rezumat popa (morariu) - Gr.T. Popa

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE 

,,Grigore T. Popa” - IAŞI 

FACULTATEA DE FARMACIE 

DETERMINAREA REZIDUURILOR 

MEDICAMENTOASE DIN 

MIEREA DE ALBINE 

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT 

Coordonator ştiinţific, 

Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu 

IAŞI, 2013 

Doctorand, 

Popa (Morariu) Ionela Daniela

Decizia Rectorului U.M.F. "Grigore. T. Popa" - Iaşi de numire a 

Comisiei de Doctorat nr. 5041/19.03.2013 

Data susţinerii publice a tezei de Doctorat: 11.04.2013

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa” - Iaşi, Facultatea de Farmacie 

Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine 

CUPRINS 

INTRODUCERE..............................................................................................5 

Motivaţia cercetării...............................................................................7 

Obiective...............................................................................................8 

PARTEA GENERALĂ..................................................................................10 

CAPITOLUL I................................................................................................10 

ALBINA - MORFOLOGIE, FIZIOLOGIE, PATOLOGIE......................10 

I.1. Albina............................................................................................10 

I.2. Bolile albinelor.............................................................................13 

I.2.1. Bolile contagioase........................................................14 

I.2.1.1. Bolile virotice...............................................14 

I.2.1.2. Bolile bacteriene...........................................15 

I.2.1.3. Boli parazitare...............................................16 

I.2.1.4. Boli micotice.................................................18 

I.2.2. Bolile necontagioase.....................................................19 

I.3. Substanţe chimioterapice utilizate în apicultură pentru prevenirea 

şi tratarea bolilor albinelor...............................................................................19 

I.3.1. Antibiotice....................................................................19 

I.3.2. Alte chimioterapice antimicrobiene..............................21 

CAPITOLUL II..............................................................................................24 

MIEREA DE ALBINE - ASPECTE GENERALE.....................................24 

II.1. Istoric...........................................................................................24 

II.2. Producerea mierii.........................................................................25 

II.3. Tipuri de miere............................................................................27 

II.4. Proprietăţile mierii.......................................................................27 

II.4.1. Proprietăţile senzoriale................................................27 

II.4.2.Proprietăţile fizico-chimice ale mierii..........................30 

II.5. Mierea în apiterapie.....................................................................33 

II.6. Mierea în circuitul economic.......................................................33 

II.7. Legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de 

albine................................................................................................................34 

3



CAPITOLUL III............................................................................................38 

PREZENŢA REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE 

(CHIMIOTERAPICE ANTIMICROBIENE) ÎN MIEREA DE 

ALBINE...........................................................................................................38 

III.1. Surse de poluare a mierii............................................................38 

III.1.1. Poluarea datorată unor factori de mediu....................38 

III.1.2. Poluarea datorată practicilor apicole..........................38 

III.2. Metode de determinare a reziduurilor medicamentoase în 

miere.................................................................................................................39 

III.2.1.Metodele de screening................................................40 

III.2.1.1. Clasificarea după principiul de 

detecţie.............................................................................................................40 

III.2.1.2. Clasificarea după gradul de 

cuantificare.......................................................................................................40 

III.2.2. Metodele confirmatorii..............................................42 

III.3. Reziduuri medicamentoase în produse apicole..........................44 

PARTEA EXPERIMENTALĂ.....................................................................52 

CAPITOLUL IV.............................................................................................52 

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE 

ALBINE...........................................................................................................52 

IV.1. Introducere.................................................................................52 

IV.1.1. Corelaţii între structura chimică şi activitatea 

antimicrobiană..................................................................................................53 

IV.1.2. Mecanismul de acţiune al 

sulfonamidelor..................................................................................................53 

IV.1.3. Provenienţa reziduurilor de sulfonamide în 

miere.................................................................................................................56 

IV.2. Obiective....................................................................................57 

IV.3. Principiul metodei......................................................................57 

IV.3.1.Tehnologia Panelurilor Biocip....................................57 

IV.3.2. Biocipul......................................................................57 

IV.3.3. Detecţia......................................................................58 

IV.4. Material şi metodă......................................................................60 

IV.5. Validarea metodei......................................................................63 

IV.5.1. Liniaritatea metodei...................................................68 

4



IV.5.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie 

(IC50)...............................................................................................................71 

IV.5.3. Specificitatea şi selectivitatea....................................72 

IV.5.4. Precizia şi acurateţea..................................................73 

IV.5.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie 

(CCβ)................................................................................................................75 

IV.5.6. Regăsirea (recuperarea).............................................76 

IV.6. Probele de miere........................................................................77 

IV.7. Rezultate şi discuţii....................................................................79 

IV.8. Concluzii....................................................................................80 

CAPITOLUL V..............................................................................................82 

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE NITROFURANI ŞI 

CLORAMFENICOL ÎN MIEREA DE 

ALBINE...........................................................................................................82 

V.1. Introducere..................................................................................82 

V.1.1. Nitrofuranii..................................................................82 

V.1.2. Cloramfenicolul...........................................................83 

V.2. Obiective.....................................................................................84 

V.3. Material şi metodă.......................................................................84 

V.4. Validarea metodei.......................................................................86 

V.4.1. Liniaritatea metodei....................................................89 

V.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie 

(IC50)...............................................................................................................91 

V.4.3. Specificitatea şi selectivitatea......................................91 

V.4.4. Precizia şi acurateţea...................................................92 

V.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie 

(CCβ)................................................................................................................94 

V.4.6. Regăsirea (recuperarea)...............................................94 

V.5. Probele de miere..........................................................................96 

V.6. Rezultate şi discuţii.....................................................................97 

V.7. Concluzii...................................................................................100 

5



CAPITOLUL VI...........................................................................................101 

ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE 

ÎN MIEREA DE ALBINE...........................................................................101 

VI.1. Introducere...............................................................................101 

VI.1.1. Chinolonele..............................................................101 

VI.1.2. Cefalosporine (ceftiofur)..........................................102 

VI.1.3. Amfenicol (fluorfenicol)..........................................103 

VI.1.4. Aminoglicozide (Streptomicina)..............................104 

VI.1.5. Macrolide (tilozină).................................................104 

VI.1.6. Tetracicline..............................................................105 

VI.2. Obiective..................................................................................106 

VI. 3. Material şi metodă...................................................................106 

VI.4. Validarea metodei....................................................................108 

VI.4.1. Liniaritatea metodei.................................................111 

VI.4.2. Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie 

(IC50).............................................................................................................113 

VI.4.3. Specificitatea şi selectivitatea..................................114 

VI.4.4. Precizia şi acurateţea................................................115 

VI.4.5. Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detectie 

(CCβ)..............................................................................................................117 

VI.4.6. Regăsirea (recuperarea)...........................................117 

VI.5. Probele de miere......................................................................119 

VI.6. Rezultate şi discuţii..................................................................120 

VI.7. Concluzii..................................................................................124 

CAPITOLUL VII.........................................................................................125 

STUDIU EXPERIMENTAL AL INFLUENŢEI REZIDUURILOR 

MEDICAMENTOASE (SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR 

PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI HEMATOLOGICI 

LA ANIMALE DE LABORATOR.............................................................125 

VII.1. Introducere..............................................................................125 

VII.2. Obiectivele cercetării..............................................................130 

VII.3. Protocol experimental.............................................................130 

VII.4. Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare de 

miere conţinând sulfonamide.........................................................................131 

VII.4.1. Material şi metodă..................................................131 

VII.4.2. Prelucrarea şi interpretarea statistică......................138 

6



VII.4.3. Rezultate.................................................................141 

VII. 4.3.1. Analiza comparativă a rezultatelor 

parametrilor analizaţi......................................................................................141 

VII.4.3.2. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor 

implicate în reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a 

eozinofilelor...................................................................................................157 

VII.4.4. Discuţii...................................................................172 

VII.4.5. Concluzii.................................................................176 

VII. 5. Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani 

după administrare de miere conţinând reziduuri de 

sulfonamide....................................................................................................177 

VII.5.1 Material şi metodă...................................................177 

VII.5.2. Rezultate.................................................................184 

VII.5.3. Discuţii...................................................................201 

VII.5.4. Concluzii.................................................................203 

CAPITOLUL VIII........................................................................................205 

CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE. 

PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................205 

VIII.1. Concluzii generale.................................................................205 

VIII.2. Contribuţii originale..............................................................208 

VIII.3. Perspective de cercetare........................................................209 

BIBLIOGRAFIE..........................................................................................210 

AVIZ COMISIA DE ETICĂ A CERCETĂRII........................................224 

AVIZ LABORATOR...................................................................................225 

LISTA INDICATORILOR REALIZAŢI DIN PROIECT......................226 

7



Teza de doctorat cuprinde: 

• 209 pagini (partea generală: 50 pagini, contribuţii 

personale: 159 pagini) 

• 73 tabele 

• 144 figuri 

• 267 referinţe bibliografice 

• Aviz Comisia de Etica Cercetării 

• Aviz laborator 

• Lista indicatorilor realizaţi din proiect 

• 3 Articole ştiinţifice -1 B+; 2 ISI 

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru 

cuprins, tabele, figuri şi referinţe bibliografice. 

Cuvinte Cheie: reziduuri medicamentoase, sulfonamide, 

nitrofurani, chinolone, antibiotice, citokine, miere. 

Această cercetare a fost susț inută de proiectul 

POSDRU/88/1.5/S/63117 „Burse doctorale pentru doctoranzi competitivi în 

Aria Europeanã a Cercetãrii”. 

8



INTRODUCERE 

Mierea este principalul produs apicol, apreciat atât pentru 

însuşirile sale nutritive, cât şi pentru efectele sale terapeutice; a fost 

prima substanţă dulce folosită în hrana omului, fiind precursoarea 

zahărului din trestie sau din sfeclă. 

Tendinţa actuală spre consum şi necesitatea îndeplinirii tuturor 

cerinţelor de calitate pentru produsele alimentare, în care se încadrează 

mierea şi celelalte produse apicole, determină şi la noi în ţară stabilirea 

unor standarde de calitate şi metode performante de analiză acceptate de 

Uniunea Europeană (UE). 

O condiţie esenţială pe care trebuie să o îndeplinească 

alimentele este ca ele să nu conţină substanţe nocive pentru 

consumatori. Prezenţa substanţelor nocive în alimente i-a preocupat şi 

îngrijorat de mulţi ani pe specialişti, această problemă căpătând în 

ultimele decenii o nouă dimensiune datorită poluării crescânde a 

mediului ambiant, precum şi prin folosirea necontrolată a unor 

substanţe chimice în scopul optimizării calităţii lor. 

În ultima perioadă, o nouă clasă de poluanţi ai alimentelor au 

intrat în atenţia oamenilor de ştiinţă şi anume reziduurile de produse 

farmaceutice. Preparatele farmaceutice administrate animalelor 

domestice, incluzând antibiotice, hormoni, anestezice, tranchilizante, 

chimioterapice etc., sunt reţinute ca şi reziduuri în diferite produse. Mai 

mult, există tendinţa de a nu percepe medicamentele ca un factor 

poluant, cu toate că există o mare probabilitate ca acestea să se transfere 

ca atare sau ca metaboliţi în produsele alimentare de origine animală 

(Hughes, Heritage, 2004). 

Asigurarea integrităţii lanţului alimentar şi protejarea sănătăţii 

consumatorilor devine astfel o necesitate. 

Standardele de calitate a mierii în UE restricţionează sever 

intrarea mierii în oricare din statele europene. Când vorbim de calitatea 

mierii ne referim la respectarea parametrilor de calitate prin aplicarea 

unei tehnici apicole corecte, dar şi la absenţa reziduurilor 

medicamentoase. 

9



Reglementările comunitare admit utilizarea mai multor clase de 

medicamente veterinare (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani, 

chinolone) pentru tratarea bolilor la albine şi nu permit prezenţa 

reziduurilor medicamentoase în miere. 

Reziduurile medicamentoase din alimente trebuie studiate şi 

determinate deoarece prin alimentaţie pot deveni un factor de risc 

pentru sănătatea publică. Se impune atât identificarea principiului activ 

medicamentos cât şi al metaboliţilor lor responsabili în unele cazuri de 

efecte nocive asupra consumatorilor (Bura M et al.,2008). 

Reglementările UE cu privire la calitatea produselor apicole 

relevă necesitatea dezvoltării şi implementării unor metode de 

determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate pentru 

identificarea şi dozarea cantitativă a reziduurilor medicamentoase. 

Dezvoltarea şi îmbunătăţirea metodele analitice în vederea 

monitorizării nivelurilor de reziduuri din mierea de albine asigură 

punerea pe piaţă a produselor alimentare sigure. 

Lucrarea de faţă prezintă rezultatele privind determinarea 

reziduurilor medicamentoase (antibiotice şi alte chimioterapice 

antimicrobiene - sulfonamide, chinolone, nitrofurani) din mierea de 

albine folosind o metodă nouă de determinare şi anume tehnologia 

Biocip. 

Obiective 

Teza de doctorat are ca scop principal studiul unor metode de 

determinare rapide, de înaltă sensibilitate şi specificitate, în vederea 

identificării şi dozării cantitative a reziduurilor medicamentoase din 

mierea de albine. 

Studiul a fost iniţiat în vederea realizării următoarelor obiective: 

Validarea metodei de determinare simultană a 12 

sulfonamide din miere utilizând tehnologia de analiză cu biocipuri 

(Biochip Array Technology, BAT) şi aplicarea acesteia la analiza 

probelor de miere. 

10



Validarea metodei de determinare simultană a 4 nitrofurani şi 

a cloramfenicolului utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la 

analiza probelor de miere. 

Validarea metodei de determinare simultană a chinolonelor, 

cefalosporinelor (ceftiofur), amfenicolilor (florfenicol), 

aminoglicozidelor (streptomicina), macrolidelor (tilozina), 

tetraciclinelor utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la analiza 

probelor de miere. 

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani prin determinarea 

citokinelor, eozinofilelor şi a imunoglobulinei E (IgE), după 

administrarea de miere conţinând sulfonamide. 

Studiu experimental al influenţei reziduurilor 

medicamentoase (sulfonamide) din miere asupra unor parametri 

biochimici şi hematologici la animale de laborator (şobolani). 

Partea generală a tezei de doctorat este structurată în 3 

capitole: 

Capitolul I expune date din literatura de specialitate privind 

morfologia, fiziologia şi patologia albinei. 

Albinele fac parte din clasa Insectelor, ordinul Hymenoptera, 

familia Apidae, genul Apis. Albina meliferă prezintă 3 grupe geografice 

mari şi anume: albina meliferă africană, albina meliferă din orientul 

apropiat şi albina meliferă europeană, care datorită însuşirilor sale 

superioare s-a răspândit pe tot globul. 

Sunt prezentate, de asemenea, bolile albinelor, mai ales cele 

contagioase care spre deosebire de bolile necontagioase, sunt mai 

periculoase şi se tratează cu chimioterapice antimicrobiene. 

Bolile contagioase ale albinelor pot fi virotice, bacteriene şi 

micotice. 

11



Bolile bacteriene cele mai răspândite sunt Loca americana, Loca 

europeana, septicemia şi paratifoza. 

Loca americana este de departe cea mai virulentă boală de puiet 

cunoscută la albinele melifere fiind rezultatul infectării cu bacteria 

sporulată Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ashiralieva, Genersch, 

2006). Este foarte contagioasă şi dacă nu este tratată la timp şi 

corespunzător poate conduce la dispariţia întregii colonii, răspândinduse 

şi la alte stupine (Williams, 2000). 

