveis.
5. Uma grande variedade de factores influencia a qualidade dos resultados obtidos. Entre eles devemos
considerar a temperatura inicial dos reagentes, a temperatura ambiente, a precisão e a
reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia da lavagem e aspiração dos poços ELISA, o
fotómetro utilizado na leitura dos resultados e a duração das incubações dos testes durante o ensaio.
Deve ser dada atenção especial à consistência, necessária para obter resultados precisos e
reprodutíveis.
6. O protocolo deve ser criteriosamente respeitado.
7. Uma selagem inadequada da saqueta com tiras de micropoços e dessecantes pode provocar a
degradação do antigénio e baixa precisão dos resultados.
8. Absorvâncias demasiado baixas podem ser observadas depois de duas ou mais utilizações do
mesmo frasco de conjugado HRP num determinado período de tempo. É importante cumprir todas as
recomendações de preparação e manipulação do conjugado HRP para evitar estas ocorrências.
9. A contaminação química do conjugado HRP pode surgir por limpeza insuficiente dos equipamentos e
instrumentos utilizados. Resíduos dos agentes químicos comuns em laboratórios, tais como a
formalina, lixívia, etanol ou detergentes provocam a degradação do conjugado HRP. Lavar bem todo
o equipamento ou instrumentos após o uso de detergentes/desinfectantes químicos.
Precauções particulares de conservação
1. Conservar todos os reagentes a 2-8º C. Não congelar. Os reagentes permanecem estáveis até à
data de validade indicada, quando armazenados e manipulados conforme descrito no protocolo.
2. As tiras dos micropoços que não forem logo utilizadas, devem ser seladas na embalagem protectora
original com dessecantes e conservadas a 2-8º C.
3. O tampão de lavagem depois de diluído é estável durante uma semana a 2-8º C.
Colheita da amostra
Este procedimento deve ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros
conservantes às amostras do teste pode interferir negativamente nos resultados. As amostras de soro com
contaminação bacteriana, que sofreram tratamento térmico ou contendo partículas visíveis não devem ser
utilizadas. Amostras ou soro muito hemolizados ou lipémicos devem ser evitados.
Após a colheita, o soro deve ser separado do coágulo. O documento H18-A2 da C L S I NCCLS) ( recomenda
as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Não armazenar as amostras à temperatura
ambiente durante mais de 8 horas. 2) Se o teste não for concluído num prazo de 8 horas, guardar a amostra
a 2-8º C. 3) Se o teste não for concluído num prazo de 48 horas, ou se houver transporte da amostra,
congelar a –20º C ou a uma temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem agitadas depois
de descongelarem e antes de serem testadas.
Procedimento
Material fornecido
1 Placa de micropoços ELISA Scl-70 (12-1 x 8 poços), com suporte
1 1,2 ml Controlo Negativo ELISA, pré-diluído
1 1,2 ml Positivo baixo ELISA Scl-70, pré-diluído
1 1,2 ml Positivo alto ELISA Scl-70, pré-diluído
1 50 ml Diluente da amostra HRP
1 25 ml Solução de lavagem HRP, 40x concentrado
1 10 ml Conjugado HRP IgG, (de cabra), IgG anti-humano
1 10 ml Cromogénio TMB
1 10 ml Solução de paragem HRP, ácido sulfúrico 0,344 M
2

Material adicional necessário mas não fornecido
Micropipetas de 5, 100, 200-300 e 500 µl
Pontas descartáveis para as micropipetas
Tubos de teste para diluições de amostras de doentes, volume de 4 ml
Água destilada ou desionizada
Recipiente de 1 L para concentrado de lavagem HRP diluído
Fotómetro para leitura da placa de micropoços, com capacidade de medição da densidade óptica de 450 nm
(e 620 nm para leituras duplas de comprimento de onda)
Método
Antes de iniciar
1. Todos os reagentes e amostras devem encontrar-se à temperatura ambiente (20-26 ºC) e ser bem
misturados.
2. Diluir a solução de lavagem HRP 1:40, adicionando o conteúdo do frasco da solução de lavagem
HRP a 975 ml de água destilada ou desionizada. Se não for utilizada a placa toda durante este
período, podem ser preparadas quantidades inferiores, adicionando 2,0 ml de concentrado a 78 ml
de água destilada ou desionizada por cada 16 poços utilizados. A solução tampão diluída mantém-se
estável durante uma semana a 2-8º C.
3. Preparar uma diluição de 1:101 de cada amostra de doente, adicionando 5 µL de amostra a 500 µL
de diluente de amostras HRP. As amostras diluídas devem ser usadas num prazo de 8 horas após a
sua preparação. NÃO DILUIR o Positivo baixo ELISA Scl-70, o Positivo alto ELISA Scl-70 e o
Controlo negativo ELISA.
4. A determinação da presença ou ausência de Scl-70 utilizando unidades arbitrárias requer o uso de
dois poços para cada um dos três controlos, e um ou dois poços para cada amostra de doente.
Recomenda-se que as amostras sejam testadas em duplicado.
