EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA, SUSPENSÕES CELULARES E ...

EMBRIOGÊNESE
SOMÁTICA, SUSPENSÕES
CELULARES E
SEMENTES SINTÉTICAS
Prof. Miguel Pedro Guerra
FIT/CCA/UFSC
mpguerra@cca.ufsc.br
Seqüência de eventos da embriogênese em Arabidopsis. Laux e
Jürgens (1997), The Plant Cell, 9.
Embriogênese somática
�Exemplo da teoria da TOTIPOTENCIALIDADE e da
PLASTICIDADE do desenvolvimento vegetal.
�Conceito:
É um processo pelo qual, células somáticas haplóides
ou diplóides, se diferenciam em plantas completas
seguindo estádios de desenvolvimento similares
aqueles observados na embriogênese zigótica
Embriogênese animal X Embriogênese vegetal
•Eixo embrionário
•Reversibilidade da programação genética
•Especificação dos órgãos
•Reversibilidade parcial? (Dolly)
EMBRIOGÊNESE
Raghavan, V. & Sharma, K.K.
�As fanerógamas iniciam seu ciclo de vida a partir de
uma célula simples, o ovo fertilizado ou zigoto;
�A fase da ontogenia associada com a progressiva
divisão é chamada de embriogênese;
�A embriogênese envolve crescimento,
diferenciação, especialização e formação de tecidos;
�Descoberta de que células somáticas e grãos de
pólen podem demonstrar padrões embriogenéticos
de desenvolvimento.
A embriogênese somática é um processo análogo a
embriogênese zigótica, onde uma célula isolada ou um
pequeno grupo de células somáticas são os precursores
dos embriões (Tautorus et al., 1991)
1

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA
A)NATURAL
�1719 – Leewenhoek: poliembrionia em citros;
�1878 – Strassburger: origem nucelar dos
poliembriões;
�Mais de 60 famílias de angiospermas, em 138
gêneros e 239 espécies;
�Rutaceae, Cactaceae, Liliaceae, Mirtaceae,
Orchidaceae, Rosaceae, Solanaceae;
�Regra: Estruturas intra-ovulares.
(Excisão)
Correlação celular
rompida
Dediferenciação Indução Rediferenciação
GANHO EXPLANTE COMPETÊNCIA
CELULAR
Célula embriogênica
com determinação
induzida
GANHO (doador)
TRANSPLANTE
DETERMINAÇÃO DESENVOLVIMENTO
Correlações
restabelecidas
Células determinadas
pré-embriogênicas
Liberação de
Inibidores naturais
Clivagem
RECONSTITUIÇÃO POR
POLIEMBRIOGENESE
EMBRIÕES
ADVENTICIOS/
PLANTAS
Horizontal: Processo morfogenético dependente da excisão, dediferenciação, indução e rediferenciação.
Vertical: Processo morfogenético no qual as células já se encontram pré determinadas. Quando estas células
são transplantadas e cultivadas em ambiente favorável, elas se multiplicam e se desenvolvem de acordo com
a ontogênese embrionária (Adaptado de Durzan, 1989)
Cascata de transdução de sinais ativados por 2,4-D e seus efeitos na reprogramação da
expressão genética e indução da divisão celular
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA
B) ES IN VITRO
�1902 – Haberlandt;
�1958 – Reinert; Steward, Mapes, Mears: ES em
D.carota
�Mais de 50 famílias; 100 gêneros; 150
espécies.
ESTÍMULO
EXTERNO
RECEPTOR
SOLÚVEL
P
Ca 2+ LIGADO
Ca 2+ LIVRE
ATP ADP
P AUXINA
RNA- POL- II P
P
NÚCLEO CITOPLASMA
DIVISÃO
Mecanismo de ação proposto para a divisão
celular induzida pela auxina
Cks
Crescimento e
diferenciação da célula
Célula poliplóide
Célula diplóide
G1
Período de
crescimento
celular antes de
que o DNA se
replique
Reinicia a interfase
telofase
anafase
metafase
profase
Diferenciação
Interfase
S
Período em
que o DNA se
replica
G2
Período posterior a
replicação do DNA;
célula se prepara
para divisão
Finaliza a interfase
Aux.
Diagrama do ciclo celular
2

