Padronização do Real Time PCR - CBMEG

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Padronização do Real Time PCR - CBMEG

Padronização do Real Time PCR

1ª ETAPA – PCR




A primeira etapa de padronização consiste na execução de um PCR de cada um dos

primers (inclusive o normalizador), utilizando um mix dos cDNAs ou apenas um.

Na tebela 1, estão os volumes das soluções e reagentes a serem usados na execução

de uma corrida de PCR para um tubo com volume de 25µL. Deve-se multiplicar esses

volumes, portanto, pelo número de reações. Por exemplo, para dois pares de primers,

serão necessários, no mínimo, 3 vezes esse volume, pois deve haver um tubo para

cada par de primer, além do branco (caso feito em duplicata, será o dobro da

quantidade de tubos).

Ao final do PCR deve-se executar a eletroforese em gel de agarose em 1% para

averiguar o resultado do PCR.

Tabela 1- Volumes de soluções e reagentes para PCR

Concentração Final

Concentração do

Estoque

Volume (μL)

dNTP 0,2mM 10mM 0,50

PCR buffer 1x 10x 2,50

Primers 1μM 10μM 2,50

Template DNA 50ng/μL 50ng/μL x

MgCl 2 1,5mM 25mM 1,50

DNA Polymerase 1U - 0,30

Água Milli-Q - -

Completar até

vol. final

Volume final - 25,00


Antes de iniciar o preparo do mix, deixe o termociclador previamente configurado

(passo 5 do procedimento)

Condições de ciclo de amplificação

1. I 1 X Desnaturação a 94 o C – 5 min

2. II 35 X Desnaturação a 94 o C - 45 s

3. Anelamento a temperatura do primer o C - 60 s

4. Extensão a 72 o C - 60 s

5. III 1X Extensão a 72 o C – 7 min


Procedimento

1. Inicialmente, deve-se prepar o mix: adicione a um eppendorf todas as

soluções da reação de PCR com exceção da DNA. A polimerase deve ser a

última a ser adicionada (após sua adição, executar o restante do

procedimento o mais rápido possível);

2. Aliquote o volume de 25 μL do eppendorf de mix para ao eppendorf de

branco;

3. Adicione o DNA ao tubo de mix;

4. Aliquote os demais tubos da reação;

5. Levar os tubos no termo-ciclador e iniciar o programa;

2ª ETAPA – DILUIÇÕES DO cDNA



Cada cDNA deverá ser diluído serialmente 1:10; 1:100; 1:1000 e utilizado para avaliar a

eficiência de amplificação dos primers de interesse.

Para cada uma das diluições de cDNA deve-se executar o PCR com todos os pares de

primers;

O resultado do PCR é verificado com eletroforese em gel de agarose 1%;

3ªETAPA – OTIMIZAÇÃO DOS CICLOS DE PCR




Tendo escolhida a melhor concentração de cDNA na etapa anterior, a última etapa

corresponde à otimização da quantidade de ciclos, isto é, verificar a sensibilidade a ser

esperada quando da execuçãoao do real time PCR. A partir de 18 ciclos, serão feitos

reações de PCR variando a quantidade de ciclos de 2 em 2 até um total de 30 ciclos

(18 ciclos, 20 ciclos, 22 ciclos, 24 ciclos e assim por diante até 30).

O PCR é executado conforme descrito na 1ª Etapa, com a diferença de que ao se

atingir cada uma das quantidades de ciclos desejadas (18, 20, 22, etc), o processo é

pausado e um dos tubos é retirado do termo-ciclado, de forma que ao final do

processo (quando o termociclador estiver realizando o ciclo de nº 30) haverá apenas

um tubo sobrando (aquele que passou por 30 ciclos)

Ao corrermos essas amostras em gel de agarose, esperamos ver uma diferenca

crescente na intensidade das bandas e de acordo com essa diferenca saberemos o que

esperar quanto a diferenca de expressao a ser obtida no real time.

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