Biotecnologia

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A sociedade Brasileira de Biotecnologia (SBBiotec), fundada em 1988, é umasociedade civil sem fins lucrativos, constituída com o objetivo de promover oprogresso da Biotecnologia, através da Ciência e do Desenvolvimento Tecnológico,integrados para possibilitar a capacitação tecnológica do setor produtivo e deserviços, visando o desenvolvimento e o bem estar da sociedade brasileira.Em 1999, a SBBiotec foi reestruturada, sendo aprovado o novo Estatuto que podeser encontrado na Home Page da Sociedade: www.sbbiotec.org.brO Congresso, realizado em novembro de 2001 contribuiu para a efetiva consolidaçãoda Sociedade Brasileira de Biotecnologia, contando com a participação de um fórumde alta credibilidade em sua área de competência.O momento atual exige que o Brasil possa contar com um foro adequado de cientistas especializados em biotecnologia, capaz de tratar dodesenvolvimento desta área, com o rigor científico e a segurança que toda a sociedade exige. Filie-se a SBBiotec para fortalecer esta iniciativa.

Alimentos transgênicosENTREVISTAEntrevista concedida aMaria Fernanda Diniz AvidosO impasse continuaFoto de Cláudio Bezerra MeloEm janeiro de 1995, o Brasil deu umpasso à frente na corrida tecnológica,com a regulamentação da lei de biossegurança,uma forte aliada da ciência,já que impõe condições de segurançapara as pesquisas de modificação genética.Hoje, passados sete anos, o quese vê é um cenário de caos e desinformação.Para falar sobre o impasse queainda cerca a questão dos transgênicose que mantém a sua proibição noBrasil, a revista Biotecnologia, Ciência& Desenvolvimento entrevistouo chefe-geral da Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia, uma das 39unidades de pesquisa da Embrapa,situada em Brasília, DF, Luiz AntônioBarreto de Castro, que foi pioneiro naimplantação e implementação do Programade Biotecnologia da Embrapa,tanto na parte de infra-estrutura, com amontagem do laboratório de engenhariagenética, como na formação deequipes especializadas nessa área.Luiz Antônio é graduado em agronomiapela Universidade Federal Ruraldo Rio de Janeiro; tem mestrado emtecnologia de sementes pela Universidadedo Mississipi, EUA; PhD emfisiologia de plantas pela Universidadeda Califórnia (Davis); e pós-doutoramentoem biologia molecular pelaUniversidade da Califórnia (Los Angeles).Luiz Antônio tem uma longaexperiência como professor e cientista,já prestou várias consultorias noBrasil e no exterior e foi professor naUniversidade Federal Rural do Rio deJaneiro entre 1965 e 1981. Hoje,acumula as funções de chefe-geral daEmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologiae presidente da SociedadeBrasileira de Biotecnologia (SBBiotec).Durante a entrevista, Luiz Antôniofalou sobre proibição dos produtostransgênicos à agricultura brasileira.Segundo ele, esses produtos possibilitamganhos econômicos significativospara o país e o seu impedimentolegal não tem justificativa, visto quevêm sendo usados há anos no mundo,sem que se tenham registros de prejuízospara o meio ambiente ou paraa saúde da população.BC&D – A lei de biossegurança foicriada em 1995. Passados seteanos, por que, na sua opinião, osprodutos transgênicos ainda nãoestão sendo comercializados noBrasil? Nesse caso, o senhor poderiaafirmar que há mais interesseseconômicos e ideológicos do quecientíficos nessa discussão?Luiz Antônio – Eu não tenho dúvidasde que existem muito mais interessesrelacionados a conflitos de mercadodo que de biossegurança, mas é importantelembrar que se as alegaçõescientíficas não tivessem encontradoeco na sociedade, na percepção pública,aqueles que são contra a biotecnologianão teriam tido sucesso. As campanhascontra os organismos geneticamentemodificados tiveram êxitoporque conseguiram convencer a opiniãopública e, portanto, o consumidor,na ponta, de que os produtos dabiotecnologia são perigosos. Hoje, oconsumidor olha a biotecnologia comdesconfiança e medo e enquanto issonão mudar, qualquer coisa que se digacontra essa tecnologia, as pessoas têmuma tendência a acreditar. Há o fatode a engenharia genética ser umaciência nova, o que poderia assustar aspessoas por seu caráter inusitado, maspor outro lado, é importante lembrarque muitas outras inovações não encontraramuma reação tão forte porquenão carregam todo esse conflitode interesses por trás. Os produtosgerados pela biotecnologia vão substituirgradualmente um mercado muitogrande e tradicional, que funciona há50 anos, que é o mercado de agroquímicos.Eu não estou fazendo nenhumacrítica aos agroquímicos que, indiscuti-4 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

velmente, tiveram uma importânciaenorme durante as últimas décadas. Sehoje conseguimos alimentar seis bilhõesde pessoas no mundo, muito sedeve a esses produtos. Mas a tendêncianatural é que as soluções biológicascomecem a substituir as soluções químicas.E é óbvio que isso não podeacontecer sem reação. Outra questãoque deve ser destacada é que ospaíses sempre protegem as suas agriculturas.A agricultura européia, porexemplo, é extremamente incompetentee subsidiada, mas ainda assim éprotegida. E, por isso, quando paísescomo Estados Unidos, Canadá e Argentinacomeçam a colocar na Europaprodutos transgênicos, que são aindamais baratos, com custo de produçãomais baixo, como o frango que sealimenta de milho e soja, isso impõe àagricultura européia um problema difícilde resolver. Ou seja, os EstadosUnidos defendem a agricultura dostransgênicos, já que têm interesse emvender esses produtos, e a Europadefende a agricultura dos não transgênicosporque quer defender a suaagricultura que está mais atrasada doponto de vista tecnológico. Na Europa,eles conseguiram convencer a sociedadede que os transgênicos potencialmenteconstituem um mal social eisso passou para o Brasil. E o Brasil, porsua vez, não protege a agricultura. Issoé um problema grave e está impedindoo desenvolvimento da biotecnologiaem nosso país há quatro anos.BC&D – Essa restrição aos organismosgeneticamente modificados(OGM’s), no seu ponto de vista,tem causado prejuízos econômicose ao avanço do conhecimentoe da ciência no Brasil?Luiz Antônio – Essa restrição aosprodutos transgênicos têm causadoprejuízos econômicos muito grandes.Eu visitei recentemente a região produtorade soja do Rio Grande do Sul,onde se cultiva há cerca de cinco anossoja transgênica, que vem da Argentina,e lá eles têm conseguido produziruma tonelada de soja por um custo deprodução 40 a 50% mais baixo do quea soja convencional. Com isso, os agricultoresdo Rio Grande do Sul conseguiramrecuperar áreas que eles játinham abandonado para a agriculturaporque não tinham mecanismos decontrole de ervas daninhas. Com a sojatolerante a glifosato associada ao plantiodireto, eles conseguiram altos níveisde produção por custos muitomais baixos. A situação daquela regiãome impressionou de tal maneira, queeu reuni dados e fotografias e pretendoescrever em breve um trabalhosobre isso. O cultivo de soja transgênica,que é sabidamente ilegal, na regiãosul é a prova viva dos prejuízos econômicosque a proibição aos transgênicosvem trazendo para o Brasil. Alémdisso, o uso de transgênicos tem sidotrocado por um possível mercadopotencial que não compensa a diferençade custo de produção. As estatísticasmostram que a tonelada de sojanão transgênica que se destina à alimentaçãohumana tem um bônus daordem de quatro a seis dólares portonelada, o que não significa nada.Ninguém vai deixar de plantar sojatransgênica para ganhar seis dólarespor tonelada a mais. A tonelada de sojacusta aproximadamente 180 dólares,então seis dólares não chega a ser nem5% do preço da tonelada de soja, ouseja, não é isso que estimula os produtores.Por outro lado, o famoso mercadode soja para a alimentação humana,que seria um nicho que o Brasil poderiaexplorar com a soja não transgênica,é pequeno. Os especialistas estimamque esse nicho não é mais doque 5% da demanda mundial de soja.Ainda assim, eu acho que se essemercado de soja convencional é interessantepara o Brasil economicamente,eu acho que nós devemos procurálo,entretanto a soja transgênica ilegalestá de tal maneira difundida, não sóno Rio Grande do Sul como no paísinteiro, que se alguém quiser plantarsoja e certificá-la como não transgênica,o custo que isso vai ter é maior doque se consegue pelo bônus, entãonão vale a pena.BC&D – O que falta ser feito parasuperar esse impasse?Luiz Antônio – Em primeiro lugarexistem problemas de natureza legal.A questão está parada por razões judiciaishá quatro anos e agora se encontrano Tribunal Regional Federal desdefevereiro. Até o momento, apenas umdos juízes, a Dra. Selene Almeida, deuparecer favorável. Os outros dois aindanão chegaram a uma posição. Naminha opinião de cidadão, essa situaçãoé inaceitável. A espera já chega acinco meses. É preciso que esses juízescheguem a uma sentença, queseja contra ou a favor, mas que aconteça.Ou seja, o entrave legal existe, eesse eu não sei como resolver. Mas háum outro ponto muito importante, eque merece cada vez mais a nossaatenção, que é o esclarecimento daopinião pública sobre os transgênicos.O que se estima é que de cada dezpessoas contrárias a transgênicos, seteo são por acreditarem que esses alimentospodem fazer mal à saúde,duas por acharem que podem causardanos ao meio ambiente e a última porrazões filosóficas ou ideológicas etc.Então, o que eu acho que deve serfeito de imediato é explicar bem aquestão dos alimentos transgênicospara o público. É importante que aspessoas saibam que esses alimentosvêm sendo consumidos há sete anosno mundo sem nenhum registro dedanos à saúde humana. Ou seja, osalimentos transgênicos não fazem maismal do que os convencionais. Quemnão pode comer soja, também nãopode comer a variedade transgênica epor aí vai. Enquanto isso não ficar claropara o público, é muito pouco provávelque a opinião pública aceite essesprodutos. É preciso investir maciçamenteem uma campanha de esclarecimento,mas esse processo envolvecustos, e a Sociedade de Biotecnologianão dispõe de recursos para arcar comuma contra campanha desse porte.Nós estamos buscando formas alternativasde chegar à opinião pública cominformações de alta qualidade científica.BC&D – Quais os principais produtostransgênicos comercializadoshoje no mundo e que característicasforam introduzidas?Luiz Antônio – O mundo hoje cultivacerca de 52 milhões de hectares detransgênicos, ou seja, uma área supe-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 5

ior a da agricultura brasileira, principalmentede soja, milho, algodão ecanola. Mas vários outros produtos estãoentrando no mercado, como arroz,tomate,e abóbora, só que em escalaainda menor. Os primeiros produtos,que já são amplamente difundidos naagricultura mundial, alcançam um rendimentode aproximadamente 150milhões de toneladas (se fizermos umaestimativa muito rudimentar de umrendimento de três toneladas por hectare),ou seja, uma vez e meia toda aprodução agrícola brasileira. Então, éóbvio que se esses produtos apresentassemalgum problema para o meioambiente ou à saúde humana, depoisde sete anos de cultivo, isso já teriasido evidenciado. No entanto, não hánenhum registro de que esses produtosfaçam mal. O que se ouve sãoacusações infundadas. Primeiro foi abatata transgênica, depois a borboletamonarca, e, agora, mais recentementeapareceu o milho que supostamenteestá “contaminando” o milho do México.E depois que essas acusações sãodivulgadas na imprensa, é muito difícildesmentí-las, mesmo com comprovaçõescientíficas.BC&D – Considerando a megabiodiversidadebrasileira, o senhoracha que o Brasil tem boas chancesde participar da corrida tecnológicacom os países de primeiromundo?Luiz Antônio - Eu acredito que sim.Acho que a biotecnologia agrícola aindaestá começando porque atualmenteos transgênicos usam um númeromuito pequeno de genes, sendo amaioria de bactérias; resistência a insetose vírus; e tolerância a herbicidas.Há ainda alguns para resistência afungos, mas ainda é uma coisa muitoincipiente. Existem alguns casos desucesso com os transgênicos que alteramvias metabólicas produzindo plantasde melhor qualidade nutricional,como é o caso do arroz dourado, quetem um teor mais alto de vitamina A;da canola e da soja, com teor maisbaixo de ácidos graxos saturados, eque, por essa razão, têm uma conseqüênciamenos prejudicial ao acúmulode colesterol no organismo humano."A tendência natural éque as soluções biológicascomecem a substituir assoluções químicas. E éóbvio que isso não podeacontecer sem reação"Mas isso ainda é muito pouco. O recentesurgimento da era genômica vaipossibilitar progressos realmente significativospara a agricultura, já que vaisolucionar os principais processos limitantesda produção. Genes pararesistência à seca e toxidez de alumíniojá foram encontrados; estão começandoa aparecer genes que vão modificarfotossíntese, fixação de nitrogênioetc. Agora é que chegou a horadas grandes mudanças na agriculturamundial com base nos genes queestão sendo descobertos de formaacelerada pelas novas técnicas genômicas.E o Brasil, com a sua megabiodiversidade,tem enormes possibilidadesde identificação de novos genes. Ecomo, felizmente, houve muito investimentona área genômica nos últimosanos, o Brasil hoje domina muito bemessa área.BC&D – Como são feitos os pedidosde patenteamento de genesno mundo e, particularmente, noBrasil?Luiz Antônio – Existem leis mais oumenos permissivas. No Brasil, é possívelpatentear um processo inovadorque tenha aplicação industrial, como ode tolerância a herbicida, como o glifosato.E esse processo foi introduzidona planta através de uma construçãofeita por engenharia genética, que fazcom que a planta não seja prejudicadapelo herbicida. É importante destacarque no Brasil, somente o processo éque pode ser patenteado, e não ogene ou a planta, como em outrospaíses, como os EUA, por exemplo,que têm uma lei de patentes maispermissiva, que permite o patenteamentode genes, desde que a suafunção seja descrita.BC&D – Quais os principais produtostransgênicos que vêm sendodesenvolvidos no Brasil hoje?Luiz Antônio – Hoje estão sendoproduzidas no Brasil principalmenteplantas para resistência a viroses, comobatata, mamão e tomate e feijão resistenteao mosaico dourado, entre outras.Mas estão em andamento umasérie de outros projetos em cooperaçãocom empresas privadas para obtençãode transgênicos com tolerânciaa herbicidas e insetos em soja e algodão,por exemplo. A Embrapa fez umacooperação com a Monsanto para introduzirgenes de tolerância a glifosatoem seus cultivares. A Embrapa é adona da genética e a Monsanto, dapatente do processo de tolerância aoglifosato. Se for autorizada a comercializaçãode transgênicos, a Embrapaimediatamente vai colocar no mercadoa soja com tolerância a glifosatoque, na minha opinião, é competitivacom a da Monsanto. A Embrapa Algodão,situada em Campina Grande, temtrabalhos em andamento para introduçãode genes de resistência a insetosem algodão, o que certamente levaráa uma redução drástica no uso deinseticidas. Então, resumindo, podemosdizer hoje que a Embrapa temuma boa genética e as empresas têmos genes, logo o casamento entre elasé a solução ideal até que a Empresatenha os seus próprios genes e possadesenvolver os produtos transgênicossozinha.BC&D – Há um ano foi apresentadoao mundo o primeiro bezerroclonado no Brasil. É possível otimizara clonagem animal a partirdas técnicas da transgenia?Luiz Antônio – As técnicas de transgeniavêm sendo utilizadas na áreaanimal com essa intenção. Não sãoexatamente aquelas utilizadas em plantas.No caso da Vitória, por exemplo,foi utilizada uma técnica de transfe-6 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

ência nuclear, através da retirada donúcleo de uma célula germinativa,substituindo-o pelo da doadora, o quepossibilitou a obtenção do clone daqueleque forneceu o núcleo. E não éisso que se faz em plantas. Existemainda algumas dificuldades para desenvolvera clonagem. Por exemplo,para fazer a Vitória, nós transferimosum núcleo de uma célula germinativa,nós ainda não conseguimos fazer umclone a partir de uma célula somática,como foi o caso da ovelha Dolly, ondefoi utilizada uma célula de glândulamamária diferenciada. Nós estamostentando fazer isso com células diferenciadas,que tem vantagens porquepode-se cultivar um grande númerode células e, assim, fazer várias tentativaspara conseguir clones. No caso daVitória, foram feitas cerca de 230 transferênciasaté chegar a um produtointeiramente sadio. Por outro lado,existem questões biológicas ainda nãototalmente elucidadas relativas ao processode biologia do desenvolvimentodos clones. A Dolly, por exemplo,vem tendo um envelhecimento precoce,não se sabe o porquê. Em suma,o ideal para a clonagem é trabalharcom células somáticas porque é umagarantia absoluta de que aquele produtovai ser efetivamente um clone epode-se usar um grande número decélulas para fazer animais transgênicos.Quando se trabalha com célulasembrionárias, se transfere um núcleoque já tem carga paterna e materna. Épor isso que trabalhar com célulassomáticas é o nosso próximo passo.Estamos desenvolvendo também animaistransgênicos, que é uma outratécnica, baseada na transformação decélulas somáticas por técnicas de bombardeamento,como com as plantas,ou por vetores virais. Para isso, precisamosde uma população grande decélulas porque nem sempre os métodosde transformação resultam emprodutos transgênicos que funcionemsatisfatoriamente. Muitas vezes, têmque se eliminar alguns porque o genepode ter sido introduzido em locais dogenoma que não são adequados, entreoutros motivos.BC&D – Recentemente cientistasbrasileiros surpreenderam o mundoquando anunciaram o sequenciamentoda bactéria Xilella fastidiosa,causadora de uma das pioresdoenças da citricultura, o amarelinho.Na prática, o que o estudodo genoma pode trazer de benefíciospara a agropecuária?" ...nesse período nós nãoconseguimos nenhum financiamentopara engenhariagenética por causa da proibiçãodos produtos transgênicos,o que é até compreensível,pois já que não poderemoscomercializar os produtos,por que fazer ciência?"Luiz Antônio – O estudo de genomasvai possibilitar uma rápida identificaçãofuncional de genes relacionadosaos principais processos que limitam aprodutividade das plantas que são deinteresse agrícola. Já foram identificadosmais de 100 genes, cuja função foiabsolutamente estabelecida e relacionadacom processos importantes relativosà agricultura, como resistência àseca e encharcamento, toxidez de alumínio,fotossíntese etc., além de genesrelacionados a fatores biológicos prejudiciaisà agricultura, como fungos,bactérias e nematóides, que são extremamentelimitantes da produção agrícola.Os estudos genômicos de algunsorganismos superiores importantes,como é o caso, por exemplo, da Arabidopsis– uma plantinha parente dorepolho – de C. ellegans, um vermemuito próximo dos nematóides fitopatogênicos,que tiveram os seus genomascompletamente seqüenciados ecom uma boa parte já, funcionalmenteelucidada, sem falar no genoma dearroz, vão disponibilizar um grandenúmero de genes para a engenhariagenética, que fará a agricultura dofuturo.BC&D – Mudando um pouco deassunto, mas nesse mesmo contextode pragas, em relação à saúdehumana, o mosquito da dengue– Aedes aegypti – tem atingidomilhares de pessoas, levando inclusiveà morte. O que a biotecnologiapode fazer para minimizaresse flagelo?Luiz Antônio – A área de controlebiológico vem crescendo justificadamenteno Brasil e em outros países.Eu, particularmente, sou um forte adeptodas soluções biológicas por engenhariagenética ou não. No caso doAedes aegypti e de outros vetores dedoenças humanas graves, como amalária, que é transmitida pelo Anopheles,o que se faz essencialmente éidentificar estirpes de bactérias quesão altamente tóxicas a esses mosquitos.No caso da dengue já existemestirpes que foram claramente caracterizadasaqui na Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia e em outrasinstituições que, de fato, controlamcom muita eficiência o mosquitoda dengue. Portanto, essa é uma linhatecnológica extremamente importante,mas não tem relação com nenhumaatividade de transgenia. Há um grandeinteresse na identificação do genomado mosquito causador da malária, queé de outro gênero, porque desse estudopodem surgir propostas interessantespara seu controle, quem sabe atéatravés de técnicas de biologia molecular,transgênicas ou não. O que euacho é que a ciência não pode ficarlimitada no seu fluxo por razões quenão são justificáveis. Com isso, eu nãoestou querendo dizer que não se deveimpor um comportamento ético à ciência,mas o pior que pode acontecerao progresso mundial é obstruir ofluxo do conhecimento, proibindo-ode seguir o seu curso normal. E isso éo que vem acontecendo no Brasil eem países da Europa, como a Itália.Pela primeira vez na história do nossopaís uma tecnologia está sendo negadaaos agricultores brasileiros. Conseqüênciasterríveis vêm acontecendo apartir disso, do ponto de vista econômico,como nós já falamos, mas maisdo que isso: nós não temos conseguidomais nenhum financiamento deagências de fomento à ciência paraBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 7

trabalhar com engenharia genética.Há dois anos e meio que eu estou nachefia da Embrapa Recursos Genéticose Biotecnologia e nesse períodonós não conseguimos nenhum financiamentopara engenharia genética porcausa da proibição dos produtos transgênicos,o que é até compreensível, jáque se não poderemos comercializaros produtos, por que fazer ciência? Asagências públicas não estão financiando,e o setor privado tem medo definanciar. Nós temos genes, por exemplo,que impedem o desenvolvimentoda vassoura de bruxa, um fungo queataca o cacau no sul da Bahia, mas nãopodemos fazer o cacau transgênicoporque não há interesse da indústria,em função desse entrave legal. Emoutros países, principalmente na Europa,a situação é ainda pior. Na Itália,por exemplo, os ministérios que financiama ciência não aprovam o repassede recursos financeiros para pesquisascom transgênicos, estão impedindo odesenvolvimento da ciência naquelepaís, o que é lamentável.BC&D – Voltando aos transgênicos,a imprensa tem noticiado comfrequência que cultiva-se no Brasil,ilegalmente, mais de três milhõesde hectares de soja geneticamentemodificada. Na sua opinião,esse clamor popular serácapaz de sensibilizar as autoridadespara a liberação comercialdesse produto?Luiz Antônio – Como pesquisadorcujo trabalho se destina a melhorar aqualidade de vida do produtor e dasociedade, eu diria que quanto maiscedo o agricultor conseguir cultivarsoja transgênica legalmente melhorserá para a agricultura, na medida emque ele vai obter maiores lucros. Eleprecisa desses lucros e tem perdidonos últimos anos em função do impedimentolegal aos transgênicos no Brasil.Entretanto, o que está acontecendoé que a difusão ilegal dessa soja temprofundos reflexos em outros setoresda indústria agrícola, que talvez sejamirrecuperáveis. Se o uso de transgênicoscontinuar proibido no Brasil, sejapor questões legais ou não, essa proibiçãoterá o efeito inverso de fazercom que a difusão da soja se generalize.Eu costumo sempre dizer que sequiserem fazer com que o Brasil plantetoda a sua área com soja transgênicaé muito fácil, basta proibir mais unsquatro ou cinco anos. Agora qual é aconseqüência disso? Toda a indústriade semente de soja brasileira, que hámuito custo nós conseguimos desenvolvernos últimos 40 anos, vai ficarseveramente abalada. E a conseqüênciadisso para o Brasil é a pior possívelporque 50% do agronegócio de sementeno Brasil é de soja. Além disso,instituições como a Embrapa, que poderiamter bastante retorno financeirodos 20 anos de investimentos feitosem biotecnologia, estão seriamenteprejudicadas pelo fato de não teremfinanciamento para as pesquisas. Parase ter uma idéia, vamos analisar, porexemplo, o acordo que foi feito entrea Empresa e a Monsanto. Para cadahectare plantado com a tecnologia,haveria um retorno de R$ 1,00. Então,vamos imaginar que esses três milhõesde hectares de soja ilegal fossemcultivados com a soja da Embrapa, nósteríamos um retorno de R$ 3 milhõespor ano. Com isso, o orçamento danossa Unidade poderia ser dobrado. Eé importante lembrar que isso é apenasum décimo da área de plantio desoja no Brasil. Portanto, é fácil concluirque em conseqüência de apenas umgene nós poderíamos ter um enormeavanço para a biotecnologia e para aagricultura brasileira.BC&D – A Folha de São Paulodivulgou recentemente que os produtostransgênicos serão submetidosao Ibama, de acordo comdecisão do Conama (ConselhoNacional do Meio Ambiente). Comisso a CTNBio (Comissão TécnicaNacional de Biossegurança) perderáo seu poder regulador? Osenhor acha que com essa decisãoficará ainda mais difícil aliberação dos OGM’s no país?Luiz Antônio – Eu não tive tempoainda para analisar cuidadosamente aquestão do CONAMA. Mas é importantedizer que a lei é clara. A leiestabelece que a instituição que tem acompetência para determinar se umproduto transgênico é passível deefeitos prejudiciais ao meio ambienteé a CTNBio (Comissão TécnicaNacional de Biossegurança). Em outraspalavras, a Comissão é, de acordocom a lei, quem pode dizer se umdeterminado produto transgênicoconstitui potencialmente um riscoambiental. Ora, a possibilidade deum risco ambiental é o que determinase é necessário fazer um estudode impacto ambiental para empreendimentos. Isso é assegurado peloartigo 225, IV, da Constituição. Portanto,a lei não muda com uma resoluçãodo CONAMA, mas o que euobservo é que ao longo de todas ascampanhas de percepção públicaque vêm sendo feitas, tem havidoum esforço para dificultar a liberaçãode transgênicos. E esse esforço conseguiu,de alguma forma, contaminaro Executivo. É evidente que o licenciamentoambiental é uma prerrogativados órgãos ambientais, mas comrelação a transgênicos, quem temque dar a última palavra, pela lei, é aCTNBio, a não ser que a lei sejarevogada. Isso mostra que os órgãosambientais do Executivo brasileironão reconhecem a existência da lei.Eles acham que a lei de biossegurançanão deve ser seguida. Não a tratamcomo o instrumento referencialpara o funcionamento da questão detransgênicos do ponto de vista ambiental.Então, dessa forma é extremamentecomplicado garantir o funcionamentodo processo. Se essa resoluçãofor aprovada, vai representarmais um atraso para a questão dostransgênicos e o país paga por esseatraso. A sociedade sofre com isso naagricultura e em outros setores daeconomia. Eu acho que impedir odesenvolvimento da biotecnologiaagrícola constitui um crime de lesapátria. É o que, lamentavelmente,está acontecendo no Brasil. A agriculturae o país, de forma geral, estãosendo prejudicados. E eu quero saberquem vai pagar por isso. Porquealguém tem que ser responsável poressas decisões que estão impedindoo desenvolvimento da biotecnologiabrasileira e fazendo com que o Brasilperca a competitividade internacional.8 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

ANÚNCIOPORTALBIOTECNOLOGIA.COM.BR(Repete fotolito que saiu na pág. 09, edição 25)