Loca europeana este mai puţin gravă decât Loca americana, 

deoarece majoritatea bacteriilor care contribuie la apariţia ei nu 

sporulează, iar sporii speciilor sporogene au o rezistenţă mai scăzută 

faţă de acţiunea agenţilor fizici sau chimici. 

Cele mai cunoscute boli parazitare sunt nosemoza, varrooza şi 

senotainioza. 

Compuşii utilizaţi în tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor 

sunt: antibiotice şi alte chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, 

chinolone, nitrofurani). 

Capitolul II este destinat principalului produs apicol, mierea de 

albine şi debutează cu o prezentare succintă a importanţei şi 

semnificaţiei mierii la multe civilizaţii antice, ce au înflorit şi decăzut 

pe parcursul timpului. 

Acest capitol continuă cu prezentarea modului de producere a 

mierii, precum şi a diferitelor criterii de clasificare ale acesteia. 

Proprietăţile mierii sunt prezentate în două secţiuni distincte şi 

anume: proprietăţi senzoriale şi proprietăţi fizico-chimice. 

Caracteristicele organoleptice ale mierii sunt determinate de 

categoria acesteia, de speciile florale din care provine, de compoziţia ei 

chimică, de modul de extracţie din faguri, de modul de condiţionare, de 

timpul şi condiţiile de păstrare. 

Principalele componente ale mierii de albine sunt zaharurile. 

Mierea conţine cantităţi reduse de substanţe azotoase reprezentate în 

principal de enzime. Substanţele minerale sunt moderat reprezentate în 

mierea de flori şi relativ abundente în cea de mană. Mierea conţine o 

12



gamă largă de acizi organici, lipide, pigmenţi, enzime, uleiuri eterice, 

substanţe cu acţiune antimicrobiană, vitamine. De conţinutul în zaharuri 

depind în mare măsură calităţile fizice ale mierii şi anume: vâscozitatea, 

higroscopicitatea şi capacitatea de cristalizare. 

Acţiunea terapeutică a mierii de albine se exercită atât asupra 

aparatului digestiv (stomac, intestin), cât şi asupra ficatului şi căilor 

biliare, ale aparatului cardiovascular, respirator, urinar, sistemului 

nervos (Andriţoiu, 2006; Grigore, 2008). 

Spre finalul capitolului II sunt atinse câteva aspecte legate de 

circuitul economic al mierii în Europa şi la nivel mondial. Dacă în 

Europa suntem pe locul doi, la nivel mondial, România a urcat în primii 

20 producători de miere ai lumii; clasamentul este dominat de China, cu 

cele 300 mii tone obţinute anual. Printre marii producători ai lumii se 

mai numără ţări precum Argentina, Statele Unite ale Americii, Turcia şi 

Ucraina, având fiecare producţii în jur de 80 mii tone pe an. 

Un aspect important prezentat în acest capitol îl reprezintă 

legislaţia şi condiţiile de admisibilitate ale mierii de albine. 

În Regulamentul CE 470/2009 de stabilire a procedurilor 

comunitare pentru limitele de reziduuri medicamentoase din alimentele 

de origine animalã, legislaţia europeană defineşte prin termenul de 

reziduuri toate substanţele farmacologic active: principii active, 

excipienţi sau produse de degradare, precum şi metaboliţii acestora, 

care se regăsesc în produsele alimentare obţinute de la animalele cărora 

li s-au administrat medicamente de uz veterinar. 

Controlul şi monitorizarea reziduurilor medicamentoase în 

alimentele de origine animală este reglementată de către Uniunea 

Europeană. Obiectivul principal al legislaţiei este de a elabora norme pe 

baza cărora să se detecteze utilizarea ilegală de substanţe în produsele 

de origine animală, utilizarea abuzivă a medicamentelor de uz veterinar 

şi de a asigura punerea în aplicare a acţiunilor adecvate în vederea 

minimizării reapariţiei tuturor acestor reziduuri în alimentele de origine 

animală. 

Termenul de ,,limita maximă de reziduuri’’ (LMR) poate fi 

definit drept concentraţia maximă de reziduu, care rezultă din utilizarea 

13



unui medicament veterinar, exprimată în µg/kg, care este permisă de 

lege sau este recunoscută ca acceptabilă în sau pe un aliment. LMR se 

exprimă pe tipul şi cantitatea de reziduuri, considerat a fi fără risc 

toxicologic pentru sănătatea umană. 

Un rol important în determinarea reziduurilor medicamentoase 

din miere îl au sensibilitatea şi precizia metodei de detecţie. Deoarece 

sunt analize de urme, este necesar ca tehnica analitică să garanteze o 

limită de detecţie cât mai scăzută. 

Decizia Comisiei 2002/657/CE este decizia de punere în 

aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte 

performanţa metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. Această 

decizie prevede criterii de performanţă şi alte cerinţe pentru metodele 

de analiză care urmează să fie utilizate în testarea probelor de miere, 

pentru a asigura calitatea şi compararea rezultatelor analitice generate 

de către laboratoarele autorizate pentru controlul oficial al reziduurilor. 

Conform Deciziei Consiliului 2003/181/CE (de modificare a 

Deciziei 2002/657/CE) este necesar să se prevadă stabilirea progresivă a 

limitelor de performanță minime necesare (LPMN) aplicabile 

metodelor de analiză care trebuie utilizate pentru substanțele pentru 

care nu s-a definit nici o limită autorizată şi, în special, pentru 

substanțele a căror utilizare nu este autorizată sau este special interzisă 

în Comunitate în vederea garantării punerii în aplicare armonizate a 

Directivei 96/23/CE. 

Limita de performanță minimă necesară (LPMN) reprezintă 

conținutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puțin detectat și 

confirmat (limita minimă de detecţie a metodei). 

Pentru majoritatea chimioterapicelor antimicrobiene, LPMN 

variază în jurul valorii de 10 µg/kg; pentru cloramfenicol această limită 

este de 0,3 µg/kg, iar pentru nitrofurani de 1 µg/kg (Michaud, 2005). 

Capitolul III prezintă principalele surse de poluare ale 

produselor apicole care sunt mediul poluant şi substanţele utilizate de 

apicultori pentru tratamentul bolilor albinelor. 

14



Activitatea albinelor este influenţată de toate elementele de 

mediu (sol, vegetaţie, aer şi apă) (Pohl, 2009). 

Bogdanov (2006) subliniază faptul că pericolul de contaminare a 

produselor apicole provine într-o mai mare măsură din practicile 

apicole, decât din mediul înconjurător. Apicultorii trebuie să ia măsuri 

pentru prevenirea contaminării produselor apicole optând pentru 

alternative ecologice în controlul bolilor albinelor, prin utilizarea 

substanţelor naturale netoxice în detrimentul celor sintetice. 

La ora actuală, în tratamentul bolilor de albine, apicultorii 

folosesc frecvent acaricidele pentru combaterea varroozei şi 

chimioterapicele antimicrobiene pentru boala Loca americana şi boala 

Loca europeana (Kleespies, 2000). 

Prezenţa reziduurilor de chimioterapice antimicrobiene din 

miere este corelată cu tratamentele aplicate albinelor în cazul bolii Loca 

americana şi/sau boala Loca europeana, boli infecto-contagioase 

cauzate de bacteriile Paenibacillus larvae subsp. larvae şi respectiv 

Melissococcus pluton. În tratamentul bolilor bacteriene ale albinelor, 

care sunt foarte periculoase deoarece pot distruge complet şi rapid 

stupina, apicultorii utilizează sulfamidele şi unele antibiotice. 

Tratamentul medicamentos ar duce numai la o aparentă vindecare 

pentru că bacteria dezvoltă spori foarte rezistenţi care nu sunt distruşi de 

aceste chimioterapice antimicrobiene şi provoacă reinfectarea. De 

aceea, tratamentul trebuie repetat la anumite intervale de timp. Astfel, 

pericolul reziduurilor în produsele apicole este mare, coloniile rămân 

purtătoare de spori, iar pericolul infecţios persistă (Ritter, 2000). 

De asemenea, în acest capitol sunt prezentate metodele de 

determinare a reziduurilor medicamentoase din miere conform normelor 

Uniunii Europene incluse în Directiva Consiliului 96/23/CE. Aceste 

metode se împart în metode de screening şi metode confirmatorii. 

Metodele de screening cele mai utilizate pentru determinarea 

reziduurilor medicamentoase din mierea de albine sunt: testul ELISA, 

testul Charm II şi testul ROSA. În general, rata rezultatelor fals pozitive 

pentru testul Charm II este destul de ridicată (Reybroeck, 2003; Beaune 

et al., 2005). 

15



Testul ELISA, utilizat cu succes pentru miere, evidenţiază 

prezenţa antibioticelor în urma reacţiilor imunoenzimatice pentru 

determinarea anticorpilor şi a antigenelor specifici. 

Metoda ELISA se utilizează pentru determinări semicantitative 

datorită încrucişării reactivităţilor antibioticelor ce aparţin aceluiaşi 

grup de antibiotice. În prezent, testul ELISA este frecvent înlocuit de 

testul Charm II (Bogdanov, 2003). 

Testul Charm II reprezintă tot o metodă de screening utilizată 

pentru diferite matrici, cum ar fi carnea şi laptele şi a fost adaptată şi 

pentru miere. Sunt cunoscute teste Charm II pentru determinarea de 

chimioterapice antimicrobiene (sulfonamide, antibiotice: tetracicline, 

antibiotice betalactamice, macrolide, amfenicoli şi aminoglicozide). Un 

procent cuprins între 0-30% dintre probele depistate pozitive în urma 

testărilor vor fi confirmate prin alte metode, cum ar fi HPLC sau LC- 

MS (Kocher,1996; Edder et al., 1999; Edder, Corvi, 2001). 

Un dezavantaj al testului Charm II constă în faptul că acesta 

permite detectarea întregului grup de antibiotice, nu a fiecărui 

reprezentant individual fiind astfel inferior altor metode cantitative 

(Bogdanov, 2003; Quintana-Rizzo et al., 2005; Bonvehi, Gutierrez, 

2009). 

Testul ROSA (Rapid One Step Assay) reprezintă o altă metodă 

de screening calitativă pentru detectarea reziduurilor medicamentoase 

din miere. Acesta utilizează o bandă test şi un minim de echipament (un 

incubator), iar rezultatele se pot citi direct. Testul ROSA este utilizat 

pentru depistarea penicilinei G şi a unor compuşi β-lactamici 

(cefalosporine) din miere. Sensibilitatea pentru penicilină este de 20 

µg/kg, iar pentru compuşii β-lactamici analizaţi este de 20-200 µg/kg 

(Legg et al., 2003). 

Rezultatele metodelor de screening sunt calitative şi 

semicantitative, iar probele testate pozitiv se vor confirma prin metode 

analitice de mare sensibilitate (HPLC, LC) în vederea cuantificării 

reziduurilor de antibiotice şi chimioterapice antimicrobiene. 

Metoda HPLC este cea mai extinsă tehnică cromatografică 

utilizată pentru analiza antibioticelor (Kanfer et al., 1998) în special cea 

16



cuplată cu detector UV (Vinas et al., 2004), dar prezintă şi unele 

dezavantaje, precum faptul că fiecare clasă de antibiotice trebuie testată 

separat. 

Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de 

masă s-a obţinut un instrument de analiză performant, capabil să separe, 

să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe. 

Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE prevede ca toate 

metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, să fie confirmate 

prin spectrometrie de masă (Gentili et al., 2005). 

Metoda LC-MS prezintă o siguranţă de detecţie de aproape 

100% (Nakazawa et al., 1999). Metoda a fost dezvoltată pentru 

sulfonamide şi tetracicline (tetraciclină, oxitetraciclină şi 

cloroxitetraciclină). Limita de detecţie este între 0,5 - 10 µg/kg, 

depinzând de substanţă. Metoda a continuat să se extindă şi pentru 

cloramfenicol şi streptomicină. Obiectivul principal a fost dezvoltarea 

metodei LC-MS, capabilă să detecteze toate reziduurile de antibiotice 

din miere (Bogdanov, 2003). 

În ultima perioadă s-au efectuat numeroase studii privind 

depistarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine utilizând 

numeroase metode de determinare cu diferite limite de detecţie şi 

cuantificare. Stadiul actual al cunoaşterii privind utilizarea acestor 

metode de determinare pentru probele de miere este prezentat în cadrul 

acestui capitol al tezei de doctorat. 

17



Partea experimentală a tezei de doctorat este structurată în 

5 capitole care urmăresc îndeplinirea sistematică a obiectivelor propuse 

în cercetarea doctorală. 

Capitolul IV - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE 

SULFONAMIDE ÎN MIEREA DE ALBINE 

Scopul cercetãrii 

Cercetarea prezentă a avut drept scop validarea unei metode de 

determinare simultană a 12 sulfonamide din miere utilizând tehnologia 

de analiză cu biocipuri (Biochip Array Technology, BAT) în vederea 

evaluãrii conţinutului acestora în probe de miere disponibile pe piaţa 

comercială din România. 

Introducere 

La ora actuală, în medicina veterinară, sulfonamidele sunt 

printre cele mai folosite substanţe medicamentoase, datorită faptului că 

au un preţ scăzut (comparativ cu antibioticele), un spectru antibacterian 

larg şi o eficacitate terapeutică apreciabilă în unele boli infecţioase. 

Sulfonamidele sunt folosite în apicultură pentru a trata trei boli 

ale albinelor şi anume, boala Loca americana, boala Loca europeana şi 

nosemoza (Reybroeck et al., 2010). 

Sulfadimetoxina, sulfametoxazolul, sulfachinoxalina şi 

sulfadiazinele sunt cele mai folosite sulfonamide în medicina veterinară, 

inclusiv în apicultură. Dacă perioada dintre tratamentul albinelor şi 

recoltarea mierii nu este respectată, aceasta poate fi contaminată cu 

reziduuri din aceste substanţe. Interesul pentru detectarea acestor 

reziduuri este de mare actualitate. 

Avertizări recente ale Uniunii Europene în legătură cu prezenţa 

sulfonamidelor în miere au condus la intensificarea supravegherii 

reziduurilor medicamentoase şi necesitatea dezvoltării de metode 

sensibile şi rapide de screening ale reziduurilor acestor substanţe în 

acest produs alimentar deosebit de apreciat de consumatori (Thompson, 

Noot, 2005). 

18



Material şi metodă 

Metoda Biocip aplicată se încadrează, conform criteriilor de 

clasificare a metodelor de determinare a reziduurilor din miere, în 

categoria metodelor de screening. 

Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence 

Investigator produs de firma Randox, UK. Acest sistem utilizează 

principiile imunologice de bază: metoda competitivă tip sandwich, 

bazată pe captură de anticorpi. Metoda de detecţie este 

chemiluminescenţa. 

Reactivii sunt livraţi de producătorul aparatului şi includ: 

Antimicrobial Array I - kit (cod de catalog EV3523, Randox 

Laboratories, UK). 

Control: Sulphonamide Multianalit Control (cod de catalog 

AMC5004, Randox Laboratories, UK). 

Validarea metodei 

Metoda de validare şi procedura de analiză a produselor apicole 

s-a realizat în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele 

analitice ale FDA, ghidurile de validare pentru reziduuri 

medicamentoase, ghidurilor pentru implementarea Deciziei Comisiei 

2002/657/CE, ghidurilor de validarea a metodelor de screening pentru 

reziduurile de medicamente veterinare şi Procedurile Standard de 

Operare ale Laboratorului S.C.Investigaţii Medicale Praxis S.R.L. Iaşi. 

Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea 

(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea; 

precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de 

detecţie, regăsirea (recuperarea) (tabel IV.2 - IV.5). 

