analytica 100

artigo 2
Imagem Ilustrativa
Autores:
Eduardo de Souza Matos 1 ,
Ronaldo Mohana-Borges *1 ,
Vitor Marcel Faça*2, Fábio César Gozzo *3 ,
Wagner Fontes4, Carlos André O. Ricart 4 ,
Fábio César Sousa Nogueira 5 ,
Mário Sérgio Palma §6 ,
Marcelo Valle de Sousa *4 .
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REVISTA ANALYTICA - ABR/MAI 19
especificidade do anticorpo e serão
denominadas de agora em diante
como F(ab)-12 LC para a cadeia
leve e F(ab)-12 HC para a cadeia
pesada (PRESTA et al, 1997). Os
resultados entre os laboratórios
foram convergentes, mesmo desenvolvendo
estratégias independentes
e utilizando diferentes
espectrômetros de massa, peptidases
e ferramentas bioinformáticas.
Materiais e Métodos
Laboratórios
participantes do Estudo
Foram convidados quatro laboratórios
brasileiros para participar
desse estudo multicêntrico:
1- Laboratório 1: Centro de Espectrometria
de massas de Biomoléculas
(CEMBIO) da Universidade
Federal do Rio de Janeiro;
2- Laboratório 2: Laboratório
de Bioquímica e Química de Proteínas,
Departamento de Biologia
Celular, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade de Brasília,
Brasília, DF;
3- Laboratório 3: Instituto de
Química, Universidade de Campinas,
Campinas, SP;
4- Laboratório 4: Laboratório
de Proteômica do Câncer, Departamento
de Bioquímica e Imunologia,
Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto - USP.
Descrição das amostras
Três frascos do medicamento
Avastin 100 mg/4mL, de três
diferentes lotes (B7233B21,
B7234B07 e B7234B12), produzidos
pelo grupo Roche, foram adquiridos
no mercado diretamente
por cada laboratório. Para cada
lote de Avastin (princípio ativo bevacizumabe),
foram aliquotados 20
tubos contendo 100 µL e 40 tubos
contendo 50 µL da amostra. O procedimento
foi realizado em câmara
de segurança biológica estéril com
fluxo laminar (Classe 2 BSC). Os
lotes aliquotados foram estocados
em freezer a -80 °C.
Estratégias experimentais
adotada pelos laboratórios
Cada laboratório teve a
liberdade de escolher os métodos
e estratégias experimentais que
julgassem mais adequados para se
alcançar os objetivos pretendidos.
Três laboratórios verificaram
a pureza e integridade dos
lotes recebidos por eletroforese
em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato
de sódio (SDS-PAGE)
sob condições não redutoras e
redutoras. O Laboratório 2 utilizou
espectrometria de massa do tipo
MALDI-TOF para tal fim. Sendo
verificada a integridade e pureza
dos três lotes, cada laboratório desenhou
e executou separadamente
o sequenciamento dos aminoácidos
dos lotes de bevacizumabe.
Os procedimentos adotados serão
descritos a seguir.
Laboratório 1
O protocolo de digestão e a
análise por CL-EM foram realizados
em dois momentos diferentes.
Alíquotas dos três lotes de bevacizumabe
foram diluídas utilizando-
-se água grau HPLC para atingir
a concentração de 2 µg/µL. Dois
volumes de 50 µL de cada lote do
bevacizumabe foram diluídos como
duas amostras distintas, sendo
uma dessas submetida a protocolo
com digestão por tripsina e a outra
submetida a protocolo de digestão
simultânea por tripsina (Promega) e
endoproteinase Glu-C (Sigma).
Foram adicionados 10 µL de
solução de bicarbonato de amônio
a 50 mM e de cloreto de cálcio a
1 mM às amostras destinadas à
digestão por tripsina e 10 µL de
solução de bicarbonato de amônio
a 50 mM às amostras destinadas
à digestão simultânea por tripsina
e endoproteínase Glu-C. Adicionaram-se
a todas as amostras 10 µL
de solução RapiGest SF a 0,2%,
homogeneizou-se e aqueceu-se
durante 15 minutos a 80 °C. Para
a redução de pontes de sulfeto e
alquilação dos radicais de cisteína,
adicionaram-se 2,5 µL de DTT a
100 mM às amostras, aquecendo-
-as durante 30 minutos a 60 °C.
Após isso, as amostras foram resfriadas
à temperatura ambiente.
Em seguida, adicionaram-se 2,5
µL de iodoacetamida 300 a mM,
deixando reagir em temperatura
ambiente durante 30 minutos ao
abrigo da luz.
Adicionaram-se 20 µL da solução
de enzima proteolítica (tripsina