(Protótipo) Elisa para Detecção de Anticorpos anti-T ... - NewsLab

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(Protótipo) Elisa para Detecção de Anticorpos anti-T ... - NewsLab

Artigo

Avaliação de um Kit (Protótipo) Elisa para

Detecção de Anticorpos anti-T. pallidum

Sáez-Alquézar A 1 , Marques WP 1 , Botini MB 2 , Alves A 2

1 - Panel Controle de Qualidade

2 - Laboratório Hemo Life

Resumo

O presente estudo teve como objetivo avaliar o desempenho

do kit anti-T. pallidum Elisa recombinante (Wiener lab.),

frente a painéis de soros positivos (n = 30), negativos (n =

30) e heterólogos (n = 50) e em paralelo com amostras provenientes

de uma rotina de triagem sorológica de um serviço

de hemoterapia (n = 1.111).

A reprodutibilidade dos soros controle interno do kit

e dos soros controle interno de baixa reatividade (Panel)

mostrou coeficientes de variação de 6,8 - 9% e 11,8 -

14,7%, respectivamente.

Todas as amostras dos painéis de soros negativos e heterólogos

apresentaram relação DO/CO < 1,0. Todas as

amostras do painel de soros positivos apresentaram relação

DO/CO > 1,2.

Num total de 1.111 amostras da rotina de triagem sorológica

observou-se a presença de 25 (2,3%) resultados repetidamente

reagentes (RRR) para o kit anti-T. pallidum Elisa

recombinante (Wiener lab.) e 27 (2,4%) para o kit utilizado

na triagem sorológica (Abbott Murex), sendo que 20 amostras

foram confirmadas como verdadeiramente positivas pelo

FTA-abs, das quais 18 apresentaram resultados reagentes

para ambos os kits.

A especificidade observada para o kit anti-T. pallidum

Elisa recombinante (Wiener lab) foi de 99,5%, o que torna

este kit adequado para procedimentos de triagem sorológica

em doadores de sangue.

Palavras-chave: Sífilis, anti-T. pallidum, Elisa

Summary

The objective of this study was to evaluate the performance

of the anti-T. pallidum Elisa recombinant (Wiener

lab), using positive (n = 30) and negative (n = 80) sera

panels, and with samples from a daily serological screening

of a hemotherapy service (n = 1.111).

The reproducibility of positive control kit and of the

positive internal control of low reactivity (Panel), showed

a variation coefficient of 6,8-9,0% and 11,8-

14,7%, respectively.

All the samples of negative sera panels, presented ratio

DO/CO < 1,0. All the samples of positive sera panels

presented DO/CO > 1,2.

In 1.111 samples of the daily sorological screening

was observed the presence of 25 (2,3%) RRR for the anti-

T.pallidum Elisa recombinant kit (Wiener lab.) and 27

(2,4%) for the kit used in the serological screening (Abbott

Murex). Only 20 samples were confirmed truly positive

by the FTA-abs test and eighteen of them showed reagent

results for both kits. The anti-T. pallidum Elisa recombinant

Kit (Wiener lab) showed a specificity of 99,5%

and could be considered adequate for use in the serological

screening of blood donors.

Keywords: Syphilis, anti-T. pallidum, Elisa

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Introdução

O

s testes sorológicos para diagnóstico

da sífilis podem ser

de dois tipos: testes treponêmicos

e testes não treponêmicos. Os

testes não treponêmicos são testes

de floculação capazes de detectar

reaginas produzidas pelo

organismo em resposta à infecção

por T. pallidum.

Os mais usados são o VDRL

(Venereal Desease Research Laboratory),

o USR (Unheated Serum

Reagin), o RPR (Rapid Plasma

Reagin) e o TRUST (Toluidine

Red Unheated Serum Test).

Os testes treponêmicos detectam

a presença de anticorpos

anti-T. pallidum e podem

ser métodos de Imunofluorescência

Indireta (FTA abs), de hemoaglutinação

(TPHA) ou de enzimaimunoensaio

(Elisa).

Em geral os testes treponêmicos

apresentam melhor sensibilidade

do que os métodos não treponêmicos,

nas diferentes fases

da infecção pelo T. pallidum e

mostram resultados reagentes em

casos de sífilis tratada.

