GENÔMICA - AMiGA - Unicamp

cbmeg.unicamp.br

GENÔMICA - AMiGA - Unicamp

GENÔMICA

25.05.2012

Dra. Ana Carolina M. Junqueira

Lab. Gené*ca e Evolução Animal

CBMEG – UNICAMP

email: anacmj@unicamp.br


O que é um Genoma

Sequência completa de DNA de um organismo (ou RNA, no caso de vírus)

Inclui regiões codificadoras e não-­‐codificadoras


O que é Genômica

Conteúdo

e

organização

Função

Evolução


Genômica Estrutural

Mapas – localizações rela*vas e posicionamento

Mapas genéHcos ou de ligação – taxas de recombinação entre loci

São essenciais para o posicionamentode trechos cromossômicos e alinhamento de sequências


Genômica Estrutural

Mapas Lsicos – análise direta de sequências (> precisão)

A resolução depende das técnicas u*lizadas: RFLP, hibridação in situ, sequenciamento


Genômica Estrutural


Genômica Estrutural


Genômica Estrutural -­‐ Mapas

Cromosomo 3 -­‐ Levedura


Métodos de sequenciamento

Mapas Lsicos detalhados são gerados por sequenciamento de DNA

Sequenciamento de Primeira Geração

Degradação química – Maxam & Gilbert

Interrupção da cadeia (ddNTPs) – Sanger

Sequenciamento de Segunda Geração

454 – Roche

Illumina – HiSeq, MiSeq

Sequenciamento de Terceira Geração

PacBio RS – Pacific Biosciences

Ion Torrent – ABI -­‐ Life Technologies

Nanopore – GridIon / MiniIon


Interrupção da cadeia / Sanger


Interrupção da cadeia / Sanger


Interrupção da cadeia / Sanger

“Dye Terminators”

G

T

A

C


Interrupção da cadeia / Sanger


Interrupção da cadeia / Sanger


Illumina


Illumina


Illumina


Illumina

hfp://wn.com/exact/Phlya1


Pirosequenciamento – 454 Roche

Liberação de pirofosfato quando há incorporação de um nucleoideo pela DNA polimerase


Pirosequenciamento – 454 Roche

Adenosina Fosfosulfato


Pirosequenciamento – 454 Roche

hfp://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspxid=7454


Sequenciamento de 3ª Geração

Life Technologies -­‐ Ion Torrent

U*liza chips semicondutores abaixo da placa de sequenciamento, que é sensível a

mudanças de pH no momento em que um nucleo[deo é incorporado.

10 Mb a 1 Gb em 2 horas.

Sequenciamento de um genoma humano em menos de 1 semana com alta qualidade.


h_p://www.youtube.com/playlistlist=PL010C8341A2D632BE

Sequenciamento de 3ª Geração

Illumina – by Ion Torrent


Sequenciamento de 3ª Geração

Life Technologies -­‐ Ion Torrent

Projeto Genoma Humano -­‐ US$ 3 bilhões

2012 – Ion Proton promete a*ngir a marca de US$ 1000


Sequenciamento de 3ª Geração

Life Technologies -­‐ Ion Torrent


Sequenciamento de 3ª Geração

Life Technologies -­‐ Ion Torrent


Sequenciamento de 3ª Geração

Oxford Nanopore – GridION e MinION

h_p://vimeo.com/36907534


Sequenciamento de 3ª Geração

Oxford Nanopore – GridION e MinION

h_p://vimeo.com/36907534


Sequenciamento de 3ª Geração

Oxford Nanopore – GridION


Sequenciamento de 3ª Geração


Sequenciamento de 3ª Geração

Oxford Nanopore – MinION


Sequenciamento Completo de Genomas

1982 Fago Lambda – 49 mil pb

1995 Haemophilus influenzae – 1,8 milhão de pb

1996 Saccharomyces cerevisiae – 12 milhões de pb

1997 Escherichia coli – 5.5 milhões de pb

1998 Caenorhabdi:s elegans – 100 milhões de pb

2000 Drosophila melanogaster – 122 milhões de pb

2001 Homo sapiens – 3,3 bilhões de pb

2008 Mammuthus primigenius -­‐ > 4 bilhões de pb

2010 Homo neanderthalensis – 4 bilhões de pb

2011 Genômica Pessoal


Sequenciamento Completo de Genomas


Sequenciamento Completo de Genomas


Sequenciamento Completo de Genomas


Sequenciamento Completo de Genomas

Não é possível sequenciar um genoma completo con*nuamente.