Limita de decizie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a 

încadrat între valorile 0,54 µg/kg şi 5,14 µg/kg. Capabilitatea de 

detecţie obţinută pentru sulfonamidele determinate s-a încadrat între 

valorile 0,79 µg/kg şi 7,99 µg/kg conform tabel IV.3, tabel IV.5 şi fig. 

IV.32. 

19



SCP 

SMP 

SMZ 

SM 

SD 

SP 

Fig. IV.32: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ) 

8 

6 

4 

2 

0 

20 

SS 

SZ 

Limita de decizie CCα (μg/kg) 

ST 

SDM 

SQ 

SMT 

Capabilitatea de detecţie CCβ (μg/kg)

21 

Precizie şi acurateţe 

Tabelul IV.2: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe) 

Parametrii de validare 

Liniaritate 

Senibilitate 

Aceeaşi serie 

Serii diferite 

ANALIT 

SZ SDM SQ SMT ST SS 

Interval de calibrare (µg/kg) 0 - 20,00 0 - 20,50 0 - 20,20 0 - 11,20 0 - 21,10 0 - 11,20 

Coeficient de corelatie r 0,987 0,982 0,986 0,988 0,991 0,986 

IC 50 (μg/kg) 0,89 1,90 1,60 0,20 0,40 0,60 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 57 51 50 51 59 47 

CV (%) 6 7 10 9 5 8 

Conc.(μg/kg) 115 99 89 112 131 113 

CV (%) 7 6 9 7 9 5 

Conc.(μg/kg) 164 140 134 170 206 167 

CV (%) 6 5 5 7 6 7 

Conc.(μg/kg) 84 51 54 61 51 36 

CV (%) 10 11 10 14 14 11 

Conc.(μg/kg) 171 101 141 101 122 90 

CV (%) 12 8 10 7 12 9 

Conc.(μg/kg) 259 160 212 138 207 136 

CV (%) 15 10 10 7 11 10 


Popa (Morariu) Ionela Daniela - Determinarea reziduurilor medicamentoase din mierea de albine

22 

Tabelul IV.3: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie) 


SZ SDM 

ANALIT 

SQ SMT ST SS 

Nivel 1 

Conc.(μg/kg) 

Recuperare (%) 

44 

112 

51 

102 

49 

98 

50 

100 

57 

115 

46 

92 

Nivel 2 

Conc.(μg/kg) 


113 

113 

96 

96 

86 

86 

112 

112 

129 

129 

112 

112 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 


159 

106 

138 

92 

134 

89 

169 

113 

204 

136 

166 

111 

Recuperarea 

Limita de decizie CCα şi 

capabilitate de detecţie CCβ 

Conc. medie (μg/kg) 1,71 2,41 1,23 2,29 0,71 2,01 

DS 0,39 0,54 0,11 1,74 0,24 0,30 

1,64 x DS 0,64 0,89 0,18 2,85 0,39 0,49 

CCα (μg/kg) 2,35 3,30 1,41 5,14 1,10 2,50 

CCβ (μg/kg) 2,99 4,19 1,59 7,99 1,49 2,99 



23 


Tabelul IV.4: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe) 


Liniaritate 

Senibilitate 



ANALIT 

SP SM SMP SCP SMZ SD 

Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 19,40 0 - 2,50 0 - 19,60 0 - 19,60 0 - 11,70 0 - 19,40 


IC 50 (μg/kg) 2,50 0,20 0,80 0,60 0,30 0,60 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 58 50 53 48 68 45 

CV (%) 7 7 7 6 5 9 

Conc.(μg/kg) 100 112 129 102 149 101 

CV (%) 6 10 6 8 5 8 

Conc.(μg/kg) 140 174 190 149 236 139 

CV (%) 7 5 6 5 6 7 

Conc.(μg/kg) 94 62 58 78 98 38 

CV (%) 11 10 9 11 9 11 

Conc.(μg/kg) 192 80 112 124 158 64 

CV (%) 13 14 8 11 8 10 

Conc.(μg/kg) 275 156 175 189 231 95 

CV (%) 8 17 9 11 9 10 

23 



24 

Tabelul IV.5: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie) 


SP SM 

ANALIT 

SMP SCP SMZ SD 

Nivel 1 

Conc.(μg/kg) 


53 

106 

49 

99 

52 

105 

47 

94 

66 

132 

44 

88 

Nivel 2 

Conc.(μg/kg) 


97 

97 

112 

112 

128 

128 

101 

101 

148 

148 

100 

100 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 


139 

93 

173 

115 

190 

126 

148 

99 

234 

156 

138 

92 

Recuperarea 

Limita de decizie CCα şi 



DS 0,09 0,19 0,55 0,48 0,24 0,15 

1,64 x DS 0,15 0,31 0,90 0,79 0,39 0,25 

CCα (μg/kg) 1,34 2,48 2,79 4,60 1,80 0,54 

CCβ (μg/kg) 1,49 2,79 3,69 5,39 2,19 0,79 





Analiza cantitativă a celor 12 sulfonamide studiate 

în diferite probe de miere 

În cercetările efectuate am analizat 11 probe de miere 

achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la mai mulţi 

producători din diferite regiuni geografice ale României. 

Prelucrarea probelor 

Extracţia sulfonamidelor din probele de miere se realizează 

astfel: în jur de 1g de probă de miere dizolvată în 9 ml tampon de 

spălare (soluţie de lucru) se menţine la incubat la 37°C timp de 30 

minute şi se agită pe un roller pentru 10 minute până la dizolvare. 

Soluţia probei se diluează cu o cantitate egală de soluţie tampon de 

spălare şi se aplică pe suprafaţa biocipului. 

Din acest mod de lucru rezultă o diluţie a probei de miere de 

1:20, de care se va ţine cont la calcul. 

Etape de lucru se execută manual şi sunt similare celor de la 

tehnica ELISA: 

• reactivii şi proba sunt adăugaţi pe un biocip pregătit pentru 

utilizare 

• incubare biocipuri la 37°C cu agitare. 

• spălare biocipuri pentru a îndepărta de pe suprafaţa lor orice 

component care nu s-a legat. 

• reactivul semnal este adăugat pe fiecare biocip înainte să aibă 

loc citirea imaginii în modulul de captare imagine al analizorului 

Evidence Investigator. 

• lumina emisă de fiecare regiune de test este analizată cu 

ajutorul softului de procesare imagine şi cuantificată rapid în unităţi de 

măsură RLU (Relative Light Unit) folosind o curbă de calibrare; 

rezultatele sunt calculate automat de un software dedicat. Intensitatea 

luminoasă este invers proporţională cu concentraţia analitului. 

Rezultate şi discuţii 

Pentru confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip, 

probele de miere au fost testate şi prin metoda LC-MS/MS. Analizele 

au fost efectuate utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent 

25



Technologies, SUA) cuplat cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP 

(Applied Biosystems, SUA). 

Două din probele analizate au fost pozitive în urma 

determinărilor prin metoda Biocip, având valori mai mari decât 10 

μg/kg pentru mai multe sulfonamide analizate cu ajutorul Panelului I 

Antimicrobian. Majoritatea ţărilor din UE au stabilit limita minimă de 

performanță necesară (LMPN) pentru sulfonamide la valoarea de 10 

μg/kg (Michaud, 2005). 

Performanţele metodei Biocip au fost bune, valorile obţinute au 

fost comparabile cu rezultatele metodei confirmatorii atât pentru 

probele pozitive, cât şi pentru probele negative. Probele pozitive 

confirmate prin metoda LC-MS/MS sunt prezentate în tabel IV.9. 

Tabelul IV.9: Valorile obținute pentru probele pozitive prin metoda 

Biocip şi metoda confirmatorie LC-MS/MS 

Proba1 Proba 2 

Biochip LC-MS/MS Biochip LC-MS/MS 

Sulfonamide Conc. (μg/kg) Conc. (μg/kg) 

1 Sulfadiazina 11.4 7.3 9.2 8.8 

2 Sulfadimetoxina < LOD < LOD < LOD < LOD 

3 Sulfakinoxalina < LOD < LOD < LOD < LOD 

4 Sulfametazina 24.8 32.6 17.1 21.3 

5 Sulfatiazol 22.6 18.4 16.2 11.7 

6 Sulfisoxazol < LOD < LOD < LOD < LOD 

7 Sulfapiridina < LOD < LOD < LOD < LOD 

8 Sulfamerazina < LOD < LOD < LOD < LOD 

9 Sulfametoxipiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD 

10 Sulfaclorpiridazina < LOD < LOD < LOD < LOD 

11 Sulfametizol 51.2 58.9 68.2 72.9 

12 Sulfadoxina < LOD < LOD < LOD < LOD 

Rezultatele probelor pozitive identificate prin metoda Biocip şi 

confirmate prin metoda LC-MS/MS au evidenţiat prezenţa aceloraşi 

sulfonamide la valori peste LMPN şi anume: sulfadiazina, 

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol. 

Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu cele 

existente în literatura de specialitate. 

26



Concluzii 

Tehnologia Biocip aplicată a permis măsurarea simultană şi 

selectivă a 12 sulfonamide în miere la nivele mult mai mici decât LMR 

stabilite. 

Determinarea cantitativă simultană a celor 12 sulfonamide 

prezintă specificitate pentru fiecare analit ţintit, iar senbilitatea metodei 

exprimată ca IC50 este ≤ 2,5 µg/kg. 

Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi 

serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici 

de 15 % pentru concentraţiile de 50, 100 şi 150 µg/kg. 

Criteriile de validare ale metodei: specificitate, acurateţe, 

liniaritate, limite de detecţie şi cuantificare, respectă recomandările 

Deciziei Comisiei Europene 2002/657/CE şi demonstrează că metoda 

poate detecta şi cuantifica reziduuri din sulfonamidele amintite fără 

analiza prin spectrometrie de masă sau derivatizarea fluorescentă a 

analiţilor. 

CAPITOLUL V - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE 

NITROFURANI ŞI CLORAMFENICOL ÎN MIEREA 

DE ALBINE 


În acest capitol ne-am propus validarea metodei de determinare 

a 4 metaboliţi ai nitrofuranului din mierea de albine şi anume 1-aminoimidazolidin-2,4-dionă 

(AHD), 3-amino-5-morfolinometil-2oxazolidinonă 

(AMOZ), 3-amino-2-oxazolidonă (AOZ), semicarbazidă 

(SEM) şi a cloramfenicolului (CAP) utilizând tehnologia Biocip şi 

aplicarea acesteia la analiza probelor de miere. 

Introducere 

Nitrofuranii au fost utilizaţi în practica veterinară ca agenţi 

antibacterieni, pentru tratarea infecţiilor cauzate de bacterii şi 

protozoare. Deşi utilizarea lor a fost interzisă pentru prima dată în UE 

începând cu data de 1 ianuarie 1997 prin anexa IV a Regulamentului 

27



2377/90/CE (Leitner et al., 2001), la ora actuală se mai folosesc pentru 

animalele care nu sunt crescute pentru consum. 

Numeroase publicaţii menţionează că nitrofuranii sunt utilizaţi 

în tratarea albinelor pentru producţia de miere, deşi actualmente, 

conform Regulamentului nr. 37/2010 al Comisiei UE, nitrofuranii sunt 

substanţe interzise pentru toate animalele producătoare de hrană. 

Nitrofuranii utilizaţi în tratamentele albinelor sunt 

nitrofurantoina, furazolidona, furaltadona şi nitrofurazona. Rezultatele 

unei determinări simultane a reziduurilor din patru nitrofurani 

(furazolidon, furaltadon, nitrofurantoin, şi nitrofurazona), au demonstrat 

că furazolidonul este principalul chimioterapic antimicrobian 

administrat în tratarea bolilor bacteriene ale albinelor (Khong et al., 

2004). 

Dezvoltarea unor metode accesibile care să permită detectarea 

lor este de interes pentru programele de monitorizare şi de reglementare 

a reziduurilor în alimente. 

Detectarea reziduurilor de nitrofurani este de obicei realizată cu 

ajutorul lichid cromatografiei în tandem cu spectrometria de masă (LC- 

MS/MS) (Leitner et al., 2001; O’Keeffe et al., 2004). Metoda 

imunochimică a fost propusă ca o alternativă pentru a detecta 

reziduurile de nitrofurani în miere. 

Cloramfenicolul are acţiune bacteriostatică şi este eficient în 

tratamentul bolilor infecţioase. Are un spectru de activitate asemănător 

tetraciclinei, dar utilizarea lui în medicina umană şi veterinară este 

interzisă datorită efectelor adverse pe care le are asupra organismului 

uman (Joshi, 2002). 


Tehnologia Panelurilor Biocip şi aparatura pentru determinarea 

cantitativă simultană a nitrofuranilor şi cloramfenicolului din miere au 

fost prezentate în capitolul IV din partea experimentală a tezei de 

doctorat. 

Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi într-un kit 

compact care include: 

28



Antimicrobial Array III – kit (cod de catalog EV3695, 

Randox Laboratories, UK). 

Antimicrobial Array III Control – kit (cod AMC5036, Randox 

Laboratories, UK). 


Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: 

a) Liniaritatea metodei 

Liniaritatea metodei s-a verificat prin efectuarea unei calibrări în 

9 puncte pentru fiecare din cei 4 nitrofurani şi pentru cloramfenicol 

utilizând calibratorii incluşi în kitul Anti Microbial Array III. 

Softul analizorului utilizează pentru calibrare o ecuaţie specifică 

pentru metoda de detecţie imunoenzimatică competitivă (Findlay, 

Dillard, 2007): 

y = D + [(A-D)/1+(x/C) B ] 

unde: 

x = concentratia analitului (µg/kg), 

y = intensitatea semnalului chemiluminescent exprimată 

în RLU 

A, B, C, D - parametri ai metodei competitive şi sunt predefiniţi 

în softul analizorului: 

A = intensitatea semnalului chemiluminiscent la 

concentraţia 0 a analitului 

B = factorul pantei 

C = punctul de inflexiune al curbei de calibrare 

D = intensitatea semnalului luminos de răspuns la o 

concentraţie teoretică infinită a analitului. 

În urma determinărilor s-au obţinut coeficienţi de corelaţie (r) 

mai mari de 0,98, cel mai mic coeficient s-a obţinut în cazul SEM 

(0,982). 

Rezultatele obţinute dovedesc faptul că a fost îndeplinită 

condiţia de admisibilitate a curbei de calibrare (coeficienţii de corelaţie 

admişi trebuie să fie > 0.949). 

29



b) Sensibilitatea metodei /Concentraţia inhibitorie (IC50) 

Concentraţia inhibitorie (IC50) pentru fiecare analit testat s-a 

calculat luând 50% din valoarea semnalului RLU generat de calibratorul 

de concentraţie zero şi extrapolând valoarea RLU astfel obţinută pe axa 

x a curbei de calibrare pe care sunt exprimate unităţile de concentraţie 

în µg/kg. Concentraţia astfel obţinută corespunde concentraţiei 

inhibitorii ce produce 50% inhibiţie. 

Sensibilitatea metodei exprimată sub formă de IC50 pentru 

determinarea cantitativă simultană a celor 4 nitrofurani şi a 

cloramfenicolului a înregistrat valori care au fost ≤ 2,32 µg/kg şi care 

sunt detaliate în fig. V.8. 

2,5 

2 

1,5 

1 

0,5 

0 

0,4 

0,09 

2,32 

Fig. V.8: Valorile sensibilităţii metodei pentru nitrofuranii analizaţi şi 

cloramfenicol 

c) Precizia şi acurateţea 

Conform legislaţiei actuale şi ghidurilor de validare pentru 

metodele de determinare ale reziduurilor medicamentoase din miere, 

precizia şi acurateţea se evaluează atât pentru concentraţia 

corespunzătoare limitelor LMPN (1 µg/kg), cât şi pentru concentraţii 

reprezentând 50 %, respectiv 150 % din LMPN. 

