Corantes naturais de urucum - Emepa

CAMILO FLAMARION DE OLIVEIRA FRANCOCorantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) no tratamento dahiperlipidemia e câncer em animais.Trabalho apresentado à Universidade Federal deViçosa, como parte das exigências do Programade Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola paraa obtenção do Pós-Doutorado.Orientadora: Prof. Dra. Tânia Toledo de OliveiraVIÇOSAMINAS GERAIS - BRASIL2008ii

DEDICATÓRIAA minha esposa, Valéria Christina Miranda Franco, todoespecial amor, carinho, compreensão e estímulo.Aos meus queridos e amados filhos, Pedro Paulo,Paula Gabrielly e Camilo Filho, e aos netos,Pedro Lucas, Abraão Henrique e PauloHenrique, com muitíssimo amor.iii

AGRADECIMENTO ESPECIALLouvarei ao Senhor em todo o tempo;o seu louvor estará continuamente na minha boca.A minha alma se gloriará no Senhor;os mansos o ouvirão e se alegrarão.Engrandecei ao Senhor comigoE juntos exaltemos o seu nome.Busquei ao Senhor e ele me respondeu;Livrou-me de todos os meus temores.Olharam para ele, e foram iluminados;E os seus rostos não ficaram confundidos.Clamou este pobre, e o Senhor o ouviu;E o salvou de todas as suas angústias.O anjo do Senhor acampa-se ao redordos que o temem e os livra.Provai e vede que o Senhor é bom;Bem-aventurado o homem que nele confia.Temei ao Senhor, vós os seus santos,Pois não têm falta alguma aqueles que o temem.Salmos 34. 1-9v

ÍNDICEPáginaCorantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) no 1tratamento da hiperlipidemia em animais...........................1 INTRODUÇÃO............................................................................. 22 OBJETIVO GERAL...................................................................... 32.1 Objetivos Específicos.................................................................. 33 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................ 43.1 Carotenóides como antioxidantes............................................... 53.2 Estabilidade dos corantes naturais.............................................. 63.3 Biossíntese dos carotenóides...................................................... 73.4 Ocorrência dos carotenóides – Distribuição na natureza............ 83.5 Funções dos carotenóides.......................................................... 93.6 Apocarotenóides.......................................................................... 93.7 Bixina........................................................................................... 93.8 Urucum........................................................................................ 153.9 Melhoramento vegetal do urucum............................................... 213.10 Principais aplicações para o pigmento........................................ 223.11 Composição da semente............................................................. 233.12 Métodos de produção do pigmento............................................. 254 METODOLOGIA.......................................................................... 265 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................... 286 CONCLUSÕES................................................................... 357 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................... 36Corantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) no 41tratamento do câncer em animais.......................................1 INTRODUÇÃO..................................................................... 422 OBJETIVO GERAL.............................................................. 422.1 Objetivos Específicos.......................................................... 423 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................. 433.1 Metástases........................................................................... 45vi

3.2 Patogênese da metástase.................................................... 463.3 Exame histopatológico......................................................... 493.4 Epidemiologia do câncer...................................................... 533.5 Mutagenicidade de corantes para alimentos........................ 553.6 Bixina.................................................................................... 553.7 Frutas alaranjadas ou amareladas....................................... 623.8 Estresse oxidativo................................................................. 633.9 Estratégia de defesa antioxidante........................................ 643.10 Mecanismos de proteção..................................................... 643.11 Flavonóides e medicamentos no câncer.............................. 653.12 Flavonóides.......................................................................... 663.13 Flavonóide e câncer............................................................. 663.14 Atividade estrogênica e antiestrogênica............................... 723.15 Ação antiinflamatória............................................................ 753.16 Angiogênese......................................................................... 783.17 Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer............ 843.18 Ciclo celular.......................................................................... 863.19 Classes de agentes antineoplásicos.................................... 883.20 Agentes alquelantes............................................................. 884 METODOLOGIA................................................................... 1205 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................... 1226 CONCLUSÕES..................................................................... 126Corantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) em animais 127com câncer induzidos com DMBA........................................1 METODOLOGIA................................................................... 1272 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................ 1293 CONCLUSÕES..................................................................... 1414 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................... 1435 LÂMINAS HISTOPATOLÓGICAS........................................ 1564 CONCLUSÃO FINAL............................................................ 186vii

Experimento 01Corantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) no tratamento dahiperlipidemia em animais¹.Camilo Flamarion de Oliveira Franco², Tânia Toledo de Oliveira³ , Tanus Jorge Nagem 4 ,RESUMOA bixina do urucum tem se destacado como uma das principais fontes de corantes naturaisutilizados no mundo, tendo como principais aplicações, nas indústrias de alimentos, têxteis,cosméticos e principalmente na farmacêutica para o tratamento de diversas doenças. O trabalho foidesenvolvido no Laboratório do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da UniversidadeFederal de Viçosa – UFV. Minas Gerais, com o objetivo de obter um fitoterápico e/ou umsuplemento alimentar, voltado ao tratamento da hiperlipidemia em animais. O delineamentoexperimental utilizado foi o de blocos inteiramente casualizados com 66 (sessenta e seis)tratamentos (coelhos) com seis (06) repetições cada. Os animais utilizados para o ensaio foramcoelhos machos da raça Nova Zelândia Branco, com 60 dias de vida e 1.800kg, provenientes dosetor de Cunicultura do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa – DZO –UFV. Os coelhos foram acondicionados em gaiolas individuais, onde permaneceram por umperíodo de adaptação de cinco (05) dias, recebendo 120g de ração PURINA e água “ad libitum”.Após este período os animais foram divididos em grupos de seis animais (06) aleatório. Paraindução da hiperlipidemia foi oferecida para os coelhos diariamente durante 30 dias a raçãopreparada (120g de ração+ 1% de colesterol cristalino da marca VETEC + 0,5% de ácido cólico),para todos os grupos à exceção do Grupo 1. Durante 30 dias os animais receberam a ração e ostratamentos diários por via oral, sendo que os tratamentos por cavagem oral. Ao final doexperimento houve a coleta de sangue pelo plexo retro orbital para que fossem feitas análises deColesterol Total, HDL, Triglicerídeos, Ferro, TGO, TGP, Fosfatase Alcalina e Gama GT. O materialfoi centrifugado em centrífuga Excelsa 2 205 N a 7.100 X g, durante 15 minutos, para obtenção dosoro. As dosagens sorológicas foram efetuadas em equipamento multiparamétrico de BioquímicaAlizé, Mod Lisabio B.652 e kits da marca Bioclin e os resultados expressos em mg/dl.Palavras – Chave: Bixina; carotenóides, colesterol, pigmentos, flavonóides.1.Trabalho apresentado no Pós-Doutorado da UFV-MG, no Curso de Pós Graduação em Bioquímica Agrícola;2. Engenheiro Agrônomo, Pesquisador III EMBRAPA;3. Professora Associado II da UFV-MG, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular; (Orientadora);4. Professor Associado II da UFOP-MG, Departamento de Química; (co-Orinetador).1

1. INTRODUÇÃOA flora brasileira é reconhecida como uma das mais importantes do planeta,dispondo da maior biodiversidade de espécies superiores. Dentre essas, o urucum(Bixa orellana L.), tem se destacado pela sua ampla aplicabilidade, figurandocomo uma das principais fontes de corantes naturais utilizados mundialmente. Naindústria de alimentos é aplicado como corantes em derivados lácteos, embutidos,doces, licores, sorvetes e margarinas. Os corantes obtidos do urucum apresentamversatilidade, estando disponíveis tanto na forma lipossolúvel quantohidrossolúvel. Sendo assim, têm um amplo espectro de aplicação. Outros ramosindustriais que também fazem uso de suas propriedades tintoriais são asindústrias, têxtil, de tintas e vernizes. O Brasil situa-se como o primeiro produtormundial de urucum, seguido pelo Quênia e Peru.A bixina, um carotenóide de cor vermelha, é o pigmento presente em maiorconcentração no arilo da semente do urucum, sendo a principal substânciaresponsável pelas características tintoriais dos corantes obtidos nas sementes,onde a sua concentração pode chegar a até 5,0%. Contudo, diferentes sementesapresentam teores inferiores a 2,0 %, notadamente porque o valor comercial damesma é baseado no percentual de bixina. Teores superiores a 2,5% sãonormalmente exigidos para exportação.Os compostos de urucum sofrem grande interferência das condições deprocesso estando susceptíveis à decomposição provocada pelo calor, luz eoxidação, como também potencializada por determinados solventes. Uma vezisolada da semente, a bixina torna-se muito vulnerável à degradação.As técnicas de extração em sua maioria visam à produção de umconcentrado bruto, no qual a bixina, maior responsável pela cor, encontra-se embaixa concentração. A otimização de um processo de extração é de fundamentalimportância e visa não somente aumentar o rendimento, como também minimizara contaminação com subprodutos de decomposição. Pesquisas da cinética deoxidação da bixina e seus isômeros, a otimização das condições deprocessamento do pigmento do urucum em diferentes temperaturas e2

concentração de álcali têm sido realizadas, como também a influência do teor deágua na redução da estabilidade.Os processos atuais em uso no Brasil destinados ao processamento dasemente de urucum, baseiam-se na extração mecânica e/ou empregandosolventes como, os óleos vegetais, para a produção de extratos lipossolúveis;solução alcalina, para o extrato hidrossolúvel ou ainda os solventes orgânicoscomo, acetona, etanol, hexano, propilenoglicol ou clorofórmio. Alguns dos extratosobtidos com estes solventes são normalmente processados na forma de pasta ouem pó, após a eliminação do solvente. Em todos os casos trata-se de produtoonde a bixina encontra-se misturada a outros componentes extraídos da semente,resultando em um material de baixo valor agregado.O desenvolvimento de tecnologia que conduza não só a extração dopigmento bruto, mas principalmente que leve à obtenção de bixina de elevadapureza, conjugada a sua estabilização é de fundamental importância para agregarvalor ao produto. Disponibilizar no mercado a bixina de elevada pureza, significamaior competitividade, e certeza de expansão comercial ao atender aossegmentos de maior tecnologia, como as indústrias farmacêuticas.2. OBJETIVO GERALObter um fitoterápico e/ou um suplemento alimentar, voltado ao tratamentoda hiperlipidemia em animais.2.1. Objetivos Específicos2.1.1. Testar concentrações de bixina lipossolúveis nos porcentuais de 4%; 5% e10% em diferentes doses em animais com hiperlipidemia induzida;2.1.2. Testar concentrações de flavonóides (rutina) em modelos animais comhiperlipidemia induzida;2.1.3. Analisar no soro sanguíneo de coelhos, colesterol total, colesterol HDL,triglicerídeos, transaminase glutâmico oxaloacético (TGO), transaminase3

glutâmico pirúvica (TGP), fosfatase alcalina, gama GT e ferro, paramensurar os efeitos hipolipidêmicos dos flavonóides e carotenóides;2.1.4. Viabilizar o uso de carotenóides e flavonóides, de acordo com osresultados de hematologia em animais com hiperlipidemia induzida.3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICAO corante de urucum apresenta-se convencionalmente de duas formas, ouseja, em extrato lipossolúvel (solúvel em óleo/óleo-resina), na forma dispersível,no qual a bixina é o princípio ativo, e em extrato hidrossolúvel, no qual a norbixinaé o princípio ativo. Yabiku, (1992), na forma solúvel em água (pó), Araújo, (1995).Existe ainda a forma lipo-hidrossolúvel (emulsificado), na qual o pigmento ésolúvel em emulsão óleo/água e água/óleo. Araújo, (1995). Ele pode ainda serencontrado nas formas, hidrossolúvel estável em meio ácido; e em suspensão emóleo, misturado com cúrcuma, em que cada tipo de corante apresenta seu teor depigmento correspondente.O pigmento é constituído basicamente do carotenóide cis-bixina, insolúvelem óleo, que compreende mais de 80% do corante presente na semente. Opigmento pode ser obtido mecanicamente, submetendo o pericarpo em óleovegetal e aquecendo a 70C; este aquecimento converte a forma cis na formatrans. O pigmento pode ser extraído por meio de solventes adequados, comoacetona e metanol dentre outros e, após sua remoção, a forma em pó é preparadae em seguida ressuspendida em óleo em concentrações de 3,5 a 5,2% de bixina.A forma solúvel em água é obtida pela remoção do pericarpo em solução alcalinaa 70C (saponificação), e o resultado é um sal de norbixina (cis e trans). Araújo,(1995).A maioria dos alimentos possui pH ácido, de forma que, quando se aplicaa solução de norbixina, o pigmento é disperso e insolubilizado no produto, graçasao abaixamento do pH, evitando-se a perda da cor por lixiviação e permitindo,assim, uma coloração uniforme. De um modo geral, a estabilidade do urucum éconsiderada boa, embora a bixina seja sensível ao pH, alterando sua coloração de4

amarelo-alaranjada para rosa-fraca, em pH baixo. A estabilidade térmica éconsiderada boa a temperaturas abaixo de 100C.A norbixina, na presença de íons de cálcio, se precipita, podendo aindareagir com as proteínas, alterando sua coloração; este fato é comum de ocorrer nacoloração de queijos, em que o pigmento pode migrar e concentrar-se no centro. Autilização do ácido ascórbico e de outros antioxidantes ajuda na estabilizaçãoAraújo, (1995).Atualmente, os pigmentos lipossolúveis são utilizados em alimentos, aexemplo das margarinas, cremes vegetais, queijos, sorvetes e outros. Já oshidrossolúveis são aplicados, principalmente, em queijos, sorvetes, derivadoscereais, confeitos, bebidas, molhos e salsichas, representando mais de 80% domercado de corantes de urucum. Carvalho, (1992).Do urucum são fabricados os corantes naturais mais difundidos na indústriade alimentos, onde seus produtos representam aproximadamente 70 % (emquantidade) de todos os corantes naturais e 50 % de todos os ingredientesnaturais que têm função corante nos alimentos. Franco et al. ( 2001). Do urucumsão produzidos:a) corantes hidrossolúveis à base de norbixina, com vasto uso em salsicharias,laticínios e cereais;b) corantes lipossolúveis à base de bixina com grandes aplicações em produtosalimentícios, a exemplo de massas, recheios e produtos oleosos;c) condimentos como o colorau ou colorífico, muito comum na culinária brasileira ena América Latina.3.1. Carotenóides como antioxidantes.Os carotenóides são grupos de pigmentos solúveis em gorduras,constituído por uma família de mais de 600 membros, exercendo uma função antioxidantee oferecendo proteção contra certos tipos de câncer.Pesquisas médicas têm demonstrado que a grande ingestão de vegetaisestá associada com a redução dos riscos de doenças degenerativas, como câncere doenças cardiovasculares. Sendo os vegetais a maior fonte de carotenóides e5

devido ao seu potencial antioxidante, os benefícios que estes compostos trazem àdieta alimentar têm sido temas de estudo de muitos pesquisadores.É consistente a hipótese dos benefícios associados ao consumo devegetais e a redução dos riscos de enfermidades crônicas relacionadas à ingestãode uma dieta de carotenóides, reporta Qing et al., (2002), após examinaremdiversas pesquisas.A administração oral de bixina (200 mmol / Kg de peso) a ratos submetidosa uma radiação (1,5 a 3,0 Gy) mostrou eficácia na inibição dos efeitos causadospela radiação, não acarretando aberrações cromossômicas nas cobaiasestudadas, desempenho comparável ao alfa-tocoferol já consagrado para estafinalidade. Também, foram testados a curcuma e o ácido elágico. Threziamma etal., (1998).Zhang et al., (1991) estudaram o efeito de inibição da peroxidação,avaliando alguns carotenos, entre estes, o beta-caroteno, a astaxantina, a luteína,o alfa-tocoferol, o licopeno e a bixina, constatando a eficácia na inibição dosconseqüentes efeitos de transformações neoplásticas induzidas quimicamente. Detodos os carotenóides testados, o alfa tocoferol foi o mais ativo inibidor daperoxidação lipídica, seguido pela bixina.3.2. Estabilidade dos corantes naturaisOs corantes sintéticos não são oxidativos, alguns corantes naturais sãooxidados facilmente, potencializando assim sua ação antioxidante na mistura.Dentro deste grupo os carotenóides são extremamente reativos econseqüentemente, instáveis devido a sua longa cadeia de duplas ligaçõesconjugadas Qing et al., (2002). Fatores como luz, calor e oxigênio potencializamprocessos de degradação Najar et al. (1988).O pH também afeta a estabilidade de muitos corantes naturais, da mesmaforma que a presença de determinados íons metálicos com reconhecidascaracterísticas catalíticas, como ferro, alumínio, cobre ou mesmo o magnésio, cujaação catalítica é menor. Estes catalisadores podem aumentar a taxa de6

decomposição de alguns pigmentos, acarretando como conseqüência, a perda decoloração. Os carotenóides particularmente são extremamente susceptíveis aestes efeitos Kuntz, (1998).Speranza et al., (1990) estudaram a interação entre o oxigênio singleto eapocarotenóides, entre eles a bixina, norbixina e seus isômeros. Reporta a autoraque este estudo é de fundamental relevância para entender os mecanismos deação que desempenham estes compostos na fotossíntese dos carotenóides, comotambém no seu efeito foto-dinâmico. Este estudo foi realizado pelo monitoramentoespectrofotométrico da solução de diferentes apocarotenóides, mantida a umatemperatura constante de 35ºC, na presença do 3,4-(4-metil-1-naftil) ácidopropiônico 1,4 endoperóxido, empregado como gerador de oxigênio singleto,alternativo à ação fotoquímica. Esta escolha foi tomada no sentido de evitarreação fotoquímica paralela, como a trans-isomerização.3.3. Biosíntese dos carotenóidesAs unidades isoprenóides formam a estrutura básica de todos osterpenóides, dos quais fazem parte os carotenóides. A associação desta matriz“monômero” leva à formação de compostos C10, C15, C20. A dimerização docomposto C20 leva ao fitoeno (C40), o primeiro composto da família doscarotenos. As transformações sucessivas, como também as prováveis rotas deformação dos inúmeros carotenos, encontram-se esquematicamenterepresentadas na Figura 1, onde a reação (1) corresponde à (1) desaturação, (2)ciclisação, (3) hidroxilação, (4) epoxidação, (5) rearranjo epóxido-furanóxido.7

Figura 1 - Últimos estágios da biosíntese de carotenóides e suas possíveis transformações.Fonte: Rodriguez –Amaya, (2001).3.4. Ocorrência dos carotenóides - distribuição na naturezaMais de 700 carotenóides já foram identificados e estão amplamentedistribuídos no reino vegetal e animal. Podem conter somente carbono ehidrogênio como os carotenos e o licopeno, ou ainda oxigênio como as xantofilas,a exemplo da capsantina na páprica; a zeaxantina e a luteína do milho. Oscarotenóides representam uma extensa família de produtos naturais. Sãoencontrados nos cloroplastos das plantas fotossintéticas, nos cromoplastos dasflores, frutos e folhas, como também em bactérias, fungos, algas e insetos.Chaudhry, (2003).8

3.5. Função dos carotenóidesOs carotenóides são fundamentais na dieta dos animais. Em váriosmamíferos eles participam dos processos bioquímicos, a exemplo da conversãodo beta caroteno em vitamina A.. Fontana et al., (1997).A presença de carotenóides nas plantas sempre despertou a atenção depesquisadores. Karrer e Jucker, (1950) destacaram a existência de muitosestudos, entre estes a possível associação dos carotenóides com os mecanismosde respiração das plantas. As pesquisas mostravam uma constante proporçãoentre os carotenóides (caroteno e xantofila) e a clorofila nas folhas das plantas,suspeitando-se daí que estes atuavam como filtro para a clorofila. Nenhumresultado, entretanto, foi conclusivo neste sentido.3.6. ApocarotenóidesUm grupo derivado dos carotenóides, os apocarotenóides, é oriundo daclivagem oxidativa dos carotenos. Algum destes carotenóides tem elevado valoreconômico como pigmentos ou por incorporar sabor ou aroma aos alimentos.Segundo Schwartz et al., (2001) as plantas produzem um grande número destescompostos que tem entre outras prováveis funções atrair insetos. A formação dosapocarotenóides deve resultar de mecanismos não específicos tais como, cooxidação,lipoxigenase ou foto-oxidação. Enzimas capazes de romper oscarotenóides em pontos específicos da molécula estão provavelmente envolvidasna síntese de um grande número destes compostos.3.7. BixinaA cis-bixina (monometiléster do diácido carboxílico (norbixina) é oconstituinte que ocorre em maior concentração no arilo da semente do urucum(Bixa orellana L.), representando cerca de 80% da bixina presente. Além doisômero cis (metil-hidrogênio 9’-cis-6,6’diapocaroteno 6,6’dioato), também estápresente a forma trans, sendo este mais estável que o isômero cis. A transisomerização acontece parcialmente quando o pigmento é submetido a processo9

de aquecimento. Galindo-Cuspinera, (2002). Quando submetida à hidrólise emmeio alcalino, a bixina perde uma molécula de metanol produzindo a norbixina,pigmento de cor vermelho intensa.São poucos os carotenóides carboxílicos conhecidos. Além da bixina, foramidentificados a crocetina, nas flores (estames) do açafrão (Crocus sativus L.), umairidáceae e a azafranina na raiz do açafrão da terra (curcuma longa) umazingeberáceae Karrer e Jucker, (1950) , Jaramilo, (2003). Os pigmentos extraídosdestas espécies, da mesma forma como aqueles do urucum têm grande aplicaçãona indústria de alimentos.Segundo Jondiko e Patteenden, (1989), a bixina foi o primeiro ciscarotenóide isolado a partir de fontes naturais. Fazem parte ainda da famíliarelativamente pequena dos apocarotenóides naturais cuja formação se dá viadegradação oxidativa dos carotenóides C : a crocetina, o β-apo-10’-carotenal, a40β- citraurina e o ácido abscíssico.Na Figura 2 são apresentadas as estruturas moleculares da cis e transbixina, cis e trans norbixina e o principal produto corado de decomposição(monometil éster do ácido 4, 8, dimetil tetradecahexaenedióico) freqüentementedesignado por C17.10

Figura 2 - Estrutura dos carotenóides bixina e norbixina, cis e trans e do principalproduto de degradação. Fonte Scotter, (1995).A bixina é indexada no Color index como CI No 75120, e pela ComunidadeEconômica Européia como EEC n o E160b e CI Natural Color 4. Marmion , (1991).Na Tabela 1 são apresentados alguns dados referentes à bixina e norbixina.11

Tabela 1 - Dados e propriedades da bixina e norbixina.N o CAS PM Fórmula empírica Ponto de Fusão ( o C)Cis Bixina 6983-79-5 394,5 C 25H 30O 4198 (e); 189-190,5 (c); 196.8 (b); 217 (a)Trans bixina 39937-23-0 204.0-206.6 (c); 216-217(d)Cis norbixina 626-76-6 380,5 C 24H 28O 4240 (c) decompõe.Trans norbixina 542-40-5 250 (c) decompõeUrucum 1393-63-1 -------12

A bixina, devido ao seu crescente consumo, tem despertado interesse depesquisadores, no sentido da busca por uma fonte alternativa para a suaprodução. Embora o mecanismo de biosíntese desta substância ainda não tenhasido elucidado. É sustentado que o carotenóide C40, mais provavelmente olicopeno, seja o precursor da bixina. Com base na estrutura similar entre a bixina ea crocetina, pigmento do açafrão, a reação poderia envolver a metil transferase ea dehidrogenase em uma série de reações precedidas seqüencialmente pelolicopeno. A suposta rota é sustentada pela análise de derivados de decomposiçãodo licopeno que se encontram acumulados em traços na semente do urucum.13

Figura 3 - Rota proposta da biosíntese da bixina a partir do licopeno.Fonte: Jako et al., (2002).Citam os autores que conversão de 25% na reação de esterificação foiobtida quando realizada à pressão atmosférica e 50 % quando a pressão dosistema foi reduzida para 200mbar. Os experimentos foram conduzidos à 65o Cpor 144 h. A substituição da bixina pela norbixina reduziu a conversão de 50%14

para apenas 8%. A reação foi monitorada por Thin Layer Chromatography (CCD)empregando placa de sílica gel MERCK e fase eluente composta de uma misturade clorofórmio/ metanol /ácido acético/água 80: 10: 8: 2, tendo apresentado osseguintes valores para o fator de retenção (Rf): 0,00 para o ácido L-ascórbico,0,36 para o éster de bixina, 0,8 para a norbixina e 0,94 para a bixina.A obtenção destes derivados tem sido conduzida no sentido de melhorarsuas características de solubilidade, estabilidade ou mesmo com vistas apotencializar seu caráter antioxidante de forma a melhor adequar sua aplicaçãopara fins específicos. Tanto a bixina quanto a norbixina apresentam baixasolubilidade na maioria dos solventes. A bixina é normalmente empregada paraprodutos com base lipídica, enquanto que em produtos com base aquosaemprega-se freqüentemente a norbixina.3.8. UrucumQuando os conquistadores espanhóis chegaram ao Novo Mundo, tiveramacesso a muitas plantas cujos extratos eram empregados pelos Maias e Aztecas.Uma destas plantas, o urucum, existente ao longo da América tropical era usadocomo extrato para tingirem tecidos e pintar o corpo, além de ser utilizada junto àvanilina na formulação de uma bebida a base de cacau. O nome científico dourucum, Bixa orellana L. foi dado em homenagem a Francisco Orellana, primeiroeuropeu a navegar o rio amazonas após uma expedição na região na AmazônicaSetentrional Giuliano, (2003), Sandi et al., (2003), Franco et al., (2001).Na botânica o urucum pertence à família das Bixaceae e por conta da suapropagação em diferentes regiões do mundo, pode-se encontrar a planta comvasta sinonímia vulgar: Urucu, urucum, açafrão, açafrão e açafroeira da terra(Brasil), atole, achiote e bija (Peru, Colômbia e Cuba), onotto e onotillo(Venezuela), urukú (Paraguai), roucou e rocouyer (República Dominicana eGuiana francesa), rocuyer (França), axiote (México), urucu (Argentina), analto, attae kushub (Honduras Britânica), analto (Honduras), guajachote (El Salvador),ditaque e kifasu (Angola), achiote, achote, anatto, bija (Porto Rico), roucou ekoessewee (Surinam) (Franco et. al., 2000). Outras denominações encontradas na15

literatura são: uñañé, eroyá, chagerica, orelana, ranota, annatto e lipstick (USA)Sandi et. al., (2003) , Catálogo Rural, (2003).Em condições normais, a planta do urucum atinge alturas entre 3 e 4 m,porém, dependendo do manejo, da idade e das condições de clima e solo em queé cultivada, pode chegar até 10 m de altura, o que não constitui nenhumavantagem, por conta das dificuldades encontradas por ocasião das colheitas, quecom certeza, onerariam os custos de produção, refletindo negativamente norendimento econômico. Franco et. al., (2008).As plantas apresentam um sistema radicular do tipo pivotante, contendo umeixo principal, a partir do qual brotam, lateralmente, ramificações secundárias eterciárias. As raízes se encontram distribuídas no solo até aproximadamente 30cm de profundidade, embora a raiz principal atinja, na sua maioria, profundidadede até 1 m. Franco et al., (2008).O seu caule é lenhoso e relativamente reto, de onde partem vários ramosque formam uma copa de aspecto bem frondoso. O diâmetro da base do troncodas plantas adultas mede de 10 a 15 cm, podendo encontrar algumas delas comdiâmetro superior a 30 cm. O aparecimento dos brotos e dos ramos primários notronco principal ocorre antes ou durante a floração. Franco et al., (2008).As folhas se prendem à superficie dorsal e ventral dos ramos, de formaalternada, são inteiras, apresentam nervuras longas e possuem coloração verde.Elas têm forma de coração e, possuem, em média, 8 cm de comprimento e 4 cmde largura. Franco et al., (2002).A inflorescência é do tipo panícula, com flores grandes e na cor branca ouem várias tonalidades. É variável o número de flores em cada inflorescência,sendo aquelas hermafroditas, com cinco sépalas, surgindo nas extremidades dosramos. O pistilo é simples e alongado, enquanto as anteras são de formato oval eos respectivos estames são encontrados em grande número. Franco et al., (2008).As flores são emitidas praticamente durante todo o ano, no entanto, commaior intensidade em duas épocas, definindo as safras da planta. Normalmente, aabertura das flores ocorre primeiramente na parte inferior e depois na porçãosuperior da inflorescência. O tempo entre a abertura das flores e a maturação dos16

