Laranja TRANSGÊNICA - Biotecnologia

PesquisaLaranjaTRANSGÊNICATransformação de laranja visando resistência ao cancro cítrico usando genes de peptídeos antibacterianosBrasil é o maior produtormundial de laranja,com 355 milhões de caixasproduzidas em 2000/01, o que corresponde acerca de 30 % da produção mundial.Além disso, o país é responsável por,aproximadamente, metade da produçãomundial de suco concentrado (61 oBrix), um dos principais produtos agrícolasexportados pelo Brasil. O volumede recursos movimentados peloagronegócio citrícola supera R$ 5 bilhõespor ano, gerando cerca de 400mil empregos diretos, somente no estadode São Paulo, o maior produtor doBrasil.A citricultura nacional apresentavários problemas fitossanitários, entreos quais se destacam a larva minadorados citros (Phyllocnistis citrella), a pintapreta (doença fúngica provocadapor Guignardia citricarpa), a clorosevariegada dos citros (CVC, causadapela bactéria Xyllela fastidiosa) e ocancro cítrico (causada pela bactériaXanthomonas axonopodis pv. citri).Cancro cítricoO cancro cítrico tem provocadograndes prejuízos tanto no Brasil comoem outros países produtores de citros.Essa doença afeta toda a parte aérea daplanta, causando lesões em frutos, folhase ramos (Figura 1). Os frutos ficamdepreciados e caem precocemente, reduzindoa produção da planta. Asportas de entrada para a bactéria docancro são ferimentos em folhas causadospelo vento ou pelo ataque da larvaminadora dos citros.O controle do cancro cítrico temsido realizado através de medidas paraprevenir a introdução da bactéria e daerradicação das plantas contaminadas.Para isso, são realizadas por agênciasfiscalizadoras, inspeções periódicas empomares comerciais e domésticos. Asplantas cítricas contaminadas, bemJoão Carlos Bespalhok FilhoIAPAR, Laboratório de Biotecnologia,bespa@hotmail.comAdilson Kenji KobayashiIAPAR, Laboratório de Biotecnologia,adilson@sercomtel.com.brLuiz Filipe Protásio PereiraIAPAR, Laboratório de Biotecnologia,lpereira@pr.gov.brLuiz Gonzaga Esteves VieiraIAPAR, Laboratório de Biotecnologia,lvieira@pr.gov.brFotos cedidas pelos autoresFigura 1. Frutos de laranja apresentando sintomas de cancrocítrico (Foto gentilmente cedida pelo Dr. Rui Pereira Leite)62 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001

Figura 2. Expressão do gene marcador gus em plantastransgênicas de laranja Pêracomo as não contaminadas, num raiode 30 metros, são cortadas e incineradas.Somente no ano de 1999, foramgastos cerca de R$ 33 milhões naerradicação de pomares infectados nosEstados de São Paulo e Minas Gerais.Entretanto, a presença e o progressoepidêmico do cancro cítrico emdiversas regiões produtoras de citrosao redor do mundo, e a sua recenteintrodução e reintrodução em váriospaíses têm levantado dúvidas quanto àeficiência da adoção exclusiva de medidaspara impedir a sua introduçãoem novas áreas e para a erradicaçãocompleta da doença em regiões ondeela foi introduzida (Leite, 1990).O desenvolvimento de variedadescítricas agronomicamente aceitáveiscom adequado nível de resistência, éainda a forma mais econômica e eficientede controlar o cancro cítrico.Entretanto, o melhoramento de citros éum processo longo, principalmentepelos aspectos botânicos desse gênero.Grande parte das espécies apresentapoliembrionia e longo período juvenil,o que dificulta a seleção de genótipospor hibridação. A obtenção deuma nova variedade é um processoque leva em média 30 anos. Os principaisavanços têm sido obtidos pelaseleção de mutações