Carta ao LeitorBIOTECNOLOGIA Ciência & DesenvolvimentoKL3 PublicaçõesFundadorHenrique da Silva CastroDireção Geral e EdiçãoAna Lúcia de AlmeidaDiretor de ArteHenrique S. Castro FºProjeto GráficoAgência de Comunicação IRISwww.agenciairis.com.briris@agenciairis.com.brGerente AdministrativoLuiz Dourado BezerraSecretáriaVilma da Silva DuarteE-mailbiotecnologia@biotecnologia.com.brHome-Pagewww.biotecnologia.com.brA Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento chega,nesta edição, ao quinto aniversário. Foram cinco anos de empenhoabsoluto de uma equipe que acreditou numa publicação que fossecapaz de divulgar os trabalhos de pesquisa que estão sendorealizados no país, e em português. Na versão impressa mantivemoscontinuamente a qualidade de produção gráfica, emboravários aumentos de custo e contínuas desvalorizações da nossamoeda tornaram o caminho mais penoso.Na internet, nosso pioneirismo esteve presente desde a primeiraedição, em 1997, quando a grande rede ainda dava seus primeirospassos. Hoje, o número de acessos, tanto do Brasil como doexterior, refletem o sucesso editorial.E tudo isso serviu, apenas como suporte, para nosso maiorpatrimônio: o conteúdo das matérias, rigorosamente selecionadopelo nosso conselho científico e gentilmente cedido por competentescolaboradores.Meia década. No nosso aniversário, agradecemos a todos queajudaram a concretizar esse trabalho.Dr. Henrique da Silva CastroNota: Todas as edições da Revista Biotecnologia Ciência &Desenvolvimento estão sendo indexadas para o AGRIS(International Information System for the Agricultural Sciencesand Technology) da FAO e para a AGROBASE (Base de Dados daAgricultura Brasileira).Departamento Comercial,Redação e Edição:SRTV/Sul - Quadra 701Ed. Palácio do Rádio IISala 215 - CEP 70340-902Brasília - DFTel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976Fax: (061) 224-2830Impressão: Gráfica São FranciscoFotolito: RibelitoAssinaturasO pedido de assinatura é realizado atravésda carta resposta-comercial encartada emcada revista, por telefonema ou faxdiretamente à KL3 ou pela Internetatravés dos nossos endereços eletrônicos.A revista não tem vendedores autorizados.Os artigos assinados são de inteiraresponsabilidade de seus autores.10 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002ISSN 1414-4522

Conselho CientíficoDr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Henrique da Silva Castro - Saúde;Dr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dr. Maçao Tadano - Agricultura;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - FitopatologiaFundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos GenéticosInstituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto RogeroSociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJColaboraram nesta edição:Alexander de Andrade;Alysson Renato Muotri;Ana Letícia Bertolo;Andréa Queiroz Maranhão;Anne Helene Souza Martinelli;Armando Morais Ventura;Augusto Schrank;Carlos Alberto Labate;Carlos Frederico Martins Menck;Carlos R. F. Grosso;Claudio Lima Aguiar;Esteban Roberto González;Farayde Matta Fakhouri;Gisele Coelho Lacerda;Jussara Bianchi Castelli;Luiz Antônio Barreto de Castro;Marcelo de Macedo Brígido;Marcio O. Lásaro;Margot Alves Nunes Dode;Maria Carolina Nasser Marchetto;Maria Cristina Ramos Costa;Maria Rosa Costa;Marilene Henning Vainstein;Mônica T. Veneziano Labate;Osmar Alves Lameira;Paloma Koprovski Menguer;Patrícia Tanada-Palmu;Pedro Edson Moreira Guimarães;Raphael Tozelli Carneiro;Rodolfo Rumpf;Siumar Camassola;Sydnei Mitidieri;Tobias José Barreto Menezes;Valéria A. Prado Defávari;Viviane Castro Yoshino.EntrevistaLuiz Antônio Barreto de Castro pág. 04PesquisaFilmes biodegradáveis pág. 12Transformação genética do eucalipto pág. 18SNPs: Sutis diferenças de um código pág. 24Caracterização genética do curauá pág. 28Produção in vitro de embriões na espécie bovina pág. 32Vetores adenovirais pág. 38Bibliotecas apresentadas em fagos pág. 44Conversão enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pág. 52Detergentes biológicos biodegradáveis pág. 56NotíciasBioNotícias pág. 62Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 11

PESQUISAFILMESBIODEGRADÁVEISFotos cedidas pelos autoresExtensão da vida útil de frutas tropicaisFigura 1 - Filme de gelatina contraum fundo de cor do sistema“Hunter”Patrícia Tanada-PalmuDoutoranda em Tecnologia de Alimentosaplicada à Nutrição, Faculdade deEngenharia de Alimentos, UnicampFarayde Matta FakhouriMestranda em Tecnologia de Alimentosaplicada à Nutrição, Faculdade deEngenharia de Alimentos, UnicampCarlos R. F. GrossoProfessor de Controle de Qualidade,Faculdade de Engenharia de Alimentos,Unicampgrosso@fea.unicamp.br12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002ecentemente surgiu umgrande interesse pelo desenvolvimentode biofilmescomestíveis ou degradáveisbiologicamente, principalmentedevido à demanda por alimentosde alta qualidade, às preocupaçõesambientais sobre o descarte das materiaisnão renováveis das embalagenspara alimentos e às oportunidades paracriar novos mercados às matérias-primasformadoras defilme, derivadas de produtosagrícolas. Biofilme é umfilme fino preparado de materiaisbiológicos, que agecomo barreira a elementosexternos e, conseqüentemente,pode proteger o produtoe aumentar a sua vidade prateleira. Algumas possíveispropriedades funcionaisdos filmes incluem retardara migração de umidade,o transporte de gases(O 2, CO 2), a migração deóleo ou gordura, o transportede solutos, oferecer umaintegridade estrutural adicionalaos alimentos, podendotambém reter compostos aromáticose carregar aditivos alimentícios oucomponentes com atividade anti-bacterianaou anti-fúngica, com liberaçãocontrolada sobre o produto onde foiaplicado.Os biofilmes são geralmente produzidoscom materiais biológicos, comopolissacarídios, proteínas, lipídios ederivados. Glúten de trigo é um termogeral para as proteínas insolúveis emágua da farinha de trigo, suas característicasde coesão e elasticidade produzemintegridade e facilitam a formaçãode filme. O filme protéico mais comumenteutilizado, entretanto, é o colágeno,que é normalmente empregadocomo cobertura de carnes processadas.A gelatina é uma proteína derivadado colágeno. A celulose acetatofitalato (CAP) é um polímero comumenteutilizado como cobertura emmedicamentos (comprimidos) destinadosa ser processados no intestino,sendo conhecido como cobertura entérica,por apresentar resistência àscondições de pH ácido. Os biofilmespossuem potencial para controlar aperda de umidade e para controlartambém a troca de oxigênio, etileno edióxido de carbono do tecidos de frutas;dessa forma, poderiam controlar arespiração do produto e aumentar suavida de prateleira, funcionando comouma alternativa ao tratamento por atmosferacontrolada (Avena-Bustillose Krochta, 1993), alternativa essaque está sendo empregada na preservaçãode frutas e hortaliças, porém queapresenta alguns inconvenientes incluindocustos de processo. Trabalhosrecentes estão explorando o potencialdas coberturas comestíveis de superfíciepara manter e estender a qualidadee a vida útil de produtos frescos ereduzir a quantidade de embalagensdescartáveis não-biodegradáveis, incluindoas coberturas aplicadas em frutas,como bananas (Banks, 1984), frutascítricas (Hagenmaier & Baker, 1993),maçãs (Banks et al., 1997), mangas(Carrilo-Lopez et al., 2000) , peras(Amarante, 1998), abacates (Johnston& Banks, 1998), morangos (Garçíaet al., 1998) e goiabas (Oliveira& Cereda, 1999). As coberturas semipermeáveisapresentaram influênciana fisiologia das frutas, no atraso doamadurecimento e no metabolismopós-colheita.Filmes a base de proteínas apresentamefetiva barreira a gases (CO 2eO 2), porém alta permeabilidade aovapor d’água (Baldwin et al., 1995;

Figura 2 - Perda de peso das goiabas cobertas com glúten, gelatinae celulose acetato fitalato durante 14 dias de armazenamentoFigura 3 - Força de ruptura das goiabas cobertas com glúten, gelatina e celulosedurante 14 dias de armazenamentoKrochta, 1996) em função do seucaráter hidrofílico. De acordo com ouso pretendido dos filmes biopoliméricos,várias modificações das propriedadesde barreira ou melhoramento daresistência física podem ser possíveis.Uma forma de modificar as propriedadesdos filmes é introduzir associaçõesintermoleculares física, química ouenzimaticamente (Gennadios et al.,1996; Shih, 1994; Marquie et al.,1995; Lim et al., 1999). Outra possívelabordagem para melhorar as propriedadesfísicas dos filmes biopoliméricostem sido a de preparar filmescompostos através do uso combinadode polissacarídeos, proteínas e lipídeos(Lim & Jane, 1993; Kamper &Fennema, 1984). Muitos filmes compostose em bicamadas estão sendoproduzidos para combinar as propriedadesapresentadas pelos diferentesmateriais para melhorar as característicasdo filme resultante quanto à permeabilidade,resistência mecânica, flexibilidade,cor, valor nutricional e aperformance de aplicação da cobertura(Amarante & Banks, 2001).O objetivo desse trabalho foi odesenvolvimento de um biofilme composto,contendo misturas de glúten detrigo, gelatina e celulose acetato fitalato,bem como testar sua aplicação emfrutas frescas. Entre as frutas, a goiabaencontra-se amplamente distribuídaem todas as regiões tropicais e subtropicaisdo mundo. No Brasil, ocorremgrandes perdas da produção agrícoladurante a fase pós-colheita, e essasperdas poderiam ser reduzidas com autilização do biofilme na cobertura defrutas. Segundo Medina et al. (1988),o comportamento do cultivar de goiabahíbrida (branca) exibiu rápido aumentona taxa de produção de CO 2após a colheita, até atingir um picoclimatérico; assim o prolongamento daconservação das goiabas, através dacobertura com os biofilmes, poderiamodular melhor a maturação, aumentandoo tempo de vida útil da fruta.No experimento foram utilizadosglúten de trigo vital (Rhodia, Campinas),gelatina (Leiner Davis, São Paulo),celulose acetato fitalato ( EastmanKodak, USA), fosfato de sódio monobásico(Synth, São Paulo), fosfato desódio tribásico (Synth, São Paulo), etanol(Ecibra, São Paulo), glicerol (Merck,Darmstadt, Alemanha), hidróxido deamônio (Synth, São Paulo), cloreto decálcio (Synth, São Paulo), nitrato demagnésio (Ecibra, São Paulo), cloretode sódio (Synth, São Paulo), ácidoclorídrico (Merck, Darmstadt, Alemanha)e goiabas frescas (adquiridas diretamentedo produtor situado próximoa Campinas).A solução formadora do filme deglúten foi preparada usando-se glútende trigo (9,0 g/100g solução), glicerol(1,5 g/100g solução), etanol (32,5 ml/100 ml solução), água destilada e hidróxidode amônio 6N para ajustar asolução a pH 10. Todos os componentesforam misturados sob agitaçãomagnética a 70 0 C. A solução filmogênicafoi centrifugada a 5.856 g por 6minutos, à temperatura ambiente. Apósisso, a solução filmogênica foi colocadasobre uma superfície de teflon e secaa temperatura ambiente por, aproximadamente,24 horas (método modificadoa partir do método de Gontardet al., 1993). O filme de gelatina foipreparado hidratando-se, por 1 hora,10 g de gelatina em 100 ml de águadestilada e, em seguida, aquecendo-seessa solução a 75 0 C por 10 minutos,Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 13

acrescentando-se a ela 0,5 g de glicerol.A solução de gelatina foi misturada,sob agitação magnética, à solução deglúten de trigo nas proporções de 1:1,1:4 e 4:1 e foi colocada em placas dePetri para secar em quantidade a formarfilmes de mesma espessura (16 mlde solução filmogênica por placa),enquanto o filme de celulose acetatofitalato foi preparado dissolvendo-sevagarosamente, em agitador mecânico10 g deste em solução tampãofosfato de sódio pH 8,0 e adicionandose0,5 g de glicerol. A solução decelulose foi misturada, sob agitaçãomagnética, à solução de glúten de trigonas proporções de 1:1, 1:4 e 4:1, sendocolocada em placas de Petri para secarde forma idêntica às anteriores.A espessura dos filmes foi medidapor meio de um micrômetro (ModeloMDC-25M, Mitutoyo, MFG, Japan), representandoa média de 5 medidasaleatórias em diferentes partes do filmee a permeabilidade ao vapor d’águadeterminada gravimetricamente em triplicataa 25 0 C, 75% de umidade relativa,usando-se o método modificadoE-96 da ASTM (ASTM, 1980). A taxade transmissão de oxigênio, feita emduplicata foi medida usando-se umamodificação do método padrão ASTMD 3985-81 com um aparelho Ox-Tran(Mocon, Inc., Minneapolis, USA) a 25 0C. As características de resistência mecânicados filmes a 25 0 C, incluindo aresistência à tração e a porcentagemde elongação na ruptura, foram determinadasusando-se um texturômetroTA.XT2 (SMS, Surrey, UK) operado deacordo com o método padrão ASTM D882-83, com separação inicial das garrase velocidade do “probe” de 50 mme 1 mm/s, respectivamente. A forçamáxima e a extensão no ponto deruptura foram obtidas para os filmestestados (100 mm de comprimento e25 mm de largura). Para todos ostestes, os filmes foram acondicionadospor dois dias em dessecadores com52% de umidade relativa, antes dostestes.A solubilidade em água foi obtidadeterminando-se a porcentagem domaterial seco do filme solubilizado emágua após 24 horas de imersão (Gontardet al., 1994) e do material inicial,determinada por secagem a 105 0 C,por 24 horas. Dois discos de 2 cm de14 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002Figura 4 - Micrografia do filme deceluloseFigura 5 - Micrografia do filme deglúten de trigoFigura 6 - Micrografia do filme degelatinaFigura 7 - Micrografia do filme compostode celulose e glúten de trigoFigura 8 - Micrografia do filme compostode gelatina e glúten de trigodiâmetro foram cortados dos filmes,pesados e imersos em 50 ml de águapor 24 horas em temperatura ambientee a quantidade remanescente esolubilizada foram determinadas gravimetricamenteapós secagem. A solubilidadeem solução ácida (HCl 1 N) foideterminada de forma semelhante àapresentada acima.As características de superfície dosfilmes foram analisadas por microscopiaeletrônica de varredura, usando-seum microscópio Jeol JMS-T330 (Tokyo,Japan) operado a 10 kV. As amostrasde filme foram fixadas em stubs dealumínio com fita de cobre e deixadasno dessecador a 0% de umidade relativa,por 7 dias. As amostras foramcobertas com ouro por meio do sputterBalzers (SDC 050, Baltec, Lichtenstein,Áustria) por 180 seg., a 40 mA. Diferençasestatísticas foram medidas comparando-semédias através do teste deTukey, em um intervalo de confiançade 95% utilizando-se o programa Statistica(Microsoft, USA).As goiabas foram escolhidas demodo que apresentassem a mesmauniformidade, coloração e ponto dematuração, fornecendo um lote homogêneo.Foram realizados seis tratamentospara cobrir as goiabas frescas comos biofilmes simples e compostos avaliando-seperda de peso e textura doproduto em função do tempo. As concentraçõesdos filmes compostos utilizadosna cobertura das goiabas foramas que apresentaram a menor permeabilidadeao vapor d’água. No tratamento1, as goiabas frescas foram imersasna solução formadora do filme decelulose acetato fitalato a temperaturaambiente, por 1 minuto, e foram penduradasatravés do cabo para secar emtemperatura ambiente. Em seguida, osfrutos foram acondicionados em bandejasplásticas para acompanhamentodo tratamento. No tratamento 2, asgoiabas foram imersas na solução formadorade filme de gelatina e notratamento 3, as goiabas foram imersasna solução formadora do filme de glúten.No tratamento 4, as goiabas foramimersas na solução formadora do filmecomposto de celulose e glúten (1:1) eno tratamento 5, a solução formadorade filme foi composta de gelatina eglúten (4:1). O tratamento 6 foi ocontrole, onde as goiabas foram imer-

sas por 1 minuto em água destilada.A perda de peso das goiabas foiacompanhada pesando-as no inícioe durante o armazenamento. Atextura das goiabas foi determinadaem texturômetro TA.XT2 (StableMicro System, Surrey, UK),através da medida da força deruptura usando-se um “probe” cilíndricode 1cm de diâmetro. Aseparação inicial do “probe” e suavelocidade foram de 30 mm e 1mm/s, respectivamente. As medidasde textura das goiabas foramtomadas com 1, 6, e 14 dias dearmazenamento em geladeira emtemperatura de, aproximadamente,7° C e 60% de umidade relativa.Fatias centrais com superfícies planasforam retiradas das goiabaspara o ensaio de textura.Os filmes compostos de glútende trigo e gelatina mostraram-setransparentes e resistentes. Comoexemplo, a Figura 1 apresenta umfilme de gelatina contra um fundode cor do sistema “Hunter” de medidade cores (L, a, b), onde o detalhe datransparência pode ser observado claramente.O aumento da concentraçãode gelatina no filme composto comglúten provocou o aumento da solubilidadetanto em água quanto em ácido.Filmes compostos com maior concentraçãode gelatina apresentaram-se totalmentesolúveis em meio ácido. Todosos filmes compostos da mistura degelatina e glúten melhoraram a permeabilidadeao vapor d’água em relaçãoao filme simples de glúten, sendoo melhor resultado o da mistura obtidopara gelatina/glúten na proporção 1:4(Tabela 1).A adição de gelatina nas misturasaumentou sensivelmente a resistênciaà tração em relação ao filme simples deglúten, diminuindo porém a elongaçãoem relação a ele. Os valores das propriedadesmecânicas dos filmes compostosse aproximam dos valores obtidospara o filme simples de gelatina. Comrelação à permeabilidade ao oxigênio,os valores obtidos pelas misturas forammais baixos se comparados com ovalor de permeabilidade do filme simplesde glúten, mas, mais, altos secomparados com os do filme simplesde gelatina (Tabela 1).As misturas de glúten de trigo eFigura 9 - A goiaba durante a análise notexturômetrocelulose formaram filmes opacos maisquebradiços devido à celulose. O aumentoda concentração de celulose namistura (celulose/glúten 1:1 e 4:1)resultou numa redução da permeabilidadeao vapor d’água, com valoressignificativamente mais baixos do queos apresentados pelos filmes simplesde glúten e de celulose.Os filmes compostos de glúten ecelulose foram totalmente solúveis emágua e os filmes com maior concentraçãode glúten apresentaram-se menossolúveis em ácido. Com relação àspropriedades mecânicas, o aumentoda concentração de celulose na misturacom glúten melhorou a resistência àtração, e piorou a elongação na rupturaquando comparados com o filme simplesde glúten.Devido à fragilidade dos filmes compostoscontendo celulose acetato fitalato,só foi possível caracterizar a permeabilidadeao oxigênio do filme compostopara a relação 1:1 (glúten ecelulose). O valor de permeabilidadeao oxigênio obtido por essa mistura foisignificativamente mais baixo comparadocom o filme simples de glúten,porém mais alto se comparado com ofilme simples de celulose.Adicionando-se celulose ou gelatinaaos filmes de glúten, foi possívelobter melhora na permeabilidadeao vapor d’água e ao oxigênio e naresistência mecânica do filme quantoà resistência à tração comparadoscom os filmes simples de glúten.As misturas de glúten e celulose(1:1 e 1:4) e glúten e gelatina (1:1e 4:1) apresentam valores próximospara a permeabilidade ao vapord’água. Os valores obtidos forammenores do que os observadopara celofane (7.27 gmm/m 2 dkPa,Taylor, 1986) e maiores do que osobservados para polietileno de altadensidade (0.02 gmm/m 2 dkPa,Smith, 1986). As misturas contendogelatina e glúten apresentarammelhor resistência mecânica que asmisturas de celulose e glúten, eapresentaram também resistênciamaior que os filmes de polietilenode alta densidade (17.3-34.6 MPa,Briston, 1988) . Quanto à permeabilidadeao oxigênio, as misturasapresentaram menor valor do queos filmes simples de glúten, menorque o valor observado para o de polietilenode alta densidade (427 cm 3 ìm/m 2 dkPa, Salame, 1986) e similar aovalor para o celofane (16 cm 3 ìm/m 2 dkPa, Taylor, 1986).As micrografias obtidas por microscopiaeletrônica de varredura são apresentadasnas Figuras de 4 a 8. A observaçãomicroscópica da superfície dosfilmes pode prover informações sobrea integridade, continuidade e tambémsobre a organização estrutural da matrizpolimérica filmogênica. Essas característicaspodem ajudar a explicar afuncionalidade dos filmes quanto à suaresistência física e às propriedades debarreira à permeação de água e gases.O arranjo conformacional característicoda gelatina em triplas hélices parecefavorecer uma estrutura de matrizmais organizada e assim funcionalmentemelhor. A observação das micrografias(Figuras 5 e 6) indica que os filmes deglúten e de gelatina individualmenteou em associação apresentam-se maiscontínuos. A morfologia dos filmes ondea celulose acetato fitalato foi utilizada(Figura 4 e 7) mostra, por outro lado,uma organização descontinuada dosfilmes, o que poderia justificar a menorresistência física observada nos ensaiosmecânicos efetuados. Deve-se obser-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 15

Figura 10 - A espessura do filme na goiaba cobertavar, entretanto, que, além da organizaçãoestrutural, existe uma estruturaprimária particular de cada proteína,onde o tipo, a quantidade e a disposiçãoespacial dos aminoácidos determinamum comportamento não desejadofrente à umidade relativa do ar, oque pode inviabilizar o aproveitamentode algumas proteínas, mesmo apresentandoboas propriedades mecânicase de barreira. Estudos nessa direçãoprecisam ser mais explorados.A perda de umidade das goiabasfrescas devido à transpiração foi observadadurante o armazenamento atravésde sua perda de peso. As coberturasde glúten de trigo, gelatina, celuloseacetato fitalato e as misturas deglúten de trigo e gelatina e glúten detrigo e celulose foram aplicadas a fimde reduzir a perda de peso e a mantera textura das goiabas frescas durante oarmazenamento. Foram realizadas comparaçõesda textura e da perda deentre as goiabas cobertas e os controles,durante duas semanas de armazenamento,em termos de porcentagemde perda de peso e força de ruptura(N), conforme ilustradas nas Figuras 2e 3. As goiabas cobertas com gelatinapura e mistura de glúten de trigo ecelulose apresentaram menor perdade peso do que as goiabas controle,durante o armazenamento, resultadoesperado e em concordância com osobservados para os testes de permeabilidadeao vapor d´água. Da mesmaforma, as goiabas cobertas com essesfilmes apresentaram uma maior preservaçãoda textura. Assim, as coberturasde gelatina e da mistura de glútene celulose foram as mais eficientes namanutenção da qualidade das goiabasfrescas. As Figuras 9 e 10, ilustram,respectivamente, o ensaio de texturae a espessura do filme na cobertura dafruta.Os resultados mostraram que foipossível obter melhores combinaçõesde glúten e celulose acetato fitalato oude glúten e gelatina com relação àpermeabilidade ao vapor de água doque os filmes simples desses mesmospolímeros. Com relação à resistênciaTabela 1 – Propriedades dos filmes compostos de glúten de trigo e gelatinaFilmeGel:glu (1:4)Gel:glu (1:1)Gel:glu (4:1)GelGluPermeabilidade aovapor d’água(gmm/m 2 dkPa)4.35 ± 0.06 a5.29 ± 0.75 a6.86 ± 0.71 a5.29 ± 0.65 a8.61 ± 1.03 a Permeabilidade aooxigênio (cm 3 µm/m 2 dkPa)20.52 ± 0.40 b16.60 ± 2.53 c14.08 ± 1.23 d9.00 ± 0.17 e41.02 ± 0.86 a Solubilidade emágua (%)*19.03 ± 0.88 b19.26 ± 0.67 b30.42 ± 0.20 a18.01 ± 0.78 b22.70 ± 4.10 b Solubilidadeem ácido (%)40.14 ± 2.52 c84.66 ± 4.52 b100.00 a100.00 a-Resistência àtração (MPa)41.53 ± 4.85 c33.93 ± 3.43 c69.94 ± 4.60 a57.47 ± 2.58 b5.25 ± 0.24 d Elongação naruptura (%)6.36 ± 1.98 b4.74 ± 0.29 b7.48 ± 0.71 b5.03 ± 0.69 b215.30 ± 12.20 a*Média e desvio padrão de replicatas. a-d Médias com letras sobrescritas diferentes são significativamente diferentes (P