Amido
Cristais de oxalato de cálcio
Alterações de parede
e membrana Primeiras divisões
0 3 5 15 20
Aquisição da
Competência
In: NEUMANN, 2000
Amido
Cristais de oxalato de cálcio
Determinação Desenvolvimento
Representação esquemática da seqüência de mudanças histológicas e
citológicas ocorridas durante o curso da embriogênese somática direta a
partir de folhas de camélia. (�) aumento; (�) decréscimo (Pedroso e Pais,
1999).
Células do
floema
secundário
Embrióides
Planta
adulta
�Diferentes padrões de origem:
In: PERES, L. (2002)
Conceitos & Histórico
�DIRETO: Proliferação celular anterior à formação do embrião é
nula ou mínima.
�INDIRETO: Requer um período para a proliferação de células
indeterminadas antes da formação do embrião somático.
�Histórico:
�Steward et al (1958) e Reinert (1958) em cenoura
�Merkle (1995) cita Levine (1947) em cenoura com ANA
�Atualmente trabalho de Waris (1957) com Oeanthe avuatica
como sendo a primeira publicação científica relatando esse
processo.
TEORIAS DA EMBRIOGÊNESE
SOMÁTICA
1) CHRISTANSON: Células competentes são receptivas a
estímulos - Indução Permissiva – Sítios receptores.
2) OSBORNE (1984): “ TARGET CELLS” -
Reconhecem sinais específicos – Sítios receptores
ativados por sinais (2,4-D)
Sistemas celulares “TARGET” Abcisão foliar
Embriogênese somática
TRAN THAN VAN: Complementariedade celular
Transmissão intercelular do estímulo
3

REG. CRESC.
EXPLANTE
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA
DIRETA INDIRETA
PEDC (Célula simples)
(Determinação durante o
ciclo celular embriogênico)
Permissivo
Inibitório
IEDC (“Clusters”)
(Células reentram
em ciclo mitótico)
Determinativo
Tulecke (1987) – Competência embriogenética
REG. CRESC.
DETERMINATIVO
EXPLANTE
REG. CRESC.
MEIO (N?)
ES DIRETA É MENOS COMUM
�As condições para sua obtenção são mais críticas
do que aquelas necessárias para produzir calos
embriogênicos;
�Busca-se a produção de grandes quantidades de
ES, para os quais calos embriogênicos e suspensões
celulares são mais adequados.
SISTEMAS EMBRIOGENÉTICOS
a) Dois estágios:
1.Indução de calos embriogenéticos;
i2,4-D – mais empregado.
2.Calos embriogenéticos (CMES) são transferidos
para meios para promover a progressão.
i2,4-D substituído por ANA, IAA ou
citocininas, ou meios isentos de fitorreguladores.
TIPOS DE ES
1.DIRETA – Células pré-determinadas antes da
excisão
�Explantes embrionários
• Nucela, óvulos, ovários, embriões, inflorescências
(tecidos florais)......
�Explantes juvenis
• Tecidos e órgãos de plântulas
�Determinação para ES direta pode ocorrer após
exposição em auxinas fortes.
• Expressão e progressão: ausência de auxinas
fortes.
2. INDIRETA -IEDC
TIPOS DE ES
�Clusters celulares, células múltiplas.
�Desdiferenciação – Rediferenciação.
�Calos embriogênicos.
�Explantes juvenis, maduros.
�Auxinas fortes.
b) Três estágios:
1.Estímulo inicial para a indução de calos em
meio com auxinas;
2.Calos sem sinal aparente de ES são sub-cultivados
para meios com menores concentrações de auxinas;
3.Calos embriogênicos ou com ES incipiente são
sub-cultivados para meios que permitam a
progressão, maturação e conversão.
4