naturais.Frente a esses problemas, a transformaçãogenética da laranjeira mostra-secomo uma estratégia de melhoramentomuito promissora, podendoser utilizada para a introdução de novascaracterísticas em variedades elite,reduzindo o tempo necessário para olançamento de novos cultivares.Transformação genética de citrosPlantas transgênicas de citros jáforam obtidas por meio da introduçãodireta de DNA em protoplastos (Vardiet al., 1990); por co-cultivo de segmentosinternodais ou de epicótilo comAgrobacterium (Moore et al., 1992;Kaneyoshi et al., 1994; Peña et al.,1995; Gutiérrez et al., 1997; Cervera etal., 1998), e por bombardeamento departículas em suspensões embriogênicasde nucelo (Yao et al., 1996). Atualmente,o método mais utilizado detransformação genética em citros é atransformação mediada por Agrobacterium,utilizando-se segmentos deepicótilo de 1 cm como explantes.Usando esse sistema, já foram obtidasplantas transgênicas de laranja doce(C. sinensis;) (Peña et al., 1995; Bond &Roose, 1998), C. aurantifolia (Peña etal., 1997), C. aurantium (Gutiérrez etal., 1997), Carrizo citrange (C. sinensisX Poncirus trifoliata; Moore et al.,1992), P. trifoliata (Kaneyoshi et al.,1994) e grapefruit (C. paradisi; Luth &Moore, 1999.Figura 3. Construção usada nos experimentos de transformaçãoEntretanto, a eficiência de transformaçãoutilizando esse protocolo deregeneração ainda é baixa. Isso sedeve, principalmente, ao pequenonúmero de brotos obtidos por explantee ao grande número de escapes.Além disso, as plantas transgênicasobtidas por esse sistema são juvenis,sendo necessário vários anos para quese possa avaliar algumas de suas característicascomerciais (produtividade,qualidade de fruto etc). Com vistas acontornar esse problema, Cervera et al.(1998) utilizaram internódios de plantasmaduras de laranja doce cultivarPineapple como explantes para transformação,conseguindo que as plantastransgênicas florescessem após 14meses.A falta de técnicas adequadas decultura de tecidos de cultivares delaranja doce adaptados às nossas condiçõesagroecológicas tem dificultadoo uso da tecnologia de transformaçãode plantas nessa cultura. Visando aminimizar esse problema, o Laboratóriode Biotecnologia Vegetal do IAPARdesenvolveu novos protocolos de regeneraçãode laranja doce Pêra, usandosegmentos finos transversais tantode tecidos juvenis (Bespalhok et al.,2001) quanto de maduros (Kobayashiet al., 2001). Esses novos protocolospermitem a transformação de laranja,tanto através de Agrobacterium tumefacienscomo também via biobalística.Essa metodologia foi utilizada em experimentospreliminares para a otimizaçãodo sistema de transformação,utilizando o plasmídeo pBE2113, quecontém o gene gus sob controle depromotores constitutivos (Figura 2).Uso de peptídeos antibacterianosVárias estratégias têm sido utilizadaspara aumentar a resistência deplantas a doenças bacterianas atravésda engenharia genética. Entre essasestratégias destacam-se: a produção depeptídeos antibacterianos, a inibiçãode fatores de virulência e o aumentodas defesas naturais e morte celularprogramada no local da infecção (Mourgueset al., 1998).Todos os organismos superiorespossuem sistemas de proteção contrainfecções por microorganismos. Os insetospossuem um eficiente sistema dedefesa contra bactérias e outros parasitas.Esse sistema, que foi bastante estu-Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001 63