frutos varia de região para região, sendo entre 100 e 140 dias, no Nordeste, Sul eSudeste, e de 80 a 110 dias no Norte, dependendo da precocidade de cadamaterial selecionado e plantado. Franco et al., (2008).Nos frutos do urucum denominados de cápsulas ou cachopas, observam-seantes da maturação fisiológica colorações variadas, desde verde-clara a verdeescura,amareladas ou vermelho-escuras. Um fruto bem desenvolvido podefornecer, em média, 40 a 60 sementes e exepcionalmente é possível existircápsulas com 70. sementes. Franco et al., (2008).Dependendo da cultivar, das condições de cultivo e do manejo das plantas,a produtividade média do urucum inicia normalmente entre 400 e 500 kg/ha até asua estabilização, variando de 1.600 a 2.000 kg/ha, a qual ocorre a partir doquarto ano de produção. Franco et al., (2008).As sementes, consideradas parte de importância comercial, pois é nopericarpo (camada que envolve as sementes) que estão os pigmentos, têm amplaaplicação industrial. Do pigmento existente no pericarpo, 80% é constituído por umcarotenóide conhecido por bixina, o qual tem a propriedade corante e pode serextraído em óleos vegetais ou bases químicas. Dependendo principalmente dacultivar utilizada e das condições edafoclimáticas da região, o teor de bixina podevariar de 1% a 6% no arilo da semente. O restante é composto por outros corantese substâncias inertes de menor importância. Franco et al., (2008).Quanto aos solos, por ser considerada uma planta rústica e tolerante, ourucum adapta-se às diferentes condições, podendo ser cultivado até mesmo nosde baixa fertilidade. Nessas situações, a produtividade será menor, comparado aode boa fertilidade. Ressalta-se que o teor de bixina das sementes não acompanhaessa relação, ou seja, mesmo que a produtividade seja baixa, o teor serásatisfatório, dependendo da cultivar utilizada. Franco et al., (2008).Mesmo reconhecendo que o urucum se adapta a solos de baixa fertilidade,são nos solos férteis onde se obtém as melhores produtividades. O ideal é que osnovos cultivos sejam realizados em solos que apresentem fertilidade de média aalta, bem como um bom sistema de drenagem natural para evitar que no períododas chuvas as plantas permaneçam sob condições de encharcamento por17

períodos considerados prolongados. Outro fator de suma importância, é que o pHdo solo esteja entre 5,5 e 7,0, os teores de cálcio e magnésio sejam satisfatórios eas quantidades de alumínio tóxico sejam muito baixas. Franco et al., (2008).A topografia do terreno para o cultivo do urucum deve variar de plana aligeiramente inclinada. Nas áreas planas e muito baixas, deve-se evitar apossibilidade de encharcamento prolongado ou até mesmo o alagamento. Nasáreas inclinadas, deve-se ter o cuidado de realizar o plantio em curva de nível,visando a conservação do solo. Neste caso, aconselha-se a construção deterraços ou bancadas. Franco et al., (2008).Quanto à temperatura, o ideal para o desenvolvimento satisfatório da plantasitua-se entre 22 e 27°C a temperatura ideal, notadamente por se tratar de umaplanta típica de clima tropical. Cultivado em regiões que apresentam temperaturasanuais médias fora dessa faixa, a produtividade poderá ser reduzida, no entanto,temperaturas muito elevadas favorecem o desenvolvimento vegetativo da cultura,havendo como conseqüência, grande emissão de galhos e folhas, porém, poucosfrutos. Sob condições de frio prolongado, o urucum paralisa o seudesenvolvimento, ocorrendo considerável redução na produtividade, o que éindesejável. Por isso, o conhecimento das temperaturas extremas de uma região éde suma importância, considerando que, tanto as baixas como as altas, podemafetar diretamente o desempenho produtivo da planta. Franco et al., (2008).A umidade relativa do ar, apesar de ser importante, não exerce influênciano desenvolvimento nem na produtividade do urucum. No entanto, a umidaderelativa favorável está em torno de 80%. Franco et al., (2008).O urucum é uma planta que se desenvolve bem em regiões com altitudesvariando de zero até 1,200 m (normalmente região litorânea), dependendo dacultivar utilizada. A pesquisa tem demonstrado que o melhor desenvolvimentodessa bixácea e as maiores produtividades são verificadas nas regiões comaltitudes variando de zero a 800 m. Franco et al., (2008).Considerando como fator climático de grande importância nodesenvolvimento e na produtividade do urucum, a pluviosidade efetiva está entre800 e 1.200 mm, bem distribuídas durante todo o ano. Relativamente o urucum18

até suporta baixos índices pluviométricos, porém, secas prolongadas e drásticas,com mais de três meses de duração, têm causado vários prejuízos, sendo oprincipal a redução da sua produtividade, essencialmente, porque a planta dourucum apresenta os processos fisiológicos de vegetar, florescer e frutificar,praticamente, durante todo o ano. Por esse motivo, em locais onde aspluviosidades são reduzidas ou ata mesmo mal distribuídas, torna-se necessário autilização da irrigação suplementar. Independente de ser proveniente das chuvasou das irrigações, a cultura deve receber um suprimento de água de, pelo menos,entre 100 e 150 mm mensais, que corresponde a 100 e 150 litros/m² de área pormês, ou seja, em torno de 3,3 a 5,0 mm∕dia, respectivamente. Franco et al.,(2008).Um dos fatores que mais danos tem mecânicos e fisiológico tem causadoas plantas de urucum, diz respeito aos ventos fortes e frios, até que elas atinjamtrês anos de idade, principalmente. A incidência direta dos ventos nas plantasprovoca injúria nas folhas, diminuindo a eficiência fotossintética e, porconseguinte, redução na produção final, além disso, pode prejudicar odesempenho dos agentes polinizadores. Os ventos aumentam a transpiraçãofoliar, o que implica em maior consumo de água pela planta. Por isso, o cultivo dourucum, em regiões de ventos fortes e prolongados, requer proteção vegetal comquebra-ventos. Como alternativa sugere-se o plantio de árvores de porte alto naslaterais das áreas de cultivo do urucum. Desta maneira, o uso de quebra-ventospode ser imprescindível. Franco et al., (2008).Oriundo da América Tropical acredita-se que tenha sido uma das primeirasplantas “domesticadas’ pelos índios da região, provavelmente para finscerimoniais, a partir da Bixa excelsa, árvore silvestre da família das (Bixáceae),Sandi et al., (2003); Vazquez-Yanes, (1999)”. A Figura 4 mostra flores, frutos esementes de urucum,19

Figura 4: Fotos de urucum: A: fruto verde; B: cachopa com frutos maduros; C: emfloração; D: fruto aberto com sementes expostas.Almeida et al., (1995) estudaram a micropopagação do urucum submetendogemas adventícias a diferentes concentrações de auxina. Segundo os autores, porserem as plantas geralmente formadas a partir de sementes, não apresentamgrande uniformidade nos plantios, com variações em relação ao teor de bixina, àresistência às pragas e à produtividade. Devido a isto, a micro propagaçãovegetativa aparece como método viável para obtenção de lavouras produtivas euniformes uma vez que, constituídas de clones, herdam as mesmascaracterísticas genéticas da planta matriz fornecedora do material propagativo.Apresenta ainda como vantagem a geração de milhares de plantas clonais,isentas de problemas fitos sanitários, podendo ainda ser multiplicado em qualquerépoca do ano.O urucum é empregado com freqüência como condimento na culináriaasiática, africana e européia. Foram os espanhóis os responsáveis pela expansãodo consumo deste produto ao redor do mundo, o que levou a um aumento de suaprodução já no século XIX. Sua maior aplicação está concentrada na indústria dealimentos, onde é empregado como corante. Sandi et al., (2003).20

Nos últimos anos o potencial do mercado internacional do urucum teve umgrande impulso. Como o produto natural é substituto para corantes sintéticos,considerados cancerígenos, a proibição ao uso destes aditivos nos EstadosUnidos, Japão e alguns países da Europa, fez com que o urucuzeiro ganhasseimportância nas regiões produtoras. Almeida et al., (1995). Atualmente, o urucumé uma das maiores fontes naturais de corantes e pigmentos vermelhos.3.9. Melhoramento vegetal do urucumO melhoramento genético das plantas cultivadas é uma prática defundamental importância. No caso do urucum, sua expressão maior reside no fatode que o Brasil, como um dos maiores produtores e exportadores mundiais dessabixácea, necessite com urgência, dispor de materiais de qualidades superiores,tanto em produtividade de grãos, como altos teores de bixina, visando competircom o mercado internacional. Franco et al., (2002).O binômio produtividade e bixina deve ser perseguido pelos melhoristas egeneticistas, visto que a qualidade terá espaço assegurado no agronegócio dourucum.Pouco tem sido feito na área da obtenção de cultivares de urucum, aexceção da seleção de tipos locais e as avaliações tradicionais dos tipos queparticipam dos ensaios regional e nacional. Ainda que se disponha de algunsconhecimentos referentes à biologia floral, maturação dos frutos, mecanismos deabertura das flores e métodos de polinização, há um longo caminho a serpercorrido em busca de informações para ampliar a base científica do melhoristapara que, a partir de então, se possa atender à demanda dos produtores e dosegmento industrial em termos de produtividade e maior rendimento de bixina.Franco et al., (2002).As características econômicas de maior importância e que se constituemparâmetros para o trabalho de melhoramento, referem-se a: número decacho/planta, número de sementes/cacho, número de cápsula/cacho,uniformidade de maturação, deiscência das cápsulas, tolerância às pragas e21

doenças, densidade das sementes, intensidade de coloração das sementes eporcentagem de bixina. Todas estas características têm herança quantitativa e.,portanto, são governadas por alguns genes que têm sua expressão grandementeinfluenciada pelo ambiente. Franco et al., (2002).A flor do urucum é hermafrodita e, desta forma, convivem na mesmaestrutura o androceu (pólen) e o gineceu (óvulo). Entretanto, a flor não podeautofecundar-se devido à ocorrência do fenômeno da protandria que faz com queos grãos de pólen estejam maduros antes das anteras se apresentaremreceptivas. Assim, a fecundação só ocorre devido à polinização cruzada que érealizada preferencialmente pelos insetos (entomofilia). A alogamia define umgrupo de plantas de polinização aberta (PPA) que se identificam com aspopulações locais de urucum, as quais apresentam grande variabilidade de tipos enada mais são que misturas de genótipos que assim permanecem geração apósgeração. Franco et al., (2002).As implicações da alogamia no melhoramento do urucum devem-se ao fatode que as plantas alógamas ou de polinização cruzada, os acasalamentos sãorealizados livremente entre todos os indivíduos da população. Com isto, estimulaseo aumento da variabilidade genética e do vigor, contribuindo para oaparecimento de indivíduos que são heterogêneos e heterozigotos devido à trocade freqüência gênica que ocorrem a cada ciclo. Há, portanto, maior flexibilidade daestrutura genética. Com endogamia forçada, ocorre perda de vigor e deterioração.Esta depressão devido ao endocruzamento é o resultado da heterozigose dealelos subvitais. Assim, o objetivo do melhoramento destas plantas é manter aheterozigose ou restaurá-la no final do programa. Franco et al., (2002).3.10. Principais aplicações para o pigmentoEm cosmética, o pigmento encontra aplicação na formulação debronzeadores, na forma de extrato oleoso; produtos de maquilagem como batonse pós-faciais; produtos para cabelos, a exemplo da tintura e xampus, comotambém em sabonetes. Na indústria têxtil é empregado para tingir algodão, lã eespecialmente a seda, conferindo a esta um efeito especial difuso, amarelo-22

laranja. Também tem sido empregado como pigmento na indústria de couro bemcomo na fabricação de tintas e vernizes, graxas para sapato e ceras para pisos.Sandi et al., (2003), Revista de fitoterapia, (2003).Estudos homeopáticos indicam seu uso para o tratamento de cardite eendocardite. Outras qualidades medicinais atribuídas referem-se ao emprego notratamento de hemorragias, dispepsias e queimaduras da pele. Catálogo Rural,(2003), Newman, (2002). Em Newman, (2002) encontram-se a relação de umgrande número de aplicações medicinais do urucum, incluídas as referências.Além do emprego da semente devido ao seu pigmento, faz-se também usodas folhas e raiz, explorando suas propriedades terapêuticas. O extrato etanólicodas folhas é citado como antídoto eficaz em caso de envenenamento pormandioca, como também um potente antiofídico. Sandi et. al., (2003).Várias são as propriedades atribuídas à planta e que são exploradas pelamedicina tradicional das quais são mencionadas: ser efetivo contra diarréia,amidalite, no tratamento de doenças peitorais, também como estimulante,diurético, febrífugo, expectorante, cicatrizante, afrodisíaco e laxante, Catálogorural, (2003); Sandi et al., (2003), Giuliano, (2003).3.11. Composição da sementeFrega et al., (1998) identificaram na fração lipídica, extraída com hexano, apresença de tocotrienóis, destacando-se elevada concentração do deltatocotrienol, 140-147 mg/100g de extrato seco, maior do que aquelas normalmenteencontradas em qualquer outra espécie vegetal. Reportam ainda não ter sidoencontrado nenhum tocoferol.Mercadante et al., (1997), isolaram 5 cinco apocarotenóides e identificarama estrutura de três outros até então desconhecidos, presentes no arilo da sementede urucum. O metil (7Z, 9Z, 9’Z)-apo-6’-licopenoato, o metil (9Z,)-apo-8’-licopenoato, e o metil 1(all-E)-apo-8’-licopenoato, foram os três novoscarotenóides encontrados. Os compostos; metil (all-E)-8-apo-betacaroten-8’-oate eo metil (all-E)-apo-6’-licopenoate, não tinham antes sido encontrados no urucum.23

Mercadante et. al., (1999) isolaram três outros apo carotenóides do urucum(Bixa orellana L.): o 6-geranilgeranil-8 ’ -metil-6,8‘diapocaroten-6-8’dioato; o 6’-geranilgeranil-6’-metil-(9Z)-6,6’-diapocaroten-6-6’-dioato e o 6-geranilgeranil-6’-metil-6-6’-diapocarotem-6-6’-dioato. Reportam os autores ter sido esta, a primeiravez que foi encontrado o geranilgeraniol esterificado com um ácido carboxílicocarotenóico.Muitas outras informações referentes à composição química da semente,raiz e folhas do urucum, são encontradas na literatura. Contudo, talvez pelasdiferentes procedências das plantas, métodos analíticos empregados, ou ainda acusta da própria instabilidade apresentada por alguns de seus componentes, ospercentuais variam bastante.A análise da semente inteira apresenta 17,5% de lipídeos sendo; ácidolinolênico, α linoléico e oléico. Possui ainda 10,6% de aminoácidos, 6 dos 8aminoácidos essenciais Contemplados no padrão ideal da OMS. As cinzas (5,4%)apresentaram alto conteúdo de fósforo, ferro e zinco, com reduzido teor de cálcio.Além da bixina e norbixina outros carotenos são encontrados em menoresquantidades no arilo da semente do urucum entre eles; isobixina, beta caroteno,criptoxantina, luteína, zeaxantina e a orellina, de cor amarela. Das folhas foramisolados os compostos apigenina, luteolina, hipoaletina e isoscutelareína, comotambém seus heterosídeos cosmosiína, além dos derivados bisulfatadosapigenina e luteolina-7-bisulfato e hipoaletina-8-bisulfato. Foram também isoladosos diterpenos; farnesilacetona, geranilgenaniol e geranil formato. No óleoessencial foi detectada a presença de dois sesquiterpenos o ishwarano ebixageneno, além de ácido gálico e pirogalol. Revista de fitoterapia, (2003).Segundo Amsar, (2002) além da bixina encontram-se também nassementes de urucum; bixina, bixol, crocetina, iswarane, ácido elágico, ácidosalicílico, treonina, ácido tomentósico, triptofano e fenilalanina. A semente brutaapresenta como composição típica; 40 a 45 % de celulose, 3,5 a 5,5 % deaçúcares, 0,3 a 0,9% de óleo essencial, 3% de óleo fixo, 1,0 a 4,5% de pigmento,13 a 16 % de proteína como também alfa e beta caroteno além de taninos esaponinas. Taylor, (2002), Amsar, (2002).24

Galindo-Cuspinera et al., (2002) empregando técnica de head space ecromatografia acplada com espectrometria de massas (CG-MS) determinaram apresença de inúmeros compostos voláteis em extratos aquosos e lipossolúveis deurucum. A identificação foi realizada por comparação com dados de bibliotecaNIST e índice de Kovats como também pelo tempo de retenção com padrõesconhecidos. Mais de 100 compostos foram detectados e cerca de 50 identificados,entre eles: acetato de bornila, ∝-cariofileno, copaene, ∝-cubebene,(+)ciclosativene, geranilfenilacetato, 1-heptanetiol, 3-metil piridina, 4-metil piridinaγ-elemene, β-humuleno, isoledene, β-pineno, selina-6-em-4-ol, δ-selinene,(-)espatulenol, e o (+) ylangene.Reith e Gielen, (1971) determinaram algumas propriedades da α e βnorbixina e α e β bixina, tais como: coeficientes de extinção molar (emclorofórmio), como também ponto de fusão, confrontando com valores disponíveisna literatura. Para realização desta pesquisa empregaram cromatografia emcamada delgada (celulose sem prévio tratamento), para isolamento e purificaçãodas amostras ensaiadas.3.12. Métodos de produção do pigmentoAs características finais do pigmento dependem não só das condições deconservação dos produtos, mas principalmente do processo de extração, o quereflete na qualidade final do produto. Desta forma muitos países importam assementes in natura. Tendo em vista que o mercado importador exige umpercentual mínimo de 2,5 % de bixina, a existência de variedades cultivadas comsomente 1,6 a 2.1 % de bixina tem levado muitos países a mudarem suaestratégia de mercado. May et al., (1997). A Índia, por exemplo, têm ampliado aexportação de pigmento processado de forma a aumentar o valor agregado.Robbins, (1995).Os corantes de urucum podem ser encontrados no mercado em diferentesformas: em solução aquosa, solúvel em óleo ou ainda, na forma de emulsão ouem suspensão. Sandi et. al., (2003). Vários são os processos adotados para25

obtenção do pigmento. O método tradicional de extração dos corantes do urucumconsiste na enérgica agitação das sementes em água fria. Uma vez separada asemente e decantada a suspensão, seca-se a pasta. Esta pasta é comercializadain natura ou misturada a um óleo comestível. O referido processo acarreta baixorendimento no teor de bixina, devido ao prolongado tempo de secagem. Sandi etal., (2003).4- MATERIAL E METODOSForam utilizados neste ensaio biológico experimental coelhos machos daraça Nova Zelândia Branco, com 60 dias de vida e 1.800kg. Os animais foramprovenientes do setor de Cunicultura do Departamento de Zootecnia daUniversidade Federal de Viçosa – DZO – UFV.O delineamento experimental utilizado foi o de blocos inteiramentecasualizados com 66 (sessenta e seis) tratamentos (coelhos) com seis (06)repetições cada.Os coelhos foram acondicionados em gaiolas individuais, ondepermaneceram por um período de adaptação de cinco (05) dias, recebendo 120gde ração PURINA e água “ad libitum”.Após este período os animais foram divididos em grupos de seis animais(06) aleatório, conforme a seguir:Grupo 1: Ração (120G)Grupo 2: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%)Grupo 3: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 4% (0,5mL)Grupo 4: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 4% (1,0mL)Grupo 5: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 4% (1,5mL)Grupo 6: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 5% (0,5mL)Grupo 7: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 5% (1,0mL)Grupo 8: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 5% (1,5mL)Grupo 9: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 10% (0,5mL)26

Grupo 10 Ração + colesterol (1%)ácido cólico (0,5%) + bixina 10% (1,0mL)Grupo11: Ração + colesterol (1%) + ácido cólico (0,5%) + bixina 10% (1,5mL)Para indução da hiperlipidemia, foi oferecida para os coelhos diariamentedurante 30 dias a ração preparada (120g de ração+ 1% de colesterol cristalino damarca VETEC + 0,5% de ácido cólico), para todos os grupos à exceção do Grupo1. Para testar a redução da hiperlipidemia foram utilizados os tratamentos citadosacima.Durante 30 dias os animais receberam a ração e os tratamentos diários porvia oral, sendo que os tratamentos por cavagem oral. Ao final do experimentohouve a coleta de sangue pelo plexo retro orbital para que fossem feitas análisesde Colesterol Total, HDL, Triglicerídeos, Ferro, TGO, TGP, Fosfatase Alcalina eGama GT. O material foi centrifugado em centrífuga Excelsa 2 205 N a 7.100 X g,durante 15 minutos, para obtenção do soro. As dosagens sorológicas foramefetuadas em equipamento multiparamétrico de Bioquímica Alizé, Mod LisabioB.652 e kits da marca Bioclin e os resultados expressos em mg/dl.27

5- RESULTADOS E DISCUSSÃOQuadro 1 - Valores médios de HDL, colesterol e triacilglicerol em soro sanguíneo de coelhos tratados com bixina,comparados ao grupo doente.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOHDL (mg/dL) Colesterol (mg/dL) Triacilglicerol (mg/dL)G1- Ração + Colesterol e ácido cólico 57,16 A 0 2020,68 A 0 129,12 A 0G2- Ração 42,50 B -26 104,42 B -95 125,57 A -3G3- Ração + C + AC. C + BIXINA 4% (0,5ml) 34,22 B -40 223,23 B -89 150,25 A +16G3- R + AC. C + BIXINA 4% (1,0mL) 43,45 B -24 133,00 B -93 255,88 B +98G5- R + C. + AC. C. + BIXINA 4% (1,5Ml) 37,92 B -34 138,93 B -93 245,46 B +90G6- R + C + AC + BIXINA 5% (0,5mL) 33,58 B -41 143,18 B -93 207,26 B +61G7- R + C + AC + BIXINA 5% (1,0mL) 41,95 B -27 168,78 B -92 166,00 B +29G8- R + C + AC + BIXINA 5% (1,5mL) 38,32 B -33 141,63 B -93 207,63 B +61G9 R + C + AC + BIXINA 10% (0,5mL) 72,47 B +27 156,16 B -92 170,05 B +32G10 R + C + AC + BIXINA 10% (1,0mL) 32,08 B -44 117,83 B -94 197,03 B +53G11 R + C + AC + BIXINA 10% (1,5mL) 39,42 B -31 145,30 B -93 245,56 B +90Teste de Dunnett a 5 % de significância, letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.28

De acordo com os resultados obtidos no quadro 1 observou-se que ogrupo 9 tratado com bixina 10% (0,5mL) foi o único que aumentou o parâmetroHDL em 27%. Este aumento é interessante uma vez que o HDL é alipoproteína que transporta o colesterol da circulação para o fígado onde ele émetabolizado. Ainda neste quadro, todos os tratamentos do grupo 3 ao grupo11 foram bastante eficazes na redução do colesterol sanguineo. Todos estesgrupos quando comparados ao grupo 1 que recebeu o colesterol e ácido cólicoe não foram tratados com a bixina, tiveram altas reduções do colesterol. Eestas variações foram estatisticamente significativas em relação ao grupo 1. Éimportante observar que o tratamento do grupo 10 foi o que valor mais seaproximou do grupo normal. O grupo 10 tratado com bixina (10% ) na dose de1mL reduziu em 94% o parâmetro colesterol com um valor médio de 117,83mg/dL, enquanto que o grupo 2 teve um valor médio de 104,42 mg/dL para o,esmo parametro. No entanto, neste mesmo quadro observou-se que todos ostratamentos não foram capazes de reduzir aos triacilgliceróis.Ainda observou-se que o tratamento do grupo 3 foi o que provocou omenor aumento no parâmetro triacilglicerol tratado com bixina 4% (0,5mL).Admite-se que os carotenóides e flavonóides presentes no extrato, tenhammecanismos de ação como antioxidantes, inibidores da oxidação do LDL,inibidores da enzima β- hidroximetilglutaril Coa, aumento da excreção de saisbiliares, o que explica o seu efeito sobre o metabolismo do colesterol. Qiuyin etal, (1997), Oliveira et al, (2004).29

Quadro 2 - Valores médios de ferro, TGO e TGP em soro sanguíneo de coelhos tratados com bixina , comparados aogrupo doente.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOFerro (mg/dL) TGO (UI /dL) TGP UI/dLG1- Ração + Colesterol e ácido cólico 225,38 A 0 34,43 A 0 40,10 A 0G2- Ração 300,00 B +33 59,67 B +73 153,33 B +282G3- Ração + C + AC. C + BIXINA 4% (0,5ml) 304,23 B +35 27,56 A -20 100,11 B +150G4- R + AC. C + BIXINA 4% (1,0mL) 301,71 B +34 65,50 B +90 171,66 B +328G5- R + C. + AC. C. + BIXINA 4% (1,5mL) 173,73 A -23 162,75 B +373 107,40 B +168G6- R + C + AC + BIXINA 5% (0,5mL) 196,93 A -13 100,33 B +191 165,16 B +312G7- R + C + AC + BIXINA 5% (1,0mL) 262,93 B +17 53,00 B +54 83,50 B +108G8- R + C + AC + BIXINA 5% (1,5mL) 182,00 B -19 152,33 B +342 122,50 B +205G9- R + C + AC + BIXINA 10% (0,5mL) 191,43 B -15 127,00 B +269 75,66 B +89G10- R + C + AC + BIXINA 10% (1,0mL) 208,83 A -7 46,00 A +34 82,22 B +105G11- R + C + AC + BIXINA 10% (1,5mL) 257,85 A +14 190,66 B +454 190,67 B +375Teste de Dunnett a 5 % de significância, letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.30

De acordo com os resultados obtidos no Quadro 2, foi observado que ostratamentos com os grupos 3, 4, 7 e 11 tiveram aumentos no nível de ferro,sendo o grupo 3 (bixina 4% na dose de 0,5mL) o que expressou o maioraumento. Já os grupos 5, 6, 8, 9 e 10 tiveram reduções. No entanto o grupo 5apresentou a maior percentagem de redução de ferro em -23%. Os resultadosobtidos nos grupos 7, 7 e 9 foram estatisticamente significativos em relação aoquadro 1. Também, os tratamentos com os grupos 3 e 4 foram estatisticamentesignificativos quando comparados com o grupo 1. Isto é uma vantagem, umavez que estes dois grupos (3 e 4) apresentaram valores de ferro, bem próximosao valor normal. O grupo 1 hiperlipidemico teve uma variação de 33% emrelação ao grupo 2 (normal). O íon ferro faz parte da estrutura da proteínahemoglobina, proteína transportadora de O 2 e CO 2 no organismo e tambémparte da estrutura de proteínas da cadeia respiratória. Portanto reduzir esteparâmetro não é interessante a não ser em doenças como a hemosiderose.Para a enzima TGO a qual, as concentrações de ferro são elevadas noorganismo observou-se um aumento na atividade em todos os tratamentos comexceção do grupo 3 que reduziu -20%. O tratamento do grupo 5 provocou umaumento na atividade da enzima de 373% e o tratamento do grupo 11 de454%.Normalmente o aumento na atividade de TGO e TGP sugere danosteciduais, hepáticos e problemas cardiovasculares. Para este parâmetrosugere-se menores doses de bixina.As transaminases catalizam a interconversão de aminoácidos e alfacetoácidopor transferência do grupo amino. As duas transaminases deinteresse clinico são de glutamato-oxaloacetato (GOT), também chamada deaspartato- transaminase (AST), e a glutamato-piruvato (GPT), tambémchamada alcalina-transaminase (ALT). Miller et al., (1999)Um aumento das amino-transferases, ocorre em doenças hepatobiliareshepatite viral aguda, com aumento de até 100 vezes, cirrose hepática comaumento de 5 vezes, mononucleose infecciosa com aumento de até 20 vezes,infarto do miocárdio em humanos a TGO varia de 20 a 200U/mL entre18 e 24horas, na distrofia muscular elevações de 4 a 8 vezes na atividade da TGO,.Motta, (2003).31

Com relação à TGP, também se observou aumento da atividade emtodos os grupos, mas apenas os grupos 4, 5, 6, 8 e 11 tiveram estesparâmetros acima do valor normal do grupo 2. Novamente observou-se que omaior aumento de +375% na atividade de TGP ocorreu no grupo 11. Asenzimas TGO e TGP são enzimas que realizam a transaminação deaminoácidos e, portanto, sempre tem sua atividade aumentada em danosteciduais. Quando sua atividade aumenta muito, há alta produção de amônia apartir de aminoácidos e isto sobrecarrega o fígado que precisa metabolizar aamônia para uréia. A amônia é extremamente tóxica para as células e precisaser convertida em uréia no fígado para que ocorra sua eliminação, quando estáem excesso o fígado não consegue metabolizar tudo. No rim ela é eliminadatambém como cloreto de amônio.32