ESTÁGIOS
1. Iniciação (Indução)
2. Proliferação (multiplicação)
3. Maturação
4. Conversão
_________________CAPÍTULO __________________________________________
I– INTRODUÇÃO
Embriogênese Somática
PLANTA
MATRIZ
Fonte de explante
Fitorreguladores
Fonte de C e N
Ciclo
Repetitivo
A
Indução
Suspensões/
Plaqueamento
Embriogênese Somática
Criopreservação
PLANTA
MATRIZ
Clivagem/
Suspensões/
Gemação
Plaqueamento
Fonte de explante
Fitorreguladores
Ciclo
Repetitivo
Escuro
A
Fonte de
Cultura
C e N Indução Embriogênica
ABA
Sementes
Sintéticas
2,4-D
CONVERSÃO
Estabelecimento
ex vitro
Ciclo de
Maturação
B
-ABA
-Fonte de C
-Agentes osmóticos
Inibição da
Clivagem/
Gemação
Maturação dos
Embriões
Somáticos
Pré-Germinação
Regeneração
de Plântulas
Aquisição da Competência Embriogenética
� Pode ser dividida em duas fases:
� Indução de células competentes
� Desenvolvimento de embriões somáticos
� Fatores que afetam:
� Genótipo do material
� Origem do explante
� Composição do meio de cultura
�auxina: 2,4-D
�Nitrogênio:
�Orgânico (aminoácidos)
�inorgânico: Relação N03 /NH4 Balanço NO 3 - /NH4 + do meio de cultura
Parâmetros Bioquímicos
Biossíntese de
hormônios
Fontes de
carbono
Poliaminas
Adaptado de Taiz e Zeiger (1998)
5

Efeito da fonte de carbono na taxa de indução de culturas
embriogênicas de A. angustifolia.
Fonte de carbono Nº de dados
Média de
Indução (% ) 1
Sacarose 3% 720 56.6 a
Maltose 3% 720 35.4 b
Média 46.0
C.V. (%) 2
33.4
Taxa média de indução de culturas embriogênicas em A. angustifolia
em resposta a diferentes tipos e concentrações de fitorreguladores.
Fitorreguladores (µM)
Número de
Explantes
Média de
Indução (% ) 1
- 480 30,02b
2,4-D (5) + BAP (2) e Kin (2) 960 48,64a
Média 39,33
C.V. (%) 2
18,90
Steiner, N & Guerra, MP (2005)
NEUMANN, 2000
Fertilização e poliembriogênese em coníferas
Aquisição da Competência
Embriogenética
Adaptado de Guerra et. al, 1999
Taxa de indução das culturas embriogênicas de Araucaria
angustifolia a partir de embriões zigóticos em diferentes
estágios de desenvolvimento.
Estágio de
desenvolvimento
Nº de dados
Média de
Indução (% ) 1
Pró-embrião 180 13.3 c
Globular 360 31.3 b
Torpedo 540 52.8 a
Pré-cotiledonar 360 66.7 a
Média 41.09
C.V. (%) 2
32.9
1- Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si
de acordo com o teste de SNK (p

Indução da embriogênese somática em Pinus taeda. A. Extrusão de massa celular suspensor-embrionária através da base
micrópila (seta). B. Proliferação da cultura embriogênica com aspecto friável, clara e translúcida (seta). C. Indução e
proliferação diretamente sobre o explante formando uma cultura embriogênica friável e translúcida. D. Megagametófito em
estágio inicial de desenvolvimento (seta) (SILVEIRA, 2001).
ES em palmiteiro (Guerra, MP & Handro, W. 1998)
ES em palmiteiro (Guerra, MP & Handro, W. 1998)
Aquisição da Competência
Embriogenética
Adaptado de Guerra et. al, 1999
7

Aquisição da Competência
Embriogenética
Adaptado de Guerra et. al, 1999 Adaptado de Guerra et. al, 1999
pE4cells
8