dado em Hyalophora cecropia, é responsávelpela produção de peptídeoscom potente atividade antitibacteriana,tais como as cecropinas.Cecropinas pertencem a uma famíliade pequenos peptídeos, isolados dahemolinfa de insetos, que exibem atividadelítica e antibactericida contramuitas bactérias gram-positivas e gramnegativas(Boman & Hultmark, 1987).Estruturalmente, esses peptídeos têmuma região N-terminal bastante básicae uma longa seqüência hidrofóbica naregião C-terminal. Essas característicassão necessárias para a ação antibacterianadas cecropinas através da formaçãode canais nas membranas, provocandoo vazamento de componentescelulares e, conseqüentemente, a morteda bactéria (Christensen et al., 1988).Vários trabalhos de transformaçãode espécies vegetais com peptídeosantibacterianos foram publicados nosúltimos anos. Batata e fumo foram asespécies mais utilizadas, principalmentepela facilidade de cultura de tecidos ea importância das bacterioses. Montanelli& Nascari (1991) transformarambatata com um gene responsável pelaprodução de cecropina e encontraramresultados positivos contra Ralstoniasolanacearum em testes preliminaresin vitro com extratos de plantas transgênicas.Jaynes et al. (1993), utilizandoo gene Shiva-1 (um análogo sintéticoda cecropina), controlado pelo promotordo inibidor de proteinase II debatata, obtiveram alta expressão emplantas transgênicas de fumo que mostraramum aumento de resistência a R.solanacearum. Por outro lado, Floracket al. (1995) transformaram fumo comgenes de cecropina B, mas não conseguiramaumentar a resistência dessaespécie contra R. solanacearum e P.syringae pv. tabaci. A rápida degradaçãoda cecropina por proteases endógenasfoi apontada como responsávelpela baixa detecção do peptídeo nasplantas transgênicas, apesar da corretatranscrição do gene inserido. Também,Hightower et al. (1994) não conseguiramaumentar a resistência de plantasde fumo a P. syringae pv. tabaci coma introdução de um gene quimérico dececropina A/B.Além das cecropinas, outros tiposde peptídeos têm sido utilizados emplantas com vistas a controlar doençasbacterianas. Norelli et al. (1994) observaramque plantas transgênicas de maçaFigure 4. Análise de PCR de plantas transgênicas de laranja Pêra. ODNA foi isolado de folhas e amplificado com primers específicospara o gene da sarcotoxina dando um produto de 268 pb. ColunaM, marcador 100 pb; coluna C, controle negativo, laranja Pêra nãotransformada; colunas 1-10, plantas transgênicas; coluna P, plasmídeopST10expressando o gene da atacina E mostrarammaior resistência a Erwiniaamylovora. Plantas transgênicas debatatas com resistência a Erwiniaamylovora foram obtidas por Düring etal. (1993) através da inserção do geneda lisozima do bacteriófago T4.Os resultados até agora relatadosna literatura indicam que a transformaçãocom peptídeos antibacterianos temgrande potencial para ser usada nomelhoramento vegetal, principalmenteatravés do uso de construções gênicascapazes de expressar esses peptídeosextracelularmente e, também, pelamodificação desses peptídeos visandoa conseguir a sua maior estabilidadefrente à degradação por proteases endógenas.SarcotoxinaA sarcotoxina é um peptídeo antibacterianoisolado de larvas de Sarcophagaperegrina pelo grupo do Dr.Natori, Universidade de Tókio (Japão).Figura 5. Processo de obtenção de plantas transgênicas de laranja Pêra apartir de tecido maduro64 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001

