Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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Biologia Molecular – QBQ3401 Química-Noturno 2009

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QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

Tampão de digestão 10X Tampão da amostra

Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8,

NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8,

MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v

DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v

*(depende da enzima) sacarose 40% p/v

B. Fracionamento do DNA em gel de agarose.

Preparo do gel de agarose 1,0%

OBS: Serão montados dois géis com espaço para aplicação de até 14 amostras

1. Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH 8).

2. Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose. Enquanto espera-se a

dissolução da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar até 40°C (até conseguir segurar com as

mãos) e acrescentar 5µL de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE

ETÍDIO É CARCINOGÊNICO!

Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente. Deixar

solidificar por pelo menos 30min.

3. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel

com menor volume possível.

4. Aplicar as amostras preparadas na experiência anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar

aproximadamente 100V. Cuidado para não tocar o tampão.

5. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel.

6. Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando óculos

protetores. Fotografar o padrão de bandas observado com uma régua posicionada na lateral do gel.

OBS: Ordem de aplicação das amostras nos géis

GEL 1: 1 - 2 - 3 - 4 -5 6 - Padrão de tamanho - 7 - 8 - 9 10 11- 12

GEL 2: 13 - 14 -15 16 17 18 - Padrão de tamanho - 19 20 21 22 23 24

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