Profª Patrícia Rocco

TERAPIA COM CÉLULAS-TRONCO EM
DOENÇAS RESPIRATÓRIAS: ESSE É O
FUTURO?
Patricia Rieken Macêdo Rocco, MD, PhD
Professora Titular em Respiração
Chefe do Laboratório de Investigação Pulmonar
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, Brasil

Introdução
• Alguns tecidos do organismo se regeneram
constantemente como a pele, paredes intestinais
e principalmente com o sangue.
• Esses tecidos têm suas células destruídas e
renovadas em um complexo processo de
proliferação e diferenciação celular.
• Entretanto, o pulmão é um órgão que tem uma
capacidade regenerativa limitada.
Uhal, 1997; Hong et al., 2004; Majka et al., 2005

Introdução
• As células do epitélio da traquéia e grandes vias aéreas, células de Clara e os
pneumócitos tipo II apresentam capacidade de proliferação e diferenciação, porém seu
reparo endógeno não é suficiente para prevenir a progressão das doenças
respiratórias.
Giangreco el al. 2009; Antunes et al., 2011

Células Progenitoras
Células tronco
administradas
Giangreco el al. 2009; Antunes et al., 2011

Terapia Celular
Gentilmente cedida por Regina Goldenberg

• As células-tronco são células indiferenciadas que
podem se diferenciar e constituir diferentes tecidos
no organismo.
• Outra capacidade especial das células-tronco é a
auto-renovação, ou seja, elas podem gerar cópias
idênticas de si mesmas.
Abreu et al., 2011

Células-tronco- Potencial de Diferenciação
TERMO DEFINIÇÃO EXEMPLO
Totipotentes São as mais indiferenciadas
Capacidade de formar todos os tipos celulares
e anexos embrionários
Pluripotentes
Capacidade de se diferenciar em
quase todos os tipos celulares dos 3
folhetos embrionários, exceto
placenta e anexo embrionário
Zigoto
Células
provenientes
folhetos
embrionários
MULTIPOTENTES
Capacidade de se diferenciar em
tipos celulares de um mesmo
folheto embrionário
Adultas (somáticas)
Unipotentes
Capacidade de gerar um único
tipo celular
Pneumócito Tipo II
Weiss et al. 2008

• Substituir células ou tecidos lesados em doenças.
Abreu et al., 2011

• Diminuir a morte celular e/ou aumentar a
capacidade de regeneração tecidual.
Abreu et al., 2011

Histórico
Autor Doença Respiratória Tipo Celular Ano
Krause et al. Fibrose Pulmonar BM-MSC 2001
Kotton et al. Fibrose Pulmonar BM-MSC 2001
Rojas et al. Lesão Pulmonar Aguda BM-MSC 2005
Weiss et al. Asma BM-MSC 2008
Zhen et al. Enfisema BM-MSC 2008
Aguilar et al. Fibrose Pulmonar HSC/BM-MSC 2009
Araújo et al. Lesão Pulmonar Aguda Mononuclear 2010
Maron-Gutierrez et al. Silicose Mononuclear 2011
Abreu et al. Asma Mononuclear 2011

Células-tronco Adulta - Mecanismos
TECIDO PULMONAR
DIFERENCIAÇÃO
CÉLULA TRONCO
INDIFERENCIADA
CÉLULA EPITELIAL
PULMONAR
TRANSDIFERENCIAÇÃO
CÉLULA
PRECURSORA
FUSÃO CELULAR
CÉLULA EPITELIAL
PULMONAR
CÉLULA TRONCO E
EPITELIAL PULMONAR
LESADA
CÉLULA EPITELIAL
PULMONAR REPARADA
Krause et al. 2008, Weiss et al. 2008, Abreu et al. 2011

VASCULAR SPACE
LUNG TISSUE
DIFERENTIATION
TRANSDIFERENTIATION
SDF-1α
SLC
CXC
CXC Stem cell Lung
Epithelial cell
Progenitor
cell
Lung
Epithelial cell
CELL FUSION
LATERAL TRANSFER OF RNA
Stem cells
Stem cell + Injured
lung epithelial cell
Multinucleated
Lung epithelial
cell
Lung
Epithelial cell
Stem cell
Abreu et al., 2011