Quadro 3 - Valores médios de fosfatase alcalina e gama-GT em soro sanguíneo de coelhos tratados com bixina,comparados ao grupo doente.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOfosfatase alcalina (UI/dL)gama gt (UI/dL)G1- Ração + Colesterol e ácido cólico 217,16 A 0 9,95 A 0G2- Ração 250,67 A +7 17,50 B +76G3- Ração + C + AC. C + BIXINA 4% (0,5ml) 260,68 B +36 26,73 B +169G4- R + AC. C + BIXINA 4% (1,0mL) 255,83 B +18 23,48 B +136G5- R + C. + AC. C. + BIXINA 4% (1,5mL) 202,41 A -7 25,26 B +154G6- R + C + AC + BIXINA 5% (0,5mL) 213,16 A -2 20,50 B +106G7- R + C + AC + BIXINA 5% (1,0mL) 185,00 A -10 14,00 B +41G8- R + C + AC + BIXINA 5% (1,5mL) 238,33 A +10 17,50 B +76G9- R + C + AC + BIXINA 10% (0,5mL) 292,83 B +35 23,17 B +133G10- R + C + AC + BIXINA 10% (1,0mL) 267,33 B +23 20,83 B +109G11- R + C + AC + BIXINA 10% (1,5mL) 312,66 B +44 41,50 B +317Teste de Dunnett a 5 % de significância, letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente– Bixina em diferentes doses e concentrações.33

De acordo com os resultados obtidos no quadro 3 observou-se que o maioraumento na atividade da enzima fosfatase alcalina ocorreu no grupo 11 tratadocom bixina a 10% na dose de 1,5ml. Um aumento na atividade desta enzimaocorre em desordens hepáticas e problemas cardiovasculares. A fosfatase alcalinaencontra-se elevada no raquitismo (aumento de 20 a 30 unidades), Doença dePaget (eleva na ordem de 50 unidades). Também aumenta a atividade nohiperparatireoidismo, icterícia obstrutiva, lieloma múltiplo, sarcoma osteogênico,dentre outras patologias. Na hepatite ocorrem alterações com níveis inferiores a10 unidades. Os valores da atividade de fosfatase alcalina podem estar 25% maiselevados após a ingestão da dieta rica em gordura. Motta, (2003).Nos resultados de gama-GT observou-se que o tratamento com o grupo 11tenha provocado o maior aumento na atividade desta enzima. Todos ostratamentos provocaram um aumento na atividade desta enzima. Esta agefavorecendo a entrada de aminoácidos para dentro da célula. Um aumentoexcessivo em sua atividade acarreta hipermetabolismo de aminoácidos altaprodução de NH 3, sobrecarrega o fígado em realizar o ciclo da uréia e outras rotasligadas aos aminoácidos A gama GT encontra sua maior concentração no tecidorenal, mas seu significado clínico refere-se principalmente às doenças de fígado edas vias biliares, nas quais exibe grande sensibilidade.O aumento da atividade das chamadas enzimas indicadoras de colestase(Gama–glutamiltransferase, fosfatase alcalina e leucina-aminopeptidase) deve-sepossivelmente a uma maior síntese destas enzimas no hepatócito, nos epitéliosdas vias biliares e também a um aumento simultâneo da permeabilidade celular aelas Os valores normais em humanos são de volume de 1 – 25UI/L. Miller et al.,(1999).34

6- CONCLUSÔESOs resultados evidenciados no trabalho de indução de hipercolesterolemiaem coelhos, onde se testou bixina a 4%, 5% e 10% nas doses 0m5mL, 1,0 mL e1,5mL, concluiu-se que:1- Todas as doses foram eficazes na redução do colesterol sanguineo emcoelhos, no entanto, a bixina a 10% com dose de 1,0 mL, reduziu em até 94%.Logo, formulações fitoterápicas ou de alimentos funcionais poderão ser lançadasno mercado como hipocolesterolemico;2- Apenas o grupo tratado com bixina a 10% e dose de 0,5 mL, foi capaz deaumentar o HDL em 27%, significativo dizer que este foi o melhor tratamento emrelação aos demais, uma vez que esta lipoproteína transporta o colesterol dacirculação para o fígado, onde é metabolizado;3- A bixina em todas as doses testadas não apresentou efeitohipotrigliceridemico;4- Em animais hiperlipidemico, o tratamento com bixina à 4% nas doses de 0,5mL e 1,0 mL, foram os tratamentos que mais aumentaram o nível de ferro nacirculação sanguínea em 35% e 34%, respectivamente;5- O tratamento com bixina 10% na dose de 1,5 mL foi o que mais influenciouo aumento da atividade de TGO e TGP em 454% e 375%, respectivamente;6- O tratamento com bixina 10% na dose de 1,5 mL foi o que mais influenciouo aumento das atividades das enzimas fosfatase alcalina e Gama GT em 44% e317%, respectivamente ;]7- Pode-se deduzir que bixina 10% na dose 1,5 mL foi tóxica para os animais35

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Experimento 02Corantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) no tratamento do câncerem animais.Camilo Flamarion de Oliveira Franco², Tânia Toledo de Oliveira³, Tanus Jorge Nagem 4 ,RESUMOO câncer, uma das mais importantes doença da humanidade, tem como fatores principais adieta incorreta, a predisposição genética e o ambiente em que vivemos, onde numerosassubstâncias estranhas são despejadas no meio ambiente diminuindo a qualidade do ar, daágua, do solo e consequentemente, dos alimentos. O trabalho foi desenvolvido no Laboratóriodo Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa –UFV. Minas Gerais, com o objetivo de obter um fitoterápico e/ou um suplemento alimentar,voltado ao tratamento do câncer em animais. O delineamento experimental utilizado foi o de blocosinteiramente casualizados com 48 (quarenta oito) tratamentos (ratos) com seis (06) repetições cada. Osanimais utilizados para o ensaio foram ratos wistar, com 45 dias de vida, provenientes do bioteri centralda Universidade Federal de Viçosa – UFV. Foram utilizados neste ensaio biológico experimental48 ratos da raça wistar, com 45 dias de vida. Os animais foram provenientes do BiotérioCentral do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Viçosa. Os ratos foramacondicionados em gaiolas individuais, onde permaneceram por um período de adaptação decinco (05) dias, recebendo ração PURINA e água “ad libitum”. Para indução do câncer de pelefoi utilizado o carcinogênico químico DMBA (7,12-dimetil bezantraceno). Foi dissolvido 25µg deDMBA em 0,1 mL de acetona e administrado 2 vezes por semana através de pinceladas napele do dorso do animal após a retirada de pelos, durante seis semanas, á exceção do grupoGrupo 1. Para testar a redução da patologia foram utilizados 08 tratamentos.Durante 06 semanas os animais receberam a ração e os tratamentos diários por via oral, sendoque os tratamentos por cavagem. Ao final do experimento houve a coleta de sangue pelo plexoretro orbital para que fossem feitas análises de Proteína Total, Colesterol, Triglicerídeos,Glicose, Fosfatase Alcalina e Albumina. O material foi centrifugado em centrífuga Excelsa 2205 N a 7.100 X g, durante 15 minutos, para obtenção do soro. As dosagens sorológicas foramefetuadas em equipamento multiparamétrico de Bioquímica Alizé, Mod Lisabio B.652 e kits damarca Bioclin e os resultados expressos em mg/dl e os resultados expressos em mg/dl. Aindaforam coletadas amostras de pele para análises histopatologicas.Palavras – Chave: Neoplasia, carcinogênese, tumor, mutações, oncogênese.41

1- INTRODUÇÃOCerca de 80 a 90% das neoplasias humanas são causadas por fatoresambientais. Reddy, (2003). O homem utiliza-se de fontes de energia e matériasprimas buscando o conforto e poder; porém, numerosas substâncias estranhassão despejadas no meio ambiente diminuindo a qualidade do ar, da água, dosolo e conseqüentemente, dos alimentos. Assim, fatores ambientais, estilo devida, componentes da dieta e contaminantes presentes nos alimentos podeminfluenciar na incidência do câncer.O câncer pode ser causado por um dos três fatores, como dietaincorreta, predisposição genética e ambiente. Mais de 35% de todos oscânceres está associado com dieta incorreta e no caso de câncer de cólon,essa percentagem sobe para 80%. Quando se adiciona consumo de álcool ecigarro à dieta ocorre um aumento de 60%. Predisposição genética do câncerestá associada a 20% dos casos. Os carcinógenos ambientais incluem,poluição do ar e água, radiação e medicamentos. Reddy, (2003).Caracterizado por instabilidade genética. O desenvolvimento do câncer élevado pelo acúmulo de trocas no DNA de aproximadamente 40.000 genescromossomais. Baak, (2003). Os tumores são causados por mutações queativam oncogenes e suprimem genes supressores de tumor.2- OBJETIVOS2.1- OBJETIVO GERALObter um fitoterápico e/ou um suplemento alimentar, voltado aotratamento do câncer em animais2.2. Objetivos Específicos2.2.1. Testar concentrações de bixina lipossolúveis nos porcentuais de 4%;5% e 10% em doses de modelos animais com câncer induzido;2.2.2. Testar concentrações de flavonóides (Rutina) em modelos animais comcâncer induzido;42

2.2.3. Analisar no soro sanguíneo em ratos, colesterol total, colesterol HDL,triacilgiceróis, transaminase glutâmico oxaloacético (TGO),transaminase glutâmico pirúvica (TGP), fosfatase alcalina, gama GT eferro, para mensurar os efeitos cancerígenos dos flavonóides ecarotenóides;2.2.4. Avaliar nos parâmetros sanguíneos com câncer induzidos por 7,12-dimetil bezantraceno (DMBA) proteína total, colesterol, triglicerídeos,glicose, fosfatase alcalina e albumina, em ratos com câncer induzido;2.2.5. Viabilizar o uso de carotenóides e flavonóides, de acordo com osresultados de hematologia em animais com câncer induzido,2.2.6. Analisar a histopatologia do fígado, intestino, rim e pele, na perspectivade avaliar os efeitos na metástase, adesão e morte de células tumorais;3- REVISÃO BIBLIOGRÁFICAAs células cancerosas são definidas por duas propriedades hereditárias:estas e sua progênie (1) se reproduzem em detrimento das normais e (2)invadem e colonizam territórios normalmente reservados para outras células.Uma célula que não prolifera mais do que suas vizinhas normais não provocamdanos significativos, mas se sua proliferação está fora de controle irá originarum tumor ou neoplasma, ou seja, um crescimento descontrolado de umamassa de células anormais. Alberts, (1997). Por definição, neoplasia é “umamassa anormal de tecido cujo crescimento excede e não está coordenada aocrescimento dos tecidos normais e que persiste mesmo cessada a causa que aprovocou”. Baak, (2003). A medida que células neoplásicas permanecemagrupadas numa massa única, o tumor é dito benigno e a cura completa podeser obtida pela remoção da massa cirurgicamente. Um tumor é consideradocomo câncer somente se for maligno, se as células tiverem o poder de invadirtecidos vizinhos. A capacidade de invasão geralmente implica na habilidade deescapar, entrar na corrente sanguínea ou vasos linfáticos e formar tumoressecundários ou metástases em outros locais do corpo. Quanto maismetástases um câncer for capaz de produzir, mais difícil a sua erradicação.Alberts, (1997).43

Neoplasia literalmente significa “crescimento novo”, e o que cresceurecentemente é um neoplasma ou um tumor. Câncer é o termo comum paratodos os tumores malignos.As características que diferenciam neoplasias benignas e malignaspodem convenientemente ser discutidas sob quatro aspectos: (a) diferenciaçãoe anaplasia; (b) taxa de crescimento; (c) invasão local; (d) metástase.Diferenciação e anaplasia: Diferenciação refere-se ao grau desemelhança entre as células neoplásicas e as células normais comparáveistanto morfológica quanto funcionalmente. Em geral, os tumores benignos sãobem diferenciados. Os neoplasmas malignos compostos de célulasindiferenciadas são ditos anaplásicos, pois, literalmente no sentido da palavra,“regridem”, indicando uma reversão de um alto nível de diferenciação para umnível inferior. A falta de diferenciação ou anaplasia é marcada por váriasalterações morfológicas e funcionais como pleomorfismo (variação de tamanhoe forma tanto das células como dos núcleos), os núcleos apresentam umaabundância de DNA e são normalmente escuros (hipercromáticos). A formanuclear é geralmente muito variável, e a cromatina freqüentemente estáaglomerada e distribuída ao longo da membrana nuclear. Grandes nucléolosgeralmente estão presentes nestes núcleos. Os tumores indiferenciados emgeral possuem um grande número de mitoses, refletindo a maior atividadeproliferativa das células parenquimatosas.Taxa de crescimento: Em geral a maioria dos tumores benignos crescelentamente durante um período de anos, enquanto a maioria dos câncerescresce rapidamente, às vezes a uma velocidade descontrolada, eventualmentese espalhando e matando seus hospedeiros.Invasão local: A maioria dos tumores benignos cresce como massascoesivas em expansão, permanecendo situadas em seu local de origem, sem acapacidade de se infiltrarem, invadirem ou metastatizarem para locaisdistantes, como ocorre nos tumores malignos, nos quais o crescimento éacompanhado de infiltração progressiva, invasão e destruição do tecido vizinho(Figura 1).44

Fonte: Alberts, (1997).Figura 1- Contraste entre um tumor benigno glandular (adenoma) e umtumor maligno glandular (adenocarcinoma).3.1. MetástaseMetástaseAs metástases inequivocamente marcam um tumor como malignoporque os neoplasmas benignos não metastatizam. A invasividade doscânceres permite que eles penetrem nos vasos sangüíneos, linfáticos ecavidades corpóreas, tendo assim a oportunidade de se espalharem. Cotran,(2000); Alberts, (1997).O processo de metástase é o resultado de uma série de eventoscomplexos. Tanaka, (2003). Uma metástase é definida como crescimento deuma ou mais células neoplásicas, ocorrendo a uma distância específica dotumor primário. É a transferência de uma doença de um órgão ou parte paraoutro não diretamente conectado àquele. Coleman, (2001a). A habilidade deinvadir e metastatizar é característica única e somente de neoplasmasmalignos. Tumores benignos não sofrem metástases. Cotran, (2000). Ametástase envolve a liberação de células de um tumor primário, disseminaçãoa sítios distantes preso na microcirculação de órgãos, extravasamento einfiltração dentro do parênquima dos órgãos e sobrevivência e crescimentodentro de uma nova colônia de tumor.45

3.2. Patogênese da metástaseInvasão – as células cancerosas podem disseminar através depropagação direta ou migração através de cavidades. Todavia, as rotas dedisseminação geralmente são secundárias envolvendo sistema circulatóriosanguíneo e linfático. Invasão e infiltração dentro de tecidos que envolvem otumor primário levam à penetração nos vasos sanguíneos, linfáticos, ou ambos,e assim se tornam bem difundidos. Cotran, (2000). As células cancerosaspossuem organelas necessárias para locomoção ativa, importante no processode invasão. Estudos revelaram a presença de enzimas destruidoras de tecidosno processo de invasão do tumor, como hidrolases lisossomais e colagenases.A destruição dos tecidos por estas enzimas, adicionado a oclusão de vasoslinfáticos e sanguíneos mediado pela expansão da massa do tumor podefacilitar a infiltração do neoplasma. Tsuchiya, (2003). A produção e secreção deserino-proteases e ativador de plasminogênio têm sido associadosneoplasmática de uma variedade de tipos de células. A invasão de tecidosnormais e a penetração da membrana vascular basal por células metastáticaspodem requerer participação ativa de enzimas hidrolíticas. A penetração nosvasos sangüíneos durante a invasão e extravasamento é o ponto de crucialimportância na metástase. Tanaka, (2003).Disseminação direta – tumores que crescem ou penetram nascavidades do corpo podem irradiar células ou embolia que “trafegam” emcavidades e superfícies de outros órgãos. Tanaka, (2003). A habilidade dascélulas neoplásicas de adesão não pode ser indicativo de habilidade deinvasão. Alberts, (1997).Disseminação linfática – o transporte através dos vasos linfáticos é opasso comum para o processo de disseminação inicial de carcinomas, mas ossarcomas também podem se disseminar por essa via. Cotran, (2000). Durantea invasão da célula neoplásica, o processo de infiltração e expansão dentrodos tecidos resulta na penetração de pequenos vasos linfáticos Tsuchiya,(2003). Estudos evidenciam que células neoplásicas podem passar livrementeentre vasos sanguíneos e linfáticos Tanaka, (2003).Disseminação hematológica – Nesse passo é típico de sarcomas, maspode ser usado por carcinomas Cotran, (2000). O primeiro passo das46

metástases é a degradação de membranas basais e matriz extracelular, masas células dos neoplasmas malignos frequentemente penetrando em pequenoscapilares, mas raramente conseguem invadir artérias e arteríolas ricas em fibraelástica. Uma vez as células neoplásicas penetradas nos vasos sanguíneos,elas são carreadas passivamente ou desenvolvem e crescem até um sítio depenetração e somente então, liberam as células dentro da circulação. Noentanto a presença de células neoplásicas na circulação não é constituinte demetástase. Muitas células liberadas dentro da circulação sanguínea sãoeliminadas rapidamente; muitas são destruídas dentro do sistema circulatório eaparece um grande número de células liberadas pelo tumor primário, e há umagrande probabilidade de muitas destas células sobreviverem com a metástase.As células neoplásicas podem agregar com outras (agregação homotípica) ououtro tipo de célula (agregação heterotípica) como plaquetas e linfócitos. Aformação de embolia multicelular pode fazer com que as células neoplásicassobrevivam na circulação e estabilizem o crescimento secundário Tanaka,(2003).Assim, a capacidade de formar metástase é que torna o câncer difícil deser erradicado cirurgicamente ou por irradiação localizada. Para sua ampladisseminação pelo corpo, uma célula típica de um tumor sólido deve ser capazde diminuir suas adesões ás vizinhas escapar do tecido de origem, migrar poroutros tecidos até alcançar os vasos sangüíneos ou linfáticos, atravessar alâmina basal e o revestimento endotelial dos vasos de forma a entrar e sair dacirculação em outro local do corpo, sobreviver e proliferar em novo ambiente.Por exemplo, em vários carcinomas que se tem estudado há perda de adesãoàs células vizinhas de um epitélio dependente da perda de expressão de umamolécula de adesão célula-célula, mas a capacidade de invasão, através dostecidos parece depender da produção de enzimas proteolíticas que podemdigerir a matriz extracelular. As etapas finais da metástase são provavelmenteas mais difíceis: muitos tumores liberam grandes quantidades de células nacirculação, mas somente uma proporção menor destas células tem sucesso naformação de colônias metastáticas.Células tumorais que tenham entrado em um vaso linfático,freqüentemente, ficam presas nos linfonodos ao longo do caminho, dando47

origem as metástases. As mutações envolvidas no desenvolvimento do câncer,ocorrem ao acaso na população inicial do tumor: somente aquelas poucascélulas que adquirem as propriedades necessárias para formação demetástase e que se alojam em ambiente adequado serão capazes de produzirtumores secundários. De acordo com este conceito de evolução, através devariação ao acaso e seleção natural, as células de um único tumor sãoheterogêneas na capacidade de formar metástases.A compreensão dos mecanismos moleculares da formação demetástase poderia, eventualmente, permitir um esquema de tratamento parabloquear o tumor. Algum progresso tem sido feito neste sentido. Tem sidomostrado, por exemplo, que para células tumorais atravessarem a lâmina basaldevem possuir integrinas apropriadas para atuarem como receptores delaminina, que permitem às células aderirem á lâmina, e devem possuir em suasuperfície colagenase tipo IV, que ajuda a digerir a lâminina. Anticorpos eoutros reagentes que bloqueiam a ligação á lâminina ou a atividade dacolagenase tipo IV demonstram bloquear a formação de metástases emanimais experimentais Cotran, (2000); Alberts, (1997).As células dos diversos órgãos do nosso corpo estão constantemente sereproduzindo, isto é, uma célula adulta divide-se em duas, e por este processo,chamado mitose, vai havendo o crescimento e a renovação das células duranteos anos. A mitose é realizada controladamente dentro das necessidades doorganismo. Porém, em determinadas ocasiões e por razões aindadesconhecidas, certas células reproduzem-se com uma velocidade maior,desencadeando o aparecimento de massas celulares denominadas neoplasiasou, mais, comumente, tumores.Nas neoplasias malignas o crescimento é mais rápido, desordenado einfiltrativo; as células não guardam semelhança com as que lhes deram origeme tem capacidade de se desenvolver em outras partes do corpo, fenômeno estedenominado metástase, que é a característica principal dos tumores malignos.Como procedimentos auxiliares no diagnóstico temos:- Ultra-sonografia;- Exame citológico (punção aspirativa com agulha fina e citologia);- Exame histopatológico (biopsia)48

3.3. Exame histopatológicoTrata-se do estudo dos tecidos do organismo ao microscópio. O examehistopatológico é o que permite afirmar com segurança a natureza de umalesão. No exame citopatológico estudam-se as células desprendidas de seuslocais de origem, os tecidos. No exame histopatológico o que se examina é umfragmento da estrutura, avaliando-se, então, toda a composição do tecido. Porisso, o exame histopatológico é o mais preciso.A obtenção do material pode ser feita através de uma pequena cirurgia,chamada biopsia a céu aberto. Dependendo do caso, retira-se todo o nódulo outumor, ou apenas uma parte sua.TratamentosExistem outros tipos de tratamentos que podem ser associados ou nãoao cirúrgico, dependendo de cada caso, tais como a quimioterapia, aradioterapia, a hormonioterapia e a imunoterapia.Quimioterapia - Este método utiliza quimioterápicos que são compostosquímicos que atuam diminuindo a multiplicação celular e, conseqüentemente, aexpansão dos tumores. Os quimioterápicos afetam também as células normais,porem acarreta maior dano às células malignas.Radioterapia – Método capaz de destruir as células tumorais peloemprego de radiações ionizantes, a radioterapia atua local ou regionalmente,podendo ser indicada de forma exclusiva ou associada a outros terapêuticos.Hormonioterapia - Consiste na utilização de hormônios que impedem ocrescimento das células tumorais.Imunoterapia – É a utilização de substâncias que modificam a respostado sistema imunológico do organismo. Estes dois últimos tipos de tratamentotêm sido utilizados como possíveis opções em casos selecionados. Osprodutos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos remotos. Abusca por alívio e cura de doenças consumo de plantas medicinais talvez tenhasido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. A históriado desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental é rica em exemplosda utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas em49

plantas e mecanismos de defesa, merecendo destaque a civilização Egípcia,Greco-romana e Chinesa. A medicina tradicional chinesa desenvolveu-se comtal grandiosidade e eficiência que até hoje muitas espécies e formuladosvegetais mundiais são estudados na busca pelo entendimento de seusmecanismos de ação e no isolamento dos princípios ativos.Devido à atribuição de critérios mais rigorosos na avaliação doscomponentes da dieta e ao desenvolvimentos de novas metodologias, cadavez mais são encontrados agentes mutagênicos e/ou carcinogênicos presentesnos alimentos. Evitar totalmente seu consumo seria, teoricamente, possível,mas na prática é difícil devido à sua quantidade e variedade. O flavonóidesquercetina, o benzil-isotiocianato são exemplos de compostos naturaismutagênicos presentes em alimentos Gaspar et al., (1993); Musk et al.; (1995).Diversos aditivos para alimentos, tais como aspartame Shephard et al., (1993)e bromato de potássio Awogi et al., (1992), têm apresentado efeitosmutagênicos em diferentes modelos experimentais. Os hidrocarbonetospolicíclicos aromáticos, como o benzo [a] pireno e as nitrosaminas, sãoexemplos de compostos mutagênicos e carcinogênicos, formados durante ocozimento de carnes, peixes e gorduras Skog et al., (1998). Na tabela 1encontram-se alguns exemplos de corantes com ação mutagênica.O potencial antimutagênico de uma substância pode ser avaliado emsistemas biológicos diversos, os mesmos empregados para o estudo eidentificação dos agentes mutagênicos. Os sistemas celulares de mamíferos,utilizados para a avaliação da mutagenicidade e/ou antimutagenicidade,abrangem os testes in vitro e in vivo. Nos testes in vivo são utilizadosfreqüentemente ratos e camundongos. Nos testes in vitro são usadasdiferentes linhagens celulares, inclusive células humanas. Outrosmicroorganismos, como as bactérias no teste. de Ames, também são usadosna avaliação do potencial antimutagênico.Em qualquer um dos sistemas-teste, o tratamento com os agentesmutagênicos, que induzem as mutações, ou com os antimutagênicos, quepermitirão inibir o aparecimento de lesões no DNA, pode ocorrersimultaneamente ou em momentos diferentes por meio de pré- ou póstratamentocom estes compostos. Os agentes antimutagênicos usados em prétratamentoou tratamento simultâneo podem atuar como agentes não50

mutagênicos. A efetividade do agente antimutagênico no pós-tratamentosugere que ele esteja atuando pelo mecanismo de bio-antimutagênese e estárelacionado ao processo de reparo das mutações, como acontece com avanilina, por exemplo, Sasaki et al., (1987) ou com o ácido tânico Sasaki et al.,(1988). Muitos compostos antimutagênicos encontrados nos alimentos sãoagentes antioxidantes e atuam seqüestrando os radicais livres de oxigênio,quando administrados como pré-tratamento ou nos tratamentos simultâneoscom o agente que induz as mutações no DNA.51

Tabela 1 Resultados experimentais de testes de atividade mutagênica e antimutagênica em corantes sintéticos e naturais.Atividade mutagênicaTipo(Natural ou Sintético)Sistema Teste*ReferênciasAmarantoCochonilhaCúrcumaCurcuminaC.I. orange5TartrazineVermelho KokunAditivoAditivoIngredienteAditivoAditivoAditivo3; 5; 7; 8929132; 4; 5; 62Giri (1991)Ishidate (1984)Mukhopadhyay et al. (1998)Araújo et al. (1999)Moller et al. (1998)Giri et al. (1990)Agarwal et al. (1994)Atividade AntimutagênicaTipo(Natural ou Sintético).TipoSistema Teste*ReferênciasBixina-CarotenoCurcuminaEritrosinaAditivoNaturalAditivoAditivo3; 5231Thresiamma et al. (1996)Salvadori et al. (1992)Thresiamma et al. (1996)Lakdawalla & Netrawali (1988)(*) 1 = Teste de Ames; 2 = Camunndongos (aberração cromossômicas); 3 = Camundongos (Sister Chromatid Exchange, SCE); 5= Ratos (aberração cromossômicas); 6 = Ratos (SCE); 7 = Células CHO (aberração cromossômica); 8 = Linfócitos in vitro(aberração cromossômica)52

3.4. Epidemiologia do câncerA epidemiologia pesquisa a distribuição das várias formas de câncerentre a população, a observação e análise das variações de sua ocorrência emdiferentes grupos ou comunidades, e os fatores de risco a que eles se expõem.Mediante a correlação existente entre os dados de morbidade e mortalidade eas diferenças verificadas nas condições ambientais, hábitos de vida ou deconstituição genética, observadas entre esses grupos, é possível seestabelecerem hipóteses sobre as prováveis causas do câncer.Como este não representa uma única moléstia, mas sim um processocomum a um grupo de doenças que diferem em sua etiologia, freqüência emanifestações clínicas, é necessário estabelecer critérios de classificação parao seu estudo. Usualmente, em Cancerologia, utilizam-se classificaçõessegundo a localização primária, o tipo histopatológico e a extensão anatômicados tumores.Os estudos comparativos de freqüência do câncer devem considerarsempre a cobertura e a qualidade dos serviços de diagnóstico, na medida emque as variações observadas entre as diferentes regiões do território nacionalpodem refletir apenas esses componentes. A comparabilidade dos dadosdependerá sempre também da utilização uniforme dos critérios adotados emdiferentes regiões, instituições e, até, entre profissionais de um mesmo serviçode saúde.Conceitos e definiçõesPara se medir a freqüência das doenças e a mortalidade por elasprovocada, utilizam-se taxas, ou coeficientes, que têm três elementosessenciais:- O grupo de população exposto ao risco de adoecer, ou morrer;- O fator tempo- O número de casos, de doenças, ou de mortes ocorridos na populaçãoexposta, em certo período de tempo.Assim, a taxa de mortalidade geral por câncer é expressa pela seguinteequação:53

