Revista Newslab Edição 160

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Autores: Geraldo Picheth1; Mauren Isfer Anghebem1,2; Guilherme Fadel Picheth3; Fabiane Gomes de Moraes Rego1 ARTIGO 01 De forma didática, o uso da absortividade molar (ε) no cálculo da atividade enzimática é a utilização de um “Fator externo” de um padrão, que não foi obtido no laboratório que realiza o teste. Este fator permite converter a velocidade de reação de transformação do substrato, em quantidade de substrato desdobrado em µmoles, no caso em tela, em µmol por minuto (µmol/min). O “fator de cálculo”, em destaque, na figura 8, é aquele indicado nas instruções de uso dos reagentes comerciais (bulas de kits) para o cálculo final da atividade enzimática. O quadro 2, lista as absortividades molares dos principais indicadores de reações enzimáticas de uso diagnóstico. Quadro 2. Absortividade molar de indicadores de reações enzimáticas ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; CHE, colinesterase; CK, creatina quinase; CK-MB, isoenzima MB da CK; FALc, fosfatase alcalina; GGT, gama-glutamiltransferase; LD, lactato desidrogenase; LPS, lipase. Observe que a absortividade milimolar, representada no quadro 2, varia em diferentes condições de medição como temperatura e pH. Portanto, a escolha da deste fator depende das condições estabelecidas para o ensaio (12). A utilização da absortividade molar obriga a rigoroso controle do processo analítico de medição, para sistemas manuais ou automatizados (23). A figura 9 resume os fatores a serem controlados para que a utilização da absortividade molar seja eficaz. Figura 9: Condições do sistema de medição essenciais para a utilização adequada da absortividade molar no cálculo da atividade enzimática. A utilização da absortividade molar, demanda que o sistema de medição (manual/espectrofotômetro ou automatizado) apresente desempenho com os padrões apresentados na figura. A forma prática e objetiva de verificação se as condições de medição são adequadas é a utilização de soros controle, que avaliem o resultado da medição e sistema analítico em uso. Uso do indicador da reação como padrão para cálculo da atividade enzimática Em condições pouco frequentes, o indicador da reação é estável e pode ser adicionado no protocolo de medição, como um padrão, para corrigir pequenos desvios do comprimento de onda, do caminho óptico, das medidas de volume e da performance do espectrofotômetro. É essencial, reiterar que este “padrão” não atua como a enzima presente na amostra. Portanto, não corrige variações da temperatura, e principalmente não é afetado por quaisquer dos fatores que afetam a velocidade da reação (concentração de substrato, pH e outros). A medição enzimática: um exemplo representativo Vamos considerar a medida da atividade da Fosfatase Alcalina (FAlc) utilizando como substrato 4-nitrofenilfostato e as condições de ensaio propostas como método de referência por Tietz e colaboradores (17), com modificações preconizadas em reagentes comerciais. As figuras 11 a 13, sumarizam os elementos para quantificação da FAlc, com metodologia usual no laboratório clínico. A reação: Figura 11: Princípio de reação da Fosfatase Alcalina com 4-nitrofenilfosfato. A Fosfatase Alcalina hidrolisa o 4-nitrofenilfosfato (incolor), produzindo monofosfato orgânico e o indicador 4-nitrofenol, que em pH alcalino apresenta intensa coloração amarela (íon 4-nitrofenóxido; 405 nm). A enzima requer íons Mg++ como ativador e o tampão AMP (2-amino-2-metil-1-propanol) atua também como aceptor do grupo fosfato (transfosforilação) o que aumenta a velocidade de reação. O substrato é auto-indicador, uma molécula de 4-nitrofenilfosfato hidrolisada produz uma molécula de 4-nitrofenol que é detectado (µmoles de produto colorido) em sistema fotométrico. Definido o tempo de reação (em minutos), se determina a atividade enzimática (µmoles/minuto). Figura 12: Condições de ensaio da Fostatase Alcalina na metodologia com 4-nitrofenilfosfato modificada de Tietz e colaboradores (17) Composição e concentração do reagente para Fosfatase Alcalina, condições do sistema de medição (espectrofotômetro) para medição e procedimento para medida da atividade. A unidade, L.mmol -1 .cm -1, para a absortividade molar mostrada no quadro 2, é usual, no entanto outras formas de expressar esta variável são utilizadas, em especial a unidade m 2 .mol -1 (m 2 /mol), preferida em textos técnicos. Figura 10: Cálculo da atividade enzimática com indicador da reação como “padrão”. Ateste: absorbância do teste (mede o consumo de substrato; Apadrão: absorbância do padrão (indicador da reação); Conc[P]: concentração do padrão em mmoL; t: tempo da reação enzimática em minutos; VT: volume total da reação (reagentes + amostra); VA: volume de amostra; 1000: fator de conversão de mmoL/L para µmoL/L (utilizado somente quando a concentração do padrão é expressa em mmoL/L. A atividade enzimática (U/L) é calculada pela velocidade ATeste/t (velocidade em minutos), e convertida em µmol de substrato desdobrado com a concentração do indicador da reação em mmol/L/ APadrão e corrigida para um litro de líquido biológico. Em destaque (quadrado tracejado) os elementos da equação que definem o “fator de cálculo” da atividade. Figura 13: Protocolo do ensaio da Fosfatase Alcalina. Misturar 1,0 mL do tampão-Substrato equilibrado a 37ºC, com 0,020 mL de soro (Fosfatase Alcalina), incubar por 1 min (Lag fase) e medir a atividade por 3 min em 405 nm. Com os resultados da variação de Absorbância (ΔA/min), calcular a atividade enzimática. Limite para diluição: amostras com ΔA/min ≥ 0,28 devem ser repetidas após diluição apropriada. 0 24 <strong>Revista</strong> NewsLab | Jun/Jul 2020
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