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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA “IN VITRO” - CCS ...

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Universidade Federal da ParaíbaCentro de Ciências da SaúdeCurso de Graduação em OdontologiaMARIÂNGELA DE ARAÚJO BARBOSAAVALIAÇÃO <strong>DA</strong> ATIVI<strong>DA</strong>DE <strong>ANTIMICROBIANA</strong> “IN VITRO” <strong>DA</strong> Punicagranatum Linn. FRENTE À Enterococcus faecalis ISOLADOS CLINICAMENTEJoão Pessoa2010


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- 3 -MARIÂNGELA DE ARAÚJO BARBOSAAVALIAÇÃO <strong>DA</strong> ATIVI<strong>DA</strong>DE <strong>ANTIMICROBIANA</strong> “IN VITRO” <strong>DA</strong> Punicagranatum Linn. FRENTE À Enterococcus faecalis ISOLADOS CLINICAMENTETrabalho de Conclusão de Cursoapresentado ao Curso de Graduação emOdontologia, da Universidade Federal daParaíba em cumprimento às exigênciaspara conclusão.Orientador: Ângelo Brito Pereira de MeloCo-Orientador: Fábio Correia SampaioJoão Pessoa2010


- 4 -Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)Biblioteca Setorial de Odontologia - UFPBB238aBarbosa, Mariângela de Araújo.Avaliação da atividade antimicrobiana “in vitro” da Punica granatumLinn. frente à Enterococcus faecalis isolados clinicamente / Mariângelade Araújo Barbosa. -- João Pessoa: [s.n.], 2010.73 f. : il. -Orientador: Ângelo Brito Pereira de Melo.Co-orientador: Fábio Correia Sampaio.Monografia (Graduação) – UFPB/<strong>CCS</strong>.1. Microbiologia. 2. Odontologia. 3. Granatum. 4. Enterococcusfaecalis.BS/<strong>CCS</strong>/UFPB CDU: 579:616.314(043.2)


- 11 -LISTA DE TABELASTabela 1 - Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato etanólico da Punica GranatumLinn. determinada pelo método da microdiluição em caldo...................................................................50Tabela 2 - Valores da Concentração Bactericida Mínima (CBM) do extrato etanólico da PunicaGranatum Linn. determinada pelo plaqueamento das diluições em BHI ágar......................................50Tabela 3 - Método de difusão em ágar (Técnica do disco). Diâmetro dos halos de inibição expressosem milímetros (mm)...............................................................................................................................51LISTA DE QUADROSQuadro 1 - Tipos de resistência em Enterococcus spp........................................................................25Quadro 2 - Diluição para microplacas SM1: A1 até A12 e C1 até C12............................................... 73


- 12 -ResumoPunica granatum Linn. ("Romãzeira") é uma planta medicinal da família Punicaseaee tem demonstrado ação bactericida e bacteriostática sobre um amplo número demicrorganismos Gram-positivos e Gram-negativos além de possuir atividadeantisséptica, antiviral e adstringente. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro aatividade do extrato hidroalcoólico da Punica granatum Linn. frente a três cepasdiferentes de E. faecalis isoladas clinicamente. O método de diluição em caldo foiutilizado para determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e ConcentraçãoBactericida Mínima (CBM) do extrato hidroalcoólico da casca da romã contraEnterococcus faecalis. O extrato apresentou atividade antibacteriana contra as trêscepas estudadas, com CIM variando de 57,57 µg/ml a 100 µg/ml, e MBC variando de72,5 µg/ml a 200 µg/ml. A sensibilidade antimicrobiana foi avaliada pela técnica dadifusão em ágar (método de difusão por discos) com três antibióticos diferentes(amoxicilina 10 µg, ampicilina µg e cefalexina 30 µg). Todas as culturasapresentaram resistência a cefalexina, e sensibilidade a amoxicilina e ampicilinacom halos de inibição de 29 mm para o primeiro e variando entre 26 e 30 mm para osegundo. Pode-se concluir que o extrato da Punica granatum Linn. apresentouatividade antibacteriana in vitro, em concentrações que podem ser indicadas naprática odontológica.UNITERMOS: granatum; Enterococcus faecalis; Microbiologia


- 13 -AbstractPunica granatum Linn. (“Pomegranate") is a medicinal plant family Punicaseae andhas demonstrated bactericidal and bacteriostatic action on a wide range of Grampositiveand Gram-negative activity also has antiseptic, antiviral and astringent. Thepurpose of this study was to test in vitro the activity of hydroalcoholic extract ofPunica granatum Linn. front of three different cultures of E. faecalis isolated fromhumans. The broth dilution method was used to determine the Minimum InhibitoryConcentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of thePomegranate pell hydroalcoholic extract against Enterococcus faecalis. ThePomegranate hydroalcoholic extract showed antibacterial activity against all cultures,with MIC ranging from 57,57 µg/ml to 100 µg/ml, and MBC ranging from 72,5 µg/mlto 200 µg/ml. The antimicrobial sensibility was evaluated by agar diffusion test (DiscDiffusion Methods) with three different antibiotics (amoxicilina 10 µg, ampicilina µg ecefalexina 30 µg). All cultures showed resistance to Cefalexina, and susceptibility toamoxicilina e ampicilina with inhibition zones measuring 29mm for the first andranging from 26 to 30mm for the second. It can be concluded that the extract ofPunica granatum Linn. showed antibacterial activity in vitro with concentrations thatcan be used as a therapeutic antibacterial agent in Dentistry.UNITERMS: granatum; Enterococcus faecalis; Microbiology


- 14 -SUMÁRIOLISTA DE FIGURAS......................................................................................................10LISTA DE TABELAS E QUADROS...........................................................................11RESUMO............................................................................................................................12ABSTRACT ........................................................................................................................131. INTRODUÇÃO..............................................................................................................162. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................202.1. Microbiologia dos canais radiculares..........................................................212.2. Enterococcus faecalis....................................................................................232.3. Fitoterapia no contexto odontológico.........................................................272.4. Punica granatum Linn. ..............................................................................293. PROPOSIÇÕES..........................................................................................................343.1. Objetivos gerais ..............................................................................................353.2. Objetivos específicos ....................................................................................354. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................364.1. Desenho do estudo..........................................................................................374.2. Localização da pesquisa ..............................................................................334.3 Preparação do Extrato da Punica Granatum Linn................................37a) Obtenção da matéria-prima.....................................................37b) Extração dos marcadores químicos.......................................38c) Concentração da solução extrativa ........................................384.4. Obtenção dos E. faecalis isolados clinicamente ......................................404.5. Tratamento bacteriano prévio à avaliação antimicrobiana ..................404.6. Avaliação antimicrobiana do extrato da Punica granatum Linn. ......424.6.1. Preparação das soluções dos extratos ........................................43


- 15 -4.6.2. Preparação do inoculo ..................................................................434.6.3. Preparação das microplacas .......................................................434.6.4. Leitura das microplacas para determinação da CIM ............444.6.5. Determinação da concentração bactericida mínima (CBM)...............................................................................................................................................474.6.6. Avaliação da susceptibilidade do E. faecalis a agentesantimicrobianos.................................................................................................................474.7. Análise dos dados ...........................................................................................485. RESULTADOS ............................................................................................................496. DISCUSSÃO .................................................................................................................537. CONCLUSÃO ...............................................................................................................60REFERÊNCIAS ..............................................................................................................62ANEXOS..............................................................................................................................72