Mecanismos de Ação
Células tronco
Tecido Lesado
AÇÃO PARÁCRINA
Alguns fatores liberados:
IL-6 e IL-1
FGF-2 e FGF-7
TGF-α
VEGF
TNF-α
Fatores
celulares
Lee et al., 2010, Abreu et al., 2011

Células-tronco adulta
PRÓS
Segurança
Ética
Fácil obtenção
Pode ser autóloga
Estudos muticêntricos
CONTRA
Pouca quantidade
Isolamento
Expansão limitada
Limitada capacidade de
diferenciação
Krause et al. 2008, Weiss et al. 2008; Abreu et al. 2008, 2011

SILICOSE

Silicose
• Doença pulmonar do grupo das
pneumoconioses gerada pela
inalação de poeira de sílica.
• O número estimado de
trabalhadores potencialmente
expostos a poeiras contendo sílica
no Brasil é superior a 6 milhões.
Carneiro et al., 2006

Silicose
• Doença pulmonar caracterizada por nódulos inflamatórios de
células mononucleares nos locais onde as partículas se
acumulam, levando ao compromentimento da troca gasosa.

ESTUDO EXPERIMENTAL

Silicose

Silicose
CAMUNDONGOS C57BL/6 FÊMEAS
(20-25 g)
CONTROLE
SÍLICA
(C)
(SIL)
n=16 n=16
Dia 0 1 hora
Dia 15
Instilação de salina (50 µl it) ou sílica
(20 mg/50 µl saline it)
Injeção de CMMO
(2 x 10 6 iv)
Mecânica e histologia
pulmonares e biologia molecular
Maron-Gutierrez et al., 2011

Silicose
* Significativamente diferente de C
Maron-Gutierrez et al., 2011

Silicose
Maron-Gutierrez et al., 2011

Lassance et al ., 2009

Métodos
CAMUNDONGOS C57BL/6 FÊMEAS (20-25 g)
CONTROLE
(CTRL, 50 µl, i.t.)
n=16
SÍLICA
(SIL 20 mg/50 µl, i.t.)
n=16
Dia 0 Dia 15
Dia 30
Dia 60
Instilação de
salina ou sílica
Instilação intratraqueal de célulastronco
nos grupos tratados células
aderentes derivadas da medula óssea
10 7 cells / 100 µL
Mecânica e
Histologia
Pulmonares
Mecânica e
Histologia
Pulmonares
Lassance et al ., 2009

A
60
Est (cmH 2
O/ml)
50
40
30
* *
*
20
10
0
CTRL Sal Cell Sal Cell
30 days
60 days
SIL
Lassance et al ., 2009

Lassance et al ., 2009

Sílica
Macrófago
Macrófago
Alvéolo

Conclusão
- Efeito benéfico a curto prazo, da terapia celular em
modelo de silicose:
Melhora dos parâmetros funcionais
Melhora dos parâmetros histológicos
- Efeito terapêutico não foi observado a longo prazo
Lassance et al ., 2009

ESTUDO CLÍNICO
Luiz Paulo Loivos, Marina A. Lima, Amir Szklo, Leandro
Vairo, Tais H.K. Brunswick, Sergio A.L. Souza, Bianca
Gutfilen, Alberto J. Araújo, Alexandre P. Cardoso, Lea
Mirian B. Fonseca, Regina C. Goldenberg, Jose Roberto
Lapa e Silva, Patricia R.M. Rocco, Marcelo M. Morales

