Preparo de amostra e análise por GCMS SQ de carbamato de etila em Cachaça usando hidrogênio como gás de arraste

Preparo de amostra e análise por GCMS SQ de carbamato de etila em
Cachaça usando hidrogênio como gás de arraste.
Autores:
Celso Blatt e Simone Nascimento
Agilent Technologies Brasil
Alameda Araguaia, 1142 – Alphaville, Barueri – SP
celso_blatt@agilent.com
Resumo
Carbamato de etila é muito comum em bebidas alcoólicas e sua análise é feita geralmente por GCMS.
Nesse trabalho foi desenvolvido um método simples de preparo da amostra para remoção de
interferentes, principalmente os açucares para poder injetar direto no GCMS. A análise por GCMS foi feita
no GC Intuvo com coluna planar DB-624ms e o espectrômetro de massa um quadrupolo simples no modo
SCAN e SIM simultâneo. O gás de arraste hidrogênio foi fornecido pelo gerador de gases da PEAK. Os
resultados são robustos e tanto no modo SCAN quando no modo SIM as curvas de calibração ficaram
ótimas e atenderam os limites da legislação Brasileira.
Palavras Chave: Carbamato de Etila, GCMS, preparo de amostra, QuEChERS, Cachaça, hidrogênio
Abstract
Ethyl carbamate is very common in alcoholic beverages and its analysis is usually done by GCMS. In this
work a simple method of sample preparation for removal of interferents was developed, mainly the sugars
to be able to inject directly into the GCMS. GCMS analysis was performed on GC Intuvo with DB-624ms
planar column and the mass spectrometer was a single quadrupole in SCAN and Sim simultaneous mode.
The carrier gas hydrogen was supplied by the PEAK gas generator. The results are robust and both in the
SCAN mode and in the SIM mode the calibration curves have been optimal and have met the limits of the
Brazilian legislation.
Keywords: Ethyl Carbamate, GCMS, sampling preparation, QuEChERS, Cachaça, hydrogen

1 - Introdução
Carbamato de etila, também conhecido como uretana, é um éster etílico de um ácido carbâmico. Estudos
em animal tem demonstrado o seu potencial carcinogênico (Baffa Junior e colaboradores, 2011). A grande
presença do carbamato de etila em bebidas alcoólicas foi descoberta na metade dos anos 1980. Foi
descoberto que o carbamato de etila é formado da reação de etanol com a ureia. Esta reação ocorre mais
em altas temperaturas e, portanto, altas concentrações de carbamato de etila são encontrados em
bebidas que são aquecidas durante o processamento, tal como cachaça, whisky e outras bebidas
destiladas. Adicionalmente, o aquecimento das garrafas durante o transporte e manuseio pode elevar o
conteúdo de carbamato de etila. Na legislação do Brasil, o limite permitido de carbamato de etila é de 150
μg/L (Masson e colaboradores, 2014).
Normalmente essa análise é feita por cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrômetros de massa
(GCMS), mas sempre precedida por um preparo de amostra. O preparo de amostra (Ryu e colaboradores,
2015) pode ser por extração liquido-liquido ou extração em fase solida com o objetivo de remover os
açucares e outros compostos que não são voláteis e podem ficar retidos ou degradados no liner do GC ou
no começo da coluna capilar. O preparo de amostra aplicado baseou-se no artigo publicado por Guerreiro
e colaboradores (2018), onde apresentou uma fácil abordagem para remoção de co-extratos polares
como açúcares e separação da fase aquosa de amostras de cachaça.
A análise por GCMS geralmente é feita com hélio como gás de arraste e usando uma coluna capilar com
media polaridade para reter o Carbamato de etila e o espectrômetro de massa no modo SIM para
monitorar a massa especifica do composto. Uma alternativa ao uso do hélio como gás arraste é usar
hidrogênio que pode ser de gerador de gás comercial e simplesmente trocando uma lente de saída da
fonte de impacto de elétrons (Connor e Fidelis, 2018).
2 – Materiais e Métodos
2.1 – Preparo da amostra
Para efeito salting-out, 5 g de carbonato de potássio foi adicionado a 10 mL de amostra em tubos de 15mL
com tampa e vortex por 20s foi aplicado. O tubo permaneceu em repouso por 2 minutos para separação
visual de duas fases conforme a figura 1 apresenta, sendo a inferior aquosa e a superior alcoólica, em
seguida 1 mL da fase superior foi transferida para vial de 2mL e injetado no GCMS Agilent.
Para curva de calibração e controles de qualidade, uma mistura de 40 % de água em etanol teve a adição
do padrão de carbamato de etila e o protocolo de extração foi seguido conforme as amostras. Brancos
foram realizados com a mesma mistura de água e etanol seguido pelo protocolo de preparo de amostra
sem adição dos padrões.