mecânica, os filmes simples de glútenapresentam-se frágeis, podendo ser melhoradosquando misturas com celuloseou gelatina são empregadas. Melhorescaracterísticas mecânicas foram, entretanto,apresentadas para misturas filmogênicasgelatina-glúten. Na coberturadas goiabas frescas, o filme simples degelatina e o composto celulose-glútenforam os mais eficientes na preservaçãoda qualidade das frutas, diminuindo aperda de peso e mantendo a texturadurante o período de armazenamento.Novas associações entre diferentes materiaispoliméricos devem ser investigadas.AGRADECIMENTOAgradecemos à FAPESP (Fundaçãode Amparo à Pesquisa do Estado de SãoPaulo) pela bolsa de doutorado concedidaa Patrícia S. Tanada Palmu.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASAmarante, C. & Banks, N.M., 2001.Postharvest physiology and quality ofcoated fruit and vegetables.Horticultural Reviews, vol. 26, 161-238.Amarante, C. V. T. Gas exchange, ripeningbehaviour and postharvest quality ofcoated pears. Palmerston North, 1998.PhD. 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PesquisaTransformação genética doEUCALIPTOInoculação de cotilédones e folhas com Agrobacterium tumefaciensEsteban Roberto GonzálezDoutorando, Departamento de GenéticaESALQ-USPergonzal@carpa.ciagri.usp.brAlexander de AndradeMestrando, Departamento de GenéticaESALQ-USPandrade@carpa.ciagri.usp.brAna Letícia BertoloIC-FAPESP, Departamento de GenéticaESALQ-USPalfberto@carpa.ciagri.usp.brRaphael Tozelli CarneiroIC-FAPESP, Departamento de GenéticaESALQ-USPrtcarnei@carpa.ciagri.usp.brGisele Coelho LacerdaTécnica de Nível Superior,Departamento de Genética ESALQ-USPglacerda@esalq.usp.brValéria A. Prado DefávariTécnica de Nível Superior,Departamento de Genética ESALQ-USPvafranco@esalq.usp.brMônica T. Veneziano LabatePós-doutora, Departamento de GenéticaESALQ-USPmtvlabat@carpa.ciagri.usp.brIntroduçãoutilização do eucaliptona produção de celulosee papel, a partir dos anos40, transformou essa árvorena principal matéria-primadas indústrias do setor. Oeucalipto representa 69 % da áreareflorestada do Brasil, cerca de 1,5milhão de hectares. Atualmente, o Brasilsitua-se entre os três maiores fornecedoresmundiais de papel para impressão.É o segundo maior exportadorde celulose de fibra curta e oprimeiro no caso de fibras produzidasa partir do eucalipto, detendo 45 % dasvendas desse produto.Grande parte do sucesso dessesetor florestal resulta dos investimentosrealizados pela indústria nacionalem busca de ganhos de produtividadee qualidade, o que possibilita a entradado produto brasileiro no mercado externo.O mercado internacional é bastantecompetitivo, principalmente comrelação aos países asiáticos, que tambémproduzem fibra curta. A principalvantagem competitiva do Brasil é a suatecnologia florestal, baseada em programasde melhoramento genético ede multiplicação clonal do eucalipto,desenvolvidos ao longo dos últimos 30anos. Todo esse ganho de conhecimentocientífico e tecnológico gerouum ganho na produtividade; de 20 m 3 /ha/ano (8 árvores/m 3 ), no início dadécada de 70, para 50 m 3 /ha/ano (3,1árvores/m 3 ), em 1999. Apesar desseaumento fantástico em produtividade,essa vantagem competitiva pode sersuperada por outros países competi-Carlos Alberto LabateProfessor Dr., Departamento de GenéticaESALQ-USPcalabate@carpa.ciagri.usp.brFigura 1 - Avaliação da eficiência do sistema de regeneração de diferentesexplantes de E. grandis (azul), E. grandis x E. urophylla (verde) e E.urophylla (amarelo)18 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Tabela 1 . Meios de cultivo utilizados nos experimentos de regeneração deEucalyptus. MM: meio de multiplicação; MA meio de alongamento; ME: meiode enraizamento. O meio M1 foi utilizado para a formação de cali e o meioM2 como indutor de gemas. O meio básico utilizado (MB) contém a metadeda concentração dos macronutrientes do meio MS (Murashige & Skoog,1962), micronutrientes de MS, 3 % (p/v) de sacarose e 0,6 % de ágar, pH 5,8e vitaminas MS-B (Barrueto Cid et al., 1994). 6-benziladenina (BA), ácidoindol butírico (IBA), ácido α-naftaleno acético (ANA), 1-fenil-3-(1,2,3-tidiazol-5-yl) uréia (TDZ)Meios de cultura Reguladores de crescimento (µM)BA IBA ANA TDZMM 0,006 - 0,88 -MA 0,44 1 - -ME - 4,9 - -M1 - - 2,5 1M2 - - 2,5 2dores com ganhos em economia deescala, equipamentos atualizados eacesso a capitais de longo prazo. Daí anecessidade de investimentos em novastecnologias que permitam a manutençãodessa vantagem competitiva,com o oferecimento de produtos demelhor qualidade, com baixo custo deprodução.A aplicação dos métodos convencionaisde melhoramento na área florestal,embora eficiente, é relativamentelenta, principalmente devido ao temponecessário para se completar cadageração de cruzamentos e a obtençãode progênies segregantes; na maioriados casos, alguns anos. A introdução degenes de interesse em progênies eclones comerciais de eucalipto, pormeio da transformação genética, ofereceuma excelente oportunidade paraacelerar-se o processo de obtenção degenótipos superiores. Entretanto, atransformação de espécies arbóreasainda é bastante difícil, principalmentepara o gênero Eucalyptus. Até poucotempo, a literatura registrava a transformaçãogenética de apenas duasespécies, E. globulus e E. camaldulensis(Mullins et al., 1997; Ho et al., 1998;Moralejo et al., 1998; Harcourt et al.,2000), mas, recentemente, Gonzálezet al. (2002) descreveram a transformaçãode E. grandis x E. urophylla, queé o principal híbrido comercial utilizadono Brasil.A dificuldade em se obter plantastransgênicas de eucalipto está associadaà baixa capacidade de regeneraçãode algumas espécies e ao sistema deseleção dos transformantes. Nos trabalhosacima citados, com exceção deHarcourt et al. (2000), que utilizaram ogene de resistência ao herbicida fosfinotricina(PPT) para a seleção dostransformantes, os demais empregaramo gene nptII, que confere resistênciaaos antibióticos aminoglicosídicos,como, por exemplo, a canamicina e ageneticina G-418. A seleção com antibióticosapresenta sérias dificuldadespara o eucalipto, em razão da existênciade variabilidade genética para tolerânciaa esses compostos químicos,como discutido mais adiante.De maneira geral, a obtenção deplantas transgênicas depende de trêscondições:I) Regeneração de plantas a partirde células ou tecidos transformados;II) Seleção que permita diferenciaras células transformadas;III) Transferência do gene de interessee sua integração no genoma doeucalipto; expressão e herança do DNAexógeno.Regeneração de Eucalyptuspor organogênese indiretaFigura 2 - Taxa de explantes vivos (%) de E. grandis após 30 dias de exposiçãoaos agentes seletivos CAN (Canamicina) e G-418 (Geneticina)A obtenção de plantas transgênicasde eucalipto requer uma metodologiaeficiente de regeneração, seja por organogêneseindireta de certos tecidos,ou por meio da embriogênese somática.A embriogênese somática já foidescrita para algumas espécies comerciaisimportantes de eucalipto, onde,na maioria dos casos, as plantas foramregeneradas a partir de plântulas (Muralidharane Mascarenhas, 1989; WattBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 19

Figura 3 - Taxa de formação de cali (%) de E. grandis após 45 dias de exposiçãoaos agentes seletivosFigura 4. Expressão do gene da β-glucuronidase em folhas de clones (A) ecotilédones de plântulas (B)et al., 1991). Os melhores resultadoscom organogênese indireta foram obtidoscom tecidos jovens, como cotilédonese hipocótilos (Tibok et al., 1995;Barrueto Cid et al. 1999). A regeneraçãode plantas a partir de órgãos madurostambém já foi relatada para algumasespécies, como por exemplo, apartir de folhas de E. citriodora (Muralidharane Mascarenhas, 1987), E. tereticornis(Subbaiah e Minocha, 1990) ede E. grandis (Laine e David, 1994).De maneira geral, esses trabalhosrelatam o uso de tidiazuron (TDZ) paraa indução de organogênese indireta dediferentes tecidos vegetais. Com oobjetivo de ajustar e de conhecer osefeitos dessa citocinina às nossas condições,realizamos uma avaliação maisdetalhada da regeneração de E. grandis,E. urophylla e do híbrido E. grandisx E. urophylla. Sementes dessesgenótipos foram germinadas por 20dias em meio MS (Murashige e Skoog,1962), até a formação de plântulas,que foram então excisadas. Os trêstipos de explantes utilizados: cotilédones,primeiro par de folhas, hipocótiloe raiz foram individualizados e transferidospara meio de cultura M1 (Tabela1), por 60 dias, renovando-se essemeio a cada 15 dias. Após esse período,foram mantidos em meio de multiplicação(MM, Tabela 1) por 30 dias e,finalmente, os cali, contendo as brotações,foram transferidos para meio dealongamento (MA, Tabela 1). O delineamentoestatístico foi inteiramentecasualizado, com seis repetições portratamento, contendo 23 explantes porparcela. O experimento fatorial foiorganizado considerando-se como fator1 as espécies de eucalipto e comofator 2 o tipo de explante. Os tratamentosresultaram das combinaçõesentre os genótipos de eucalipto e otipo de explante. Quatro tipos de explantesforam considerados: raízes,cotilédones, folhas e hipocótilos, totalizandodoze tratamentos. Os valoresestão expressos em porcentagem decali que emitiram brotações após 120dias (Figura 1).A eficiência de regeneração dependedo tipo de explante e da espécie,como podemos observar na figura1. As taxas de regeneração, a partir decotilédones, do híbrido E. grandis x E.urophylla, e de E. grandis apresentaramos melhores resultados, ao redorde 22% a 25%, respectivamente; emboraas folhas e hipocótilos tambémtenham produzido boas taxas de regeneração.As raízes mostraram uma baixaeficiência de regeneração. No casoparticular de E. urophylla, os valoresde regeneração observados para todosos tipos de explantes foram os maisbaixos, inclusive não se conseguindoregenerar plantas a partir das raízes. Omesmo foi observado nos trabalhos deBennet e McComb (1982) e Laine eDavid (1994), para o caso de E. marginatae E. grandis, respectivamente.Nesse protocolo, o TDZ foi incorporadoaos meios de formação de calie de desenvolvimento de gemas, conseguindo-se,dessa forma, uma altafreqüência de indução de gemas, além20 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 5. Seqüência do protocolo de transformação genética do eucalipto: (A)Inoculação com Agrobacterium tumefaciens contendo o gene de interesse, (B)Cotilédone (esquerda) ou folha (direita), (C) calo induzido a partir de cotilédone oufolhas na presença de TDZ, (D) formação de brotações, (E) plântulas em fase de alongamentoe enrizamento, (F) plantas regeneradas e cultivadas em câmara de crescimento,(G) Southern blot dos transformantes primáriosde uma maior capacidade de formaçãode brotos e de plantas regeneradas. Osderivados da uréia, como o TDZ, possuemefeito similar às citocininas, sendocapazes de estimular diferentesrespostas morfogenéticas, inclusive aformação de brotos em diferentes espéciesvegetais (Huetteman & Precee,1993). O efeito indutor da formaçãode brotações destes compostos émais pronunciado do que o observadocom BAP, para a maioria das espéciesvegetais testadas e, particularmente,em espécies arbóreas (Lu, 1993). Emborao modo de ação desses compostosnão seja totalmente conhecido (Hare& Van Staden, 1994), parece estarenvolvido com a ativação e a diferenciaçãode células específicas durante oprocesso de regeneração de hipocótilosde E. globulus (Azmi et al., 1997).Efeito dos antibióticos naseleção de transformantesUm fator importante na obtençãode plantas transgênicas é a existênciade um bom sistema de seleção detransformantes. Os antibióticos são amplamenteutilizados para essa finalidade,entretanto, apresentam desvantagens,como, por exemplo, a existênciade variabilidade genética no eucaliptopara tolerância a determinados antibióticos,possibilitando a ocorrência deescapes, ou seja, falsos transformantespositivos. Tanto a canamicina, como ageneticina G-418 são antibióticos queinibem a síntese de proteínas nas célulaspela associação à subunidade menordos ribossomos.A resposta às diferentes concentraçõesdesses dois antibióticos, foi avaliadaem cotilédones cortados de plântulascom 20 dias. O experimentobaseou-se no sistema de regeneraçãodescrito anteriormente. Cotilédones deE grandis foram cortados e submetidosaos seguintes tratamentos: controlepositivo, com o explante em meio decultivo, na ausência de agente seletivo;canamicina nas concentrações de50 e 100 mg/L e geneticina,nas concentrações de 2,5, 5 e10 mg/L. Dois parâmetros foramutilizados nas avaliaçõese estão expressos em porcentagens:número de explantesvivos após 30 dias deexposição aos agentes seletivos,e número de cali formadosapós 45 dias (Figuras 2 e3, respectivamente).Pela análise comparativaentre os agentes seletivos utilizados,pode-se observar quea geneticina foi mais eficiente,se considerarmos a porcentagemde morte dos explantes.Entretanto, os explantesque não morreram, apresentaramformação de cali, oque dificulta o uso desse antibióticocomo agente seletivo.Um dos possíveis problemasdo uso da geneticina é suabaixa difusão nos tecidos,permitindo o aparecimentode escapes. Já, a canamicinainibiu drasticamente a regeneraçãode cali (Figura 3). Noentanto, os explantes nãoapresentaram alta taxa demortalidade (Figura 2).Esses resultados confirmama baixa eficiência dos antibióticosaminoglicosídicos para a seleção detransformantes em Eucalyptus queapresentam tolerância natural a essescompostos químicos, embora tenhaminibido a regeneração de cali transgênicos.A geneticina G418 induziu necrosesseveras dos explantes, ocasionandoa morte rápida dos mesmos, mas,em baixas concentrações, levou aoaparecimento de escapes.Transformação genética deEucalyptus por meio deAgrobacteriumA metodologia utiliza a transformaçãogenética por meio deAgrobacterium,e pode ser empregadapara cotilédones ou folhas de clonesmicropropagados de Eucalyptus grandis,Eucalyptus urophylla e do híbridoE. grandis x E. urophylla. No caso decotilédones, as sementes são esterilizadase semeadas em placas de Petricontendo meio de cultivo MS (Mu-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 21

ashige e Skoog, 1962), e mantidas,por dois dias, em câmara de crescimento,sob condições controladas defotoperíodo (16h de luz e 8h de escuro)e temperatura de 26°C. Após esseperíodo, as sementes que germinaram,ou se for o caso, as folhas declones micropropagados, são inoculadasem meio líquido MS contendoAgrobacterium tumefaciens (na densidadede 10 7 -10 9 células/mL) e mantidasem co-cultivo por 24h, na presençade acetoseringona (20 mg/L), sobagitação constante (100 rpm). Em seguida,as sementes ou as folhas sãotransferidas para placas de Petri contendomeio MS sólido para o co-cultivoem meio sólido por mais 48h. O materialé posteriormente lavado em águaestéril contendo 200 mg/L de cefotaxima,submetido à secagem em papelde filtro estéril, antes de ser transferidopara meio MS sólido contendo 100mg/L de cefotaxima. A figura 4A mostraa expressão transitória do geneuidA que codifica a enzima β-glucuronidase(GUS), sob o controle do promotor35S do vírus do mosaico dacouve-flor (CaMV), em folhas cotiledonares,após 15 dias do co-cultivo. Podeseobservar que a transformação doscotilédones ocorre preferencialmentenas regiões periféricas (Figura 4B). Afigura 5 mostra a sequência completado processo de transformação de E.grandis x E. urophylla de cotilédonesou folhas de clones micropropagados.Após a inoculação dos tecidos com aAgrobacterium, o material é transferidopara o meio de formação de calo M1(Tabela 1) contendo 5 mg/L de geneticinaG-418 (Figura 5C). Posteriormente,os cali são transferidos para omeio de indução de brotações M2(Tabela 1) na presença do agenteseletivo (Figura 5D), até a formação debrotações, que são, então, mantidasem meio de alongamento (MA, Tabela1) por 30 dias, sendo, em seguida,transferidas para meio de enraizamento(ME, Tabela 1) (Figura 5E). Uma vezformadas as raízes, as plântulas sãotransferidas para vaso e mantidas emcâmara de crescimento sob condiçõescontroladas (Figura 5F). A análise molecularpara a confirmação da integraçãodo gene de interesse no genomada planta é feita com o auxílio datécnica de Southern blot, como ilustradona figura 5G, para quatro plantastransgênicas de E. grandis x E. urophyllaque expressam o gene Lhcb1*2de ervilha (Gonzáles et al., 2002).AgradecimentosEsse projeto foi financiado pelaFAPESP (Inovação Tecnológica 98/01394-0), Cia. Suzano de Papel e Celulose,CNPq/Rhae e CAPES.Referências BibliográficasAzmi A Dewitte W, Drevet C, VanonckelenH, Landre P, Boudet AM,Jouanin L, Chriqui D (1997) Budregeneration from Eucalyptus globulusclones and seedlings throughhormonal imbalances induced byAgrobacterium tumefaciens strain82.139. 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AnúncioUNISCIENSE Hund Wetzlar(Novo)Fotolitos e provas em anexoObs.: Vai entrar outro anúncio UNISCIENSE(também novo) na página 31 desta ediçãoBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 23

SNPs:PesquisaSutis diferenças de um códigoO genoma sob um novo ponto de vistaPedro Edson Moreira GuimarãesOrientação do Prof. Dr. Emmanuel Dias NetoLaboratório de Neurociências – LIM27Departamento e Instituto de PsiquiatriaUniversidade de São Paulopedson@usp.brMaria Cristina Ramos Costa, PhDCoordenação do Prof. Dr. Marco Antonio ZagoCentro de Terapia Celular – Hemocentro de RibeirãoPretoFaculdade de Medicina de Ribeirão PretoUniversidade de São Paulomcrcosta@usp.brmedida que a seqüêncianucleotídica do genomahumano foi sendodesvendada, umaconstatação evidente foio grande número de variações deponto encontradas ao se compararsegmentos correspondentes do genoma(figura 1). Antes mesmo doprimeiro rascunho da seqüênciacompleta ser divulgado, uma grandeparcela da comunidade científicajá voltava sua atenção para essaspequenas e abundantes variaçõesdispersas por todo o código genético(figura 2). As mais comuns(ocorrem, aproximadamente, a cada600 bases) são denominadas polimorfismosde nucleotídeos únicosou SNPs (pronuncia-se ‘S’ ‘N’ ‘Ps’ou SNiPs), e correspondem a posiçõesonde existe uma alternânciados nucleotídeos A, C, G e T, emuma freqüência alélica mínima de1% em uma dada população(Brookes, 1999).Os SNPs ocorrem tanto em regiõescodificadoras como em nãocodificadoras dos genomas. Emregiões codificadoras, quando resultamem uma substituição deaminoácido na seqüência protéica,são denominados não sinônimos,podendo a substituição ser conservativaou não conservativa em funçãodas características dos aminoácidosenvolvidos na troca. Nessescasos, podem haver modificaçõesestruturais e funcionais na proteína. Embora SNPs sinônimos nãoalterem a seqüência protéica, elespodem modificar a estrutura e aestabilidade do RNA mensageiro,e, conseqüentemente afetar a quantidadede proteína produzida. Alémdisso, SNPs podem promover: splicingalternativo, alterações no padrãode expressão de genes (comono caso de alterações em seqüênciasde promotores), geração ou supressãode códons de terminaçãoou poliadenilação na molécula deRNA mensageiro e alteração noscódons de iniciação de tradução.As substituições mais freqüentesque ocorrem no DNA são as queFigura 1 - Alinhamento de seqüênciascorrespondentes ao mesmo segmentogenômico de três indivíduos,mostrando um SNP não sinônimo A/G, que causa a substituição deglutamina para arginina na seqüênciaprotéica.A) Indivíduo homozigoto AA.B) Indivíduo homozigoto GG.C) Indivíduo heterozigoto AG24 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 2 - Distribuição por cromossomo dos SNPs depositados no banco de dados dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). Aqui podemos observar, como mencionado no texto, que os polimorfismos humanos estão dispersospor todo o genomaenvolvem bases nitrogenadas demesma característica estrutural, ouseja, trocas entre duas purinas (A/G ou G/A) ou duas pirimidinas (C/T ou T/C) e são denominadas transições.As transversões são substituiçõesde uma purina por umapirimidina ou vice-versa. Essas alterações,algumas vezes, têm origemem erros de incorporação debases durante a replicação do DNA;em outros casos, são causadas porlesões no DNA por agentes ambientais.Caso essas mutações ocorramem células germinativas, sejamtransmitidas às gerações seguintese se fixem na população em umafreqüência mínima de 1%, passama ser denominadas de polimorfismos(Kwok & Gu, 1999).Atualmente, os SNPs podem serempregados nas mais diversas áreas,como medicina forense, antropologiamolecular, evolução, definiçãode marcadores de predisposiçãoa determinadas patologias ede prognóstico a diferentes tratamentos,genética de populações,conservação e manejo de fauna,farmacogenética, desenvolvimentode vacinas, entre outras. Comoexemplo, podemos citar o mecanismode resistência a uma droga recentementedesenvolvida para otratamento da leucemia mielóidecrônica, o STI571, que é um inibidorespecífico da atividade tirosinaquinase da proteína híbrida BCR-ABL, responsável pelo desenvolvimentodessa neoplasia. Apesar dosresultados favoráveis obtidos comessa nova droga, um grupo de pacientesmostrou-se resistente a ela.Em um estudo recente, foi demonstradoque a resistência à droga estárelacionada com um polimorfismono resíduo 315 da proteína. A substituiçãode treonina por isoleucinanessa posição impede a formaçãode uma ponte de hidrogênio essencialpara a ligação do inibidor. Dessaforma, uma análise prévia dessepolimorfismo em pacientes podeindicar quais devem ser tratadoscom o STI571 (Gorre et al., 2001).Um outro estudo recente, conduzidopor um grupo de pesquisadoresbrasileiros, identificou umSNP não sinônimo no geneCOL18A1, que eleva em duas vezese meia o risco de se desenvolvercâncer de próstata (Iughetti et al.,2001). A substituição Asp104Asnna endostatina, um produto docolágeno XVIII e potente inibidorda angiogênese, prejudica a funçãodessa proteína, o que explica amaior predisposição ao desenvolvimentodo tumor.Em busca de outros polimorfismosque pudessem contribuir parao desenvolvimento de abordagensfarmacológicas individualizadas,ou seja, que atendessem ao perfilgenético de cada paciente, foi criado,em 1999, um consórcio envolvendoonze gigantes da indústriafarmacêutica e de biotecnologia,denominado The SNP Consortium.O projeto se estendeu até o final de2001 e utilizou um orçamento estimadoem 50 milhões de dólares,tendo sido capaz de identificar, juntamentecom o Projeto Genoma Humano,1,42 milhão de SNPs no genomahumano (Sachidanandam etal., 2001).Uma iniciativa anterior, lançadaem 1996 pelo National Cancer Institutedos USA e denominada CancerGenome Anatomy Project(CGAP), visa gerar informações etecnologias necessárias para decifrara anatomia molecular das célulastumorais. Dentre as ferramentasdesenvolvidas, algumas são volta-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 25

Figura 3 - Genotipagem em sistema de multiplex. Aqui um único indivíduo foi genotipado para quatro diferentesSNPs. Podemos ver que o indivíduo genotipado é homozigoto CC para o SNP1, homozigoto GG para o SNP2,heterozigoto AT para o SNP3 e homozigotoTT para o SNP4das para a identificação e mapeamentode SNPs. Como resultadodesse projeto, foram identificados,até o momento, mais de 20 milSNPs humanos. As informações demapeamento e caracterização decada polimorfismo estão disponibilizadasem bancos de dados públicos(http://gai.nci.nih.gov, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).No Brasil, utilizando as seqüênciasgeradas pelo Projeto GenomaFigura 4 - Exemplo de análise deum polimorfismo por RFLP, ondea presença do nucleotídeo C criaum sítio de restrição para aenzima de restrição. Gel deagarose contendo na raia 1 umindivíduo homozigoto CC, na raia2 um homozigoto TT e na raia 3um heterozigoto TC (apenas oalelo C é digerido)do Câncer Humano (FAPESP/LICR-HCGP), encontra-se em andamentouma iniciativa de identificaçãode SNPs na região codificadora degenes humanos (HCGP-SNP, http://bit.fmrp.usp.br/hcgp_snp). Osdados produzidos até o momentoresultaram na identificação e validaçãoexperimental de novos SNPshumanos, que estão sendo avaliadosem população normal para determinaçãode freqüência alélica eem amostras derivadas de diferentestumores.É importante ressaltar que nosprojetos de identificação de SNPs,principalmente aqueles em largaescala, a participação de uma equipede bioinformática é fundamental.Graças ao desenvolvimento tecnológicode softwares e de equipamentoscada vez mais robustos esofisticados, vem sendo possívelgerar e analisar um grande númerode dados de seqüências de DNA.Inicialmente, as abordagens dedetecção de SNPs consistiam emamplificar fragmentos genômicosequivalentes, de regiões gênicascandidatas a determinado fenótipo(predisposição a uma doença neuropsiquiátrica,por exemplo), doDNA de vários indivíduos, entregrupos teste e controle, e compararsuas seqüências buscando variações.Atualmente, a maior partedos estudos desenvolvidos visandoa identificação de SNPs em largaescala tem explorado as milharesde seqüências presentes nos bancosde dados, incluindo clones genômicose, principalmente, seqüênciasde cDNA ou ESTs (ExpressedSequence Tags). Os bancos de dadosde ESTs apresentam um elevadograu de redundância, e o fato deas seqüências serem derivadas detecidos de vários indivíduos tornaa utilização desses bancos muitopromissora para a identificação depolimorfismos.As ferramentas de bioinformáticasão utilizadas em várias etapasdo estudo de polimorfismos, desdea identificação das variações até apredição do efeito delas. Outraaplicação importante é a construçãoe manutenção de bancos dedados e de ferramentas que podemser acessadas pela internet. Essesbancos atuam como sedes de referênciapara a deposição de SNPs,sendo que no maior banco públicode polimorfismos, que é mantidopelo National Center for BiotechnologyInformation (dbSNP, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP), jáestão depositados mais de 4,1 milhõesde SNPs humanos e um númeroconsiderável de polimorfismosde outras espécies.Apesar da indiscutível contribuiçãoda bioinformática na identificaçãode SNPs, a necessidade de26 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

validação experimental dos dadose estudos de associação são indispensáveispara se avaliar o potencialinformativo de cada polimorfismo.Dessa forma, o surgimento ea evolução de métodos de validaçãoe de genotipagem de amostraspara SNPs confirmados tambémmerecem reconhecimento. Hoje, épossível genotipar vários SNPs emvárias amostras em um mesmo tubode reação; como exemplo podemoscitar o sistema de multiplexdesenvolvido pela Applied BiosystemsTM , que pode genotipar até 10SNPs em uma mesma reação (figura3). Outros métodos robustos degenotipagem podem ser citados:chips de DNA ou microarrays, cromatografialíquida de alta pressãodesnaturante (DHPLC), espectrometriade massa, PCR em temporeal, mini-sequenciamento e seqüenciamentode uma única base.Entretanto, em análises de menorescala, métodos como seqüenciamento(figura 1) e digestão porenzimas de restrição – RFLP (RestrictionFragment Length Polymorphism)são rotineiramente empregados.Na figura 4, é mostrado umexemplo de SNP genotipado utilizandouma enzima de restrição,onde a presença do polimorfismocria um sítio para a enzima, podendoos diferentes alelos ser identificadosem um simples gel.PerspectivasUm tema ainda bastante polêmicoque envolve polimorfismos deDNA é a legalidade de se patenteardados de SNPs. De um lado, há ointeresse econômico de grandesempresas farmacêuticas. Um dosobjetivos é o de conhecer o genomahumano, de modo a associarSNPs com resposta a drogas. Deoutro lado, os pesquisadores e asinstituições envolvidos na geraçãode dados públicos. Muitas vezes,as empresas farmacêuticas utilizamos dados públicos em seus projetos,e deles retiram os resultadosque serão transformados em patentesprivadas sem retorno aos pesquisadorese às instituições responsáveispela produção dessesdados. Essa discussão ainda estálonge de alcançar um ponto final,mas uma tendência que vem-se tornandoconsenso entre os envolvidosé a possibilidade de se patentearprodutos industrializados específicoscriados a partir de dadosde SNPs, mas não os polimorfismosem si.Até o momento, grande partedos estudos tem relatado a associaçãoentre um único SNP e umadeterminada patologia, ou mesmodefinido um SNP como um marcadorpara predisposição a uma doença.Entretanto, visando a compreensãodas bases moleculares dedoenças de características genéticasmais complexas, pesquisas têmsido intensificadas no sentido detentar associar, ao fenótipo alterado,conjuntos de determinadosSNPs, denominados haplótipos(Brookes, 2002). Embora esse tipode enfoque necessite de maioresinvestimentos tanto tecnológicoscomo financeiros e envolva umnúmero maior de amostras, eleconstitui uma abordagem muitopromissora nas patologias humanasmais comuns, como distúrbiosneuropsiquiátricos, doenças autoimunes,doenças cardiovascularese câncer.Podemos vislumbrar para umfuturo não muito distante a compreensãoe subseqüentes tratamentospara essas patologias. Teremosuma medicina pessoal, voltada paraas características genéticas de cadaindivíduo. A indústria farmacêuticajá busca, através de drogas maisespecíficas, suprir essas necessidadesindividuais, conseguindo, comalgum sucesso, reduzir os efeitoscolaterais de vários medicamentos.Testes mais acurados estão sendodesenvolvidos e será possível definir,antes mesmo do nascimento,um mapa clínico do genoma decada pessoa, contendo informaçõescomo as patologias a que será maissusceptível e a quais tratamentosresponderá melhor. Sob essa novaótica, não é arriscado dizer que aspessoas poderão viver mais e commelhor qualidade de vida.AgradecimentosSomos especialmente gratosao Prof. Dr. Emmanuel Dias Netopelo apoio e pela revisão do manuscrito.Agradecemos à FAPESPas bolsas de pós-doutorado deMaria Cristina Ramos Costa e abolsa de mestrado de Pedro EdsonMoreira Guimarães.ReferênciasBrookes AJ. 1999. The essence ofSNPs. Gene 234(2):177-186.Brookes AJ. 2002. 4th Internationalmeeting on Single NucleotidePolymorphism and complexgenome analysis varioususes for DNA variations. Eur JHum Genet 10(2):153-155Gorre ME, Mohammed M, EllwoodK, Hsu N, Paquette R, Rao PN,Sawyers CL. 2001. Clinical resistanceto STI-571 cancer therapycaused by BCR-ABL genemutation or amplification. Science293(5531):876-880.Iughetti P, Suzuki O, Godoi PH,Alves VA, Sertie AL, Zorick T,Soares F, Camargo A, MoreiraES, di Loreto C, Moreira-FilhoCA, Simpson A, Oliva G, Passos-BuenoMR. 2001. A polymorphismin endostatin, anangiogenesis inhibitor, predisposesfor the development ofprostatic adenocarcinoma.Cancer Res. 61(20):7375-7378.Kwok PY, Gu Z. 1999. Single nucleotidepolymorphism libraries:why and how are webuilding them? Mol Med Today5(12):538-543.Sachidanandam R, Weissman D,Schmidt SC, Kakol JM, SteinLD, Marth G, Sherry S, MullikinJC, Mortimore BJ, WilleyDL, et al. 2001. A map of humangenome sequence variationcontaining 1.42 millionsingle nucleotide polymorphisms.Nature 409 (6822):928-933.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 27

