Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

Exercício 9. Tecnologia do DNA recombinante

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

1. A figura na página seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo

método de Sanger. Escreva a seqüência deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima.

Traduza a seqüência obtida, considerando as três fases de leitura. O que aconteceria se durante a leitura

do gel você tivesse omitido uma base? Como você faria para ter segurança absoluta da seqüência deste

fragmento de DNA?

2. O que a diferencia a técnica de Southern blot da técnica de Northern blot?

3. Você gostaria de analisar os níveis de expressão do gene que codifica a proteína A de um fungo em

resposta ao estresse hipertérmico. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado, se você quiser

analisar simultaneamente os níveis de expressão de milhares de genes deste fungo na mesma condição,

qual seria a metodologia mais adequada?

4. Qual a diferença entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a

presença de íntrons em genes eucarióticos complica a geração de produtos protéicos que eles codificam

quando a expressão é feita em bactéria. Como se pode resolver este problema?

5. A partir de uma biblioteca de cDNA você isolou um cDNA completo que codifica para uma proteína

que é um potente estimulador do sistema imunológico. Agora você deseja clonar este cDNA em um

vetor de expressão para produzir grande quantidade desta proteína em E. coli. O cDNA possui nas

suas extremidades sítios para enzima BamHI e você planeja cloná-lo no sítio de BamHI do vetor de

expressão. Esta é sua primeira vez com experimentos de clonagem e você decide seguir

cuidadosamente as instruções do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser

tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5’.

a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina?

b) Como você analisaria se a clonagem foi bem sucedida?

c) A proteína de seu interesse afeta o crescimento das bactérias. Como você faria para obter grande

quantidade desta proteína recombinante?

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