apostila de exercícios

QBQ-211 - 1996 - LABORATÓRIO IIICINÉTICA ENZIMÁTICAOBJETIVOEstudar as influências das concentrações de enzima e de substrato na velocidade deuma reação enzimática, examinar as curvas obtidas, obter alguns parâmetros cinéticos (K m eV max ) e discutir seus valores e importância.INFORMAÇÕES GERAISA enzima escolhida para este estudo é a invertase de levedura que catalisa a hidróliseda sacarose para produzir glicose e frutose.C 12 H 22 O 11 + H 2 O → C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6sacarose glicose frutoseA determinação da velocidade da reação (ou da atividade enzimática) pode ser feitaatravés da dosagem dos açúcares redutores formados (glicose e frutose). A dosagem baseiasena reação entre o ácido 3,5 dinitro-salicílico (DNS) e os açúcares redutores. Estesmonossacarídeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor característica, cujaformação pode ser acompanhada a 540 nm.Nestas experiências as velocidades da reação serão expressas em µmoles de sacarosehidrolisada por minuto.Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (µmoles) de açúcares redutoresformada, por um cálculo estequiométrico simples, pode-se determinar a quantidadecorrespondente (µmoles) de sacarose hidrolisada.Para estudos de velocidade, o tempo de reação deve ser medido com a maior exatidãopossível. Para isso, o grupo deverá organizar-se de maneira a não permitir que a reação seinicie em tempos diferentes nos vários tubos. Para tal, é importante manter os tubos em gelodurante a adição dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nosprotocolos, com a enzima sendo adicionada por último. Leva-se então os tubos, todos juntos,ao banho a 37 o C para reagir. Transcorrido o tempo determinado , os tubos devem voltartodos juntos, simultaneamente, para o gelo. Aí a reação pára.PROCEDIMENTO1) Curva PadrãoAtenção: A curva padrão será fornecida na forma de um xerox do gráfico A 540 versusµmoles de sacarose hidrolisada.A finalidade da curva padrão é relacionar valores de absorbância a 540 nm comµmoles de sacarose hidrolisada.Para construir a curva padrão utiliza-se seis tubos (180 x 20 mm), conforme indicadoabaixo, contendo volumes crescentes de solução padrão redutora (glicose 5,5 mM maisfrutose 5,5 mM), completando o volume em cada tubo para 2,0 ml com tampão. Como nãoocorrerá hidrólise de sacarose nos tubos de 1 a 5, pode-se acrescentar logo em seguida aotampão, o reagente DNS.