PesquisaCaracterização genética do Curauá(Ananas erectifolius)através de Marcadores RAPDFotos cedidas pelos autoresCaracterização e uso de recursos genéticos vegetais na Amazônia OrientalMaria Rosa CostaEng. Agro., M.Sc. em GenéticaEmbrapa Amazônia OrientalBelém – PAmrco@cpatu.embrapa.brFigura 1 - Eletroforese do RAPDem curauá gerado pelo primerOPAZ 14. A primeira e a últimacolunas correspondem aomarcador Ladder e as demais,aos genótipos analisadosimportância das plantasdoadoras de fibra na fabricaçãode utensílios é conhecidadesde as épocasremotas pelas comunidadesindígenas. Segundo Medina (1959),esse grupo de plantas é o segundo emimportância para o homem depois dasespécies alimentares. Na Amazônia,várias são as espécies produtoras defibras e segundo Oliveira et al. (1987),somente na microrregião do salgadoParaense existem 17 espécies de plantasfibrosas, com utilização atual.O Estado do Pará, em seu passadorecente, tem tradição no cultivo deplantas produtoras de fibras, tal comoa malva e a juta, tendo a Amazôniainúmeras plantas com possibilidadesreais de aproveitamento na indústriaTabela1 - Identificação dos acessos analisados. Belém, PA, 2001.N 0C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12C13C14C15C161Origem-BrasilOsmar Alves LameiraEng. Agro., Dr. emBiotecnologiaEmbrapa Amazônia OrientalBelém – PALocalidadeSantarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Cultura de Tecidos 1Ponta de Pedras, PA 1Ponta de Pedras, PA 1Santarém, PA 1Santarém, PA 1Bragança, PA 1Bragança, PA 1Viviane Castro YoshinoBolsita PIBICCNPq/FCAPEmbrapa AmazôniaBelém – PACultivar/variedadeTanaka RoxoTanaka BrancoMarilda BrancoAraçari BrancoAraçari RoxoBom Futuro BrancoBom Futuro RoxoCentrinho BrancoCentrinho RoxoEmbrapa/cpatu RoxoSolteira BrancoPonta de Pedra BrancoDiamantina BrancoDiamantina RoxoBragança BrancoBragança Roxotêxtil. Nesse contexto, o curauá (Ananaserectifolius), planta pré-colombiana, utilizadaprincipalmente na fabricação de cordas,sacos e utensílios domésticos, despontacomo sucedâneo para o aproveitamentode fibras.O curauá é uma bromeliácea distribuídanos Estados do Pará (Rios Xingu, Tocantins,Trombetas, entre outros), Acre,Mato grosso, Goiás e Amazonas e é cultivadaprincipalmente por pequenos produtoresda região do Lago Grande deCuruai, no Município de Santarém. Estudosrecentes têm demonstrado o grandepotencial dessa planta como produtora defibra de excelente qualidade, podendo serutilizada na indústria automobilística, devidoà sua resistência, maciez e peso reduzido.Há crescente demanda de fibras docurauá por grupos empresariais preocupados,principalmente com a utilização deprodutos naturais biodegradáveis, o quetorna essa espécie estratégica para o Estadoe cria uma perspectiva de melhoria daqualidade de vida dos pequenos produtores(Ledo, 1967).Segundo Ledo (1967), há ocorrênciade dois tipos de curauá: um de folhas roxoavermelhadas,que se desenvolve mais,chamado de curauá roxo; e outro de folhasverde-claras, conhecido por curauá branco.Algumas das diferenças entre os doistipos de curauá residem não só na coloraçãoda folha, mas na resistência e namaciez das fibras, no porte da planta e naquantidade de rebentos e filhos. Outradiferença encontrada nos plantios de curauáé a ocorrência, em algumas plantas,de espinhos foliares, que aparecem quandoa planta entra no processo de envelhecimento.No Estado do Pará, o curauá ocorreprincipalmente nos Municípios de Santaréme Bragança, e a Embrapa AmazôniaOriental, por intermédio do seu Laborató-28 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

io de Biotecnologia de Plantas, realizouuma coleta da espécie naqueles locaispara a formação de um Banco Ativo deGermoplasma para trabalhos de propagaçãoin vitro, caracterização moleculare melhoramento genético da cultura. Osestudos de caracterização, através demarcadores moleculares em associaçãocom avaliação da divergência genéticanessa espécie, são bastante limitados ouinexistem. Esse trabalho é consideradoprioritário, devido à demanda existentepara se quantificar a variabilidade genéticados acessos; para verificar a similaridadeentre eles a fim de sanar dúvidasquanto à origem e uso nos cruzamentos,além de para auxiliar na escolha deacessos potenciais para o enriquecimentoda variabilidade genética no próprioBanco Ativo de Germoplasma. Apesarda reconhecida variabilidade fenotípicaexistente nesses bancos, o germoplasmade curauá tem sido pouco estudadosob o ponto de vista genético. O usocombinado de marcadores morfológicose moleculares subsidiará os trabalhos demelhoramento, em busca de cultivaresmais produtivos e com características dequalidade que atendam demandas dosetor produtivo, contribuindo, ainda, parao intercâmbio de material e de informaçõesentre instituições de pesquisa.Assim, o objetivo deste estudo foiexaminar o polimorfismo gerado pormarcadores RAPD e analisar a diversidadegenética entre acessos de curauápertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma(BAG) da Embrapa AmazôniaOriental.Material e MétodosGermoplasmaO material investigado foi compostode 16 acessos de curauá provenientesdo Banco Ativo de Germoplasma daEmbrapa Amazônia Oriental, em Belém,PA (Tabela1).RAPDO DNA genômico foi obtido atravésde folhas em estádio médio dedesenvolvimento, recém-coletadasque, após desinfecção, foram maceradascom nitrogênio líquido, e cerca de200 mg de pó foram transferidos paratubos eppendorf. Adicionou-se, emseguida, 700 µl de solução extratora.Os tubos foram vortexados e colocadosem banho-maria a 60 0 C durante 60minutos. O extrato foi misturado com700 µl de clorofórmio-álcool isoamil(24:1) para formar uma emulsão. Apóscentrifugar por 10 minutos a 4 0 C e12.000 rpm, a parte superior aquosafoi cuidadosamente isolada e submetidaa álcool 95%, o que ocasionou aprecipitação do DNA. O material foicolocado em freezer (-20 0 C) por 20minutos, sendo, em seguida, centrifugadopor 10 minutos a 4 0 C e 12.000rpm, lavado com 1000 µl de etanol70%, para remover sais e, posteriormente,foi secado a temperatura ambiente,por, aproximadamente, 12 horas.O DNA foi ressuspendido com 100µl RNAse/ TE (10ug.ml -1 ). A concentraçãode DNA foi estimada em gel deagarose 1,0% pela comparação do DNAtotal com três concentrações do DNAlambda. As amostras utilizadas no RAPD,após a quantificação, partiram de diluiçõesda amostra total em água estéril,de modo a conter 5 ng/µl de DNA. Asalíquotas foram armazenadas a –20 0 C.Os primers utilizados foram: OPS03,OPN15, OPN09, OPN02, OPAZ16,OPAZ14 e OPAZ03.As reações foram desenvolvidas deacordo com o protocolo de Williams etal. (1990), com pequenas modificações,num volume final de 13 µl contendoágua destilada autoclavada, 20mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 2,0mM MgCl2, 200 µM de cada dNTP, BSApurificada (2,5 mg/ml), 1,3 uM primerarbitrário, 1U.I Taq DNA polimerase e15 ng de DNA genômico, cobertascom duas gotas de óleo mineral.As amplificações foram realizadasem termociclador de DNA ThermolyneAmplitron II, modelo DB.80225,sendo realizados 40 ciclos de 1’ a 94 0 C;1’ a 37 0 C; e 2’ a 72 0 C, seguidos de mais7’ a 72 0 C para a completa extensãodos produtos amplificados. O métodoutilizado para a separação dos produtosamplificados foi a eletroforese horizontal,em gel de agarose 1,5%, coradocom brometo de etídio 1mg/ml.Utilizaram 13 µl de cada reação, acrescidosde 2 µl de uma solução de azul debromofenol (40 %) mais sacarose. Utilizou-seTBE (Trizma base 0,1 M; ácidobórico 1M e EDTA 0,5M) como tampãodo gel e de corrida.Após a eletroforese, os géis foramvisualizados e fotografados em equipamentode foto documentação, portransiluminação em ultravioleta.Aplicou-se um ladder de 1Kb noinício e no final do gel para definir otamanho aproximado dos fragmentosgerados nas PCRs.Inicialmente, construíu-se uma matrizpara os fragmentos polimórficosamplificados com presença (1) e ausênciade banda (0). Somente foramconsideradas as bandas que não davammargens a dúvidas. Bandas muito fracas,de difícil resolução, não foramincluídas. Para análise dos dados, utilizou-seo NTSYS-pc (Numerical Taxonomyand Multivariate Analysis System),versão 2.02. A similaridade entreas amostras foi estimada pelocoeficiente de Jaccard, quegerou a matriz de similaridade.A partir dessa matriz, foigerado o cluster, pelo métodoUPGMA (“UnweightedPair-Group Method Using ArithmeticAverage”), que foiexpresso na forma de umdendograma (Fig.3).Resultados e DiscussãoFigura 2 - Matriz de distância genética estimada pelo coeficiente de Jaccardpara todos os indivíduos analisadosUm total de 104 marcadoresRAPD, com tamanhosvariando de 300pb a 2.200Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 29

similaridade, variando de 12% a 80%,incluem-se 14 materiais, oriundos de diferenteslocalidades. No segundo grupo,encontram-se dois materiais com similaridadegenética de 51%. Os acessos C1,C6 e C14 foram distintos em relação aorestante, constituindo subgrupos isoladosdentro do seu grupo. Observou-segrande divergência em alguns materiais,oriundos da mesma localidade, concluindo-sehaver pouca relação entre a origemgeográfica e o padrão da distribuiçãoda variabilidade genéticaobtida.Observou-se que, nesse caso, osmarcadores RAPD foram eficientes naseparação dos acessos de acordo com acoloração, fornecendo resultados similaresaos obtidos a partir de característicasmorfo-agronômicas.ConclusõesFigura 3 - Dendograma gerado pelo método de análise cluster UPGMA para ocoeficiente de Jaccard, para as 79 bandas geradas pelo RAPDOs marcadores RAPD mostraram-seeficientes para detectar polimorfismo nessaespécie e podem ser utilizados comouma poderosa ferramenta na obtençãode informações úteis para o manejo doBanco de Germoplasma e para o direcionamentode programas de melhoramentogenético.Observou-se que a avaliação da divergênciagenética feita por marcadoresRAPD foi similar à obtida pelas característicasmorfológicas, separando os acessospela coloração.Figura 4 - Curauá Brancopb, foram amplificados pelos sete primersutilizados, dos quais 79 eram polimórficos,gerando 75,96 % de polimorfismo.O número de marcadoresamplificados variou de 20 (OPN-02) a12 (OPN-09). O número de fragmentospolimórficos por primer variou de 16(OPN-02) a 8 (OPN-15). Observou-seentre os fragmentos amplificados a ocorrênciade bandas específicas aos indivíduos.Na Fig.1, visualizam-se exemplosdesses marcadores. Estimaram-se os índicesde similaridade para todos osindivíduos analisados (Fig.2). A maiordistância foi obtida comparando-se o C4com o C14 (12 %). O segundo maiordistanciamento genético foi entre oFigura 5- Curauá Roxoacesso C2 com o C14 e o C16 (14%);C2 com o C7 (17%) e C2 com o C10(18%). Isso indica que esses acessossão candidatos potenciais, como fontede variabilidade, no programa de hibridizaçãodessa espécie, visando ao melhoramentogenético. Por outro lado, amaior similaridade genética foi entre oC11 e o C13 (80%).Na Fig.3, encontra-se o dendograma,gerado pelo método UPGMA, atravésdo programa NTSYS-pc, 2.02. Essaanálise de distância genética gerou ocluster, que mostra a separação dosacessos em dois grupos principais. Noprimeiro grupo, que se subdividiu emdois subgrupos, com coeficiente deReferências BibliográficasLEDO, I. A. de M. O cultivo do curauáno lago grande de Franca. Belém:BASA, 1967. 23 p.MEDINA, J. C. Plantas fibrosas da floramundial. Instituto Agronômicode Campinas. 913 p. 1959.NELSON, J. C. ITMI Wheat mappingworkshop – laboratory manual.Cornell University, 1993.OLIVEIRA, J.; ALMEIDA, S. S. de; VILHE-NA-POTYGUARA, R.; LOBATO, L. C.B.Espécies vegetais produtoras de fibrasutilizadas por comunidades Amazônicas.Boletim doMuseu Paraense Emílio Goeldi, SérieBotânica, v. 7, n. 2, p. 393-428,1991.WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A. R.;LIVAK, K. J.; RAFALSKI, J. A.; TIN-GEY, S.V. DNA polymorphisms amplifiedby arbitrary primers are usefulas genetic markers. Nucleic AcidsResearch, v.18, p.6531-6535, 1990.30 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

AnúncioUNISCIENSE BioLabs(Novo)Fotolitos e provas em anexoObs.: Vai entrar outro anúncio UNISCIENSE(também novo) na página 23 desta ediçãoBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 31

PesquisaProdução in vitro deEmbriões na Espécie BovinaFotos cedidas pelos autoresUma promissora ferramenta de multiplicação animalMargot Alves Nunes DodeMédica Veterinária, PhD - PesquisadoraEmbrapa Recursos Genéticos eBiotecnologiaRodolfo RumpfMédico Veterinário, PhD - PesquisadorEmbrapa - Recursos Genéticos eBiotecnologiaIntroduçãoinseminação artificial (IA) embovinos foi o primeiro passopara acelerar a transferênciade características desejáveis e permitindoa disseminação de genes demachos considerados superiores e aFigura 1 - Ovócitos bovinos imaturos, logo após a aspiração dos folículosovarianos, apresentando células do cumulus compactasmelhoria do nível zootécnico dos rebanhos.Um reprodutor bovino pode produzirmilhares de bezerros durante suavida produtiva pela IA, enquanto, nomesmo período, uma fêmea não écapaz de produzir mais do que de 8 a10 bezerros. Portanto, o possível ganhogenético obtido pela linhagemmaterna era extremamente limitado.Com o desenvolvimento de técnicasde reprodução assistida em animais,ocorreu um grande avanço na otimizaçãoe multiplicação de fêmeas de interessenão só para a produção animal,mas também para a conservação eregeneração de espécies animais emperigo de extinção.A transferência de embriões (TE)proporciona um melhor aproveitamentode matrizes de elevado mérito genético,podendo aumentar, em média,10 vezes o número de crias por ano.Com o advento da produção in vitrode embriões (PIV) esse potencial demultiplicação se torna ainda maior. Aaspiração de ovócitos imaturos diretamentedos folículos ovarianos, associadaà maturação e fecundação in vitrodesses, e ao cultivo in vitro dos embriões,permite que sejam produzidas,em média, 36 crias por ano oriundos deuma única fêmea. Além disso, somentecom o estabelecimento da PIV deembriões é que técnicas como a clonagempor transferência nuclear, a injeçãointracitoplasmática de espermatozóides(ICSI) e a transgenia podem seraprimoradas e utilizadas (Rumpf et al.,2000).Embriões produzidos in vitro sãoaqueles produzidos pela manipulaçãode gametas, fora de organismo materno.Essa técnica, inicialmente, se resumiaà fecundação in vitro (FIV); entretanto,após o nascimento do primeirobezerro, em 1981, (Brackett et al.,1982), foram obtidos avanços consideráveis.Atualmente, essa tecnologia serefere à combinação de vários processosinterdependentes, que vão desdea obtenção dos ovócitos imaturos àtransferência dos embriões para as fêmeasreceptoras, que levarão a gestaçãoa termo. Essa biotécnica surgecomo uma nova opção para a multipli-32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

cação animal, não só pelo seu potencial,mas também porque abre a possibilidadede utilizar bezerras pré-púberes,vacas em início de gestação, vacascom subfertilidade adquirida e vacassenis.Obtenção de ovócitosimaturos para PIVO desenvolvimento do método depunção folicular transvaginal (OPU)tem possibilitado a recuperação deovócitos de animais vivos, permitindoa produção de embriões de fêmeas devárias idades e diferentes estágios fisiológicos.Na OPU a obtenção deovócitos é feita pela punçãofolicular com uma agulha acopladaa uma sonda transvaginal,de forma que os folículosa serem puncionados são visualizadosna tela do ultra-som. Amédia de ovócitos viáveis obtidospor coleta in vivo é emtorno de oito, entretanto essamédia depende da estratégiaadotada. Assim, é possível puncionaros folículos de uma doadoraduas vezes por semana,uma vez por semana ou umavez a cada duas semanas, sendoque, nas duas últimas alternativas,é possível dobrar osresultados mediante a estimulaçãohormonal (Goodhand et al.,1999). Independente da estratégia, oresultado final esperado é de, pelomenos, uma gestação por semana pordoadora (Peixer, et al., 1996; Bousquet,et al., 2000).Ovários de abatedouro são a principalfonte de ovócitos para serem utilizadosna pesquisa, e são geralmenteprovenientes de animais sem valoreconômico. A aspiração de ovócitos apartir desses ovários, da mesma formaque no método in vivo, é realizadacom uma agulha acoplada a uma bombaà vácuo, com a qual se aspiramtodos os folículos presentes na superfíciedos ovários com diâmetro variandoentre 2 e 6 mm. A média deovócitos recuperados por ovário estáentre 6 e 10, sendo que a quantidadee a qualidade dos ovócitos obtidos éinfluenciada pela época do ano, estadofisiológico do animal e tamanho dofolículo aspirado (Dode et al., 2001).Convém ressaltar, entretanto, que,quando se trabalha com ovários isoladosde vacas de elevado mérito genético,além da punção dos folículosvisíveis, pode ser feita a dissecaçãodesses ovários, maximizando o seuaproveitamento.Maturação in vitro de ovócitosDurante a ovogênese, os ovócitosde mamíferos permanecem retidos noestágio de diplóteno da prófase daprimeira divisão meiótica, desde a vidafetal até pouco antes da ovulação. AFigura 2 - Ovócitos bovinos maturos, após 22 horas dematuração in vitro, apresentando expansão das célulasdo cumulusretomada da meiose pode ser mediadapor um estímulo hormonal in vivo, oupela retirada do ovócito de dentro dofolículo (Warssaman & Albertini, 1994).Portanto, quando os ovócitos são aspiradosdos folículos ovarianos (normalmenteentre 2- 6 mm de diâmetro)para serem utilizados na PIV, eles aindasão imaturos e necessitam sofrer oprocesso de maturação in vitro (MIV).Essa é realizada cultivando os ovócitos,logo após a aspiração do folículo, emmeio de maturação, com temperaturae atmosfera apropriada, por um períodode 22-24 horas.A maturação envolve mudançasnucleares e citoplasmáticas que devemocorrer simultaneamente e queconferem aos ovócitos a capacidadede serem fecundados, descondensarema cabeça do espermatozóide, formaremos pró-núcleos e terem desenvolvimentoembrionário normal (Dodeet al., 2000a).Os eventos nucleares envolvemreorganização da rede de microtúbulos,rompimento do envoltório nuclear,condensação dos cromossomos eprogressão para metáfase I, anáfase I,telófase I, expulsão do primeiro corpúsculopolar e retenção no estágio demetáfase II (Cha e Chian, 1998).No que se refere ao citoplasma,ocorre reprogramação na síntese protéica,mudança na atividade da proteínaquinase ativada por mitógenos(MAPK) e do fator promotor da maturação(MPF), bem como no desenvolvimentodos mecanismos de liberaçãode Ca++, e aquisição da capacidadede descondensar acabeça do espermatozóide(Salamone et al., 2001). Aindadurante esse período,ocorrem mudanças na organizaçãocitoplasmática, taiscomo um contínuo desenvolvimentodos estoques delipídios, redução do aparelhode Golgi, aparecimento devários ribossomos adjacentesaos cromossomos, rearranjodas mitocôndrias e alinhamentodos grânulos corticaispróximos à membranaplasmática (Dieleman et al.,2002). O aumento no estoquede lipídios pode estarassociado à formação de umpool de energia essencial para o ovócitosuportar o desenvolvimento apósa fecundação.Outro evento que ocorre na maturaçãoé a expansão das células documulus que circundam os ovócitos.Essas são células da granulosa especializadas,que estão metabolicamenteassociadas entre si e com o ovócito.Projeções celulares das células do cumulusatravessam a zona pelúcida eformam pequenas junções com o ovócito(gap). Essas junções são a únicaentrada de substâncias ou estímulos noooplasma. No ovócito imaturo (figura1), elas estão muito compactadas e,durante a maturação, iniciam a secreçãode ácido hialurônico, que se depositaentre elas separando-as e causandoa expansão dessas células (figura2). A ligação metabólica vai diminuindogradativamente à medida que aexpansão aumenta (Warssaman & Al-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 33

ertini, 1994), sugerindo que a presençadessas células seja essencial noperíodo inicial da maturação.A maturação representa o estágiofinal da preparação do ovócito para afecundação; portanto, as mudanças estruturaise bioquímicas que ocorremdurante esse período sãonecessárias para que esseprocesso seja completo.Entretanto, para que issoocorra, o ovócito precisater competência meiótica,que é adquirida progressivamentedurante afase final do crescimentoovocitário. Essa competênciase refere à capacidadedo ovócito de completara divisão meiótica,descondensar a cabeçado espermatozóide, formaros pró-núcleos e suportaro desenvolvimentoembrionário subseqüente(Warssaman & Albertini,1994). Ovócitoscompetentes necessitamter estocado fatores importantes,na forma de proteínas ouRNAm estável, que deverão ser utilizadosdurante a maturação, fecundação einício do desenvolvimento embrionário(Chan e Chian, 1998).Tendo em vista que os ovócitosmaturados in vitro, quando comparadosaos in vivo apresentam menorestaxas de blastocisto após a fecundaçãoe o cultivo in vitro (Takagi et al.,2001), pode-se supor que a maturaçãoainda continua sendo um problema naPIV. Sendo que, vários fatores podemafetar o sucesso da maturação ovocitária,entre eles podemos citar a morfologiado complexo cumulus-ovócito(CCO), as condições de maturação e acompetência do ovócito.A morfologia dos CCOs tem sidocorrelacionada com as taxas de blastocistos,a redistribuição das mitocôndriase o conteúdo de ATP dos ovócitos,os quais diferem entre os consideradosmorfologicamente bons e ruins. Emovócitos imaturos morfologicamentesuperiores, as mitocôndrias aparecemdistribuídas de forma uniforme na periferiado citoplasma. Após a maturação,aparecem como grupos maioreslocalizados não só na periferia mas34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002Figura 3 - Fecundação in vitro de ovócitos bovinos, em queovócitos maturos e espermatozóides são co-incubados no meiode fecundação por um período de 12 a 18 horastambém na porção mais central docitoplasma, o que não ocorre nos ovócitosconsiderados inferiores (Stojkovicet al., 2001). Da mesma forma, oconteúdo de ATP em ovócitos imaturosé maior nos morfologicamente superiores,havendo uma correlação positivaentre a concentração de ATP doovócito e o número total de células dosembriões produzidos. Esses fatores,entre outros, podem ser responsáveispela diferença na capacidade de desenvolvimentodesses ovócitos.Além das características morfológicas,as condições de cultivo afetamdrasticamente a maturação. A presençade hormônios, substâncias antioxidantes,fatores de crescimento, temperatura,atmosfera gasosa, são algunsfatores que têm sido relatados comoresponsáveis por muitos dos problemasque ocorrem durante a maturação.Em bovinos, o crescimento do ovócitoestá completo quando o folículosatingem em torno de 2 mm de diâmetroe, nesse estágio, alguns ovócitos jáestão competentes para se desenvolverin vitro. Para a MIV, os ovócitos sãocoletados, geralmente, de folículos de2-6 mm, e são maturados in vitro porum período de 24 horas. Se compararmoscom a situação in vivo, folículosdesse diâmetro levariam alguns diasaté chegarem ao estágio pré-ovulatório.Portanto, esse período que correspondeao de dominância folicular, éeliminado no cultivo in vitro. É possívelque os vários processos, pelosquais os ovócitos passam durante esseperíodo, possam afetar a competênciados ovócitos utilizados para PIV, já quenesses o período final da foliculogênesenão ocorre (Dode e Adona 2001;Dieleman et al., 2002). Visando a superaressa situação, váriastentativas têm sidofeitas, utilizando agentesfisiológicos e farmacológicospara reter osovócitos imaturos emmeiose (Dode et al.1999; Adona et al.,2000a; Adona et al.,2000b; Dode et al.2000b). Essa retençãodo núcleo, por um determinadoperíodo antesda retomada da meiosedaria aos ovócitosuma maior oportunidadepara que as mudançascitoplasmáticas necessáriasà maturaçãopudessem ocorrer. Entretanto,até o momento,nenhuma melhora naprodução de embriões tem sido obtidaquando os ovócitos são retidos até 24horas após a aspiração (Dode e Adona,2001).Mesmo após a rigorosa seleção deovócitos e o uso de condições decultivo adequadas, a taxa de produçãode embriões viáveis ainda é o dobroem ovócitos maturados in vivo quandocomparados com os maturados in vitro(Van de Leemput et al., 1999).Portanto, o folículo de origem pareceser vital para conferir aos ovócitos oambiente necessário para atingir a completacompetência para o desenvolvimento.Essa hipótese foi confirmadapor Pivato et al. (1999) e Blodin et al.(2002), que utilizaram diferentes protocoloshormonais antes da OPU, eobtiveram ovócitos mais competentes,aumentando o número de embriõesproduzidos na PIV.Fecundação in vitroPara a FIV, espermatozóides e ovócitosmaturos são co-incubados em ummeio específico, por um período emtorno de 18 horas (figura 3), sendopossível co-incubar por períodos me-