Fase alcoólica contendo
carbamato de etila
Fase aquosa, açúcares e
outros co-extratos
polares
Figura 1: Diferentes tipos de amostras de cachaças após agitação com carbonato de potássio e repouso
de 2min.
2.2 – Análise por GCMS
O instrumento utilizado (figura 2) foi o GC Intuvo 9000 com injetor split/splitless acoplado a um
espectrômetro de massa com um quadrupolo, 5977B, com fonte de ionização por impacto de elétrons.
Para a injeção das amostras líquidas foi usado o injetor de amostras G4513A em conjunto com a bandeja
de 150 amostras 7693. Segue abaixo as condições do método GCMS:
- Gás de arraste: hidrogênio do gerador Peak Scientific Precision – Hydrogen Trace 250cc – 99,9999%
- Volume injetado: 1 μL
- Modo de injeção: Splitless a 240 °C por 0,5 min e fluxo da purga de 60 mL/min
- Coluna Capilar: DB-624 UI, part number 122-1334UI-INT, 30 m x 250 μm x 1.4 μm
- Fluxo na coluna: Hidrogênio, fluxo constante a 1.2 mL/min
- Guard Chip Intuvo no modo Track Oven, temperatura do BUS (Intuvo) em 250 °C
- Rampa no forno: 40 °C por 2 min; rampa de 20 °C/min até 250 °C; tempo de corrida de 12.5 min
- Temperatura da interface GCMS: 280 °C
- Temperatura da fonte EI no MS 5977: 280 °C, quadrupolo a 150 °C
- Aquisição dos dados: modo SCAN e SIM simultâneos, SCAN de 33 a 400, N=2 e SIM (62 e 74) dwell 50

Figura 2: GCMS Intuvo/5977B com gerador de hidrogênio da PEAK usado para as análises de carbamato
de etila em cachaça.
3 – Resultados e Discussão
O analito carbamato de etila é volátil e fácil de ser analisado por GCMS. Mas, as cachaças comerciais têm
de 6 a 30 g/L de açúcar e esse açúcar não deve ser injetado no GCMS. É necessário um preparo de amostra
para remover esses interferentes não voláteis da cachaça. O método de preparo aplicado de efeito saltingout
mostrou ser bastante efetivo e rápido. Foram feitos testes de robustez com 100 injeções de cachaças

comerciais extraídas e os resultados mostraram que a área teve uma variação entre 10 a 15 % na área do
analito para uma mesma amostra.
O uso de padrão interno como carbamato de propila, butila ou o metila é recomendado para reduzir o
coeficiente de variação proveniente dos diferentes tipos de composição da cachaça, onde cada marca tem
sua própria receita de produção podendo apresentar diferentes interferentes, e também para minimizar
possíveis variações de preparo de amostra em rotina do laboratório.
A curva de calibração foi feita tanto em álcool etílico quanto em matriz de cachaça após preparo da
amostra. As concentrações do carbamato de etila foram de 75, 150, 300, 600 e 1200 μg/L. Como a
legislação Brasileira pede 150 μg/L como máximo aceitável de carbamato, a curva foi feita com um ponto
abaixo do limite e vários pontos acima para verificar a linearidade.
A aquisição do sinal do carbamato de etila foi feita no modo de varredura (SCAN) e no modo de
monitoramento dos íons selecionados (SIM) de maneira simultânea. Um dos objetivos era verificar a
identidade e confirmar pelo espectro de massas o analito carbamato de etila através do modo SCAN e
comparação com a biblioteca comercial da NIST. O outro modo de aquisição no modo SIM era para tornar
a aquisição do sinal mais especifica ao carbamato, monitorando somente as massas 62 e 74 para
quantificar com a massa 62 mais intensa e qualificar com a massa 74. Uma vantagem do modo SIM é a
maior sensibilidade porem nessa aplicação, tanto no modo SCAN quanto no modo SIM o carbamato de
etila foi detectado com área excelente para o ponto mais baixo da curva. As figuras 3, 4 e 5 mostram as
curvas de calibração no modo SCAN e SIM no solvente e SIM com a curva na matriz respectivamente.
Figura 3: Curva do carbamato de etila no modo SCAN feito em solvente.