30 

0,44 

0,74 

AHD AOZ SEM AMOZ CAP 

IC50 (µg/kg)



Precizia s-a determinat în cadrul aceleiaşi serii analitice şi în 

serii analitice diferite. Valorile obţinute pentru determinarea preciziei şi 

acurateţei sunt prezentate în fig. V.9. şi în fig.V.10. 

31

32 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

10,15 

Fig.V.9: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în 

cadrul aceleiaşi serii analitice 

7,87 

0,68 0,64 0,61 

Nivel 1 (0,50 µg/kg) 

n = 20 

8,32 

0,96 

5,86 

0,44 

AOZ AMOZ AHD SEM CAP 

8,92 

Conc. (µg/kg) 

CV (%) 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

8,02 

8,1 

Nivel 2 (1 µg/kg) 

n = 20 

5,72 

1,16 1,14 1,07 1,25 

7,46 7,26 

Fig. V.10: Precizia şi acurateţea pentru concentraţii care reprezintă 50 %, 100% şi 150% din LMPN în 

serii analitice diferite 

0,75 



CV (%) 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

8,33 

11,78 

1,84 1,73 1,81 


n = 20 

8,71 

2,25 

12,93 

1,06 


9,84 


CV (%) 





d) Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ) 

Limita de decizie (CCα) a fost calculată ca fiind media 

aritmetică a concentraţiei analitului la nivel LMPN plus 1.64 x DS a 

repetabilităţii la α = 5% (CCα) Capabilitatea de detecţie (CCβ) a fost 

calculată ca fiind media aritmetică a concetraţiei analitului la nivel CCα 

plus 1.64 x DS a repetabilităţii la α = 5% (CCα). Valorile obţinute sunt 

redate în fig. V.11. 

CAP 

SEM 

AOZ 

1,2 

1 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0 

Fig. V.11: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ) 

e) Regăsirea (recuperarea) 

Procentul de recuperare s-a calculat pentru 3 nivele de 

concentraţie reprezentând 50%, 100 % şi 150 % din limita minimă de 

performanţă necesară pentru reziduurile de nitrofurani şi cloramfenicol 

în mierea de albine (LMPN = 1 µg/kg). Probele de miere au fost 

îmbogăţite cu următoarele concentraţii de nitrofurani şi cloramfenicol: 

0.5, 1, 1.5 µg/kg. Procentele de recuperare au fost calculate efectuând 

raportul dintre concentraţia analitului din proba analizată şi concentraţia 

teoretică a analitului din soluţia standard. 

33 

AHD 

AMOZ 



V.14. 



Procentele de recuperare obţinute sunt prezentate în fig.V.12- 

140 

200 

AOZ 

AMOZ 

AHD 

SEM 

Fig.V.12: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care 

reprezintă 50 % din LMPN 

120 

100 

150 

100 

80 

60 

40 

20 

50 

0 

0 

AOZ 

0,62 

1,06 

Procentul de recuperare - Nivel 1 (0,50 µg/kg) 

n = 20 

124 124 136 

106 

AMOZ 

0,62 

1,11 

111 

AHD 

0,68 

1,19 

119 

SEM 

0,96 

1,25 

Fig. V.13: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care 


34 

192 

CAP 

125 

CAP 

0,32 

0,75 

64 

Procentul de recuperare - Nivel 2 (1 µg/kg) 

n = 20 

75 




Conc. (µg/kg)



150 

100 

50 

0 

123 


n = 20 

115 121 

1,84 1,73 1,81 2,25 


Fig.V.14: Valorile procentului de recuperare pentru concentraţii care 


Analiza cantitativă a celor 4 metaboliţi de 

nitrofuran şi a cloramfenicolului în diferite probe de 

miere 

Metoda validată a fost aplicată la determinarea a 11 probe de 

miere achiziţionate din supermarketuri şi 5 probe achiziţionate de la 

producători din diferite regiuni geografice ale României în perioada mai 

- august 2011. 


Derivatizarea şi extracţia nitrofuranilor şi cloramfenicolului din 

probele de miere s-a realizat astfel: 

▪ mase de probă în jur de 1g de probă de miere dizolvate în 4 ml 

apă distilată se incubează la 37°C timp de 30 minute şi se agită pe un 

agitator pentru 10 minute până la dizolvare. 

▪ peste soluţia probei se adaugă mai întâi 0,5 ml soluţie HCl 1M 

şi apoi 100 µl soluţie 10mM 4-nitrobenzaldehidă. Se omogenizează 

amestecul, se agită pe un agitator pentru 10 minute şi apoi se incubează 

timp de 16 – 24 ore la 37°C. 

35 

150 

1,06 

71 


Conc. (µg/kg)



▪ după incubare, în fiecare probă se adaugă 5 ml soluţie fosfat 

dipotasic (0.1M K2HPO4·3H2O). Se corectează pH-ul soluţiei obţinute 

la valoarea de 7,4 cu soluţie NaOH 1M. 

▪ peste această soluţie se adaugă acetat de etil (15 ml acetat de 

etil la 5ml proba miere derivatizată). După agitare cu ajutorul 

agitatorului Vortex timp de 2 minute, urmează omogenizarea timp de 

10 minute şi centrifugarea probei 10 min la 4500 rcf. 

▪ din supernatant se transferă în microtuburi câte 6 ml din fiecare 

probă. Microtuburile cu probe se evaporă pentru 30 min la 60°C şi 

presiune 15 psi. 

▪ reziduul obţinut după evaporare se reia cu 375 µl diluant 

pentru probe (AM III DIL SPE) şi se agită cu ajutorul agitatorului 

Vortex timp de 2 minute. 


tehnica ELISA: 


Confirmarea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip pentru 

probele de miere analizate s-a realizat prin metoda LC-MS/MS, 

utilizând sistemul Agilent 1100 LC (Agilent Technologies, SUA) cuplat 

cu spectrometru de masă 4000 Q TRAP (Applied Biosystems, SUA). 



reziduuri medicamentoase la valori peste LMPN. În proba 3 s-au 

determinat concentraţii de nitrofurani (SEM şi AOZ) peste valoarea de 

1 μg/kg (LMPN), valorile obţinute prin metoda Biocip fiind 

comparabile cu cele obţinute prin metoda LC-MS/MS (tabel V.4). 

36



Tabelul V.4: Concentraţiile celor 4 nitrofurani şi cloramfenicol 

determinate prin metoda Biocip şi LC-MS/MS 

Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg) 


Proba 1 Biocip 0,50 0,74 0,46 0,75 0,79 

LC-MS/MS 0,17 0,12 0,32 0,19 0,88 

Proba 2 Biocip 0,76 0,75 0,78 0,66 0,84 

LC-MS/MS 0,41 0,42 0,13 0,28 0,33 

Proba 3 Biocip 1,24 2,88 4,16 7,21 3,07 

LC-MS/MS 1,11 1,46 2,34 6,54 2,34 

Proba 4 Biocip 0,68 0,53 0,55 0,54 0,23 

LC-MS/MS 0,08 0,34 0,11 0,38 0,07 

Proba 5 Biocip 0,35 0,65 0,73 0,44 0,76 

LC-MS/MS 0,12 0,18 0,65 0,22 0,61 

Proba 6 Biocip 0,44 0,88 0,67 0,57 0,49 

LC-MS/MS 0,43 0,65 0,60 0,52 0,29 

Proba 7 Biocip 0,41 0,54 0,65 0,72 0,77 

LC-MS/MS 0,09 0,16 0,45 0,43 0,43 

Proba 8 Biocip 0,28 0,78 0,89 0,34 0,44 

LC-MS/MS 0,22 0,98 0,99 0,21 0,94 

Proba 9 Biocip 0,27 0,99 0,54 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,07 0,76 0,76 0,72 0,32 

Proba 10 Biocip 1,07 0,99 1,14 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,72 0,77 0,76 0,72 0,32 

Proba 11 Biocip 0,43 0,43 0,54 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,44 0,76 0,76 0,72 0,32 

Proba 12 Biocip 0,76 0,65 0,42 0,63 0,85 

LC-MS/MS 0,42 0,48 0,53 0,26 0,12 

37



Proba Metoda Concentraţie analit (μg/kg) 


Proba 13 Biocip 0,43 0,74 0,89 0,34 0,44 

LC-MS/MS 0,87 0,81 0,19 0,21 0,14 

Proba 14 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,80 0,16 0,26 0,42 0,02 

Proba 15 Biocip 0,89 0,79 0,54 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,80 0,76 0,46 0,62 0,53 

Proba 16 Biocip 0,89 0,89 0,54 0,88 0,11 

LC-MS/MS 0,48 0,32 0,32 0,21 0,26 



Concluzii 

Tehnologia Biocip a permis măsurarea simultană şi selectivă a 4 

metaboliţi de nitrofurani şi a cloramfenicolului în miere la nivele mult 

mai mici decât LMPN admise. 

Metoda aplicată se caracterizează prin specificitate pentru 

fiecare analit ţintit şi prin sensibilitate exprimată ca IC50, care a 

înregistrat valori ≤ 2,32 µg/kg. 

Metoda prezintă o precizie foarte bună atât în cadrul aceleeaşi 

serii analitice, cât şi în serii analitice diferite, cu valori tipice mai mici 

de 15 % pentru concentraţiile de 0,5, 1 şi 1,5 µg/kg. Limita de decizie 

(CCα) obţinută pentru determinarea metaboliţilor a 4 nitrofurani şi 

cloramfenicolului s-a încadrat între valorile 0,37 µg/kg şi 1,05 µg/kg. 

Capabilitatea de detecţie (CCβ) a înregistrat valori care s-au încadrat în 

intervalul 0,42 - 1,14 µg/kg. Coeficientul de recuperare obţinut s-a 

situat în domeniul 64 – 192 % faţă de concentraţia iniţială. 

38



CAPITOLUL VI - ESTIMAREA CONŢINUTULUI DE 

CHINOLONE ŞI ANTIBIOTICE ÎN MIEREA DE ALBINE 


Studiul din acest capitol a avut drept scop validarea unei 

metode de determinare simultană a chinolonelor (QNL), 

cefalosporinelor (ceftiofur - CEFT), amfenicolilor (tiamfenicol - TAF), 

aminoglicozidelor (streptomicina - STR), macrolidelor (tilozina - TYL), 

tetraciclinelor (TCN) utilizând tehnologia Biocip şi aplicarea acesteia la 

analiza probelor de miere. 

Introducere 

Chinolonele constituie o clasă de agenţi antimicrobieni sintetici 

eficienţi în tratamentul multor boli infecţioase provocate de bacterii atât 

în medicina umană, cît şi în cea veterinară. 

Majoritatea utilizărilor de uz veterinar al acestor chimioterapice 

antimicrobiene este sub formă de fluorochinolone. Deşi la ora actuală 

datele ştiinţifice privind eficacitatea fluorochinolonelor în apicultură 

sunt reduse, utilizarea acestora ca profilaxie a bolilor albinelor, în 

special în Asia, a luat amploare în ultimii ani. Această utilizarea a fost 

confirmată de detectarea reziduurilor de chinolone în mierea din acea 

zona (Savoy Perroud, 2009). 

Utilizarea pe scară largă a chinolonelor în medicina veterinară 

reprezintă un pericol potențial pentru sănătatea umană; acestea fi 

prezente sub formă de reziduuri în produsele alimentare (Wegener, 

1999), care poate determina reacții alergice sau fenomene de rezistenţă 

la antibiotice la om. 

Ceftiofurul face parte din cefalosporinele de generaţia a treia, 

dezvoltate exclusiv pentru uz veterinar. Este bactericid in vitro prin 

inhibarea sintezei peretelui celular al germenilor. 

În ultimii ani, ceftiofurul a fost folosit în apicultură pentru 

tratarea infecţiilor bacteriene deşi nu este recomandat în timpul 

producţiei mierii, totuşi poate fi detectat în miere (Moats, Buckley, 

1998). 

39



Tiamfenicolul şi fluorfenicolul sunt antibiotice cu spectrul larg, 

foarte asemănătoare ca structură şi mod de a acţiona cu cele ale 

cloramfenicolului. 

Streptomicina se utilizează în apicultură împotriva bolii Loca 

americana şi Loca europena în mai multe ţări, în special în America 

Centrală şi de Sud. 

În ciuda faptului că tratamentele cu streptomicină nu sunt 

permise în cele mai multe țări (UE, SUA) datorită toxicităţii crescute, 

utilizarea acesteia este adesea sugerată în diferite forumuri apicole și în 

manualele de apicultură (Mutinelli, 2003). În China, streptomicina și 

cloramfenicolul au fost antibiotice preferate pentru a controla un mare 

focar de boală Loca americana în 1997 (Ortelli et al., 2004). 

Macrolidele sunt chimioterapice antibacteriene larg răspândinte 

în practica medicală şi veterinară. Din grupa macrolidelor mai face 

parte tilozină care este utilizată la nivel global în apicultură şi a cărei 

eficacitate a fost dovedită de către autori diferiţi (Hitchcock et al., 1970; 

Moffett et al., 1970; Peng et al., 1996; Pettis, Feldlaufer, 2005). 

Tetraciclinele sunt chimioterapice antimicrobiene cu spectru larg 

bacteriostatic, cu o lungă istorie în medicina veterinară. Oxitetraciclina, 

de obicei sub formă de clorhidrat, este utilizată în apicultură de la 

începutul anilor cincizeci în tratamentul bolilor bacteriene de puiet, cum 

ar fi Loca americana (Hopingarner, Nelson, 1987; Spivak, 2000) și 

Loca europeana (Oldroyd et al., 1989.; Waite et al, 2003;. Thompson et 

al., 2005). 


Tehnologia Biocip a permis determinarea simultană, cantitativă 

atât a compuşilor părinte din cele 6 clase de chimioterapice 

antimicrobiene cât şi a principalilor metaboliţi ai acestora. 

Toate determinările au fost efectuate pe analizorul Evidence 

Investigator produs de firma Randox, UK. 

Toţi reactivii sunt multianalit şi sunt furnizaţi de producătorul 

aparatului într-un kit compact care include: 

Anti Microbial Array II (EV3524) produs de Randox 

Laboratories, UK 

40



Control: Multianalit Control (cod de catalog AMC5004, 

Randox Laboratories, UK). 


Validarea metodei de determinare cantitativă simultană a celor 

6 tipuri de chimioterapice antimicrobiene luate în studiu utilizând 

tehnologia Biocip reprezintă un protocol care întruneşte concomintent 

cerinţele deciziei 2002/657/CE şi posibilităţile unui laborator oficial cu 

număr mare de probe de testat. 

Parametrii de validare evaluaţi au fost următorii: calibrarea 

(liniaritatea); sensibilitatea (IC50); specificitatea şi selectivitatea; 

precizia (intermediară şi reproductibilitate) şi acurateţea; limita de 

detecţie; regăsirea (recuperarea). Valorile parametrilor de validare sunt 

inserate în tabel VI.1 şi tabel VI.2. 

Limita de decizie obţinută pentru clasele de antibiotice 

determinate s-a încadrat între valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg. 

Capabilitatea de detecţie obţinută pentru aceleaşi chimioterapice s-a 

încadrat între valorile 2,05 µg/kg şi 8,81 µg/kg. 

Valorile obţinute sunt redate în tabel VI.2 şi fig. VI.16. 