Taxa de mortalidade número de mortes por câncer/ano= ________________________________ X 100.000Geral por câncer número de pessoas expostas ao riscode morrer por câncer no anoAs taxas de mortalidade podem ser especificas para váriascaracterísticas, tais como sexo, idade, tipo ou localização de tumores, etc.,permitindo comparações entre diferentes subgrupos de uma mesmapopulação.A morbidade pode ser expressa pelas taxas de incidência e prevalência,assim definidas:número de novas mortes da doençaem um período de tempoTaxa de incidência = _______________________________ X 100.000número de pessoas expostas ao risco dedesenvolver a doença no mesmo períodonúmero de casos da doença existentesnum determinado momentoTaxa de prevalencia = _______________________________ X 100.000População médianesse determinado momentoA incidência expressa de uma determinada população desenvolver umadoença. A prevalência é a quantidade de casos existentes de uma doença(casos novos e antigos), relacionando-se, portanto, com a incidência e com aduração da doença. Doenças agudas e fatais como a raiva, por exemplo, têm,assim, incidência e prevalência semelhantes.As taxas são utilizadas para comparar dados de diferentes populações.Entretanto, a análise comparativa entre taxas deve ser cuidadosa. Diferençasentre elas podem refletir, por exemplo, apenas diferenças na composição etáriadas populações estudadas. Por esta razão, utiliza-se o recurso dapadronização de taxas por idade, visando a anular o efeito, neste caso, dadiferença observada na estrutura etária das populações. A padronização das54

taxas por idade permite a comparabilidade dos coeficientes de distintosregistros ou países, mesmo que as populações tenham diferentes distribuiçõesetárias.A Agência Internacional Para Pesquisa Sobre o Câncer (IARC), em suaspublicações sobre a incidência do câncer nos cinco continentes, tem adotadotrês populações-modelo de padronização: africana, mundial e européia. Aprimeira é representativa de uma população jovem; a terceira típica de umapopulação velha; enquanto a segunda representa um padrão intermediárioentre os dois extremos de modelos.Para limitar-se a influência da idade, também pode ser usada acomparação restrita ao grupo etário compreendido entre 35 e 64 anos,compondo-se a chamada população truncada.3.5. Mutagenicidade de corantes para alimentosUm dos corantes naturais mais conhecidos é a bixina, usada comocorante em manteigas, queijos, margarinas e outros alimentos. Este coranteapresentou ação antimutagência, reduzindo as freqüências de micronúcleos ede aberrações cromossômicas, induzidas pela radiação-gama, nas células damedula óssea de camundongos e em linfócitos de ratos em cultura.Thresiamma et al., (1996); Thresiamma et al., (1998).3.6. BixinaA cis-bixina (monometiléster do diácido carboxílico (norbixina) é oconstituinte que ocorre em maior concentração no arilo da semente do urucum(Bixa orellana L.), representando cerca de 80% da bixina presente. Além doisômero cis (metil-hidrogênio 9’-cis-6,6’diapocaroteno 6,6’dioato), também estápresente a forma trans, sendo este mais estável que o isômero cis. A transisomerização acontece parcialmente quando o pigmento é submetido aprocesso de aquecimento. Galindo-Cuspinera, (2002).55

Quando submetida à hidrólise em meio alcalino, a bixina perde umamolécula de metanol produzindo a norbixina, pigmento de cor vermelhointensa.São poucos os carotenóides carboxílicos conhecidos. Além da bixina,foram identificados a crocetina, nas flores (estames) do açafrão (Crocus sativusL.), uma iridáceae e a azafranina na raiz do açafrão da terra (curcuma longa)uma zingeberáceae. Karrer e Jucker, (1950) ; Jaramilo, (2003). Os pigmentosextraídos destas espécies, da mesma forma como aqueles do urucum têmgrande aplicação na indústria de alimentos.Segundo Jondiko e Patteenden, (1989), a bixina foi o primeiro ciscarotenóide isolado a partir de fontes naturais. Fazem parte ainda da famíliarelativamente pequena dos apocarotenóides naturais cuja formação se dá viadegradação oxidativa dos carotenóides C : a crocetina, o β-apo-10’-carotenal,40a β- citraurina e o ácido abscíssico.Na Figura 2 são apresentadas as estruturas moleculares da cis e transbixina, cis e trans norbixina e o principal produto corado de decomposição(monometil éster do ácido 4, 8, dimetil tetradecahexaenedióico) freqüentementedesignado por C17.56

Figura 2 - Estrutura dos carotenóides bixina e norbixina, cis e trans e do principalproduto de degradação. Fonte Scotter (1995).A bixina, devido ao seu crescente consumo, tem despertado interessede pesquisadores, no sentido da busca por uma fonte alternativa para a suaprodução. Embora o mecanismo de biossíntese desta substância ainda nãotenha sido elucidado. É sustentado que o carotenóide C40, maisprovavelmente o licopeno, seja o precursor da bixina. Com base na estruturasimilar entre a bixina e a crocetina, pigmento do açafrão, a reação poderiaenvolver a metil transferase e a dehidrogenase em uma série de reaçõesprecedidas seqüencialmente pelo licopeno. A suposta rota é sustentada pelaanálise de derivados de decomposição do licopeno que se encontramacumulados em traços na semente do urucum.57

Figura 3 - Rota proposta da biossíntese da bixina a partir do licopeno.Fonte: Jako et al, (2002).Citam os autores que conversão de 25% na reação de esterificação foiobtida quando realizada à pressão atmosférica e 50 % quando a pressão dosistema foi reduzida para 200mbar. Os experimentos foram conduzidos à 65º Cpor 144 h. A substituição da bixina pela norbixina reduziu a conversão de 50%para apenas 8%. A reação foi monitorada por Thin Layer Chromatography(CCD) empregando placa de sílica gel MERCK e fase eluente composta deuma mistura de clorofórmio/ metanol /ácido acético/água 80: 10: 8: 2, tendo58

apresentado os seguintes valores para o fator de retenção (Rf): 0,00 para oácido L-ascórbico, 0,36 para o éster de bixina, 0,8 para a norbixina e 0,94 paraa bixina.A obtenção destes derivados tem sido conduzida no sentido de melhorarsuas características de solubilidade, estabilidade ou mesmo com vistas apotencializar seu caráter antioxidante de forma a melhor adequar sua aplicaçãopara fins específicos. Tanto a bixina quanto a norbixina apresentam baixasolubilidade na maioria dos solventes. A bixina é normalmente empregada paraprodutos com base lipídica, enquanto que em produtos com base aquosaemprega-se freqüentemente a norbixina.59

Tabela 2. Efeito de carotenóides como agentes antioxidantes presentes nadieta e sobre a nefrotoxicidade provocada pelo antitumoral cisplatina emmodelos animais.Antioxidantes Sistema-Teste Resultados ReferênciasBixina Ratos Proteção Silva et al,(2001)Curcumina Ratos Proteção parcial Antuneset al,(2001)Glutamina Ratos Proteção parcial Mora et al,(2003)Selenito de sódio Camundongos Proteção Baldew et al,(1989)Selenito de sódio Camundongos Proteção Shenberg et al,(1989)Selenito de sódio Ratos Proteção parcial Camargo et al,(2001)Selenito de sódio Ratos Proteção parcial Francescato etal, (2001)Vitamina C Ratos Sem proteção Antunes et al,(2001)VitaminaE Ratos Proteção Antunes et al,(2000)Vitamina C e E Ratos jovens e Proteção Appenroth et al,adultos(1998)Estudos em animais experimentais têm demonstrado o potencialanticarcinogênico dos carotenóides da dieta, e sua capacidade de seqüestraros radicais livres, causadores do estresse oxidativo e é um carotenóide usadocomo corante para alimentos extraído do urucum (Bixa orellana). A bixina é umpotente inibidor da peroxidação lipídica. Esta foi testada em duas dosesdiferentes (2,5 ou 5,0 mg/kg de peso corporal) e inibiu de forma significativa aperoxidação lipídica e a depleção de glutationa renal induzidas pela cisplatinaem animais sacrificados 24h após a injeção do antitumoral cisplatina, Silva et al60

(2001). Neste estudo observou-se que a bixina agiu como um protetor danefrotoxicidade da cisplatina. Desde que o tratamento somente com a bixina foiseguro nas condições experimentais utilizadas, os resultados sugerem que abixina pode ter aplicações futuras na clínica como agente nefroprotetor àtoxicidade da cisplatina.Existem sólidas evidências, Baliga et al (1998) para sustentar a tese queos carotenóides provenientes da dieta (e não de suplementos) podem diminuiro risco de câncer pulmonar e de outras patologias, tanto que os derivados davitamina A, os retinóides, são promissores fármacos antineoplásicos,Hannemann, (1988) fenóis e carotenóides presentes em frutas e vegetaisvermelhos ou roxos (e sucos e vinhos).Os principais pigmentos que dão a cor vermelho-arroxeada às uvas ejabuticaba são os flavonóides antocianina e a quercetina, o carotenóidelicopeno e certos ácidos orgânicos. Trata-se de compostos fenólicos comelevada atividade antioxidante encontrados em diversos alimentos, Silva et al,(2001); Appenroth et al, (1997); Antunes et al, (2000). (Tabela 4).61

TABELA 3- Compostos carotenóides e flavonóides e suas fontes.CompostoFonteFlavonóides e ácidos fenólicoCatequinasChás, uvas e vinho tintoFlavonas e FlavonóidesFrutas cítricasFlavonóides (quercetina) Cebola, azeitona, chás, maça e vinhoAntocianinas e antocianidinas Cerejas, morangos, uvas, frutas coloridasÁcido cafeico e outrosUvas, vinhos, azeitonas, café, maças,tomates, ameixas e cereaisCarotenóidesα caroteno e β-carotenoBocaiúva, pupunha, vegetais verdesfolhudos, manga, cenoura, batatas,Licopenomanga, etc.ZeaxantinaPitanga, tomate e derivados, mamão,goiabaCriptoxantinaVegetais verdes folhosos, pequi, milho emLuteinalata, nectarina, pêssegos, etcCaju, mamão papaia, nectarina, pêssego,pequi, etc.Abóbora, abobrinha, vegetais verdesfolhudos, pimenta, etc.Fontes: Silva et al, ( 2001) ; Apperoth et al, (1997) ; Antunes et al, (2000).3.7. Frutas alaranjadas ou amareladasOs carotenóides são responsáveis por este tipo de coloração e pordiversas atividades biológicas, tais como: remoção do oxigênio singlete,remoção de radicais peroxila, modulação do metabolismo de carcinógenos,inibição da proliferação celular, - aumento da diferenciação celular (retinóides),estimulação da comunicação intercelular, aumento da resposta imunológica, ecapacidade de filtrar a luz azul. Sabe-se que o β-caroteno é capaz de protegero DNA contra a oxidação Umegaki et al, (1994).62

Os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ouna membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA)estão relacionados com o seu sítio de formação Anderson, 1996 ; Yu &-Anderson, (1997). Entre as principais formas reativas de oxigênio o O 2apresenta uma baixa capacidade de oxidação, o – OH mostra uma pequenacapacidade de difusão e é o mais reativo na indução de lesões nas moléculascelulares. O H 2 O 2 não é considerado um radical livre verdadeiro, mas é capazde atravessar a membrana nuclear e induzir danos na molécula de DNA pormeio de reações enzimáticas e produzir radicais livres Anderson, (1996).3.8. Estresse oxidativoA formação de radicais livres “in vitro” ocorre via ação catalítica dasenzimas, durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem nometabolismo celular e pela exposição a fatores exógenos (Tabela 4). Contudo,na condição de pró-oxidante a concentração desses radicais pode aumentardevido à maior geração intracelular ou pela deficiência dos mecanismosantioxidantes Cerutti, (1991,1994). O desequilibro entre as moléculas oxidantese antioxidantes que resulta na indução de danos celulares pelos radicais livrestem sido denominados de estresse oxidativo Sies, (1993).Tabela 4 - Fontes endógenas e exógenas de geração de radicais livres.EndógenasRespiração aeróbicaInflamaçõesPeroxissomosEnzimas do citocromoExógenasOzônioRadiações gama e ultravioletaMedicamentosDieta (compostos tóxicos)CigarroA ocorrência de um estresse oxidativo moderado, freqüentemente éacompanhada do aumento das defesas antioxidantes enzimáticas, mas aprodução de uma grande quantidade de radicais livres pode causar danos emorte celular (Anderson, 1996).63

Os danos oxidativos induzidos nas células e tecidos têm sidorelacionados com a etiologia de várias doenças, incluindo doençasdegenerativas tais como as cardiopatias, aterosclerose e problemaspulmonares (Quadro 2) Ames et al., (1993), Witzum, (1994), Roy & Kulkarni,(1996), Stahl & Sies, (1997). Os danos no DNA causados pelos radicais livrestambém desempenham um papel importante nos processos de mutagênese ecarcinogênese Poulsen et al., (1998).3.9. Estratégias de defesa antioxidanteA produção contínua de radicais livres durante os processos metabólicoslevou ao desenvolvimento de muitos mecanismos de defesa antioxidante paralimitar os níveis intracelulares e impedir a indução de danos Sies, (1993). Osantioxidantes são agentes responsáveis pela inibição e redução das lesõescausadas pelos radicais livres nas células. A célula produz enzimasantioxidantes como defesa.Uma ampla definição de antioxidante é “qualquer substância que,presente em baixas concentrações quando comparada a do substrato oxidável,atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira eficaz.” Sies & Stahl,(1995).3.10. Mecanismos de proteçãoOs antioxidantes são capazes de interceptar os radicais livres geradospelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre oslipídeos, os aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxospoliinsaturados e as bases do DNA, evitando a formação de lesões e perda daintegridade celular. Os antioxidantes obtidos da dieta, tais como as vitaminasC, E e A, os flavonóides e carotenóides são extremamente importantes naeliminação dos radicais livres.Outro mecanismo de proteção é o reparo das lesões causadas pelosradicais. Esse processo está relacionado com a remoção de danos da moléculade DNA e a reconstituição das membranas celulares danificadas.64

Em algumas situações pode ocorrer uma adaptação do organismo emresposta a geração desses radicais com o aumento da síntese de enzimasantioxidantes.O controle do nível das enzimas antioxidantes nas células éextremamente importante para a sobrevivência no ambiente aeróbico, Barnett& King, (1995). Os organismos eucariotos possuem enzimas antioxidantescomo a enzima superóxido dismutase, a catalase e a glutationa peroxidase quereagem com os compostos oxidantes e protegem as células e os tecidos doestresse oxidativo,Traber, (1997). Em adição aos efeitos protetores dosantioxidantes endógenos, a inclusão de antioxidantes na dieta é de grandeimportância e o consumo de frutas e vegetais está relacionado com adiminuição do risco do desenvolvimento de doenças associadas ao acúmulo deradicais livres, Pompella, (1997).3.11. Flavonóides e medicamentos no câncerA literatura indica que muitos produtos naturais são estudados comoagentes quimioprotetores contra cânceres de ocorrência mundial, Reddy,(2003). Os maiores grupos desses produtos são potentes antioxidantes efenólicos naturais. Esses produtos naturais são encontrados principalmente emfrutas e vegetais (Tabela 1) como também extratos de plantas e ervas Reddy,(2003). Muitos constituintes de plantas podem ser responsáveis por efeitosprotetores. Alimentos derivados de plantas contêm uma grande variedade defitoquímicos anticâncer com grande potencial bioativo que reduz asusceptibilidade ao câncer, Birt, (2001). Muitos desses constituintes podem sercompostos fenólicos ou polifenólicos como isoflavonas da soja, catequinas dochá, ésteres fenólicos no café, ácidos fenólicos no vinho tinto, quercetina emcebola Reddy, (2003). Dos muitos anticarcinógenos detectados em plantascomestíveis, os antioxidantes - vitaminas C e E e a pró-vitamina -caroteno têmrecebido uma grande atenção. Flavonóides e isoflavonóides são especialmentepromissores candidatos na prevenção do câncer Birt, (2001).65

3.12. FlavonóidesFlavonóides são metabólitos secundários de plantas e definidosquimicamente como substâncias compostas por uma estrutura comum defenilcromanona (C 6 -C 3 -C 6 ) com substituição em uma ou mais hidroxilas,incluindo derivados, Birt, (2001).Flavonóides e Isoflavonóides ocorrem comumente como éster, éter ouderivados glicosídicos ou ainda uma mistura deles, Birt, (2001). Mais de 5000diferentes flavonóides têm sido descritos, Marchand, 2002; Yang, (2001). Emhumanos, flavonóides e isoflavonóides ocorrem somente através da ingestãodietética Birt, (2001). Os flavonóis são os mais abundantes flavonóides emalimentos. A quercetina, kaempferol e merecetina compõem os três maiscomuns flavonóis. Flavanonas são encontradas principalmente em frutascítricas e flavones em aipo Catequinas estão presentes em grande número dechás verde e preto e vinho tinto, antocianinas são encontradas em morango.Isoflavonas são encontrados quase exclusivamente em comidas derivadas dasoja. Marchand, (2002).Os flavonóides são usualmente absorvidos por difusão passiva, apósserem glicosilados e convertidos em agliconas. Marchand, (2002) porglicosidases em alimentos ou da mucosa gastrointestinal, ou da microflora docólon Yang, (2001). Após sua absorção, os flavonóides são conjugados nointestino delgado, fígado pela glucuronidação, sulfatação ou metilação oumetabolizados a pequenos compostos fenólicos Marchand, (2002); Yang,(2001).3.13. Flavonóide e câncerUm grande número de flavonóides e isoflavonóides Birt, (2001) tem sidomostrado por suprimir a carcinogênese em vários modelos animais Rashmi,(2003). Existe um considerável interesse nesses compostos que parecemexercer efeitos benéficos em mecanismos que envolvem a patogênese docâncer. Em recentes anos, uma considerável atenção tem sido dada àhabilidade desses compostos em inibir o ciclo celular, a proliferação celular, o66

estresse oxidativo e na indução da detoxificação de enzimas, apoptose e nosistema imune Birt, (2001).Flavonóides também possuem efeitos benéficos na bioativação decarcinógenos. Os flavonóides quercetina, Kaempferol e galangina e o flavonaapigenina estão associados com a inibição do citocromo P450 Marchand,(2002).Vários flavonóides (quercetina, apigenina e catequinas do chá) têm sidomostrado com atividade antiinflamatória por inibir cicloxigenase-2 (COX-2) einduzir a óxido nítrico sintase. Inflamações crônicas estão relacionadas naetiologia de um grande número de cânceres e inibidores COX-2 estão sendoestudados como agentes quimioprotetores contra câncer de cólon Marchand,(2002), Yang, (2001).Atividades antiproliferativas têm sido relacionadas com propriedadesanti-estrogênicas de certos flavonóides (isoflavonóides, quercetina). Genisteínae quercetina inibem a proteína tirosina quinase que está envolvida naproliferação celular. A apigenina, luteolina e quercetina têm sido relacionadaspor impedir ciclo celular e apoptose elo mecanismo dependente de p-53.Muitos dos efeitos biológicos dos fitoestrógenos, especialmente daisoflavona genisteína, inclui inibição da angiogênese – formação de novosvasos sanguíneos que ocorre como parte do crescimento e expansão detumores malignos; inibição da tirosina quinase que é responsável pelafosforilação de proteínas requeridas para regulação da função celular (incluindodivisão celular), inibição da enzima topoisomerase e outras enzimas envolvidasna transdução de sinais. Genisteína também inibe a autofosforilação doreceptor do fator de crescimento epidermal, que possui uma grande expressãona maioria dos tipos de câncer. Age também como antioxidante, que previnedano oxidativo ao DNA Mishra, (2003). A tabela 5 mostra alguns fitoquímicosassociados com a prevenção do câncer.67

Tabela 5 – Fitoquímicos associados com a prevenção do câncer.ClassefitoquímicosCompostos típicos Fontes alimentares Atividadesrelacionadas com aprevenção docâncerCarotenóides Alfa e beta caroteno, Vegetais e frutas Atividadelicopeno, luteína. verde escuro, antioxidante,vermelho e modulação doamarelo.metabolismo docarcinógeno,inibição daproliferação celular,da expressão dooncogene, benefíciono sistema imune.Polifenóis Ácidos fenólicos, Vegetais e frutas Inibe proliferaçãocurcumina, quercetina,celular, induzapigenina, naringenina,apoptose, inibehesperidina,passos decatequinas, reservatrol.transdução desinais, aumenta aresposta imune.Fitoestrógenos Isoflavonas Produtos derivados Alteraoda sojametabolismoestrogênico, diminuia atividade detirosina quinase,induz apoptose,Terpenos Monoterpeno Vegetais e frutas Aumenta a atividadedas enzimas da faseII, induz apoptose.Fonte: Greenwald, (2001)A seguir estão alguns dos mecanismos de ação em que os flavonóidesatuam como anticarcinogênicos. Para evitar os danos causados pelos ROS, o68

organismo desenvolveu vários mecanismos de defesa, isto é, potenciais deneutralização das ações dos radicais livres, chamados de antioxidantes.O mais efetivo passo na prevenção do câncer é bloquear a suainiciação, como por exemplo, prevenindo o dano ao DNA como resultado dosROS ou carcinógenos Manson, (2003).Estudos epidemiológicos têm mostrado a correlação entre consumoelevado de compostos fenólicos (flavonóides) e redução do risco de doençascardiovasculares como também redução de certos tipos de câncer Ferguson,(2001). Tem-se mostrado que muitos desses estudos mostram o efeito protetordessas substâncias Hollman, (1997).É de considerável interesse as sustâncias químicas (principalmentenaturais) em que podem proteger contra os ROS Surh, (2003). Flavonóidescomo flavonas, flavonois e isoflavonas têm ganhado uma atenção particulardevido ao potencial protetor contra o câncer Cai, (1997). Os flavonóides maisfrequentemente estudados são quercetina, luteolina, kaempferol, apigenina egenisteína. Os mecanismos em que eles possuem efeitos na prevenção docâncer não estão totalmente envolvidos Williams, (2004). Muitos estudossugerem que os flavonóides podem agir como antioxidante. ROS sãoconhecidos por causar dano oxidativo em moléculas como DNA e lipídios.Peroxidação de lipídios e oxidação de bases do DNA são consideradosimportantes marcadores biológicos no desenvolvimento do câncer, doençascardíacas e neurodegenerativas. Yokozawa, (1997). O desenvolvimento e adescoberta de artifícios que reduz o dano oxidativo podem contribuir naprevenção de câncer e outras desordens degenerativas em humanos Cai,(1997).Flavonóides e isoflavonóides podem proteger contra o câncer e/oudoenças cardíacas através da inibição do dano oxidativo Birt, (2001). Reddy(2003) relata que a propriedade antioxidante dos flavonóides faz com que elestenham a propriedade de inibir vários tipos de câncer.Numerosos mecanismos de ação para isoflavonóides têm sido sugeridospara inibição do processo de carcinogênese Watanabe, (2002). SegundoLambert (2003) a atividade antioxidante de polifenóis tem sido bem estudada invitro, mas a atividade antioxidante na prevenção do câncer in vivo está sendodifícil de ser estabelecida. Porém pesquisadores estudam os supostos69

mecanismos de ação da atividade antioxidante dos polifenóis. Williams, (2004);Weiss, (2003); Lambert, (2003) Provavelmente a atividade antioxidanteassociada dos flavonóides é a sua habilidade de “varrer” os radicais livresFerguson, (2001). Os polifenóis removem os radicais livres, rompendo a reaçãoem cadeia dos radicais livres na peroxidação de lipídios. Cai, (1997). Elestambém extinguem os ROS e nitrogênios gerados em sistemas biológicosLambert, (2003). Outro mecanismo antioxidante é que eles quelam metaiscomo ferro, íons e cobre, prevenido a participação deles em reações tipoFenton na geração de radicais hidroxil altamente reativos Yang, (2001).Isoflavonas como genisteína e daidzeína têm essa habilidade de quelar osradicais livres Djuric, (2001). Essas isoflavonas previnem a formação de 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina nas células, exposição do DNA aos oxidantes edano oxidativo ao DNA Wei, (1995).A mais importante contribuição para o aparecimento do câncer é o danooxidativo ao DNA. Se a célula contém DNA danificado antes que o DNA sejareparado, provavelmente resultará em uma alteração genética permanente nospassos da carcinogênese. Células do corpo que se dividem rapidamente sãomais susceptíveis a carcinogênese devido a menor oportunidade do DNA serreparado antes da divisão celular Reddy, (2003).A oxidação do DNA é, provavelmente, a causa mais importante demutações que potencialmente podem ser reduzidas por antioxidante dietéticoBirt, (2001). O mecanismo protetor de frutas e vegetais e nutrientesantioxidantes parecem envolver os estágios iniciais mais que os finais dacarcinogênese Reddy, (2003). Quercetina, luteolina e genisteína têm mostradocapacidade de inibir o dano oxidativo do DNA induzido por irradiaçãoultravioleta. Weiss, (2003).Experimentos em animais sugerem que dietas a base de soja inibemtumores de mama e fígado induzidos por radiação e produtos químicos Wei,(1995). Muitos estudos atribuem o efeito anticarcinogênico pelos inibidores deprotease de soja. Wei (1995) mostrou que após a inativação dos inibidores deprotease em autoclave, dietas a base de soja inibiram tumores de mamainduzidos por carcinógenos em ratos. Essa observação levanta a hipótese queisoflavonas de soja podem ser responsáveis pelo efeito anticarcinogênico dasoja. Genisteína é a mais abundante isoflavona de soja e tem sido identificada70

como potente inibidor de tirosina quinase in vitro Djuric, (2001). Genisteínatambém exibe propriedade antioxidante Wei, (1995).A propriedade antioxidante dos flavonóides foi o primeiro mecanismo deação estudado, em particular com relação ao efeito protetor contra doençascardiovasculares. Cai, (1997). Flavonóides tem mostrado ser altamente efetivoem “varrer” os diferentes tipos de moléculas oxidantes, incluindo oxigêniossimples e vários radicais livres que possivelmente estão envolvidos no dano aoDNA e na promoção do tumor Marchand, (2002).A atividade antioxidante de substâncias fenólicas e fitoquímicos foramatribuídas primeiramente aos grupos hidroxila sendo capazes de doar osátomos de hidrogênio na “varredura” dos ROOs Loo, (2003). Essa idéia temsido desenvolvida principalmente porque H 2 O 2 ou produtos da reação com OH,são essências para transdução do sinal e ativação de genes específicos quepromovem a proliferação de células cancerosas. Assim, a varredura dessesROS com substâncias fenólicas mostrou inibir esse processo celular econsequentemente a proliferação de células cancerosas Loo, (2003).In vitro, genisteína tem demonstrado possuir propriedades estrogênicas,antioxidante, inibição de topoisomerase II, tirosina quinase e angiogênese eindução da diferenciação celular. Existem estudos em que ela também inibiu ocrescimento de linhagens de células de próstata humana e de ratos Wang,(2002). Fitoquímicos de soja inibiu o crescimento de tumores de próstata emroedores onde o câncer de próstata foi induzido por linhagens de célulasinjetadas Greenwald, (2001).Certos polifenóis podem induzir a fase II de enzimas como glutationatransferase (GST), aumentar a excreção de espécies oxidantes ou induzirenzimas antioxidantes como as metalotioneína (metal ligado à proteína comatividade antioxidante) Ferguson, (2001). Os polifenóis também podem inibircitocromo P450 ou enzimas como cicloxigenase ou lipoxigenase que possuematividade oxidante Williams, (2004).A habilidade de certos polifenóis de se ligarem a minerais pode serbenéfica em muitos os casos, desde cobre e ferro pode iniciar a produção deradicais hidroxilas. Por exemplo, ácido tânico tem mostrado inibir a formaçãode radical hidroxila devido a capacidade de complexarem com íons ferro.Muitos polifenóis com função antioxidante exterminam os radicais livres e71

