Especial microbiologia Pt. 2

Protocolos de Microbiologia Clínica
Coprocultura
Parte 2 - Outros enteropatógenos
• Carlos Henrique Pessôa
de Menezes e Silva
Doutor em Microbiologia
Microbiologista do Centro Tecnológico
de Análises (CETAN), Vila Velha-ES
Consultor em Microbiologia do Laboratório
Landsteiner, Vitória-ES
: carloshenrique@cetan.com.br
Escherichia coli causadoras de diarréia
E. coli enteropatogênica (EPEC)
São assim definidas as E. coli pertencentes
ao sorogrupo epidemiologicamente
implicado como patógeno, onde o mecanismo
de virulência não está rela cionado
à excreção de típicas enterotoxinas.
Origem e prevalência ainda hoje são
controvertidas, pois surtos de infecção
são esporádicos. Homem, bovinos e suínos
podem ser infectados. A proporção
de cepas patogênicas e não patogênicas,
embora objeto de intensas pesquisas, ainda
é desconhecida.
Denomina-se “diarréia infantil” a
doença usualmente associada à EPEC.
Causa a destruição das microvilosidades
intestinais a partir da aderência da bactéria
à membrana plasmática do enterócito,
aderência esta mediada por fímbrias codificadas
por plasmídeos, ocasionando
uma diarréia com febre, náuseas e vômitos.
EPEC são potencialmente infectantes para
crianças e lactentes e a dose infectante é
muito baixa.
Em alguns casos de doen ças em adultos,
o inóculo é geralmente similar a outros
enteropatógenos (cerca de 10 6 ) para
causar infecção. Surtos de EPEC estão geralmente
implicados com contaminação
alimentar (como ingestão de carne crua
e galinha), embora qualquer alimento
exposto à contaminação fecal seja bastante
suspeito. Apesar de esporádicos, os
surtos de EPEC são mais freqüentes em
países que possuam práticas sanitárias
deficientes (cerca de 50% dos índices de
mortalidade são reportados em países do
terceiro mundo).
E. coli enteroinvasora (EIEC)
Produz uma doença conhecida como
“disenteria bacilar” muito semelhante à
causada por Shigella. Qualquer alimento
contaminado com fezes de indivíduos
infectados, bem como água contaminada,
irá causar a doença. Surtos de EIEC são freqüentemente
associados com a contaminação
de carnes e leite não pasteurizado.
A bactéria é ingerida e invade as células
epiteliais do intestino, resultando em uma
doença caracterizada por febre, vômitos
e cólicas, com sangue e leucócitos PMN
nas fezes. A disenteria causada por EIEC
geralmente ocorre de 12 a 72 horas após a
ingestão do alimento contaminado, sendo
Quadro 1. Características de infecções intestinais por Escherichia coli
Mecanismo
patogênico
primário
Sítio primário de
infecção
Dano à mucosa
intestinal
Epidemiologia
ETEC EIEC EHEC EPEC
Enterotoxina LT e/ Invasão de Citotoxina semelhante à da Aderência a enterócitos
ou ST
enterócitos
Shigella
Intestino delgado Intestino grosso Intestino grosso Intestino delgado
Ausente (intacta)
Diarréia de viajantes,
diarréia infantil
Necrose, ulceração,
inflamação
Esporádica
Destruição de
microvilosidades, morte
celular
Colite hemorrágica,
síndrome hemolítica
urêmica
Destruição de microvilosidades
Diarréia infantil
Febre Ausente Comum Ausente Comum
Fezes:
- Natureza
- Sangue
- Pus (PMN)
Aquosa
Ausente
Ausente
Purulenta
Comum
Presente
Sanguinolenta
Proeminente
Ausente
Aquosa
Ausente
Ausente
ETEC = E. coli enterotoxigênica EIEC = E. coli enteroinvasora EHEC = E. coli enterohemorrágica EPEC = E. coli enteropatogênica
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a dose infectante muito baixa (estimada
em pouco mais de 10 células bacterianas).
São freqüentemente fermentadores
tardios (ou não fermentadores) de lactose,
imóveis, com prova de lisina descarboxilase
negativa, sendo, portanto, facilmente
confundidos com Shigella.
E. coli enterotoxigênica (ETEC)
Tem sido etiologicamente associada
com doença diarréica de todos os grupos
etários de diversas localizações em todo o
mundo. O microrganismo causa diarréia
em crianças principalmente em países menos
desenvolvidos e em turistas em visita
a países em desenvolvimento (por esse
motivo é freqüentemente denominada de
“diarréia dos via jantes”). A etiologia dessa
doença (similar à cólera) é reconhecida
há cerca de 20 anos. Produz dois tipos de
enterotoxinas: LT (uma toxina termolábil)
e ST (uma toxina termoestável, que resiste
ao aquecimento a 100°C por 15 minutos).