INTRODUÇÃO- 16 -


- 17 -1. IntroduçãoA terapia endodôntica tem como uma das finalidades principais a máximaeliminação de bactérias do sistema de canais radiculares (SCR) que agridem apolpa e os tecidos perirradiculares. Embora fatores físicos e químicos possam estarenvolvidos na etiologia das patologias pulpares e periapicais as infecçõesbacterianas são as principais responsáveis por tais situações. Estas conseguemmanter o processo patológico por um período mais prolongado quando comparadoao mantido nas agressões físicas ou químicas, além de exercerem um papelsignificante nas falhas do tratamento endodôntico (ALVES, 2004).Até mesmo após a limpeza completa do sistema de canais radicularesmediante a ação mecânica dos instrumentos, da solução irrigadora e da açãoquímica com desinfetantes, é difícil alcançar em todos os casos a eliminação totaldas bactérias (BYSTRÖM; CLAESSON; SUNDQVIST, 1985; COLDERO et al. 2002).Estes procedimentos reduzem o número de microrganismos viáveis no canalradicular, mas a anatomia complexa do sistema de canais dificulta a limpezacompleta dos mesmos. A maioria dos microrganismos se encontra presente à luz docanal, entretanto, agregados microbianos podem colonizar as paredes do canal;além disso, a infecção pode se propagar para túbulos dentinários e para variaçõesda anatomia interna, as quais consistem mais em regra do que em exceção,mormente no terço apical, de acordo com Siqueira Júnior (2002).Microrganismos resistentes ao tratamento endodôntico ou mesmo aquelesque invadem o SCR pós-tratamento são os principais responsáveis peloaparecimento ou manutenção de lesões perirradiculares (FERRARI; CAI;BOMBANA, 2007), predominando um número limitado de espécies, particularmentebactérias Gram-positivas, podendo ser preferencialmente facultativas (NAIR, 2006).Enterococcus faecalis raramente são observados nas infecções primárias.Trata-se de uma espécie comumente encontrada em casos de infecçõessecundárias ou persistentes, chegando a representar de 38 a 70% da composiçãomicrobiana dos SCR nesses casos. (PINHEIRO, et al., 2003).Tendo em vista que o preparo químico-mecânico (PQM) e as soluçõesirrigadoras não são suficientes para combater todos os tipos de microorganismospresentes numa infecção endodônitica, a odontologia lança mão do uso demedicações intracanais (MI) a fim de otimizar a sanificação do SCR. As MIcomumente utilizadas são o Hidróxido de cálcio e a Clorexidina, no entanto, de


- 18 -acordo com a literatura, a segunda supera a ação da primeira frente ao E. faecalis,(MAIA FILHO et al. 2008), todavia ainda com ação limitada.Como alternativa ao combate das afecções da cavidade bucal, a terapiacomplementar com plantas medicinais apresenta-se como aliada às práticasodontológicas mostrando bons resultados. A Punica granatum Linn. (famíliaPunicaceae), romãzeira, como conhecida no Brasil, é um arbusto ou pequena árvorenativa da Ásia, cultivada mundialmente em regiões de clima tropical e subtropicalsendo vários de seus componentes utilizados como adstringente, agentehemostático e no controle da diabete (ROSS; SELVASUBRAMANIAN S;JAYASUN<strong>DA</strong>R, 2001). É comumente utilizada no tratamento de infecções degarganta, tosse e febre, devido ao seu potencial antiinflamatório e antimicrobiano(MACHADO, et al, 2003).Segundo Pereira (2002), a Punica granatum Linn. tem demonstrado açãobactericida e bacteriostática sobre um amplo número de microrganismos Grampositivose Gram-negativos.Neste sentido, o extrato da romã tem sido frequentemente utilizado naspesquisas da área odontológica a fim de comprovar sua ação microbiológica sobreas bactérias inerentes a cavidade bucal. Entretanto na literatura pertinente poucosestudos correlacionam o fitoterápico às bactérias do endodonto e principalmentesobre bactérias isoladas clinicamente.Como a utilização de plantas medicinais trás consigo grandes benefícios paraquem dela utiliza por oferecer soluções eficientes e mais baratas torna-senecessário que sejam feitas pesquisas com intuito de verificar o potencial dasmesmas.Na odontologia, o extrato obtido a partir do fruto da Punica Granatum Linn.tem mostrado uma ação antimicrobiana eficaz frente a bactérias cariogênicas eperiodontopatogênicas (PEREIRA, et al., 2005) Assim, torna-se interessante verificarsua ação sobre a microbiota endodôntica, sendo o Enterococos faecalis omicroorganismo selecionado por apresenta-se bastante resistente às soluções emedicações utilizadas atualmente na endodontia ( MELO, 2008).Considerando a importância de se estudar novas substâncias que agreguemresultados positivos à terapia endodôntica, o presente estudo objetivou avaliar aatividade antimicrobiana do extrato da Punica granatum Linn. frente à Enterococcusfaecalis como isolados clínicos.


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REVISÃO DELITERATURA- 20 -


- 21 -2 Revisão de Literatura2.1 Microbiologia dos canais radicularesDas mais de 500 espécies bacterianas presentes na cavidade bucal, somentequinze a trinta conseguem colonizar o Sistema de Canais Radiculares (SCR).Diversos são os fatores que influenciam a sobrevivência bacteriana dentro doSCR, tais como o próprio nicho ecológico, a nutrição, presença ou não de oxigênio,pH e ainda a concorrência ou cooperação com outros microorganismos(SUNDQVIST; FIGDOR, 2003).O tratamento endodôntico além de eliminar diretamente as bactérias, podeperturbar completamente a ecologia intrarradicular delicada e privar as bactériaspersistentes de sua fonte de nutrição. (SUNDQVIST, 1992).Em condições normais, o esmalte e cemento são os envoltórios naturais dosdentes que protegem o tecido pulpar das agressões bacterianas proveniente dacavidade bucal. Entretanto quando essa proteção é perdida cria-se uma via deinvasão microbiana que dependendo dos casos pode vir a atingir a câmara pulpar(LOPES; SIQUEIRA, 2004). Segundo os mesmos autores as principais vias deacesso que os microorganismos utilizam para atingir a polpa são: túbulosdentinários; exposição pulpar; periodonto e anacorese hematogênica.Quando da instalação da infecção radicular, a composição da microbiota deSCRs pode variar dependendo do tipo de infecção endodôntica e da lesãoperirradicular (CAIRES, 2005).Na infecção endodôntica primária, aquela que ocorre logo após a necrosepulpar, as bactérias encontram-se usualmente em combinações de quatro a seteespécies, com prevalência de anaeróbias estritas (ALVES, 2004). Estudos queutilizam métodos de cultura microbiológica revelam ser as espécies dos gêneros:Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Streptococcus, Peptostreptococcus,Eubacterium, Propionibacterium, Campylobacter, Selenomonas e Actnomyces, asmais presentes nestas infecções (LOPES ; SIQUEIRA, 2004).Quando microrganismos conseguem sobreviver à terapia endodôntica ouquando infectam o sistema de canais radiculares durante o tratamento endodônticoou após ele, estabelecem-se as infecções persistentes e secundárias,respectivamente (ALVES, 2004). Estes microorganismos resistentes ao tratamentoendodôntico ou mesmo aqueles que invadem o SCR pós-tratamento são os


- 22 -principais responsáveis pelo aparecimento ou manutenção de lesõesperirradiculares. Diagnostica-se a periodontite apical secundária quando a lesãoaparece ou se mantêm diante de um tratamento endodôtico mal qualificado, isto é,pobremente preparado e obturado, diferentemente da periodontite apical persistente,que ocorre em dentes endodonticamente bem conduzidos, mas que ainda persisteou surge uma reação inflamatória periapical. Normalmente, estas situações sãoassintomáticas, podendo ou não apresentar fístula (FERRARI; CAI; BOMBANA,2007).A infecção secundária geralmente é dita como uma monoinfecção podendoapresentar um pequeno número de espécies diferentes quando comparada àsprimárias. Predominam geralmente a microbiota associada a bactérias Grampositivasem proporções praticamente iguais a anaeróbios e facultativos,destacando-se Enterococcus faecalis. Em tais infecções, os fungos podem serencontrados em quantidade maior que nas primárias (SIQUEIRA JR., 2002;PINHEIRO, et al., 2003).Siqueira Júnior e Lopes (2004) englobaram em categoria únicamicroorganismos de infecções secundárias e/ou persistentes. Dentre os gênerosenvolvidos citam-se: Enterococcus, Actinomyces, Streptococcus, Cândida,Propionibacterium, Staphylococcus e Pseudomonas.Pinheiro, et al., (2003) isolou e identificou bactérias de cinqüenta e uma raízesde dentes com lesões periapicais persistentes. Das espécies microbianas isoladasEnterococcus faecalis foi a mais freqüente. Anaeróbios obrigatórios representaram42,6% das espécies e o gênero isolado com mais freqüência foi Peptostreptococcus,que foi associado com os sintomas clínicos (P