Bilhões de pares de bases devem ser montados em fragmentos pequenos de

100 a 700 pb.

Estratégias:

Sequenciamento baseado em mapa

Shotgun

Exemplo:


Sequenciamento baseado em mapa


Sequenciamento baseado em mapa

Separação e isolamento de cromossomos inteiros.

Digestão parcial – população de moléculas com tamanho semelhante.

Subclones em cromossomos ar*ficiais de bactéria (BACs) ou levedura (YACs)

Hibridação da biblioteca com sondas de marcadores mapeados

Triagem da biblioteca com a superposição subclones com marcadores

vizinhos, gerando fragmentos con[guos

Fragmentação, clonagem e sequenciamento (shotgun)

Montagem das sequências

Preenchimento de gaps


Shotgun


Shotgun

Fragmentação aleatória dos cromossomos

Clonagem

Sequenciamento

Montagem das sequências

Preenchimento de gaps

* Não há necessidade de gerar mapas gené*cos ou rsicos previamente

* Maior número de reads deve ser sequenciado para garan*r a sobreposição


Clone-­‐by-­‐clone X Shotgun


Genoma Humano

1980 Projeto Genoma Humano – inicia*va internacional com 20 grupos

Sequenciamento completo em 15 anos com US$ 3 bilhões

1990 Início do projeto

1993 Mapas rsicos detalhados para os 24 cromossomos

Sequenciamento automá*co permi*u aumento da escala

1998 Celera Genomics – esforço privado (shotgun)

2001 Publicação de ambas as inicia*vas


SNPs

SNPs – Polimorfismos de um único nucleoideo

Geralmente não estão associados a variações feno[picas

Numerosos e dispersos – 1 SNP a cada 1000pb para o GH

Marcadores associados a loci ligados a doenças

Ú*l para determinação de parentesco e ancestralidade comum


A genômica se tornou pessoal

hfps://www.23andme.com/


A genômica se tornou pessoal


Metagenomas e Microbiomas

Metagenoma – “genoma cole*vo” da microbiota de uma amostra ambiental

Microbioma – genomas, microbiota e suas interações em um ambiente


Metagenomas e Microbiomas


Metagenomas e Microbiomas


A, RNA

B, chroma*n

C, energy

D, cell cycle

E, amino acids

F, nucleo*des

G, carbohydrates

H, coenzymes

I, lipids

J, transla*on

K, transcrip*on

L, DNA

M, envelope

N, cell mo*lity

O, protein turnover

P, inorganic

Q, second metabolites

R, general func*on

S, unknown

T, signal transduc*on

U, secre*on

V, defence

W, extracellular

Z, cytoskeleton.


Metagenomas e Microbiomas

ü Buzzing around since Permian (250 Mya)

ü Evolved into hundreds of thousands of species (> 150 thousand species)

ü Radia*on more diverse than all terrestrial vertebrates

ü Survived two mass ex*nc*on events

ü Saw the angiosperms arise

ü Witnesses of dinosaur evolu*on and ex*nc*on

ü Ubiquitous and cosmopolitan

ü Nutrient recyclers in nature and pollinators

ü Cause diseases in humans and animals

ü Developed different feed strategies, niche occupancy, sizes, body shapes


Metagenomas e Microbiomas

Head

Thorax

Abdomen

Legs + Wings

ü Survey of the microbial diversity of a fly

ü Microbiome associated to different *ssues

ü Pathogen related to diseases

ü Interac*ons and biological significance of endosymbionts

ü Rela*ve amount of DNA and mtDNA in different *ssues


Metagenomas e Microbiomas


Genômica Funcional

Como os genes estão organizados e qual sua função

Métodos computacionais foram fundamentais para a iden*ficação de genes

Iden*ficação de genes

Compreensão da função de sequências

Transcriptoma

Proteoma


Genômica Funcional

ESTs – Expressed Sequence Tags

Nos eucariotos, apenas uma pequena % do DNA codifica proteínas

Marcadores associados a sequências expressas

Ferramenta para predição de transcritos, proteínas e suas funções

Mapeamento rsico (hibridização, localização em genomas)