41



TYL 

TAF 

CEFT 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

TCN 

Fig. VI.16: Limita de decizie (CCα) şi capabilitatea de detecţie (CCβ) 

42 

QNL 

STR 



43 


Tabelul VI.1: Parametrii de validare ai metodei (liniaritate, sensibilitate, precizie şi acurateţe) 


Liniaritate 

Senibilitate 



ANALIT 

CEFT QNL STR TCN TAF TYL 

Interval de calibrare (μg/kg) 0 - 7 0 - 11,5 0 - 76 0 - 4 0 - 5 0 - 5 


IC 50 (μg/kg) 0,25 0,52 1,30 1,70 0,50 0,55 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Nivel 1 

Nivel 2 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 1,25 0,63 3,91 1,48 0,31 0,31 

CV (%) 6,8 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00 

Conc.(μg/kg) 2,50 1,25 7,81 2,22 0,63 0,63 

CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00 

Conc.(μg/kg) 5,00 2,50 15,63 3,33 1,25 1,25 

CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00 

Conc.(μg/kg) 0,49 0,93 5,03 0,99 0,38 0,33 

CV (%) 6,80 4,30 4,60 6,90 3,40 5,00 

Conc.(μg/kg) 1,05 1,80 8,51 1,43 0,59 0,66 

CV (%) 5,80 6,60 3,40 7,60 4,50 4,00 

Conc.(μg/kg) 1,97 3,29 18,88 2,25 1,17 1,28 

CV (%) 5,00 6,80 4,60 5,70 6,80 4,00 



44 

Tabelul VI.2: Parametrii de validare ai metodei (recuperare, limita de decizie şi capabilitate de detecţie) 


CEFT QNL 

ANALIT 

STR TCN TAF TYL 

Nivel 1 

Conc.(μg/kg) 


0,56 

112 

0,62 

123 

0,57 

113 

0,63 

125 

0,60 

119 

0,60 

119 

Nivel 2 

Conc.(μg/kg) 


0,87 

87 

1,00 

100 

0,91 

91 

0,84 

84 

1,00 

100 

1,05 

105 

Nivel 3 

Conc.(μg/kg) 


1,54 

77 

1,74 

87 

2,00 

100 

1,68 

84 

1,98 

99 

1,86 

93 

Recuperarea 

1Limita de decizie CCα şi 



DS 2,44 1,52 0,28 2,38 0,53 0,65 

1,64 x DS 4,01 2,50 0,47 3,91 0,87 1,07 

CCα (μg/kg) 4,50 3,43 5,50 4,90 1,25 1,40 

CCβ (μg/kg) 8,51 5,93 5,97 8,81 2,05 2,47 


Popa Universitatea Universitatea (Morariu) Ionela de de Medicină Medicină Daniela - şi şi Determinarea Farmacie Farmacie „Grigore „Grigore reziduurilor T. T. Popa” Popa” medicamentoase - - Iaşi, Iaşi, Facultatea Facultatea din de de mierea Farmacie Farmacie de albine 

Popa Popa (Morariu) (Morariu) Ionela Ionela Daniela Daniela - - Determinarea Determinarea reziduurilor reziduurilor medicamentoase medicamentoase din din mierea mierea de de 

albine albine



Analiza cantitativă a chinolonelor şi a diferitelor 

tipuri de antibiotice în probe de miere 

Metoda validată a fost aplicată pe 43 de probe de miere de 

diferite sortimente în vederea determinării reziduurilor de chinolone şi 

antibiotice. 


Eşantioane de miere analizate prin metoda LC-MS/MS şi 

identificate ca fiind fără reziduuri de medicamente au fost utilizate ca şi 

probe blanc sau controale negative în cadrul protocolului de validare. 

Optimizarea procedurii de extracţie 

Datorită faptului că mierea este o matrice complexă ce conţine 

zaharuri, dar şi alte substanţe precum pigmenţi sau compuşi fenolici, 

care trebuie eliminaţi înainte de începerea determinărilor de reziduuri 

medicamentose, am inclus o etapă de extracţie în cadrul protocolului de 

testare, ţinînd cont de proprietăţile diferite ale antibioticelor incluse în 

studiu. 

S-a luat în considerare necesitatea de a dezvolta o metodă 

comună pentru extracţia simultană a mai multor clase de antibiotice. 

Prelucrarea probelor poate fi făcută în două moduri: 

Metoda diluţiei rapide: 

cântărirea a ≈ 1 g de miere; 

adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37 o C); 

omogenizare, diluţie şi filtrare; 

aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip). 

Metoda extracţiei: 

cântărirea a ≈ 1 g de miere; 

adăugarea a 9 ml de soluţie tampon de reacţie (37 o C); 

vortexare şi adăugare de acetat de etil; 

vortexare, omogenizare, centrifugare; 

eluare şi evaporare până la uscare a stratului organic superior; 

resuspensie în soluţie tampon de reacţie şi vortexare; 

45



aplicarea probei pe suprafaţa de microtitrare (biocip). 


tehnica ELISA. 


După testarea celor 43 probe de miere, în 9 probe au fost 

identificate reziduuri de chinolone, ceftiofur, tiamfenicol, streptomicină, 

tilozină şi tetracicline. Atât probele pozitive cât şi cele negative au fost 

confirmate prin metoda LC-MS/MS. După cum se observă din datele 

prezentate în tabel VI.9, valorile de concentraţie obţinute cu ajutorul 

metodei Biocip sunt comparabile cu cele obţinute prin metoda LC- 

MS/MS. Doar pentru o singură probă au fost identificate reziduuri de 

tilozină cu ajutorul Panelului Antimicrobian II, ceee ce nu s-a confirmat 

prin metoda LC-MS/MS. Astfel, putem afirma că pentru tilozină, în 

probe de miere, metoda Biocip a permis detectarea cu precizie a unei 

valori mici de concentraţie, însă această concentraţie de 1.9 μg/kg nu a 

fost detectată de metoda LC-MS/MS. Acest rezultat ar putea de 

asemenea să indice faptul că sensibilitatea metodei Biocip este mult mai 

înaltă decât cea a metodei LC-MS/MS. 

Rezultatele comparative pentru cele 9 probe de miere pozitive 

pentru reziduurile de antibiotice analizate sunt prezentate în tabelul 

VI.9. 



antibiotice la valori peste LMPN şi anume: ciprofloxacină, 

norfloxacină, streptomicină, tilozină şi clortetraciclină. 

Cele 9 probe pozitive de miere provin de la apicultori particulari 

din diferite regiuni geografice din România. 

46



Tabelul VI.9. Concentraţiile celor 6 clase de antibiotice în probele de 

miere determinate prin metoda Biocip şi confirmate prin metoda LC-MS/MS 

Proba Metoda QNL CEFT TAF STR TYL TCN 

(µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) (µg/kg) 

Proba Biocip < LOD < LOD < LOD < LOD 3.4 < LOD 

1 LC- 

MS/MS 

< LOD < LOD < LOD < LOD 6 < LOD 

Proba Biocip 10.4 < LOD < LOD 29 < LOD < LOD 

2 LC- Ciprofloxacină < LOD < LOD 22 < LOD < LOD 

MS/MS 5µg/kg, 

Norfloxacină 

7µg/kg 

Proba Biocip 54.9 < LOD < LOD 34.9 < LOD < LOD 



Norfloxacină 

10µg/kg 

Proba Biocip 12.7 < LOD < LOD < LOD < LOD 10.7 

4 LC- Ciprofloxacină < LOD < LOD < LOD < LOD Clor- 


tetraciclină 

Norfloxacină 

2µg/kg 

8µg/kg 



MS/MS 7 µg/kg, 

Norfloxacină 

3µg/kg 

Proba Biocip < LOD < LOD < LOD 17.8 < LOD < LOD 

6 LC- 

MS/MS 

< LOD < LOD < LOD 18 < LOD < LOD 

Proba Biocip 9.4 < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD 

7 LC- Ciprofloxacină < LOD < LOD < LOD < LOD < LOD 


Norfloxacină 

4µg/kg 




Norfloxacină 

15µg/kg 

Proba 

9 

Biocip 

LC- 

MS/MS 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

1.9 

< LOD 

< LOD 

< LOD 

47





Vidal et al. (2009) au dezvoltat recent o metodă pentru 

detectarea simultană a 16 antibiotice (macrolide, tetracicline, chinolone 

şi sulfonamide). Majoritatea probelor de miere au fost achiziţionate din 

supermarketuri, iar cinci dintre ele au fost colectate de la diferiţi 

apicultori particulari din Granada şi Almería. Rezultatele studiului au 

relevant un conţinut de 8,6 μg/kg în una din probele comercializate, în 

timp ce o probă provenită de la un apicultor particular a prezentat urme 

de sarafloxacină şi reziduuri de tilozină, sulfadimidină şi 

sulfaclorpiridazină (Vidal et al., 2009). 

Concluzii 

Sub aspectul performanţei analitice, metoda Biocip prezintă o 

precizie excelentă atât în cadrul aceleeaşi serii analitice, cât şi în serii 

analitice diferite, cu valori tipice mai mici de 15 % pentru concentraţiile 

de 0,5, 1 şi 1,50 µg/kg. Limita de decizie (CCα) obţinută pentru cele 6 

clase de chimioterapice antimicrobiene determinate s-a încadrat între 

valorile 1,25 µg/kg şi 5,5 µg/kg. Capabilitatea de detecţie (CCβ) a 

înregistrat valori situate în intervalul 2,05 - 8,81 µg/kg. Coeficientul de 

recuperare obţinut s-a situat în domeniul 77– 125 % faţă de concentraţia 

iniţială. Performanţele metodei Biocip au fost corespunzătoare, 

rezultatele obţinute au fost comparabile cu valorile de concentraţie 

determinate prin metoda confirmatorie, atât pentru probele pozitive cât 

şi pentru probele negative. 

Panelul Antimicrobian II reprezintă un sistem foarte eficient 

pentru detectarea şi cuantificarea simultană multianalit pentru 6 clase 

diferite de chimioterapice antimicrobiene în probe de miere. 

Compararea rezultatelor obţinute prin metoda Biocip şi LC-MS/MS a 

evidenţiat că metoda biosenzor propusă, prezintă adecvare la scopul 

propus, şi anume determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în 

cadrul programelor europene de supraveghere a siguranţei alimentelor. 

48



CAPITOLUL VII - STUDIU EXPERIMENTAL AL 

INFLUENŢEI REZIDUURILOR MEDICAMENTOASE 

(SULFONAMIDE) DIN MIERE ASUPRA UNOR 

PARAMETRI BIOCHIMICI, IMUNOLOGICI ŞI 

HEMATOLOGICI LA ANIMALE DE LABORATOR 

Scopul cercetării 

Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit 

studierea influenţei unor reziduuri medicamentoase (sulfonamide) din 

mierea de albine asupra şobolanilor, rasa Wistar prin: 

• evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale parametrilor 

implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin analizarea 

variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL-4, IL-6, 

IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular (VEGF), 

interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa (TNFα), IL- 

1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF), înainte şi 

după administrarea de miere de albine conţinând un amestec de 

sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina, 

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina) 

• evaluarea unor parametri biochimici (uree, creatinină, acid 

uric, bilirubină totală, bilirubină directă, aspartat aminotransferaza - 

AST, alanin aminotransferaza - ALT, triiodotironina - T3, tiroxina - T4) 

şi hematologici (hematocrit - Hct, hemoglobina - Hb, numărătoare 

globule roşii - RBC, concentraţia medie a hemoglobinei dintr-un volum 

dat de eritrocite - MCHC, volum eritrocitar mediu - MCV) după 

administrare de miere conţinând sulfonamide. 

Introducere 

Chimioterapicele antimicrobiene sunt eficiente împotriva bolilor 

albinelor, însă reziduurile medicamentoase pot să persiste o perioadă 

mai mare de timp în ţesuturi (uneori chiar şi o lună), iar consumul de 

miere care conţine astfel de reziduuri reprezintă un potenţial risc pentru 

sănătatea omului. Literatura include date privind toxicitatea acestor 

compuşi. 

49



Intensitatea acţiunii, durata de acţiune şi toxicitatea 

sulfonamidelor derivă din capacitatea organismului de a le transforma 

în sulfonilamidă, activitatea antibacteriană datorându-se structurii 

sulfanilamidice. Prezenţa grupei metoxi pe radicalii heterociclici 

determină o întârziere a eliminării din organism şi o acţiune prelungită 

(Castrejon, 2010). 

Se consideră că sulfonamidele au o toxicitate medie care include 

tulburări gastrointestinale (greaţă, vomă, diaree), reacţii de 

hipersensibilitate (alergice) care constau în erupţii cutanate, eozinofilie, 

rareori şoc anafilactic; la persoanele cu deficit genetic de glucozo-6fosfat 

dehidrogenază a enterocitelor poate apărea anemia hemolitică. 

Sulfamidele au acţiune competitivă cu bilirubina pentru situsurile de 

legare ale acesteia şi de aceea nu trebuie administrate în ultimul 

trimestru de sarcină şi la nou-născut. Bilirubina nelegată se poate 

depozita în ganglionii bazali ai creierului şi în subtalamus, determinând 

encefalopatie toxică (icter nuclear – Kernicterus) (Naisbitt et al., 2001; 

Verdel et al., 2006 ). 

În urma biotestelor efectuate la rozătoare s-a raportat că 

sulfametazinul produce tumori cu diferite localizări; de asemenea au 

fost prezentate dovezi privind toxicitatea sulfonamidelor asupra glandei 

tiroide (Finkelman, 2007). Unele sulfonamide inhibă prin mecanism 

competitiv lactoperoxidaza şi tiroid peroxidaza, mediatori în sinteza 

hormonilor tiroidieni, putând conduce la hipertiroidism. 

În plus sulfonamidele pot da uneori febra medicamentoasă, 

boala serului şi lupus eritematos sistemic (hipersensibilitate de tip III 

mediată de imunoglobulinele G), toxicitate hepatică (inclusiv necroza). 

Sulfonamidele pot da reacţii alergice severe, incluzând toxicitate 

hepatică şi hematologică, pe lângă toxicitatea dermatologică. Şi reacţiile 

de fotosensibilizare sunt relativ frecvente la sulfonamide. Aproximativ 

3% din populaţie este afectată de reacţii alergice la sulfonamide. 

Citotoxicitatea compuşilor hidroxilaminici asupra limfocitelor umane a 

fost demonstrată prin studii in vitro (Contreras, 2003). Aceşti compuşi 

produc ocazional un număr de reacţii alergice (hipersensibilitate), de la 

rash-uri tegumentare minore (inclusiv reacţii maculopapulare şi reacţii 

50



de tip pruriginos care apar tipic după o săptămână de tratament), până la 

reacţii severe sau care pun uneori în pericol viaţa pacienţilor cum ar fi: 

eritemul multiform, sindromul Stens-Johnson şi necroliza epidermică 

toxică. Reacţiile de hipersensibilitate la niveluri terapeutice de 

sulfonamide, au fost intens studiate în schimb nu s-au raportat cazuri 

de alergie la sulfonamide datorită ingestiei de alimente contaminate cu 

reziduuri medicamentoase, însă manifestările specifice ar fi greu de 

recunoscut la doze atât de mici. Deoarece în publicaţiile din literatura 

de specialitate sunt disponibile doar date limitate am decis efectuarea 

unei evaluări mai complete pentru acest aspect. 

Biomarkerii care evidenţiază reacţile de hipersensibilitate sunt 

citokinele, imunoglobulinele E, limfocitele şi histamina. 

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrare 

de miere conţinând sulfonamide 

Protocol experimental 

Studiul s-a desfăşurat pe 2 loturi de şobolani care au consumat 

miere conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5 

sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina, 

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina); 

concentraţiile citokinelor obţinute au fost comparate cu valorile obţinute 

pentru lotul martor. Fiecare lot a inclus 15 şobolani, pentru ca 

semnificaţia statistică să fie acceptabilă, iar lotul martor a fost format 

din 10 şobolani. 

