Autores: Geraldo Picheth1; Mauren Isfer Anghebem1,2; Guilherme Fadel Picheth3; Fabiane Gomes de Moraes Rego1 ARTIGO 01 Formas de Medição da Atividade A atividade enzimática pode ser medida essencialmente de duas formas: medição cinética (kinetic) ou medição em ponto final (endpoint) (7). Na medição cinética (múltiplos pontos, ou medição contínua) a reação é monitorada em diferentes tempos permitindo identificar a fase linear. A medição em ponto final, apenas uma medida após tempo pré-determinado é realizada, assumindo que a reação tenha transcorrido de forma linear (7). A figura 5 exemplifica as formas de medição. Figura 5: Exemplos gráficos de medidas de ponto final (um ponto, linha tracejada) e cinética (múltiplos pontos). A medição em ponto final, uma única medida de absorbância é realizada, com a expectativa que a reação tenha transcorrido de forma linear com o tempo (linha tracejada). A medição cinética (em múltiplos pontos) permite definir o período de linearidade e os períodos de lag fase e exaustão do substrato. A medição em ponto final, tem como principal vantagem a simplicidade e a possibilidade de processamento de múltiplas amostras simultaneamente. O processo agiliza rotinas não automatizadas. Como um único ponto, em tempo definido, é utilizado para o cálculo da atividade, sempre deixa a suspeita que a reação possa não ter se desenvolvido de forma linear, e, portanto, fragilizando a confiabilidade dos resultados. Deve ser ressaltado, que as metodologias enzimáticas que utilizam o ponto final como forma de medição, são desenvolvidas para resultados confiáveis e plenamente aceitas no laboratório clínico (7). A medição cinética é superior, permitindo o monitoramento da reação, e identificando com segurança o período linear e eventuais desvios da linearidade, bem como possível exaustão de substrato, em amostras hiperativas. Em sistemas manuais, a medição cinética consome tempo do equipamento e do seu operador, realizando uma amostra por vez. Esta desvantagem é superada quando se dispõe de equipamentos automatizados, que processam múltiplas amostras e realizam todas as medições e cálculos de forma automatizada (7). Convertendo velocidade de reação em Atividade Enzimática A forma de expressar a atividade enzimática foi padronizada, a partir de 1961, pela Comissão de Enzimas da União internacional de Bioquímica (10). Foi definida a Unidade Internacional (UI ou U) como a “quantidade de enzima que catalisa a reação de 1 micromol de substrato por minuto”, em condições específicas (“condições de ensaio”) de temperatura, pH, substratos e ativadores. As enzimas são usualmente expressas em Unidades por litro (U/L) (7). Em 1999 foi oficializado a unidade “katal” (símbolo kat) para compatibilizar com o Sistema Internacional (SI, Système International d’Unités) de unidades onde um katal representa a quantidade de enzima que catalisa 1 mol de substrato por segundo (11). A figura 6 resume as unidades de atividade enzimática e a conversão de U/L para as unidades mais frequentes empregadas em enzimas de uso diagnóstico µkat/L e nkat/L. As unidades U/L e kat/L são interconversíveis com os fatores apresentados (7). Figura 6: Definições de unidades de medida de atividade enzimática. [S]: concentração de substrato, min: minuto; s, segundo; L: litro de líquido biológico. U/L, Unidades Internacionais por litro (U/L) e kat/L, Unidade katal por litro. Dois procedimentos são empregados para converter a velocidade de reação em unidade de atividade enzimática: uso da absortividade molar ou um padrão do composto indicador (ex. cromógeno). A maioria das medições de enzimas diagnósticas utiliza a absortividade molar no cálculo das unidades enzimáticas. Uso da absortividade molar A absortividade molar (ε) é uma constante para um determinado composto, em comprimento de onda definido e condições padronizadas de temperatura, pH, solvente e outros (12). A figura 7 resume a definição de absortividade molar. Figura 7: Conceito de absortividade molar Em uma análise espectrofotométrica a luz incidente (I0) em comprimento de onda definido e passível de ser absorvido pela molécula em solução, deixa a cubeta (com caminho ótico definido = “b”) com menor intensidade (It), luz transmitida. A relação logarítmica da razão entre I0/It é designada Absorbância (A), uma variável adimensional. A lei de Beer mostra que em certas condições a Absorbância (A) de um composto é diretamente proporcional a concentração (c), ao caminho que a luz percorre pela solução (b) e a uma constante intrínseca do composto, a absortividade (a). Quando a concentração é expressa em termos molares, o símbolo “a” é substituído por épsilon (ε) e esta constante é designada absortividade molar. Aplicando a absortividade molar, a medida da atividade enzimática em U/L pode ser calculada com a equação mostrada na figura 8. Figura 8: Cálculo da atividade enzimática. ΔA: delta (variação) da absorbância; Δt: delta (variação) do tempo; ε: absortividade molar; b: caminho óptico ou distância que a luz percorre na cubeta, usualmente 1,00 cm); VT: volume total na cubeta (reagentes + amostra); VA: volume de amostra; 1000: fator de conversão de mmoL/L para µmoL/L (utilizado somente quando a absortividade molar é expressa em L.mmoL-1.cm-1. A atividade enzimática (U/L) é calculada pela velocidade de reação (ΔA/Δt, variação de absorbância por tempo no período linear, em minuto) e convertida em µmol de substrato desdobrado, pela absortividade molar (ε) do indicador da reação em comprimento de onda específico (milimolar no caso da fórmula estabelecida na figura), com correção do caminho óptico (b, usualmente 1,00 cm), corrigida a diluição da amostra (VT/VA), para um litro de líquido biológico. Em destaque (quadrado tracejado) os elementos da equação que definem o “fator de cálculo” da atividade, elemento constante, mantidas as condições de ensaio. Como exemplo, uma amostra de soro, onde a atividade enzimática apresente 15 U/L, a quantidade de enzima presente é capaz de desdobrar 15 µmoles de substrato por minuto por litro de soro, em condições padronizadas (concentração de substrato, tampão, pH, temperatura, ativadores, outros). 0 22 <strong>Revista</strong> NewsLab | Jun/Jul 2020
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