Técnica
1. ANTES DE INICIAR O TESTE, TODOS OS COMPONENTES DEVEM ENCONTRAR-SE À
TEMPERATURA AMBIENTE (20-26º C). Coloque o número de tiras/micropoços necessários no
suporte. Guarde imediatamente as tiras que não foram utilizadas na saqueta com dessecante,
selando-a para minimizar a exposição ao vapor de água.
2. Adicione 100 µL do Positivo baixo ELISA Scl-70, do Positivo alto ELISA Scl-70, do Controlo Negativo
ELISA pré-diluídos e das amostras diluídas aos respectivos poços. Tape os poços e efectue, numa
superfície nivelada, a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação inicia-se
após a adição da última amostra.
3. Lavagem: Aspire bem o conteúdo de cada poço. Adicione 200-300 µl de solução de lavagem HRP
diluída a todos os poços e, em seguida, aspire. Repita esta sequência mais duas vezes num total de
três lavagens. Depois da última lavagem, inverta a placa e coloque-a sobre papel absorvente para
retirar qualquer líquido residual. É imprescindível esvaziar completamente os poços após cada passo
do procedimento de lavagem. Mantenha a mesma sequência para a aspiração como aplicada na
adição das amostras.
4. Adicione 100 µL do conjugado HRP IgG a cada poço. O conjugado deve ser removido dos frascos,
usando condições padrão assépticas e boas práticas de laboratório. Retire do frasco apenas a
quantidade necessária para o ensaio. P AR A E V ITAR U MA P O TE NCIAL CONTAMINAÇÃO
MICROBIANA E/OU QUÍMICA, NUNCA DEVE VOLTAR A COLOCAR O CONJUGADO NÃO
USADO NO FRASCO. Faça a incubação dos poços durante 30 minutos, como descrito no passo 2.
5. Lavagem: Repita o passo 3.
6. Adicione 100 µL do cromogénio TMB a cada poço e faça a incubação durante 30 min., no escuro e
à temperatura ambiente.
7. Adicione 100 µl de solução de paragem HRP a cada poço. Mantenha a mesma sequência e
contagem de tempo na adição da solução de paragem HRP, tal como efectuado para o cromogénio
TMB. Bata suavemente na placa para obter uma mistura homogénea nos poços.
8. Determine a densidade óptica (DO) de cada poço a 450 nm num prazo de 1 hora após a paragem da
reacção. Se desejar uma leitura bicromática, pode usar como referência um comprimento de onda de
620 nm.
Controlo de qualidade
1. O Positivo baixo ELISA Scl-70, o Positivo alto ELISA Scl-70 e o Controlo Negativo ELISA devem ser
processados com cada lote de amostras para garantir que todos os reagentes e procedimentos
actuam correctamente.
2. Uma vez que o Positivo baixo ELISA Scl-70, o Positivo alto ELISA Scl-70 e o Controlo Negativo
ELISA são pré-diluídos, não controlam o procedimento associado à diluição de amostras.
3. Outros controlos podem ser testados de acordo com as directivas ou requerimentos locais e/ou
nacionais ou de acordo com as disposições de organizações acreditadas. Outros soros de controlo
adequados podem ser preparados efectuando alíquotas de amostras de soro humano e conservando
a < -20ºC.
4. Para que os resultados dos testes possam ser considerados válidos, devem ser cumpridos todos os
critérios a seguir definidos. Se algum não for cumprido, o teste deve ser considerado inválido e o
ensaio repetido.
a. A absorvância do Positivo alto ELISA Scl-70 pré-diluído deve ser superior à absorvância do
Positivo baixo ELISA Scl-70 pré-diluído, que deve ser superior à absorvância do Controlo
negativo ELISA pré-diluído.
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. O Positivo alto ELISA Scl-70 pré-diluído deve ter uma absorvância superior a 1,0, enquanto o
Controlo negativo ELISA pré-diluído não pode ter uma absorvância superior a 0,2.
c. A absorvância do Positivo baixo ELISA Scl-70 deve ser mais do dobro da absorvância do
Controlo Negativo ELISA ou superior a 0,25.
d. O controlo negativo ELISA e o positivo alto ELISA Scl-70 servem para monitorizar falhas
substanciais dos reagentes. O Positivo alto ELISA Scl-70 não consegue assegurar a precisão
no ponto de decisão do ensaio.
e. O utilizador deve recorrer ao documento C24-A da CLSI (NCCLS) para obter instruções
suplementares sobre as práticas do Controlo de Qualidade apropriadas.
Cálculo dos resultados
Em primeiro lugar é determinada a densidade óptica média (DO) para cada conjunto de duplicados. A
reactividade de cada amostra pode então ser calculada dividindo a DO média da amostra pela DO média do
Positivo baixo Scl-70. O resultado é multiplicado pelo número de unidades do Positivo baixo ELISA Scl-70
que se encontram no rótulo.