Repetitive embryogenesis
(budding) Embriogênese Somática
PLANTA
MATRIZ
Embrião zigótico
Fitorreguladores
Fonte de carbono
Embriogênese Somática
Ausência
Fitorreguladores
Ciclo
Repetitivo
A
Indução
Suspensões/
Plaqueamento
Morfologia celular
Fonte de carbono
Indução e Multiplicação
celular
Pró-embriões aptos para
entrar no ciclo B
Ciclo de
Maturação
B
PLANTA
MATRIZ
Embrião zigótico
Fitorreguladores
PLANTA
MATRIZ
Fonte de carbono
Ciclo
Repetitivo
A
Ausência
Fitorreguladores
Ciclo
Repetitivo
A
Indução
Fonte de carbono
Suspensões/
Plaqueamento
Suspensões celulares
Curva de crescimento celular típica, na qual se relaciona o
número de células nas diferentes fases (lag, exponencial, linear,
de desaceleração e estacionária) com o tempo de cultivo.
Pró-embriões
Conversão em plantas
Embriogênese Somática
Pré-maturação
2,4-D
ABA
Fontes de
carbono
Ciclo de
Maturação
B
Maturação dos
Embriões
Somáticos
Agentes
Osmóticos
Inibição da
Clivagem/
Gemação
10

Papel da auxina exógena durante a histodiferenciação na ES.
Embriogênese Somática
Criopreservação
PLANTA
MATRIZ
Clivagem/
Suspensões/
Gemação
Plaqueamento
Embrião zigótico
Fitorreguladores
Ciclo
Repetitivo
Escuro
A
Fontes de
Cultura
carbono Indução Embriogênica
Sementes
Sintéticas
2,4-D
CONVERSÃO
Estabelecimento
ex vitro
Ciclo de
Maturação
B
-Pré-maturação
-ABA
-Fontes de carbono
-Agentes osmóticos
Inibição da
Clivagem/
Gemação
Maturação dos
Embriões
Somáticos
Pré-Germinação
Regeneração
de Plântulas
FONTE
Explante
Clivagem
gemação
Indução
Ciclo
repetitivo
A
Embriogênese Somática
Embriogênese
Embriogênese
repetitiva
Cultura
Embriogênica
Sementes
sintéticas
Ciclo de
maturação
B
Conversão
Regeneração de
plantas
Inibição de
clivagem e
gemação
Maturação de
embriões
11

ES em palmiteiro (E. edulis)
j,k,l) Embriogênese
em rizoma de
bananeira (Cv. Grand
Naine)
m) Estágios
embrionários de
desenvolvimento
n,o,p,q,r,s) Conversão à
plântulas de bananeira
(Cv. Grand Naine)
PLANTA
MATRIZ
Embrião
zigótico
2,4-D (5 µM)
BAP e Kin (2 µM)
Maltose ou
sacarose(3%)
Escuro
Criopreservação
Ciclo de
Maturação
Sementes
Sintéticas
2,4-D,BAP, Kin
Estabelecimento
ex vitro
- ABA (150µM)
- Maltose (9%)
- PEG (7%)
- Carvão ativado (0,15%)
Regeneração
de Plântulas
Figura 2. Processo de dois ciclos para a indução e modulação da embriogênese somática de A.angustifolia. A) Estabelece condições
para a obtenção de ciclos repetitivos de divisão celular em meio de cultura BM suplementado ou não com 2,4- D (5 µM), BAP e Kin (2
µM cada); B) Estabelece condições para a progressão e maturação dos embriões somáticos em meio de cultura BM suplementado
com PEG (7%), Maltose (9%) e ABA (150µM). Adaptado de Durzan (1988) e Guerra et al., (1999).
c
Clivagem
Indução
Ciclo
Repetitivo
A
2,4-D (2 µM)
BAP e Kin (0,5 µM)
Maltose ou sacarose(3%)
Escuro
A
Suspensões/
Plaqueamento
Cultura
Embriogênica
ES em Lilium spp (Alves et al., 2003).
g
c
a
B
Inibição da
Clivagem
Maturação dos
Embriões
Somáticos
Luz
Sacarose
(3%)
Germinação
a,b,c) Embriogênese
em base de bainha
foliar de bananeira
(Cv. Grand Naine)
d,e,f) Embriogênese
em raíz de bananeira
(Cv. Grand Naine)
g,h,i) Embriogênese
em ápice floral
masculino de
bananeira (Cv. Grand
Naine)
b
d e
f g h
t
14