- 23 -Synergistes oral clone BA 121 (33%) e Olsonella uli (33%). A detecção dessesnovos microrganismos em canais radiculares infectados sugere a possívelparticipação dos mesmos na patogenicidade das doenças perirradiculares.2.2. Enterococcus faecalisO gênero Enterococcus é habitante da microbiota do trato digestivo humano ede outros animais, apresentando baixa patogenicidade. No entanto, são causa deinfecções urinárias e intra-abdominais, endocardite e sepse, comportando-se, muitasvezes, como um agente oportunista em infecções hospitalares (TAVARES, 2000).Pertencente ao antigo gênero Streptococcus (grupo D), os Enterococcusforam excluídos deste grupo em 1980 por apresentarem diferenças genéticas emrelação às outras bactérias. Descrevem-se 16 espécies pertencentes ao novogênero sendo E. faecalis mais frequentemente isolado de infecções humanas (95%)e E. faecium em menor proporção (5%) (JULIET, 2002).Microscopicamente E. faecalis caracterizam-se como cocos Gram positivos,anaeróbios facultativo, imóvel e não esporulados podendo variar seu tamanho entre0,5 e 0,8 micrômetros. O grupo Enterococcus pode ser identificado, bem comooutros cocos Gram positivos, de forma simplificada uma vez que são catalase eoxidase negativos, possuem motilidade variável a depender de cada espécie ecomportam-se de forma positiva frente o NaCl a 5%. Os E. faecalis com motilidadenegativa apresentam-se como PYR (pyrrolidonyl-aminopeptidase) e Bile esculinapositivos (ANVISA, mod. V, 2004).Inúmeros são os fatores de resistência dessa bactéria, desde habilidade deformação de biofilme à produção de substância de agregação como adesinas desuperfície, ácido lipopoliteicóico, produção extracelular de superóxido, enzima líticagelatinase e hialuronidase (PARADELLA; KOGA-ITO; JORGE, 2007). E. faecalistambém impedem a liberação de enzimas hidrolíticas por célulaspolimorfonucleadas, o que pode explicar o seu domínio em infecções pulpares(REYNAUD, 2005).A habilidade do E. faecalis de sobreviver a períodos extensos em ambientesnutricionais limitados representa uma importante característica da patogênese destaespécie em processos patológicos com falhas no tratamento endodôntico (FIDGOR,2003).


- 24 -Na odontologia o E. faecalis destaca-se pela sua alta resistência ao Hidróxidode cálcio e, portanto, à terapia endodôntica que dela utiliza como MI (EVANS et al.,2002).EVANS et al., em 2002 procuraram esclarecer os mecanismos que permitemao E. faecalis sobreviver ao alto pH do hidróxido de cálcio. As bactérias foramexpostas a concentrações subletais de hidróxido de cálcio, com e sem prétratamentosdiversos. Agentes bloqueadores foram adicionados para determinar opapel do estresse celular induzido pela síntese de proteínas e da parede celularassociada à bomba de prótons. O resultado mostrou que o E. faecalis foi resistente aum pH de 11,1, mas não ao de 11,5. Mostrou ainda que não houve diferença nasobrevivência das células quando a síntese de proteínas foi bloqueada durante aindução do estresse, no entanto houve uma redução drástica da viabilidade celularquando um inibidor da bomba de prótons foi adicionado à célula. Os autoresconcluíram que a resistência do E. faecalis ao hidróxido de cálcio parece estarrelacionada ao estresse induzido à síntese de proteínas, mas uma bomba deprótons em funcionamento é fundamental para a sobrevivência de E. faecalis em pHelevado.Na tentativa de encontrar uma solução que combatesse o E. faecalis, Baker etal. (2004) investigaram a habilidade de irrigantes endodônticos e medicamentos naeliminação de Enterococcus faecalis em túbulos dentinários infectados, e se suaação antimicrobiana foi reforçada por surfactante. Foram feitas tentativas deaumentar o poder bactericida do hidróxido de cálcio, incluindo a adição demedicamentos como monoclorafenol canforado (CMC) e iodeto de potássio 2% (KI).As amostras foram incubadas por 15 minutos ou 24 horas. A Microbiologiaquantitativa das bactérias remanescentes foi realizada e os grupos foramcomparados usando a Análise de Variância simples (One way ANOVA). Os autoresconcluíram que a adição de surfactantes não reforça a ação antibacteriana dequalquer medicamento e sob as condições in vitro deste estudo, KI foi capaz deeliminar E. faecalis de dentina radicular bovina quando usado com um tempo decontato de 15 minutos.Com relação à ação antimicrobiana do hipoclorito de sódio e da clorexidinasobre cepas de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli,Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, Sassone, et al., (2003)observaram em estudo in vitro o comportamento das bactérias quando postas emcontato com cada solução e repetidas 10 vezes, em diferentes intervalos de tempo:


- 25 -imediatamente, 5 minutos, 15 minutos e 30 minutos após contato e em diferentesconcentrações: hipoclorito de sódio (1% e 5%) e clorexidina (0,12%, 0,5% e 1%). Osresultados demonstraram que a solução de clorexidina a 0,12% não foi capaz deeliminar as amostras de E. faecalis em nenhum intervalo de tempo testado enquantoque a clorexidina a 0,5% e 1% eliminaram todas as cepas testadas assim como asduas concentrações de hipoclorito de sódio.Já em 2007, Silva, se propôs a avaliar em estudos longitudinais a eficácia dohipoclorito de sódio e da clorexidina sobre E. faecalis presente em infecçõesendodônticas através de revisão sistemática, tendo como fonte de catalogaçãobibliográfica MEDLINE e Cochrane Library no período de 1966 até 01 de janeiro de2007 e dos 229 artigos relacionados, o autor observou que a eficácia do hipocloritode sódio e da clorexidina sobre E. faecalis foi demonstrada in vitro por teste decontato direto e nos estudos envolvendo dentina contaminada, tanto o hipoclorito desódio quanto a clorexidina mostram-se ineficazes sobre E. faecalis.Com relação à sensibilidade do gênero a antibióticos Juliet, em 2002, relatouque estas bactérias são naturalmente resistentes a estes medicamentos, ou podemadquirir-la em outro momento da vida.O quadro abaixo especifica os antibióticos envolvidos nesse processo:Quadro 1 - Tipos de resistência em Enterococcus spp. (JULIET, 2002).Tipos de resistênciaAntimicrobianosNatural àAdquirida àCefalosporinas; Oxacilinas; Clindamicina; Lincomicina;Cotrimoxazol; Aminoglicósidos (baixo nível).Ampicilina-penicilina; Cloranfenicol; Eritromicina; Tetraciclinas;Quinolonas; Vancomicina-teicoplanina; Nitrofurantoína;Aminoglicósidos (alto nível).Uma série de mecanismos de resistência recém-adquiridos surgiu ou tornou-semais freqüente durante a década passada, incluindo a resistência aaminoglicosídeos de alto nível, ampicilina e vancomicina e a produção de β-lactamases (JAIMES, 2003).Dos antibióticos utilizados na clínica odontológica, destacam-se a cefalexinapertencente ao grupo das cefalosporinas, de resistência natural dos E. faecalis, e aampicilina e amoxicilina, estes últimos do grupo das penicilinas semi-sintéticas, de


- 26 -resistência adquirida, todos classificados como antibióticos β-lactâmicos(WANNMACHER; FERREIRA, 2007).As penicilinas atuam sobre a síntese da camada basal da parede celularbacteriana, sendo, desta forma, bactericidas, e atóxicos às células humanas por nãopossuírem parede celular. A ampicilina e amoxicilina pertencem ao grupo daspenicilinas semi-sintéticas, este grupo veio reduzir as lacunas deixadas pelaspenicilinas naturais (TORTAMANO; ARMONIA, 2004).As cefalosporinas estão intimamente relacionadas às penicilinas, no que dizrespeito ao núcleo molecular e seguem o mesmo mecanismo de ação daspenicilinas. A cefalexina é classificada como uma cefalosporina de primeira geração,efetivas contra cocos aeróbios Gram-positivos, exceto Enterococcus, como jámencionado (WANNMACHER; FERREIRA, 2007).As bactérias que conseguem resistir ao tratamento químico-cirúrgico podemsobreviver na intimidade da dentina radicular ou mesmo externamente ao canal,encontrando um meio favorável ao seu crescimento, principalmente em dentesportadores de infecções crônicas. Embora Enterococcus faecalis sejam raramenteencontrados em casos de infecções primárias, eles são frequentemente encontradosem casos em que a terapia endodôntica fracassou (LOPES; SIQUEIRA, 2004).Em 2004, Siqueira e Rôças investigaram a ocorrência de 19 espéciesmicrobianas, por meio de reações em cadeia da polimerase (PCR), em 22 amostrasde canais radiculares de dentes com insucesso do tratamento endodôntico. Todasas amostras foram positivas a pelo menos uma das seguintes bactérias Grampositivas:Enterococcus faecalis, Pseudoramibacter alactolyticus ouPropionibacterium propionicum. Enterococcus faecalis foi a espécie mais prevalente,detectada em 77% dos casos.Utilizando o PCR, Rôças et al., (2004) investigaram a prevalência deEnterococcus faecalis em canais não tratados e em canais com tratamentoendodôntico prévio associados a lesões periapicais crônicas. Enterococcus faecalisfoi isolado em 67% dos dentes com insucesso do tratamento endodôntico e em 18%dos casos de infecções primárias, sendo detectado principalmente em dentesassintomáticos.Diante do exposto fica clara a necessidade de se estudar novas substânciasque consigam combater tal bactéria. Os fitoterápicos por possuírem baixo custo eestarem com maior facilidade ao alcance da população tornam-se foco dos