também podem quelar íons metálicos que são capazes de catalisar aperoxidação de lipídios Williams, (2004).3.14. Atividade Estrogênica e Anti-estrogênicaUm estudo prospectivo demonstrou uma redução positiva entre consumode soja e diminuição do risco de câncer de próstata. Mais recentemente, umestudo epidemiológico com homens de 59 países mostrou que uma dieta ricaem soja teve efeito protetor contra mortalidade por câncer de próstata Wills,(2003).Vários estudos têm investigado a relação entre isoflavonóides contidosem produtos derivados de soja e prevenção e/ou incidência de muitos tipos decâncer, incluindo mama e próstata Shirai, (2002). Estudos experimentais efisiológicos indicam que fitoestrógenos possuem um papel inibitório durante ainiciação e a promoção de fases do desenvolvimento do câncer Mishra, (2003).A população asiática que tradicionalmente consome dietas ricas emderivados de soja tem uma alta ingestão de fitoestrógenos Mishra, (2003), quesão compostos não-esteroidais derivados de plantas que possuem atividadeestrogênica Strauss, (1998). Essa população possui um alto nível plasmático eurinário de fitoestrógenos e uma baixa incidência de cânceres hormôniodependentescomo mama e próstata comparado com a população ocidentalMishra, (2003). Strauss, (1998), sugere que essas dietas ricas emfitoestrógenos podem prevenir contra doenças cardiovasculares, sintomas damenopausa e osteoporose pós-menopausa. A soja, então, tem sidorecomendada para controlar sintomas da pré-menopausa e como medidapreventiva para câncer de mama. O consumo de soja pode proteger contracarcinógenos químicos em câncer de mama em ratos, Po, (2002).A atividade estrogênica de isoflavonóides foi primeiramente notada nadécada de 40 quando a infertilidade de carneiros na Austrália foi devido àpastagem consumida por eles era rica em isoflavonas. Desde então, a lista deisoflavonóides incluindo genisteína, daidzeína tem-se mostrado agonistaestrogênico em vários modelos animais, Birt, (2001). Os flavonóides eisoflavonóides testados estão em ordem de estrogenicidade: genisteína >Kampherol > naringenina > apigenina > dadzeína > biochanina A >72

formononetina > luteolina > fisetina > catequina > hesperidina. Birt, (2001).Muitas propriedades das isoflavonas de soja como prevenção da osteoporose,retardamento dos sintomas da menopausa, diminuição dos níveis de colesterolpodem ser sugeridos através de mecanismos relacionados ao estrógenoBoersma, (2001). Flavonóides e isoflavonóides são metabolizados por umabactéria intestinal quando ingeridos Mishra, (2003) a estrógenos difenólicosoriginados de plantas e o estrógeno humano 17-β-estradiol Birt, (2001). Figura4 ilustra a estrutura química do 17-β-estradiol .Fonte: Boersma, (2001)Figura 4 – Estrutura do 17-β-estradiol e da genisteínaIsoflavonóides como genisteína e daidzeína são fenóis com estruturasimilar ao estradiol humano (figura 4), Mishra, (2003). Mais de 400 substânciasquímicas têm sido descritas como fitoestrógenos, que estruturalmente sãoderivados fenil-benzo-pirano Wills, (2003).O potencial estrogênico de todos os isoflavonóides e/ou flavonóidesreportados é extremamente fraco, 10 3 a 10 5 vezes menor que o 17-β-estradiolMishra, (2003); Birt, (2001).Isoflavonóides e/ou flavonóides podem conter estrógenos endógenosatravés da ligação competitiva com receptores de estrógenos. A afinidaderelativa desses compostos com a receptor de estrógeno é 0,05-1% da afinidadede ligação do 17-β-estradiol Birt, (2001). Um estudo examinou o efeito daformononetina no tecido glandular mamário e seu potencial estrogênico foiextremamente fraco e proporcional à capacidade de ligação dos receptores deestrógeno. Baseada tanto na fraca atividade estrogênica e na baixa capacidadede ligação aos receptores de estrógeno, isoflavonóides e/ou flavonóides podem73

não exercer provavelmente um significado na prevenção do câncer viamecanismos antiestrogênicos.Todavia, recentes estudos sobre estrogenicidade da isoflavona in vitro ein vivo mostrou que a gliciteína foi três vezes mais potente que a genisteína invivo, mas em torno de vinte vezes menos potente que a genisteína in vitro. Issosugere que a bioaviabilidade in vivo e in vitro podem diferir significativamente(Birt, 2001). A genisteína também está sendo eficaz na regulação da expressãode receptores de andrógenos e estrógenos de glândulas prostáticas de ratosquando oferecida em concentrações semelhantes à encontradas na dietahumana rica em soja Wills, (2003).O papel dos fitoestrógenos na modificação do risco de câncer não podeser confinado somente em suas propriedades estrogênicas, mas pelamediação de numerosos mecanismos bioquímicos não relatados na atividadeestrogênica Mishra, (2003).Fitoestrógenos podem reduzir os efeitos biológicos dos hormôniossexuais e afetar o ciclo mesntrual humano. Estudos in vivo e in vitro sugeremque os fitoestrógenos estimulam a síntese e globulinas ligantes ao hormôniosexual no fígado. Em adição, fitoestrógenos promovem o prolongamento dociclo mesntrual humano Mishra, (2003).Baicaleína (figura 5) é uma flavona extraída da planta Scutellariae radix,um ingrediente do chá de ervas. Seu efeito contra o câncer está sendodocumentado em câncer de próstata e hepático. É também agenteantioxidante, antiinflamatório e inibidor de prostaglandinas E 2 PO, (2002).Segundo Strauss (1998) os mecanismos de ação dos fitoestrógenospodem ser divididos em três grupos:1- Ação relacionada ao receptor de estrógeno (ER) resultando em efeitosestrogênicos ou antiestrogênicos. Muitos estudos in vitro indicam que váriosfitoestrógenos agem similarmente aos estrógenos esteroidais. Eles ligam aosreceptores de estrógenos, induzem genes, estimulam o crescimento de célulascancerosas e suas ações podem ser bloqueadas pelos antiestrógenos Shirai,(2002). Fitoestrógenos são geralmente mais fracos que estrógenos esteroidaisendógenos, e sugere-se que eles ajam como antiestrógenos pela competiçãocom estrógenos endógenos mais potentes para ligarem aos ERs. Um estudo74

elata que fitoestrógenos como genisteína são bons ligantes aos ERs Fritz,(2002). Fitoestrógenos possuem uma afinidade maior de ligação a um subtipodo receptor - ER β . Sheike, (2003).2 – Interação com muitas enzimas chave na produção de esteróides sexuais eefeitos na produção de proteínas ligadoras de esteróides sexuais. Numerososestudos in vitro, relatam que muitos, mas não todos fitoestrógenos, inibemmuitas enzimas chave na biossíntese de estrógenos e andrógenos. Essasincluem 17-β-hidroxiesteróide oxidorredutase tipo 1 e 2, aromatase e 5-αredutase.Em adição, já está sendo demonstrado que fitoestrógenos estimulama produção de hormônio sexual ligado à globulina in vitro. Em teoria é sugeridoque fitoestrógenos podem modular a produção de hormônio sexual ligado aglobulina in vitro. Strauss, (1998).3 – Ações não-hormonais. Muitos fitoestrógenos têm sido relatados em exercervárias ações (efeitos) que não estejam relacionados ao ER. Esses efeitosincluem atividade antiproliferativa, inibição da tirosina quinase, proteína quinaseC, DNA topoisomerase II, atividade antioxidante, inibição da angiogênese.Strauss, (1998).3.15. Ação antiinflamatóriaVários flavonóides (quercetina, apigenina, catequinas) têm sidoestudados por possuírem atividade antiinflamatória inibindo a ciclooxigenase-2(COX-2) e induzindo a óxido nítrico sintase. Ferguson, (2001). A ciclooxigenase-2 é uma enzima que catalisa a formação de prostaglandinas e tromboxanos ápartir do ácido araquidônico. COX-2 e sua isoenzima COX-1 estão envolvidastambém na indução da angiogênese de cultura de células endoteliais. Aoverexpressão de COX-2 tem sido implicada na tumorigênese de cânceres decólon, reto, estômago, pulmão, mama e cabeça e pescoço. A atividade de COXtem conferido várias vantagens na transformação de células através da inibiçãode apoptose, diminuição da proliferação celular, redução da adesão célulacélula,aumento da aderência de células a matrix extracelular e a indução daangiogênese. Além disso, a formação de prostaglandina E 2 é catalisada por75

COX-2 e induz a síntese de fatores de crescimento angiogênicos como VEGF.COX-2 também modula atividade de peptídeos regulatórios de crescimento,como TGF-β (Sharma, 2001). A inflamação crônica é um passo importante naetiologia do câncer e inibidores de COX-2 têm sido estudados como agentesquimioprotetores contra câncer do colo retal Marchand, (2002). Aquimioprevenção é considerada um dos propósitos mais promissores naprevenção de cânceres humanos Sakata, (2003).A hesperidina flavonóide de ocorrência natural encontrado em frutas evegetais; e quando sozinha ou combinada com diosmina exercem açãoanticarcinogênica em modelos animais para câncer de língua, intestino,esôfago e bexiga (Williams, 2004). Estudos também indicam que alguns tiposde flavonóides incluindo a hesperidina possuem atividade antiinflamatória Surh,(2003). Atualmente, Daflon 500mg, um flavonóide purificado contém 90% dediosmina e 10% de hesperidina e possui uma proteção contra tratamento antiinflamatórioe insuficiência venosa; e existe uma possível correlação entreefeito antiinflamatório e atividade quimioprotetora de hesperidina Sakata,(2003).Várias publicações indicam associação positiva entre inflamação crônicae risco de câncer Williams, (2004); Surh, (2003); Sakata, (2003). Recentesestudos mostram que enzimas como COX-2 e/ou óxido nítrico sintase (iNOS)em associação com resposta inflamatória podem ter um papel central nacarcinogênese Surh, (2003). Expressão de COX-2 em células epiteliais ouintestinais como os macrófagos são induzidos por estímulo inflamatório comoendotoxina de lipopolissacarídeo, e alta expressão da proteína COX-2 tem sidoobservada em macrófagos intersticiais em adenomas colônicos de humanos eanimais Sakata, (2003). Um recente estudo sugeriu que COX-2 mediada porparácrina sinalizada por macrófagos pode ser o pivô central na progressão detumores do cólon Etherton, (2002).Um estudo documentou que a expressão e atividade de iNOS , que élocalizado predominantemente em macrófagos é elevado em adenomas decólon e adenocarcinomas humanos, sugerindo sua participação emcarcinogênese. Muitos estudos prévios sugerem que a hesperidina podemmodular a síntese de prostaglandinas, a expressão e atividade enzimática deCOX-2 ou iNOS. Ferguson, (2001). A hesperidina inibe a expressão e atividade76

de isoformas de COX e iNOS em macrófagos celulares. O efeito da inibição dahesperidina pode ser relatado com eficácia antiinflamatória e anticarcinogênicaSakata, (2003).Etherton (2002) relatou que compostos fenólicos possuem efeitoantitrombótico que aparece como resultado da agregação plaquetária, reduçãoda síntese de mediadores pró-trombóticos e pró-inflamatórios, diminuindo aexpressão de adesão molecular. Existem também muitas evidências que ospolifenóis podem modular a produção de óxido nítrico pelo endotélio vascular,resultando em vasorelaxamento.Compostos fenólicos podem inibir a atividade de ciclooxigenase,reduzindo a agregação plaquetária e tendência à trombose Etherton, (2002).Quercetina inibe a agregação plaquetária in vitro e reduz síntese detromboxano in vivo Ferguson, (2001).Regulação inapropriada de COX-2 e iNOS tem sido implicada nafisiopatologia de certos tipos de cânceres humanos devido a uma desordeminflamatória Surh, (2003). Desde que a inflamação esteja claramente ligada apromoção do tumor, substâncias com potente atividade antiinflamatória podemexercer efeitos quimioprotetores na carcinogênese, particularmente no estágiode promoção Sakata, (2003).Os fitoquímicos quimioprotetores exercem distintos mecanismosmoleculares que incluem inibição da expressão de iNOS e subseqüentebloqueio da produção de óxido nítrico, indução da fase-2 de detoxificação deenzimas, eliminação de radicais livres, indução da apoptose e etc. Surh,(2003).A produção elevada de óxido nítrico em condições inflamatórias crônicasleva a uma geração de peroxinitrito, conhecidos como aldeídos e epóxidosderivados da peroxidação lipídica. Essa inflamação crônica pode levar a umainstabilidade genômica Ferguson, (2001). Uma variedade de polifenóis podeexercer efeitos na função imune e inflamatória das células.Certos polifenóis podem afetar (usualmente inibindo) processossecretórios, mitogênesis, interações célula-célula, incluindo efeitos possíveis naadesão molecular e função Williams, (2004).77

3.16. AngiogêneseSegundo Cão, (2002), a angiogênese é um processo de crescimento denovos vasos sanguíneos, é envolvido na fisiologia e patologia de processoscomo desenvolvimento embrionário, ciclo reprodutivo, crescimento de tumor emetástase, retinopatia diabética e inflamação crônica Sharma, (2001). Assim,supressão anormal da angiogênese pode prover estratégias terapêuticas notratamento de desordens dependentes da angiogênese. Um grande número deinibidores endógeno da angiogênese tem sido identificado e produzem efeitosdramáticos no crescimento de tumores e metástase em modelos animais.Arbser, (2004). A indução do processo de angiogênese é caracterizada peladegradação da membrana basal vascular, migração do endotélio celular,proliferação e formação dos túbulos. Segundo Sharma (2001), a angiogênese écrítica na transição lesões pré-malignas no estado proliferativo a fenótiposmalignos, que levam ao crescimento do tumor a metástases. O crescimento detumores sólidos e metástase são dependentes da angiogênese do tumor. Hámais de 30 anos atrás, Dr. Judah Folkman levantou a hipótese que ocrescimento do tumor e metástases era dependente do grau deneovascularização Cao, (2002). A partir de então, muitos estudosexperimentais realizados em modelos animais surgiram para provar essahipótese. Quando um pedaço de tecido de tumor foi implantado em uma córneade coelhos, o tumor implantado obteve um crescimento exponencial linearquando novos vasos sanguíneos cresceram ao redor do tecido do tumorArbisier, (2004).A angiogênese permite que os tumores cresçam até 1-2mm de diâmetro,invadindo tecidos circunvizinhos e indo até sítios distantes no corpo(metástase). O aumento da vascularização precede a neoplasia Sharma,(2001).Uma alternativa apropriada para o estudo da angiogênese envolvefatores de crescimento necessários para a formação de novos vasossanguíneos. Em doenças malignas estabelecidas, fator de crescimentoangiogênicos pode ser liberado diretamente, através das células do própriotumor, ou indiretamente, via recrutamento de outras células como macrófagose células endoteliais Sharma, (2001). A liberação inicial dessas substâncias ou78

a evidência da formação de complexos entre fatores de crescimentoangiogênicos e receptores de alta-afinidade pode ser chamado de “trocas”angiogênicas. Esse estágio pode ser induzido por vários processos, incluindohipoxia. A capacidade de células malignas induzirem angiogênese estáassociada com produção desses fatores de crescimento, e concentraçãosanguínea periférica que pode estar relacionada com MVD (densidade demicrovasos) em muitos tumores primários Sharma, (2001).A expressão de fatores de crescimento angiogênicos pode aumentar emtecidos pre-neoplásicos, embora a interpretação de resultados experimentaisseja complicada pela expressão constitutiva de fatores de crescimento doepitélio normal e da expressão da doença aguda. Em ratos, com câncerquimicamente induzido, a concentração do fator de crescimento vascularendotelial (VEGF) é aumentada em uma simples hiperplasia. A produção deVEGF pode ser o passo limitante no desenvolvimento de lesões pré-malignasSharma, (2001).A figura 9 ilustra que a metaplasia e a hiperplasia podem ser reativas efrequentemente regressarem, enquanto que a displasia é caracterizada pormudanças moleculares mais avançadas e pode persistir por muitos anos. Assetas pretas indicam a descoberta em estágios mais cedo no modelo abaixo epara algumas medidas de angiogênese foi observada expressão crescentedentro de alguns estágios.79

Fonte: Sharma, (2001).Figura 5 - Passos múltiplos da carcinogênese.O consumo de dietas baseadas em plantas pode ser benéfico nadiminuição dos riscos do aparecimento e progressão de doenças relacionadascom angiogênese, incluindo câncer, retinopatia diabética e artrite reumatóide.Recentemente muitos polifenóis extraídos de plantas podem ser potentesinibidores da angiogênese Cao, (2002). (Tabela 6)80

Tabela 6 – Polifenóis anti-angiogênicosFonte: Cao, (2002).Muitos polifenóis têm o efeito de inibir o crescimento de tumor emanimais experimentais. Esses estudos sugerem que os polifenóis pode ser umgrupo importante de compostos naturais terapêuticos no tratamento dedesordens dependentes da angiogênese Gosslau, (2004).Os flavonóides possuem uma dupla ação quimioprotetora no câncer,eles suprimem o crescimento tanto das células tumorais quanto das célulasendoteliais O´prey, (2003). Luteolina, genistéina, apigenina, quercetina efisetina inibem uma cultura de tumor e células endoteliais em concentraçõessimilares. Gosslau, (2004). Tem sido sugerido que flavones, 3,4-diidroxiflavone,reservatrol e luteolina são alguns dos mais potentes polifenóis anti-endoteliaisque suprimem a proliferação celular Cao, (2002). Epigalocatequina -3-galato(EGCC) presente no chá-verde é um efetivo inibidor na supressão da81

angiogênese distal em animais, todavia, relativamente altas concentrações sãorequeridas para inibição celular endotelial in vivo O´prey, (2003).Segundo Cao (2002), a nível molecular esses polifenóis inibidores,suprimem o crescimento de receptores de ativação do fator ativado, proteínaquinase C (luteolina, reservatrol, quercetina), tirosina quinase (genisteína),fosfoinositideo-3-quinase luteolina, quercetina) e receptor do fator decrescimento epidermal S6 quinase (genisteína, Kaempferol), Sharma, (2001).Eles bloqueiam a função regulatória do ciclo celular como quinasesdependentes de ciclina (cdk) e manutenção do tumor e estágios quiescentes decélulas endoteliais Gosslau, (2004). Outro mecanismo inibitório dos flavonóidesinclui a inibição da proteína mitogênio-ativada (MAP) quinase e regulação derepressores do ciclo celular com p21 Cao, (2002).Genisteína inibe a fosforilação de tirosina quinase. Estudos in vitro e invivo descrevem efeitos quimioprotetores dessa isoflavona. Genisteína edaidzeína inibem a proliferação celular do tumor in vitro. Em comparação com agenisteína, a daidzeína possui um efeito inibitório menor Gosslau, (2004). Deacordo com Cao (2002), a genisteína está associada com a inibição daangiogênese em tratamento de cânceres de próstata e mama. Entre os efeitosdescritos da genisteína, os mecanismos anti-angiogênicos envolvem baixaregulaçãode MMP-9 VEGF, assim como alta regulação de inibidores teciduaisde metaloproteinases, que levam a redução da invasão celular do tumor ecrescimento dos vasos sanguíneos.A apigenina inibe o crescimento de vasos linfáticos em adenocarcinomaintestinal quimicamente induzido. Mecanismo anti-agiogênico da apigeninaenvolve a inibição das hialuronidase, resultando na diminuição da produção eclivagem de ácido hialurônico, que estimulam a angiogênese. Cao, (2002).O efeito anti-tumor está relacionado ao aumento da apoptose, reduçãoda proliferação celular do tumor e diminuição da densidade vascular.Birt (2001) descreve a proliferação celular desregulada como ummarcador de aumento da susceptibilidade à neoplasia. Prevenção do câncergeralmente está associada com inibição, reversão ou retardamento dahiperproliferação celular. Já é bem conhecido que flavonóides dietéticos eisoflavonóides têm demonstrado inibir a proliferação de linhagens de célulascancerosas humanas.82

Flavonóides e isoflavonóides podem inibir o ciclo celular e induzir aapoptose, linhagens de células cancerosas onde as células estavam emdivisão, quando tratadas com flavonóides e isoflavonóides tiveram umadesestruturação nos check-points G1/S e G2/M. Williams, (2004). Quercetinabloqueia o ciclo celular em G1/S de células cancerosas de cólon. Ela tambéminduz apoptose, resultado da fragmentação nuclear, condensação da cromatinanuclear. Reddy, (2003). Marchand (2002) descreveu que em modelos in vitro,flavonóides tem mostrado afetar sinalização celular e a progressão do ciclocelular. Genisteína e quercetina inibem a proteína tirosina quinase que tambémestá envolvida na proliferação celular. Apigenina, luteolina e quercetinamostraram-se eficazes no processo de morte celular, impedindo a progressãodo ciclo celular através do mecanismo dependente de p-53. Estudosdemonstram que a genisteína age sinergicamente com ácido eicosapentanóicoinibindo a proliferação de células de câncer humano in vitro. Nesse estudogenisteína inibiu a proliferação de células pancreáticas cancerosas in vitroatravés da modulação da síntese de DNA pela alteração da oxidação daglicose. Essa ação necessita de estudos futuros, mas representa meios paraexplicar como a genisteína pode inibir o crescimento do tumor Reddy, (2003).Um outro mecanismo proposto de proteção contra o câncer pelosflavonóides inclui a indução da fase II de detoxificação de enzimas na célula.Modificação da detoxificação de enzimas celulares pode ser o maiormecanismo protetor contra carcinógenos químicos. Muitos carcinógenos sãofrequentemente metabolizados a carcinógenos pelas enzimas da fase I, comocitocromo P450 que catalisa reações oxidativas Birt, (2001). Os flavonóidesquercetina, Kaempferol e galangina e flavona apigenina tem mostrado inibir acitocromo P450, da família CYP1A. Essas enzimas possuem um grande papelna ativação de carcinógenos humanos. Quercetina e naringina também têmmostrado inibir CYP3A4, que é a mais abundante enzima da citocromo P450no fígado Marchand, (2002). Os metabólitos oxidados são potencialmentecarcinógenos xenobióticos que são detoxificados por enzimas metabolizadorasfase II dentro de forma que são relativamente inerte e excretada maisfacilmente. Estudos animais e in vitro têm mostrado que catequinas aumentama atividade detoxificante e enzimas antioxidantes como glutationa redutase,83

glutationa peroxidase, glutationa-S-redutase, catalase e quinina redutaseMarchand, (2002).O conhecimento da função da função da resposta imune pelosantioxidantes dietéticos pode ser benefício na prevenção do câncer. Desde quecélulas fagocitárias produzem ROS como parte da defesa do corpo contrainfecção, ingestão adequada de antioxidantes é requerida para prevenir danospelos oxidantes das próprias células imunes Cao, (2001).Os flavonóides também têm se mostrado proteger as células contradanos de raios-X, bloqueando a progressão do ciclo celular, inibindo mutações,bloqueando a síntese de prostaglandinas, e prevenindo multiestágios emexperimentos animais Reddy, (2003).Quercetina injetada intraperitonealmente a uma concentração de150mg/kg/dia reduziu o crescimento de dois tipos de câncer de próstata emcamundongos. Isoflavonas, ácido fenólico e genisteína inibiram câncer debexiga também em camundongos Reddy, (2003).3.17. Quimioterápicos utilizados no tratamento do câncerO termo quimioterapia foi criado por Ehrlich, no início do século, paradescrever o uso de compostos químicos sintéticos capazes de destruir agentesinfecciosos. Mais recentemente, a definição do termo foi ampliada para incluiros antibióticos-substâncias produzidas por alguns microrganismos, que matamoutros microrganismos ou inibem o seu crescimento. Na atualidade, o termoquimioterapia é também aplicado ao uso de produtos químicos (naturais ousintéticos) utilizados para inibir o crescimento de células malignas oucancerosas no corpo Rang, (2001).Os agentes utilizados no tratamento do câncer afetam tanto as célulasnormais como as neoplásicas, porém eles acarretam maior dano às célulasmalignas do que às dos tecidos normais devido às diferenças quantitativasentre os processos metabólicos dessas duas populações celulares. Oscitotóxicos não são letais às células neoplásicas de modo seletivo. Asdiferenças existentes entre o crescimento das células malignas e os dascélulas normais e as pequenas diferenças bioquímicas verificadas entre elas84

provavelmente se combinam para produzir seus efeitos específicos Los,(2003).Os agentes quimioterápicos são utilizados para indução da remissão dotumor, para intensificação ou consolidação, e como terapia de manutenção.Remissão é obtida quando todas as evidências clínicas do tumor tiveremdesaparecido. Intensificação é a utilização de um agente quimioterápico comdiferentes mecanismos de ação utilizada durante a remissão, com o objetivo dedestruir qualquer célula neoplásica resistente. Terapia de manutenção é aadministração de drogas que mantenham o paciente em remissão, sendo maisimportante em tumores hematopoiéticos Fonseca, (2002).A maioria dos pacientes com tumores sólidos avançados ainda morredessa doença. Los, (2003). Por isso, novas drogas efetivas são requeridas enovos agentes aparecem continuamente. Os últimos anos testemunharam oaparecimento de um grande número de drogas antineoplásicas e muitas nãopodem ser incluídas em uma simples classificação. Classificadamente asdrogas antineoplásicas podem ser agrupadas como quimioterapia, terapiahormonal e imunoterapia. A quimioterapia inclui um número de famíliasdefinidas tanto pela estrutura química quanto mecanismo de ação: agentesalquilantes, antibióticos, antimetabólicos, inibidores de topoisomerase I e IIinibidores de mitose e outros (tabela 7). Uma classificação de drogas tem doisobjetivos principais: a realização de uma visão inclusiva das drogas disponíveise o designo de uma terapia de combinação. Espinosa, (2003).85

Tabela 7 – Classificação clássica das drogas antineoplásicas.QuimioterapiaAlcalóidesAntibióticosAntimetabólicosInibidores de topoisomeraseInibidores de mitoseOutrosTerapia HormonalEsteróidesAnti-estrógenosAnti-andrógenosAnálogos de LH-RHAgentes anti-aomataseImunoterapia InterferonInterleucina –2VacinasFonte: Espinosa, (2003).É essencial compreender a cinética do ciclo celular para o uso correto daatual geração de drogas antineoplásicas. Muitas das drogas citotóxicas maispotentes atuam em fases específicas do ciclo celular e só exercem a suaatividade contra células que se encontra em fase de divisão. Assim, neoplasiasmalignas humanas que atualmente são mais susceptíveis ás medidasquimioterápicas são as que possuem grande fração de crescimento, isto é, altaporcentagem de células em processo de divisão. Sternberg, (2003).3.18. O Ciclo celularO ciclo de divisão celular é a maneira fundamental pela quais todos osseres vivos são reproduzidos. Para produzir um par de células filhageneticamente idênticas, o DNA precisa ser fielmente replicado e oscromossomos replicados precisam ser segregados em duas células separadas86

A duração do ciclo celular varia grandemente de um tipo de célula paraoutra. O ciclo celular é tradicionalmente dividido em fases distintas, das quais amais dramática é a mitose, o processo de divisão nuclear, culminando com omomento de divisão celular propriamente dito. Na mitose o enovelamentonuclear rompe-se, o conteúdo nuclear se condensa em cromossomos visíveis eos microtúbulos se reorganizam para formar o fuso mitótico que irá separar oscromossomos. À medida que a mitose prossegue, o processo parece cessarbrevemente em uma fase chamado metáfase, na qual os cromossomos, jáduplicados, são alinhados no fuso mitótico e estão prontos para a segregação.A separação dos cromossomos duplicados marca o início da anáfase, durantea qual os cromossomos se movem para os pólos do fuso, onde sãodescondensados para formar os núcleos intactos. A célula é, então,desdobrada em duas por um processo chamado citocinese, a qual étradicionalmente considerada como o fim da fase mitótica, ou fase M, do ciclocelular. O período mais longo que vai de uma fase M à seguinte é conhecidocomo interfase (figura 6).Fonte: www.arrakis.es/~lluengo/ ciclocelular.htmlFigura 6 – As quatro fases sucessivas de um ciclo-padrão de uma célula procariótica.87

