maria cristina salimena da silva - UFF

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3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Camundongos distróficos mdx e controle não-distróficos C57BL10/J (C57) foram mantidos no Biotério de Patologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade Federal Fluminense (UFF) em gaiolas plásticas forradas com maravalha de pinus autoclavada, em ambiente com temperatura (20 o C) e ciclo de luz (12h/12h) controlados, recebendo suplemento vitamínico vitagold semanalmente, ração (Nuvital, Paraná, Brasil) e água filtrada ad libitum. 3.2 Castração cirúrgica Camundongos mdx e C57 machos e fêmeas selecionados com idade de 28 dias foram anestesiados com ketamina (50mg/kg) e xilasina (20mg/kg). As fêmeas
foram submetidas à ovariectomia (OVX) através de duas pequenas incisões para-espinhais na região dorsal entre a crista ilíaca e as costelas mais inferiores; e já os machos foram submetidos à orquiectomia (OOX) através de incisão mediana do saco escrotal. O grupo SHAM recebeu apenas a incisão cirúrgica sem a retirada das gônadas. Camundongos machos e fêmeas, não operados, pareados também na mesma idade, foram usados como controle. Os animais foram sacrificados por inalação de éter e, 4 semanas após cirurgia, na idade correspondente à fase de regeneração muscular (8 semanas), foram estudados . Após assepsia com solução de álcool iodado, os músculos gastrocnêmio e solear foram cuidadosamente dissecados e retirados. 3.3 Análise histológica Os músculos gastrocnêmio e solear foram fixados em formol Millonig tamponado (pH 7,2) durante 48h na temperatura ambiente. Após lavagem em água corrente durante 4 h os tecidos foram desidratados em soluções crescentes de álcool etílico (70%, 95%, 100%) durante 60 minutos em cada etapa e passados 3 vezes em álcool absoluto. Posteriormente, foram submetidos a 3 passagens em xilol para a completa retirada do álcool e da gordura do material. A impregnação e a inclusão com parafina foram realizadas em duas incubações a 60 o C por 1 hora. Todo o processamento foi feito automaticamente por meio de um processador de tecidos (LuPe PT -5, Brasil). Os blocos foram cortados semi-serialmente em micrótomo Spencer 820 (American Optical, USA) na espessura de 5 m e colocados em lâminas desengorduradas, previamente filmadas, com solução glicerol-albumina. Em seguida, os cortes foram desparafinizados em três lavagens de 3 minutos com 37
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