A enterotoxina LT de ETEC é uma proteína
complexa e de alto peso molecular que
está estrutural e funcionalmente relacionada
à toxina colérica. A dose infectante
é relativamente alta (100 milhões a 10
bilhões de bactérias).
O microrganismo precisa colonizar o
intestino delgado e se estabilizar (período
de incubação de um a dois dias), onde
então se prolifera e produz as toxinas
que induzem à secreção de fluidos (provocando
uma diarréia intensa e aquosa).
Com uma dose infectante muito alta, a
diarréia pode ser induzida em 24 horas.
Em crianças, a dose infectante é bem
menor para se ter um quadro instalado.
A contaminação da água com dejetos
humanos pode levar a uma contaminação
cruzada dos alimentos. Contaminações de
alimentos por manipuladores também é
freqüente, principalmente em alimentos
à base de carne e leite. A doença é usualmente
autolimitada. Em crianças ou idosos
debilitados, uma reposição apropriada de
eletrólitos é necessária.
E. coli enterohemorrágica (EHEC)
O subtipo de EHEC mais comum é o
A) ETEC se liga firmemente às microvilosidades intestinais através de suas fímbrias, secreta
enterotoxinas no interior das células intestinais.
B) EPEC destrói as microvilosidades intestinais e se torna firmemente ligada através de um
pedestal constituído de actina e proteínas ligadoras de actina.
C) EIEC penetra na célula intestinal, podendo se multiplicar no interior do fagolisossoma e
invadir células vizinhas, digerindo suas membranas citoplasmáticas.
D) EHEC atua de forma similar à EPEC, mas além disso libera Shiga-toxinas nas células
intestinais, promovendo a sua lise.
Figura 1. Interação dos diversos tipos de E. coli causadoras de diarréia com as células
intestinais humanas
O157, a famosa bactéria responsável pelo
grande surto que matou cerca de 20 pessoas
e infectou outras 500 nos Estados Unidos
em 1996, devido à ingestão de bolo de
carne contaminado. É caracteristicamente
responsável pela colite hemorrágica, causando
dores abdominais intensas, diar réia
sanguinolenta, com pouca ou nenhuma
febre. Cerca de 80% das cepas isoladas
pertencem ao sorogrupo O157:H7 e as
crianças com menos de cinco anos são
as mais acometidas. Produz uma potente
toxina (denominada “verotoxina” ou “toxina
shiga-like”, pois é semelhante à toxina
produzida pela Shigella dysenteriae).
Carnes cruas ou mal cozidas contaminadas
têm sido implicadas como potentes
fontes de contaminação humana. A dose
infectante ainda é desconhecida, mas é
muito próxima à de Shigella (cerca de 10
células bacterianas). A doença pode ter
índices de mortalidade acima de 50% em
pacientes idosos. Uma seqüela comum associada
com a infecção, especialmente no
caso de crianças infectadas, é a “síndrome
hemolítica urêmica”.
Diagnóstico laboratorial: Com exceção
das cepas de EHEC (não fermentadoras de
sorbitol), não há um teste bioquímico específico
que diferencie as E. coli causadoras
de diarréia das E. coli presentes em amostras
fecais normais e devem, portanto, ser diferenciadas
através de provas sorológicas (com
a caracterização dos antígenos somático [O]
e flagelar [H] das mesmas). A utilização dos
meios de cultura sugeridos na Parte 1 deste
protocolo (ágar MacConkey + ágar XLD +
caldo GN) é suficiente para o isolamento
destes sorogrupos enteropatogênicos de
E. coli. No entanto, deve-se ficar atento
ao fato das características apresentadas
pelas amostras fecais, uma vez que muito
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raramente fezes sólidas/pastosas carreiam
algum destes sorogrupos. Neste tipo de
amostra, geralmente as E. coli crescidas
são meramente pertencentes à microbiota
intestinal normal. Para o isolamento seletivo
de EHEC, pode-se utilizar meios específicos
como o ágar MacConkey-sorbitol (Figura 2)
ou meios cromogênicos (Figura 3).
Yersinia
O gênero Yersinia possui três espécies
de importância clínica: Y. estis (o agente
causal da peste bubônica), Y. seudotuberculosis
e Y. n terocolitica (muito implicadas
em casos severos de gastroenterites, com
formação de abscessos locais e até morte
causada por peritonites). Y. nterocolitica tem
sido implicada na gastroenterite aguda, podendo
causar uma forma grave que simula
a apendicite. Das três espécies patogênicas
de Yersinia, somente Y. nterocolitica e Y.
seudotuberculosis causam diarréias.