Esse peptídeo possui 39 aminoácidos epertence ao grupo das cecropinas. Emestudos in vitro, a sarcotoxina mostrou-sealtamente eficiente na inibiçãodo crescimento de algumas bactériascausadoras de doenças em plantas,especialmente para X. axonopodis pv.citri (Ohshima et al., 1999).A expressão da sarcotoxina em plantasde tabaco sob controle de umpromotor constitutivo aumentou a resistênciaa duas bactérias fitopatogênicas:P. syringae pv. tabaci e E. carotovorasubsp. carotovora (Ohshima etal., 1999). Também, plantas de tabacotransformadas com o gene da sarcotoxinasob o controle de um promotorinduzido por ácido salicílico (PR1a)apresentaram um aumento na resistênciatanto a bactérias fitopatogênicascomo a fungos Rhizoctonia solani ePythium aphanidermatum (Mitsuharaet al., 2000).Apesar de ainda serem necessáriosmais estudos sobre a segurança alimentarda sarcotoxina, resultados recentesmostram que a sarcotoxina tempouca ação sobre microrganismos benéficosque fazem parte da flora intestinalhumana (Mitsuhara et al., 2001).Transformação de citroscom o gene da sarcotoxinaFigura 6. Plantas inoculadas com isolado de X. axonopodis pv. citri (10 4cfu/ml) após 26 dias. Planta não transgênica utilizada como controle (esquerda)e planta transgênica expressando sarcotoxina (direita)A obtenção de plantas transgênicasde laranja doce de cultivares plantadosno Brasil com o gene da sarcotoxina éuma estratégia muito promissora paraaumentar a tolerância à bactéria docancro cítrico. Assim, foram realizadostrabalhos de transformação de plantasde laranja com o gene da sarcotoxinano Labotatório de Biotecnologia Vegetaldo IAPAR. O plasmídeo utilizadopara transformação (pST10) contém ogene da sarcotoxina (stx IA) ligado aum peptídeo sinal que tem a função deexportar o peptídeo para o espaçointercelular sob controle do promotorconstitutivo 35S, do vírus do mosaicoda couve-flor e o gene da neomicinafosfotransferase (npt II), que confereresistência ao antibiótico canamicina(Figura 3). Esse plasmídeo foi cedidoao IAPAR através de um convêniocientífico com o Instituto Nacional deRecursos Agrobiológicos (NIAR, Japão).A metodologia de transformaçãode laranja usou a estirpe EHA-105 deAgrobacterium tumefaciens como vetorpara inserção do gene da sarcotoxina.Um aspecto inovador da metodologiaé a utilização de segmentos finos dematerial vegetal maduro para a transformação,o que reduz em, pelo menos,cinco anos o início de produção eavaliação das plantas transgênicas. Emexperimentos preliminares, plantas delaranja Pêra regeneradas a partir detecido maduro floresceram após 12meses em casa de vegetação.Internódios de mudas de laranjaPêra mantidas em casa de vegetaçãoforam utilizados como explantes iniciais.Esses internódios foram desinfestados,cortados transversalmente em segmentosde 1-2 mm e imersos em meiocontendo Agrobacterium. Os explantesforam então co-cultivados por 72horas e transferidos para meio de induçãode gemas com 200 mg/l cefotaxima,200 mg/l timetina e 25 mg/l canamicina.Após três semanas no escuro,os segmentos que apresentavam gemasforam transferidos para meio dealongamento ainda com a presença deantibióticos. Após 3-4 semanas no meiode alongamento, as gemas regeneradasmaiores que 1 mm foram microenxertadasem plântulas de Carrizo citrangegerminadas in vitro. Quando osenxertos apresentavam de 3 a 4 folhas,pequenos segmentos de tecido foliarforam utilizados para detecção da presençado gene da sarcotoxina atravésde PCR. Enxertos apresentando a bandacorrespondente ao gene da sarcotoxina(Figura 4) foram então transplantadosdiretamente em solo ounovamente enxertados em plantas delimão cravo em casa de vegetação(Figura 5).Foram obtidos diversos