- 27 -pesquisadores e os resultados dos estudos nos mostram que se trata de umagrande fonte de substâncias viáveis à utilização clínica.2.2 Fitoterapia no contexto odontológicoDevido a grande diversidade da flora brasileira e variedade de espéciesvegetais, o Brasil destaca-se pela larga utilização de plantas para fins medicinais.Nos últimos anos é clara a aceitação industrial quanto à fabricação de produtos comconteúdo natural e cultivos caseiros mesmo sem qualquer orientação à população(BORBA; MACEDO, 2006), isso demonstra a importância de explorar o potencial dosmesmos.Estudar o conhecimento e conceituações populacionais a respeito do mundovegetal permite-nos saber quais indicações e modo de uso das plantas medicinais,bem como avaliar clinicamente a eficácia desses métodos terapêuticos (BORBA;MACEDO, 2006).Segundo Colavitti (2002) os paises com maior tradição no uso desse tipo deterapia são China e Índia onde se registra seu uso desde 1500 a.C. comprovandosuas raízes históricas. Nesse período muito tem se pesquisado a respeito dafitoterapia e hoje temos o conhecimento de sua eficácia, o que fundamenta autilização na atualidade (LIMA JUNIOR, 2005).No Brasil, o conhecimento do valor medicinal de ervas e líquidos era bemmaior nas comunidades indígenas, no qual toda informação era passada dos maisvelhos aos mais novos, hoje, devido ao evento da medicina alopática e degradaçãode modos e costumes algumas restrições vem ocorrendo dentro dessascomunidades (PINTO; MADURO, 2003). Em contrapartida é sabido que osmicrorganismos que causam prejuízos à saúde humana estão ficando cada vez maisresistentes a maioria dos antimicrobianos já conhecidos, fato este que contribui aoincentivo da procura por medicamentos de ocorrência natural.O uso de óleos e extratos essenciais de plantas demonstram larga eficiênciaantimicrobiana contra uma ampla variedade de microorganismos incluindo fungosfilamentosos, leveduras e bactérias. Usos práticos dessas atividades são sugeridosem humanos e animais, bem como na indústria de alimentos (DUARTE, 2006).Na odontologia vários estudos são feitos com intuito de conhecer as plantasmais utilizadas pela população contra as doenças odontológicas e os benefícios queelas podem oferecer (DUARTE, 2006). Num levantamento bibliográfico realizado por


- 29 -Enterobacter aerogenes, Serratia liquefaciens, Proteus mirabilis, Staphylococcusepidermidis.Dentre os produtos naturais avaliados frente a E. faecalis os opoterápicostambém demonstram ação antimicrobina como mostram os estudos abaixo:Costa, et al. (2008) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato deprópolis verde; da Pasta Guedes-Pinto (Iodofórmio + PMCC + Rifocort®); do Extratode própolis verde + Rifocort® + Iodofórmio; do Rifocort® + Extrato de própolis verde;do Hidróxido de cálcio + Extrato de própolis verde; do Hidróxido de cálcio + Sorofisiológico; do Iodofórmio + Extrato de própolis verde; do Iodofórmio + Sorofisiológico; do Rifocort®; do Paramonoclorofenol canforado e do Soro fisiológico(controle negativo), contra cepas de Enterococcus faecalis. Os autores observaramque o Rifocort®; o Rifocort® com extrato de própolis verde; a pasta Guedes-Pinto; apasta de própolis verde com Rifocort® e iodofórmio; e o paramonoclorofenolcanforado apresentaram ação antimicrobiana contra o E. faecalis significativamentesuperior quando comparadas com as demais substâncias testadas, concluindo que asolução de extrato de própolis verde apresentou baixa atividade antimicrobianacontra o E. faecalis e, dentre as substâncias testadas, o Rifocort® apresentou maioração antimicrobiana.Maia Filho, et al. (2008) compararam a eficácia de três irrigantes utilizados notratamento de canais radiculares e do extrato de própolis frente à Enterococcusfaecalis. Foram utilizadas em teste de difusão em Agar as seguintes substâncias:extrato de própolis produzido pelas abelhas Scaptotrigona sp., hipoclorito de sódio5%, hidróxido de cálcio e gel de clorexidina 2%. O extrato de própolis apresentouuma boa atividade antimicrobiana, sendo maior que hipoclorito de sódio a 5%,entretanto, o gel de clorexidina foi o mais efetivo contra E. faecalis.2.4 Punica granatum Linn.A Punica granatum Linn é uma planta da família das Punicaceae, é origináriado nordeste da Índia e mundialmente cultivada nas regiões de clima tropical esubtropical (SOUSA, et al. 1991). A Romã, seu fruto, é considerada como símboloda vida, longevidade, saúde, feminilidade, fecundidade, conhecimento, moralidade eimortalidade, da espiritualidade, e até da divindade (MAHDIHASSAN, 1984). Possuiaspecto globóide ou esférico, de casca amarelada, manchada de escuro contendoem seu interior sementes ou bagos de cor rósea ou carmim vivo (MOREIRA, 1978),


- 30 -divididas internamente em muitas lojas, são irregularmente facetadas apresentandosarcotesta translúcida, mesotesta esclerótica e testa formada de células polposas(BARROSO et al., 1999) Fig. 1.Figura 1 – Fruto da Punica granatum Linn (romã) ao lado de uma flor, a qual se frutifica após trêsanos de cultivo da romãzeira. Fonte: MELO, (2008)Toda a planta contém, entre os seus princípios ativos, tanino em grandequantidade (em torno de 22% a 25% de ácido punicotânico). Seus alcalóidespossuem propriedades digestiva, espasmolítica, anti-diarréica e anti-helmíntica e apelieterina possui ação tóxica específica contra a tênia. Por conterem moléculasbastante coloridas, podem ser úteis no tingimento de tecidos (HOLETZ et al., 2002).Os alcalóides pelieterina e isopelieterina estão presentes de 0,3% a 0,9% nascascas da raiz e do fruto. A casca do fruto também contém tanino e alcalóides, alémde substâncias com ação antibiótica. Possui também atividade antisséptica, antivirale adstringente. É empregada popularmente no tratamento de dores de garganta,rouquidão, inflamação da boca. Do pericarpo, rico em taninos, foram isoladasgranatinas A e B, punicalagina e punicalina, sendo estes os principais responsáveispela atividade antimicrobiana (HOLETZ et al., 2002).Segundo Pereira (2002), a Punica granatum Linn. tem demonstrado açãobactericida e bacteriostática sobre um amplo número de microrganismos Grampositivose Gram-negativos. Muitos estudos na área odontológica estão sendo


- 31 -desenvolvidos na intenção e se adquirirem novos conceitos em relação aos efeitosdo fitoterápico.Machado et al. (2002) através do fracionamento do extrato acetato de etila defrutos de Punica granatum Linn, guiado por ensaios antimicrobianos frente acolônias de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, conduziu ao isolamentoe à determinação estrutural do tanino elágico punicalagina. Os ensaiosantimicrobianos foram realizados pelo método de difusão em discos de papelmostrando uma clara zona de inibição do crescimento celular de 20mm. Aconcentração inibitória mínima das substâncias foi determinada pelo método dediluição em caldo apresentando valor de 61,5 µg mL -1. Os autores concluíram ser apunicalagina a grande responsável pela atividade antibacteriana da romã.Catão et al. (2006) avaliaram a atividade antimicrobiana “in vitro” do extratoetanólico de Punica granatum L. (romã) determinando a concentração inibitóriamínima (CIM) sobre amostras de Staphylococcus aureus. Para isso utilizoudezessete amostras da bactéria, sendo uma ATCC e 16 de origem humana, obtidasde diferentes processos infecciosos em pacientes ambulatoriais da cidade deCampina Grande – PB, as quais foram, posteriormente, semeadas em Agar MuellerHinton preparadas em placas de Petri, sendo uma placa para cada uma dasdiferentes concentrações de 10% a 0,01%. Constatou-se que a CIM do extratoetanólico da romã foi obtida na concentração de 10%, em que a mesma foi capaz deinibir 100% das cepas analisadas.Estudo feito por Pereira et al. (2006), utilizando a técnica de difusão em ágarpara determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), mostrou apotencialidade da P. granatum na inibição do crescimento bacteriano frente àslinhagens de Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis,Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei, principais microorganismos do biofilmedental, nas concentrações 1:32, 1:8, 1:8, 1:512, e 1:128, respectivamente. Todas aslinhagensforam sensíveis ao extrato hidroalcoólico de Punica granatum. Os autores tambémobservaram melhores resultados do extrato em relação à clorexidina com achadossemelhantes na diluição de 1:256 ,exceto para o S. mutans.Salgado et al. (2006) ao avaliarem o efeito antiplaca e antigengivite de um gelcontendo extrato aquoso de romã a 10% utilizando um modelo de gengiviteexperimental parcial em humanos, observaram que o gel contendo extrato de romã a