Sondas para análise da expressão gênica (microarray)

1. Isolamento de RNA

2. Transcrição reversa (cDNA)

3. Sequenciamento de trechos curtos (500 a 800 pb)


Genômica Funcional

Homologia – Comparação em bancos de dados

Comparação de sequências de DNA a procura de genes com função

conhecida (genes ortólogos).

Genes ortólogos em geral tem funções correlatas ou a mesma

função em diferentes organismos (BLAST, NCBI).

Famílias gênicas geradas por duplicação no mesmo genoma (genes

parálogos).

Diversidade protéica atual pode ter sido gerada pela combinação de

um número limitado de domínios protéicos.

Comparação de domínios protéicos conhecidos pode levar à função


Genômica Funcional

FilogenéHca

Presença e ausência de genes em diferentes espécies pode indicar

proteínas funcionalmente relacionadas em vias bioquímicas.

Padrão de fusão

Proteínas fusionadas podem estar em genes diferentes, mantendo

a funcionalidade.

Genes vizinhos

Em procariotos -­‐ função e localização (operons).

Em eucariotos – genes reguladores do desenvolvimento embrionário


Genômica Funcional

Expressão Gênica – Microarranjos de DNA


Genômica Funcional

Expressão Gênica – Microarranjos de DNA


Genômica Funcional

RNA-­‐seq

Detecção de SNPs, edição de RNA e splicing alterna*vo são mais acurados.

Maior habilidade de discriminar regiões de alta iden*dade.

Perfil de transcrição sem necessidade de mapeamento ou sequenciamento

genômico prévio


Genômica ComparaHva

Como os genomas evoluem

Quais as forças evoluHvas que moldam a estrutura e organização dos genomas

Como as espécies se relacionam

Qual a velocidade das mudanças


Genômica ComparaHva

Procariotos

580 mil pb – Mycoplasma genitalium

7 milhões pb – Mesorhizobium lo:

Nº de genes é uniforme = 1000 a 2000, com 1 gene a cada 1000pb

Diversidade gênica pode ser de ~25% entre espécies

Transcrição e tradução são realizadas por um conjunto parecido de genes

conservados

Transferência horizontal ocorre amplamente e parece ter sido importante na

evolução dos procariotos


Genômica ComparaHva

Eucariotos

Genomas maiores e mais variáveis.

Não há relação entre tamanho do genoma e complexidade do organismo.

Nº de genes – Procariotos < Eucariotos unicelulares < Eucariotos mul*celulares

Cópias repe**vas compostas principalmente de transposons.

Quanto maior o tamanho do genoma, maioro nº de sequências repe**vas.

Complexidade do organismo está relacionada ao tamanho e número de íntrons.

Genomas + complexos fazem mais combinações de domínios protéicos


Genômica ComparaHva

Genoma Humano

25% do DNA é transcrito em RNA.

2% é codificado em proteínas.

1 gene = 2 a 3 mRNAs diferentes (splicing alterna*vo).

Nº de genes = 20 a 25 mil.

Densidade gênica varia entre os cromossomos.

Em média, os genes tem 27000 pb e 9 exons.

Domínios protéicos são parecidos com os de Drosophila, mas o proteoma

humano é mais diverso por fazer mais combinações.


Genoma Humano

Genômica ComparaHva


Quer saber mais sobre genomas

Prêmio Nobel – Grafeno

h_p://www.wired.com/gadgetlab/2010/10/graphene/

Biomoléculas anHgas sequenciadas do gelo da Groenlândia

h_p://www.genomesonline.org/cgi-­‐bin/GOLD/index.cgi

Sequenciamento do Mamute

h_p://www.sciencemag.org/content/317/5834/111.abstract

Microbioma Humano

h_p://www.scien*ficamerican.com/ar*cle.cfmid=ul*mate-­‐social-­‐network-­‐bacteria-­‐protects-­‐health

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