nores sem afetar as taxas de produçãode embriões (Dode et al., 2002a).Para que a FIV ocorra com sucesso,é necessário que os ovócitos tenhamsofrido uma maturação completa eque os espermatozóides tenham sidoadequadamente preparados.Para a preparaçãodo sêmen a ser utilizadona FIV, vários métodospara remover oplasma seminal e/oucrioprotetor e melhoraras características seminaistêm sido descritos.Entre eles, podesecitar a lavagem porcentrifugação, gradientesde densidade, filtragemem coluna defibra de vidro e migraçãoascendente. Osmais utilizados são gradientede densidadeFigura 4 - Embriões bovinos produzidos a partir de ovócitosmaturados, fecundados e cultivados in vitroutilizando percoll e amigração ascendente,conhecida por swimup.O gradiente de percoll, apesar deproporcionar uma maior taxa de recuperaçãode espermatozóides quandocomparado ao swim-up, apresentagrande variação entre partidas, sendoalgumas deletérias aos espermatozóides,afetando os resultados da FIV.Embora, o swim-up apresente menortaxa de recuperação, a qualidade espermáticaé semelhante à obtida como percoll. Com relação à simples lavagemdo sêmen, onde não ocorre seleçãoespermática, essa tem sido utilizadasem afetar a produção de blastocistos(Avery e Greve, 1995).Tem sido sugerido que a passagemdos espermatozóides pelo gradientede percoll poderia retirar algumas glicoproteínasda membrana do espermatozóidee, com isso, acelerar a capacitação.Portanto, poderia ser esperadoque o método utilizado poderia alteraro tempo de capacitação e a vida útil doespermatozóide, o que poderia alteraro tempo necessário para a fecundação.Entretanto, estudo comparando os diferentesmétodos de preparação espermáticaem diferentes períodos deco-incubação demonstou que a variaçãoentre os tempos de duração da FIVfoi similar para todos os métodos utilizados(Dode et al., 2002a). Os melhoresresultados foram observados quandoa FIV foi realizada por um períodode 12 horas, independente do métodoutilizado.Além do método utilizado para preparaçãodo sêmen e do tempo de coincubação,outros fatores podem afetara taxa de fecundação tais como adose inseminante, a interação tourovacae a diferença entre touros nacapacidade de fecundar e produzirembriões. A variação individual de tourosé um dos principais fatores queinterferem na FIV e produção de embriões.Portanto, é necessário testar ostouros antes de seu uso na FIV deovócitos de diferentes doadoras (Watanabeet al., 1999).Cultivo de embriõesproduzidos in vitroApós a fecundação in vitro, osembriões são transferidos para o cultivoembrionário onde permanecem porum período de 7 dias, até atingirem oestágio de blastocisto (figura 4), quando,então, podem ser transferidos parao útero de fêmeas receptoras quelevarão a gestação a termo.O cultivo in vitro de embriõesrequer um sistema que suporte umalto desenvolvimento embrionário. Oco-cultivo com células somáticas eraessencial para se obter taxas aceitáveisde desenvolvimento embrionário. Entretanto,com o desenvolvimento domeio SOF, que foi criado baseado naconstituição do fluido do oviduto debovinos, foi eliminada a necessidadede co-cultivo, visto que, nesse meio, oszigotos se desenvolvem com boas taxassem a presença de células somáticas(Watson 2000). Esse meio, contudo,requer uma atmosferade 5% de 0 2, a qualdifere da utilizada para aMIV e FIV. Estudos têmdemonstrado, entretanto,que o meio SOF podeser utilizado com altatensão de oxigênio, desdeque as células do cumulusremanescentes nozigoto após a FIV sejammantidas (Dode et al.,2002b). Esses resultadossugerem que as célulasdo cumulus facilitariamo crescimento embrionáriopor retirarem substânciastóxicas, diminuindoo estresse oxidativo.Condições de cultivoin vitro normalmenteaumentam a produção de radicaislivres, pois os embriões estão maisexpostos a luz e a altas concentraçõesde O 2, afetando a taxa de desenvolvimentoembrionário.Comparando os embriões produzidosin vitro e os produzidos in vivo, foiobservado que eles diferem em váriascaracterísticas, tais como aspectos morfológicos,aspectos metabólicos, alteraçõescromossômicas, número de célulase expressão de RNAm específicos(Van Soom et al. 1996; Viuff et al,1999, 2000). Essas diferenças, possivelmentedeterminam o começo deuma série de problemas que levam auma redução na eficiência da técnica(Farin et al., 2001). Os embriões PIVapresentam maior vacuolização, menornúmero de células, menor densidadede mitocôndrias, maior densidadede lipídios (Crosier et al., 2001) ejunções incompletas entre as célulasdo botão embrionário e do trofoblasto(Farin et al., 2001). A maior densidadede lipídios observada nesses embriõessugere que eles retiram mais lipídiosdo meio de cultivo ou que seu metabolismoestaria alterado. Em estudo utilizandoa técnica de FISH para avaliarpoliploidias, foi observado que 72%Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 35

dos embriões produzidos in vitro erammixoplóides e que, apesar da mixopolidiaocorrer também em embriões invivo, nos in vitro ocorre com maiorfreqüência e em estágios mais precocesdo desenvolvimento (Viuff et al,1999). Além disso, a poliploida só foiobservada nos in vitro e não nos invivo (Viuff et al., 2000, 2001).Muitos desses problemas são devidosao processo de maturação, masque se manifestam no desenvolvimentoembrionário, visto que o número decélulas e as alterações cromossômicas,por exemplo, são diferentes quandoos embriões PIV são produzidos a partirde ovócitos maturados in vivo e invitro (Van Soom et al., 1996; Vuiff etal., 2000, 2001).Na PIV, cerca de 30% a 50% dosovócitos inseminados chegam ao estágiode blastocisto e os índices de gestaçãoestão em torno de 35 % (Dayanet al., 2000). As maiores perdas nodesenvolvimento embrionário ocorremnos estágios de 8 para 16 células (ativaçãodo genoma do embrião) e póstransferência,em torno dos dias 14 e15 da gestação. Quando embriões PIVou in vivo foram transferidos no dia 7pós-inseminação e recuperados no dia17 da gestação, foi observado que adegeneração e a perda embrionária foimaior nos embriões PIV (Farin etal.,2001). Esse período coincide com oreconhecimento materno da prenhez,o qual depende de um sinal enviadopelo embrião, o interferon -ô, ao organismomaterno. De fato, tem sido demonstradoque embriões PIV secretamquantidades menores de interferon-ôdo que os in vivo, sendo que quantopior a qualidade morfológica do embriãomenor a secreção (Stojkovic etal., 1999).Além do sistema de cultivo usual,outros métodos estão sendo propostoscom vistas a aumentar as taxas deprodução de blastocisto e os índices degestação. Entre eles pode-se citar, osistema de meio seqüencial, em que érealizada uma perfusão para introduzirmudanças na composição do meio decultivo. Essas mudanças são determinadasde acordo com as mudanças nosrequerimentos dos embriões em diferentesestágios de desenvolvimento(Thompson, 1999). E, o cultivo emmicro-câmara usando um sistema microfluídico,que proporciona um ambienteque é mais próximo do sistema invivo do que o sistema estático emmicro-gotas. Além disso, esse permitea utilização de meio seqüencial commudança gradual sem movimentar osembriões (Beebe et al., 2002).Considerações finaisApesar do avanço que houve nessaárea nos últimos anos, vários aspectosprecisam ser ainda esclarecidos. Asquestões estão associadas à avaliaçãoda competência biológica dos gametase ao próprio sistema de cultivo. Estudosbásicos sobre os diversos mecanismosenvolvidos, estão sendo conduzidosno mundo todo. Os resultadosdesses estudos esclarecerão os aspectosrelativos à maior susceptibilidadedos embriões PIV à criopreservação, àmenor viabilidade dos ovócitos debezerras quando comparados aos devacas e às baixas taxas de prenhez.É importante salientar também que,por se tratar de uma técnica relativamentenova, o monitoramento rigorosodas doadoras de ovócitos, dos ovócitos,dos embriões e dos produtosnascidos é de fundamental importânciapara que essa técnica possa serutilizada com segurança, de forma adequadae nas situações mais indicadas.A utilização comercial dessa técnicaainda está limitada ao custo e vai dependerdo balanço entre o méritogenético do produto (bezerro) e ocusto de sua produção. A PIV estásendo gradualmente integrada a programasde melhoramento genético,como uma ferramenta complementara IA e a TE.Em termos práticos, o potencial daPIV fica mais evidente quando se discutemsuas diferentes aplicações. Àmedida que o sistema PIV melhora,novas alternativas surgem, como a criopreservaçãodo ovócito e do embrião,a identificação do sexo dos embriõespreviamente à transferência, abipartição dos mesmos, visando à produçãode gêmeos monozigóticos e àmelhoria dos índices de gestação mediantea transferência dos pares para amesma receptora. O maior impacto daPIV, no entanto, será a sua aplicaçãoassociada à sexagem de espermatozóides.Isso porque, com uma doseinseminante sexada será possível produzirem torno de 30 gestações. Portanto,verdadeiras linhas de produçãode embriões sexados poderão sermontadas para a produção de fêmeas,machos e animais com grau de sanguefixo, como, por exemplo, a GirolandaF1.ReferênciasADONA, P.R., DODE, M.A.N., CHIO-CHETTA, L. FERREIRA, C.B. Retençãoda meiose em folículos inteiros.Arq Fac Vet UFRGS, Porto Alegre,v.28, n.1, p.192, 2000a.ADONA, P.R., DODE, M.A. N., RODO-VALHO, N.C.M., FERREIRA, C.B. 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VETORES ADENOVIRAISPesquisaAdenovírus recombinantes como uma poderosa ferramenta de transferência gênicaFotos e lustrações cedidas pelos autoresAdenovírus-RecombinantesBreve história do adenovíruss adenovírus compreendemuma ampla família devírus não-envelopado quecontêm uma dupla fita deDNA genômico de aproximadamente36 Kpb (Horwitz, 1996). Os adenovírushumanos, hoje com 50 diferentessorotipos virais identificados, estãoentre os vírus mais bem caracterizadose compreende um importante grupode agentes etiológicos que apresentamcapacidade de infectar diferentestipos de células. Os sintomas clínicosmais importantes associados aos adenovirusestão relacionados a doençasrespiratórias, urinárias, oculares e gastrointestinais.Em geral, as infecçõespor adenovírus são de fácil cura, maspodem ser fatais em pacientes imunocomprometidos,nos quais podem causarinfecções generalizadas (Hierholzer,Alysson Renato MuotriPós-doutorando do Departamento deMicrobiologia do Instituto de CiênciasBiomédicas – USParmuotri@usp.brMaria Carolina NasserMarchettoMestranda do Departamento de Microbiologiado Instituto de Ciências Biomédicas – USPJussara Bianchi CastelliMédica Assistente do Laboratório de AnatomiaPatológica, InCor-HCFMUSPArmando Morais VenturaProfessor Doutor do Departamento deMicrobiologia do Instituto de CiênciasBiomédicas – USPCarlos Frederico Martins MenckProfessor Titular do Departamento deMicrobiologia do Instituto de CiênciasBiomédicas – USP1992).A caracterização desses agentes começouem 1953, quando Rowe e cols.,trabalhando com culturas isoladas detecidos de amídalas e adenóides removidoscirurgicamente de crianças, descreveramum agente que causava degeneraçãoespontânea nas células epiteliais.No ano seguinte, dois pesquisadores(Hillerman e Werner, 1954),estudando uma epidemia de doençarespiratória em recrutas militares, descreveramum agente viral similar queinduzia efeito citopático em culturasde células humanas. Esses vírus foram,inicialmente, denominados de “adenoiddegeneration” (AD), “adenoidpharyngealconjuntival”(APC) e “acuterespiratory disease agents” (ARD).Em 1956, a nomenclatura dada aogrupo adenovírus foi adotada e semantém até os dias atuais (Enders ecols., 1956). Um interesse maior poresses vírus surgiu em 1962, quandoTrentin e cols. Demonstraram, pelaprimeira vez, que os adenovírus humanosdo tipo 12 apresentavam capacidadede transformar células primáriasde hamsters. Esse foi o primeiro relatode um vírus patogênico humano relacionadocom oncogênese. No entanto,apesar da ampla pesquisa realizadasobre esse assunto, até hoje não secomprovou qualquer correlação deadenovírus e câncer em humanos. Essecurioso fato de oncogênese provocadapor adenovírus humanos em roedoresé reflexo da semipermissividade à replicaçãodos adenovírus, que ocorrenessas células (Branton e cols., 1984).Dessa forma, apenas parte do genomaviral é expressa, induzindo o fenótipotransformado. Esses genes, expressosde forma precoce, foram caracterizadoscomo regulatórios do processo dereplicação viral e localizados nas regiõesE1A e E1B do genoma viral (Galose cols., 1980). Provavelmente, existemfunções complementares em célulasde roedores, que permitem a suatransformação por esses genes do genomaadenoviral, o que, aparentemente,não ocorre em células humanas,mesmo porque, são encontradascom freqüência seqüências adenoviraisjunto ao genoma de células nãoepiteliais em humanos (por exemplo,células do sangue), indicando uma nãopermissividade ou semipermissividadeque não se reflete em transformação.A infecção viral, mais precisamentena fase de adsorção da partícula viralna membrana celular, é mediada poruma interação de alta afinidade entre afibra protéica do capsídeo com o receptorcelular CAR (Coxsackie andAdenovirus Receptor), recentementeidentificado como uma glicoproteínade 46 KDa. Aparentemente, a susceptibilidadede células à infecção poradenovirus é diretamente proporcionalaos níveis de expressão de CAR.Com a internalização do vírus porendocitose, o genoma viral é deslocadopara o núcleo celular por meio demicrotúbulos, onde a fase precoce dociclo replicativo é iniciada. Nessa fase,temos a transcrição das regiões regulatóriasE1-E4, que dura cerca de 5 horas.A replicação do DNA e a transcriçãodas proteínas estruturais (da fase tardia,regiões L1-L5) acontece posteriormente.O ciclo se completa em tornode 32 horas e a liberação do vírusocorre após a lise celular, gerando emtorno de 10 4 partículas virais por célulainfectada (Horwitz, 1996).38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 1 - Esquema da construção do adenovírus recombinante AdEGFP.O cassete para expressão em células de mamíferos contido no plasmídeopShuttle é constituído por um promotor forte de citomegalovírus (CMV),um sítio de clonagem múltipla, a seqüência sinal de poliadenilação dohormônio de crescimento bovino (PA) e a seqüência da resistência acanamicina (kan). Esse cassete de expressão é flanqueado pelos sítiosúnicos das enzimas de restrição PI-Sce I e I-Ceu I. O plasmídeo pAdeno-X contém os dois ITRs flanqueando o sinal de encapsidação viral ( ),ausência de seqüências E1 e E3 do genoma adenoviral tipo 5 ( E1\E3)e o gene de resistência a ampicilina (Amp). A construção recombinantefoi digerida com Swa I antes da transformação em E.coli e com Pac Iantes da transfecção em células HEK293. Apenas os sítios de restriçãousados estão mostrados. A figura está fora de escala. Todo o procedimentofoi primeiramente descrito por Mizuguchi e Kay em 1998Usando adenovíruscomo vetor genéticoUma vez que o vírus selvagemcausa uma infecção lítica, adenovírusrecombinantes para experimentos detransferência gênica devem ser defectivosem genes essenciais. Isso permitenão só impedir a replicação viralcomo também cria espaço no genomado vírus para a introdução de um geneexógeno de interesse. A região E1contém alguns desses genes e os adenovírusdeficientes em E1 podem sercomplementados com a utilização decélulas HEK (“human embryonic kidney”)293, que contêm essa regiãoviral integrada em seu genoma, fornecendoos genes E1A em trans (VanOrmondt e cols, 1980, Graham e cols.,1977). Por outro lado, a região E3 nãoé essencial e sua ausência em nadainterfere na habilidade replicativa dovírus, podendo ser suprimida sem problemas.Dessa forma, os adenovírusdeficientes na replicação ( E1 e E3)foram os primeiros vetores gerados ebatizados de primeira geração de adenovírusrecombinantes (Graham,2000). Esses vetores podem ser amplificadosem células HEK293 e, posteriormente,utilizados na infecção de qualqueroutra célula alvo. O espaço geradono genoma viral pela ausência dessasseqüências é capaz de suportar até8 Kbp de um transgene (105% do totalde um vírus selvagem). No entanto, obaixo, mas persistente nível de expressãode alguns genes virais dessaprimeira geração de adenovírus, foisendo caracterizado como responsávelpela ativação da resposta imune dohospedeiro e conseqüente baixo tempode expressão do transgene (Yang ecols., 1994). Com o aperfeiçoamentono desenho de vetores derivados deadenovirus, outras seqüências foramsendo eliminadas e, hoje, o melhorvetor adenoviral para uma expressãoprolongada do transgene e, baixa respostaimune in vivo, é aquele em quetodos os genes virais foram retirados,restando apenas seqüências essenciaisem cis, como o sinal de empacotamento( ), e as regiões flanqueadoras(ITRs, “Inverted Terminal Repeats”)do genoma viral, também importantesno correto empacotamento. Essa últimageração de vetores (freqüentementechamada de “all-deleted” ou“helper-dependent”) é refinada e necessitade um segundo vírus auxiliar,fornecedor de todas as proteínas viraisem trans, para que ocorra a replicaçãodo vetor viral (Morral e cols., 1999).Os vetores adenovirais são extensivamenteusados como ferramenta detransferência gênica para células demamíferos, particularmente quando umalto nível de expressão do produtotransgênico é requerido (revisado emDani, 2000). Esse amplo uso é justificadopor algumas razões: sua estabilidadee habilidade de crescer em altostítulos, fácil manipulação/purificação ecapacidade de infectar um amplo es-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 39

Figura 2 - Esquema da produção do adenovírusrecombinante AdEGFP em células HEK293 e suautilização na infecção de células-alvo humanaspectro de tipos celulares, não só demamíferos, independentemente do estadodo ciclo celular (Graham, 2000).Apesar da óbvia vantagem dos vetoresadenovirais “all-deleted” in vivo,os vetores mais utilizados possuemapenas as regiões E1 e E3 retiradas doseu genoma (primeira geração) e representamuma ferramenta extremamentepoderosa para uma transferênciagênica de alta eficiência e expressão.Existem algumas técnicas já estabelecidaspara facilitar a obtenção devetores recombinantes de adenovírus,pois, pelo grande tamanho do genomadesses vírus, dificulta operações simplesde clonagem em bactérias (revistoem Ventura, 2000). Recentemente,um eficiente método para construçãode adenovírus recombinante foi desenvolvido,baseando-se em ligaçõesde fragmentos de DNAin vitro (Mizuguchi e Kay,1998). Por essa estratégia,um vetor intermediáriocontendo o transgenee o DNA viral defectivoé digerido com enzimasde restrição quepossuem sítios raramenteencontrados, seguidode uma reação de ligaçãoentre os fragmentosde DNA obtidos e o plasmídeocontendo seqüênciasadenovirais, comercializadopela Clontech,CA, EUA (pAdeno-X). Ovetor recombinante éamplificado em bactériase posteriormentetransfectado em célulasHEK293. O efeito citopáticopode ser detectadoalguns dias após atransfecção. Os vírus recombinantesgeradosestão prontos, no sobrenadante,para a infecçãoda população celularalvo. Por esse método,os adenovírus recombinantes são obtidossem sucessivos e exaustivos processosde purificação por subclonagemou de seleção por antibióticos.Com o intuito de testar a eficiênciadessa nova tecnologia de ligação invitro e confirmar a habilidade de transduçãogênica desse vetor, descrevemosaqui a obtenção de um vetoradenoviral carregando o gene marcadoregfp (Enhanced Green FluorescentProtein). A proteína GFP foi isolada apartir de Aequoria victoria e tem sidoutilizada como um importante marcadorpara transferência e expressão gênicaem diversos organismos (Chalfie ecols., 1994). Em 1996, Cormack e cols.desenvolveram uma variante dessaproteína (EGFP), que possui uma fluorescência35 vezes maior que a proteínaselvagem. Essa proteína pode serFigura 3 - Triagem das construções por PCR que contêm o cDNA egfp. Coluna1: água, colunas de 2 a 16, clones candidatos. A seta indica o tamanho esperadodo fragmento (370 pb)facilmente detectada a olho nu, semnecessidade de substrato ou marcaçõesadicionais, pela excitação por luzUVA (395/470 nm), emitindo umafluorescência verde (509 nm) in vivoe in vitro. Com o vetor construído, foipossível atingir um alto nível de expressãoda proteína EGFP em ensaiostransientes, além de uma infecção de100% em uma população celular humanaalvo.Construção do adenovírusrecombinante carregandoo cDNA egfp (AdEGFP)Um resumo da estratégia utilizadaestá esquematizado na figura 1 e, basicamente,envolve três passos. Primeiramente,o cDNA egfp foi clonado nosítio de clonagem múltipla do vetorintermediário pShuttle. O plasmídeoresultante foi clivado com duas enzimasde restrição raras (PI-Sce I e I-CeuI), liberando um inserto que contém ocassete de expressão do cDNA egfp,sob orientação de um promotor fortede citomegalovírus (CMV). O insertofoi diretamente clonado no vetor adenoviral(pAdeno-X) nos mesmos sítiosraros de restrição, gerando o plasmídeopAdEGFP. Após essa reação, aligação é digerida com outra endonuclease,Swa I, a fim de diminuir onúmero de falsos positivos (sem oinserto desejado). Após a digestão, omaterial é purificado e utilizado paratransformar baterias competentesE.coli, DH5á. Nessa etapa, cerca de70% das colônias obtidas contêm oinserto desejado, em triagem feita porPCR, figura 2. Na última etapa doprocesso, o DNA do adenovírus recombinanteé digerido com Pac I,expondo as ITRs e transfectado emcélulas HEK293 de baixa passagemem cultura. O processo de produçãoviral pode ser todo acompanhado diretamente(e convenientemente) pelavisualização da proteína EGFP. Essegene marcador pode também ser incorporadono esqueleto do pAdeno-Xjunto com um segundo cassete deexpressão, sob ação de um promotorindependente ou não. Após 10-20 dias,o efeito citopático é claramente visívele acompanhado pelo microscópio defluorescência, figura 3. A expressão deegfp é visível em 12-24 horas após atransfecção em 30% a 40% de HEK293,40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 4 - Efeito citopático causado pela transfecção do pAdEGFP em célulasHEK293. A e B demonstram o começo do efeito citopático 7 dias após atransfecção. C e D mostram a morfologia celular 10 dias após a transfecção.Nas duas situações, o mesmo campo foi fotografado com duas condições deluminosidade diferentes: A e C com luz fluorescente; B e D com luz UV (395-470 nm), e aumento de 100Xde efeito citopático acontecem emfrascos de 75 cm 2 , sugerindo que adegradação de DNA ou outro fatorpode limitar a eficiência da produçãoviral; (v) A estratégia é direta e nãorequer qualquer tipo de passo envolvendorecombinação; dessa forma,quando a construção desejada é detectada,não é necessário o isolamento deplacas virais: trata-se de uma soluçãohomogênea de vírus.Quando a maioria das células descolado fundo do frasco (em torno de15 dias após a transfecção), os vírus sãoimediatamente processados para umareação de PCR. Na figura 4A temos ademonstração de que o vírus geradopor esse sistema é positivo para ocDNA egfp e para a fibra, um componenteestrutural do capsídeo do adenovírus.O DNA viral gerado foi negativopara o gene E1, confirmando ostatus replicação-deficiente e não acusandocontaminação com o vírus selvagem.A figura 4B demonstra a integridadeestrutural das partículas viraisproduzidas, detectadas por microscopiaeletrônica.representando a eficiência de transfecçãodessas células com esse tipo deconstrução. Os vírus obtidos podemser recolhidos do sobrenadante e utilizadospara infectar diretamente umaoutra célula alvo ou amplificados novamenteem HEK293 para atingir altostítulos virais.Algumas observações importantessobre esta metodologia devem sermencionadas: (I) é possível incluir maisde um cassete de expressão ou insertosde até 8 Kpb. No entatno, é importanteevitar os sítios de restrição: PI-SceI, I-Ceu I, Swa I e Pac I no(s) gene(s)de interesse a ser(em) clonado(s) nopShuttle; (II) A digestão com Swa Iantes da transformação em bactérias ea resistência a ampicilina do pAdeno-X, fornecem um alto rendimento deobtenção da construção desejada; (III)as células HEK293 são facilmente transfectadaspor precipitação em cálcio oumétodos baseados em lipossomos eexpressam o gene E1 de forma constitutiva,necessário para a propagaçãode todos os adenovírus recombinantes.Células saudáveis e com baixapassagem (até p40) são requisitos essenciaispara o sucesso do empacotamentoviral; (IV) apesar da alta eficiênciade transfecção, apenas alguns focosDetecção de expressão deEGFP em células humanasO título viral produzido após a transfecçãoem HEK293 variou entre 10 3 e10 5 unidades formadoras de expressãopor ml de sobrenadante (medido diretamentepor microscopia ou citometriade fluxo). O título obtido é proporcionalà eficiência de transfecção e ovírus recombinante obtido (AdEGFP)foi usado para infectar fibroblastos humanos(linhagem XP12RO), que nãoexpressam os genes E1 e EGFP. Acarga viral usada foi de 10 vírus porcélula (MOI 10) e a expressão deFigura 5 - Análise da integridade das partículasvirais recombinantes AdEGFP. A. Análisedo DNA viral recombinante por PCR. Coluna1: água, coluna 2: pAdEGFP e coluna 3: DNAdo vírus AdEGFP. Fibra, egfp e E1 foram osgenes analisados por PCR. B. Partículas viraisdetectadas por microscopia eletrônica. Assetas indicam os vírus recombinantes AdE-GFP. Aumento de 16.000XBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 41