Densidade óptica da amostra
Valor da amostra = ———————————————————— x Positivo baixo ELISA Scl-70
(unidades) DO do Positivo baixo ELISA Scl-70 (unidades)
A relação entre a reactividade e a quantidade de anticorpos presentes é não linear. Apesar de o aumento ou
a diminuição das concentrações de anticorpos no doente se reflectirem num respectivo aumento ou
diminuição da reactividade, a alteração não é proporcional (ou seja, a duplicação da concentração de
anticorpos não duplica a reactividade). Se for requerida uma quantificação mais exacta dos anticorpos do
doente, será necessário efectuar diluições em série das amostras do doente, e a última diluição com
resultado positivo no ensaio deve ser reportada como sendo o título de anticorpos do doente.
Interpretação dos resultados
O teste ELISA é muito sensível à técnica aplicada e é capaz de detectar até pequenas diferenças em
populações de doentes. Os valores abaixo indicados são apenas valores sugeridos. Cada laboratório deve
estabelecer os seus próprios valores de referência, baseados nas suas técnicas, controlos, equipamentos e
população de doentes e em função dos seus próprios procedimentos estabelecidos.
A amostra pode ser classificada de negativa, fracamente positiva, moderadamente positiva ou fortemente
positiva, de acordo com a tabela seguinte.
Unidades
Negativa 80
1. Um resultado positivo indica a presença de anticorpos Scl-70 e sugere a possibilidade de
esclerodermia.
2. Um resultado negativo indica a ausência de anticorpos Scl-70 ou níveis abaixo do ponto de decisão
do ensaio.
3. Sugere-se que os resultados apresentados pelo laboratório incluam a declaração: “Os seguintes
resultados foram obtidos com INOVA QUANTA Lite® ELISA Scl-70. Valores Scl-70 obtidos através
de métodos de ensaio de outros fabricantes não podem ser comparados. A magnitude dos níveis de
IgG descritos não pode ser correlacionada com um título final”.
Limitações do método
1. A presença de imuno complexos ou de outros agregados de imunoglobulinas na amostra do doente
podem causar um aumento do nível de ligação não-específica e produzir resultados falsos positivos
neste ensaio.
2. Nem todos os doentes com esclerodermia e CREST são Scl-70 positivos.
3. Os resultados deste ensaio devem ser utilizados em conjunto com as conclusões clínicas e outros
testes serológicos.
4. As características de desempenho do ensaio não foram determinadas para outras matrizes além do
soro.
Valores esperados
A capacidade do teste QUANTA Lite® ELISA Scl-70 para detectar anticorpos Scl-70, foi avaliada através da
comparação com um teste de dupla difusão, disponivel no mercado, da INOVA Diagnostics, Inc. Os
resultados do teste de Ouchterlony foram considerados como positivos se existisse uma linha de
precipitação identificável, e negativos, caso não se observasse nenhuma linha ou uma linha de nãoidentidade.
Intervalo de valores normais
Cento e uma amostras de soro aleatórias foram seleccionadas e testadas com o ensaio Scl-70 ELISA. A
média da população testada foi de 3,2 unidades com um desvio padrão de 0,7 unidades. O intervalo dos
valores da população variou entre 2,1 e 5,1 unidades. Este ensaio indica que a média normal é superior a 24
desvios padrão abaixo do ponto de decisão.
4

Sensibilidade e Especificidade Relativa
Para determinar a sensibilidade e especificidade relativa do ensaio, 295 amostras ANA positivas contendo
anticorpos de uma grande variedade de antigénios nucleares foram testadas por ambos os métodos, por
Ouchterlony e por ELISA. Das 295 amostras testadas, 13 foram positivas e 282 negativas em ambos os
métodos.
INOVA
+ -
+ 13 0 Sensibilidade relativa 100%
OT Especificidade relativa 100%
- 0 282 Eficiência relativa 100%
Precisão e Reprodutibilidade
A precisão e a reprodutibilidade do ensaio foram medidas testando seis réplicas de cada tipo de amostra,
moderadamente positiva e negativa, em seis ensaios distintos. A reactividade média da moderadamente
positiva foi de 51,9 unidades enquanto que o valor médio da amostra negativa foi de 18,0 unidades. O desvio
padrão e o coeficiente de variação para cada amostra encontram-se resumidos na tabela que se segue.
Moderadamente positiva Negativa
DP CV DP CV
Total 8,8 16,9% 0,7 3,9%
Dentro do teste 7,4 14,2% 0,7 3,6%
Entre testes 4,7 9,1% 0,6 3,4%
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Referências
1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in
Immunology 33: 167-239, 1982.
2. Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus.
Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982.
3. Catoggio, LJ, et al.: Serological markers in progressive systemic sclerosis. Clinical Correlations.
Annals of the Rheumatic Diseases 42: 23-27, 1983.
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sclerosis. Br J Dermatol 112: 23, 1985.
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antibody-a specific marker of systemic sclerosis. Br J Dermatol 115: 393-401, 1986.
6. Stein V, et al.: Clinical correlations and prognosis based on serum autoantibodies in patients with
systemic sclerosis. Arthritis and Rheumatism 31: 2, 1988.
7. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
Institute of Health, 2007, Fifth Edition.
Fabricado por:
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9900 Old Grove Road
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