Surtos de infecção através de alimentos
causados por Y. seudotuberculosis têm sido
reportados nos Estados Unidos nos últimos
tempos e transmitidos por água e alimentos
no Japão. Cepas de Y. nterocolitica podem ser
encontradas em carnes (de porco, carneiro,
boi, etc), ostras, peixes e leite cru. A causa
exata da contaminação alimentar ainda é
desconhecida. Entretanto, a prevalência
destes microrganismos no solo, na água e
em animais como porcos e animais silvestres
oferece ampla oportunidade para a contaminação
alimentar. A doença é freqüentemente
caracterizada por sintomas como
gastroenterite com diarréia e/ou vômitos;
entretanto, febre e fortes dores abdominais
são os sintomas mais marcantes.
Diagnóstico laboratorial: Y. enterocolitica
é um microrganismo com morfologia
de pequenos cocobacilos Gram-negativos
que produzem colônias pequenas e puntiformes
em ágar MacConkey. Deve-se
suspeitar de Yersinia sempre que o meio de
T.S.I. apresentar uma coloração amarelopálida
ou alaranjada após 24 horas de
incubação. Isto se deve à fraca produção
de ácido na superfície do ágar, mostrando
ausência de acidificação na base. A bactéria
cresce mais rapidamente à temperatura de
Figura 2. Ágar MacConkey-sorbitol: EHEC =
colônias incolores (sorbitol-negativas)
Figura 3. Meio cromogênico seletivo para
EHEC (colônias vermelhas)
Figura 4. Ágar CIN (Cefsulodina-Irgasan-
Novobiocina), meio seletivo para Yersinia
enterocolitica (colônias vermelhas)
22-29°C do que a 37 ºC.
As colônias são tipicamente pequenas,
pálidas ou incolores nos meios entéricos
usuais (como ágar S.S. e MacConkey),
que devem ser incubados por mais de 24
horas à temperatura ambiente. As placas
devem ser examinadas a 24 e 48 horas
para colônias diminutas suspeitas. O enriquecimento
alcalino é um método que
pode auxiliar na detecção desta bactéria.
O método envolve a mistura de uma parte
de fezes com duas partes de KOH a 0,25%
em solução salina. Concentrações mais
altas (0,50%) de KOH foram relatadas
como sendo letais para Y. enterocolitica.
Da mesma forma, o enriquecimento a
frio também é eficaz, mas é demorado e
conseqüentemente pode não permitir a
detecção do microrganismo numa escala
temporal clinicamente relevante.
O ágar de cefsulodina-irgasan-novobiocina
(CIN) é um meio seletivo e diferencial
para a recuperação de Y. enterocolitica a
partir de espécimes fecais. As colônias desta
bactéria aparecem chatas, com um centro
vermelho (Figura 4). Algumas propriedades
que podem distinguir esta bactéria de outras
Yersinia incluem resultados positivos para
ornitina descarboxilase e a fermentação da
sacarose e resultados negativos para a fermentação
da rafinose, melibiose e ramnose.
Mais de 70% dos isolados são urease(+).
Devido à baixa prevalência deste microrganismo
em certas áreas geográficas, cada
laboratório precisa determinar se cada lote
de fezes vai ser avaliado quanto à presença
desta bactéria ou se estas culturas só serão
realizadas quando solicitadas.
Aeromonas e Plesiomonas
Aeromonas hydrophila é amplamente
encontrada em águas naturais, solo e águas
salgadas. Algumas cepas são capazes de
causar doença em peixes e anfíbios bem
como no homem, que adquire a infecção
através de feridas abertas que entram em
contato com águas contaminadas ou pela
ingestão de um número suficientemente
grande de microrganismos presentes na
água ou em alimentos. Pouco é sabido
sobre outras Aeromonas, mas elas são
também microrganismos aquá ticos e em
alguns casos também são implicadas em
infecções humanas. A. hydrophila pode
causar de uma diarréia leve, autolimitada,
à disenteria aguda ou uma diarréia
aquosa crônica persistindo por semanas
ou meses, além de ser também implicada
em alguns casos de sepsis em indivíduos
imunologicamente comprometidos, bem
como naqueles portadores de patologias
malignas como o câncer. A. caviae e A.
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veronii biovar sobria (considerados como
“supostos patógenos”) podem também
causar gastroenterite e até sepsis nestes
pacientes.