A replicação do DNA nuclear ocupa somente uma parte da interfase, achamada fase S do ciclo celular (S = síntese). O intervalo entre o término damitose e o começo da síntese de DNA é chamado de fase G 1 (G = gap oulacuna) e o intervalo entre o final da síntese de DNA e o início da mitose échamado de fase G 2 . G 1 e G 2 propiciam um tempo adicional para o crescimentocelular. Se a interfase durasse somente o tempo suficiente para a replicação deDNA, a célula não teria tempo para duplicar sua massa antes de se dividir.Durante G 1 , a célula monitora seu próprio crescimento e tamanho. Nesta fase,proteínas e RNA são sintetizados para atividade das funções celulares (Silva,1998). No final dessa fase ocorre aumento de enzimas para síntese de DNA. Afase G2 fornece um intervalo de segurança de maneira que a célula possaassegurar uma completa replicação de DNA antes de iniciar a mitose. Nessafase a síntese de DNA cessa, e a síntese de RNA continua com a produçãodos precursores microtubulares do fuso mitótico. Na fase M, a produção deRNA cessa e ocorre a mitose SILVA, 1998. G 1 , S, G 2 e M são as tradicionaissubdivisões do ciclo celular padrão. Células em G 1 , se elas ainda não estãocomprometidas com a replicação de DNA, podem interromper seu crescimentodurante o ciclo e passar para um estado especializado de repouso,frequentemente chamado de G 0 (G zero), onde elas podem permanecer pordias, semanas ou mesmo anos antes de retornar a proliferar Alberts, (1997).3.20. .Classes de agentes antineoplásicosOs agentes antineoplásicos podem ser classificados conforme suaorigem e estrutura química, seu mecanismo de ação, seu efeito sobre o ciclocelular ou seu alvo potencial. De modo geral, estas drogas interferem nasíntese ou duplicação de DNA através de vários mecanismos, sendo que amaioria possui vários alvos. Fonseca, (2002).3.21. Agentes alquilantesAfetam as células em todas as fases do ciclo celular de modoinespecífico. Fonseca, (2002). Os agentes alquilantes utilizados em tratamento88

quimioterápico têm a propriedade de se transformar em fortes eletrófilosatravés da formação de intermediários do íon carbânio ou de complexos detransição com as moléculas alvo. Tais reações resultam da formação deligações covalentes por alquilação de vários componentes nucleófilos como,fosfato, amino, sulfidrila, hidroxila, carboxila e grupos imidazólicos. Os efeitosquimioterápicos e citotóxicos estão diretamente relacionados à alquilação doDNA. Lichtman, (2003). A figura 7 ilustra os mecanismos de ação dos agentesalquilantes.Fonte: Lichtman, (2003)Figura 7 - Mecanismo de ação dos agentes alquilantes.Existem três possíveis conseqüências da reação de mecloretamina(mostarda nitrogenada) com resíduos de guanina nas cadeias de DNA.Primeiro, uma cadeia lateral 2-cloroetil sofre ciclização intramolecular deprimeira ordem, com liberação de Cl - e formação de um intermediárioetilenimínio reativo. O etilenimínio intermediário pode reagir através da89

formação de um íon carbânio ou de um complexo intermediário de transição,com grande número de íons inorgânicos e radicais orgânicos por meio dereações que se assemelham a uma reação de substituição nucleofílica desegunda ordem. A alquilação no nitrogênio 7 dos resíduos de guanina no DNA,que é uma reação altamente favorável, pode exercer diversos efeitos deconsiderável importância biológica. Quando o nitrogênio 7 da guanina sofrealquilação (transformando-se em nitrogênio de amônio quaternário) o resíduode guanina é mais ácido e a tautômero enol é favorecido. A guanina modificadapode formar pares de bases com os resíduos de timina, levando a umapossível codificação errônea e à substituição final de um par de bases deadenina-timina por guanina-citosina. Segundo, a alquilação do nitrogênio 7labiliza o anel imidazol, tornando possível a sua abertura ou a suadespurinação, por excisão dos resíduos de guanina. Qualquer dessas reaçõespode provocar grave lesão da molécula de DNA. Terceiro no caso desubstâncias alquilantes bifuncionais, como a mostarda nitrogenada, a segundacadeia lateral 2-cloroetil pode sofrer ciclização semelhante e alquilaria oresíduo de guanina ou outra fração nucleofílica, como um grupo amino ou umradical sulfidrila de uma proteína. Esse processo pode resultar na ligaçãocruzada de duas cadeias de ácidos nucléicos ou na ligação de um ácidonucléico a uma proteína por ligações covalente. Najman, (2002).Existe, assim, a formação de ligações covalente com resíduos depurinas ou pirimidinas do DNA, como também a alquilação de outras moléculasbiológicas que provocam importantes efeitos sobre viabilidade e função celularTimotheadou, (2003).Os alquilantes utilizados englobam um grupo heterogêneo desubstâncias químicas que têm em comum a capacidade de contribuir, emcondições fisiológicas, com grupos alquílicos para macromoléculasbiologicamente vitais, como o DNA. Na maioria dos casos, os parâmetrosfísicos e químicos, como lipofilicidade, capacidade de atravessar membranasbiológicas, as constantes de dissociação em ácido, a estabilidade em soluçãoaquosa, são essenciais para atividade biológica. Espinosa, (2003).90

Ações farmacológicasAs ações farmacológicas mais importantes dos agentes alquilantes sãoas que interferem no crescimento celular, atividade mitótica e diferenciação efuncionamento. Licthman, (2003). Essas drogas interferem na divisão celulardos tecidos de rápida proliferação (grande proporção das células encontra-seem divisão).Todos os agentes alquilantes deprimem a função da medula óssea ecausam distúrbios gastrintestinais. Rang, (2001), hematológicas(mielossupressão) e vesicais (cistite hemorrágica). Com o uso prolongado,podem ser observados dois outros efeitos indesejáveis, depressão dagametogênese (principalmente em homens), resultando em esterilidade eaumento do risco de leucemia não linfocítica aguda e outras neoplasiasmalignas. Rang, (2001).Mostardas nitrogenadasAs mostardas nitrogenadas estão relacionadas com a mostarda deenxofre, o “gás de mostarda” empregado durante a Primeira Guerra Mundialcom fórmula básica R-N-bis (2-cloroetil) (figura 8)FONTE: Rang, (1998).Figura 8 – Mostardas nitrogenadas empregadas na terapia.91

No organismo, cada cadeia lateral 2-cloroetil sofre ciclizaçãointramolecular com liberação de um íon cloreto. O derivado etileno imônioaltamente reativo assim formado pode interagir com o DNA e outras moléculas.CiclofosfamidaÉ provavelmente, o agente alquilante mais utilizado. Litchman, (2003),além de ser útil como terapia imunossupressora em alguns pacientes renais eportadores de doenças reumatológicas. A ciclofosfamida só exibe atividadecitotóxica, mutagênica ou alquilante fraca e é relativamente estável em soluçãoaquosa. Quando administrada em animais experimentais ou a pacienteportadores de tumores susceptíveis, observam-se efeitos quimioterápicospronunciados, bem como mutagenicidade e carcinogenicidade. SegundoFonseca, (2002) as principais indicações para seu uso são: linfomas, sarcoma,adenocarcinoma mamário, leucemia linfocítica. Essa droga sofre ativaçãometabólica inicial pelo sistema de oxidação de função mista do citocromo P450,no fígado, com transporte subseqüente do intermediário ativado para os locaisde ação, ou seja, ela é inativa até ser metabolizada no fígado (figura 9)Lichtman, (2003); Rang, (2001).Fonte: Rang, (2001|)Figura 9 – Metabolismo da ciclofosfamida.92

A ciclofosfamida é inativa até ser metabolizada no fígado por oxidasesde função mista P450 a 4-hidroxiciclofosfamida que forma aldofosfamida deforma reversível. A aldofosfamida é transportada para outros tecidos, onde éconvertida em mostarda de fosforamida (a verdadeira molécula tóxica) e emacroleína que é responsável pelos efeitos indesejáveis, Rang, (2001).As vantagens da ciclofosfamida são as disponibilidades deadministração por via oral ou parenteral e a possibilidade de utilizar dosesfracionadas por longos períodos de tempos. Como imunossupressora, aciclofosfamida tem recebido considerável atenção para o controle da rejeiçãode órgãos após transplante e em distúrbios não-neoplásicos associados a umaalteração da reação imune, Radin, (2003).IsofosfamidaAnálogo da ciclofosfamida é também ativada por hidroxilação no fígado.A grave toxicidade do trato urinário limitou o uso da isofosfamida quando foiintroduzida pela primeira vez no início da década de 70. Entretanto, asmudanças feitas nos esquemas posológicos, a hidratação adequada e aadministração concomitante de mesma permitem atualmente o uso de dosesefetivas de isofosfamida com acentuada redução da incidência de cistitehemorrágica. Atualmente a isofosfamida é usada em combinação com outrasdrogas no tratamento do câncer testicular de células germinativas, Sternberg,(2003).MelfalanÉ um derivado fenilalanínico da mostarda de nitrogênio. SegundoFonseca, (2002) ele promove alquilação do DNA, é indicado principalmentepara tratamento de mieloma múltiplo e linfoma e possui como efeitos colateraisnáusea, vômito, anorexia (rara), mielossupressão moderada. Está disponívelpara administração por via oral, embora a absorção possa variarextraordinariamente entre pacientes na dependência de fatores como ingesta93

alimentar e pH gástrico. O efeito terapêutico depende do grau demielossupressão alcançado e as contagens sanguíneas devem ser seguidasrigorosamente.NitrosouréiasSão fármacos antineoplásicos que possuem atividade contra um grandenúmero de neoplasias malignas humanas, Espinosa, (2003). Funcionamquimioterapicamente como substâncias alquilantes bifuncionais. Alguns dessesfármacos, em particular a carmustina (BCNU) e a lomustina (CCNU) possuemalta lipofilicidade, atravessando a barreira hematoencefálica, permitindo o seuuso no tratamento das leucemias meníngeas e tumores cerebrais, Lichtman,(2003). Todavia, as nitrosouréias exercem, em sua maioria, um grave efeitodepressor cumulativo sobre a medula óssea, que aparece 3 a 6 semanas apóso início do tratamento, Rang, (2001), com exceção da extreptozocina.TriazenosA dacarbazina é o principal representante desse grupo e funciona comoum alquilante após ativação metabólica do fígado. Parece inibir a síntese deRNA e de proteínas mais do que a do DNA. Mata lentamente as células eparece não haver nenhuma fase do ciclo celular em que a sensibilidade sejamaior. Tem sido utilizada no tratamento de melanoma maligno, Espinosa,(2003).CisplatinaA cisplatina ou composto cisplatina-diaminocloroplatium (CDDP) é umagente citotóxico inorgânico que contém o metal pesado platina; é efetivo parao tratamento adjuvante de osteossarcoma, carcinoma de células escamosas,94

tumores de bexiga, dos testículos, esôfago, pulmão, melanomas emesoteliomas, Sobral, (2001).Assemelha-se aos agentes alquilantes em seu mecanismo de ação.Inibe mais a síntese de DNA do que a síntese de RNA e proteínas, e é umquimioterápico ciclo celular não específico, Bonassa, (2000). De acordo comCarneiro, (1992), a cisplatina atua predominantemente na fase S, em queocorre a síntese de DNA nuclear e os efeitos nas ligações cruzadas não maisevidentes. Entretanto, esta especificidade parece ser variável entre os distintostipos celulares.Quimicamente, a cisplatina é um composto inorgânico formado por umátomo central de platina circundado por átomos de amônia e cloro em posiçãocis no plano horizontal, Bonassa, (2000).A descoberta desse novo agente quimioterápico utilizado e divulgado naprática clínica ocorreu quando um grupo de pesquisadores nos Estado Unidoda América fez passar uma corrente elétrica entre eletrodos de platina eobservaram a inibição do crescimento de Escherichia coli. Posteriormente,comprovaram a formação de compostos inorgânicos contendo platina, napresença de íons cloro e amônia, com efeitos evidentes na inibição dareplicação bacteriana, além da atividade antiblástica em tumoresexperimentais, Carneiro, (1992).A entrada do fármaco na célula se dá por simples difusão semnecessidade de um sistema específico de transporte. Dentro da célula, os íonscloreto dissociam-se e são substituídos por moléculas de água, resultandonuma forma aquosa, que se liga de forma covalente à hélice do DNA e inibesua replicação, Ogilvie, (1991). Segundo Carneiro, (1992), a formação deespécies ativadas deste agente citotóxico (cisplatina) pode ser resultante dahidrólise do cloro.Em soluções salinas, ricas em íons cloreto a cisplatina torna-se inativa eestável. Uma vez no citoplasma da célula, um meio pobre em íon cloreto ocorredissociação da cisplatina em seus diferentes compostos Delisle, (1996).Estudos em animais de laboratórios sugeriram a evidência clínica denefrotoxicidade se desenvolve poucos dias após a administração da cisplatina.Assim como na necrose tubular induzida pelo mercúrio, há o aparecimento95

precoce de cristais, proteinúria e aumento da descamação de células tubularesrenais observados na urinálise.Uma característica dos complexos inorgânicos de platina usadosclinicamente demonstra que suas atividades anti-tumorais e nefrotóxicas estãoligadas às suas configurações moleculares, especificamente a seu isomerismogeométrico; somente os complexos de cisplatina possuem propriedades antitumoraise nefrotóxicas, já os compostos correspondentes à trans-platina sãoisento de tais características. A maioria das informações disponíveis sobre anefrotoxicidade da platina é derivada de estudos com cisdiclorodiaminoplatinum(II), o mais potente e mais amplamente testado doscomplexos de platina com atividade anti-tumoral, Madias & Harrington, (1978).AntimetabólicosIncluem um grupo variado de compostos que interferem em diversosprocessos metabólicos celulares normais, resultando em interrupção da síntesede ácidos nucléicos. Podem agir de duas maneiras: por incorporação da drogaem substituição a um constituinte normal da célula, como um compostoquímico essencial; ou por inibição de uma enzima chave do metabolismocelular. São mais eficazes em células com alta fração de crescimento egeralmente fase-específica. Afetam as células durante a fase “S” do ciclocelular, Fonseca, (2002).Os poliglutamatos de folato apresentam afinidade muito maior peladiidrofolato redutase do que o monoglutamato de folato. O FH 4 atua como cofatorna transferência de unidades de um carbono, processo que é essencialtanto para metilação da uracila no 2-desoxiuridilato (DUMP) para formartimidilato (DTMP) e, portanto, para a síntese de DNA, quanto para síntese denovo das purinas.Durante a formação de DTMP a partir da DUMP, o FH 4 é novamenteconvertido em FH 2 . A diidrofolato redutase tem atividade fundamental namanutenção do nível de FH 4 intracelular através da redução do FH 2 produzidoa partir da redução do folato e do FH 2 gerado durante a síntese de timidilato. Ometotrexato possui maior afinidade pela diidrofolato redutase do que o FH 2 ; por96

conseguinte, inibe a enzima e causa depleção do FH 4 intracelular. A ligação dometotrexato a diidrofolato redutase envolve uma ligação de hidrogênio adicionalou ponte iônica não presente quando ocorre ligação de FH 2 . A reação maissensível à depleção de FH 4 é a síntese de timidilato, que é inibida pelaconcentração de metotrexato de 1nmol/L, ao passo que a inibição da síntesede purinas requer uma concentração 10 vezes maior, Rang, (2001).A compreensão desses eventos permite apreciar os fundamentos para ouso de timidina e/ou leucovorina (ácido folínico) na “recuperação” de célulasnormais da toxicidade causada por drogas como o metotrexato. A leucovorina éuma enzima do folato totalmente reduzida que penetra nas células através dosistema de transporte específico mediado por transportador, sendo convertidaem outros cofatores ativos de folato. Não requer redução pela diidrofolatoredutase. Por outro lado, a timidina pode ser convertida pela timidina quinasecontornando assim a reação catalisada pela timidilato-sintetase e fornecendo oprecursor necessário para síntese de DNA. Um importante aspecto da ligaçãode antagonistas ativos do folato as diidrofolato redutase é a sua afinidade muitoalta pela enzima. A ligação requer a participação do NADPH como cofatorobrigatório num complexo ternário com enzima e inibidor, Sergeeva, (2003).O metotrexato, como outros antimetabólitos, é apenas parcialmenteseletivo para células tumorais, sendo tóxico para as células normais em rápidadivisão, como as do epitélio intestinal e da medula óssea. Os antagonistas dofolato matam as células durante a fase S do ciclo celular, e as evidênciasindicam ser o metotrexato muito mais eficaz quando a população celular estána fase logarítmica de crescimento e não na fase de platô. Entretanto, como ometotrexato também é capaz de inibir a síntese de RNA e de proteínas, elediminui a velocidade de entrada das células na fase S, e a sua ação citotóxicafoi considerada “auto limitante,” Los, (2003).Análogos de pirimidinaEste grupo de fármacos possui a capacidade de inibir a biossíntese denucleotídeos de pirimidina ou simular esses metabólitos naturais de modo a97

interferir em funções celulares vitais como a síntese de ácidos nucléicos,Lichtman, (2003).Fluorouracil (5-FU)Antimetabólito utilizado no tratamento de tumores sólidos comoadenocarcinoma gastrointestinal, câncer de mama, câncer de célulasescamosas de cabeça e pescoço, Lichtman, (2003) e câncer de cólon/reto.Estes agentes bloqueiam a reação de metilação do ácido desoxiuridílico emácido timidílico, interferindo na síntese de DNA e, em menor proporção, deRNA, provocando crescimento não balanceado e impedindo a divisão celular.Embora se tenha demonstrado que o 5-FU é muito mais letal paracélulas em crescimento logarítmico do que para células estacionárias, nãoexiste nenhum efeito claramente demonstrado num estágio delimitado do ciclocelular. O fenômeno da “morte sem timina” foi invocado para explicar os efeitoscitotóxicos do 5-FU e de seus derivados. O bloqueio da reação da timidilatosintetaseinibe a síntese de DNA, enquanto prossegue a produção celular deRNA e de proteínas. Verifica-se um desequilíbrio no crescimento, que não écompatível com a sobrevivência celular. Foram identificados váriosmecanismos bioquímicos em associação com a resistência aos efeitoscitotóxicos do 5-FU ou da fuloxuridina. Esses mecanismos incluem a perda ouredução de atividades das enzimas necessárias para ativação do 5-FU,diminuição da pirimidina-monofosfato-cinase (que diminui incorporação no RNAe amplificação da timidilato sintetase e alteração da timidilato-sintetase que nãoé inibida pelo F-dUMP.AntibióticosOs antibióticos anti-tumorais produzem seus efeitos principalmenteatravés de uma ação direta sobre o DNA, Lichtman, (2003).98

Actinomicina DActinomicina D é um membro de uma classe de drogas similares quesão isoladas de Streptomyces ou sintetizadas quimicamente, Espinosa, (2003).É efetivo no tratamento de tumor de Wilm´s, sarcoma de Ewing´s,rabsomiossarcoma e câncer testicular. Actinomicina D tem uma estruturainteressante que é composta por um anel fenoxazona, cromóforo, que conferea cor vermelha à droga. Dois polipeptídios cíclicos idênticos são ligados aocromóforo (figura 13). A ligação antibiótico-DNA é pela intercalação com o anelfenoxazone inserido perpendicularmente ao longo do eixo dupla hélice do DNAe das cadeias polipeptídicas estendidas ao longo da menor volta. Estaintercalação depende da interação específica entre as cadeias polipeptídicas edesoxiguanosina. E também bloqueia a síntese de DNA e RNA. A baixasconcentrações, a inibição da síntese de RNA predomina, ao passo que emaltas concentrações, tanto a síntese de RNA quanto de DNA são afetadas.Fonte: Radin, (1996).Figura 13 – Estrutura da actinomicina DEm adição a esse efeito, a actinomicina D causa “single-stranded DNAbreaks” de maneira similar que a doxorrubicina, Radin, (2003).99

AntraciclinasAntraciclinas de uso clínico, daunomicina (figura 14) e doxorrubicina sãoantibióticos produzidos por espécies de Streptomyces, Radin, (2003).Fonte: Radin, (1996).Figura 14 – Estrutura de AntraciclinasDaunorrubicina é o mais efetivo agente no tratamento de leucemiamielocítica e linfocítica. Doxorrubicina é usado no tratamento de tumoressólidos como carcinomas de mama, pulmão, tireóide, ovário.Doxorrubicina e daunorrubicina são conhecidos por intercalar entredupla hélice de DNA, quebrar cátions divalentes e engajar reações deoxidação-redução. Em adição, esses agentes, em baixas concentrações,reagem diretamente com membranas celulares resultando em alterações dasfunções das membranas, Lichtman, (2003).Tanto doxorrubicina quanto daunorrubicina agem intercalando de formaperpendicular ao longo do eixo da dupla hélice do DNA, afetando síntese deDNA e RNA. Ocorrem quebras uni- ou bifilamentares. Acredita-se que a quebrado DNA seja mediada pela ação da topoisomerase II ou pela produção deradicais livres. As antraciclinas reagem como o citocromo P-450 redutase napresença de fosfato de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo reduzido (NADPH)para formar intermediários de radical semiquinona que, por sua vez, podemreagir com o oxigênio para produzir radicais de ânion superóxido. Estes podemgerar peróxido de H e radicais hidroxila, que são altamente destrutivos para ascélulas. A produção de radicais livres é significativamente estimulada pela100

interação da doxorrubicina com ferro, Radin, (2003). A toxicidade máximaocorre durante a fase S do ciclo celular. Com baixas concentrações da droga,as células prosseguem pela fase S e morrem em G 2,.Inibidores de topoisomeraseDNA topoisomerases são enzimas que catalisam a interconversão deisômeros topológicos do DNA. Estas reações incluem mudanças no estado desuper-helicoidização do DNA, Roskoski, (1997). Estas enzimas aumentam oudiminuem o grau de subenrolamento do DNA e a propriedade do DNA que elasafetam é o número de ligações; desempenham também papel importante emprocessos como replicação e empacotamento do DNA, Lehninger, (2002).O DNA de ocorrência natural existe com super-hélices negativas. Umaestrutura com super-hélices negativas exibe um giro anti-horário. Todas asinterconversões topológicas necessitam de uma quebra transitória e reunião daestrutura desoxirribose-fosfato. As DNAs topoisomerases são alvos paraagentes anticânceres em humanos.Existem duas classes gerais de topoisomerases I e II. A topoisomerase Ifaz um corte em apenas um filamento e permite que o filamento intacto passepelo corte, que é então, fechado. A topoisomerase II faz um corte em doisfilamentos e permite que um segmento do DNA passe pelo segmento aberto. Aação da topoisomerase I é diminuir em um o número de ligações e datopoisomerase II diminuir em dois, Lehninger, (2002).Topoisomerase ICatalisa a clivagem de um filamento de DNA para formar um corte, peloqual passa o filamento complementar. A enzima então reúne o filamento. Umahidroxila da tirosina no centro ativo da topoisomerase I forma uma ligaçãocovalente fosfodiéster com um filamento de DNA. O produto é um fosfodiésterde alta energia de uma tirosina enzimática com uma hidroxila de umdesoxirribonucleotídeo. Após a clivagem da ligação fosfodiéster de umfilamento, o filamento intacto passa pelo corte. Depois disso, a hidroxila livreataca o átomo de fósforo do intermediário covalente enzima-substrato e101

desloca o grupamento tirosil da enzima, reorganizando a ligação fosfodiéster. Atopoisomerase I alivia a tensão no DNA com super-helicoidização negativa,Stryer, (2004).Campothecin (CPT) – inibidor de topoisomerase IO evento central no ciclo catalítico da topoisomerase I é a formação deum complexo covalente onde a enzima é ligada a uma fita do DNA via, ligaçãofosfotirosil, Oguma, (2001). A primeira droga identificada como bloqueadorespecifico do complexo topoisomerase i-DNA foi o indol alcalóide demonoterpeno - CPT com 5 anéis, Bailly, (2003).O 20-S-CPT foi originalmente Isolado em 1966 da árvore nativa daChina, Camptotheca acuminata. O alcalóide é produzido durante a biossíntesedo triptofano. A descarboxilação do triptofano fornece a triptamina que é entãoconjugada com o terpenóide secologanin para formar strictosidna, aintermediária chave na formação da maioria dos monoterpenóides índolealcalóides de ocorrência em plantas, incluindo CPT, Lu, (1999); Kutchan,(1995).Em 1985, a descoberta do CPT como potente inibidor de topoisomeraseforneceu novos passos para o desenvolvimento de drogas anticâncer. CPTinibe tanto reações de clivagem como religação do DNA pela topoisomerase I.Stewart, (2001). Desde essa data, cientistas têm procurado ativamenteinibidores adicionais desta enzima e os estudos culminaram em 1990 com adescoberta dos análogos de TPT (Hycamtin TM ) e IRT (Camptosar TM ). Osucesso do CPT e seus análogos como agentes anticâncer tem estimulado apesquisa por outros agentes com a mesma propriedade de inibir topo I,Kjeldsen, (1992).CPT não mostrou uma interação significante com o DNA ou a topo Iisoladamente, mas uma interação forte com complexo enzima - DNA. É bemestabelecido que a forma lactona do CPT é estabilizado pela irreversibilidadedo complexo covalente topo I-DNA. Laco, (2002).A maior limitação do uso de CPT é a interconversão dentro da formacarboxilato, que inativa a molécula. No sangue humano, o equilíbriolactone/carboxilato é deslocado inativando a forma aberta durante a ligação102

preferencial do sal à albumina sérica, a proteína sanguínea predominante. Aafinidade da forma COOH com a albumina sérica é estimada em 100 vezesmaior do que com a forma O-CO. Assim, quando CPT é administradointravenosamente, mais de 95% da droga inativada liga-se à albumina séricahumana e torna-se não disponível, pelo menos transientemente, para exercerefeito terapêutico. Essas considerações têm estimulado a descoberta de novosCPTs que exibam melhor estabilidade no sangue humano, Burke, (2000);Bailly, (2003).A modificação estrutural do esqueleto de CPT propõe um reforço no anellacuna e a redução da ligação da forma carboxilato com a albumina sérica,Bailly, (2003).A primeira demonstração que o anel E lactona pode ser modificado foiem 1997 onde se expandiu o anel lactona de uma série de novos derivados deCPT. Químicos do Instituto Henri Bcaujour (França) desenvolveram esintetizaram uma nova família de análogos de CPT onde metileno foi inseridoentre funções carboxila e álcool do anel E. Assim criou-se a família hCPT (emanalogia com a reação de homologação que consiste na incorporação de umcarbono adicional dentro do anel), Lavergne, (2000).A quebra do DNA induzida por inibidores da topoisomerase I torna-serapidamente tóxica para as células. O mecanismo responsável pela morte dascélulas por CPT e análogos tem sido ativamente estudado. A interação queestabiliza o complexo terciário droga-topoisomerase I-DNA com a forquilha dereplicação resulta na produção da dupla fita “quebrada” que pode serdiretamente responsável pela morte celular. A inibição da topoisomerase porCPT tem seu maior impacto na transcrição. O dano no DNA serve comoativador da morte da maquinaria celular Li, (2001).Topoisomerase IIA topoisomerase II (topo II) humana pode relaxar tanto super-hélicesnegativas quanto positivas, em processo dependente de ATP. A DNA girase,uma topo II bacteriana que funciona à frente da forquilha de replicação introduzsuper-hélices negativas nas moléculas de DNA. A introdução de super-hélices103

negativas alivia a supertorção positiva que ocorre na forquilha de replicação. Asenzimas topoisomerase II alteram em dois o número de ligação no DNA. Issoocorre porque dois filamentos da dupla hélice são quebrados e uma regiãointacta do DNA passa pela quebra, Stryer, (2004); Roskoski, (1997).Segundo Larsen (2003), a enzima nuclear topoisomerase II tem sido omaior alvo para agentes antineoplásicos usado no tratamento de câncer demama, pulmão e próstata, sarcomas.Todos os agentes antineoplásicos direcionados para topoisomerase IIsão capazes de interferir em pelo menos um passo do ciclo catalítico (figura15). Os domínios de ATPase da topoisomerase são mostrados em azul, odomínio central em azul escuro, e o resíduo de tirosina, em vermelho.. O ciclocatalítico é iniciado por enzima que liga a dois segmentos da dupla fita do DNA,chamado segmento G (em vermelho) e o segmento T (em verde) (Passo 1).Próximas duas moléculas de ATP são ligadas, que é associado comdimerização dos domínios de ATPase (Passo 2). O segmento de G é clivado(Passo 3) e o segmento de T é transportado pela fratura no segmento de G queé acompanhado pela hidrólise de uma molécula de ATP (Passo 4). O segmentode G é então religado e a molécula de ATP restante é hidrolisada (Passo 5).Em dissociação das duas moléculas de ADP, está o segmento de Ttransportado pela abertura na parte C-terminal da enzima (Passo 6).Finalmente, os domínios de ATPase N-terminais reabrem, permitindo a enzimapara dissociar o DNA (Passo 7). Agentes capazes de estabilizar o complexocovalente DNA-topoisomerase II são tradicionalmente chamados de “poisons”da toposiomerase II, ao passo que agentes que agem em um ou mais passosdo ciclo catalítico são chamados de inibidores catalíticos, Larsen, (2003).104