Terapia com células tronco em
pacientes com silicose

Terapia com células tronco em
pacientes com silicose

Terapia com células tronco em
pacientes com silicose

Terapia com células tronco em
pacientes com silicose

D30
D180

Perfusão (%)
16
14
12
10
8
6
4
2
Pulmão Direito
Ápice
*
Perfusão (%)
40
30
20
10
Pulmão Direito
Terço Médio
* *
* *
Perfusão (%)
30
25
20
15
10
5
*
Pulmão Direito
Base
*
*
*
0
0 30 60 120 180
0
0 30 60 120 180
0
0 30 60 120 180
Tempo (Dias)
Tempo (Dias)
Tempo (Dias)
Pulmão Esquerdo
Ápice
Pulmão Esquerdo
Terço Médio
Pulmão Esquerdo
Base
16
40
30
Perfusão (%)
14
12
10
8
6
4
2
*
Perfusão (%)
30
20
10
*
* *
*
Perfusão (%)
25
20
15
10
5
* *
*
*
0
0 30 60 120 180
0
0 30 60 120 180
0
0 30 60 120 180
Tempo (Dias)
Tempo (Dias)
Tempo (Dias)

ASMA

Asma
• A asma permanece como um importante problema de saúde pública,
acometendo cerca de 300 milhões de pessoas em todo mundo (OMS).
• No Brasil, a asma acarreta óbito de aproximadamente 8 pessoas ao dia,
sendo responsável por 2.500 óbitos ao ano (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008).
HUMANO
SOCIAL
FINANCEIRO
GINA 2010

Asma
• Aproximadamente 5% dos pacientes asmáticos são
refratários a terapia convencional.
Fibrose Subepitelial
Hiperplasia de
Músculo Liso
Espessamento da
Via Aérea
Inflamação Alérgica
Crônica
Hiperplasia de
Miofibroblasto
Angiogênese
Alterações na MEC
GINA 2010

Asma Alérgica Crônica
• Diversos estudos demonstraram que o epitélio das vias
aéreas de pacientes asma alérgica crônica apresenta
reduzida capacidade regenerativa.
Insuficiência
no pool de células
tronco residentes
Redução de
células tronco
endógenas
presentes
na circulação
Borthwick et al., 2001; Kim et al., 2005; Palange et al., 2006

ESTUDO EXPERIMENTAL

Abreu et al., 2011

Hipótese
• Testar a hipótese que a terapia com células
mononucleares derivadas da medula óssea
poderia interferir no processo inflamatório e
de remodelamento em modelo experimental
de asma alérgica crônica.
Abreu et al., 2011

Métodos
Camundongos Fêmeas
C57BL/6
n = 28
CONTROLE (C)
OVOALBUMINA (OVA)
C-SAL C-CELL OVA-SAL OVA-CELL
Xisto et al. 2005; Abreu et al. 2011

C-SAL
C-CELL
BRONCOCONSTRICTION INDEX
4
3
2
1
0
SAL
CELL
*
SAL
CELL
OVA-SAL
100 µm
OVA-CELL
100 µm
C
OVA
* Significativamente diferente de C-SAL
100 µm
100 µm
Abreu et al., 2011

BALF
* Significativamente diferente de C-SAL # Significativamente diferente de OVA-SAL
Abreu et al., 2011

Mecânica do Pulmão
Est,L (cmH 2 O/ml)
60
50
40
30
20
10
*
∆P,L (cmH 2 O)
4
3
2
1
∆P1
∆P2
*
*
0
SAL
C
CELL
SAL
OVA
CELL
0
SAL
C
CELL
SAL
OVA
CELL
* Significativamente diferente de C-SAL
Abreu et al., 2011

Hiperresponsividade da Via Aérea
Resistance (%)
150
140
130
120
110
C-SAL
C-CELL
OVA-SAL
OVA-CELL *
*
*
100
0
SAL 3 10 30 100
Methacoline (µg/kg)
* Significativamente diferente de C-SAL
Abreu et al., 2011

Transdiferenciação
Fusão Celular
Célula-tronco

Abreu et al., 2011

Microscopia Confocal
< 1%
Abreu et al., 2011

Célula
Tronco
Parácrino
Abreu et al., 2011

RT-PCR TEMPO REAL
IL-5
(Fold changes relative C-SAL)
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
*
*
* #
0
SAL
CELL
SAL
CELL
C
OVA
* Significativamente diferente de C-SAL # Significativamente diferente de OVA-SAL
Abreu et al., 2011