Plesiomonas shigelloides tem sido envolvida
em muitos casos de infecções humanas,
com evidências fortes de contaminação
principalmente pela água. O microrganismo
pode estar presente em águas poluídas que
são usadas para recrea ção, para consumo
humano direto e naquelas usadas para lavar
alimentos que serão consumidos sem um
cozimento adequado, além de serem encontradas
também em pescados crus. A maioria
das infecções causadas por P. shigelloides
ocorre principalmente nos meses de verão.
A ingestão desta bactéria nem sempre causa
doença humana, mas o microrganismo pode
ficar alojado temporária e transitoriamente
no organismo como microbiota não infectante
do trato gastrointestinal. A bactéria na
maioria das vezes é isolada de pacientes
com diarréia, mas em alguns casos é também
isolada de pacientes sadios (0,2 a 3,2% da
população). A diarréia provocada por P.
shigelloides é normalmente branda e autolimitada,
com episódios de febre, calafrios,
dores abdominais e náusea.
Os sintomas começam a aparecer 20-
24 horas após o consumo do alimento e/ou
água contaminados. Manifesta-se como uma
diarréia aquosa, não mucóide e não sanguinolenta;
em casos severos, as fezes podem
tomar uma coloração amarelo-esverdeada
e tingidas de sangue. A duração da doença
geralmente limita-se no máximo a sete dias.
A patogênese da infecção causada por P.
shigelloides ainda é desconhecida. Há suspeitas
de que esta bactéria seja toxigênica e
invasora. Seu significado como um patógeno
entérico é presumido, pois predominam os
isolamentos a partir de fezes de pacientes
com diarréia. Complicações extra-intestinais
(como sepsis) podem ocorrer em indivíduos
imunocomprometidos ou com patologias
como câncer, hepatopatias e leucemia.
Diagnóstico laboratorial: A. hydrophila
pode ser cultivada a partir de amostras fecais
ou de sangue, utilizando-se ágar contendo
sangue de carneiro acrescido de ampicilina.
Esta droga previne o desenvolvimento da
Figura 5. Ágar MacConkey: colônias
lactose(+) de Aeromonas hydrophila
maioria dos microrganismos acompanhantes
indesejáveis. Os laboratórios de Microbiologia,
utilizando procedimentos rotineiros, não
demonstrariam facilmente esses microrganismos,
pois eles tenderiam a ser confundidos
com enterobactérias, a não ser que fosse feito
um teste de oxidase (positivo para o gênero
Aeromonas). A identificação da espécie
pode ser confirmada por testes bioquímicos.
Recomenda-se o uso de ágar E.M.B. ou Mac-
Conkey (Figura 5) em conjunto com outro
meio mais seletivo (como o ágar X.L.D.) e
ágar sangue de carneiro com ampicilina
(10 µg/mL). P. shigelloides cresce na maioria
dos meios de cultura de rotina, embora não
cresça em ágar TCBS (tiossulfato-citrato-sais
biliares-sacarose) ou ágar bismuto-sulfito. Em
ágar E.M.B., ágar S.S. ou ágar MacConkey
a bactéria se apresenta como não fermentadora
(ou com fermentação tardia) de lactose
(Figura 6), tendo ainda reação positiva para a
prova de oxidase e negativa para H 2
S.
Vibrio
Os vibriões são microrganismos altamente
móveis, Gram-negativos, com morfologia
de bacilos curvos (com aparência
de vírgula), possuindo um único flagelo
polar. Dos vibriões clinicamente significantes
para o homem, Vibrio cholerae, o
agente causal da cólera, é o mais importante.
É adquirido através da ingestão de água
e alimentos contaminados. Outro vibrião
muito importante é o V. parahaemolyticus,
um vibrião halofílico associado a gastroenterites,
adquirido através da ingestão de
pescados crus ou mal-cozidos.
Diagnóstico laboratorial: Quando se
suspeita da presença de Vibrio, o espécime
fecal deve ser examinado fazendo-se inicialmente
um esfregaço, corando-o pelo método
de Gram, procurando por células bacterianas
morfologicamente semelhantes às dos vibrios.
Os vibriões são sensíveis ao pH ácido e morrem
rapidamente em soluções com pH abaixo
de 6. Entretanto, eles são muito tolerantes a
meios alcalinos. Paralelamente, o espécime
deve ser semeado em meio de TCBS (tiossulfato-citrato-sais
biliares-sacarose), que é tanto
seletivo como diferencial (Figura 7), tendo
como etapa inicial o enriquecimento prévio
da amostra em água peptonada alcalina (pH
9,0), incubada a 37°C por cerca de 6-8 horas
e subcultivado então no ágar TCBS.
