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Ivana DantasDisc.: Interação Droga-ReceptorProf. PedroIntrodução Inflamação das vias aéreas x hiperreatividade dasvias aéreas durante a asma brônquica Pacientes asmáticos em condições basais níveisnormais de endotelina-1 (ET-1) nos brônquios(Chalmers et al., 1997a) TNF e IL-8 produção de ET-1 por célulasepiteliais das vias aéreas em cultura (Yang et al.,1997) Níveis de ET-1 estão elevados no fluido brônquicotraqueale no plasma durante os ataques asmáticos Sefadex produz uma inflamação eosinofílica das viasaéreas síntese do mRNA de ET-1 níveisde ET-1 no fluido brônquico-alveolar ET-1 é produzida por células epiteliais brônquicas emacrófagos, e células epiteliais brônquicas depacientes asmáticos mostram aumento da expressãode ET-11


ObjetivoExaminar a hipótese de que receptores deendotelina-1 são superexpressos nomúsculo liso das vias aéreas na faseinicial da asma brônquicaMateriais e MétodosAnimaisQuantificação de mRNARatos adultos machosSprague-Da wleyAnestesiaenfluranoSefadex 5mg/ml/KgControle: salinaConfirmação macroscópica da inflamaçãoinduzida por sefadex Isolamento de RNA total e transcrição reversa:- As células musculares lisas da traquéia e brônquios foram isoladase homogeneizadas com reagente de TRIzol para extração domRNA total- O processo de transcrição reversa (RNA cDNA) foi realizadoutilizando o kit Gene Amp RT (PE Applied Biosystems, USA)Estudos de miografiae RT-PCRQuantificação da expressão do mRNA dosreceptores de ET-1 tipo A e B (ET Ae ET B) O RT-PCR foi realizado para avaliar a expressão do mRNA dosreceptores ET A e ET B :- Curvas de dissociação foram feitas após RT-PCR e amplificaçãonão-específica foi detectada no presente estudo- Os produtos do PCR de ET A (64bp), ET B (86bp) e EF-1 (96bp)foram visualizados em gel de agarose por eletroforeseEstudos funcionais Segmentos circulares foram cortados da traquéia e brônquios Foi retirado o epitélio de cada segmento Dois grupos de segmentos foram divididos e um deles eraconectado a um transdutor do deslocamento da força unido a umcomputador para a contínua mensuração da tensão isomérica e ooutro grupo a um dispositivo do deslocamento Os segmentos foram imersos numa solução tampão de bicarbonato(37ºC, 5% CO2, pH 7,4) Inicialmente, os segmentos traqueais e brônquicos foram expostospor 60min a uma tensão de 2nN e 1nN, respectivamente2


Análises dos dados A habilidade de contração de cada segmento foi examinada atravésda exposição a uma solução rica em potássio (60mM), a qual causaefeito máximo Quando a contração máxima era obtida em 1min, os segmentoseram lavados com solução tampão Apenas após 2 contrações fortes (>1mN), os segmentos eramutilizados para outros experimentos A contração induzida pela solução de potássio foi utilizada comocontratilidade de referência e o máximo foi definido como 100% ET-1 e sarafotoxina 6c foram adicionadas para se alcançar curvascumulativas de concentração-resposta Após a inflamação eosinofílica ter sido estabilizada (24h),os efeitosna contratilidade de ET-1 e sarafotoxina 6c foram estudados natraquéia e brônquios A resposta na contratilidade dos segmentos é expressacomo percentagem da contração induzida por 60mM deK + Valores E máx referem-se à máxima contratilidadeinduzida por um agonista Valores pEC 50 são o logaritmo negativo da concentraçãomolar que causa 50% da contração máxima Teste não-pareado foi utilizado para os estudosmoleculares e twoway ANOVA com Bonferroni post-testfoi utilizado para os estudos funcionais para comparargrupo controle e grupo sefadex Significância estatística pBrônquios3


Contração máxima induzida por Ach 10 -3 nM O presente estudo mostrou que a inflamação induzida por sefadexpor 24h causa a superexpresão do mRNA de ET B e up-regulationdas respostas funcionais ao agonista seletivo sarafotoxina 6c emcélulas musculares lisas de brônquiosDiscussão Foi demonstrado pela primeira vez que na inflamação das viasaéreas induzida por sefadex há superexpressão do mRNA doreceptor ET B nas células musculares lisas de brônquios, semaumento significativo da expressão do receptor ET A A instilação na traquéia de sefadex consiste em um métodobastante conhecido para se estudar inflamação das vias aéreas Sabe-se que durante este processo, a concentração de ET-1 podeaumentar até 30x e que esta pode contribuir para a hiperreatividadedas vias aéreasConclusão No presente estudo, os resultados moleculares corroboram com osestudos funcionais de contratilidade, já que houve superexpressãode ET B nas células musculares lisas de brônquios com aumento dacontratilidade brônquica, mas não traqueal, causada por ET-1 esarafotoxina 6c após sefadex Então, as respostas aumentadas a sarafotoxina 6c e ET-1 nostecidos brônquicos pode ser explicada pela superexpressão dereceptores ET B nesses tecidos Durante o processo de inflamação eosinofílica o nível aumentadode ET-1 provavelmente causa maior consumo dos receptores ETB,no entanto, os mecanismos de up-regulation desses receptores sãomelhores estudados para músculo liso de vasos sanguíneos Acredita-se eles envolvam síntese de novo via proteínaquinase C eproteínaquinases ativadas por mitógeno, via citocinas Durante a inflamação das vias aéreas induzida porsefadex, há aumento significativo da expressão domRNA de receptores de endotelina-1 do tipo ET B nascélulas musculares lisas das vias aéreas4


Obrigada!5

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