- 32 -10% não foi eficiente em evitar a formação de placa bacteriana supragengival eprevenir a inflamação gengival, não demonstraram diferença estatística significanteentre os grupos controle (gel placebo) e experimental (gel fitoterápico). Esseresultado pode ter sofrido influência devido ao tipo de extrato valiado.Em contrapartida ao avaliar-se um dentifrício à base do extrato etanólico daromã o resultado mostrou-se diferente. Esta pesquisa produzida por Pereira, et al.em 2005 foi realizada em estudantes de uma escola da cidade de João Pessoa-PB.O estudo mostrou que o dentifrício reduziu significantemente o número deStreptococcus mutans na cavidade bucal, além de reduzir o índice se sangramentogengival nos pacientes aos quais fizeram uso do produto.Vasconcelos et al. (2006) investigaram a concentração inibitória mínima deaderência (CIMA) de três linhagens de estreptococos (mutans ATCC 25175, sanguisATCC 10557 e mitis ATCC 9811), S. mutans isolado clinicamente e de cepas deCândida albicans, separadamente ou associadas, frente a um gel fitoterápico obtidoda Punica granatum Linn. (romã) e ao agente antifúngico miconazol (Daktarin® geloral). Os valores de inibição do gel fitoterápico foram de 1:16 para S mutans (ATCC),S. mutans (IC) e S. sanguis; 1:128 para S. mitis e 1:64 para C. albicans. Sobre asmesmas linhagens, as concentrações inibitórias mínimas de aderência do miconazolforam: 1:512, 1:64, 1:4, 1:128, 1:16 respectivamente. O gel da romã apresentoumaior eficácia sobre associações de três e quatro microrganismos do que o gel domiconazol sendo sugerido pelo autor seu uso como opção no controle da aderênciados microrganismos testados na cavidade bucal.Schreiner, et al (2009) avaliaram a ação antimicrobiana e conseqüenteinibição da aderência de microrganismos da saliva sobre ligaduras ortodônticaselásticas, da infusão das folhas de Punica granatum (romã). Houve reduçãosignificativa no número de ufc/mL de microrganismos orais da superfície dasligaduras após o uso do chá de romã, estatisticamente significante (p


- 33 -que se mostraram efetivos com relação à atividade antimicrobiana, apresentaram-secitotóxicos a macrófagos provenientes de ratos; todavia, a associação formada peladiluição 1:2 do extrato com o hidróxido de cálcio P.A. demonstrou-se biocompatível,possibilitando, por conseguinte, potencial para ser utilizada como medicaçãointracanal.


PROPOSIÇÕES- 34 -


- 35 -3. Proposições3.1 Objetivo GeralEsse experimento se propôs a avaliar, in vitro, a atividade antimicrobiana doextrato hidroalcóolico da Punica granatum Linn. frente à culturas de E. faecalisisoladas de humanos.3.2 Objetivos Específicos- Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato da Punicagranatum Linn. frente a três cepas de E. faecalis isolados clinicamente pelo métododa microdiluição em caldo e baseado nisto averiguar laboratorialmente apossibilidade da aplicação clínica do extrato.- Determinar a Concentração Bactericida Mínima (CBM) do extrato da Punicagranatum Linn. frente à três cepas de E. faecalis isolados clinicamente.- Observar a sensibilidade antimicrobiana das cepas isoladas frente aantibióticos comuns na clínica odontológica.


MATERIAIS EMÉTODOS- 36 -


- 37 -4. Materiais e métodos4.1 Desenho do estudoTrata-se de um estudo experimental do tipo microbiológico onde se avaliou aatividade antimicrobiana do extrato hidroalcoolico da Punica granatum Linn. frente àEnterococcus faecalis isolados clinicamente. A determinação da concentraçãoinibitória mínima do extrato frente à bactéria estudada foi avaliada pelo método damicrodiluição em caldo de acordo com a metodologia de Andrews, 2001, modificadapor Sampaio (2008).4.2 Localização da pesquisaTodo o processo de verificação da capacidade antimicrobiana do extratohidroalcoolíco da Punica granatum Linn. frente à Enterococcus faecalis foi realizadano Laboratório de Biologia Bucal (LABIAL) vinculado ao programa de pós-graduaçãoem Odontologia da Universidade Federal da Paraíba.4.3 Preparação do Extrato da Punica Granatum Linn.a) Obtenção da matéria-primaA matéria-prima (fruto) da Punica granatum Linn foi obtida no MercadoPúblico Central de João Pessoa (PB) e identificada, botanicamente, no HerbárioLauro Xavier do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federalda Paraíba (nº. JPB 37501). Os frutos foram lavados com água e separados emcasca e mesocarpo, sendo a casca o material utilizado nos experimentos. Emseguida, ela foi levada à secagem em estufa (Marconi, Piracicaba, SP, Brasil) a33ºC, durante uma semana, para eliminação de umidade e estabilização doconteúdo enzimático. Passado este período, o material foi retirado da estufa,triturado em pó em moinho elétrico (Solab, Piracicaba, SP, Brasil) e então submetidoa processo de extração dos princípios ativos (Fig.2).


- 38 -b. Extração dos marcadores químicosO método de extração empregado foi à lixiviação ou percolação em fluxocontínuo à temperatura ambiente. Por se tratar de uma matéria rica em polifenóis defácil modificação estrutural, não foi utilizada a extração a quente, preservando-seassim a estabilidade do material. Na lixiviação em fluxo contínuo, utilizou-se umprocesso onde existe a renovação constante da solução extratora (soluçãohidroalcoólica a 80% v/v) (Vetec, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) durante um período devinte e quatro horas. Decorrido esse tempo, o marco ficou esgotado (extração totaldos marcadores ou princípios ativos). Nessa etapa foram utilizadosaproximadamente oito litros de solução hidroalcoólica para 1Kg de matéria-prima(casca do fruto) seca e pulverizada, visando-se ao completo esgotamento da droga.Foi recuperado o volume de 6.600ml do extrato que foi passado em filtros de papelcom poro de 0,7µm de diâmetro (Mellita, Avaré, SP, Brasil) para retirada deimpurezas, e acondicionado em frascos âmbar limpos, secos e estocados emcâmara fria (Brastemp, São Bernardo do Campo, São Paulo, Brasil).c) Concentração da solução extrativaA etapa seguinte foi a concentração da solução em nível de extrato fluido 1:1(p/v). Procedeu-se à concentração do extrato em rota-vapor (IKA-WERK ® , Breisgau,Alemanha), a uma temperatura constante de 45ºC, para se preservar a estabilidadedo material. Esse procedimento teve a intenção de promover a total evaporação doálcool.A extração e concentração do extrato hidroalcoólico da Punica granatum Linn,foram realizados no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF) da UniversidadeFederal da Paraíba.


Figura. 2: Fluxograma do método de obtenção do extrato Hidroalcoolico da Punica granatum Linn.Fonte: MELO, (2008)- 39 -


33Beyin korteksinin fonksiyonel alanlarını tanımlamada pozitron emisyontomografisinin kullanılması ile değişik fonksiyonel alanlar hakkındadaha fazla bilgi elde edilmiştir (50,53).