3.0
2.5
2.0
1.5
RT-PCR TEMPO REAL
*
* #
4
3
2
1
*
TGF-β
(Fold changes relative C-SAL)
PDGF
(Fold changes relative C-SAL)
1.0
0.5
0
SAL CELL SAL CELL
C OVA
0
4
3
2
1
SAL CELL SAL CELL
C OVA
*
*
#
VEGF
(Fold changes relative C-SAL)
0
*
*
* #
SAL CELL SAL CELL
C OVA
* Significativamente diferente de C-SAL # Significativamente diferente de OVA-SAL
Abreu et al., 2011

Conclusões
• A terapia com células mononucleares derivadas de
medula óssea reduziu os processos inflamatórios e de
remodelamento, resultando em melhora da mecânica
pulmonar e da hiperresponsividade da via aérea no
presente modelo de asma alérgica crônica.
• As células atuaram através de um efeito parácrino já
que o número de células que implantaram foi pequeno.
Abreu et al., 2011

ESTUDO CLÍNICO
Marina A. Lima, Leandro Vairo, Sergio A.L. Souza,
Bianca Gutfilen, Alberto J. Araújo, Alexandre P.
Cardoso, Lea Mirian B. Fonseca, Regina C. Goldenberg,
Marcelo M. Morales, Jose Roberto Lapa e Silva ,
Patricia R.M. Rocco

Estudo Fase 1
• Estudo clínico prospectivo e não-randomizado.
• 10 pacientes com asma persistente que não
respondem às terapias com corticosteróide,
broncodilatador e anti-IgE.
• Transplante autólogo de células mononucleares
derivadas de medula óssea.

LESÃO PULMONAR AGUDA

Lesão Pulmonar Aguda
• A Lesão Pulmonar Aguda afeta
aproximadamente 200.000 pacientes anualmente
nos EUA e é responsável por 10% a 15% das
admissões nas Unidades de Terapia Intensiva.
• Apesar dos recentes avanços no entendimento
da fisiopatologia da LPA, a mortalidade perdura
elevada (26 a 34%).
Erickson et al., 2009

destruição da
membrana
alvéolo-capilar
Maron-Gutierrez et al, 2009

Lesão Pulmonar Aguda
INSULTO
DIRETO
• Causas Comuns:
Pneumonia;
Aspiração de conteúdo
gástrico.
Célula tipo II
Surfactante
Macrófago
Alveolar
Célula tipo I
Intersticio
Célula
Endotelial
Fibroblasto
Eritrócito
Rocco & Pelosi, 2008

Lesão Pulmonar Aguda
INSULTO
INDIRETO
Mediadores
inflamatorios
Célula Tipo I
• Causas Comuns:
Célula Tipo II
Sepse;
Trauma grave com choque e
múltiplas transfusões.
Macrófago
Alveolar
Fibroblasto
Célula Endotelial
Eritrócito
Rocco & Pelosi 2008

Stem Cell
Stem Cell

Araujo et al., 2010

Hipótese
• Uma vez que a fisiopatologia da LPA difere
de acordo com o insulto primário, a resposta
da terapia com células mononucleares
derivadas de medula óssea (BMDMC) seria
diferente em função da etiologia da LPA.
Araujo et al., 2010

Araujo et al., 2010

100
ALIp-BMDMC
ALIexp-BMDMC
ALIp-SAL
Percent Survival
80
60
40
20
ALIexp-SAL
0
0
1 2 3 4 5 6 7
Days
Araujo et al., 2010

60
DAY 7
Est,L (cmH 2
O.mL -1 )
40
20
* *
**
# †
0
p exp p exp p exp p exp
SAL CELL SAL CELL
C
ALI
Araujo et al., 2010

Collagen Fiber (µm 2 /µm)
0.08
0.06
0.04
0.02
*
*
*
*
‡
#
DAY 7
**
DAY 7
#
**
0.00
p exp p exp p exp p exp
SAL CELL SAL CELL
C
ALI
Araujo et al., 2010

Araujo et al., 2010

Araujo et al., 2010

ALIexp-CELL
ALIp-CELL
50 µm 50 µm
5%
2%
Araujo et al., 2010

Araujo et al., 2010

Conclusões
• A terapia com BMDMC foi capaz e inibir a
fibrogênese independentemente da etiologia da
LPA, entretanto, a terapia celular atenuou as
alterações morfo-funcionais pulmonares bem
como a expressão de fatores de crescimento e
mediadores inflamatórios de forma mais intensa
na LPA extrapulmonar do que na pulmonar.
Araujo et al., 2010

BMDMC:
INTRAVENOSA OU
INTRATRAQUEAL?

