Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 37 1

a temperatura ambiente. Após a remoçãoda saponina por centrifugação, foicolocado o anticorpo monoclonal antivimentinae depois um anticorpo secundárioconjugado com FITC. A leitura foifeita por citometria de fluxo FACSCALI-BUR BD® e a análise em software PA-INT-A-GATE da BD®.RESULTADOSCultivo de condrócitos em pérolas dealginato: Na cultura em pérola de alginatode sódio (ilustração 01), os condrócitosnão perderam seu fenótipo,continuando como células ovaladas queformam grupos isógenos (ilustração 02).Ilustração 04: Condrócitos marcados com anexina V (FL1) e iodeto de propídeo(FL3). Em azul e ciano temos expressão de anexina V; em verde e ciano temosexpressão de iodeto de propídeo, e somente o ciano representa a coexpressão deanexina V e iodeto de propídeo. A maior parte da cultura em cinza são as célulasque não expressaram os marcadores, sendo consideradas células viáveis. Ao lado,temos a legenda que mostra a porcentagem de cada cor (isto é cada expressão)1mL. Foi feito o gotejamento da soluçãoda seringa em cloreto de sódio a 55mMpara a formação das pérolas de alginato.Essas foram cultivadas em meioDMEM Dulbecco’s Modified Eagle MediaMeio - GIBCO ® suplementado comF-12 Nutrient Mixture (Ham) - GIBCO ® ,com troca a cada dois dias.Dissolução da pérola de alginato paraliberação de condrócitos: as pérolas dealginato foram incubadas a temperaturaambiente com citrato de sódio a 165mMpor uma hora. Após contrifugação, opellet celular formando foi ressuspensoem meio de cultura.Ilustração 05: Aumento 20X. Trêssemanas de cultivo (após segunda passagem)das células mononucleadas damedula óssea. Na microscopia de luzcontrastadada observa-se o aumento daformação de colônias celulares (noscírculos).Coleta de medula óssea e processamento:foi retirado 5 mL de medula ósseada crista ilíaca de coelhos machos(com heparina para não coagular). Osangue foi processado em laboratóriotendo suas células mononucleadas separadaspor Ficoll-hypaque ® densidade1.077g/mL como descrito no protocolode ZAGO e COVAS, 2006. As célulasmononucleadas foram cultivadas em fracosde 25cm 2 com meio Knockout-DMEM- GIBCO ® .Tripsinização das culturas: para “soltar”as CTMs que aderiram a placa, foifeito digestão enzimática com tripsina a0,25% durante 2 minutos.Viabilidade celular por azul de tripan:foram coletadas amostras de células emisturado (v:v) com azul de tripan 0,2%.A mistura foi colocada na Câmara deNeubauer para contagem celular.Viabilidade celular por marcação comanexina-V e iodeto de propídeo: foiutilizado o KIT “ANNEXIN V-FITC APOP-TOSIS DETECTION KIT I” - BD Pharmingene a marcação das células foifeita de acordo com as especificaçõesdo fabricante. A leitura foi feita em citômetrode fluxo FACSCALIBUR BD® e aanálise em software PAINT-A-GATE daBD®.Marcação das CTM com anti-vimentina:A vimentina é um componente intracelularde caracterização das CTM,portanto sua marcação é de extrema significância.A permeabilização celular foifeita com saponina a 1% por 15 minutosViabilidade Celular e Progressão daApoptose em Cultura Tridimensionalde Condrócitos: A viabilidade celular foianalisada por dois métodos (1) por marcaçãocom anexina V e iodeto de propídeoanalisadas por Citometria de Fluxo;e (2) usando-se o corante de viabilidadecelular azul de Tripan com análisepela Câmara de Neubauer.Em ambas as análises, podemos perceberdiminuição da taxa de viabilidadecelular (gráfico 01).Para confrontar as duas metodologiasde avaliação da viabilidade celular utilizou-seo teste não paramétrico de Mann-Whitney. Não houve diferença significativados testes para p