Figura 6 - Transdução de EGFP em fibroblastos humanos(XP12RO) infectados com AdEGFP (10 MOI).A. Análise por microscopia de fibroblastos infectadoscom o AdEGFP, em luz branca fluorescente e luz UV(100X). B. Citometria de fluxo de células XP12ROantes e depois da infecção com o AdEGFP. M1 =porcentagem do total de células que expressam aproteína EGFPFigura 7 - Expressão de EGFP após a infecção doAdEGFP (10 MOI) em fibroblastos humanos. A.Visualização do extrato de proteínas totais de célulasXP12RO não infectadas e previamente infectadascom o AdEGFP, sob a luz UV. B. Western-blotda proteína EGFP (38 KDa) em função do tempoapós a infecção viral. 1. uma hora, 2. duas horas, 3.quatro horas, 4. oito horas, 5. doze horas, 6. 24 horas,7. quarenta e oito horas e 8. setenta e duashoras. Foi utilizado o anticorpo anti-EGFP comosondaEGFP foi detectada 24 horas após ainfecção, usando-se microscópio defluorescência invertido e citometria defluxo, figura 5. Essa dose foi capaz deinfectar mais de 97% da populaçãocelular sem qualquer efeito citopáticovisível, mesmo após as células ficaremuma semana em contato com o vírus.A extração de proteínas totais de célulasinfectadas ou não pelo AdEGFP járevela a alta expressão do transgene,bastando compará-los sob a luz UV,figura 6A. A proteína EGFP foi detectadapor Western-blot 4 horas após ainfecção. O maior nível de expressãoobtido foi em 48 horas após a infecção;em 72 horas, já observamos uma diminuiçãoda expressão, provavelmentedevido à diluição da proteína com aduplicação celular, figura 6B.Discussão e PerspectivasA tecnologia de transferência gênicapor adenovírus é, sem dúvida, umdos métodos mais poderosos que temoshoje em dia para introdução degenes em células de mamíferos. Osadenovírus têm um amplo espectro decélulas permissivas, de modo que vetoresderivados desses vírus podemser utilizados para transferir genes deinteresse para células de várias espécies(incluindo humanos) e de diferentestecidos. Uma vez que o maquináriode infecção dos adenovírus independedo ciclo celular, podem ser infectadascélulas em replicação ou diferenciadas.É possível ainda trabalhar comcélulas primárias (não imortalizadas)ou com linhagens transformadas, ondea eficiência de infecção é idêntica.Após a infecção, a expressão do transgenecomeça tão logo o DNA viralatinja o núcleo celular e tem início aexpressão gênica transiente (Marchettoe cols., 2001). Logicamente, níveiscontrolados de expressão podem seratingidos com o uso de promotoresespecíficos ou indutíveis. Além disso,em células somáticas, como o DNAadenoviral não integra no genoma celular,o risco da freqüência de mutaçõesinsercionais e da atenuação daexpressão genética é reduzido, o quegeralmente acontece quando genomasestranhos se integram no DNAcelular (Verma e Somia, 1997). Essesvírus recombinantes podem prontamenteco-expressar mais de um transgenena mesma célula alvo com baixatoxicidade, indicando que a grandemaioria das células sobrevive ao processode infecção. Métodos convencionaispara a criação de vetores recombinantessão geralmente baseados emfenômenos de recombinação in vivo,seja em células HEK293, seja em E.coli.Esses métodos são trabalhosos e ineficientes,envolvendo um tempo muitogrande durante a purificação de placasvirais para o isolamento de possíveiscandidatos a adenovirus recombinantes.Mesmo após todo esse esforço, écomum encontrar contaminação comvírus selvagem. Esses processos nãosão satisfatórios para um futuro usoclínico e, uma vez que não estão baseadosem uma clonagem direta, favorecema emergência de vírus com replicação-eficientedurante a amplificação.O método utilizado aqui, desenvolvidopor Mizuguchi e Kay (1998),oferece uma alternativa mais direta esimples, contornando todos esses reveses.Com um protocolo elegante,baseado apenas em ligações in vitro, o42 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

procedimento utiliza técnicas básicasde biologia molecular para incorporarDNA exógeno no esqueleto de umadenovirus humano do tipo 5, comreplicação-deficiente. Uma das maioresvantagens desse método consistena obtenção de quantias razoáveis ehomogêneas de vírus sem passar porqualquer procedimento de purificaçãode placas virais. O uso do gene marcadorEGFP torna possível ainda visualizartodo o processo de uma formaextremamente conveniente.O vírus recombinante carregando ocDNA egfp (AdEGFP) é capaz de infectar100% de uma população decélulas humanas, sem o menor traçode citotoxicidade, com um elevadonível de expressão do transgene. Aexpressão desse gene marcador começacom 4 horas e ainda podia serdetectado 5 dias após a infecção nascélulas utilizadas. A estabilidade daproteína a ser expressa e o padrão dereplicação da célula alvo podem modificaro modelo de expressão do transgene.Trabalhando com células primáriasem confluência, foi possível detectara expressão de proteínas funcionaistransduzidas por esses adenovírus recombinantesem até dois meses apósa infecção (Muotri e cols., 2002). Essesresultados mostram que o AdEGFPpossui uma alta capacidade de infecçãoe de transferência gênica, resultandonuma alta expressão de EGFP emfibroblastos humanos. A eficiência dessesvetores para uso clínico está sendoexplorada pela indústria biofarmacêutica,que visa à sua utilização na genômicafuncional. Qualquer modificaçãoque venha a melhorar a escala e arapidez do processo de criação deadenovírus recombinantes vai causarum impacto direto no número de genesque podem ser estudados. Acreditamosque o sistema como existe hojejá consegue suportar a produção depequenas bibliotecas de transgenesem adenovirus de forma eficiente. Alémdo mais, vírus com modificações específicasno transgene (previamente produzidaspor PCR degenerativo, porexemplo) podem ser selecionados invivo a partir de uma população originalcom base direta em ensaios funcionaisna célula alvo. Logicamente, o problemaimunológico e a característica epissomaldos adenovírus devem ser levadosem conta, principalmente quandose trabalha in vivo. O uso desses vetoresem terapia gênica deve levar aindaem consideração a resposta imune emhumanos, e o uso da última geração devetores adenovirais, com a maioria dosgenes virais ausentes, representa, comcerteza, um dos recentes avanços queserão, em breve, assimilados pela indústria.AgradecimentosAgradecemos os órgãos financiadores:CNPq e FAPESP.ReferênciasBranton, PE, Bayley, ST, Graham, FL.1985. Transformation by humanadenoviruses. Biophys. Acta. 780:67-94.Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, WardW, Prasher D. 1994. Green fluorescentprotein as a marker for geneexpression. 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PESQUISABibliotecas Apresentadas emFAGOSMarcelo de Macedo BrígidoProf. Dr., Grupo de Imunologia Molecular – UnBLab. Biologia Molecular / departamento deBiologia Celularbrigido@unb.brFotos e ilustrações cedidas pelos autoresPhage Display LibrariesAndréa Queiroz MaranhãoProfa. Dra., Grupo de Imunologia Molecular – UnBLab. Biologia Molecular / departamento deBiologia Celularandreaqm@unb.brFigura 1 - Organização estruturalde uma partícula viral dobacteriófago M13 (Kischenko etal., 1994, com modificações). Ovírion tem cerca de 9.300 Å de comprimentoe 65 Å de diâmetro. A extremidadedo vírus, que é montadaprimeiro (distal), é recoberta porcinco cópias de p7 (33 resíduos deaminoácidos) e cinco moléculas dep9 (32 resíduos de aminoácidos). Aextremidade proximal, que é montadapor último, possui cinco cópias dep6 (113 resíduos de aminoácidos) ecinco de p3 (406 resíduos deaminoácidos). Entre as duas extremidadeso DNA circular e de fita simples(ssDNA) é recoberto por milharesde cópias de p8 (50 resíduos deaminoácidos)44 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002urante os últimos anos, umanova perspectiva da BiologiaMolecular tem atraído diversosgrupos de pesquisadores: o desenvolvimentode novas biomoléculas como objetivo de se obter fármacos, vacinase outras drogas de interesse biotecnológico.A grande maioria dos processosbiológicos envolve contatos entresuperfícies macromoleculares (enzimasubstrato,receptores-efetores, proteínas- ácidos nucléicos, etc.) que sãoresultantes das forças físico-químicascaracterísticas dessas superfícies contactantes.Dessa forma, pode-se afirmarque a evolução molecular se manifestapela busca do aprimoramentode tais interações, seja no intuito defavorecê-las ou não, mas procurandosempre a manutenção do equilíbrio dosistema vivo. Na natureza, esse fenômenoocorre como um processo detentativas e erros, onde subpopulaçõesde variantes da população primordialsão selecionadas, positiva ounegativamente. Assim, a evolução molecularnatural é um processo quedemanda longos períodos de tempo,uma vez que a seleção é exercida sobum pequeno número de variantes (Kenanet al., 1994).Atualmente é possível aplicar, emlaboratório, métodos que visem a dirigirartificialmente a evolução molecularem função de objetivos prédeterminados.Em oposição aos mecanismosnaturais, as metodologias realizadasin vitro abreviam o tempo requerido,selecionando populações molecularescompostas pelo maior númeropossível de variantes. Uma das metodologiasmais empregadas atualmenteé a construção de bibliotecas conformacionais,que são definidas comouma população de ligantes em potencial,composta por (bio)moléculas deformas variantes. Cada membro dabiblioteca apresenta uma forma distinta,que determinará a capacidade deinteração deste com uma moléculaalvo.Quanto maior for o número deformas representadas na biblioteca,mais facilmente será encontrado umligante afim (Posner et al., 1994).Vários tipos de bibliotecas conformacionaisforam descritos, com a utilizaçãode diversas estratégias; entreessas, destacam-se aquelas sintetizadasquimicamente, como as de oligonucleotídeose de peptídeos fixos ouem solução (revisadas por Kenan etal., 1994), e as produzidas em sistemasvivos, como as leveduras, bactériasou bacteriófagos filamentosos (revisadaspor Scott,1993).Bacteriófagos FilamentososOs fagos filamentosos (M13, f1, fd,entre outros) pertencem à família Inoviridaede bacteriófagos e possuemcomo material genético DNA fita simples(ssDNA). A infecção viral ocorrevia pilus sexual de células bacterianasgram negativas que apresentam o genedesta fímbria especial codificado peloplasmídio F. A liberação das partículasvirais, que são produzidas a cada ciclose realiza a partir da extrusão do DNAatravés da membrana. Em nenhumdestes dois processos ocorre lise celular.A partícula viral esquematizada nafigura 1 é composta pelo genoma virale por cinco proteínas estruturais. Nocapsídio do fago estão presentes asproteínas p3, p6, p8, p7 e p9. No fagoselvagem, encontram-se cerca de 2.800

Figura 2 - Esquematização do ciclo infectivo de bacteriófagosfilamentosos. Os fagos filamentosos infectam células de bactérias Gramnegativas através da interação de p3 adesinas do pillus sexual. Apóseste contato inicial, o DNA fita simples entra dentro da célula e é convertidoa DNA fita dupla ou RFDNA. Ao assumir essa conformação, a síntesede proteínas virais se dá utilizando-se a maquinaria celular. As novas partículasvirais são montadas a partir da extrusão do DNA fita simples pelamembrana celular, onde estão localizadas as proteínas virais estruturais(Webster, 2000)cópias da proteína 8 (p8), que formamo corpo do capsídio cilíndríco e flexível.Nas extremidades desse capsídioencontram-se de três a cinco cópiasdas demais proteínas estruturais. Aextremidade distal contém as proteínasp7 e p9, enquanto que a proximalé composta pelas proteínas codificadaspelo gene 3 (p3) e pela proteínap6. O diâmetro da partícula viral é decerca de 65 Å e o seu comprimentodepende do tamanho do genoma encapsulado,sendo que cada nucleotídeodo ssDNA confere 1,435 Å decomprimento ao ser envolvido por p8,e as proteínas minoritárias contribuemcom cerca de 175 Å. (Makowisk, 1993).A incorporação de proteínas exógenasna superfície dos fagos filamentososfaz-se fusionando-se esses peptídeoscom proteínas estruturais daspartículas virais. As duas principais proteínasutilizadas para esse fim são aproteína p8 e a p3.O ciclo infectivo dos fagos filamentosos(figura 2) é iniciado pela ligaçãoda proteína p3 à extremidade dos pilida célula bacteriana. Em seguida, ocorrea internalização do ssDNA viral (denominadofita +), que atua como moldepara a síntese da fita complementar(denominada -) dentro da hospedeira,originando um DNA de fita dupla,correspondente à forma replicativa(RFDNA). O RFDNA é capaz de dirigira sua replicação, a produção de ssDNA,bem como a síntese de mRNA viral,utilizando-se, para tanto, da maquinariaenzimática da hospedeira.Os vírions formados são montadospela extrusão do ssDNA através doenvelope bacteriano, sem lisar a célulaou impedir sua divisão. Após atravessara membrana, o DNA viral passa aser revestido pelas proteínas estruturais,completando assim a montagemda partícula viral, que é então liberadapara o sobrenadante da cultura (Smith& Scott, 1993).A principal proteína estrutural utilizadapara a apresentação de proteínasé a proteína 3. Responsável pela adesãoda partícula viral ao pilus sexual, oproduto do gene III dos fagos filamentososcorresponde à maior das proteínasestruturais, com uma massa molecularde cerca de 42 kDa na sua formamadura. Essa proteína é sintetitizadasob a forma de um precursor contendopeptídeo sinal, que é clivado durante apassagem através da membrana. Aproteína 3 (p3) associa-se ao capsídioviral através de 23 resíduos de aminoácidoshidrofóbicos próximos à extremidadeC-terminal. O produto do geneIII contém ainda dois arranjos repetitivosdo motivo Ser-Gly-Gly-Gly ou Ser-Glu-Gly-Gly-Gly, localizados a 70 e a215 resíduos de aminoácidos da extremidadeN-terminal. Esses arranjos sãoresponsáveis pela aparente flexibilidadeda molécula (Makowski, 1993)Em 1984, Crissman e Smith estabeleceramo papel funcional dos domíniosamino e carboxi de p3, sendo aporção N-terminal requerida para ainfectividade viral, enquanto que a C-terminal desempenha papel na morfogênesedas partículas. Em 1985, Smithmostrou que era possível inserir umgene inteiro entre os dois domínios dep3 e que esta ainda era capaz demanter ambas as funções. Mais surpreendenteainda era o fato de que aseqüência exógena era incorporada àpartícula viral e apresentada de formaacessível ao reconhecimento molecular.Isso demonstrava que determinantesantigênicos, presentes na proteínaexógena fusionada à p3 eram apresentadosna superfície da partícula viral.Esses trabalhos levaram à proposiçãode que bibliotecas conformacionais depeptídeos ou mesmo de proteínaspoderiam ser construídas por meio damanipulação do gene III, assim comodo gene VIII de bacteriófagos filamentosos(Smith, 1993).Outra possibilidade de apresentaçãoé utilizar-se do principal constituintedo capsídio de fagos filamentosos, aproteína p8. Essa proteína tem umaforma cilíndridica e é composta por 50resíduos de aminoácidos. Também ésintetizada como uma pré-proteína apartir da expressão do gene VIII. Quandoancorada à membrana celular pelopeptídeo sinal, expõe o seu domínioC-terminal para o periplasma. À medidaque ocorre a extrusão do DNA viral,p8 vai sendo incorporada no vírionemergente. No vírus, a porção C-terminalaparece próxima ao ssDNA, enquantoa N-terminal, dotada de grandeBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 45

misturas com proteínas selvagens. Polipeptídeosde maior massa molecularpodem ser apresentados ao longo docapsídio do bacteriófago, fusionados ap8, desde que p8 selvagem (em tornode 80%) seja fornecida ao sistema.Esse tipo de construção pode ser alcançadoquando fagomídios são utilizados(a proteína selvagem é sintetizadaa partir do genoma do fago auxiliar),ou quando os vetores virais apresentamduas cópias do gene viii, umaselvagem e uma de fusão (Webster,2000).Apresentando Peptídeos naSuperfície dos FagosFigura 3 - Seleção de ligantes de uma biblioteca utilizando-se oantígeno adsorvido em placa de microtitulação. Bibliotecas de formasvariantes do gene de interesse são obtidas e clonadas em fagomídiospara incorporação do peptídeo ao capsídio viral. As partículas virais defusão apresentando a biblioteca são produzidas e colocadas em contatocom ao antígeno fixado a um suporte. Sucessivas lavagens são realizadase os fagos remanescentes são eluídos da placa e amplificados por meiode infecção de células bacterianasflexibilidade, fica exposta ao solvente,sendo essa última aquela que é manipuladapara apresentar peptídeos exógenos(Smith & Scott, 1993).Inicialmente acreditava-se que apenasbibliotecas de peptídeos (de, nomáximo, 6 a 8 resíduos de aminoácidos)podiam ser apresentadas pelaproteína VIII. Isso é válido nos sistemasde apresentação onde todas as proteínas8 são de fusão, não existindoA possibilidade de expressão deuma proteína de fusão no capsídio defagos, de maneira acessível ao reconhecimentopor um ligante, abriu ocaminho para a construção de bibliotecasconformacionais apresentadas nasuperfície dessas partículas virais. Osvírus, cujos genomas são manipuladosde forma a apresentarem em seuscapsídios o polipeptídeo exógeno fusionadocom uma de suas proteínasestruturais, são denominados fagos defusão.Nas bibliotecas construídas em fagosfilamentosos, a seleção de formas,com maior ou menor afinidade, por umligante alvo é feita misturando-se fagosde fusão, produzidos e liberados para osobrenadante de cultura de célulasinfectadas, com a molécula reconhecidapelo peptídeo recombinante fixaem um suporte. A figura 3 mostra umesquema onde uma placa de microtitulaçãofoi recoberta com um ligante;em seguida, incubaram-se fagos defusão apresentando uma biblioteca deformas de peptídeo exógeno fusionadasà proteína 3. Durante os procedimentosde lavagem, os fagos capazesde reconhecer o ligante com o qual aplaca foi sensibilizada, são retidos. Osfagos selecionados podem ser obtidosatravés de condições de eluição quedesfavoreçam a ligação desses com amolécula presa ao suporte, e após asua amplificação por meio de infecçãode células de E. coli, os fagos selecionadospodem ser utilizados em novosciclos de seleção. A cada procedimentode seleção, formas mais afins dopeptídeo exógeno são obtidas, ocorrendoo processo de maturação daafinidade (Lowman & Wells, 1993).Devido às diferenças nas quantidadesde p3 e p8 presentes nas partículasvirais de fusão, as bibliotecas apresentadasno contexto da proteína 8 sãoditas multi ou polivalentes, uma vezque várias cópias da proteína de interessesão incorporadas ao capsídio dosfagos, e aquelas que se utilizam de p3são denominadas monovalentes, emvirtude da presença de, no máximo,46 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 4 - Representaçãoesquemática de umfagomídeo hipotético paraa construção de bibliotecasconformacionais nasuperfície de partículasviraistrês cópias das proteínas de fusão.Essas diferenças nas quantidades podemser exploradas em momentosdistintos da seleção de bibliotecas:pode-se assegurar seleção de formasde menor afinidade, utilizando-se bibliotecasmultivalentes e, em seguida,submetê-las a um refinamento da afinidadeem sistemas monovalentes (Wells,1996).VetoresTanto o gene VIII quanto o gene IIIvêm sendo utilizados para a expressãode bibliotecas conformacionais embacteriófagos filamentosos. Diversasestratégias têm sido descritas para amanipulação desses genes com vistasà obtenção de sistemas eficientes paraa expressão das bibliotecas (Smith,1993). Uma das formas encontradaspara se superar os problemas de manipulaçãodo DNA viral foi a utilização defagomídios, que são plasmídios quepossuem, além da origem de replicaçãoativa em E. coli, a origem dereplicação fagos filamentosos, que contémtodos os elementos para a sínteseda fita complementar e replicação viral,bem como o sinal de empacotamentodo DNA fita simples. Nessessistemas, células transformadas com ofagomídio são infectadas por um fagoauxiliar (helper), que contêm todos osgenes do bacteriófago filamentoso,permitindo o resgate do fagomídio soba forma de partícula viral. Durante ainfecção viral, o ssDNA provenientedos fagomídios é revestido por proteínasestruturais preferencialmente aossDNA originado pelo helper. Isso ocorreporque os fagos helper apresentammutações na seqüência que forma ogrampo, as quais dificultam o empacotamentode seu próprio material genético(Webster, 2000).O fagomídio construído para apresentaçãode bibliotecas conformacionaisna superfície de fagos filamentososé manipulado de forma a expressaros diversos peptídeos quiméricos, fusionadosa um dos genes III ou VIII.Quando ocorre a infecção com o fagoauxiliar, os capsídios são montadoscontendo misturas de p3 ou p8 selvagem(codificadas pelo auxiliar), e proteínasquiméricas (expressas a partirde um dos genes III ou VIII fusionados,contidos no fagomídio), gerando umaprogênie de fagos de fusão. Nas célulasreinfectadas por esses fagos defusão, os fagomídios podem ser obtidossob a forma de plasmídios bacterianos(fita dupla - RFDNA) podendoassim ser amplificados, purificados enovamente manipulados (Breitling etal., 1991).A utilização de fagomídios, comovetores para a construção de bibliotecastem sido bastante difundida (Dübelet al., 1993). A maior vantagem dessesistema é a possibilidade do gene daproteína de fusão se propagar na formade um plasmídio. Dependendo dopromotor utlilizado, esse gene podeser amplificado de forma regulada atéo momento da infecção com o fagoauxiliar, reduzindo o número de mutantesselecionados negativamente. Osfagomídios transformam E. coli de formamais eficiente que o RFDNA e apartícula viral formada a partir de seussDNA, de menor tamanho que a originadapelos vetores do tipo fago, é maisestável, dissociando-se menos facilmentedos ligantes imobilizados (Breitlinget al., 1991).O esquema geral de um fagomídioutilizado para a produção de bibliotecasna superfície de bacteriófagos filamentososestá representado na figura4. Dentre os elementos constituintesmais importantes, destacam-se: as origensde replicação de E. coli e defagos, o gene que confere resistência aantibiótico, o promotor que dirige atranscrição do gene de fusão e a seqüêncialíder responsável pela citolo-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 47

Tabela 1 - Exemplos de Utilização de Bibliotecas Apresentadas em FagosBibliotecaFinalidade / Espécie MolecularPequenos Peptídeos Mapeamento de sítios enzimáticosRandômicosMapeamento de Epitopos(até 20 resíduos de aminoácidos, Agonistas e antagonistas de biomoléculassendo de 6 a 8 randômicos) Identificação de mimotoposPeptídeos ligantes a ácidos nucléicosPeptídeos com potencial para vacinaçãoEndereçamento endotelialReferênciaCheadle et al., 1994Hoess et al., 1995; Wang et al., 1995Smith et al., 1993; South et al., 1995Folgori et al.,1994Wu et al., 1995Stoute et al., 1995Pasqualini & Rouslahti, 1996Grandes PolipeptídeosReceptores celularesEnzimas: β-lactamasetripsinaInibidores de ProteasesInibidores da coagulação sangüíneaDomínio de ligação ao HIV do CD4 humanoHormôniosAnticorpos: FabscFvHumanização de AnticorposProteínas obtidas a partir debibliotecas de cDNAConstrução de fatores transcricionaisEstabilização de ProteínasScarseli et al., 1993; Robertson, 1993Soumillion et al., 1994Corey et al., 1993Roberts et al., 1992Pannekoek et al., 1993Abrol et al., 1994Lowan & Wells, 1993Zebedee et al., 1992;Maranhão & Brígido, 2000; Ward,1993Wang et al., 2000Barth et al., 2000Beerli et al.,2000Chakravarty et al., 2000calização do produto de fusão.As origens de replicação são seqüênciasgênicas que são reconhecidaspela maquinaria celular ou viralpara produzir cópias do fagomídio. Aorigem de E. coli mais usada nos vetoresjá construídos é a col E1, derivadados plasmídios tipo pUC, responsávelpelo alto número de cópias do fagomídiona célula, em sua forma plasmidial(dupla fita). A origem de fago correspondeà região intergênica encontradano genoma dos vírus. Essa seqüência écapaz de, com o auxílio das enzimascelulares, transformar o fagomídio dessDNA (forma infectante, empacotadano capsídio viral) em forma replicativae vice-e-versa (Allen Jr. et al.,1993).Assim, quando a célula contendo ofagomídio é infectada pelo fago auxiliarpara a produção de partículas virais,ocorre a replicação do DNA plasmidialpelo mecanismo de círculo rolante,dando origem ao DNA fita simples,que migra para a membrana celularpara ser revestido por proteínas docapsídio.As seqüências promotoras utilizadaspara dirigir a síntese do produto defusão nos vetores têm sido as maisdiversas. Acredita-se que a estequiometriaentre proteínas de fusão e proteínasselvagens seja um importantefator na estabilidade da partícula viralapresentadora de proteínas exógenas(Posner et al., 1994). Dessa forma, autilização de promotores muito fortes,como os virais, deve ser evitada amenos que esses possam ser mantidossob repressão até o momento da produçãoda partícula viral recombinante.As seqüências codificadoras para opeptídeo sinal são responsáveis peloencaminhamento da proteína de fusãopara a membrana celular. Deve-se ressaltarque a translocação total atravésda membrana celular não ocorre, umavez que o domínio C-terminal de p3permanece inserido nesse compartimentocelular até que o produto defusão seja incorporado ao capsídio dovírion emergente (Breitling et al.1991). Entre as seqüências líderes descritas,a mais usada é a pel B (Hoogenboomet al., 1991).Vantagens sobre outrossistemas de seleção.Quando comparadas às bibliotecasde expressão construídas em sistemascomo λgt11, os sistemas utilizandofagos filamentosos apresentam váriasvantagens. A primeira delas é quefagos filamentosos não lisam as célulasinfectadas, o que possibilita a separaçãode partículas virais do conteúdointracelular, eliminando-se assim muitoda reatividade cruzada com proteínascelulares. Assim, enquanto a varredurade clones em sistemas tradicionais(que lisam as células) requer oligante puro (Rapoport et al., 1995),tal não é exigido quando são utilizadasbibliotecas apresentadas na superfíciede partículas virais. Bibliotecas construídasna superfície de fagos já foramcapazes de ser selecionadas até pelainteração do fago de fusão com superfíciesde células em cultura, e mesmodiante da complexidade de formaspresentes nesse tipo de superfíciealvo,as partículas foram capazes deinteragir com o ligante específico (Meulemanset al. 1994; Edwards, et al.,2000).Outra característica importante éque essa nova metodologia utiliza osmais rápidos protocolos de seleção jádescritos, e possibilita a varredura deaté 10 8 clones por ciclo de seleção.Esse método é mais rápido porque osobrenadante das culturas infectadas,contendo de 10 10 a 10 13 clones por mL,pode ser utilizado diretamente para aseleção. Essa utilização prescinde datransferência para membranas, que,além de limitar o número de clones(limitação de área) do filtro, é umprocesso extremamente trabalhoso.O alto número de variantes geradosnas bibliotecas apresentadas na super-48 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