Figura 4: Curva do carbamato de etila no modo SIM feito em solvente.
Figura 5: Curva do carbamato de etila no modo SIM na matriz.
Os cromatogramas (figura 6) mostram a análise em 12,5 min onde o carbamato de etila sai em 7,026 min.
O pico fica muito mais nítido no modo SIM mas se extrair o íon 62 do modo SCAN também pode se ver
bem o pico do carbamato de etila no modo SCAN nesse ponto mais baixo da curva com 75 μg/L (figura 7).

Figura 6: Cromatogramas no modo SIM e no modo SCAN da análise de carbamato de etila (7,026 min) em
cachaça.
Figura 7: Cromatogramas do íon 62 extraído no modo SCAN e modo SIM para o carbamato de etila.

O uso de hidrogênio como gás de arraste em GCMS é tido como perigoso e também se diz que o vácuo
não fica tão bom quanto com o gás hélio porque a molécula de hidrogênio é menor e mais difícil de retirar
da câmara de vácuo. Nesse trabalho foi substituída a lente de saída da fonte de íons de 3 mm por uma de
6 mm, a G2589-20045. O uso da lente com diâmetro maior é recomendado pelo fabricante para ser usado
com hidrogênio como gás de arraste para GCMS. Essa é a única modificação necessária, mas precisa dizer
ao software que está usando hidrogênio como gás de arraste. A figura 8 mostra o espectro obtido do
carbamato de etila no GCMS usando hidrogênio e hélio como gás de arraste. Se observa que o espectro é
mesmo tanto para hélio quando para hidrogênio, onde o match com a NIST foi de 882 para hidrogênio e
904 para hélio (máximo ou ideal é 1000), ambos usando o modo SCAN e sem subtração de background.
Figura 8: Espectros de massa obtidos do carbamato de etila por GCMS usando no primeiro exemplo o
hidrogênio e no segundo o hélio como gás de arraste.
4 – Conclusões
Com o processo de preparo de amostra simplificado e eficiente, as análises do Carbamato de etila por
GCMS podem ficar mais baratas e rápidas. O uso do GCMS mostra a eficiência, linearidade para a faixa de
concentração necessária, sensível e permite a confirmação inequívoca da identidade do carbamato de
etila. O GC Intuvo usa colunas planares e permite aquecimentos mais rápidos e uso da tecnologia micro
fluídica que reduz volumes mortos e manutenções mais fáceis. O uso do hidrogênio como gás de arraste
apesar de ser um mito entre os usuários de GCMS, mostrou ser eficiente, seguro e não alterou a
sensibilidade, o desempenho da coluna e mesmo o espectro de massa se mostrou idêntico quando
comparado com o espectro obtido com Hélio como gás de arraste. O gerador PEAK usado permite ser
instalado na sala junto com o GCMS e não precisa de linha de gás nem reguladores de gás entre o gerador
e o GC.

5 – Referências bibliográficas
Baffa Junior, J. C. [ET AL] Ethyl-carbamate determination by gas chromatography-mass spectrometry at
different stages of production of a traditional Brazilian spirit. Food Chemistry 129 (2011) 1383-1387.
Connor, E. [ET AL] The effect of draw out lens diameter on sensitivity of GC-MS analysis. PEAK Application
Note, 2018 – www.peakscientific.com/articles
Guerreiro, T. M. [ET AL] New Approach of QuEChERS and GC-MS Triple-Quadrupole for the Determination
of Ethyl Carbamate Content in Brazilian cachaças, 2018; 5(April), 1–9.
Masson, J. [ET AL] GC-MS analysis of ethyl carbamate in distilled sugar cane spirits from northern and
southern regions of Minas Gerais. J. Inst. Brew, 2014; 120: 516-520
Ryu, D. [ET AL] Determination of Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages and Fermented Foods Sold in
Korea. Toxicol Res 2015 Sep; 31(3): 289-297.