a b Figura 2. Efeito dos diferentes
tratamentos de maturação nas
culturas embriogênicas de A.
angustifolia. a) cultura
c d
embriogênica em meio de cultura
com sacarose (9%) e ABA (150µM)
com aspecto granular e embriões
somáticos com a superfície rugosa;
b) cultura embriogênica em meio de
cultura com maltose (9%) e ABA
(150µM); c,d) embriões somáticos
e f globulares na superfície da cultura
embriogênica; e,f) embriões
somáticos globulares, torpedo e
cotiledonares na superfície da
g
h
cultura embriogênica; g) embrião
somático cotiledonar; h) embrião
somático cotilédones clorofilados
em meio de cultura BM (Gupta &
Pullman, 1991) suplementado com
carvão ativado 1,5 g.L-1. (Bars
=1mm).
Curva de crescimento celular
SUSPENSÕES CELULARES
SISTEMAS DE CULTIVO
A) Cultivo fechado: Até fase estacionária, frações para subcultivo.
- Micropropagação
B) Cultivo contíuo fechado: Meio de cultura fresco é adicionado,
células permanecem.
- Metabólitos secundários extracelulares
C) Cultivo contínuo aberto: Adição de meio, saída de meio e células.
- Metabólitos intracelulares
MÉTODOS PARA MEDIR O CRESCIMENTO
1. Número de células
-Dispersão dos agregados, contagem em microscópio
2. Volume celular
-Centrífuga por 3 min a 200g (PCV)
-Sedimentação celular
3. Peso Fresco
4. Peso Seco
-60 o C por 12 h
5. Índice Mitótico (IM)
-Fixação em FAA (2ml fixador/5 ml suspensão), 30 min a 3
horas;
-Coloração: Carbolfucsina, carmim acético, feuelgen;
-Leitura em microscópio: 1.000 células
IM = células em mitose x 100
total de células
15

CRIOCONSERVAÇÃO DE SUSPENSÕES CELULARES
1. Concentrar a suspensão 3 a 4 vezes;
2. Agregar gradualmente um volume igual de solução crioprotetora;
-DMSO: 5 a 10%
-Glicerol, Prolina, Glicose (1 a 2 M)
-Sacarose e Manitol
3. Dispensar em ampolas de polietileno de 2 ml;
4. Congelar até - 40 o C ou - 70 o C a uma velocidade de congelamento de 1-
2 o C/min;
5. Transferir para N líquido a – 196 0 C;
6. Descongelamento da ampola em água a 37 0 C;
7. Viabilidade depende:
-Tipo de célula e estado fisiológico, tipo do crioprotetor,
velocidade de congelamento, temperatura final de congelamento,
temperatura de armazenamento, processo de descongelamento.
BIORREATORES
Os biorreatores foram incialmente utilizados para a
micropropagação nos EUA, Japão, Taiwan, Coreia, Cuba,
Costa Rica, Holanda, Espanha, Belgica e França (Ziv,
2000);
Propagação de plantas ornamentais, bulbosas, abacaxi,
batata, café, cana de açúcar, florestais, ...;
Redução no custo por propágulo de
U$ 0,17 para U$ 0,06-0,07 (Ziv, 2000);
Um dos maiores problemas da propagação em larga escala
via esta tecnologia é a contaminação;
APLICAÇÕES DAS SUSPENSÕES CELULARES
1. Estudos sobre o ciclo celular
a. Tempo e distribuição das diferentes fases
b. Sincronia ou assincronia
2. Índices de atividade celular e pontos de controle do ciclo celular
3. Fitohormonios e regulação do ciclo celular
- Auxinas: transição entre as fases G1 e S;
- Citocininas: transição entre as fases G2 e M
4. Estudos fisiológicos e bioquímicos
4.1. Absorção de nutrientes
4.2. Eventos metabólicos em suspensões celulares
- Vinca rosea
- Taxus brevifolia
5. Indução e isolamento de mutantes
- Toxinas de agentes fitopatogênicos
- Altas concentrações de sais
- Estresses bióticos e abióticos
6. Embriogênese Somática
Four kinds of bioreactor which might be used for micropropagation
16