fície do capsídio de fagos permite amutação randômica simultânea de até 6códons de aminoácidos, possibilitandoque as (~2x10 6 ) formas possam sersubmetidas a ciclos de seleção de umasó vez (Lowman & Wells, 1993). Vale apena ressaltar que, ao se isolar o fagoatravés do fenótipo (capacidade de ligaçãoa uma molécula-alvo) apresentadoem seu capsídio, isola-se também ogenótipo codificador dessa característica.Isso ocorre uma vez que o ssDNA dofagomídio ou fago de fusão é empacotadono capsídio da partícula que apresentao peptídeo exógeno.Apesar das vantagens aqui apresentadas,existem alguns relatos que apontamproblemas na utilização desses sistemasde expressão/seleção. O primeiroproblema diz respeito à instabilidadeobservada em bibliotecas que apresentamalguns tipos de anticorpos, e, alémdisso, há autores que consideram que opasso de amplificação, que envolve umatransfecção viral, possa ser um empecilho(Rapoport et al., 1995). Outrosrelatam também problemas de crescimentocelular nas culturas que expressama proteína de fusão, o que poderiaocasionar uma relativa tendenciosidadeda biblioteca, que passaria a expressar,preferencialmente, as formas mais toleradaspela bactéria (Kenan et al., 1994).A despeito desses problemas as bibliotecasapresentadas em fagos (phagedisplay libraries), em conjunto com oprocedimento de seleção (biopanning),são uma metodologia consagrada naliteratura. Diversos exemplos delas eseus principais resultados estão listadosna Tabela I.Outros fagos também já foram utilizadospara apresentação de proteínasexógenas em seus capsídios: baculovírus(Lindley etal., 2000), bacteriófago λ(Zhang et al., 2000) e vírus da hepatiteB (Kratz et al., 1999). Alguns ajustestambém foram propostos. Entre esses,destaca-se a utilização de bibliotecasfusionadas à porção infectiva da proteínaIII, acoplando-se assim a seleção deligantes com capacidade infectante dapartícula selecionada (Krebber et al.,1997), a regulação da expressão com autilização de diferentes promotores(Huang et al., 2000), a obtenção demutantes de pVIII para melhorar a expressãode grandes polipeptídeos (acimade 100 kdA) de forma multivalente(Sidhu et al., 2000) além da otimizaçãode métodos de seleção utilizando-se asuperfície de células em cultura comoalvo da seleção (Watters et al., 1997;Edwards, et al., 2000).Entre os trabalhos que se utilizamdessa técnica com aplicabilidade e potencialterapêutico, destaca-se o estudode endereçameto de tumores. Esseestudo vem sendo explorado por experimentosde seleção in vivo, utilizando-sebibliotecas de peptídeos expressasna superfície de bacteriófagosfilamentosos (Pasqualini & Ruoslahti,1996; Johns et al., 2000). As bibliotecassão injetadas por via intravenosa nacauda de camundongos e, após a suacirculação na corrente sangüínea, oanimal é sacrificado e os seus órgãossão retirados. Os fagos que conseguiramromper a barreira endotelial sãoobtidos desses órgãos e caracterizados.A partir desses estudos, várias aplicaçõesenvolvendo químio e radioterapiaespecíficas têm sido propostas.Além disso, busca-se a associação entreos peptídeos expressos em fagos eaqueles presentes na superfície decélulas tumorais metastásicas visandoao desenho de drogas capazes deimpedir a migração e, conseqüentemente,a metástase.Outro campo importante que seabriu nos últimos anos foi a possibilidadede se desenharem fatores transcricionaistotalmente in vitro a partir debibliotecas de zinc fingers e de seleçãocom diferentes oligonucleotídeos.Esses experimentos resultaram no isolamentode domínios protéicos capazesde reconhecer seqüências específicasde DNA. Utilizando-se essas proteínasartificiais, selecionadas por PhageDisplay, já foi possível ligar e desligargenes in vivo de plantas (Beerli etal., 2000).Resumidamente, pode-se dizer queas bibliotecas conformacionais - apresentadasno capsídio de fagos filamentosos- têm emergido como poderosoinstrumento em diversas áreas de pesquisa,desde as mais básicas, como oestudo de estruturas biomoléculas, atéà obtenção e o desenho de novosfármacos e vacinas contra diferentesdoenças (Medynski, 1994).Bibliotecas combinatóriasde anticorposUma das moléculas mais utilizadaspara a construção de bibliotecas emfagos filamentosos são as imunoglobulinas.Os anticorpos são proteínas envolvidasna resposta imune a agentesinfecciosos e são investigados sistematicamentepor seu envolvimento nahomeostase do organismo vertebradoe por seu potencial biotecnológico. Autilização de anticorpos na medicinaterapêutica e na propedêutica vemcrescendo nos últimos anos e certamenteterão um grande impacto namedicina deste novo século.Os anticorpos são obtidos in vivopor um processo de seleção naturalinduzida pela presença do imunógenoacompanhado por linfócitos, gerandoanticorpos de alta afinidade a um dadoantígeno. É exatamente esse mecanismode seleção in vitro que chamou aatenção dos pesquisadores no sentidode adaptar anticorpos às bibliotecascombinatórias em fago. Assim como osanticorpos, que são selecionados invivo por um imunógeno externo, osfagos são selecionados in vitro por umligante. Essa analogia entre os doisprocessos foi inicialmente comentadapor Winter e seus colegas, em 1992(Hoogenboom & Winter, 1992) e,desde lá, a obtenção de anticorposrecombinantes nos sistemas apresentadosem fagos tem sido cada fez maisfreqüente. Neste sentido admite-se queos anticorpos recombinantes obtidospor apresentação em fago seriam representativosda resposta imune. Esseconceito é, no entanto, falho, pois nãoconsidera que o processo de seleçãoem fago seja influenciado por outrosparâmetros muito distintos daquelesencontrados no organismo. Por outrolado, com um sentido pragmático, aobtenção de anticorpos com especificidadee afinidade compatíveis àquelesobtidos in vivo é possível.O desempenho do reagente obtidoquanto a sua capacidade de reconhecimentodo antígeno depende de doisfatores fundamentais: o tamanho dabiblioteca inicial, isto é, a capacidadede representar o repertório do animalimunizado; e o procedimento de seleçãoutilizado. Várias estratégias têmsido utilizadas para se alcançar esseêxito e elas se baseiam em obter umabiblioteca inicial de tamanho igual ousuperior ao repertório imune (em tornode 10 7 ), buscando melhor eficiênciade transformação e de amplificaçãoBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 49

dos genes variáveis dos anticorpos.Os anticorpos maduros são o resultadoda combinação de genes variáveisque são associados em umprocesso,do qual resulta uma alta variabilidade.Essa combinação de genesassociada à maturação de afinidadepermite aos anticorpos uma capacidadede ligação a um número ilimitadode formas. Sendo assim, uma bibliotecade anticorpos representativa contémformas ligantes a um númerovirtualmente ilimitado de antígenos.Em nosso grupo de trabalho, adaptamosbibliotecas de anticorpos emfago para explorar questões básicas(Maranhão & Brígido, 2000) e paraobtenção de reagentes com aplicaçãobiotecnológica. Com um viés acadêmico,utilizamos essa técnica para comparara seleção de famílias de genesvariáveis por determinado antígeno,com a resposta imune in vivo. Tentamos,com isso, observar se, fora docontexto in vivo, conseguiríamos observaruma tendência na associação decertos antígenos com anticorpos derivadosde determinadas famílias degenes variáveis. Caso haja alguma associação,teremos uma forte evidênciade como o antígeno seleciona o repertórioobservado in vivo. Por outro lado,bibliotecas combinatórias estão sendoutilizadas para selecionar anticorposde alta afinidade específicos para detectarantígenos de tumor ósseo. Apartir do repertório natural de pacientescom osteosarcoma, procuramos encontraranticorpos que auxiliem o diagnósticodessa doença e que possam sereventualmente utilizados na terapêuticacomo agentes anti-tumorais. Estamostambém atuando na área de biotecnologiaagronômica, onde procuramosdesenvolver anticorpos eficientesna neutralização de enzimas de nematóidesenvolvidas na infestação dedeterminados tipos de cultivos. A idéiaé introduzir genes sintéticos, codificadoresdesses anticorpos, no genomade hortaliças no intuito de se obteremplantas transgênicas, que, produzindoo anticorpo neutralizante, tornem-seresistentes aos parasitas.PerspectivasO estudo da tecnologia de apresentaçãode bibliotecas combinatórias nasuperfície de bacteriófagos, que datade 17 anos, já mostrou o seu potencialna produção de novas formas comcapacidade ligante a um grande númerode moléculas. Espera-se que nospróximos anos essa técnica venha arepresentar uma técnica corriqueira deampla divulgação entre os pesquisadores.Nesse contexto, torna-se importanteressaltar que essa técnica complementaa atual onda de projetosgenômicos, onde se gera um grandevolume de informação, mas com poucainterpretação em nível fenotípico.Com a técnica de apresentação emfago, podemos agora testar genes deinteresse em grande escala, na buscade um conjunto de proteínas que interagem,e que vem sendo chamado deinteratoma. A busca desses interatomaspromete expandir os limites criadoscom os projetos genômicos e permitemagora inferir acerca de comoesses genes se relacionam, explicandoo indivíduo fenotipicamente. Nessecontexto, a técnica de apresentaçãoem fago poderá ser amplamente utilizada.Portanto, espera-se, que nos próximosanos, venhamos a considerarum papel corriqueiro a técnica deapresentação em fago.Referências BibliográficasAbrol, S., Sampath, A., Arora, K. &Chaudhary, V. K. (1994). Constructionand characterization of M13bacteriophages displaying gp 120binding domains of human CD4.Indian J. Biochem. & Biophys., 31:302-309Allen Jr., G. C., Dixon, N. E. & Kornberg,A. (1993). Strand switching ofreplicative DNA helicase promotedby the E. coli primossome. Cell,74: 713-722.Barth, S., Weidenmüller, M.K., Schimidt,M.F.G. & Engert, A. (2000).Combining phage display and screeningof cDNA expression libraries:a new approach for identifying thetarget antigen of an scFv preselectedby phage display. J. Nol. 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CONVERSÃO ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DEPesquisaCANA-DE-AÇÚCARFotos cedidas pelos autoresAplicação da biotecnologia enzimática na conversão de resíduos da indústria de alimentosClaudio Lima AguiarPesquisador do Laboratório de Bioquímica -Faculdade de Engenharia de Alimentos -Universidade Estadual de Campinas.claguiar@yahoo.com.brTobias José Barreto MenezesProfessor Doutor - Departamento deAgroindústria, Alimentos e Nutrição -Universidade de São Paulo.tmenezes@mpc.com.brIntroduçãos resíduos agro-industriais sãoabundantes e podem ser utilizadospara produção de glicosee de produtos derivados (Gacesa& Hubble, 1991). No Brasil, obtêm-seos mais diversos subprodutos e resíduosagro-industriais, como é o caso doFigura 1 - Linha de moagem de cana-de-açúcar com formação do bagaçobagaço de cana-de-açúcar. Em decorrênciada produção do álcool etílico edo açúcar cristal a partir da cana-deaçúcar,avalia-se que, da quantidade debagaço processado (Figura 1) e utilizadopara alimentar caldeiras, haja umexcedente correspondente a 8% nasdestilarias anexas e 12% nas autônomas,que poderia ser empregado nahidrólise de açúcares, como glicose, apartir da celulose contida nesse bagaço(Camargo, 1990).Há diversas maneiras pelas quaisessa celulose pode ser transformadaem açúcares livres: ação de ácidos,bases, compostos oxidantes, microrganismosou enzimas. A degradação biológicada celulose consiste em umahidrólise enzimática catalisada por celulasesque são amplamente produzidaspor fungos e bactérias (Barrichelo& Brito, 1985). Khandke et al. (1989)relatam que a celulose é degradadapor um complexo de enzimas compostoessencialmente por endocelulase,exocelulase e β-glicosidase. Noentanto, para possibilitar a transformaçãoenzimática da celulose para glicose,o bagaço deve ser previamentetratado por algum tipo de processoquímico ou físico. A cristalinidade, aárea superficial específica, o grau depolimerização e a adsorção de celulasesobre o substrato sólido de celulose sãopara Ryu & Lee (1992) importantesparâmetros que governam a hidrólisedesse polímero. A resistência à hidróliseque a natureza estrutural da maioriados resíduos celulósicos apresentapode, segundo Sales et al. (1987), serparcialmente superada com algum tipode tratamento físico, químico ou biológicopara melhorar seu aproveitamento,sendo que um dos processos maisantigos empregados para deslignificaresses resíduos consiste em umidificáloscom solução de hidróxido de sódio.Menezes et al. (1976) e Menezes et al.(1991) relatam que o tratamento alcalinode compostos ligno-celulósicosaumentou a sua digestibilidade, tornandoo substrato predisposto à ação52 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Tabela 1: Variáveis independentes no planejamento fatorial 2 3Causas de variaçãoA: celulase-bagaçoB: tipo de bagaçoC: presença de β-glicosidaseNíveisBaixo Alto7,0 EGU/g/g 28 EGU/g/gBC1 BC20,0 UI/g/g 2,8 UI/g/gForam considerados os extratos enzimáticos comerciais: celulase de T. viride(atividade enzimática expressa em unidade de endo-glucanase, EGU/g) e β-glicosidase de A. niger (UI/g), por grama de bagaço, em base seca. Os tiposde bagaços analisados foram: BC1 – bagaço lavado e moído e, BC2 – bagaçotratado com solução de hidróxido de sódio a 4%, ácido fosfórico e vapor.substrato em açúcares redutores, sendo45,5% de glicose, quando utilizaramcelulase total de Trichoderma harzianumE58 com uma atividade de 15 U/g celulose a 45°C por 48 horas deincubação.Neste trabalho, o potencial de hidrólisedo bagaço de cana-de-açúcartratado e não tratado foi então avaliadopela utilização do extrato fúngico emcomparação com o preparado comercialde Trichoderma viride, complementadoou não com preparado comercialde β-glicosidase.de enzimas celulolíticas. Para Menezes& Hennies (1991), o tratamento dobagaço de cana com hidróxido desódio potencializou a síntese da celulasede Aspergillus niger utilizada nahidrólise de resíduos celulósicos, indicandouma maior exposição da celulosedevido ao efeito deslignificante dotratamento alcalino. Lee et al. (1995)utilizando materiais lignocelulósicos, alcançaramporcentagens de hidrólisede 60 a 70%, com atividade enzimáticade 20 U/g celulose. Menezes & Hioshii(1982) obtiveram 35% de hidrólise dobagaço de cana tratado a 121ºC comsolução de hidróxido de sódio a 4%, eporcentagens inferiores a 10% foramalcançadas com bagaço tratado comálcali sem aquecimento. O tratamentodo bagaço de cana com solução dehidróxido de cálcio a 2% aumentou asusceptibilidade da celulose ao ataqueenzimático por linhagens de Aspergillussp. (Gupte & Madamwar, 1997).Van Walsum et al. (1996) utilizaramum tratamento com água (220°C, 5MPa e 120 s) para acondicionar bagaçode cana, predispondo as fibras celulósicasà hidrólise enzimática e simultâneafermentação alcoólica.Segundo Dueñas et al. (1995) arazão de celulase:β-glicosidase de 1:2foi favorável para a hidrólise da celulose.Esses autores relatam que a interaçãosinérgica de Trichoderma reesei eAspergillus phoenicis em fermentaçãosubmersa promoveu uma eficiênciamaior de degradação lignocelulolíticado que o uso único de T. reesei, provavelmentedevido à interação complementardas celulases do T. reesei e β-glicosidase do A. phoenicis para completahidrólise do bagaço de cana. ParaLatif et al. (1995), a razão de celulasepara β-glicosidase deveria ser 1:1,5para que a hidrólise da celulose aaçúcares fermentescíveis seja mais eficiente.Mes-Hartree et al. (1987), utilizando5% de celulose comercial, alcançaramcerca de 52% de conversão doMaterial e métodosO microrganismo utilizado foi Aspergillusniger IZ-09, o qual foi desenvolvidoe mantido em meio Czapek-Dox, por aproximadamente, sete diasem estufa a 30°C.As enzimas empregadas foram: umapreparação comercial de celulase deTrichoderma viride e uma preparaçãocomercial de β-glicosidase de Aspergillusniger, fornecidas pela Novo Nordiske um extrato bruto de celulaseobtido em laboratório, a partir do cultivode Aspergillus niger IZ-9 em meiode Mandels-Weber (1969) com papelde filtro como fonte de carbono. Umaatividade enzimática de celulase (expressaem Unidades de EndoGlucanase,EGU) foi definida como aquela quelibera um micromol de glicose porminuto a 50ºC.Foram utilizados dois tipos de bagaçode cana-de-açúcar: o sem tratamentoquímico (BC1) e o bagaço tratadoTabela 2: Comparação de médias de hidrólise da celulose do bagaço de canaTratamento12345678EGU/g/g bagaço7,028,07,028,07,028,07,028,0Tipo de bagaçoBC1BC1BC2BC2BC1BC1BC2BC2UI β-glicosidase/g/gbagaço0,00,00,00,02,82,82,82,8Conversão (%)*9,45 f15,91 e25,66 d46,41 b11,27 f15,91 e35,71 c59,50 a* Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 1%. D.M.S. (1%) = 3,33;D.M.S. (5%) = 2,49.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 53

Tabela 3: Efeito dos diferentes tratamentos sobre a porcentagem dehidrólise da celulose de bagaço de cana-de-açúcarTratamentos12345678com hidróxido de sódio a 4%, ácidofosfórico e vapor d’água. O tratamentofoi conduzido pesando-se 100 g dobagaço de cana lavado e moído, quefoi autoclavado (121°C; 30 minutos)com 2000 mL de solução de hidróxidode sódio a 4%. O material recuperadoapós filtração, foi neutralizado comácido fosfórico e seco em estufa a 65°Caté massa constante. Ao bagaço obtidofoi adicionado à mesma quantidade deágua destilada, autoclavado em seguidaa 121°C por 30 minutos. A suspensãofoi filtrada e o material sólido secoa 65°C até massa constante. O bagaçoassim obtido foi denominado BC2.A conversão enzimática foi avaliadaa partir de um planejamento fatorialconstituído de 2 3 tratamentos, com trêsrepetições. Para esse experimento,Porcentagem de hidrólise (%)*0 h 24 h 48 h 72 h0,0 7,9 9,5 9,50,0 14,0 15,1 16,10,0 17,3 22,2 26,10,0 32,6 40,7 47,30,0 9,9 11,1 11,30,0 14,2 16,1 16,10,0 22,9 32,1 36,40,0 39,6 53,0 59,5* As concentrações de celulose e glicose foram expressas em miligramas pormililitro, e os valores medidos após 72 horas de incubação a 50ºC e agitaçãorotativa de 100 rpmforam consideradas a influência de trêsvariáveis: proporção celulase-bagaço(A), tipo de bagaço (B) e presença deβ-glicosidase (C). Os níveis adotadossão mostrados na Tabela 1. Todos osexperimentos foram conduzidos a 50 o Ce agitação circular de 100 rpm.Os resultados foram analisados empregando-seo programa SANEST -Sistema de Análise Estatística para Computadores(Zonta & Machado, 1992), eaplicando-se o teste de Tukey paracomparação das médias da hidrólise dacelulose presente no bagaço de cana.Finalmente a conversão da celuloseem açúcares redutores, expressa emporcentagem, foi determinada adicionando-seaos Erlenmeyer de 250 mL, 5g de bagaço (ms.), 40 mL de águadestilada, 10 mL de solução-tampãoTabela 4: Formação de glicose durante a hidrólise da celulose de bagaço decana-de-açúcarTratamentos12345678Concentração (mg/mL)*Celulose Glicose16,7 1,8415,4 3,1024,3 8,9617,1 16,2016,3 2,2015,4 3,1020,8 12,5012,5 20,80* As concentrações de celulose e glicose foram expressas em miligramas pormililitro, e os valores medidos após 72 horas de incubação a 50ºC e agitaçãorotativa de 100 rpmcitrato de sódio 1 mM (pH 4,8) e aquantidade correspondente de cadaextrato enzimático segundo a Tabela1. Os frascos foram incubados emagitador rotativo a 100 rpm a temperaturade 50°C, por 24 horas. O teor deaçúcares redutores foi medido no sobrenadantesegundo o método deMiller (1959). A celulose foi determinadasegundo o método espectrofotométricodescrito por Updegraff(1969).Resultados e discussãoAs maiores porcentagens de hidróliseforam alcançadas com bagaçode cana tratado, o que evidencia queo tratamento físico e químico foi necessáriopara um melhor aproveitamentodo conteúdo celulósico dobagaço, sem o qual o seu uso diretamentena forma encontrada nas usinasseria impedido (Menezes & Hioshii,1982; Barrichelo & Brito, 1985;Sales et al., 1987; Van Walsum et al.,1996 e Gupte & Madamwar, 1997). Otratamento com NaOH, H 3PO 4e vaporproporcionou maior suscetibilizaçãoda celulose à hidrólise enzimática,resultando em maiores conversõesem açúcares redutores do que apenasa moagem do bagaço.Pela Tabela 2, pode-se verificarque o tratamento 8 propiciou maiorporcentagem de hidrólise quando foramaplicados sobre o bagaço de canatratado níveis mais elevados de celulasee β-glicosidase.Na Tabela 3, foram apresentadasas porcentagens de hidrólise obtidasem três intervalos de tempo consideradospara o estudo, ou seja, 24, 48 e72 horas. Pode-se observar que há umaumento gradual na porcentagem dehidrólise do material celulósico comformação de açúcares redutores, independentedo tratamento empregado,muito embora em alguns a conversãoda celulose tenha sido maisacentuada. O perfil de formação deaçúcares redutores, na forma de glicose,pode ser observado na Tabela 4,na qual está representada a reduçãoda concentração de celulose com aumentoconsecutivo da concentraçãode glicose. Da mesma forma que a54 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Tabela 3, o aumento na conversão épercebido em todos os tratamentosefetuados.A relação celulase-bagaço foi umimportante fator que influenciou nahidrólise dos bagaços, atingindo, aproximadamente,o dobro da conversãoquando foi usado em nível elevadopara celulase (28,0 EGU/g/g de bagaço)e bagaço tratado (BC2). A adiçãode β-glicosidase, além da celulase, foiigualmente importante para potencializara hidrólise da celulose. Utilizandobagaço de cana sem tratamento, apresença da β-glicosidase não foi estatisticamentesignificativa. Cuskey etal. (1983) e Tsuneda & Thorn (1995)relataram que a associação da celulosecom lignina reduz a acessibilidadedo complexo enzimático, o que poderiaexplicar a baixa eficiência da β-glicosidase em bagaço sem tratamentoprévio.Dentro das condições em que foidesenvolvido o experimento, podeseconcluir que o extrato fúngico decelulase, quando utilizado com a mesmapotência, teve comportamentosemelhante à preparação comercial.Entre os tratamentos utilizados, destacou-seaquele com solução de hidróxidode sódio a 4%, ácido fosfórico evapor. A adição de β-glicosidase aumentoua porcentagem de hidrólise.Pelos resultados obtidos pelas análisesestatísticas, o tratamento 8 (28,0EGU/g de celulase, 2,8 UI/g de β-glicosidase e bagaço tratado), foi oque promoveu maior hidrólise da celulose,com valor médio de 59,5%.Referências bibliográficasBARRICHELO, L. E. G.; BRITO, J. O.Química da madeira. Piracicaba:Centro Acadêmico “Luiz deQueiroz”, 1985. 126 p.CAMARGO, C. A. Perfil do setor. 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PesquisaDETERGENTES BIOLÓGICOS BIODEGRADÁVEISAVALIAÇÃO DAS FORMULAÇÕES DO MERCADOIlustrações cedidas pelos autoresGrupo de Biologia de Fungos de Importância Médica e Biotecnológica Centro de Biotecnologia - UFRGSSydnei MitidieriDoutorando em Biologia Celular eMolecularUFRGSmitidier@dna.cbiot.ufrgs.brAnne Helene Souza MartinelliGraduanda em Ciências BiológicasUNISINOSanisinha@bol.com.brSiumar CamassolaGraduando em AgronomiaUFRGSscamassola@yahoo.com.brPaloma Koprovski MenguerGraduanda em Ciências BiológicasUFRGSpalomitamk@yahoo.com.brAugusto SchrankPh.D, Professor Adjunto do Depto.Biologia Molecular e Biotecnologia ePesquisador do Centro de Biotecnologiaaugusto@dna.cbiot.ufrgs.brMarilene Henning VainsteinPh.D, Professora Adjunta do Depto. deMicrobiologia e Pesquisadora do Centrode BiotecnologiaCBiot-UFRGSmhv@dna.cbiot.ufrgs.brIntroduçãos enzimas são proteínasdotadas de propriedadesespeciais, estando presentesem todos os sistemasbiológicos, onde exercem diversas funções,acelerando reações entre componentesquímicos. A isSo se chamaatividade catalítica das enzimas. Elasproduzidas pelos organismos vivos e,quando degradadas, são reaproveitadascomo aminoácidos. Agem em matérias-primasrenováveis, como frutos,cereais, leite, gorduras, carne, algodão,couro e madeira. Sendo originalmenteproduzidas para atuar em células vivas,mantêm usualmente sua atividade empressões atmosféricas e em condiçõesmoderadas de temperatura e pH. Comoproteínas, as enzimas são passíveis dedesnaturação (perda da atividade), poragentes químicos e físicos. A maioriadelas possui um rendimento máximo atemperaturas de 30º a 70°C e em pHaproximadamente neutro, havendo,entretanto, grandes variações entre asdiversas enzimas (Crueger & Crueger,1984; Falch, 1991; Godfrey, 1996).Os detergentes modernos apresentamum espectro de ação e de utilizaçãobastante amplo, havendo, conseqüentemente,necessidade de especializaçãodas formulações. A principalvantagem da formulação de detergentesque contenha enzimas é a substituiçãode produtos cáusticos, ácidos esolventes tóxicos, que agridem o meioambiente e que provocam o desgastede materiais e de instrumentos. O usodiversificado das enzimas deve-se àsua característica de atuar como biocatalisadoresespecializados. As enzimasadicionadas às formulações de deter-Figura 1 - Teste de atividade utilizando azocaseína 2% (m/v) comosubstrato, realizado nos produtos “A”, “B” e “C”. O ensaio foi realizado emquintuplicata, sendo mostrado o seu desvio padrão. A atividadeproteolítica foi expressa como ∆OD/mL.h. A absorbância dosobrenadante foi lida em espectrofotômetro em λ de 440 nm.* Estatisticamente significativo, teste de Tukey α=0,0556 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