Os testes não treponêmicos

não detectam casos de sífilis tratada

e devem ser realizados em

soro puro e diluído 1/10, para evitar

resultados falsos negativos

devidos ao fenômeno de pró-zona.

Tanto os testes treponêmicos

quanto os não treponêmicos podem

apresentar resultados falsos

positivos biológicos.

Na triagem sorológica de doadores

de sangue, os testes mais

utilizados são os não treponêmicos

devido a dois fatores: a) menor

custo; b) menor % de descarte

pelo fato de não detectarem

os casos de sífilis tratada.

Testes Elisa para a detecção

de anticorpos anti-T. pallidum

(IgG e IgM) podem melhorar a

qualidade da triagem sorológica

de doadores de sangue devido

a sua maior sensibilidade e

ao fato de poderem ser automatizados,

com leitura por aparelhos

(não visual) pode compensar

a diferença de custo com os

testes não treponêmicos.

O objetivo do presente trabalho

foi avaliar o desempenho de um kit

Elisa recombinante, para detecção

de anticorpos anti-T. pallidum, desenvolvido

por Wiener lab, frente a

painéis de soros positivos, negativos

e heterólogos e em paralelo com

uma rotina de triagem sorológica de

um serviço de hemoterapia.

Materiais e Métodos

Descrição do kit avaliado

Trata-se de um kit Elisa, baseado

no princípio sandwich para detecção

de anticorpos anti-T. pallidum,

desenvolvido por Wiener lab.

Equipamentos e

procedimentos utilizados

Incubadora MIC3 Malcom Médica;

lavadora Tecan; leitora Spectra

Modelo Classic/Tecan.

Determinação da

reprodutibilidade

Foi determinada a reprodutibilidade

dos soros controles negativo

e positivo do kit e dos soros

controle internos, negativo e positivo

de baixa reatividade, produzidos

pela Panel, através da

realização de 10 determinações de

cada um dos soros controle (realizados

por dois operadores) para

obtenção da média (M) e o desvio

padrão (dp), possibilitando o cálculo

do coeficiente de variação (CV

= dp/M x 100).

Painéis de soros

Foram utilizadas 110 amostras

de soros, previamente caracterizadas

quanto à reatividade para

os testes de uso obrigatório na

triagem sorológica de doadores de

sangue, divididas em três painéis

de amostras positivas (n = 30),

negativas (n = 30) e heterólogas

(n = 50).

Avaliação em paralelo com

uma rotina de triagem sorológica

Para a análise foram utilizadas

1.111 amostras provenientes de

uma rotina de triagem sorológica

de doadores de sangue, num período

de sete dias.

O kit utilizado para a detecção

de anticorpos anti-T. pallidum, na

rotina de triagem sorológica foi o

kit ICE Syphilis Abbott Murex.

Todas as amostras que apresentaram

reatividade para qual-

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quer um dos kits anti-T. pallidum

Elisa utilizados foram repetidas em

duplicata.

As amostras repetidamente

reativas (RR) para cada um dos

kits foram submetidas ao teste

treponêmico de Imunofluorescência

(FTA abs).

Resultados

Reprodutibilidade

O coeficiente de variação (CV)

em 10 determinações sucessivas,

realizado em dias diferentes por

operadores diferentes, do Controle

Positivo Interno do kit apresentou

valores de 6,8% e 9% e em 10

determinações sucessivas do Controle

Positivo Interno Máster - Panel

apresentou os valores 11,8%

e 14,7% (tabela 1).

Painéis de soros negativos

e heterólogos

Todos os resultados obtidos

com os painéis de amostras negativas

e heterológas mostraram

relação DO/CO < 1,0 (0,0 e 0,4)

(Gráfico 1).

Painel de soros positivos

Todos os resultados obtidos

com o painel de 30 amostras positivas

mostraram relação DO/CO

> 1,0. (1,3 a >15,7).

Avaliação em paralelo com uma

rotina de triagem sorológica

Todas as amostras que apresentaram

reatividade para cada

um dos kits Elisa utilizados foram

repetidas, observando-se

34 amostras repetidamente reativas

(RR), sendo 27 amostras

RR para o kit Murex e 25 para o

kit Wiener.

