12.07.2015 Views

Tehnici de laborator in micologia medicala - PIM Copy

Tehnici de laborator in micologia medicala - PIM Copy

Tehnici de laborator in micologia medicala - PIM Copy

SHOW MORE
SHOW LESS
  • No tags were found...

Create successful ePaper yourself

Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.

<strong>Copy</strong>right © 2007Societatea Română <strong>de</strong> Micologie Medicală şi MicotoxicologieNici o parte a acesteipublicaţii nupoate fi reprodusă, transmisă, stocatăsau difuzată în orice formă sau pr<strong>in</strong> orice mijloace, fărăă acordul scriss alS.R.M.M.M. Toate cererile <strong>de</strong> reproducere a materialelor publicate vor fiadresate în scris pe adresa:Societatea Română <strong>de</strong> Micologie Medicală şi MicotoxicologieOP 6, CP 1356Iaşi – RomâniaEditor volum şi <strong>de</strong>sign copertă:<strong>in</strong>g. Ionuţ Ail<strong>in</strong>căiComenzi la:Societatea Română <strong>de</strong> Micologie Medicală şi MicotoxicologieOP 6, CP 1356Iaşi – Româniae-mail: comenzi@fungi.rowww.fungi.roDescrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României<strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> <strong>laborator</strong> în <strong>micologia</strong> medicalăă / sub red.:Mihai Mareş. – Iaşi : <strong>PIM</strong>, 2007Bibliogr.In<strong>de</strong>x.ISBN 978-973-716-677-7I. Mareş, Mihai (ed.)543.06582.28Editura <strong>PIM</strong>Şos. Ştefan cel Mare nr. 11www.pimcopy.roIaşi RomâniaII


Cupr<strong>in</strong>sCap. 1 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> recoltare, transport şi procesare primarăa prelevatelor cl<strong>in</strong>ice ............................................................................................... 11.1. Sângele ..................................................................................................... 21.1.1. Recoltarea sângelui pentru hemocultură ................................... 31.1.2. Numărul <strong>de</strong> hemoculturi şi momentul prelevării ...................... 41.1.3. Volumul <strong>de</strong> sânge ce urmează a fi însămânţat .......................... 41.1.4. Medii <strong>de</strong> cultură ........................................................................ 41.1.5. Durata <strong>in</strong>cubării şi prelucrarea hemoculturilor ......................... 71.1.6. Semnificaţia hemoculturilor pozitive cu fungi saprobioţi ........ 81.2. Măduva osoasă hematogenă ..................................................................... 81.3. Lichidul cefalo-rahidian ........................................................................... 81.4. Raclatul cornean ....................................................................................... 91.5. Prelevatul otic .......................................................................................... 91.6. Flui<strong>de</strong>le <strong>in</strong>traoculare ................................................................................ 91.7. Firele <strong>de</strong> păr ............................................................................................. 91.8. Fragmentele unghiale şi scuamele cutanate ............................................. 91.9. Secreţiile respiratorii joase ..................................................................... 101.10. Aspiratul pulmonar ................................................................................ 111.11. Biopsia pulmonară ................................................................................. 111.12. Alte flui<strong>de</strong> organice normal sterile ......................................................... 111.13. Secreţiile purulente d<strong>in</strong> abcese subcutanate sau d<strong>in</strong> plăgi <strong>de</strong>schise ....... 121.14. Produsele patologice <strong>de</strong> la nivelul mucoasei orale................................. 121.15. Ur<strong>in</strong>a ...................................................................................................... 121.16. Secreţiile vag<strong>in</strong>ale .................................................................................. 141.17. Produse patologice <strong>de</strong> la nivelul tractului genital mascul<strong>in</strong> ................... 151.18. Fragmentele tisulare biopsice ................................................................. 151.19. Tehnica aspiraţiei cu ac f<strong>in</strong> .................................................................... 15Bibliografie selectivă ............................................................................. 18Cap. 2 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> microscopie directă ................................................................. 212.1. Coloraţia negativă cu tuş <strong>de</strong> India .......................................................... 222.2. Coloraţia negativă cu mercurochrom 2% şi tuş <strong>de</strong> India ....................... 232.3. Coloraţia cu lactofenol şi albastru <strong>de</strong> anil<strong>in</strong>ă ......................................... 242.4. Coloraţia cu hidroxid <strong>de</strong> potasiu şi cerneală Parker ............................... 252.5. Clarificarea cu hidroxid <strong>de</strong> potasiu şi dimetil sulfoxid .......................... 252.6. Coloraţia cu calcofluor alb şi KOH 10% ............................................... 262.7. Coloraţia Gram ....................................................................................... 282.8. Coloraţia Gram - calcofluor alb ............................................................. 302.9. Coloraţia Giemsa.................................................................................... 312.10. Coloraţia May-Grunwald-Giemsa .......................................................... 322.11. Coloraţia Wright .................................................................................... 342.12. Coloraţia cu mucicarm<strong>in</strong> Southgat ......................................................... 352.13. Coloraţia Musto ..................................................................................... 36Bibliografie selectivă ............................................................................. 39VI