- 43 -4.6.1 Preparação das soluções dos extratos:Num tubo plástico esterilizado com tampa preparou-se a solução mãe (SM)do extrato numa proporção de 1 mg do extrato bruto para cada 1 mL de DMSO(dimetil sulfóxido) sob constante vibração.Em seguida, prepararam-se as seguintes soluções:a. SM1 (Solução Mãe 1): transferiu-se 500 µL de SM para tubos deensaio esterilizados contendo 500 µL do meio BHI caldo (Bacto TM ,USA).b. SM2 (Solução Mãe 2): transferiu-se 500 µL de SM para tubos deensaio esterilizados contendo 2.500 µL do meio BHI caldo (Bacto TM ,USA).c. SM3 (Solução Mãe 3): transferiu-se 500 µL de SM para tubos deensaio esterilizados contendo 4.500 µL do meio BHI caldo (Bacto TM ,USA).Nesta fase avaliou-se o líquido difundido e enriquecido com os compostos doextrato da Punica granatum Linn.Para controle positivo foi utilizado o Digluconato de Clorexidina a 2% emdiluições seriadas.4.6.2 Preparação do inóculoApós contagem das colônias bacterianas das três cepas, padronizou-se onúmero de colônias de acordo com a escala de 0,5 de Mac Farland.A cepa identificada como M21Efg conteve inicialmente ~1, 6 x 10 8 UFCs,seguida das cepas M35Efa e M37e3 com ~ 6 x 10 8 e ~ 1,2 x 10 8 respectivamente.Os inóculos utilizados corresponderam às diluições citadas.4.6.3 Preparação das microplacasTodo o procedimento foi feito em capela de fluxo laminar e com vidrarias,ponteiras e meios de cultura previamente esterilizados e em quadruplicata. As


- 44 -microplacas com 96 orifícios (COSTAR ® 3590, USA) foram preparadas de forma quecada poço tinha ao final um volume de 100 µL (Fig. 5).Figura. 6. Preparação das microplacas e leitura após aplicação da resazurina. Fonte: Própria autora.O sistema de diluição foi controlado pelo volume da solução-mãe utilizada deacordo com a metodologia de Andrews (2001), modificada por Sampaio (2008), deforma que se obteve diferentes concentrações variando de 400µg/mL à 15 µg/mL.Os poços foram preenchidos com o meio de cultura BHI caldo, o inoculo e assoluções dos extratos. Do poço A1 ao A7 utilizou-se a solução Mãe 1 do extrato, deA8 à A12 utilizou-se a solução Mãe 2 e do B1 ao B8, a solução Mãe 3 (ANEXO 1).As linhas C e D corresponderam a duplicata das linhas A e B sendo depois utilizadaspara determinação da CBM.Para o controle positivo realizou-se microdiluições seriadas até o décimo poçoda linha H, iniciando com o digluconato de clorexidina à 2%.Também foram realizados os seguintes controle de esterilidade: do caldo BHI,da cultura, do extrato e da clorexidina.Na seqüência as placas foram seladas com parafilme e incubadas a 37°C porum período de 20hs (ANDREWS, 2001).4.6.4 Leitura das microplacas para determinação da CIMApós o período de incubação bacteriana, 30 µL de resazurina (Sigma ® ,Steiheim, Alemanha) em solução aquosa na concentração de 0,5% foram acrescidosnos poços de A1 à A12; B1 à B8; G1 à G10 e H1 à H5 e re-incubadas em estufabacteriológica a 37°C por mais duas horas. Tal substância é um indicador de óxido-


- 45 -redução, utilizado para revelar alteração de pH no meio determinado pelocrescimento bacteriano (MONTEJANO et al., 2005).Este sistema revelador permite a leitura das microplacas em pouco tempo. Ospoços que adquirem uma coloração rosada indicam a reação química de óxidoreduçãoda resazurina em resorfurina sendo interpretada como presença de célulasviáveis, enquanto que nos poços onde não há mudança na coloração do coranteinterpreta-se como ausência de células viáveis, indicando inibição do crescimentocelular pelo extrato. A CIM (Concentração inibitória mínima) corresponde ao últimopoço azul da linha no sentido esquerda - direita.


- 46 -Figura. 7. Ilustração da determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) pelo método demicrodiluição em caldo. Fonte: Própria autora.


- 47 -4.6.5 Determinação da concentração bactericida mínima (CBM)Para confirmação de morte bacteriana (CBM), retirou-se 50 µL dos poçoscontroles (linha C e D) de todas as situações em que não houve crescimentobacteriano aparente demonstrado pela resazurina e plaqueou-se o conteúdo em BHIágar, sendo o mesmo incubado por 20 horas à 37°C. A ausência de crescimentobacteriano indica a concentração bactericida mínima.4.6.6. Avaliação da sensibilidade do E. faecalis a agentes antimicrobianosVerificou-se a sensibilidade do E. faecalis frente a antibióticos freqüentes naclínica odontológica como a ampicilina (10µg), a amoxicilina (10µg), e a cefalexina(30µg). A análise se efetuou através da preparação de antibiogramas (técnica dosdiscos).Após inoculação das cepas em BHI caldo por 20 horas a 37°C, 500 µL do caldocontaminado foi semeado sobre placas petri (90 X 15mm) através do método daimersão. Cada cepa foi cultivada em placas diferentes. Os discos de antibióticosforam colocados sobre o meio de cultura de forma que ficassem eqüidistantes. Todoprocedimento foi realizado sob capela de fluxo laminar e a manipulação dosmateriais se deu com instrumentos estéreis.As placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 20 horas a 37°C eem seguida avaliaram-se os halos de inibição através da medição com réguamilimetrada.InoculaçãoDiscos com antibióticosAvaliação dos halos deinibiçãoFigura. 8 – Sensibilidade antimicrobiana do E. faecalis a ampicilina, amoxicilina e cefalexina.Própria autora.Fonte:


- 48 -4.7 Análise dos dados:A análise dos dados foi feita de forma descritiva observando a açãoantimicrobiana positiva ou não do extrato da Punica granatum Linn. de acordo com ametodologia proposta por Andrews J.M. (2001), modificado por Sampaio (2008)(ANEXO 1).


RESULTADOS- 49 -


- 50 -ResultadosOs resultados do estudo para Concentração Inibitória Mínima (CIM),Concentração Bactericida Mínima (CBM) do extrato hidroalcoólico da Punicagranatum Linn. frente às três cepas do E. faecalis e a sensibilidade das mesmasaos antibióticos, serão dispostos nas tabelas e figuras a seguir:Tabela 1. Valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato etanólico da Punica GranatumLinn. determinada pelo método da microdiluição em caldo.MicroorganismoCIM ( µg/ml)M21Efg 59,5M35Efa 57,57M37e3 100Tabela 2. Valores da Concentração Bactericida Mínima (CBM) do extrato etanólico da PunicaGranatum Linn. determinada pelo plaqueamento das diluições em BHI ágar.MicroorganismoCBM ( µg/ml)M21Efg 95,9M35Efa 72,5M37e3 200A CIM foi interpretada como sendo à menor concentração da droga capaz deinibir o crescimento visível de um organismo após um período de incubação (tabela1), enquanto que a CBM referiu-se àquela concentração capaz de impedir ocrescimento de um organismo em sub-culturas livre de antibiótico (Tabela 2)(ANDREWS, 2001).Tratando-se da CIM (Tabela 1) todos valores foram iguais ou inferiores a 100µg/ml estando as cepas E. faecalis M35Efa e E. faecalis M21Efg com valoresrelativamente semelhantes. A cepa mais resistente a ação do extrato foi a E. faecalisM37e3 tanto para CIM (Tabela 1) quanto para CBM (Tabela 2).Com intuito de compreender a virulência das cepas selvagens dos E. faecalistrabalhadas neste estudo, optou-se por analisar a resistência das bactérias aantibióticos comuns na clínica odontológica. Para isso utilizou-se o método dadifusão em Agar pela técnica dos discos (Figura 9). A avaliação da atividade


- 51 -antibacteriana foi baseada na medição do diâmetro da zona de inibição formada emtodo o disco,expressos em mm, método já regulamentado pela ANVISA (NCCLS,2003). Os resultados encontrados seguem abaixo (Tabela 3; Figura 9 a, b, c):Tabela 3. Método de difusão em ágar (Técnica do disco). Diâmetro dos halos de inibição expressosem milímetros (mm).MicroorganismosDiâmetro dos halos de inibição (mm)Cefalexina 30µg Ampicilina 10µg Amoxicilina 10µgM21Efg 18 30 29M35Efa 18 29 29M37e3 18 26 29CEF30AMO10AMP10a


- 52 -CEF30AMP10AMO10bAMO10AMP10CEF30cFigura. 9 a,b,c.– Presença dos halos de inibição formados pelos antibióticos na cepa M21Efg,M35Efa e M37e3. Fonte: Própria autora.Analisando os resultados pudemos observar que a Cefalexina 30 µg(Laborclin, Pinhais, PR, Brasil) foi o antibiótico menos efetivo para todas as trêscepas, apresentando o halo de inibição de 18mm, enquanto que a Amoxicilina 10 µg(Sensibiodisc – CECON, São Paulo, SP, Brasil) e a Ampicilina 10 µg (Sensibiodisc –CECON, São Paulo, SP, Brasil) mostraram maior potencial antimicrobiano e comefetividade relativamente equivalente para as três cepas.Assim, apesar das cepas terem sido obtidas através de isolados clínicos, asmesmas apresentaram-se susceptíveis aos antimicrobianos comuns na clínicaodontológica.