Agitação
mecânica
Propulsão de ar
(borbulhamento)
Sem agitação
Emissão de luz
FONTE
Explante
Escuro
2,4-D
Fonte de Carbono
Nitrogênio - Gln
Clivagem
gemação
Ciclo
repetitivo
A
BIORREATORES
Embriogênese
repetitiva
ABA (?)
PEG (?)
2,4-D Maltose
Gln (?)
Ciclo de
maturação
B
Indução Cultura
Embriogênica Sementes
sintéticas
Conversão
Regeneração de
plantas
Aerador- girador
Tambor giratório
Filtro giratório
Aeração simples
Coluna de bolhas
Levantamento de ar
Inibição de
clivagem e
gemação
Maturação de
embriões
Fase gasosa
Membrana porosa
Sobre aeração
Honda et al., 2001
�Citocinina
�Luz
CA
GA 3
CKs
SEMENTES SINTÉTICAS – UNIDADES ENCAPSULÁVEIS
�Grandes volumes em pequeno espaço;
�Fixação e ganho genético - criopreservação;
�Semeadura direta a campo;
�Sementes recalcitrantes;
�Adição de nutrientes, microorganismos, pesticidas,
reguladores de crescimento; carvão ativo; ...
TECNOLOGIA DE SEMENTES
SINTÉTICAS
Emprego de embriões somáticos como
sementes verdadeiras, combinado a
eficiência e baixo custo do “sistema
semente” com a produção clonal massal em
CT.
TÉCNICAS EMPREGADAS
1. DESSECAÇÃO EM RESINA SOLÚVEL
�Polietileno óxido (Kitto e Janick, 1985)
2. DESSECAÇÃO E REHIDRATAÇÃO (Gray
et al., 1980)
�Quiescência induzida (75% - 13%);
�Germinação após 21 dias;
�Soja, Videira, gramíneas.
17

3. ENCAPSULAMENTO ES
HIDRATADOS/DESIDRATADOS EM GEL
�Alginato de sódio (Redenbaugh et al., 1986,
Calgene) Baixo custo, facilidade de uso,
propriedades geleificantes, ausência de
toxicicidade.
�Reconstituição de endosperma sintético;
�Adição de microorganismos benéficos, pesticidas,
reg. crescimento;
�Alfafa, aipo, brassicas, algodão, alface, milho;
�Trocas gasosas (?).
SEMENTES SINTÉTICAS – UNIDADES ENCAPSULÁVEIS
Semente sintética é análoga à semente verdadeira ou
botânica, e consistem de um embrião somático envolto por
uma ou mais camadas de compostos artificiais, formando
uma cápsula;
Unidade encapsulável é qualquer propágulo capaz de ser
convertido em plântulas normais, com tamanho de até 8 mm,
livre de tecido do explante materno; vigorosa habilidade de
conversão em condições ambientais normais, tolerância ao
estresse (Sakamoto et al., 1995);
SEMENTES SINTÉTICAS – UNIDADES ENCAPSULÁVEIS
Seleção do explante
Indiviualização
Solução de Alginato de
Sódio (2%) + Componentes
1000
1000
Captura com
micropipeta
H 2 O
Complexação em
(CaCl 2 ) (50 mM)
por 15 minutos
Germinação em bandejas com substrato
FITOTRON – CASA DE VEGETAÇÃO
Descomplexação em KNO 3
(100 mM) por 30 minutos
4. GEL PROTETOR FLUIDO (Fluid drilling)
�Currah et al. (1974) EZ; Drew (1979) ES –
Cenoura;
�Acrilamida – amido – potássio;
�Argila de magnésio-silicato;
�Sementes (ES) pequenas/pré germinadas.
SEMENTES SINTÉTICAS – UNIDADES ENCAPSULÁVEIS
A cápsula serve de proteção ao explante, contra danos
mecânicos durante a armazenagem, transporte e semeadura
(Gray & Purohit, 1991; Onishi et al., 1994); além de funcionar
como um endosperma sintético contendo nutrientes, ...;
O alginato de sódio apresenta boas características para o
encapsulamento por causa de suas propriedades
geleificantes, do baixo custo, da facilidade de uso e da
ausência de toxicidade (Guerra et al., 1998);
18