eventos delaranja Pêra transgênica contendo ogene da sarcotoxina. As plantas transgênicasforam clonadas através deenxertia em porta-enxertos de limãocravo para serem inoculadas com acepa 306 da bactéria de X. axonopodispv citri.A inoculação das plantas transgênicascom a bactéria do cancro cítricoé feita pelo método de infiltração emfolhas novas utilizando-se seringas hipodérmicas.A avaliação da resistênciaé feita após três semanas através dacontagem de lesões por área foliar edo re-isolamento da bactéria.A análise de Western blot em folhasmostrou que há uma variação naexpressão da sarcotoxina nos diferenteseventos. Os resultados da inoculaçãodas plantas transgênicas com abactéria do cancro cítrico mostraramque as plantas apresentando maioresquantidades de sarcotoxina foram maisBiotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001 65

esistentes ao cancro cítrico (Figura 6).Considerações finaisO projeto para o desenvolvimentoda laranja transgênica foi iniciado em1999 e tem sido financiado pelo CNPq,através do programa RHAE, e pelaFundação Araucária (Governo do Estadodo Paraná). Deverão ser feitos ainda,estudos necessários para se conhecero efeito da introdução do gene dasarcotoxina nas plantas, na segurançaalimentar e o seu impacto no ambiente,antes que essa tecnologia possa serutilizada de maneira mais ampla. Agrande eficiência do protocolo de transformaçãode laranja desenvolvido tornapossível a inserção de novos genesque podem contribuir para minimizaroutros problemas da citricultura, taiscomo o ataque de pragas e a resistênciaa estresses abióticos.Além do Instituto Agronômico doParaná, através do Laboratório de Biotecnologia,outras instituições brasileirasque atuam no desenvolvimento deplantas transgênicas de laranja são: oCentro de Citricultura do Instituto Agronômicode Campinas (IAC), em Cordeirópolis(SP), a Escola Superior deAgricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) eo Centro de Energia Nuclear (CENA),da USP, em Piracicaba (SP).Referências bibliográficasBespalhok F.; Kobayashi, A.K.; Pereira,L.F.P.; Hissano, Z. & Vieira, L.G.E.(2001) In vitro adventitious shootregeneration from sweet orange usingthin epicotyl sections. Crop BreedAppl Biotech 1:27-34.Boman, H.G. & Hultmark, D. (1987)Cell-free immunity in insects. AnnVer Microbiol 41:103-126.Bond, J.E. & Roose, M.L. (1998) Agrobacterium-mediatedtransformation ofthe commercially important citruscultivar Washington navel orange.Plant Cell Rep 18:229-234.Cervera, M.; Juarez, J.; Navarro, A.; Pina,J.A.; Duran-Vila, N.; Navarro, L. &Peña, L. (1998) Genetic transformationand regeneration of mature tissuesof woody fruit plants bypassingthe juvenile stage. Transgenic Res7:51-59.Christensen, B.; Fink, J.; Merrifield, R.B.& Mauzerall, D. (1988) Channel-formingproperties of cecropins andrelated model compounds incorporatedinto planar lipid membrane.Proc Nat Acad Sci USA 85:5072-5076.Düring, K.; Porsch, P.; Fladung, M &Lorz, H. (1993) Transgenic potatoplants resistant to the phytopathogenicbacterium Erwinia carotovora.The Plant J 3: 587-598.Florack, D.; Allefs, S.; Bollen, R.; Bosch,D.; Visser, B. & Stiekema, W. (1995)Expression of giant silkmoth cecropinB genes in tobacco. TransgenicRes 4: 132-141.Gutiérrez-E, M.A.; Luth, D. & Moore,G.A. (1997) Factors affecting Agrobacterium-mediatedtransformationin Citrus and production of sourorange (Citrus aurantium L.) plantsexpressing the coat protein gene ofcitrus tristeza virus. Plant Cell Rep 16:745-753.Hightower, R.; Baden, C.; Penzes, E. &Dunsmuir, P. (1994) The