Padronização do Real Time PCR
1ª ETAPA – PCR
A primeira etapa de padronização consiste na execução de um PCR de cada um dos
primers (inclusive o normalizador), utilizando um mix dos cDNAs ou apenas um.
Na tebela 1, estão os volumes das soluções e reagentes a serem usados na execução
de uma corrida de PCR para um tubo com volume de 25µL. Deve-se multiplicar esses
volumes, portanto, pelo número de reações. Por exemplo, para dois pares de primers,
serão necessários, no mínimo, 3 vezes esse volume, pois deve haver um tubo para
cada par de primer, além do branco (caso feito em duplicata, será o dobro da
quantidade de tubos).
Ao final do PCR deve-se executar a eletroforese em gel de agarose em 1% para
averiguar o resultado do PCR.
Tabela 1- Volumes de soluções e reagentes para PCR
Concentração Final
Concentração do
Estoque
Volume (μL)
dNTP 0,2mM 10mM 0,50
PCR buffer 1x 10x 2,50
Primers 1μM 10μM 2,50
Template DNA 50ng/μL 50ng/μL x
MgCl 2 1,5mM 25mM 1,50
DNA Polymerase 1U - 0,30
Água Milli-Q - -
Completar até
vol. final
Volume final - 25,00
Antes de iniciar o preparo do mix, deixe o termociclador previamente configurado
(passo 5 do procedimento)
Condições de ciclo de amplificação
1. I 1 X Desnaturação a 94 o C – 5 min
2. II 35 X Desnaturação a 94 o C - 45 s
3. Anelamento a temperatura do primer o C - 60 s
4. Extensão a 72 o C - 60 s
5. III 1X Extensão a 72 o C – 7 min
Procedimento
1. Inicialmente, deve-se prepar o mix: adicione a um eppendorf todas as
soluções da reação de PCR com exceção da DNA. A polimerase deve ser a
última a ser adicionada (após sua adição, executar o restante do
procedimento o mais rápido possível);
2. Aliquote o volume de 25 μL do eppendorf de mix para ao eppendorf de
branco;
3. Adicione o DNA ao tubo de mix;
4. Aliquote os demais tubos da reação;
5. Levar os tubos no termo-ciclador e iniciar o programa;
2ª ETAPA – DILUIÇÕES DO cDNA
Cada cDNA deverá ser diluído serialmente 1:10; 1:100; 1:1000 e utilizado para avaliar a
eficiência de amplificação dos primers de interesse.
Para cada uma das diluições de cDNA deve-se executar o PCR com todos os pares de
primers;
O resultado do PCR é verificado com eletroforese em gel de agarose 1%;
3ªETAPA – OTIMIZAÇÃO DOS CICLOS DE PCR
Tendo escolhida a melhor concentração de cDNA na etapa anterior, a última etapa
corresponde à otimização da quantidade de ciclos, isto é, verificar a sensibilidade a ser
esperada quando da execuçãoao do real time PCR. A partir de 18 ciclos, serão feitos
reações de PCR variando a quantidade de ciclos de 2 em 2 até um total de 30 ciclos
(18 ciclos, 20 ciclos, 22 ciclos, 24 ciclos e assim por diante até 30).
O PCR é executado conforme descrito na 1ª Etapa, com a diferença de que ao se
atingir cada uma das quantidades de ciclos desejadas (18, 20, 22, etc), o processo é
pausado e um dos tubos é retirado do termo-ciclado, de forma que ao final do
processo (quando o termociclador estiver realizando o ciclo de nº 30) haverá apenas
um tubo sobrando (aquele que passou por 30 ciclos)
Ao corrermos essas amostras em gel de agarose, esperamos ver uma diferenca
crescente na intensidade das bandas e de acordo com essa diferenca saberemos o que
esperar quanto a diferenca de expressao a ser obtida no real time.
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