(ONISHI et al., 1994) (ONISHI et al., 1994)
(ONISHI et al., 1994) (ONISHI et al., 1994)
19

a
b
(ONISHI et al., 1994)
c d
a) ES em estádio torpedo de Feijoa sellowiana b) unidades
encapsuladas c) semente sintética germinando d) conversão a
plântula de F. sellowiana.
Indução das
culturas
PBZ
Plantas matrizes
Estabelecimento
em vasos
Introdução in vitro
Multiplicação
ANA BAP PBZ
Indução AIB
Individualização
MICROPROPAGAÇÃO MASSAL
MICROBROTOS-UNIDADES
ENCAPSULÁVEIS -
BROMÉLIAS
82% de
sobrevivência
Wittrockia superba
Rompimento da cápsula e crescimento – Fitotron – Casa de vegetação
Encapsulamento
Alginato de sódio
+ MS/2
20

TECNOLOGIAS ASSOCIADAS A PROPAGAÇÃO MASSAL
BIORREATORES
SEMENTES SINTÉTICAS / UNIDADES ENCAPSULÁVEIS
BIORREATORES
SEMENTE GEMA
PLANTAS MATRIZES ESTABELECIMENTO IN VITRO
ACLIMATIZAÇÃO
CRESCIMENTO
ENRAIZAMENTO
MULTIPLICAÇÃO
Embriogênese somática em Vriesea reitzii
Indução
Culturas embriogênicas
MS básico MS básico
MS + AG3 (10µM) 140 dias
120 dias
Desenvolvimento
150 dias
Airlift bioreactor
Proliferação Conversão
Aclimatização
em Substrato
65 dias
60 dias
Alongamento
MS Básico
21

Imersão temporária
Doble RITA
Principais vantagens dos biorreatores de imersão temporária
Fonte: CIRAD
•Redução nos custos de laboratório
através de manipulação simplificada de
plantas e meio de cultura;
•Melhoramento da nutrição: o meio entra
em contato direto com os explantes
durante a imersão;
•Diminuição da asfixia e hiperidricidade;
•Completa renovação da atmosfera;
•Divisão de tecidos ocorre durante a
agitação;
•Diminuição da variação somaclonal
(Feuser, 2000).
CIRAD
22

Biorreator de imersão temporária (LFDGV/ CCA/UFSC).
MOTOCROMPRESSOR
TEMPORIZADOR
1 MANGUEIRAS DE SILICONE
2 VÁLVULAS SOLENÓIDES
3 FILTROS DE AR 0,2 micras
4 ROLHAS DE SILICONE
5 TUBOS DE VIDRO
6 RESERVATÓRIO DE MEIO
DE CULTURA
7 RECIPIENTE DE CULTIVO
6
3
2
4
5
1
A B
Integração de embriogênese somática em um programa conservação
e ou melhoramento genético.
Polinização controlada
Indução da embriogênese somática
e proliferação das culturas embriogênicas
Maturação germinação dos
embriões somáticos
Conversão em plantas
Teste de progênie
Seleção das melhores
culturas embriogênicas
testadas
1
Populações Naturais (Remanescentes)
Criopreservação
1
7
Parentais
Selecionados
Multiplicação das culturas
embriogênicas
selecionadas
Maturação dos embriões
somáticos
Germinação do embrião
somático
Estabelecimento do
reflorestamento clonal
Biorreator de imersão temporária (LFDGV/ CCA/UFSC).
Aplicações da Embriogênese
Somática
� Alto rendimento biológico (embriões somáticos)
� Alto grau de automatização
� Sincronismo, uniformidade e pureza genética;
� Programas de melhoramento genético;
� Fixação do ganho genético
� Conservação da espécie
� Modelo biológico para estudos fisiológicos e bioquímicos
durante o metabolismo celular e morfogênese vegetal
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Embriogênese somática
• Alto rendimento biológico (embriões somáticos)
• Alto grau de automatização
• Sincronismo, uniformidade e pureza genética;
• Programas de melhoramento genético florestal;
• Modelo biológico metabolismo celular e morfogênese
vegetal
Micropropagação comercial: rápida proliferação, produção
em grande escala na fase de multiplicação (Ziv, 2000);
A mecanização e automação: ferramentas chaves;
Os biorreatores: promotores da micropropagação;
Sementes sintéticas – unidades encapsuláveis: aplicação
em protocolos de micropropagação comercial;
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