Em 18 amostras o resultado foi

RR para ambos os kits utilizados,

de modo que nove amostras foram

RR apenas para o kit Murex e

sete apenas para o kit Wiener.

As 34 amostras com resultados

RR foram submetidas a um

teste de Imunofluorescência Indireta

(FTA abs), que mostrou positividade

em 20 delas.

Todas as 18 amostras RR para

ambos os kits Elisa foram positivas

no FTA abs.

Das nove amostras RR, apenas

para o kit Murex, uma mostrou

resultado positivo para o FTA abs

e das sete amostras RR, apenas

para o kit Wiener uma também

mostrou resultado positivo para o

FTA abs.

Discussão

Os coeficientes de variação

observados para os soros controles

positivos do kit (6,8% e 9%) e

para os soros controle interno de

baixa reatividade (11,8% e

14,7%) mostraram um baixo índice

de dispersão. Para os controles

negativos os coeficientes de

variação também mostraram baixo

índice de dispersão, mesmo

tendo mostrado valores numericamente

altos devido aos valores

Tabela 1. Estudo da reprodutibilidade em soros controle

Controles do kit Wiener

Controles internos (Panel)

Positivo Negativo Positivo Negativo

Operador 1 Operador 2 Operador 1 Operador 1 Operador 2 Operador 1

DO/CO DO/CO DO/CO DO/CO DO/CO DO/CO

Média 2,965 2,547 0,017 0,551 0,672 0,019

Desvio Padrão 0,20059 0,229794 0,008854 0,06497 0,098511 0,010729

Coeficiente de

variação %

6,8 9 52,7 11,8 14,7 56,1

V

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Gráfico 1

extremamente baixos de absorbância

observados. (Tabela 1).

O comportamento do kit Sífilis

Elisa recombinante (Wiener lab),

frente aos painéis de soros com

amostras negativas e heterólogas

foi satisfatório, mostrando boa especificidade

com relação DO/CO <

1,0 em todas as amostras (Gráfico

1). Da mesma forma, os resultados

obtidos com o painel de amostras

positivas mostraram 100% de

sensibilidade, com relação DO/CO

> 1,2 em todas as amostras.

A sensibilidade observada

para o kit Wiener frente ao painel

de amostras positivas foi de

100%. Os resultados observados

em amostras da triagem sorológica

mostraram que o comportamento

dos dois kits Elisa utilizados

foi semelhante quanto à

sensibilidade. Duas amostras

apresentaram resultados discordantes

nos dois testes Elisa utilizados.

Numa dessas amostras

os resultados, em DO/CO, para

os testes Elisa, Murex e Wiener,

respectivamente, foram 0,5 e 1,2

e na outra 2,3 e 0,1.

Ambas apresentaram resultado

positivo fraco no teste de FTA

abs. Isso significaria um resultado

falso negativo para cada um

dos testes Elisa. Nesse caso a sensibilidade

dos dois kits Elisa utilizados

seria de 94,7%. Todavia,

levando em consideração que as

leituras observadas no teste FTA

abs foram muito fracas, para as

duas amostras em questão, outra

interpretação poderia ser que os

resultados obtidos nessas duas

amostras correspondessem a falsos

positivos biológicos.

A especificidade observada

para o kit Wiener foi de 99,5 %

(seis RFP em 1.111 amostras da

triagem sorológica) e para o kit

Murex de 99,3% (oito RFP em

1.111).

Conclusão

Conclui-se que o protótipo kit

sífilis Elisa recombinante (Wiener

lab) é adequado para uso em procedimentos

de triagem sorológica

de doadores de sangue.

Referências Bibliográficas

1. Ferreira AW & Ávila SLM. Sorologia: Importância e parâmetros in: Diagnóstico laboratorial das principais doenças

infecciosas e auto-imunes. Editores: A. Walter Ferreira e Sandra LM Ávila. Guanabara Koogan, 2ª edição, 2001.

2. Saez-Alquézar A, Marques W, Botini MP, Alves A. Avaliação de um kit Elisa recombinante para a determinação de

anticorpos anti-T. pallidum. 27º Congresso de Hematologia e Hemoterapia – São Paulo, nov de 2004.

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