Fonte: Larsen, (2003)Figura 15- Ciclo catalítico da DNA topoisomerase II.Os inibidores catalíticos de topoisomerase II são compostospertencentes a um grupo heterogêneo, quanto à estrutura química (figura 16),que tanto podem interferir na ligação entre DNA e topoisomerase II(aclarubicina e suramina), estabilizando o complexo monocovalente DNAtopoisomeraseII (merbarone, ICRF-187) ou inibem a ligação do ATP(novobiocina).105

Fonte: Larsen, (2003).Figura 16 - Estrutura química de diferentes inibidores catalíticos detopoisomerase IIInibidores catalíticos de topoisomerase IIAclarubiinaÉ uma antraciclina, usada clinicamente no tratamento de leucemiamielocítica aguda. Aclarubicina é um forte agente intercalador que previne a106

ligação do topoisomerase II com o DNA, Sorensen, (1992). É um antagonistaclássico de “poisons” da topo II.Aclarubicina também inibe topo I dependendo da concentração. Altasconcentrações de aclarubicina estimulam a formação do complexo covalenteDNA-topoisomerase I, Nitiss, (1997).Ela induz dano ao DNA provavelmente durante a fase S, onde aatividade da topoisomerase é necessária para relaxar a super hélice à frente daforquilha de replicação. A morfologia de células tratadas com aclarubicina éclaramente diferente daquelas células tratadas com outros inibidores detopoisomerase II, Gieseler, (1999). Juntamente com a indução do dano DNA,aclarubicina induz crescimento celular dependente da concentração na fase G 2do ciclo celular, Larsen, (2003).SuraminÉ um composto polianiônico com propriedades antitripanosomal eantifiliarial. Altas doses de suramina modulam a atividade de numerosasenzimas celulares, principalmente topoisomerase II e certos receptores defatores de crescimento, Larsen, (2003). Usado para tratar pacientes comcâncer de próstata, Sternberg, (2003).Segundo Benini, (2001), a exposição prolongada pode causarneuropatias e linfopenia. Recentes estudos, usando baixas doses de suraminaem combinação com agentes citotóxicos como vincristina, doxorrubicina ou 5-fluorouracil têm demonstrado sua baixa toxicidade, Benini, (2001); Larsen,(2003). Esses estudos são baseados na habilidade da suramina em inibir aligação de certos fatores de crescimento presente da superfície das células,Larsen, (2003).NovobiocinaDrogas cumarínicas, como novobiocina e coumermicina podem inibirtopoisomerases por diferentes mecanismos. Novobiocina inibe a girase B em107

actérias e em humanos inibe a topoisomerase II bloqueando o sítio de ligaçãodo ATP. Pode ser usada extensivamente modulando a reposta celular tanto poragentes alquilantes quanto por outros inibidores de topoisomerase. Muitaslinhagens de células resistentes a agentes alquilantes mostram aumento deatividade para topoisomerase II, Larsen, (2003).3.23. Ação de flavonóides e outros fenóis no metabolismoEntre os antioxidantes presentes nos vegetais, os mais ativos efreqüentemente encontrados são os compostos fenólicos, tais como osflavonóides. As propriedades benéficas desses compostos podem seratribuídas à sua capacidade de seqüestrar os radicais livres, Decker, (1997).Os compostos fenólicos mais estudados são: O ácido caféico, o ácido gálico eo ácido elágico. Esses compostos de considerável importância na dieta podeminibir o processo de peroxidação lipídica, Hartman & Shankel, (1990); Halliwellet al., (1995).O ácido elágico, encontrado principalmente na uva, morango e nozes,tem sido efetivo na prevenção do desenvolvimento do câncer induzido pelasSubstâncias do cigarro.A curcumina, um composto fenólico não sendo flavonóides usado comocorante de alimentos, é um antioxidante natural derivado da cúrcuma (Curcumalonga) que tem sido extensivamente investigado. A curcumina seqüestra osradicais livres e inibe a peroxidação lipídica, agindo na proteção celular dasmacromoléculas celulares, incluindo o DNA, dos danos oxidativos, Kunchandy& Rao, (1990); Subramanian et al., (1994).Os compostos fenólicos podem inibir os processos da oxidação emcertos sistemas, mas isso não significa que eles possam proteger as células eos tecidos de todos os tipos de danos oxidativos. Esses compostos podemapresentar atividade pró-oxidante em determinadas condições, Decker, (1997).Os flavonóides atuam como antioxidantes na inativação dos radicaislivres, em ambos os compartimentos celulares lipofílico e hidrofílico. Essescompostos têm a capacidade de doar átomos de hidrogênio e, portanto, inibiras reações em cadeia provocadas pelos radicais livres, Hart man & Shankel,108

(1990); Arora et al., (1998). Os flavonóides mais investigados são: a quercetina,a miricetina, a rutina e a naringenina Hartman & Shankel, (1990).A quercetina está presente nas frutas e vegetais, e é o flavonóide maisabundante encontrado no vinho tinto. Entretanto, esse antioxidante pode reagircom ferro e tornar-se um pró-oxidante, Gaspar et al., (1993).Os flavonóides miricetina, quercetina e rutina pesquisados foram maisefetivos do que a vitamina C na inibição dos danos oxidativos induzidos peloH 2 O 2 no DNA de linfócitos humanos, Noroozi et al., (1998).Os flavonóides (-)-epicatequina e rutina apresentaram atividadeantioxidante sobre o OH - superior ao antioxidante manitol, um conhecidoseqüestrador de radicais hidroxila, Hanasaki et al., (1994).Outros flavonóides naturais, (-)-epicatequina e (-)-epigalocatequina, compropriedades antioxidantes e inibidores do processo de carcinogênese, sãoencontrados no chá verde e em menores concentrações no chá preto, Riceevanset al., (1995); Mukherjee et al., (1997).Knekt et al,. (1997) encontraram uma relação inversa entre o consumode flavonóides na dieta e o desenvolvimento de tumores em indivíduos na faixaetária de 50 anos e não-fumantes. Os autores observaram que entre as muitasfontes de flavonóides da dieta, o consumo de maçãs apresentou os melhoresresultados na prevenção do desenvolvimento de tumores no pulmão.Indução por DMBA em modelos animaisTanaka et al, 2008 avaliaram efeitos de constituintes de rosina de Pinuzspez e modelos de carcinogênese induzida em pele de camundongos comDBMA/TPA. O DMBA (7,12-dimetilbenzoantraceno é um iniciador dacarcinogênese e o TPA é um promotor).O TPA usado é o 12-0-tetradecanoilforbol-13-acetato que é conhecidocomo promotor de tumores. Após a ativação induz proliferação das célulastumorais através da ativação da PAR-2 (receptor 2 ativado de protease) namembrana plasmática.O DMBA é o modelo mais aceito de câncer oral. A hipótese de que ascélulas têm um papel no desenvolvimento do tumor e o seu conteúdo no109

granulo parece estar envolvido no aumento da proliferação de células tumoraisou por indução de angiogênese.Foi observado que células dos mastócitos derivado de mediadores e dediferentes receptores de células no câncer de colón para explorar a associaçãoentre células dos mastócitos e proliferação de células tumorais.A triptase é uma prótese liberada de células grânulos dos mastócitos einduz a proliferação de células tumorais através do estímulo ativados dereceptores PAR-2 ativados (do tripotirobina quinase) na membrana plasmáticade células tumorais. Inicialmente foi sugerido que a triptase seria um agonistado PAR-2 em células endoteliais de aorta de bovinos.A triptase deteriora a barreira da função endotelial em células por induzirstress durante a formação das fibras de actina e ruptura de caderinas queatuam nas paredes das células endoteliais.Tem sido demonstrado que o estímulo de PAR-2 por triptase dosmastócitos em células do carcinoma humano DLD-1 in vitro induz proliferação.PAR-2 é um dos receptores do tipo tirosina quinase (TKR) ligado às proteínasRas (GTPase intracelular é uma proteína que age na redução desta).As Ras ativada induz a síntese de cascata de quinases que culmina coma ativação das MAP quinases (proteases ativada por mitose), que não sãoserino proteases quinases. Estas são capazes de translocar o núcleo,regulando a tradução de fatores de fosforilação, que regulam a expressão deproteínas do ciclo celular e induzem a proliferação de células tumorais.Os receptores de PAR-2 também são agonistas da triptase dependentesda produção de Prostaglandina E 2 e da ciclooxigenase. Este efeito foiobservado na inibição da produção de PGE 2 por indometacina resultando nainibição na resposta proliferativa por interação entre triptase e PAR-2.Aronando et al, 2007 relataram efeitos potenciais de células dosmastócitos em hamster com carcinogênese induzida por DMBA. Nestapesquisa foi relatado que o processo de ativação da carcinogênese leva àformação de produtos liberados dos mastócitos são estocados em grânulos. Atriptase é uma protease liberada das células dos mastócitos.110

Tabela 8 – Formas de indução de câncerTipo1. Carcinógeno genotóxicoPrimário, ação direta, agentesalquilantesExemploDimetilsulafato, etilenoamina, -propiolactonela2. Pro-carcinógenosHidrocarbonos aromáticos policíclicos Benzo(a)pirenoNitrosaminasDimetilnitrosamijnaHidrazina1,2-dimetilhidrazinaInorgânicoCadmo, plutônio3. Carcinógenos epigentéticosPromotoresEstado sólidoHormôniosImunossupressoresCocarcinógenosEsteres de ferbol, sacarina, ácidosbiliaresAsbestos, plásticoEstrógenoAnálagos de purinaCatecol4. Não classificados ClofibratoFonte: Reddy, (2003).Existe relação entre exposição a carcinógenos e predisposição genética,Reddy, (2003).Carcinogênese químicaAtualmente sabe-se que muitas formas de câncer são causadas pelaexposição a certos agentes químicos (carcinógenos químicos). Os agentesquímicos incluem produtos naturais e subprodutos industriais, assim comopoluentes ambientais. Os agentes químicos carcinogênicos em sua maioriaprecisam ser metabolizados pelo organismo para se transformarem em111

derivados que reajam covalentemente com DNA, RNA, e proteínas celulares,Reddy, (2003). Alguns exemplos de carcinógenos químicos estão mostradosna figura 17. A variação na estrutura e potência sugere muitos mecanismosenvolvidos na carcinogênese, Guengerich, (2001).Fonte: Reddy, (2003).Figura 17 – Estrutura de alguns carcinógenos químicos.O carcinoma de fígado é o quinto câncer mais comum no mundo eestima-se 473.000 novos casos anualmente, Wild, (2000). Baseados nosmecanismos de ação, os hepatocarcinógenos químicos têm sido classificadosem duas categorias (tabelas 6 e 7): genotóxicos ou carcinógenos com açãodireta, que formam ligações covalentes co DNA nuclear e induzem trocasgenéticas na célula em replicação; e os não-gentóxicos ou carcinógenosepigenéticos, em que sal ação não envolve alterações na estrutura do DNA oudano genético, Wogan, (2000).112

Tabela 9 – Carcinógenos genotóxicos do fígado que humanos podem estarexpostosMicotoxinas contaminantes de alimentosAflatoxinas B 1 , G 1 e M 1 ; ochratozina AToxinas produzidas por cianobactérias em águas de beber poluídasMicrocistina –LRConstituintes de plantas usadas por alimentos ou medicamentosCicasina (metilazoxymetanol)Derivados alquibenzenosSafrol: metileugenol, beta aseroneAlcalóides de pirrolizidinaQuímicos produzidos durante processamento e cocção de alimentosComposto N-nitrosoDimetilnitrosamina, N-nitrosopirrolidinaAminas heterocíclicasProdutos pirrólicos aminoácidosDrogasTamoxifenoFonte: Wogan, (2000).113

Tabela 10- Carcinógenos não-genotóxicos do fígado que humanos podemestar expostosMicotoxinasFumonisinasProliferadores de peroxissomosTricloroetileno, dietilexilfalato, clofibratoHidrocarbonos clorinatadosPesticidas organoclóricosPoliclorinatos bifenóisTCDDSolventes (clorofórmio)DrogasOxazepanFonte: Wogan, (2000).Além da aflatoxina, a micotoxina fumonisina B produzida por Fusariumssp, que contaminam principalmente cereais estão sendo associados comohepato e nefrocarcinógenos.A ochratoxina A é uma micotoxina produzida por Aspergillus ochraceus ePenicillium verrucosum, são comumente encontrados em cereais, leguminosas,café entre outros. Esta micotoxina é associada a problemas nefrotóxicos,hepatotóxicos, imunossupressores e teratogênicos. Recentes estudos relatamtumores no trato urinário e fígado de ratos e camundongos.Carcinogênese por radiaçãoNos Estados Unidos, em 2003, espera-se 54.200 novos casos demelanoma e aproximadamente 7.600 desses irão a óbito,. Zafiropoulos, (2003)relata que o câncer de pele é um dos tipos mais comuns de cânceresatualmente.Existe uma diferença entre carcinomas de células escamosas (SCC) ecarcinomas de células basais (BCC). O SCC é mais agressivo, provocainvasão localizada e metástase potencial. Já o BCC é menos agressivo,114

crescimento lento, raramente causa metástase e acomete principalmentepessoas mais velhas, Zafiropoulos, (2003).Exposição repetida e crônica de crianças a luz do sol está sendoepidemiologicamente mostrada como causa principal de câncer de pele Albert,(2003); Ichihashi, (2003). Radiação ultravioleta (UVB) é o menor componenteda luz do sol que alcança a superfície da Terra e é experimentalmentedemonstrada como a mais efetiva luz que induz câncer de pele em animais epode causar danos no DNA, particularmente nos dímeros ciclobutano pirimidinae foto produtos que induzem mutação em células epidérmicas, levando aodesenvolvimento do câncer, Ichihashi, (2003). UVB também é conhecido porregular a expressão do gene através de passos de transdução de sinaisintracelular que pode contribuir para o desenvolvimento de câncer de célula epromoção do tumor. Em adição, UVB promove uma supressão da reaçãoimune, induz tolerância a antígenos. Luz ultravioleta A (UVA) e radiação UVBpromovem danos no DNA diretamente ou indiretamente através de estresseoxidativo, Ichihashi, (2003).Alimentação e câncerA dieta possui uma grande contribuição na etiologia e prevenção docâncer, Greenwald, (2001). Porém, ainda, muitas questões precisam seresclarecidas, incluindo exatamente como específicos fatores dietéticos estárelacionado na prevenção do câncer, como fatores dietéticos podem interagirpara aumentar o risco de câncer. Estudos epidemiológicos, embasados emdados de experimentos com animais e in vitro têm contribuído imensamentepara ajudar elucidar a ligação existente entre dieta e prevenção de câncer,Greenwald, (2001).Muitas evidências têm sugerido que modificações no estilo de vidapodem diminuir o risco de câncer como redução da ingestão de gorduras,principalmente de origem animal, aumento da ingestão de fibras, incluindovariedade de vegetais e frutas, prática de atividade física, manutenção do pesoideal, consumo moderado de bebida alcoólica e minimizar consumo de são ecomidas defumadas, Platz, (2000).115

Vegetais e frutasA literatura indica que muitos produtos naturais são estudados comoagentes quimioprotetores contra cânceres de ocorrência mundial, Reddy,(2003). Os maiores grupo desses produtos são potentes antioxidantes efenólicos naturais. Esses produtos naturais são encontrados principalmente emfrutas e vegetais (Tabela 11) como também extratos de plantas e ervas, Reddy,(2003). As evidências epidemiológicas sugerem a proteção contra uma grandevariedade de cânceres, particularmente do trato respiratório e digestivo,incluindo também câncer de boca, faringe, esôfago, pulmão, estômago, cólon ereto, Greenwald, (2001). Muitos constituintes de plantas podem serresponsáveis por efeitos protetores. Muitos desses constituintes podem sercompostos fenólicos ou polifenólicos como flavonóides, catequinas do chá,ésteres fenólicos, ácidos fenólicos, quercetina, Reddy, (2003). Dos muitosanticarcinógenos detectados em plantas comestíveis, os antioxidantesvitaminas C e E e o -caroteno têm recebido uma grande atenção.Atualmente uma das classes de compostos mais pesquisados no câncersão flavonóides, curcumina, carotenóides, alcalóides, terpenóides, diversosóleos essenciais com diferentes naturezas químicas.116

Tabela 11 - Antioxidantes quimioprotetores de frutas e vegetais.Fonte Componente ativo Mecanismo de ação Cânceres reduzidosAzeitonas Polifenóis Antioxidante Vários cânceresMaçãs Antioxidante Vários cânceresMorangos,Vitamina C,AntioxidanteVários cânceres“cantaloupe”, melão bioflavonóides,“chalcones”Repolho verde, Vitamina C, luteina, Antioxidante, suprime Vários cânceresbrócolis, couve-flor zeaxantinapromoção de tumor depulmão em ratosÓleos vegetais, óleos Vitamina EProteção contra Câncer de pelequentes de semente,germe de trigoperoxidação delipídiosVegetais e frutasmarelo-alaranjado-caroteno Antioxidante Câncer de mama,cólon, célula dofígado, câncer defígado e cólon emcamundongosCenouras-caroteno ecompostos fenólicosAntioxidante,expressão do geneLeucemia, câncer depulmãopS2Tomate Licopeno, vitamina C Potente antioxidante, Vários cânceresinibe danos ao DNAUvas, vinho tinto, Fenóis, catequinas, Antioxidante, estimula Vários cânceresfrutas cítricas -criptoxantina,bioflavonóides,“chalcones”, vitaminaCexpressão do gene p-73Alho, cebola, alhoporró,Alicina, flavonóides, DetoxificamCâncer de estômagocebolinha vitamina C, selênio carcinógenos, inibe abactéria H. pyloriFeijão Compostos fenólicos Antimutagênico Câncer induzidos poraflatoxina.Fonte: Reddy, (2003).Flavonóides e câncerFlavonóides são metabólitos secundários de plantas e definidosquimicamente como substâncias compostas por uma estrutura comum de117

fenilcromanona (C 6 -C 3 -C 6 ) com substituição em uma ou mais hidroxilas,incluindo derivados (Birt, 2001). (Tabela 12)Tabela 12- Estrutura química de certos flavonóides de ocorrência em plantas.Fonte: Birt, (2001).Mais de 6000 diferentes flavonóides têm sido descritos, Marchand,(2002); Yang, (2001). Os flavonóis são mais abundantes em alimentos. Aquercetina, kaempferol e merecetina compõem os três mais comuns flavonóis.Flavanonas são encontradas principalmente frutas cítricas e flavones em aipo.Catequinas estão presentes em grande número de chás verdes, preto e vinhotinto, antocianinas são encontradas em morangos e as Isoflavonas sãoencontrados quase exclusivamente em comidas derivadas da soja Marchand,(2002).118

Os flavonóides são usualmente absorvidos por difusão passiva, apósserem glicosilados e convertidos em agliconas, Marchand, (2002) porglicosidases em alimentos ou da mucosa gastrointestinal, ou da microflora docólon Yang, (2001). Após sua absorção, os flavonóides são conjugados nointestino delgado, fígado pela glicuronidação, sulfatação ou metilação oumetabolizados a pequenos compostos fenólicos, Marchand, (2002); Yang,(2001).Um grande número de flavonóides suprime a carcinogênese em váriosmodelos animais, Rashmi, (2003). Existe um considerável interesse nessescompostos que parecem exercer efeitos benéficos em mecanismo que envolvea patogênese do câncer. A propriedade antioxidante dos flavonóides foi oprimeiro mecanismo de ação estudado, Marchand, (2002), em particular comrelação ao efeito protetor contra doenças cardiovasculares, Yang, (2001).Flavonóides também possuem efeitos benéficos na bioativação decarcinógenos. Os flavonóides quercetina, kaempferol e galangina e a flavonaapigenina estão associados com a inibição do citocromo P450 e enzimas dafamília CYP1A. Essas enzimas possuem uma grande função na ativação deum número suspeito de carcinógenos humanos como hidrocarbonetospolicíclicos e aminas heterocíclicas. Marchand, (2002), Birt, (2001). Aquercetina e a naringenina inibem CYP3A4 e contribuem para o efeitosupressor. Marchand, (2002).Vários flavonóides como quercetina, apigenina e catequinas do chápossuem atividade anti-inflamatória inibindo a cicloxigenase e (COX-2) einduzindo a óxido nítrico sintase. Inflamações crônicas estão relacionadas naetiologia de um grande número de cânceres e inibidores COX-2 estão sendoestudados como agentes quimioprotetores contra câncer de cólon. Marchand,(2002); Yang, (2001).As atividades antiproliferativas têm sido relacionadas com propriedadesanti-estrogênicas de certos flavonóides (isoflavonóides, quercetina). AGenisteína e quercetina inibem a proteína tirosina quinase que está envolvidana proliferação celular. A apigenina, luteolina e quercetina têm sidorelacionadas por impedir ciclo celular e apoptose pelo mecanismo dependentede p-53. Flavonóides ativem genes supressores de tumores do tipo p53. Os119

flavonóides ativam genes supressores de tumores do tipo p-53 e p-31induzindo o apoptose de células tumorais.4- METODOLOGIAForam utilizados neste ensaio biológico experimental 48 ratos da raçawistar, com 45 dias de vida. Os animais foram provenientes do Biotério Centraldo centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa.Os ratos foram acondicionados em gaiolas individuais, ondepermaneceram por um período de adaptação de cinco (05) dias, recebendoração PURINA e água “ad libitum”.Para indução do câncer de pele foi utilizado o carcinogênico químicoDMBA (7,12-dimetil bezantraceno). Foi dissolvido 25µg de DMBA em 0,1 mLde acetona e administrado 2 vezes por semana através de pinceladas na peledo dorso do animal após a retirada de pelos, durante seis semanas, á exceçãodo grupo Grupo 1. Para testar a redução da patologia foram utilizados ostratamentos citados abaixo.G1- RaçãoG2- Ração + DMBAG3- Ração + DMBA + Bixina 4% (0,5 mL)G4- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL)G5- Ração + DMBA + Bixina 5% (0,5 mL)G6- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL)G7- Ração + DMBA + Bixina 10% (0,5 mL)G8- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL)Durante 06 semanas os animais receberam a ração e os tratamentosdiários por via oral, sendo que os tratamentos por cavagem. Ao final doexperimento houve a coleta de sangue pelo plexo retro orbital para que fossemfeitas análises de Proteína Total, Colesterol, Triglicerídeos, Glicose, FosfataseAlcalina e Albumina. O material foi centrifugado em centrífuga Excelsa 2 205 Na 7.100 X g, durante 15 minutos, para obtenção do soro. As dosagenssorológicas foram efetuadas em equipamento multiparamétrico de BioquímicaAlizé, Mod Lisabio B.652 e kits da marca Bioclin e os resultados expressos em120

mg/dL e os resultados expressos em mg/dl. Ainda foram coletadas amostras depele para análises histopatologicas.121

5- RESULTADOS E DISCUSSÃOQuadro 4 - Valores médios de proteínas totais, colesterol e triaciglicerol em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixinacomparados ao grupo doente.TRATAMENTOS%CONTEÚDO VARIAÇÃO%CONTEÚDO VARIAÇÃO%CONTEÚDO VARIAÇÃOProteína Total (mg/dL) Colesterol (mg/dL) Triacilglicerol (mg/dL)G2- Ração + DMBA 82,70 A 0 108,21 A 0 36,16 A 0G1- Ração 83,51 A +1 111,60 A +3 40,16 A +11G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (0,5 mL) 80,60 A -3 152,83 B +41 32,93 A -9G4- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 76,65 A -7 117,55 A +9 51,08 A +41G5- Ração + DMBA + Bixina 5% (0,5 mL) 81,14 A -2 126,76 A +17 48,46 A +34G6- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 80,55 A -3 114,18 A +6 64,71 A +79G7- Ração + DMBA + Bixina 10% (0,5mL) 88,92 A +8 127,63 A +18 38,82 A +7G8- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 87,25 A +6 149,11 B +38 37,65 A +4Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.122

De acordo com os resultados obtidos no quadro 4, observou-se que osgrupos 3, 4, 5 e 6 tratados, tiveram uma redução na concentração de proteínastotais em relação ao grupo 2 (com câncer não tratado). Os grupos 7 e 8apresentaram aumentos na concentração de proteínas totais (8 e 6%)respectivamente, embora não tenha sido estatisticamente significativo emrelação ao grupo 2.Um aumento na concentração de proteínas totais normais éinteressante, uma vez que as mesmas têm diferentes funções no sangue etambém, porque durante a carcinogenese, muitas oncoproteínas sãosintetizadas nas células tumorais, ocasionando uma hipoproteinemia, nascélulas normais.Algumas (das proteínas do sangue como a albumina, globulinas, beta egama), ceruloplasmina, haptoglobinas, transferrina, transcortina têm açõesdiferenciadas no sangue.A hipoproteinemia pode ocorrer em edemas, doença hepática, anemiacom deficiência de ferro, doença de Wilson dentre outras. Ahipogamaglobilinemia ocorre no mielona múltiplo, leucemias, linfomas dentreoutras. No entanto sabe-se que durante a carcinogenese várias oncoproteínassão formadas e isto afeta o metabolismo normal de proteínas nas célulasnormais. Portanto aumentar a síntese de proteínas totais é interessante paraos pacientes. Ainda no quadro 1, observou-se que os animais com câncerinduzido por DMBA em todos os tratamentos tiveram aumento no parâmetrocolesterol, sendo que o grupo 8 foi o que teve o maior aumento desteparâmetro. Os resultados mostram que o grupo 3 foi o que mais aumentou aconcentração de colesterol.No que diz respeito ao parâmetro triacilglicerol os tratamentosaumentaram os níveis, com exceção do grupo 3 que reduziu em 9%. Tambémo maior aumento de triacilglicerol ocorreu com o grupo 6 (tratado com bixina à5% na dose de 1mL).A bixina não se apresentou eficaz para a redução do triacilglicerol nosanimais com câncer induzidos por DMBA (7,12 dimetilbenzo(a)antraceno, comotambém no seu efeito hipolipidemico, significando dizer que não apresentouinfluência na redução das taxas de lipídeos no sangue destes animais.123

Quadro 5 - Valores médios de glicose, fosfatase alcalina e albumina em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixinacomparados ao grupo não tratado.TRATAMENTOS%CONTEÚDO VARIAÇÃO%CONTEÚDO VARIAÇÃO%CONTEÚDO VARIAÇÃOGlicose (mg/dL)Fosfatase Alcalina(UI/mLAlbumina (UI/dL)G2- Ração + DMBA 207,83 A 0 66,66 A 0 4,27 A 0G1- Ração 229,39 A +10 80,00 A +20 4,42 A +3G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (0,5 mL) 191,11 A -8 66,66 A 0 4,27 A 0G4- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 186,73 A -10 119,00 B +79 3,93 A -8G5- Ração + DMBA + Bixina 5% (0,5 mL) 213,74 A +3 128,20 B +92 3,88 A -9G6- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 175,63 A -15 131,00 B +97 3,63 B -15G7- Ração + DMBA + Bixina 10% (0,5mL) 172,79 A -17 92,00 A +38 4,09 A -4G8- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 189,40 A -9 90,50 A +36 4,24 A -1Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.124

De acordo com os resultados obtidos no quadro 5, observou-se quetodos os tratamentos dos grupos 3, 4, 6, 7 e 8 tiveram o parâmetro glicosereduzido. O grupo 7 foi o que mais reduziu a glicose (-17%). Durante acarcinogenese a via glicolitica é aumentada, portanto há um maior metabolismode glicose. e consequentemente redução na circulação sanguinea. Todos osgrupos de 2 a 8 foram tratados com a droga DMBA, indutora de câncer.No que diz respeito ao parâmetro fosfatase alcalina, todos ostratamentos afetaram a atividade desta enzima, com exceção do grupo 3. Aenzima fosfatase alcalina é um dos marcadores tumorais e sua atividadeaumentada está relacionada a processos de carcinogenese hepática, Lima etal, (1980). A fosfatase alcalina encontra-se elevada no raquitismo (aumento de20 a 30 unidades), doença de Paget (elevada na ordem de 50 unidades).Também, aumenta a atividade no hiperparatireoidismo, icterícia obstrutiva,lieloma múltiplo, sarcoma osteogênico, dentre outras patologias. Na hepatiteocorre alterações com níveis inferiores a 10 unidades, Os valores da atividadede fosfatase alcalina podem estar 25% mais elevadas após a ingestão de umadieta rica em gordura. Motta, (2003)O parâmetro albumina apresentou pequenas reduções nos grupos 4, 5,6, 7 e 8. A maior redução de albumina ocorreu no tratamento do grupo 6 quepermitiu uma redução de 15%. A albumina tem sua concentração aumentadasempre em presença de nutrientes e de fármacos ou de outras substânciaspresentes no sangue, uma vez que ela é uma das proteínas transportadoraspresentes no sangue.A albumina tem como principal função transportar ácidos graxos,transporte de bilirrubina do sistema reticulo endotelial para o fígado, transportede fármacos. Os níveis séricos de albumina são dependentes da velocidade dasíntese, da secreção pela célula hepática, da distribuição pelos líquidoscorporais e da degradação.A hiperalbuminemia ocorre na carcinomatose hepática, desidratação,diarréia, menigite, neoplasias, osteomelite, sarcoidose dentre outras. Ahipoalbuminemia é promovida pela redução ou defeito na síntese devido aodano hepatocelular, deficiência na ingestão de aminoácidos, aumento dasbordas de albumina e catabolismo por estresse. Motta, (2002).125