DISCUSSÃO- 53 -


- 54 -DiscussãoA fitoterapia vem crescendo visivelmente ao longo dos anos, e isso pode serconstatado pelo crescente interesse do mercado mundial de fitoterápicos quemovimenta cerca de US$ 22 bilhões por ano e seduz a cada ano mais adeptos nospaíses desenvolvidos (PINTO, et al. 2002). Cechinel Filho & Yunes (1998) relatamque talvez o principal fator que contribua consideravelmente para o crescimento emquestão consiste na evolução dos estudos científicos, que comprovam, cada vezmais, a eficácia das plantas medicinais, principalmente aquelas empregadas namedicina popular com finalidades terapêuticas.Toda substância, independente de sua proporção na planta e de serconhecida ou não, pode ser um princípio ativo (Cechinel Filho & Yunes, 1998), assimextratos brutos ou semipuros podem ser obtidos como forma de avaliar a açãofarmacológica dessas substâncias. Segundo os mesmos autores, existem váriasmetodologias descritas para a preparação de extratos vegetais, visando oisolamento de seus constituintes químicos. Um dos métodos que consideram ser omais adequado para a análise químico-farmacológica é a preparação de um extratohidroalcoólico (etanol/água 50/50, v/v). Trata-se do análogo às tinturas realizadas nacultura popular, onde se misturam as partes ativas das plantas com bebidasalcoólicas (CIRILO, 1993 apud CECHINEL FILHO; YUNES, 1997).Nesse sentido, o presente trabalho buscou testar a ação antimicrobiana doextrato etanólico da casca da romã frente a E. faecalis isolados clinicamente, etestar a sensibilidade das cepas a antimicrobianos comuns na clínica odontológica.Atualmente, diversos fitoconstituintes já são conhecidos. Estudos realizadosem modelos experimentais são empregados no sentido de entender suas atividadesbiológicas in vitro e in vivo (CATÃO et al., 2006). Baseando-se nos estudos deOLIVEIRA, et al., (2007) e SANTOS, et al., (2009) que fizeram um levantamentobibliográfico e pesquisaram entre raizeiros e usuários de serviços odontológicospúblicos e privados da cidade de João Pessoa – PB, respectivamente, a Punicagranatum L. foi a planta medicinal mais citada tanto pela literatura quanto pelosusuários, bem como descrito por Cavalcante (2010).Partindo do princípio que é muito mais provável encontrar atividade biológicaem plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantasescolhidas ao acaso (SPONCHIADO JÚNIOR, 2006), resolveu-se avaliar a açãoantimicrobiana do extrato etanólico da Punica granatum Linn.


- 55 -Num contexto mais específico, clinicamente se sabe que a endodontia sofrecom os insucessos em algumas terapias, e os trabalhos se referem ao E. faecaliscomo o principal responsável por essa problemática (PARADELLA; KOGA-ITO;JORGE, 2007) ressaltando a importância da evolução da pesquisa nessa área.Inúmeros são os fatores de resistência desta bactéria, desde habilidade deformação de biofilme à produção de substância de agregação como adesinas desuperfície, ácido lipopoliteicóico, produção extracelular de superóxido, enzima líticagelatinase e hialuronidase (PARADELLA; KOGA-ITO; JORGE, 2007). E. faecalistambém impedem a liberação de enzimas hidrolíticas por célulaspolimorfonucleadas, o que pode explicar o seu domínio em infecções pulpares(REYNAUD, 2005).Para verificar a ação antimicrobiana do extrato da Punica granatum Linn.,determinou-se a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericidamínima (CBM) da solução frente à bactéria estudada.Andrews (2001) define a CIM como sendo a menor concentração de umadroga que inibe o crescimento visível de um organismo após um período deincubação, e CBM como a menor concentração de antimicrobiano capaz de impediro crescimento de um organismo em sub-culturas livres de antibióticos. O mesmoautor ainda considera a CIM como o “padrão ouro” para determinar a sensibilidadede organismos aos antimicrobianos.Analisando os resultados observamos que o extrato da romã apresentou umaeficaz atividade antimicrobiana mesmo em baixas concentrações. Esse efeitoprovavelmente se deve à ação da punicalagina que segundo Machado et al. (2002)é a principal responsável pela sua atividade antimicrobiana. Estes autoresrealizaram o fracionamento do extrato acetato de etila de frutos de Punica granatum,guiado por ensaios antimicrobianos frente a colônias de Staphylococcus aureusresistentes à meticilina, descrevendo pela primeira vez o isolamento e identificaçãodo tanino responsável pela atividade contra uma bactéria de importância médica.Nosso estudo foi realizado com três cepas selvagens do E. faecalis e emquadruplicata para garantir a maior veracidade dos resultados. Escolheu-sedeterminar a CIM através do método da microdiluição em caldo por se tratar de umatécnica quantitativa que remete em números a CIM de uma substância em oposiçãoao método da difusão em ágar, considerado como qualitativo (REIS, 2006). Alémdisso, o método de difusão em ágar conta com a desvantagem da dependência dopeso molecular das substâncias, assim soluções de peso molecular mais baixo


- 56 -difundem-se mais rapidamente que aquelas de maior peso, o que pode gerarresultados falso-positivos. Deste modo, mesmo que a substância testada seja umpotente agente antimicrobiano, essa propriedade pode ser “camuflada” devido àscaracterísticas moleculares do produto (BLACK, J.G. apud ORLANDO, 2005).A Tabela 1 expõe os resultados da atividade antibacteriana obtidos para astrês cepas onde pode-se observar que o extrato hidroalcoolico da romã apresentouótima atividade com valores de Concentração Inibitória Mínima igual ou inferior a100 µg/ml. É muito comum estudos alegarem boa atividade antimicrobiana estandoos compostos em alta concentração. Segundo Rios & Recio (2005) isso é um erro,pois a presença de atividade para os extratos só se torna interessante no caso deconcentrações abaixo de 100 µg/ml.Em se tratando da CBM, de acordo com a Tabela 2, a cepa M37e3apresentou a maior resistência ao extrato, enquanto as cepas M21Efg e M35Efaforam mais susceptíveis. Isto é devidamente aceitável uma vez que se trata debactérias selvagens as quais dependendo do organismo vivo que se encontrempodem ou não adquirir mais resistência a determinado antimicrobiano.A ação da Punica granatum Linn. vem sendo estudada de forma bastanteexpressiva na odontologia. As pesquisas mostram a eficácia da substância sobbactérias cariogênicas e periodontopatogênicas, entretanto são escassos naliteratura relatos da ação antimicrobiana do extrato da romã frente às bactérias doendodonto, mais precisamente sobre o E. faecalis.Em 2008, Melo determinou a CIM do extrato etanólico da Punica granatumLinn frente a E. faecalis (ATCC 6057) através da difusão em ágar. Observou que 1:4foi a mínima concentração capaz de inibir tal bactéria, apresentando halo de inibiçãovariando de seis a nove mm. Sabendo-se que o método de determinação daconcentração inibitória mínima através da difusão em ágar remete resultadosqualitativos (REIS, 2006), no nosso estudo foi possível quantificar em µg/ml a CIMdo extrato, além de utilizar três cepas de bactérias selvagens tornando os resultadosmais clinicamente confiáveis.A busca por um antimicrobiano capaz de inibir o E. faecalis é de grandeimportância para a clínica endodôntica. Muitos extratos possuem atividade biológicacontra a bactéria, entretanto para isso, necessitam estar em elevada concentração.Destacam-se entre estas o extrato obtido do caule da Tovomita sp. com CIM igual a500 µg/mL e CBM a 540 µg/mL (NEPOMUCENO et al., 2003); extrato hidroalcoólico