Pentru acest studiu s-au selecţionat femele de şobolani rasa 

Wistar cu greutate de 180 - 220 g. Şobolanii au fost împărţiti în 3 loturi: 

l - lot de control – administrare prin gavaj gastric de hrană standard şi 2 

ml miere de albine, lotul 2 - şobolani cărora li s-au administrat prin 

gavaj gastric timp de 5 zile, miere cu amestec de sulfonamide şi lotul 3 

- şobolani cărora li s-au administrat prin gavaj gastric 2 ml de miere 

îmbogăţită cu 100 µg/kg amestec de sulfonamide, timp de 14 zile 

consecutiv. 

51



Studiul a fost realizat în conformitate cu aprobarea emisă de 

către Comitetul de Etică a Cercetării al Universităţii de Medicină şi 

Farmacie "Grigore T. Popa "- Iaşi. 


Determinările cantitative ale citokinelor, s-au efectuat pe 

analizorul Evidence Investigator (Randox Laboratories, UK), 

determinările cantitative ale imunoglobulinei E (IgE) s-au efectuat pe 

aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), iar 

eozinofilele s-au determinat pe analizorul automat de hematologie, 

model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, Germania). 

Reactivi: 

Rectivi pentru determinarea simultană a 12 citokine: IL-2, 

IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, VEGF, IFNγ, TNFα, IL-1α, IL-1β, MCP-1, 

EGF sunt furnizaţi într-un kit compact care cuprinde: 

Kit High Sensitivity Cytokine Array I (cod EV3623, 

producător Randox Laboratories, UK) 

Control : Multianalit Control (Randox Laboratories, UK) 

utilizat pentru verificarea preciziei şi acurateţii metodei 

Reactivi pentru determinările de IgE: kit ELISA (Clin Pro 

Internaţional, SUA), cod EH-518 

Reactivi pentru determinarea hemoleucogramei sunt 

reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de hematologie Sysmex XT 

1800i. 

Prelucrarea şi interpretarea statistică 

Datele obţinute au fost prelucrate statistic în vederea eliminării 

variaţiilor biologice şi a erorilor de determinare şi totodată pentru 

validarea rezultatelor studiului. S-a efectuat în acest scop descrierea 

statistică a eşantioanelor de probe pentru obţinerea descriptorilor de 

interes (medie, mediană, eroare standard a mediei - ES, deviaţie 

standard, varianţă, amplitudine, coeficient Skewness, coeficient 

Kurtosis). 

Prelucrarea şi reprezentarea grafică a datelor s-a realizat 

utilizând module de lucru ale softurilor MedCalc şi Microsoft Office 

2007. 

52



Testele statistice aplicate: pentru probele cu valori normal 

distribuite au fost t-Student pentru probe independente cu varianţe egale 

şi t-Student pentru probe independente cu varianţe inegale, iar pentru 

cele a căror distribuţie nu a putut fi normalizată - testul Mann-Whitney. 

Pentru a verifica normalitatea distribuţiei datelor s-au utilizat 

testele D’Agostino-Pearson şi Kolmogorov-Smirnov. 

Rezultate 

A. Analiza comparativă a rezultatelor parametrilor 

analizaţi 

Rezultatele obţinute pentru determinarea citokinelor, IgE şi 

eozinofilelor în urma administrării de miere conţinând reziduuri de 

sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII..4. 

Media valorilor obţinute pentru citokine, IgE şi eozinofile în 

cadrul loturilor analizate este prezentată în fig.VII.9 - VII.10. 

53

54 

IL-4 14 

(pg/mL) 

12 

IL-10 

(pg/mL) 

18 

16 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

5,39 

2,85 

B 

14,19 

9,28 

Fig.VII.9: Variaţia valorilor interleukinelor Th-1 derivate (A), Th-2 derivate (B) şi APC derivate (C) 

Fig. VII.10: Variaţia valorilor factorilor de creştere (A), a valorilor IgE (B) şi eozinofilelor (C) 

16,14 

Lot 1 Lot 2 Lot 3 

8,37 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Deviatia standard a mediei 





Tabelul VII.4: Tabelul sinoptic al rezultatelor determinărilor de 

citokine, IgE şi eozinofile 

Parametru 

Media ± DS 

determinat 

Interleukine T h-1 

derivate (pg/ml) 

Interleukine Th-2 derivate (pg/ml) 

Interleukine APC 

derivate (pg/ml) 

Factori de creştere 

(pg/ml) 

Lot 1 (n = 10) Lot 2 (n = 15) Lot 3 (n = 15) 

IL-2 4,96 ± 0,73± 6,57± 0,72 6,75± 0,73 

IFN-γ 4,07± 0,45 6,80 ± 0,85 6,71 ± 0,78 

IL-4 5,39 ± 0,73 14,19 ± 2,35 16,14 ± 2,87 

IL-10 2,85 ± 0,28 9,28 ± 2,92 8,37 ± 2,13 

IL-1α 3,22 ± 0,47 3,17 ± 0,35 2,57 ± 0,21 

IL-1β 4,68 ± 1,24 3,84 ± 1,29 5.99 ± 2.07 

IL-6 5,23 ± 0,50 9,85 ± 2,50 8,16 ± 1,39 

IL-8 4,58 ± 0,67 9,34 ± 2,07 8,56 ± 2,07 

TNF-α 3,04 ± 0,24 4,66 ± 0,48 4,93 ± 0,54 

VEGF 2,91 ± 0,36 8,53 ± 1,91 8,59 ± 1,91 

MCP1 137,1 ± 1,26 150,51 ± 4,03 148,31 ± 3,62 

EGF 4,76 ± 0,63 6,72 ± 0,81 6,85 ± 1,00 

IgE (UI/ml) 2,05 ± 0,34 14,43 ± 2,52 16,03 ± 3,08 

Eozinofile (%) 2,42 ± 0,42 7,18 ± 0,90 8,33 ± 0,96 

B. Analiza corelaţiei rezultatelor citokinelor implicate în 

reacţia alergică cu rezultatele IgE şi a eozinofilelor. 

Valorile fiecărui lot examinat au fost considerate ca fiind diferite 

semnificativ statistic faţă de celelalte pentru un anumit parametru atunci 

când probabilitatea de eroare a fost mai mică de 0,05 (p < 0,05). 

Pentru compararea variabilelor cantitative s-a folosit indicele de 

corelaţie Pearson (r). Procentul în care valorile variabilelor analizate 

sunt realmente corelate este indicat de coeficientul de corelare Pearson 

(R 2 ). 

Analiza parametrilor luaţi în studiu pentru fiecare lot şi corelaţia 

între valorile lor cu ajutorul indicelui de corelaţie Pearson este ilustrată 

în tabel VII.19- VII.20. 

55

56 

Lot 

1 

Lot 

2 

Interleukine Th-1 

derivate 

IL-2 

(pg/ml) 

IFN-γ 

(pg/ml) 

Tabelul VII.19: Analiza corelaţiei citokinelor cu IgE 


derivate 

IL-4 

(pg/ml) 

IL -10 

(pg/ml) 

IL-1α 

(pg/ml) 

Interleukine APC derivate Factori de creştere 

IL-1β 

(pg/ml) 

IL-6 

(pg/ml) 

IL-8 

(pg/ml) 

TNF-α 

(pg/ml) 

VEGF 

(pg/ml) 

MCP1 

(pg/ml) 

EGF 

(pg/ml) 

r 0,2434 -0,1098 -0,3065 -0,0486 0,0492 0,1340 -0,1928 -0,3676 0,2860 -0,3950 -0,2191 -0,2606 

P 

0,4981 0,7627 0,3891 0,8939 0,8926 0,7121 0,5935 0,2960 0,4231 0,2586 0,5431 0,4670 

R 2 0,0592 0,0121 0,0939 0,0024 0,0024 0,0180 0,0372 0,1351 0,0818 0,1560 0,0480 0,0679 

r 0,0586 -0,3220 0,8579 0,5250 -0,0299 0,1240 -0,00357 0,1639 0,5319 0,1500 -0,1570 -0,1875 

P 0,8357 0,2418 < 0,0001 *** 0,0445 * 0,9158 0,6597 0,9899 0,5594 0,0413 * 0,5936 0,5763 0,5034 

R 2 

0.0034 0,1037 0,7360 0,2756 0,0009 0,0154 

0,1274 x 

0,0269 0,2829 0,0225 0,0246 0,0352 

Lot r 0,5887 0,6019 0,7537 0,3130 0,5582 0,4170 0,3137 0,2180 0,3160 -0,1235 0,3933 0,1560 

3 P 0,0210 * 0,0176 0,0012 ** 0,2560 0,0306 * 0,1220 0,2548 0,4350 0,2512 0,6610 0,1469 0,5788 

R 2 0,3466 0,3622 0,5681 0,0980 0,3115 0,1739 0,0984 0,0475 0,0999 0,0153 0,1547 0,0243 

p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***) 

10 -6 



57 


derivate 

IL-2 

(pg/ml) 

IFN-γ 

(pg/ml) 

Tabelul VII.20: Analiza corelaţiei citokinelor cu eozinofilele 


derivate 

IL-4 

(pg/ml) 

IL -10 

(pg/ml) 

IL-1α 

(pg/ml) 

57 

Interleukine APC derivate Factori de creştere 

IL-1β 

(pg/ml) 

IL-6 

(pg/ml) 

IL-8 

(pg/ml) 

TNF-α 

(pg/ml) 

VEGF 

(pg/ml) 

MCP1 

(pg/ml) 

Lot 1 r 0,3426 -0,1593 -0,4433 -0,4420 0,2597 0,0545 -0,4268 -0,2998 -0,0303 0,0909 -0,3271 -0,5131 

P 0,3325 0,6601 0,1994 0,2009 0,4687 0,8811 0,2187 0,4001 0,9338 0,8028 0,3563 0,1293 

R 2 0,1174 0,0254 0,1966 0,1954 0,0674 0,0030 0,1821 0,0898 0,0009 0,0083 0,1070 0,2633 

EGF 

(pg/ml) 

Lot 2 r -0,0184 0,0025 0,6865 0,4610 -0,1119 0,2600 0,0179 0,1183 0,2401 0,2640 -0,0340 -0,1516 

P 0,9482 0,9928 0,0047 ** 0,0837 0,6913 0,3493 0,9495 0,6747 0,3888 0,3417 0,9043 0,5897 

R 2 

0,0003 

0,0645 x 10 - 

4 0,4713 0,2125 0,0125 0,0676 

0,3204 x 

0,0140 0,0576 0,0697 0,0012 0,0230 

Lot 3 r 0,5280 0,3553 0,5857 0,2930 0,6600 0,4630 0,1905 0,2630 0,4650 -0,0895 0,3627 0,0948 

P 0,0431 * 0,1937 0,0218 * 0,2892 0,0074 ** 0,0822 0,4964 0,3436 0,0807 0,7512 0,1840 0,7368 

R 2 0,2788 0,1263 0,3431 0,0858 0,4356 0,2144 0,0363 0,0692 0,2162 0,0080 0,1315 0,0090 

p < 0.05 semnificativ(*), p ≤ 0,01 distinct semnificativ (**), p ≤ 0,001 foarte semnificativ (***) 

10 -3 





Discuţii 

Reacţiile de hipersensibilitate/întârziată tip IV, mediate de 

citokine eliberate de celulele T sensibilizate, activează cascada reacţiilor 

sistemului imunitar implicată în producerea leziunilor tisulare 

(Castrejon et al., 2010). 

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC 

derivate la loturile de şobolanii studiate putem concluziona că citokine 

au prezentat valori serice semnificativ crescute ale IL-1α, IL-1β, IL-6, 

IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3 comparativ cu lotul martor, 

concentraţiile medii fiind corelate cu perioada de timp pe care s-a 

desfaşurat administrarea de miere cu sulfonamide. 

Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele imunologice şi 

datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor privitoare la reacţiile 

de hipersensibilitate la sulfonamide. Astfel, interleukinele IL-1α, IL-1β, 

IL-6, IL-8, TNF-α sunt produse de către celulele dendritice mature 

numite, grupate sub denumirea de interleukine APC (antigen-presenting 

cell) derivate, ele având un rol crucial în iniţierea răspunsului imun de 

către limfocitele T. (Sallusto, Lanzavecchia, 1994). 

Concluzii 

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice la loturile de 

şobolanii studiate putem concluziona că citokinele analizate prezintă 

profil dublu pro-inflamator şi anti-inflamator şi diferă de cele ale 

şobolanilor din lotul martor. Douăsprezece componente diferite, atât 

pro- cât şi anti-inflamatorii, au fost analizate: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL- 

10, VEGF, IFNγ, TNF, IL-1α, IL-1β, MCP-1 şi FEG. 

Evaluarea modificărilor profilului de citokine după 

administrarea de miere conţinând sulfonamide a condus la rezultate care 

evidenţiază faptul că la şobolanii care au consumat miere conţinând 

sulfonamide nivelurile de citokine IL-4 şi IL-10, împreună cu IgE şi 

eozinofilele plasmatice au crescut de 5-30 ori. Prin contrast, nu s-au 

observat concentraţii semnificativ crescute ale citokinelor proinflamatorii, 

cum ar fi TNF, IL-1α sau IL-1β. Concentraţiile citokinelor 

studiate, care sunt indici de hipersensibilitate, sunt crescute în sânge şi 

se corelează cu prezenţa de eozinofilie la şobolani, după ingestia de 

58



miere conţinând sulfonamide. Celelalte tipuri de citokine au fost uşor 

crescute, cu nivele de concentraţie care, în studiul de faţă nu par a fi 

corelate cu biomarkerii indicatori de hipersensibilitate. 

Valorile obţinute pentru citokinele IL-4 şi IL-10, împreună cu 

IgE şi eozinofilele indică un răspuns maxim după o expunere timp de 

14 zile, diferenţele fiind semnificative statistic comparativ cu lotul 

martor. 

Determinarea citokinelor plasmatice este un instrument util în 

studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani. 

Evaluarea parametrilor biochimici şi hematologici la şobolani 

după administrare de miere conţinând reziduuri de 

sulfonamide 

Protocol experimental 

Studiul s-a desfăşurat pe 1 lot de şobolani care a consumat miere 

conţinând amestec de sulfonamide (100 µg/kg amestec de 5 

sulfonamide - 20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina, 

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametizol, sulfadimetoxina), iar 

concentraţiile obţinute pentru parametri biochimici, hematologici şi 

imunologici au fost comparate cu valorile obţinute pentru lotul martor. 

Fiecare lot a inclus 5 şobolani, număr minim necesar pentru ca 

semnificaţia statistică a studiului să fie acceptabilă. 


Determinările cantitative ale parametrilor biochimici (uree, 

creatinină, acid uric, bilirubină totală, bilirubină directă, AST, ALT) 

vizaţi de experimentul realizat s-au efectuat pe analizorul automat Rx 

Imola (Randox Laboratories, UK), parametrii imunologici (T3, T4) s-au 

efectuat pe aparatul Stat Fax 303 Plus (Awareness Technology, SUA), 

iar parametri hematologici s-au efectuat pe analizorul automat de 

hematologie, model Sysmex XT 1800i (Sysmex Europe Gmbh, 

Germania). 

59



Reactivi: 

Rectivi pentru determinări biochimice sunt produşi de 

firma Randox Laboratories, UK şi sunt reactivi dedicaţi pentru 

analizorul automat Rx Imola: 

Kit pentru determinarea cantitativă a ureei în ser, plasmă şi 

urină prin metoda cinetică enzimatică, cod UR3825 

Kit pentru determinarea cantitativă a creatininei în ser, plasmă 

şi urină prin metoda colorimetrică, cod CR3814 

Kit pentru determinarea cantitativă a acidului uric în ser, 

plasmă şi urină prin metoda enzimatică colorimetrică, cod UA3824 

Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei totale în ser 

sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3859 

Kit pentru determinarea cantitativă a bilirubinei directe în ser 

sau plasmă prin metoda colorimetrică, cod BR3807 

Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii 

aspartataminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC) 

Kit pentru determinarea cantitativă a activităţii 

alaninaminotransferazei în ser sau plasmă prin metoda UV (IFCC) 

Reactivi pentru determinările imunologice: 

Kit pentru determinarea T3 (triiodotironina), cod EH-500, 

producător Clin Pro Internaţional, SUA. 