expressionof cecropin peptide in transgenictobacco does not confer resistance toPseudomonas syringae pv tabaci.Plant Cell Rep 13: 295-299.Jaynes, J.M.; Nagpala, P.; Destefano-Beltran, L.; Hong-Hung, J.; Kim, J.;Denny, T. & Cetiner, S. (1993) Expressionof a cecropin B lytic peptideanalogue in transgenic tobacco confersenhanced resistance to bacterialwilt caused by Pseudomonas solanacearum.Plant Sci 8:43-53.Kaneyoshi, J.; Kobayashi, S.; Nakamura,Y.; Shigemoto, N. & Doi, Y. (1994). Asimple and efficient gene transfersystem of trifoliate orange (Poncirustrifoliata Raf.). Plant Cell Rep 13:541-545.Kobayashi, A.K.; Bespalhok F., J.C.; Pereira,L.F.P.; Molinari, H.B.C.; Galvão,R.M & Vieira L.G. (2001) Agrobacterium-mediatedtransformationof sweet orange cv. Pêra (Citrussinensis L. OSBECK) with sarcotoxinantibacterial peptide gene. IV Latin-American Meeting on Plant Biotechnology,Goiânia, GO, p. 125-125.Leite, R.P. (1990) Cancro cítrico: prevençãoe controle no Paraná. Circular N o61, Fundação Instituto Agronômicodo Paraná, Londrina, Pr, 51p.Luth, D. & Moore, G. (1999) Transgenicgrapefruit plants obtained by Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation. Plant Cell Rep 57:219-222.Mitsuhara, I.; Matsufuru, H.; Ohshima,M.; Kaku, H.; Nakajima, Y.; Murai,N.; Natori, S. & Ohashi, Y. (2000)Induced expression of sarcotoxin IAenhanced host resistance against bothbacterial and fungal pathogens in transgenictobacco. Mol Plant Microbe In13:860-868.Mitsuhara, I.; Nakajima, Y.; Natori, S.; Mitsuoka,T. & Ohashi, Y. (2001) In vitrogrowth inhibition of human intestinalbacterial by sarcotoxin IA, an insectbactericidal peptide. Biotechnol Lett23:569-573.Montanelli, C. & Nascari, G. (1991) Introductionof an antibacterial gene inpotato (Solanum tuberosum L.) using abinary vector in Agrobacterium rhizogenes.J Genet Breed 45: 307-316.Moore, G.A.; Jacono, C.C.; Neidigh, J.L.;Lawrence, S.D. & Cline, K. (1992) Agrobacterium-mediatedtransformation ofCitrus stem segments and regenerationof transgenic plants. Plant Cell Rep11:238-242.Mourgues, F.; Brisset, M. & Chevreau, E.(1998) Strategies to improve plant resistanceto bacterial diseases through geneticengineering. Tibtech 16:203-210.Norelli, J.L.; Aldwinckle, H.S.; Destefano-Beltran, L. & Jaynes, J.M. (1994) Transgenic‘Malling 26’ apple expressing theattacin E gene has increased resistanceto Erwinia amylovora. Euphytica 77:123-128.Ohshima, M.; Mitsuhara, I.; Okamoto, M.;Sawano, S.; Nishiyama, K.; Kaku, H.;Natori, S. & Ohashi, Y. (1999) Enhancedresistance to bacterial diseases oftransgenic tobacco plants overexpressingsarcotoxin IA, a bactericidal peptideof insect. J Biochem 125: 431-435.Peña, L.; Cervera, M.; Juárez, J.; Navarro,A.; Pina, J.A. & Durán-Vila, N. (1995)Agrobacterium-mediated transformationof sweet orange and regeneration oftransgenic plants. Plant Cell Rep 14:616-619.Peña, L.; Cervera, M.; Juárez, J.; Navarro,A.; Pina, J.A. & Navarro, L. (1997)Genetic transformation of lime (Citrusaurantifolia Swing.): factors affectingtransformation and regeneration. PlantCell Rep 16:731-737.Vardi, A.; Bleichman, S. & Aviv, D. (1990)Genetic transformation of Citrus protoplastsand regeneration of transgenicplants. Plant Sci 69:199-206.Yao, J-L.; Wu, J-H.; Gleave, A.P. & Morris,B.A.M. (1996) Transformation of citrusembryogenic cells using particle bombardmentof transgenic embryos. PlantSci 113:175-183.66 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 23 - novembro/dezembro 2001