6- CONCLUSÕESOs resultados apresentados no experimento de carcinogenese induzidospor DMBA revelaram que:1- Os animais que receberam bixina 10% na dose de 0.5 mL tiveram amaior redução da glicose a 17%, à exceção do grupo tratado combixina a 5% na dose de 0,5 mL2- A atividade da fosfatase alcalina foi maior no grupo 6, tratado combixina a 5% na dose de 1,0 mL. Essa enzima é um dos marcadorestumorais utilizados no trabalho;3- O tratamento com bixina 5% na dose de 1,0 mL foi o que maisreduziu a concentração de albumina na ordem de 15%. A albumina éum transportador universal de medicamentos e nutrientes para ostecidos.4- O tratamento com bixina a 10% na dose de 0.5 mL foi o que maisinfluenciou o aumento na concentração de proteínas totaissanguíneas. Isto é de suma importância, uma vez que durante acarcinogenese ocorre uma intensa síntese de oncoproteinas,reduzindo a síntese de proteína normal no organismo do animal;5- Todos os tratamentos apresentaram aumento na concentração decolesterol sanguíneo nos animais com câncer induzido;6- Todos os tratamentos, também influenciaram o aumento daconcentração de triacilglicerois no soro sanguíneo dos animais comcâncer induzidos, à exceção do grupo tratado com bixina a 4% nadose 0,5 mL que reduziu em 9%126

Experimento 03Corantes naturais de urucum (Bixa orellana L.) em animais comcâncer induzido com DMBA.1- METODOLOGIAForam utilizados neste ensaio biológico experimental 36 ratos da raçawistar, com 45 dias de vida. Os animais foram provenientes do Biotério Centraldo centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa.Os ratos foram acondicionados em gaiolas individuais, ondepermaneceram por um período de adaptação de cinco (05) dias, recebendoração PURINA e água “ad libitum”.Para indução do câncer de pele foi utilizado o carcinogênico químicoDMBA (7,12-dimetil bezantraceno). Foi dissolvido 25µg de DMBA em 0,1 mL deacetona e administrado 2 vezes por semana através de pinceladas na pele dodorso do animal após a retirada de pelos, durante seis semanas, á exceção dogrupo Grupo 1. Para testar a redução da patologia foram utilizados ostratamentos citados abaixo.G1- RaçãoG2- Ração + DMBAG3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1mL)G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1mL)G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1mL)G6- Ração + DMBA + Rutina (30mg)Durante 06 semanas os animais receberam a ração e os tratamentosdiários por via oral, sendo que os tratamentos por cavagem. Ao final doexperimento houve a coleta de sangue pelo plexo retro orbital para que fossemfeitas análises de uréia, creatinina, ácido úrico, proteínas, cálcio, magnésio,fósforo, HDL, colesterol, triglicerideos, glicose, ferro, LDH, TGO, TGP, fosfatasealcalina, amilase, albumina,. O material foi centrifugado em centrífuga Excelsa2 205 N a 7.100 X g, durante 15 minutos, para obtenção do soro. As dosagenssorológicas foram efetuadas em equipamento multiparamétrico de Bioquímica127

Alizé, Mod Lisabio B.652 e kits da marca Bioclin e os resultados expressos emmg/dL e os resultados expressos em mg/dl. Ainda foram coletadas rim, fígado,intestino e amostras de pele para análises histopatologicas.128

2- RESULTADO E DISCUSSÃOTabela 1 - Valores médios de uréia, creatinina e ácido úrico em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina e Rutinacomparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOUREIA(mg/dL)CREATININA(mg/dL)ÁCIDO ÚRICO(mg/dL)G2- Ração + DMBA 82,40 A 0 0,38 A 0 1,85 A 0G1- Ração 79,23 A -4 0,50 A +31 1,41 A -24G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 85,33 A +4 0,43 A +11 2,77 B +50G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 84,62 A +3 0,43 A +11 2,58 B +39G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 80,95 A -2 0,49 A +29 3,57 B +93G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 86,00 A +4 0,62 B +62 3,99 B +116Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.129

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 1 Observou-se que osanimais dos grupos 3 e 6 tiveram um aumento de 4% na concentração deuréia. Estes valores não foram estatisticamente significativos em relação aogrupo 2. No entanto para o parâmetro cretatinina neste mesmo quadroobservou-se que o tratamento de grupo 5 e do grupo 6 promoveu aumentos de29% e 62% respectivamente. Possivelmente o uso do DMBA tenha provocadoeste aumento e danos renais.Para o parâmetro ácido úrico os grupos 3, 4, 5 e 6 provocaramaumentos de 50, 39, 93 e 116% respectivamente. Estes aumentos foramestatisticamente significativos em relação ao grupo 2. Aumentos de ácido úricotambém estão associados a danos renais.130

Tabela 2 - Valores médios de proteína, Cálcio e Magnésio em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina e Rutinacomparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOPROTEÍNA(mg/dL)CÁLCIO(mg/dL)MAGNÉSIO(mg/dL)G2- Ração + DMBA 86,13 A 0 8,74 A 0 2,96 A 0G1- Ração 79,37 B -8 9,40 A +8 2,80 A -5G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 87,12 A +1 8,50 A -3 3,07 A +4G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 87,12 A +1 8,54 A -2 2,96 A 0G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 90,82 A +5 9,83 A +12 3,35 A +13G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 100,88 B +17 9,81 A +12 3,18 A +8Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.131

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 2 observou-se que osanimais dos grupos 5 e 6 aumentaram a concentração de proteínas em 5 e17% respectivamente. Isto é uma vantagem uma vez que durante acarcinogenese ocorre síntese de oncoproteinas e as proteínas normais doorganismo são reduzidas. De acordo com os resultados obtidos para cálcio,observou-se que os grupos 5 e 6 provocaram um aumento de cálcio de 12%.Para o parâmetro magnésio os grupos 5 e 6 também provocaram um aumentode 13 e 8% respectivamente.Durante a carcinogenese todo o metabolismo é acelerado e as enzimasrequerem mais cálcio e Mg +2 como cofatores enzimáticos.132

Tabela 3 - Valores médios de fósforo, HDL e colesterol em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina e Rutinacomparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOFOSFORO(mg/dL)HDL(mg/dL)COLESTEROL(mg/dL)G2- Ração + DMBA 5,64 A 0 57,62 A 0 98,72 A 0G1- Ração 6,73 A +19 53,02 A -8 100,77 A +2G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 5,67 A 0 55,10 A -4 95,58 A -3G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 6,79 A +20 59,48 A +3 110,93 A +12G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 7,47 B +32 65,47 A +14 120,08 B +22G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 6,33 A +12 69,28 B +20 124,58 B +26Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.133

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 3, observou-se que osanimais dos grupos 4, 5 e 6 influenciaram um aumento de 20, 32 e 12%respectivamente. No parâmetro fósforo. Durante a carcinogenese variasoncoproteínas requerem maior quantidade de fósforo.Os animais tratados com DMBA dos grupos 5 e 6 tiveram aumentos de14 e 20% no parâmetro HDL. É de se esperar que todo o metabolismo estejaaumentado na carcinogenese. De acordo com os resultados obtidos no quadro3 os animais tratados com DMBA dos grupos 4, 5 e 6 tiveram aumentos de 12,22 e 26% respectivamente.134

Tabela 4 - Valores médios de triglicerídeos, glicose e ferro em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina e Rutinacomparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOTRIGLICERÍDEOS(mg/dL)GLICOSE(mg/dL)FERRO(mg/dL)G2- Ração + DMBA 66,35 A 0 221,53 A 0 181,72 A 0G1- Ração 88,08 B +33 208,45 A -6 230,53 B +27G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 68,45 A +3 201,12 A -9 147,48 B -19G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 72,88 A +10 191,20 A -14 173,05 A -5G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 67,95 A +2 265,53 B +20 205,67 A +13G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 75,28 A +13 316,98 B +43 215,63 B +19Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Belina em diferentesdoses e concentrações.135

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 4, observou-se que osanimais dos grupos 4 e 6 tiveram aumento de triacilgliceróis de 10 e 13%respectivamente. Para o parâmetro glicose os grupos 5 e 6 tiveram aumentosde 20 e 43% respectivamente. Durante a carcinogenese a via glicolítica éacelerada e o metabolismo de glicose (catabolismo) se intensifica.De acordo com os resultados obtidos os grupos 5 e 6 tiveram aumentosde 13 e 19% respectivamente. Durante a carcinogenese ocorre proteólise devárias proteínas que contém ferro em sua molécula.136

Tabela 5 - Valores médios de LDH, TGO/A e TGP/ALT em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina e Rutinacomparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOLDH(mg/dL)TGO/A(UI/mLTGP/ALT(UI/mLG2- Ração + DMBA 7480,33 A 0 60,50 A 0 31,17 A 0G1- Ração 908,00 B -88 87,17 B +44 31,33 A +1G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 728,17 B -90 67,83 A +12 30,33 A -3G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 693,50 B -91 108,55 B +79 34,83 A +12G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 3617,33 B -52 123,05 B +103 28,67 A -8G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 2409,83 B -68 132,33 B +119 32,50 A +4Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.137

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 5, observou-se quetodos os grupos reduziram a atividade da enzima Lactato Desidrogenase. Osanimais do grupo 1 (doente) tiveram aumento de 88% em relação ao gruponormal.Esta enzima cataliza a conversão do Lactato em Purivato. Sua atividadeestá muito aumentada durante a carcinogenese. Mota et al, (2003). Éimportante verificar que na carcinogenese a via glicolitica é intensificada. Oproduto final da via glicolítica é o lactato que formado em grandes quantidadesnecessita de aumento na atividade da Lactato Desidrogenase para formarpiruvirato. Este vai para o ciclo de Krebs e outras rotas metabólicas. A enzimaTGO teve suas atividades aumentadas nos grupos 4, 5 e 6. Uma intensaproteólise que ocorre na carcinogenese favorece a desaminação deaminoácidos e, portanto aumento da atividade da TGO que realiza estastransformações. Em relação à atividade da TGP observaram-se pequenasvariações.138

Tabela 6 - Valores médios de fosfatase alcalina, amilase e albumina em soro sanguíneo de ratos tratados com Bixina eRutina comparados ao grupo doente não tratado.TRATAMENTOS CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃO CONTEÚDO % VARIAÇÃOFOSFATASE ALCALINA(mg/dL)AMILASE(mg/dL)ALBUMINA(mg/dL)G2- Ração + DMBA 131,50 A 0 803,17 A 0 4,36 A 0G1- Ração 207,67 B +58 1001,67 A +25 4,22 A -3G3- Ração + DMBA + Bixina 4% (1,0 mL) 173,17 B +32 937,33 A +17 4,70 B +8G4- Ração + DMBA + Bixina 5% (1,0 mL) 206,00 B +57 1199,20 B +49 4,63 A +6G5- Ração + DMBA + Bixina 10% (1,0 mL) 186,17 B +42 942,67 A +17 4,80 B +10G6- Ração + DMBA + Rutina 30mg (1,0 mL) 142,83 A +9 1188,00 B +48 5,03 B +15Teste de Dunnett a 5% de significância letras iguais equivalem a tratamentos não diferentes do doente – Bixina em diferentesdoses e concentrações.139

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 6 observou-se que afosfatase alcalina teve sua atividade aumentada nos grupos 3, 4, 5 e 6 em 32,57, 42 e 9% respectivamente. Esta enzima é considerada um marcadortumoral. Nos animais com câncer não tratados (G1), a atividade dela foireduzida em 58% .Os resultados da atividade da amilase mostraram-se superiores nosgrupos 4 e 6 com 49 e 48% respectivamente. Esta enzima atua na hidrólise doscarboidratos. Nos animais com câncer não tratados sua atividade foi reduzidaem 25%.Com relação aos resultados obtidos para proteína e albumina observouseque os grupos 5 e 6 tiveram aumentos de sua concentração em 10 e 15%.Esta proteína é transportadora de nutrientes, medicamentos e compostos defototerápicos.140

3- CONCLUSÕES1- Para o parâmetro ácido úrico os grupos 3, 4, 5 e 6 provocaramaumentos de 50, 39, 93 e 116% respectivamente. Estes aumentos foramestatisticamente significativos em relação ao grupo 2. Alterações em ácidoúrico e creatinina estão associados a aumento de danos renais.2- De acordo com os resultados obtidos no Quadro 2 observou-se queos tratamentos dos animais dos grupos 5 e 6 aumentaram a concentração deproteínas em 5 e 17% respectivamente. Isto é uma vantagem uma vez quedurante a carcinogenese ocorre síntese de oncoproteinas e as proteínasnormais do organismo são reduzidas.3- De acordo com os resultados obtidos para cálcio, observou-se que osgrupos 5 e 6 provocaram um aumento de cálcio de 12%. Há vantagens noaumento deste parâmetro, mas não na carcinogênese.4-Para o parâmetro magnésio os grupos 5 e 6 também provocaram umaumento de 13 e 8% respectivamente.Durante a carcinogenese todo o metabolismo é acelerado e as enzimasrequerem mais cálcio e Mg +2 como cofatores enzimáticos.5-De acordo com os resultados obtidos no Quadro 3, observou-se queos tratamentos dos animais dos grupos 4, 5 e 6 influenciaram um aumento de20, 32 e 12% respectivamente no parâmetro fósforo. Durante a carcinogenesevarias oncoproteínas requerem maior quantidade de fósforo.6-Os animais tratados com DMBA dos grupos 5 e 6 tiveram aumentos de14 e 20% no parâmetro HDL. É de se esperar que todo o metabolismo estejaaumentado na carcinogenese.7-De acordo com os resultados obtidos no Quadro 4, observou-se queos animais dos grupos 4 e 6 tiveram aumento de triacilgliceróis de 10 e 13%respectivamente. Logo animais tratados com DMBA não reduzemtriacilgliceróis durante a carcinogênese e os extratos de urucum nãoinfluenciaram nesta redução.141

8-Para o parâmetro glicose os grupos 5 e 6 tiveram aumentos de 20 e43% respectivamente. Durante a carcinogenese a via glicolítica é acelerada e ometabolismo de glicose (catabolismo) se intensifica.9-De acordo com os resultados obtidos para o parâmetro ferro os grupos 5 e 6tiveram aumentos de 13 e 19% respectivamente. Durante a carcinogeneseocorre proteólise de várias proteínas que contém ferro em sua molécula10-De acordo com os resultados obtidos no Quadro 5, observou-se que todosos grupos reduziram a atividade da enzima Lactato Desidrogenase. Os animaisdo grupo 1 (doente) tiveram aumento de 88% em relação ao grupo normal. Suaatividade está muito aumentada durante a carcinogenese. Mota et al, (2003). Éimportante verificar que na carcinogenese a via glicolitica é intensificada. Oproduto final da via glicolítica é o lactato que formado em grandes quantidadesnecessita de aumento na atividade da Lactato Desidrogenase para formarpiruvirato.11-A enzima TGO teve suas atividades aumentadas nos grupos 4, 5 e 6.Uma intensa proteólise que ocorre na carcinogenese favorece a desaminaçãode aminoácidos e, portanto aumento da atividade da TGO que realiza estastransformações.12-De acordo com os resultados obtidos no Quadro 6 observou-se que afosfatase alcalina teve sua atividade aumentada nos grupos 3, 4, 5 e 6 em 32,57, 42 e 9% respectivamente. Esta enzima é considerada um marcadortumoral. Nos animais com câncer não tratados (G1), a atividade dela foireduzida em 58% .13-Os resultados da atividade da amilase mostraram-se superiores nosgrupos 4 e 6 com 49 e 48% respectivamente. Esta enzima atua na hidrólise doscarboidratos. Nos animais com câncer não tratados sua atividade foi reduzidaem 25%.14-Com relação aos resultados obtidos para proteína e albuminaobservou-se que os grupos 5 e 6 tiveram aumentos de sua concentração em10 e 15%. Esta proteína é transportadora de nutrientes, medicamentos ecompostos de fototerápicos.Pode-se concluir que os tratamentos com bixina e rutina nãoinfluenciaram na redução de marcadores tumorais e de outros parâmetros142

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5- LAMINAS HISTOPATOLOGICASGRUPO 1- RAÇÃOFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesO fígado normal possui lóbulos hepáticos poligonais, delimitados porseptos conjuntivos, que se orientam ao redor de uma veia central. Oshepatócitos dispõem-se em cordões de células que convergem para a veiacentral. Entre os cordões de hepatócitos estão os capilares sinusóides,frequentemente contendo sangue em seu interior.O Figado é dividido em diversos lóbulos. Cada lóbulo está cercado poruma linha não corada que é a região onde existia tecido adiposo, o qual éeliminado na fixação. No centro de cada lóbulo, existe a veia centro-lobular,para onde convergem diversos capilares chamados sinusóides. Por seremvasos, os sinusóides são revestidos internamente de endotélio, cujos núcleosaparecem de forma alongados e bem corados. Acompanhando os sinusóides,estão os cordões de hepatócitos, que são as células típicas do fígado,possuindo núcleos grandes e menos corados que os endoteliais.156

Figura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezesO fígado normal possui lóbulos hepáticos poligonais, delimitados porseptos conjuntivos, que se orientam ao redor de uma veia central. Oshepatócitos dispõem-se em cordões de células que convergem para a veiacentral. Entre os cordões de hepatócitos estão os capilares sinusóides,frequentemente contendo sangue em seu interior.O Figado é dividido em diversos lóbulos. Cada lóbulo está cercado poruma linha não corada que é a região onde existia tecido adiposo, o qual éeliminado na fixação. No centro de cada lóbulo, existe a veia centro-lobular,para onde convergem diversos capilares chamados sinusóides. Por seremvasos, os sinusóides são revestidos internamente de endotélio, cujos núcleosaparecem de forma alongados e bem corados. Acompanhando os sinusóides,estão os cordões de hepatócitos, que são as células típicas do fígado,possuindo núcleos grandes e menos corados que os endoteliais.157

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 10 vezesO intestino grosso ser dividido nos segmentos: ceco, reto e anus. Amucosa do intestino grosso não apresnta vilos. È constituída por epitéliocilíndrico simples com células calciformes, sobre uma lâmina própria de tecidoconjuntivo frouxo, contendo criptas de Lieberkuhn mais longas que o intestinodelgado. A camada muscular é formada por túnicas de músculo liso, umacircular interna e outra longitudinal externa. A camada mais externa é serosa.158

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezesO intestino grosso ser dividido nos segmentos: ceco, reto e anus. Amucosa do intestino grosso não apresnta vilos. È constituída por epitéliocilíndrico simples com células calciformes, sobre uma lâmina própria de tecidoconjuntivo frouxo, contendo criptas de Lieberkuhn mais longas que o intestinodelgado. A camada muscular é formada por túnicas de músculo liso, umacircular interna e outra longitudinal externa. A camada mais externa é serosa.159

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesNo grupo observou-se predominância de fibras colágenas em detrimentodo elemento celular, não há infiltrado inflamatório, predominantementemononuclear, escasso e difusamente distribuído na derme, circundado porfibras colágenas em região adjacente ao epitélio. Fibras colágenas adjacentesao epitélio. No epitélio, maior formação de fibras colágenas, algumas célulasmononucleadas difusamente distribuídas.160

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezesNo grupo observou-se predominância de fibras colágenas em detrimentodo elemento celular, não há infiltrado inflamatório, predominantementemononuclear, escasso e difusamente distribuído na derme, circundado porfibras colágenas em região adjacente ao epitélio. Fibras colágenas adjacentesao epitélio. No epitélio, maior formação de fibras colágenas, algumas célulasmononucleadas difusamente distribuídas.161

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesRim normal. Cápsula, zona cortical e zona medular. Os néfrons sãoenvolvidos por uma lâmina basal em continuidade com tecido conjuntivoescasso. Os corpúsculos renais e os túbulos de trajeto sinuoso são corticais,enquanto que as duas porções da alça de Henle, que são retilíneas, situam-sena zona medular.O rim controla a eliminação de diversas substâncias resultantes dometabolismo dos nutrientes, sobretudo das proteínas. Também atua naregulação da concentração de água, eletrólitos e não-eletrólitos no meiointerno, possuindo papel muito importante na manutenção da homeostase.O rim pode ser dividido em duas zonas: cortical e medular. A zonacortical localiza-se mais externamente, enquanto a zona medular possuilocalização mais interna.À unidade funcional do rim deu-se o nome de néfron. O néfron éconstituído pela cápsula de Bowman, pelos túbulos contorcidos proximal edistal e pela alça-de-Henle. A alça-de-Henle localiza-se na zona medular,enquanto todas as outras estruturas localizam-se na zona cortical. No néfronocorre todo o processo de filtração e reabsorção do líquido tissular (também defiltrado glomerular). O néfron desemboca em um tubo coletor. O tubo coletor,que não faz parte do néfron, desemboca na pélvis renal que irá formar o ureter.162

Os principais componentes do néfron são:Cápsula de Bowman: dentro da cápsula de Bowman está o glomérulo,que é um tufo de capilares do tipo fenestrado. Tanto a cápsula de Bowmanquanto o glomérulo são formados por epitélio simples pavimentoso. Aoconjunto formado pela cápsula de Bowman e pelo glomérulo deu-se adenominação corpúsculo renal ou de Malpighi.Túbulo contorcido proximal: o túbulo contorcido proximal inicia-sepróximo ao corpúsculo de Malpighi e dirige-se em direção à zona medular,onde penetra muito pouco. O epitélio do túbulo contorcido proximal é simplescúbico alto. Nos preparados histológicos, percebe-se que a luz deste túbulo évisivelmente mais estreita que a luz do túbulo contorcido distal. As células queformam o epitélio do túbulo contorcido proximal são altamente acidófilas,portanto se coram intensamente de vermelho pelo HE. Essa acidofilia éexplicada pela presença de muitas mitocôndrias filamentosas no citoplasma. Aporção do citoplasma que entra em contato com a luz do túbulo apresentamicrovilos, que formam uma estrutura denominada orla em escova.Alça-de-Henle: é uma estrutura intermediária entre os túbuloscontorcidos proximais e distais, que inicia-se na zona medular, aprofunda-senessa zona e curva-se, retornando à zona cortical. Seu aspecto é, portanto,semelhante à letra U. Possui uma parte delgada, constituída por célulasachatadas e uma parte espessa, formada por células idênticas às células dotúbulo contorcido distal.Túbulo contorcido distal: é a continuação da alça-de-Henle edesemboca no tubo coletor. É possível diferenciá-lo dos túbulos contorcidosproximais, pois seu epitélio é simples cúbico baixo e não possui microvilos, nãoformando, assim, orla em escova. O seu citoplasma não é tão acidófilo quantoo citoplasma dos túbulos contorcidos proximais, devido à menor quantidade demitocôndrias.163

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezesRim normal. Cápsula, zona cortical e zona medular. Os néfrons sãoenvolvidos por uma lâmina basal em continuidade com tecido conjuntivoescasso. Os corpúsculos renais e os túbulos de trajeto sinuoso são corticais,enquanto que as duas porções da alça de Henle, que são retilíneas, situam-sena zona medular.O rim controla a eliminação de diversas substâncias resultantes dometabolismo dos nutrientes, sobretudo das proteínas. Também atua naregulação da concentração de água, eletrólitos e não-eletrólitos no meiointerno, possuindo papel muito importante na manutenção da homeostase.O rim pode ser dividido em duas zonas: cortical e medular. A zonacortical localiza-se mais externamente, enquanto a zona medular possuilocalização mais interna.À unidade funcional do rim deu-se o nome de néfron. O néfron éconstituído pela cápsula de Bowman, pelos túbulos contorcidos proximal edistal e pela alça-de-Henle. A alça-de-Henle localiza-se na zona medular,enquanto todas as outras estruturas localizam-se na zona cortical. No néfronocorre todo o processo de filtração e reabsorção do líquido tissular (também defiltrado glomerular). O néfron desemboca em um tubo coletor. O tubo coletor,que não faz parte do néfron, desemboca na pélvis renal que irá formar o ureter.Os principais componentes do néfron são:164

Cápsula de Bowman: dentro da cápsula de Bowman está o glomérulo,que é um tufo de capilares do tipo fenestrado. Tanto a cápsula de Bowmanquanto o glomérulo são formados por epitélio simples pavimentoso. Aoconjunto formado pela cápsula de Bowman e pelo glomérulo deu-se adenominação corpúsculo renal ou de Malpighi.Túbulo contorcido proximal: o túbulo contorcido proximal inicia-sepróximo ao corpúsculo de Malpighi e dirige-se em direção à zona medular,onde penetra muito pouco. O epitélio do túbulo contorcido proximal é simplescúbico alto. Nos preparados histológicos, percebe-se que a luz deste túbulo évisivelmente mais estreita que a luz do túbulo contorcido distal. As células queformam o epitélio do túbulo contorcido proximal são altamente acidófilas,portanto se coram intensamente de vermelho pelo HE. Essa acidofilia éexplicada pela presença de muitas mitocôndrias filamentosas no citoplasma. Aporção do citoplasma que entra em contato com a luz do túbulo apresentamicrovilos, que formam uma estrutura denominada orla em escova.Alça-de-Henle: é uma estrutura intermediária entre os túbuloscontorcidos proximais e distais, que inicia-se na zona medular, aprofunda-senessa zona e curva-se, retornando à zona cortical. Seu aspecto é, portanto,semelhante à letra U. Possui uma parte delgada, constituída por célulasachatadas e uma parte espessa, formada por células idênticas às células dotúbulo contorcido distal.Túbulo contorcido distal: é a continuação da alça-de-Henle edesemboca no tubo coletor. É possível diferenciá-lo dos túbulos contorcidosproximais, pois seu epitélio é simples cúbico baixo e não possui microvilos, nãoformando, assim, orla em escova. O seu citoplasma não é tão acidófilo quantoo citoplasma dos túbulos contorcidos proximais, devido à menor quantidade demitocôndrias.165

G2- RAÇÃO + DMBAFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezesOcorreu apoptose e inúmeras células mortas e hemorragia aparecem notecido. Os animais tratados com DMBA drogad indutora de câncer afetam estetecido e todo o metabolismo de nutrientes e medicamentos é afetados uma vezque o fígado é o órgão central do metabolismo.166

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezesFoi observado maior numero de células mortas.167

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezesNovamente observou-se grande numero de células mortas com focos dehemorragia. Isto se deve ao uso diário do DMBA na pele dos animais168

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezesInfiltração de neutrofilos, hemorragia, vasos sanguineos, maior numerode células mortas devido ao uso do DMBA.169

G3- RAÇÃO + DMBA + BIXINA 4% (1,0 ML)Figura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezes170

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezes171

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezes172

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezes173

G4- RAÇÃO + DMBA + BIXINA 5% (1,0 ML)Figura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezes174

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezes175

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezes176

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezes177

G5- RAÇÃO + DMBA + BIXINA 10% (1,0 ML)Figura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezes178

Figura 1- Lâminas de Intestino com de aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezes179

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezes180

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezes181

G6- RAÇÃO + DMBA + RUTINA (30mg)Figura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Fígado com aumento de 40 vezes182

Figura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Intestino com aumento de 40 vezes183

Figura 1- Lâminas de Pele com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Pele com aumento de 40 vezes184

Figura 1- Lâminas de Rim com aumento de 10 vezesFigura 1- Lâminas de Rim com aumento de 40 vezes185

6- Conclusão finalObservou-se que tanto a bixina nas diferentes concentrações (4% e 5%),quanto o flavonoide rutina na dose de 30mg, não foram eficazes narecuperação e melhoria das condições dos tecidos da pele, intestino, fígado erim dos animais com câncer induzido com DMBA (grupo normal e grupostratados). Mesmo com os tratamentos os tecidos mostram morte celular,hemorragia, infiltração de neutrófilos.186