Kit pentru determinarea T4 (tetraiodotironina sau tiroxina), 

cod EH-501, producător Clin Pro Internaţional, SUA. 

Reactivi pentru determinarea eozinofilelor 

(hemoleucograma) sunt reactivi dedicaţi pentru analizorul automat de 

hematologie Sysmex XT 1800i. 

Rezultate 

Rezultatele obţinute pentru parametri biochimici, imunologici şi 

hematologici în urma administrării de miere conţinând reziduuri de 

sulfonamide la şobolani Wistar sunt redate în tabel VII.26 

60



Tabelul VII.26: Tabelul sinoptic pentru valorile obţinute pentru 

parametri biochimici ºi hematologici după administrare de miere cu reziduuri 

de sulfonamide la şobolani 

Parametru 

determinat 

61 

Media ± DS 

Lot 1 (n = 5) Lot 2 (n = 5) 

Creatinină (mg/dl) 0,45 ± 0,05 0,72 ± 0,03 

Uree (mg/dl) 17,04 ± 3,80 18,36 ± 0,87 

Acid uric (mg/dl) 1,71 ± 0,29 2,40 ± 0,42 

Bilirubina totală (mg/dl) 0,62 ± 0,04 1,27 ± 0,09 

Bilirubina directă (mg/dl) 0,08 ± 0,017 0,32 ± 0,070 

AST (U/l) 60,71 ± 8,66 109,57 ± 7,36 

ALT (U/l) 72,75 ± 4,14 128.23 ± 5,99 

T4 (µg/dl) 4,50 ± 0,30 3,32 ± 0,21 

T3 (ng/dl) 0,70 ± 0,14 0,34 ± 0,03 

Hct (%) 47,80 ± 3,69 52,70 ± 6,64 

VEM (MCV) (fL) 81,60 ± 6,13 98,50 ± 5,49 

RBC (milioane/mm 3 ) 9,72 ± 1,14 5,14 ± 0,38 

Hb (g/dl) 16,10 ± 0,92 14,50 ± 1,16 

CHEM (MCHC) (g/dl) 38,.60 ± 2,79 34,50 ± 2,20 

Concluzii 

Rezultatele obţinute evidenţiază variaţii moderate în cadrul 

loturilor luate în studiu. Concentraţiile serice ale alanin 

aminotransferazei şi ale aspartat aminotransferazei au crescut în urma 

administrării de miere cu sulfonamide, comparativ cu valorile 

determinate la lotul martor. 

Aceste rezultate sunt în concordanţă cu date din literatura de 

specialitate, conform cărora acţiunea toxică a sulfonamidelor, chiar 

administrate în cantităţi foarte mici, se manifestă prin perturbarea 

parametrilor hepatici la animalele de laborator (Hess et al., 1999). 

Astfel, activitatea ALT şi activitatea AST au înregistrat creşteri 

semnificative statistic (p < 0,0001) la şobolanii care au primit miere cu 

sulfonamide, comparativ cu lotul de control, evidenţiind astfel 

modificarea permeabilităţii membranei hepatocitului.



Valorile concentraţiei bilirubinei directe variază asemănător cu 

cele ale bilirubinei totale, astfel, pentru lotul care a consumat miere cu 

sulfonamide, valorile bilirubinei directe au fost de 0,32 mg/dl ± 0,07 

faţă de 0,08 mg/dl ± 0,017 înregistrate pentru lotul martor. 

Cercetările noastre au înregistrat o creştere nesemnificativă 

statistic a uremiei, la 18,36 ± 0,87 mg/dl pentru lotul tratat cu 

sulfonamide, comparativ cu lotul de referinţă pentru care concentraţia 

medie a ureei a fost 17,04 ± 3,80. 

Efectul administrării de miere cu sulfonamide la şobolani asupra 

funcţiei renale s-a concretizat în creşterea semnificativă a valorilor 

concentraţiilor acidului uric şi creatininei în cadrul lotului test 

comparativ cu lotul martor. 

În literatura de specialitate nu există date suficiente cu privire la 

modificarea parametrilor biochimici determinaţi în prezentul studiu ca 

urmare a toxicităţii datorate administrării de miere cu sulfonamide. 

Rezultatele obţinute pentru valorile triiodotironinei (T3) 

sugerează confirmarea ipotezei conform căreia sulfonamidele interferă 

în sinteza hormonilor tiroidieni. 

Valorile plasmatice ale tiroxinei (T4) au scăzut foarte 

semnificativ la animalele care au consumat miere cu sulfonamide, 

comparativ cu lotul martor. Rezultatele sunt concordante cu cele 

obţinute de Cribb et al.(1996). 

CAPITOLUL VIII - CONCLUZII GENERALE. 

CONTRIBUŢII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE 

CERCETARE 

Concluzii generale 

În urma rezultatelor obţinute la validarea metodei Biocip pentru 

cele 3 Paneluri Antimicrobiene, dar şi la determinările cantitative 

efectuate pe diferite probe de miere, putem concluziona următoarele: 

62



metoda biosenzor propusă este adecvată scopului şi anume 

pentru determinarea concentraţiei fiecărui analit în parte, în cadrul 

programelor de supraveghere a siguranţei alimentelor. 

metoda Biocip utilizată prezintă avantajul că nu necesită 

extracţia analitului din matricea biologică cu solvenţí organici. 

tehnica multiplexarii permite detecţia simultană, dintr-o 

singură probă, minimalizând astfel variaţiile biologice, variaţiile 

analitice şi de stabilitate. Detectarea se realizează prin 

chemiluminiscenţă indusă enzimatic, iar fiecare biocip conţine opţiunea 

de controale incluse. 

această tehnică de multiplexare are de asemenea largi 

implicaţii atât asupra cantităţii de probă cât şi asupra vitezei de testare, 

permiţând posibilitatea obţinerii unui număr mare de rezultate (540 

determinări) într-un timp scurt. 

determinarea reziduurilor medicamentoase prin metoda 

Biocip nu necesită operaţii adiţionale (derivatizare), echipamente şi 

accesorii suplimentare, prin urmare este mai puţin laborioasă, şi implică 

costuri mai mici comparativ cu metodele cromatografice. 

volumul de reactiv utilizat pentru un test este mai mic decât la 

oricare alt sistem. Un volum total de reacţie de 350 µl este necesar 

pentru toate testele dintr-un panel antimicrobian. 

Acest avantaj al metodei Biocip presupune un spaţiu de stocare 

redus şi producerea unor cantităţi mai mici de deşeuri biologice 

periculoase. 

toţi reactivii utilizaţi pentru sistemul Evidence Investigator au 

coduri de bare făcând sistemul foarte uşor de folosit şi facilitând 

eficientizarea timpului de lucru şi a costurilor. 

Obiectivele cercetărilor din această teză au inclus şi studiul 

influenţei reziduurilor sulfonamidelor din mierea de albine asupra 

şobolanilor Wistar prin evaluarea modificărilor valorilor plasmatice ale 

parametrilor implicaţi în reacţiile de hipersensibilitate de tip alergic prin 

analizarea variaţiei valorilor serice ale citokinelor: interleukina IL-2, IL- 

4, IL-6, IL-8, IL-10, factorul de creştere al endoteliului vascular 

63



(VEGF), interferon gamma (IFNγ), factor de necroză tumorală alfa 

(TNFα), IL-1α, IL-1β, MCP-1, factorul de creştere epidermică (EGF), 

înainte şi după administrarea de miere de albine conţinând un amestec 

de sulfonamide (20 µg din fiecare sulfonamidă: sulfadiazina, 

sulfametazina, sulfatiazol şi sulfametoxazol, sulfadimetoxina). 

În urma măsurării concentraţiilor citokinelor serice APC 

derivate la loturile de şobolanii incluse în experiment putem 

concluziona că citokinele au prezentat valori serice semnificativ 

crescute pentru IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α în cadrul loturilor 2 şi 3 

comparativ cu lotul martor, concentraţiile medii fiind corelate cu 

perioada de timp în care s-a desfaşurat administrarea de miere 

conţinând sulfonamide. Rezultatele obţinute concordă cu mecanismele 

imunologice şi datele prezentate în literatură, în cadrul studiilor 

privitoare la reacţiile de hipersensibilitate la sulfonamide. 

După administrarea de miere cu sulfonamide, parametrii 

biochimici, hematologici şi imunologici (hormonii tiroidieni) la lotul 

căruia i s-a administrat miere conţinând sulfonamide, comparativ cu 

lotul de control, au înregistrat modificări după cum urmează: 

1. Evoluţia valorilor alanil aminotransferazei, evidenţiază 

creşteri semnificative ale activităţii acesteia (p < 0,0001), sugerând 

permeabilizarea membranei hepatocitului şi migrarea sa în spaţiul 

intercelular. Dinamica valorilor determinate pentru AST sugerează că ar 

avea loc migrarea AST din citoplasma hepatocitelor în spaţiul 

intercelular datorită creşterii permeabilităţii membranare. Această 

permeabilizare a membranei hepatocitului poate fi consecinţa lezării 

consecutive legării sulfonamidelor sau a unor metaboliţi ai acestora de 

proteinele membranare. 

Bilirubina totală a înregistrat o creştere de 48,81%. Rezultatele 

obţinute în urma determinării concentraţiilor plasmatice ale bilirubinei 

totale şi bilirubinei directe confirmă afectarea severă a funcţiei hepatobiliare 

în urma administrării timp de 14 zile, prin gavaj gastric, a mierii 

conţinând sulfonamide. Parametrii de investigare a funcţiei renale au 

înregistrat concentraţii crescute la lotul testat, ca urmare a toxicităţii 

datorate administrării de miere conţinând sulfonamide. Astfel, s-au 

64



înregistrat creşteri ale creatininei, ureei şi acidului uric în procente de 

60 %, 7,74%, respectiv 40,35%. 

2. Parametrii hematologici au înregistrat variaţii semnificative. 

Modificările indicilor hematologici în sensul reducerii semnificative a 

numărului de eritrocite, a cantităţii de hemoglobină şi a valorii 

hematocritului au evidenţiat instalarea unei anemii eritrocitare la lotul 

testat. 

3. Investigarea funcţiei tiroidiene prin determinarea T3 şi T4 şi 

urmărirea raportului acestora a evidenţiat scăderea foarte semnificativă 

a valorilor plasmatice ale tiroxinei la animalele care au consumat miere 

conţinând sulfonamide, comparativ cu lotul martor. 

Contribuţii originale 

Sintetizând activitatea de cercetare din studiile efectuate în 

cadrul acestei teze de doctorat se remarcă următoarele elemente de 

originalitate: 

validarea unei metode de analiză cantitativă a reziduurilor 

medicamentoase (antibiotice, sulfonamide, nitrofurani şi chinolone) din 

mierea de albine prin metoda Biocip, metodă care se distinge atât prin 

precizie şi acurateţe, liniaritate, limită de decizie şi capabilitate de 

detecţie, randament de recuperare, cât şi prin simplitatea şi uşurinţa 

metodologiei de lucru, prin costuri reduse pentru aparatură şi reactivi, 

comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice 

utilizate în prezent; 

tehnologia Biocip simplifică metodologia de confirmare a 

prezenţei reziduurilor medicamentoase prin posibilitatea de cuantificare 

şi identificare individuală a substanţelor antimicrobiene utilizate în 

tratamentul bolilor la albine şi care se regăsesc ca reziduuri în miere; 

determinarea conţinutului în reziduuri medicamentoase al 

mierii de albine disponibilă pe piaţa românească utilizând metoda 

Biocip evită obţinerea unor rezultate fals pozitive; 

tehnologia Biocip permite identificarea individuală a 

citokinelor, biomarkeri care evidenţiază reacţiile de hipersensibilitate; 

65



realizarea unui model experimental pe animale de laborator 

care a avut ca obiectiv major identificarea reacţiilor de hipersensibilitate 

cu manifestări alergice la doze foarte mici datorate ingestiei de miere 

conţinând sulfonamide, precum şi repercusiunile generate de aceste 

reziduuri medicamentoase la nivel biochimic, imunologic şi 

hematologic. În literatura de specialitate sunt disponibile doar date 

limitate referitoare la dozarea citokinelor plasmatice, un instrument util 

în studiul reacţiilor de hipersensibilitate de tip întârziat la şobolani. 

Perspective de cercetare 

Rezultatele obţinute în cadrul prezentei teze de doctorat oferă 

posibilitatea orientării către noi direcţii de cercetare: 

continuarea determinărilor cantitative ale reziduurilor 

medicamentoase în alte produse apicole (polen, lăptişor de matcă, 

propolis); 

extinderea cercetărilor din mierea de albine prin validarea 

metodei Biocip pentru încă 3 sulfonamide şi anume: sulfametoxazol 

(SMX), sulfamonometoxină(SMM) şi trimetoprim (TMP) incluse în 

Panelul Antimicrobian I Plus; 

extinderea determinărilor cantitative de citokine şi la IL-5 şi 

IL-13 care sunt indici de hipersensibilitate şi care nu au fost evaluate în 

acest experiment şi corelarea rezultatelor din ambele studii; 

evaluarea modificărilor parametrilor biochimici, hematologici 

şi a stresului oxidativ în cadrul studierii toxicităţii reziduurilor 

metaboliţilor de nitrofurani la şobolani ca urmare a administrării prin 

gavaj gastric de miere de albine conţinând aceste reziduuri; 

revizuirea legislaţiei privind siguranţa alimentului, prin 

introducerea unor limite maxime admisibile vizând prezenţa 

reziduurilor medicamentoase în mierea de albine şi în alte produse 

apicole. Se cunoaşte faptul că depistarea reziduurilor în miere în urma 

controalelor întreprinse de organismele autorizate, poate duce la 

sancţiuni financiare pentru producătorii acesteia, la retrageri de pe piaţă 

a loturilor corespunzătoare şi la declanşarea unor alerte de siguranţă. 

66



Bibliografie selectivă 

Andriþoiu V. Mierea. In cap.VI Produse apicole, Apiterapia în 

planningul familial, tezã de disertaþie, Arad, 2006; 162-166. 

Ashiralieva A, Genersch E. Reclassification, genotypes and virulence of 

Paenibacillus larvae, the etiological agent of American 

foulbrood in honeybees - a review. Apidolologie 2006; 37: 411– 

420. 

Beaune P, Diserens JM, Reybroeck W. Proficiency Testing of Charm II 

Tests for Residue Control of honey. Proceedings of the 39th 

Apimondia International Agricultural Congress, Dublin, Ireland, 

August 21-26, 2005: 33-34. 

Bogdanov S. Contaminants of bee products, Apidologie 2006; 37, 1-18. 

Bogdanov S. Current state of analytical methods for the detection of 

residues in bee products. Apiacta 2003; 38, 399-409 

Bonvehý´ JS and Coll FV. Flavour index and aroma profiles of fresh 

and processed honeys. J Sci Food Agr 2003; 83, 275. 

Bura M, Pătruică S, Bura VA. Tehnologia apicolă. Timişoara: Editura 

Waldpress, 2008, 235-249. 