- 57 -bruto da casca do Stryphnodendron adstringens (barbatimão) com CIMcorrespondente a 200 µg/mL (ORLANDO, 2005) ou acima de 400 µg/mL (SOARES,2008); e o extrato etanólico da Q. grandiflora (Pau Terra da Folha Larga) com CIMequivalente a 1000 µg/ml (AYRES, 2008).Estes resultados mostram eficácia antimicrobiana contra E. faecalis,entretanto em concentrações muito superiores a 100 µg/mL. Vale ressaltar que estesestudos utilizam cepas com diferentes tipos de atividade e padrão de resistência.Apesar disso, do ponto de vista clínico e mesmo com limitações metodológicas,novas pesquisas com estas plantas não devem ser descartadas.Satish; Raghavendra & Raveeshaos (2008) observaram ação antimicrobianasobre o E. faecalis de algumas plantas comuns na região de Mysore Karnataka –Índia. Dentre estas se destacam a Acacia nilotica; Emblica officinalis; Lawsoniainermis; Lawsonia inermis; Manilkara zapota; Oxalis corniculata e algumas plantasconhecidas na nossa região, a Punica granatum (Romãzeira); Tamarindus indica(Tamarindeiro); No mesmo estudo os autores observaram a ineficácia antimicrobianados extratos de Macroslen parasiticus; Samanea saman; Syzygium cumini e daconhecida Anacardium occidentale, popularmente chamada de cajueiro roxo, frenteao E. faecalis.Outros extratos também se apresentaram ineficazes frente à mesma bactériaa exemplo dos extratos fluidos obtidos da Malva sylvestris (Malva), Calêndulaofficinalis (Calêndula), Plantago major (Tanchagem) e Curcuma zedoarea (Curcuma)(BUFFON, et al., 2001).O extrato aquoso a 10% dos frutos da Physalis pubescens L. (Juá de Capote)nas concentrações de 10 µL e 20 µL e o extrato aquoso liofilizado dos frutos e dasfolhas da mesma planta, em todas as concentrações testadas pelo autor (400, 200,150, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 mg/ml) também não apresentaram ação biológicasobre o E. faecalis (<strong>DA</strong>LL’ AGNOL, 2007); assim como o extrato etanólico da Q.grandiflora (Pau Terra da Folha Larga) sobre a cepa isolada do E. faecalis portadorado gene vanA (AYRES, 2008); e o extrato bruto hidroalcóolico e as frações aquosase butanólica de Lotus corniculatus (Cornichão) (<strong>DA</strong>LMARCO, 2009).Em contrapartida Oliveira et al. (2008) observaram que a mínimaconcentração do extrato etanólico e em clorofórmio da entrecasca de Crótonurucurana Baillon (Sangra d’água) foi igual a 0,5 µg/mL. Esta planta é amplamenteutilizada na medicina popular para inflamações, infecções, diarréia, câncer e feridas,como mesmo discutem


- 58 -os autores, e diante das baixas concentrações de ação antimicrobiana há boasperspectivas de uso clínico.Extratos hidroalcoólicos das folhas da Persea gratissima Gaertn, o abacateiro,também provaram possuir atividade antimicrobiana (CIM =100 µg/mL) frente ao E.faecalis (REIS, 2006) com nível de concentrações consideravelmente aplicáveis naclínica odontológica, assim como a Punica granatun Linn.Diante do exposto fica nítida a dificuldade em se comparar resultados deestudos com plantas medicinais, pois as variáveis vão desde os aspectos edáficosclimáticosque exercem influência na composição química, como o estágio dodesenvolvimento do vegetal quando da coleta, parte da planta estudada, forma depreparar o material para estudo, até os protocolos seguidos nos experimentos(AURICCHIO; BACCHI, 2003). Todavia mesmo com toda dificuldade compreende-seque o E. faecalis é uma bactéria de resistência moderada às plantas medicinais, eque o extrato hidroalcoólico da romã conseguiu mostrar capacidade antimicrobianasuperior a muitas destas plantas.Vale salientar que apenas uma cepa de E. faecalis mencionada naspesquisas acima citadas foi isolada clinicamente. Como neste estudo se trabalhoucom esse tipo de bactéria, tornou-se necessário avaliar a sensibilidade dessasculturas a antimicrobianos comuns na clínica odontológica a fim de averiguar o graude virulência dessas bactérias.De acordo com a tabela 3, pode-se observar uma maior resistência das cepasfrente à cefalexina, seguido da ampicilina e amoxicilina (Figura 9. a,b,c), quemostraram resultados semelhantes, corroborando com os estudos realizados porTorres (2002); Crespo (2002); Juliet (2002); Pinheiro, (2005).Como se observa, a cepa M37e3 apresentou maior resistência emcomparação às outras amostras tanto para a ampicilina quanto para o extrato daromã, isso se deve ao desenvolvimento nas bactérias, em seu processo evolutivo,de formas cada vez mais eficazes para evadir os pontos de ação dosantimicrobianos (CRESPO, 2005).A grande característica do gênero Enterococcus está na sua resistêncianatural a múltiplos antibióticos, bem como sua capacidade de adquirir resistência aoutros. Segundo Juliet, (2002) eles são naturalmente resistentes às cefalosporinaspodendo adquirir resistência à ampicilina, contudo este último é considerado o


- 59 -medicamento de escolha para infecções envolvendo E. faecalis, promovendo umefeito inibidor, nãolítico, na bactéria (JULIET, 2002) assim como a amoxicilina (SHEPARD; GILMORE,2002).Ao analisar os resultados observou-se que apesar das bactérias estudadasserem cepas selvagens, elas não apresentaram qualquer tipo de resistênciaadquirida. Apresentaram sensibilidade e resistência aos antibióticos condizentescom a literatura, e sensibilidade ao extrato da Punica granatum Linn. assim comomostraram nos estudos de Melo (2008) e Satish; Raghavendra & Raveeshaos(2008).A pesquisa com produtos naturais é estratégica para o Brasil uma vez que nopaís, o registro de um fitomedicamento necessita de estudos científicos para acomprovação da qualidade, da eficácia e da segurança de uso (CALIXTO, 2003).Além disso, comparado aos custos (cerca de US$ 350 milhões a US$ 800 milhões ecerca de 10 a 15 anos de pesquisa) necessários para o desenvolvimento de umnovo medicamento sintético, a produção de um fitomedicamento requer 2 a 3 % domesmo valor além do menor tempo de pesquisa (CALIXTO, 2003).Analisando a possibilidade de aplicação clínica da Punica granatum L. éinteressante ressaltar que devido a grande quantidade de taninos encontrados emtoda planta (HOLETZ et al., 2002), novas pesquisas devem ser feitas na intenção deinvestigar se este corante natural (PRATES, 2009) é capaz de causar algum efeitoantiestético.Da mesma maneira, é interessante averiguar se o extrato da romã tem açãoantimicrobiana semelhante frente às demais bactérias encontradas nas infecçõesendodônticas para que futuramente possa torna-se apta à aplicação clínica.


CONCLUSÕES- 60 -


- 61 -ConclusõesDiante dos resultados obtidos é lícito concluir que:- O extrato hidroalcóolico da romã apresentou atividade antimicrobiana frenteàs três cepas de E. faecalis selvagens;- A Concentração inibitória mínima (CIM) para as três cepas estudadasapresentou valores iguais ou inferiores a concentração ideal para atividadeantimicrobiana de extratos de plantas medicinais;- A Concentração bactericida mínima (CBM) foi maior para cepa M37e3;ampicilina;- A cepa M37e3 foi quem mais resistiu à ação da Punica granatum Linn. e da- As três cepas apresentaram características semelhantes de resistência esensibilidade a antibióticos;


REFERÊNCIAS- 62 -


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ANEXOS- 72 -


- 73 -ANEXO 1Quadro 2 - Diluição para microplacas SM1: A1 até A12 e C1 até C12.Poços Sol. SM Inóculo Meio QuantidadeMãe (µL) (µL) (µL) extrato (µg)Vol. final(mL)Conc. final(µg/mL)A1 C1 1 80 20 - 40 0.1 400A2 C2 1 70 20 10 35 0.1 350A3 C3 1 60 20 20 30 0.1 300A4 C4 1 50 20 30 25 0.1 250A5 C5 1 40 20 40 20 0.1 200A6 C6 1 30 20 50 15 0.1 150A7 C7 1 20 20 60 10 0.1 100A8 C8 2 55 20 25 9,2 0.1 91,85A9 C9 2 50 20 30 8,4 0.1 83,5A10 C10 2 45 20 35 7,5 0.1 75,15A11 C11 2 40 20 40 6,7 0.1 66,8A12 C12 2 35 20 45 5,6 0.1 58,45B1 D1 3 50 20 30 5 0.1 50B2 D2 3 45 20 35 4,5 0.1 45B3 D3 3 40 20 40 4 0.1 40B4 D4 3 35 20 45 3,5 0.1 35B5 D5 3 30 20 50 3 0.1 30B6 D6 3 25 20 55 2,5 0.1 25B7 D7 3 20 20 60 2 0.1 20B8 D8 3 15 20 65 1,5 0.1 15Fonte: Andrews et al., J Chem. Agents, 2001 e adaptação de Sampaio, 2008, no prelo.

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