V. cholerae forma tipicamente colônias
amarelas, chatas, grandes, enquanto que V.
parahaemo lyticus aparece tipicamente como
colônias azul-esverdeadas. As colônias típicas
de V. cholerae devem ser subcultivadas
em ágar nutriente antes de se realizar um
teste de aglutinação em lâmina com soro O1.
Um inóculo bacteriano pode ser transferido
para o ágar T.S.I. e após incubação de 24
horas a 37°C há uma reação sem produção
Figura 6. Ágar MacConkey: colônias
lactose(-) de Plesiomonas shigelloides
Figura 7. Ágar TCBS (Tiossulfato-
Citrato-Bile-Sacarose): Vibrio cholerae
(colônias amarelas sacarose[+]) e V.
parahaemolyticus (colônias verdes sacarose
[-])
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Figura 8. Ágar seletivo para Campylobacter
(colônias espalhadas e transparentes)
de gás ou H 2
S. O teste de oxidase também é
bastante indicado para caracterizar o microrganismo
(teste positivo). Outros testes bioquímicos
úteis na identificação de V. cholerae
incluem: catalase, indol, lisina e ornitina
descarboxilases, fermentação de sacarose
(todos positivos). Estas bactérias dão reações
negativas para os seguintes testes bioquímicos:
produção de gás a partir da glicose,
fermentação da lactose, inositol, hidrólise
da esculina e arginina dehidrolase.
Campylobacter
Campylobacter jejuni e C. coli são bacilos
Gram-negativos curvos, móveis, microaerófilos,
reconhecidos como importantes
patógenos entéricos. A importância dos
membros do gênero Campylobacter como
patógenos entéricos somente foi realmente
reconhecida após 1970. O desenvolvimento
de meios de cultura específicos e de
procedimentos de isolamento foi a maior
barreira para que só a partir desta época
fossem introduzidos métodos sensíveis e
específicos para tal fim. Estima-se que o
número de casos de infecções por Campylobacter
nos Estados Unidos seja equivalente
àquele por Salmonella, excedendo o
número de casos de shigeloses. No Brasil,
esta situação é bem semelhante. Os sinais
e sintomas clínicos das infecções causadas
por Campylobacter incluem febre, dores abdominais
e diarréia. A bactéria pode invadir
a corrente sangüínea e causar endocardites,
artrites sépticas ou meningites. Alguns
indiví duos são portadores assintomáticos
destes microrganismos, servindo portanto
de reservatórios da infecção.
Figura 9. Ágar seletivo (Karmali) para
Campylobacter (colônias brancas)
Diagnóstico laboratorial: As fezes contêm,
caracteristicamente, leucócitos PMN
e hemácias. Estes elementos são facilmente
observados em esfregaços corados pelo método
de Gram. Um ágar contendo uma mistura
de antimicrobianos e adicionado de 10% de
sangue de carneiro é o meio de cultura seletivo
recomendado para o isolamento de Campylobacter
spp. Este meio possui hoje várias
formulações modificadas, disponíveis comercialmente.
O meio é constituído basicamente
de uma base rica e nutritiva (tipo ágar-base
Brucella) suplementado com anfotericina-B,
cefalotina, polimixina-B, trimetoprim, vancomicina
e sangue de carneiro.
Os antimicrobianos suprimem o de-
Referências Bibliográficas
senvolvimento da microbiota fecal normal,
facilitando o isolamento bacteriano. Caso
seja utilizado um meio líquido para enriquecimento
da amostra, normalmente usa-se o
caldo Tioglicolato adicionado dos mesmos
suplementos. A incubação das placas inoculadas
deve ser feita a 42°C em uma atmosfera
de aproximadamente 5-15% de oxigênio e
5-12% de CO 2
. C. jejuni apresenta colônias
pequenas, não hemolíticas e mucóides, geralmente
acinzentadas e com bordas irregulares.
Estas colônias tendem a se espalhar pelo ágar
(Figura 8). Outro meio muito utilizado (Karmali)
contém carvão ativado e as colônias de
Campylobacter possuem cor branca (Figura
9). Caso as placas sejam examinadas com 24h
de incubação, tratá-las como se elas fossem
culturas para anaeróbios, ou seja, examiná-las
e rapidamente recolocá-las na jarra, refazendo
a atmosfera. Os padrões de crescimento a 25,
37 e 42°C, bem como as reações bioquímicas
e a susceptibilidade ao ácido nalidíxico
e à cefalotina são dados úteis no auxílio à
correta identificação e diferenciação das
espécies, sobretudo se os estudos forem realizados
pela metodologia tradicional, ou seja,
sem automação.
•
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NewsLab - edição 87 - 2008