Figura 2 - Teste de atividade amilolítica realizada nos produtos “A”, “B” e“C”. O ensaio foi realizado em quintuplicata, sendo mostrado o seu desviopadrão. A atividade amilolítica foi expressa em Unidades Internacionais(U.I.) por mL.min. A leitura foi realizada em espectrofotômetro em λ de550 nm.* Estatisticamente significativo, teste de Tukey α=0,05gentes de uso hospitalar, doméstico eindustrial agem digerindo e dissolvendoresíduos orgânicos (sangue, fezes,urina, vômitos, manchas diversas), higienizandoas partes externas e internasde instrumentos cirúrgicos, desobstruindocanais com resíduos e coagulados,eliminando resíduos fecais doscanais e superfícies dos fibroscópios eremovendo contaminantes da roupariahospitalar (Godfrey, 1996)Os principais tipos de enzimas utilizadasnessa indústria incluem: a) amilases– degradam amido e outros glicídiosde carboidratos; b) proteases –degradam ligações peptídicas; c) lipases– degradam lipídeos; d) celulases -degradam celulose (Bon, 1995).A preocupação crescente com oambiente é outro fator que tem levadoos fabricantes a reavaliar as formulaçõesjá existentes. Nas formulaçõesmais recentemente utilizadas, muitosingredientes impróprios, até entãoempregados, foram substituídos porenzimas, mantendo o mesmo desempenhodos antigos produtos. As enzimascomo princípios ativos dos detergentesapresentam a grande vantagemde ser 100% biodegradáveis. Umanova geração de detergentes sem fosfatoe sem cloro alvejante, contendoapenas uma mistura de enzimas, comformulação mais segura e menos cáustica,foi introduzida na Europa há váriosanos. O uso de enzimas, em particularas amilases, em processos industriais,satisfaz as exigências das normas deISO 14000 de baixo impacto ambiental,além da redução de gastos energéticosassociados ao aumento da qualidadedo produto (Bon, 1995). As projeçõesindicam que combinações variadasde misturas de enzimas venham asubstituir, cada vez mais, os ingredientesmenos aceitáveis do ponto de vistaambiental, nas formulações de detergentes.Um exemplo está na fabricaçãode detergentes de máquinas delavar louças automáticas, no mercadoeuropeu. A substituição de muitos dosingredientes que agrediam o meioambiente por enzimas tornou possívelà manutenção do mesmo desempenho(Novozyme, 2000).Estes exemplos ilustram a capacidadetecnológica das enzimas parasolucionar uma variedade de problemasambientais. São muitos os principaisbenefícios da utilização de enzimasnesse processo, entre eles: atuamem temperaturas e condições físicasmoderadas substituindo solventes orgânicos,e em muitas condições severas,reduzindo o gasto energético eeliminando a poluição ambiental; sãoaltamente específicas, o que significamenos efeitos indesejáveis e não liberaçãode produtos intermediários imprópriosdurante o processo de suautilização; podem ser utilizadas parao tratamento de resíduos em dejetosbiológicos, inclusive em grandes volumese são totalmente biodegradáveis(Novozyme, 2000).No início do século XX, Röhm(1913), desenvolveu o primeiro métodode lavagem de tecidos comdetergentes que continham enzimas,fabricando a primeira formulação dessesdetergentes. A empresa de Röhmpatenteou o produto em 1913 e apreparação foi comercializada até osanos sessenta. A formulação do produtobaseava-se na tripsina, uma enzimadigestiva produzida no pâncreasde mamíferos. O produto não obtevegrande sucesso, pois a tripsinanão era suficientemente ativa emlíquidos fortemente alcalinos (pHmaior que 9,0), obtidos pela diluiçãodo detergente (Bon, 1995).Em 1959, ocorreu um desenvolvimentomarcante na indústria de detergentes.O químico suíço Jaag, quetrabalhou para a companhia de detergentesGebrüder Schnyder, em Biel,na Suíça, desenvolveu um produtonovo denominado Bio 40, que continhauma protease bacteriana emsubstituição à tripsina. Embora a proteasebacteriana fosse mais adequadaao propósito industrial, esse aindanão era o produto ideal. Em 1962, aempresa Novo Nordisk lançou nomercado um produto denominadoAlcalase®. A ação dessa protease alcalinaobtida de microrganismos nãoera afetada por outros componentesdo detergente e era eficaz nas temperaturasdesejadas (Novozyme,2000).O primeiro grande sucesso de“marketing” de um detergente formuladocom enzimas foi o Biotex,que continha Alcalase® e foi produzidopela KORTMAN & SCHULTE (atualmenteKortman Intradal) em colaboraçãocom Gebrüder Schnyder. Osucesso desse produto marcou umareal inovação na utilização de enzimasem detergentes a partir de então(Novozyme, 2000).O uso de enzimas para propósitosindustriais progrediu rapidamenteapós 1965, devido, principalmente,ao uso crescente de diferentes enzimasem detergentes. Entretanto, hou-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 57

ve um retrocesso temporário no inícioda década de setenta, quando se averiguouque as enzimas poderiam causarreações alérgicas (Novozyme,2000).Por iniciativa do “Food and DrugAdministration” (FDA), a “NationalAcademy of Science” (NAS), efetuouuma ampla investigação sobre esseassunto. A NAS, em seu relatório de1971, concluiu que as enzimas presentesnas formulações de detergentesnão só são inofensivas aos consumidores,como também proporcionam vantagenstecnológicas definidas à indústria.Os produtores de detergentes sãohoje os maiores consumidores de enzimasindustriais. Por isso, constantemente,estão sendo desenvolvidosnovos produtos contendo novas enzimase novas formulações com tal finalidade.A principal e mais recente inovaçãonesse campo foi a introdução,em 1988, de uma formulação comlipase (Novozyme, 2000).Como mencionamos acima, as enzimasmais utilizadas em formulaçõesde detergentes são as amilases, proteases,lipases e celulases.As amilases, produzidas na glândulasalivar e no pâncreas de vários mamíferose também produzidos por fungose bactérias são hidrolases capazes dedegradar especificamente as ligaçõesglicosídicas do amido (amilose, amilopectina)e de seus produtos de degradação(maltodextrinas) até o estágiode oligossacarídeos. São amplamentedistribuídas na natureza, onde participamem vários processos biológicostais como a digestão de alimentos poranimais e microrganismos, e na germinaçãoe maturação de grãos. São tambémempregadas em outros segmentosindustriais, para despolimerizaçãocontrolada do amido, originando substratosimportantes em processos fermentativos,e na preparação de xaropesde glicose, maltose ou mistos;panificação; cervejaria; e produção deetanol. Na formulação de detergentes,são utilizadas para a remoção de resíduosinsolúveis de alimentos ricos emamido pela degradação de oligossacarídeos,tornando-os solúveis e, portanto,facilmente removíveis (Hopkins,1946; Fogarty & Kelly, 1980; Cornelis,1987; Vihinen & Mantsala, 1989; Moraes,1993; Chuzel & Cereda, 1995).As proteases são as enzimas maisutilizadas na indústria de detergentespara a remoção de resíduos protéicosou proteínas, como sangue, manchasde ovo, suor humano, entre outros.Esse grupo inclui uma larga variedadede enzimas que clivam ligações peptídicasem substratos menores (peptídeos)ou maiores (proteínas), atuandona porção central dos substratos protéicos(endopeptidases) ou nas porçõesexternas (exopeptidases). O grupomais comumente empregado naindústria de detergentes é o das endopeptidasesde especificidade não restrita,as quais degradam substratos protéicosa peptídeos solúveis. Tais enzimasprovêm de várias fontes (North,1984; Perona & Craik,1995).Lipases são enzimas que hidrolisamas ligações éster das gorduras, produzindoálcoois e ácidos graxos (Bon,1995).A celulase utilizada em detergentesenzimáticos traz ao produto propriedadesque possibilitam a modificaçãoda estrutura de fibras de celulose encontradasno algodão. Quando essecomplexo é adicionado a um detergentemantém a vivacidade das corescom um efeito amaciante, provavelmentedevido à remoção das microfibras(Wainwright,1990; Peberdy,1994).Apesar dos detergentes enzimáticosjá serem utilizados há muitos anos,o seu uso no Brasil é mais recente.Como as enzimas possuem ação diretasobre determinada substância, devemosconsiderá-la como uma substânciaativa em uma formulação. A AgênciaNacional de Vigilância Sanitária- ANVI-SA define ingrediente ativo como: “Ingredienteativo ou princípio ativo -substância presente na formulação paraconferir eficácia ao produto, segundosua destinação” (ANVISA, 2001). Osativos químicos são definidos em percentual,massa ou volume. Em umaformulação contendo enzimas não sedeve especificar concentração enzimáticadessa forma, visto que essesprodutos são freqüentemente constituídosde misturas heterogêneas dediversas proteínas, além de serem passíveisde sofrerem inúmeras interferências,alterando, assim, sua atividadeenzimática. Além disso, uma parte daquantidade de enzima pode estar presentena preparação, mas inativada oudesnaturada, ou seja, parcialmente desprovidada sua atividade original. Outrosfatores presentes na formulaçãofinal do produto também podem provocaruma diminuição da atividadeenzimática.Devido a essas dificuldades, desde1961 a “ENZYME COMMISSION” da“International Union of Biochemistryand Molecular Biology (IUBMB)”, juntamentecom a “International Union ofPure and Applied Chemistry (IUPAC)”,vem editando as recomendações paraa definição do conceito de atividadeenzimática. Essas recomendações têmo caráter de Convenção Internacionale inclui o Brasil como signatário. Essadefinição indica que a concentraçãoenzimática em uma formulação deveser definida não em termos de volumeou massa e sim da sua atividade enzimáticaexpressa em U.I. (UNIDADESINTERNACIONAIS). Uma U.I. é a quantidadede enzima capaz de catalisar atransformação de um micromol do substratoou produzir um micromol deproduto, por um determinado períodode tempo em condições padrões. Essaforma de determinação é precisa quandose trata de substratos bem definidose baseados em uma padronização epossibilita perfeitas comparações entrediferentes formulações (IUBMB,1992).Alternativamente, quando se tratade reações mais complexas, onde ossubstratos ou os produtos são menosdefinidos, como as proteases, a “EN-ZYME COMMISSION” recomenda aadoção de critérios quantitativos paradefinir a unidade enzimática, levandosempre em consideração a necessidadede identificar a ação catalítica típicada enzima, igualmente em condiçõespadronizadas de ensaio (IUBMB, 1992).O objetivo deste trabalho é demonstrarexperimentalmente que asdefinições utilizadas pelo “ENZYMECOMMISSION” são as mais adequadase precisas para a comparação dos váriosdetergentes enzimáticos comercializadosno Brasil. Em um ensaio noqual foram utilizadas três formulaçõesde detergentes enzimáticos encontradosno mercado, as atividades enzimáticasde protease e amilase foram de-58 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

terminadas e comparadas. O detergente“A” continha em sua formulaçãoamilase, protease e lipase, todas definidasem percentual; os detergentes“B” e “C” continham amilase, protease,lipase e carboidrase, também definidasem percentual. Convém salientar quea carboidrase é uma nomenclatura queengloba um grupo de enzimas capazesde hidrolisar ligações de carboidratos.Esse termo utilizado na rotulagemde um detergente não é apropriado,visto que as amilases e as celulases são,por definição, carboidrases.Material e métodosDeterminação da atividade deprotease - A determinação da atividadeproteásica dos diversos detergentesfoi realizada utilizando-se azocaseína2% (m/v) como substrato. Nesseensaio de atividade proteolítica, a atividadefoi expressa como ∆OD.mL -1 .h -1 .Para o ensaio foi utilizada uma misturade reação que continha: 0,1 mL desubstrato, 0,1 mL de amostra enzimáticae 0,2 mL de tampão fosfato 50 mMpH 8,0. Os tubos foram incubados a50ºC por quinze minutos. Transcorridoo tempo de incubação, foram adicionados0,8 mL de ácido tricloroacético20% a cada amostra. Para o branco dareação foi utilizado 0,1 mL de substrato,0,8 mL de ácido tricloroacético 20%,0,1 mL de amostra enzimática e 0,2 mLde tampão fosfato 50 mM pH 8,0.Todos os tubos foram resfriados e centrifugadospor cinco minutos a 13.000X g em centrífuga Eppendorf. Os ensaioscom as amostras foram realizadosem quintuplicata, utilizando-se umbranco para cada amostra. A atividadeproteásica foi estimada a partir da leituraem espectrofotômetro (λ 400 nm)do sobrenadante da reação (Sangorrínet al., 2001).Determinação da atividade deamilase - A determinação da atividadeamilolítica foi realizada utilizando-seamido solúvel a 1% (m/v) como substrato.Nesse ensaio, a atividade foiexpressa em U.I. Para o ensaio foiutilizada a mistura de reação contendo100 µL de amostra; 300 µL de tampãocitrato de sódio 50 mM pH 6,0 e 200 µLde substrato. Para o branco da amostra,Figura 3 - Teste de atividade lipásica realizada nos produtos “A”, “B” e“C”. O ensaio foi realizado em quintuplicata, sendo mostrado o seu desviopadrão. A atividade lipásica foi expressa em Unidades Internacionais (U.I.)por mL.h. A leitura foi realizada em espectrofotômetro em λ de 410 nm.* Estatisticamente significativo, teste de Tukey α=0,05foram utilizados 100 µL de amostra,300 µL de tampão citrato de sódio 50mM pH 6,0 e 200 µL de H 2O destilada.Os tubos foram incubados a 42º C porquinze minutos. Transcorrido o tempode incubação, foram adicionados 1,5mL do reagente contendo ácido dinitrosalicílico.As amostras foram incubadas a 96ºCpor cinco minutos. Os tubos foramresfriados e adicionados 17,9·mL deH 2O destilada. Todos os tubos foramhomogeneizados. Os ensaios com asamostras foram realizados em quintuplicata,utilizando-se um branco paracada amostra. A leitura da atividadeamilolítica foi realizada em espectrofotômetro(λ 550 nm). O reagente DNScontém 3,53 g de ácido 3,5-dinitrossalicílicoe 6,0 g de hidróxido de sódioem 472 mL de água destilada, acrescidode 102 g de tartarato duplo desódio e potássio, 2,53 mL de fenol e2,76 g de metabissulfito de sódio (Summer,1929: in Fuwa,1954).Determinação da atividade delipase - A determinação da atividadelipásica foi realizada utilizando-se ρ-nitrofenil palmitato 3mg.mL -1 em isopropanolcomo substrato. Nesse ensaio,a atividade foi expressa em U.E.(1U = 1 µmol liberado de ρ-nitrofenol).Para o ensaio foi utilizada a mistura dereação contendo 900 µL de emulsão e100 µL de amostra. A emulsão continha1 mL de substrato e 9 mL de soluçãoemulsionante, constituída de 2 g deTriton X-100, 0,5 g de goma arábica e450 mL de tampão Tris-HCl 50 mM pH8,0. Para o branco da amostra, foramutilizados 100 µL de amostra, 900 µL deemulsão, sendo a reação lida imediatamenteem espectrofotômetro. Os tubosde amostra foram incubados a 40ºC por trinta minutos. A leitura da atividadelipásica foi realizada em espectrofotômetro(λ 410 nm). Os ensaioscom as amostras foram realizados emquintuplicata, utilizando-se um brancopara cada amostra (Beisson et al.,2000).A análise estatística foi realizadautilizando-se análise de variância comum alfa de 0,05. Para se verificar quaisos detergentes que diferiam, foi utilizadoo teste de Tukey (Berquó, 1981).Resultados e discussãoTrês detergentes enzimáticos comercializadosno Brasil foram utilizadospara os experimentos. Após aanálise enzimática, em relação a suaatividade proteásica, para o produto“A” foi encontrado um valor médio de20,99+0,36 U.E.mL -1 .h -1 ; no produto“B” foi determinada uma atividadeenzimática média de 26,52+0,28U.E..mL -1 .h -1 ; no produto “C”, 25,5+0,21U.E.mL -1 .h -1 ; conforme pode ser verificadona Figura 1. Foi constatada umaBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 59

diferença estatisticamente significativaentre os detergentes, através daanálise de variância, utilizando-se α de0,05. Através do teste de Tukey, encontramosdiferença estatisticamentesignificativa no produto “A”comparadocom os outros dois. Entre o produto “B”e “C”não houve diferença estatisticamentesignificativa. O ensaio utilizadopara a determinação da atividade amilolíticaapresentou diferença estatisticamentesignificativa entre os três detergentestestados. No produto “A” foiencontrado um valor médio de1,187+0,057 U.I.mL -1 .h -1 e de1,487+0,047 U.I.mL -1 .h -1 ; e de1,997+0,031 U.I.mL -1 .h -1 para os produtos“B” e “C”, conforme pode serobservado na Figura 2. Através doteste de Tukey, pôde-se verificar queas três formulações apresentaram concentraçõesestatisticamente diferentesentre elas. O ensaio utilizado para adeterminação da atividade lipásicaapresentou diferença estatisticamentesignificativa entre os detergentes testados.No produto “A” foi encontradoum valor médio de 0,0573+0,0024U.I.mL -1 .h -1 ; e de 0,384+0,012 U.I.mL -1.h -1 e 0,663+0,0115 U.I.mL -1 .h -1 paraos produtos “B” e “C”, conforme podeser observado na Figura 3. Através doteste de Tukey, pôde-se verificar queas três formulações apresentaram concentraçõesestatisticamente diferentesentre elas para um α de 0,05.Os resultados obtidos nesse trabalhoexplicitam a necessidade de umareformulação nos rótulos dos detergentesenzimáticos no que diz respeitoà quantidade de enzimas presentesna sua formulação. O fato de os detergentes“A”, “B” e “C” apresentarem emseus rótulos percentagens que variamde 15% a 0,25% na constituição dasformulações, isto não resulta em umaatividade enzimática proporcional, oque, na prática, vale dizer que apresentamuma variação no rendimento.Após esses ensaios, podemos verificarque as enzimas utilizadas como princípiosativos dos detergentes enzimáticos,por serem moléculas biológicas deorigem protéica, estão sujeitas a variaçõesdevido a vários fatores. Dessaforma, poderemos encontrar três detergentesenzimáticos que contenhamem sua rotulagem o mesmo percentualde uma determinada enzima e amesma apresentar diferentes atividadesenzimáticas, como foi observadocom relação à protease na formulação“A” e ”C”. Já a formulação “A” apresentaem sua rotulagem uma concentraçãodez vezes superior às primeiras.Nessa formulação, consta uma concentraçãode 15%. Isso significa a presençade 150 g de protease por litro dedetergente, fato este biologicamenteimprovável, pois não estaria totalmentesolúvel. Para as outras duas enzimastambém encontramos concentraçõessemelhantes com atividades diferentes.Concluímos, portanto, que a quantificaçãodos princípios ativos enzimáticosem formulações de detergentesdeve ser expressa em atividade enzimática,conforme determinação da“ENZYME COMMISSION”. Falta emnosso país uma regulamentação específicapara a padronização da rotulagemdos detergentes enzimáticos. Assimque essa regulamentação estiverem prática, uma comparação real eprecisa dos diferentes produtos serápossibilitada aos consumidores.AgradecimentosCAPES, CNPq e FAPERGS pelo apoiofinanceiro.Referências bibliográficasANVISA. http://www.anvisa.gov. br.Pesquisa realizada em março de2001.BERQUÓ, E.S.; SOUZA, J.M.P.; GOTLI-EB, S.L.D. Bioestatística. São Paulo:EPU, 1981. 350p.BON, E.P.S. A tecnologia enzimática noBrasil. 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Novel uses forfungi in biotechnology. Chem Ind,15:31-34, 1990.60 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002

ANÚNCIO NOVOENVIADO POR SEDEX DE BELOHORIZONTE AOS CUIDADOS DEJOÃO ALBERTO.(Agência Polo Comunicação)Qualquer dúvida ou problema, favor telefonar(34) 3217-2244 - Henrique - Agência Iris.Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 61

Dupla de microorganismos pode livrar rios e córregos de metais pesadosDentro de algum tempo, uma duplade microorganismos poderá facilitara descontaminação de rios, lagos eribeirões brasileiros que “adoecem” porcausa da poluição. Trata-se de um “casal”,que cresce junto numa relaçãosimbiótica (um organismo depende dooutro para viver), e é capaz de separarmetais pesados como, por exemplo,mercúrio, ouro e chumbo, da água,livrando os rios de contaminação causadapor resíduos industriais, ação degarimpeiros e até esgoto doméstico.Apesar da pesquisa se desenvolverhá dois anos, ainda não foi possívelseparar os microorganismos. A biólogae coordenadora do Setor de Biotecnologiada Fundação Centro Tecnológicode Minas Gerais (Cetec), Patrícia Pimentel,diz que, até o momento, sabeseque se trata de uma levedura e umabactéria, mas elas ainda não foramidentificas. “É um desafio separá-las,pois elas estão sempre unidas. O próximopasso é identificá-las por meio dabiologia molecular. Todavia, não temosestimativa de quando isso ocorrerá”,explica a bióloga.Por ser um processo lento e dependentede muito investimento, osresultados obtidos até agora são empequena escala. Segundo Patrícia Pimentel,ainda não foi possível realizaruma pesquisa mais abrangente, porquesão necessários mais investimentos.Mas, a intenção é garantir a reproduçãodo “casal” em escala industrial,para utilizá-lo em mananciais contaminadospor metais pesados.Se a reprodução em grande escalafor possível e as pesquisas seguirem orumo esperado, os microorganismospoderão ser utilizados na indústria paradescontaminar esgotos e reservatóriosantes do despejo nos rios, córregos elagoas. Outra possibilidade é permitir autilização comercial dos metais queestão na água sob forma líquida. Adupla é capaz de alterar o estado físicodos minerais, transformando-os em sólidos.Nos testes, a dupla de microorganismosé colocada em contato com asolução de metais pesados ocorrendo aimediata precipitação. Com o pH dasolução variando de um a sete, hámetais que chega a 99,9% de separação.Patricia diz pela falta de confirmaçãodos resultados, prefere não citar aindaos metais pesados que chegaram a serseparados em quase 100% da solução.O experimento foi realizado nocórrego Rico, em Paracatu, Minas Gerais,e está em estudo no Cetec e naUniversidade Católica de Brasília (UCB).O estudo também é acompanhadopelo especialista em prospecção doCentro de Gestão e Estudos Estratégicos(CGEE), Alfred Leroy Trujillo. Apesquisa tem recursos dos ministériosde Ciência e Tecnologia (MCT), doMeio Ambiente (MMA) e de Minas eEnergia (MME), e do Conselho Nacionalde Desenvolvimento Científico eTecnológico (CNPq). Até hoje, foraminvestidos R$ 410 mil. “É muito pouco.Mas o pesquisador brasileiro está acostumadoa trabalhar muito com poucodinheiro”, lamenta a bióloga. (Gabrielado Vale)Agência BrasilInstituto Agronômico cria uma bananeira que dispensa pulverizaçãoUma nova variedade de banana dotipo nanica criada pelo Instituto Agronômico(IAC), da Agência Paulista deTecnologia dos Agronegócios, da Secretariade Agricultura e Abastecimentode São Paulo, é resistente às sigatokasamarela e negra, doenças queanulam a produção das bananeiras eatacam todos os tipos dessa planta. ANanicão IAC 2001 — que dispensatotalmente a pulverização — será lançadaem breve e já está registrada emnome do IAC junto ao Ministério daAgricultura, Pecuária e Abastecimento.Há 40 anos presente no Brasil, asigatoka amarela seca as folhas da bananeirae acaba com a produção. Asigatoka negra provoca a mesma conseqüênciaque a amarela, porém com62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002velocidade três vezes maior que esta.A sigatoka negra chegou no Paísem 1998 e já está na Amazônia. Atendência é que essa doença se alastrepor todas as regiões tropicais úmidasdo Brasil, país em que a banana é, emtonelagem, a fruta mais consumida.Devido ao fato de ser um grandeconsumidor desse produto, menos de1% (um por cento) da produção nacionalé exportada.Com a característica de dispensartotalmente a pulverização, a NanicãoIAC 2001 tem sua importância destacadaquando se observa as duas sigatokas.A amarela é controlada comuma pulverização por mês. Já a negrarequer três pulverizações mensais, ouseja, quase uma por semana. Em termosde custo, a sigatoka amarela custahoje para o produtor paulista R$ 500,00(quinhentos reais) por hectare, porcada pulverização. Daí é possível calculara redução de custo que essavariedade irá propiciar ao agricultor. Asigatoka negra, que já está disseminadapor toda a América Central, somenteé controlada com quarenta ou maispulverizações por ano, a um custo trêsvezes maior do que se gasta nos bananaisde São Paulo.A ausência de pulverização viabilizadapela Nanicão IAC 2001 resultaráem bananas com menos agrotóxicospara o consumidor. Além dessa qualidade,a nova banana tem a mesmautilização do Nanicão comum, porémé três vezes mais rica em vitamina C e

mais digestiva.Para o mercado, a nova variedade sedestacará por ser mais grossa, porque,livre da doença, tem condições de sedesenvolver plenamente. Outro benefícioé que a Nanicão IAC 2001, após aclimatização, conserva-se por mais tempoem condições de ser consumida, ouseja, dura mais nas prateleiras dos supermercadose na casa do consumidor.Essa novidade irá estimular a cadeiaprodutiva da banana, com redução decustos de produção, maior tranqüilidadepara o produtor — que não irá temer aperda da plantação —, e fruta commenos agrotóxicos para o consumidor.A Nanicão IAC 2001 é também imunea outra importante doença da bananeira,chamada Mal do Panamá, que nãotem cura.Segundo o pesquisador Raul Moreira,há alguns híbridos gerados em Hondurasque são resistentes às sigatokas,porém o valor desses não tem sido bom, omesmo que ocorre com outro híbrido existenteno mercado.PESQUISACom o objetivo de obter uma variedaderesistente às sigatokas amarela e negra, apesquisa sobre a nova variedade de bananateve início em 1995 e foi concluída este ano.A Nanicão IAC 2001 já está testada em SãoPaulo há 5 anos e em Manaus, há 2 anos.Em São Paulo, o resultado dessa pesquisadeverá beneficiar principalmente o Vale doRibeira, maior região produtora de banana doEstado. Em razão de a sigatoka amarela serintensa nas regiões secas e irrigáveis, o nortede Minas Gerais também tem se desenvolvidocomo centro de produção de banana, e,portanto, também poderá ser beneficiadocom a pesquisa do IAC.Nome da variedade: Nanicão IAC 2001Carla Gomes – IAC – ImprensaEmail: midiaiac@iac.brTelefone: 19 3231 5422 R.124/191Células-tronco podem recompor medula espinhal lesadaUma técnica desenvolvida peloInstituto de Ortopedia e Traumatologia(IOT) da Faculdade de Medicina(FM) da USP aponta uma possívelcura para lesões na medula espinhal.As lesões, cuja principal causa é atraumática, têm como conseqüênciapossível a paraplegia - mal que aindanão apresenta cura.A medula espinhal é responsávelpela transmissão de impulsos nervososentre o cérebro e os órgãos docorpo humano, permitindo a mobilidadee a sensibilidade. Suas células,diferentemente do que ocorre emoutros tecidos, não apresentam, porvários motivos, a capacidade de regeneração.Com isso, a medula podenão recuperar suas funções após umalesão, ocasionando a perda dos movimentose da sensibilidade.O projeto de pesquisa proposto,coordenado pelo Professor TarcisioEloy Pessoa de Barros Filho e pelaDra. Erika Barros, consiste na utilizaçãode células-tronco para repor ascélulas da medula lesada. As célulastronco,oriundas da medula óssea,estão presentes no indivíduo adulto emantêm a capacidade de se diferenciarem outros tipos de células senecessário. Do paciente incluído noprojeto serão mobilizadas e extraídasestas células que, após concentradas,serão reinjetadas no local da lesão.Espera-se que as células-tronco sediferenciem e recomponham a medulaespinhal, reestabelecendo suafunção.O uso de células-tronco no tratamentoda lesão medular é inédito.Em outros centros, os preparadosdestas células estão sendo testadospara o tratamento de males comolesões cardíacas, infartos e a doençade Alzheimer. Além de ser uma técnicainédita, ela tem outro fator dedestaque. “Como usaremos célulasde uma mesma pessoa, não se corre orisco de haver rejeição”, afirma Erika.Outro elemento que favorece o andamentoda pesquisa é o sucesso emexperiências semelhantes realizadasem animais, nos quais as células-troncocumpriram a função que era esperada.Apesar destes fatores, a doutoraErika adverte que não se pode criarfalsas expectativas. “A pesquisa estáapenas em sua fase inicial, e serãonecessários anos para saber se estamosno caminho certo”, comenta. Segundoa médica, o prazo mínimo para a observaçãode resultados positivos da técnicaé de cinco anos.Atualmente, o IOT selecionou 30pacientes para serem incluídos no grupode estudo. Sete destes já tiveram opreparado de células-tronco extraídodo organismo, aguardando agora o processoda “reinjeção”.Agência USP de NotíciasOlavo Soareswww.highveld.com/protocols.html Molecular Biology Protocol apresenta links para métodos, procedimentos,estratégias e técnicas de bioquímica, biologia celular e molecular.rebase.neb.com O Banco de Dados de Enzimas de Restrição - REBASE é uma coleção de informação sobre as enzimasde restrição e proteínas relacionadas. Contém sítios de reconhecimento e clivagem, isoesquisômeros, disponibilidadecomercial, sensibilidade à metilação e ainda dados da seqüência e cristalografia.Dica fora! Na sua última edição BioDicas indicou Protocol Online (www.protocol-online.net), no entanto tal página saiudo ar sem apresentar explicações, www.methodbook.net pode ajudar quem procura por protocolos.BioDicas é uma colaboração de Marcio O. Lásaro - marciolasaro@hotmail.comBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 26- maio/junho 2002 63

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