Castrejon JL, Lavergne SN, El-Sheikh A et al. Metabolic and chemical 

origins of cross-reactive immunological reactions to arylamine 

benzenesulfonamides: T-cell responses to hydroxylamine and 

nitroso derivatives. Chem Res Toxicol 2010; 23:184-92. 

Contreras JP, Ly NR, Gold DR, et al. Allergen-induced cytokine 

production, atopic disease, IgE, and wheeze in children. J 

Allergy Clin Immun 2003; 112:1072–1077. 

Cribb AE, Lee BL, Trepanier LA, Spielberg SP. Adverse reactions to 

sulphonamide and sulphonamide-trimethoprim antimicrobials: 

clinical syndromes and pathogenesis. Adverse Drug React 

Toxicol Rev 1996; 15: 9-50. 

Decizia 2002/657/CE din 12 august 2002 de aplicare a Directivei 

96/23/CE a Consiliului în ceea ce priveşte performanţa 

metodelor analitice şi interpretarea rezultatelor. JOUE 2002, L 

221:8. 

67



Decizia 2003/181/CE din 13 martie 2003 de modificare în ceea ce 

priveşte stabilirea limitelor de performanţă minime necesare 

(LMPN) pentru anumite reziduuri în alimente de origine animal. 

JOUE 2003, L 71:17. 

Directiva 96/23/CE a Consiliului din 29 aprilie 1996 privind mãsurile 

de control care se aplicã anumitor substanþe ºi reziduurilor 

acestora existente în animalele vii ºi în produsele obþinute de la 

acestea ºi de abrogare a Directivelor 85/358/CEE ș i 

86/469/CEE ºi a Deciziilor 89/187/CEE ºi 91/664/CEE. JOUE 

1996, L 125:10. 

Edder P, Cominoli A, Corvi C. Determination of streptomycin residues 

in food by solid phase extraction and liquid with post-column 

derivation and fluorometric detection. J Chromatogr A 1999; 

830: 345-351. 

Edder P, Corvi C. Utilisation du Charm II pour le depistage des residus 

d’antibiotique dans les dendees alimentairea d’origine animale. 

Mitt Lebensm Hyg 2001; 92: 218-228. 

Findlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in 

Ligand Binding Assays. AAPS J 2007, 9 (29) : E260-E267. 

Finkelman FD. Anaphylaxis: lessons from mouse models. J Allergy 

Clin Immun 2007; 120:506-15. 

Gentili A, Perret D, Marchese S. Liquid chromatography-tandem mass 

spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary 

drugs in animal-food products, Trend Anal Chem 2005; 

24(7):704-733 

Grigore G. Fitoterapia şi apiterapia. Boli tratate cu plante medicinale şi 

produse apicole, Bucureşti, Ed. Ştefan, 2008, 98-115. 

Hess DA, Sisson ME, Suria H et al. Cytotoxicity of sulfonamide 

reactive metabolites: apoptosis and selective toxicity of CD81 

cells by the hydroxylamine of sulfamethoxazole. Faseb J 1999; 

13(13): 1688-98. 

Hitchcock JD, Moffett JO, Lackett JJ, Elliott JR. Tylosin for control of 

American foulbrood disease in honey bees. J. Econ. Entomol. 

1970; 63: 204-207. 

68



Hopingarner R, Nelson K. 1987. American foulbrood cleanup rate using 

three terramycin treatments. Am Bee J 1987; 128:120-121. 

Hughes P, Heritage J. Antibiotic growthpromoters in food animals. 

FAO Anim Pr 2004; 160: 129-52. 

Joshi S. HPLC separation of antibiotics present in formulated and 

unformulated samples. J Pharmaceut Biomed 2002; 28:795-809. 

Kanfer I, Skinner M, Walker RB. Analysis of macrolide antibiotics. J 

Chromatogr A 1998; 812:255-286 

Khong SP, Gremaud E, Richoz J et al. Analysis of matrix-bound 

nitrofuran residues in worldwide-originated honeys by isotope 

dilution high-performance liquid chromatography-tandem mass 

spectrometry. J Agr Food Chem 2004; 52(17): 5309-5315. 

Kleespies RG, Radtke J, Bienefeld K. Virus -like particles found in the 

ectoparasitic bee mite Varroa jacobsoni Oudemans. J Invertebr 

Pathol 2000; 15, 87-90. 

Kocher U. Nachweis von Streptomycin-Ruckstanden in Honig mittels 

Charm II- Test und Absicherung der Befunde durch HPLC mit 

Nachsaulenderivatisierung und Fluorescenzdetektion. 

Lebensmittelchemie 1996; 50:115-117. 

Legg, DR, Baumgartner A, Salter R, Wheeler A. ROSA (Rapid One 

Step Assay) for antibiotics in honey. Apiacta 2003; 38, 207-217. 

Michaaud V. Antibiotic residues in honey - the FEEDM view, Apiacta 

2005; 40, 52-54. 

Moats WA, Buckley SA. Determination of free metabolites of ceftiofur 

in animal tissues with an automated liquid chromatographic 

cleanup. J AOAC Int 1998; 81(4): 709-13. 

Moffett JO, Wilson WT, Parker RL. The effect of Penicel, tetracycline 

and erythromycin on adult bees, brood-rearing, and honey 

production. Am Bee J 1958;98: 22-24. 

Mutinelli F. Practical Application of Antibacterial drugs for the Control 

of Honey Bee Diseases. Apiacta 2003; 38:149-155. 

Naisbitt DJ, Gordon SF, Pirmohamed M, et al. Antigenicity and 

immunogenicity of sulphamethoxazole: demonstration of 

69



metabolism-dependent haptenation and T-cell proliferation in 

vivo. British J Pharmacol 2001; 133:295-305. 

Nakazawa H, Ino S, Kato K, Watanabe T et al. Simultaneous 

determination of residual tetracyclines in food by highperformance 

liquid chromatography with atmospheric pressure 

chemical ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 

1999; 732(1):55-64. 

O'Keeffe M, Conneely A, Cooper KM et al. Nitrofuran antibiotic 

residues in pork: The FoodBRAND retail survey. Anal Chim 

Acta 2004; 520:125-131. 

Oldroyd BP, Goodman RD, Hornitzky MAZ, Chandler D. 1989. The 

effect on American foulbrood of standard oxytetracycline 

hydrochloride treatments for the control of European foulbrood 

of honeybees (Apis mellifera). Aust J Agr Res 1989; 40(3): 691- 

697. 

Ortelli D, Edder P, Corvi C. Analysis of Chloramphenicol Residues in 

Honey by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. 

Chromatographia 2004; 59:61-64. 

Peng CYS, Mussen E, Fong A et al. Laboratory and field studies on the 

effects of the antibiotic tylosin on honey bee Apis mellifera L. 

(Hymenoptera: Apidae) development and prevention of 

American foulbrood disease. J Invertebr Pathol 1996; 67(1): 65- 

71. 

Pettis J, Feldlaufer M. Efficacy of tylosin and lincomycin in controlling 

American foulbrood in honey bee colonies. J Apic Res 2005; 

44(3): 106-108. 

Pohl P. Determination of metal content in honey by atomic absorption and 

emission spectrometries. Trend Anal Chem 2009; 28(1):117-128. 

Quintana-Rizzo J, Salter RS, Saul SJ. Solid phase extraction procedures 

for validation of Charm II sulfonamide, streptomycin and 

chloramphenicol positives and detection of tylosin in honey. 

Apiacta 2005; 40:55-62. 

Regulamentul (CE) Nr. 470/2009 al Parlamentului European ºi al 

Consiliului din 6 mai 2009 de stabilire a procedurilor 

70



comunitare în vederea stabilirii limitelor de reziduuri ale 

substanþelor farmacologic active din alimentele de origine 

animalã, de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 2377/90 al 

Consiliului ºi de modificare a Directivei 2001/82/CE a 

Parlamentului European ºi a Consiliului ºi a Regulamentului 

(CE) nr. 726/2004 al Parlamentului European ºi al Consiliului. 

JOUE 2009, L 152:11-22. 

Regulamentul (UE) nr. 37/2010 al Comisiei din 22 decembrie 2009 

privind substanþele active din punct de vedere farmacologic ºi 

clasificarea lor în funcþie de limitele reziduale maxime din 

produsele alimentare de origine animal. JOUE 2011, L 15:1. 

Reybroeck W, Jacobs FJ, De Brabander HF, Daeseleire E. Transfer of 

sulfamethazine from contaminated beeswax to honey. J Agr 

Food Chem 2010; 58:7258–7265. 

Reybroeck W. Residues of antibiotics and sulphonamides in honey on 

the Belgian Market. Apiacta 2003; 38: 23-30. 

Ritter W, 2000, Bolile albinelor, Bucureşti: Ed. M.A.S.T., 2000, 117- 

145. 

Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by 

cultured human dendritic cells is maintained by 

granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus 

interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. 

J Exp Med 1994; 179:1109-18. 

Savoy Perroud MC, Le-Breton MH, Graveleau L, Diserens JM . 

Validation of an ELISA kit for the detection of fluoroquinolones 

in honey. Poster at 41st Apimondia Congress 2009, France, 

Montpellier, September 15-20. 

Spivak M. Preventive antibiotic treatments for honey bees. Am. Bee J. 

2000; 140: 867-868. 

Thompson HM, Waite RJ, Wilkins S et al. Effects of European 

foulbrood treatment regime on oxytetracycline levels in honey 

extracted from treated honeybee (Apis mellifera) colonies and 

toxicity to brood. Food Addit Contam 2005; 22: 573-578. 

Thompson TS, Noot DK. Determination of sulfonamides in honey by 

71



lichid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chim 

Acta 2005; 551:168-176. 

Verdel BM, Souverein PC, Egberts ACG, Leufkens HG. Diference in 

Risk of Allergic Reaction of Sulfonamide Drugs based on 

Chemical Structure. Ann Pharmacother 2006; 40:1040-6. 

Vidal JL, Aguilera-Luiz MM, Romero-Gonzalez R, Garrido-Frenich A. 

Multiclass Analysis of Antibiotic Residues in Honey by 

Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass 

Spectrometry. J Agr Food Chem 2009; 57(5): 1760–1767. 

Vinas P, Balsalobre N, Lopez-Erroz C, Hernandez-Cordoba M. Liquid 

chromatography with ultraviolet absorbance detection for the 

analysis of tetracycline residues in honey. J Chromatogr A 

2004; 1022, 125-129. 

Waite RJ, Brown MA, Thompson HM, Brew MH. 2003. Controlling 

European foulbrood with the shook swarm method and 

oxytetracycline in the UK. Bee World 2003; 82: 130-138. 

Wegener HC, Aarestrup FM, Gerner-Smidt P, Bager F. Transfer of 

antibiotic resistant bacteria from animals to man. Acta Vet Scand 

Suppl 1999; 92:51–57. 

Williams DL. A veterinary approach to the European honey-bee (Apis 

mellifera). Rev Vet J 2000; 160:61-73. 

72



 

ARTICOLE PUBLICATE IN EXTENSO 

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Mătiuţ S, Cuciureanu R. 

Method validation for simultaneous determination of 12 sulfonamides 

in honey using Biochip Array Technology. Rev. Farmacia 2012; 

60(1):143-154. (Jurnal ISI, factor de impact :0.850). 

http://www.revistafarmacia.ro/201201/issue12012art16.html 

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R. 

Immune response in rats following administration of honey with 

sulfonamides residues. Rev Romana Med Lab 2012; (1/4):63-72. (Jurnal 

ISI, factor de impact 2010: 0,113). 

http://rrml.ro/articole/articol.php?year=2012&vol=1&poz=8 

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Cuciureanu R. Multi-analytic 

detection of antibiotic residues in honey using a multiplexing Biochip 

Assay. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2012; 116(1):324-329. (Jurnal 

indexat în baze de date internaţionale - B+). 

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722076/50_popa.pdf 

 

PARTICIPAREA LA CONFERINŢE NAŢIONALE 

Popa (Morariu) ID, Şchiriac EC, Ungureanu D, Cuciureanu R. 

Evidenţierea răspunsului imun la şobolani după administrarea de miere 

conţinând sulfonamide, prezentare orală, Sesiunea ştiinţifică 

(videoconferinţă) în cadrul activităţii din proiect ''Organizarea de 

sesiuni ştiinţifice ale doctoranzilor (simpozioane)'', Videoconferinţă 

Iaşi-Timişoara, 11 decembrie 2012. 

Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Validarea metodei 

de determinare a 12 sulfonamide din miere utilizând Tehnologia 

Biochip, prezentare orală, Simpozionul Naţional: Contribuţii ale 

73



tinerilor cercetători la dezvoltarea cercetării ăn domeniul medicofarmaceutic, 

Iaşi, 7-9 noiembrie 2012. 

Ionela Daniela Popa (Morariu) , I. Chirila, Elena Corina 

Şchiriac , Rodica Cuciureanu. Evaluation of oxidative stress and serum 

biochemical parameters in rats following administration of honey with 

nitrofurans, poster, A 5-a Conferinţă a Doctoranzilor şi a 2-a 

Conferinţă a Postdoctoranzilor în Medicină şi şi Farmacie, Tg Mureş, 4- 

6 iulie 2012. 

Popa (Morariu) Ionela Daniela, Şchiriac Elena –Corina, 

Cuciureanu Rodica. Determinarea profilului de citokine la şobolani în 

urma administrării de miere de albine îmbogăţită cu sulfonamide, 

poster, 50 de ani de învăţmânt universitar farmaceutic la Iaşi, ediţia a 

V-a, 6-8 octombrie 2011. 

Popa (Morariu) ID, Hristodorescu C, Schiriac EC, Matiut S, 

Cuciureanu R. Simultaneous detection of four nitrofuran metabolites in 

honey using biochip array technology, prezentare orală, Simpozionul 

Doctoranzilor din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse doctorale 

pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării 

POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 8 septembrie 2011. 

Morariu D.I., Schiriac C.E., Cuciureanu R. Simultaneous 

detection and quantification for drug residues in honey.New 

possibilities, poster, Congresul Naţional de Farmacie, ediţia a XIV-a, 

Tg.Mureş, 13-16 octombrie 2010. 

Popa (Morariu), I. D., Schiriac, C.E.,Cuciureanu, R. Method 

validation for simultaneous multianalit detection of drug residues in 

honey using Biochip Array Technology, poster, European Strategy for 

Phd Programs din cadru proiectului POSDRU cu titlul: Burse 

doctorale pentru doctoranzi competitive în Aria Europeană a Cercetării 

POSDRU/88/1.5/63117, Timişoara, 20-22 septembrie 2010. 

74



 

PARTICIPAREA LA CONFERINŢE INTERNAŢIONALE 

Ionela Daniela Popa (Morariu), Elena Corina Schiriac, Rodica 

Cuciureanu. Method validation for simultaneous multianalyt detection 

of quinolones, ceftiofur, thiamphenicol, streptomycin, tylosin and 

tetracyclines in honey using Biochip Array Technology, poster, The 

15th Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena-Grecia, 13-15 mai 

2011. 

Popa (Morariu), I. D. , Chirila, I., Şchiriac, E. C., Cuciureanu, 

R. Toxic effect of drug residues on the serum biochemical parameters 

of rats following administration of honey with sulfonamides, poster, 

DKMT Euroregional Conference on Environment and Health, 18 -19 

mai 2012, Szeged-Ungaria. 

Popa(Morariu), I.D.; Rodríguez, Y; Berrada, H; Mañes, J; 

Cuciureanu, R; Font, G. Evaluación de la presencia de micotoxinas en 

polen mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de 

masas en tandem, prezentare orală, Aetox Congres, Valencia, Spania, 

29 iunie 2012. 

75

rezumat popa (morariu) - Gr.T. Popa

Transform your PDFs into Flipbooks and boost your revenue!

Delete template?

Save as template ?