LPA Pulmonar
LPA Extrapulmonar

Intravenosa
ou
Intratraqueal
Araujo et al., 2011

ALIexp-CELL-iv
ALIp-CELL-iv
5%
2%
ALIexp-CELL-it
ALIp-CELL-it
1% 5%

60
Est,L (cmH 2
O.mL -1 )
40
20
* *
0
SAL
iv it
BMDMC
C
SAL iv it
BMDMC
ALIp
SAL iv it
BMDMC
ALIexp
Araujo et al., 2011

Terapia com célula
mesenquimal

Summary of criteria to identify MSC
1. Adherence to plastic in standard culture conditions
2. Phenotype Positive (> 95%)
CD105
CD73
CD90
Negative (< 2%)
CD45
CD34
CD14 ou CD11b
CD79a ou CD19
HLA-DR
3. In vitro differentiation: osteoblasts, adipocytes, chondroblasts

Maron-Gutierrez et al. , 2011

LPA Pulmonar
Maron-Gutierrez et al. , 2011

LPA Extrapulmonar
Maron-Gutierrez et al. , 2011

Medula
CÉLULAS MESENQUIMAIS
REPARO
Tecido Adiposo
INFLAMAÇÃO
Tecido Pulmonar
Lesão Pulmonar Aguda
Silva et al., 2011

Summary of criteria to identify MSC
1. Adherence to plastic in standard culture conditions
2. Phenotype Positive (> 95%)
CD105
CD73
CD90
Negative (< 2%)
CD45
CD34
CD14 ou CD11b
CD79a ou CD19
HLA-DR
3. In vitro differentiation: osteoblasts, adipocytes, chondroblasts

Ratos Wistar, ♀,
200-250 g (n=48)
C (n=24)
LPA (n=24)
SAL (n=6)
BM-MSC
(n=6)
AD-MSC
(n=6)
L-MSC
(n=6)
SAL (n=6)
BM-MSC
(n=6)
AD-MSC
(n=6)
L-MSC
(n=6)

Dia 0 Dia 2 Dia 7
Salina ou LPS de E.coli
Salina ou MSC [medula ou tecido adiposo ou pulmão (1x10 5 , 50 µl)]
Aquisição do dado
Silva et al. 2011

2,5
** ** **
Est,L (cmH 2
O/ml)
2,0
1,5
1,0
0,5
*
*
0,0
SAL
BM
AD L SAL BM
AD
L
MSC
MSC
C
ALI
Silva et al. 2011

LPA-SAL
ALI-BM-MSC
AL-AD-MSC
ALI-L-MSC
Silva et al. 2011

Conclusões
• A terapia com células mesenquimais oriundas da
medula óssea ou tecido adiposo leva a melhora
morfo-funcional mais intensa do que as células
mesenquimais advindas do tecido pulmonar.
Silva et al. 2011

Conclusões
• É evidente que as células-tronco derivadas da
medula óssea são capazes de auxiliar no reparo e
remodelamento nas doenças respiratórias, porém
são necessários mais estudos antes de se iniciar
estudos clínicos.

Perspectivas Futuras
Integração? / Diferenciação/
Liberação de fatores?
Subpopulação(ões) mais
indicada?
Único ou Combinado?
Dosagem?
Via de Administração?
Melhor momento para o
transplante?

Obrigada!
Apoio Financeiro: CNPq, FAPERJ, INCT-NOFAR, PRONEX, CAPES

Obrigada
Apoio Financeiro: CNPq, FAPERJ, INCT-NOFAR, PRONEX, CAPES

Perguntas????