Cap. 3 Medii <strong>de</strong> cultivare ...................................................................................... 413.1. Generalităţi ............................................................................................. 413.2. Compoziţia mediilor <strong>de</strong> cultură .............................................................. 423.3. Prepararea şi sterilizarea mediilor .......................................................... 433.4. Controlul <strong>de</strong> calitate şi păstrarea mediilor ............................................. 44Medii <strong>de</strong> cultivare .................................................................................. 46Bibliografie selectivă ............................................................................. 96Cap. 4 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> însămânţare şi transplantare ............................................... 1014.1. <strong>Tehnici</strong> uzuale ...................................................................................... 1014.2. <strong>Tehnici</strong> speciale.................................................................................... 1034.2.1. Tehnica <strong>de</strong> purificare a izolatelor levurice .............................. 1034.2.2. Tehnica însămânţării levurilor pe Agarul cu fă<strong>in</strong>ă<strong>de</strong> porumb şi tween 80 ......................................................... 1054.2.3. Tehnica <strong>de</strong> cultivare pe suporturi transparente ...................... 1054.2.4. Tehnica <strong>de</strong> cultivare în „picătură suspendată” ....................... 1064.2.5. Tehnica <strong>de</strong> cultivare pe bloc <strong>de</strong> geloză ................................. 1064.3. <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> transplantare ....................................................................... 107Bibliografie selectivă ........................................................................... 108Cap. 5 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> exam<strong>in</strong>are microscopică a fungilor d<strong>in</strong> culturi ................. 1095.1. Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru <strong>de</strong> anil<strong>in</strong>ă(levuri) .............................................................................................. 1095.2. Preparatul extemporaneu cu lactofenol şi albastru <strong>de</strong> anil<strong>in</strong>ă(fungi filamentoşi) ............................................................................ 1105.3. Preparatul extemporaneu cu bandă a<strong>de</strong>zivă ......................................... 1105.4. Lutarea preparatelor extemporanee ...................................................... 111Bibliografie selectivă ........................................................................... 112Cap. 6 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> histopatologie ........................................................................ 1136.1. Obţ<strong>in</strong>erea probelor ............................................................................... 1136.2. Examenul macroscopic ........................................................................ 1136.3. Fixarea .............................................................................................. 1136.3.1. Formol soluţie 10% tamponată pH 6,8 ................................ 1156.3.2. Fixatorul Bou<strong>in</strong> ..................................................................... 1166.3.3. Fixatorul Hollan<strong>de</strong> ................................................................ 1166.4. Procesarea ţesuturilor ........................................................................... 1176.4.1. Deshidratarea ........................................................................ 1186.4.2. Clarificarea ........................................................................... 1196.4.3. Impregnarea cu paraf<strong>in</strong>ă ....................................................... 1196.4.4. Inclu<strong>de</strong>rea ............................................................................. 1206.4.5. Secţionarea............................................................................ 1206.4.6. Etalarea secţiunilor ............................................................... 1216.4.7. Colorarea .............................................................................. 1236.5. Montarea .............................................................................................. 148VII


In<strong>de</strong>x6.6. Etichetarea şi arhivarea ........................................................................ 150Bibliografie selectivă ........................................................................... 151Cap. 7 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> seromicologie ......................................................................... 1537.1 Fungitell ........................................................................................... 1537.1.1. Pr<strong>in</strong>cipiul testului .................................................................. 1537.1.2. Materiale furnizate împreună cu testul Fungitell .................. 1547.1.3. Materiale necesare dar nefurnizate împreună cu kitul .......... 1547.1.4. Atenţionări şi precauţii ......................................................... 1557.1.5. Păstrarea reactivilor .............................................................. 1557.1.6. Recoltarea / Stocarea / Marcarea probelor ............................ 1557.1.7. Tehnică <strong>de</strong> lucru ................................................................... 1557.1.8. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1577.1.9. Controlul calităţii .................................................................. 1587.1.10. Limite ................................................................................... 1587.1.11. Interferarea cu alte substanţe ................................................ 1597.1.12. Valori aşteptate ..................................................................... 1597.2. Platelia ® Aspergillus ............................................................................ 1607.2.1. Pr<strong>in</strong>cipiul testului .................................................................. 1607.2.2. Materiale furnizate odată cu kitul ......................................... 1607.2.3. Materiale necesare, dar nefurnizate odată cu kitul ............... 1617.2.4. Conservarea reactivilor <strong>de</strong>sigilaţişi a celor reconstituiţi ............................................................ 1617.2.5. Tehnica <strong>de</strong> lucru ................................................................... 1627.2.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1647.3. Platelia ® Candida Ac ............................................................................ 1657.3.1. Introducere ............................................................................ 1657.3.2. Pr<strong>in</strong>cipiul testului .................................................................. 1657.3.3. Materiale furnizate împreună cu kitul ................................... 1657.3.4. Materiale necesare dar nefurnizate impreună cu kitul .......... 1667.3.5. Tehnica <strong>de</strong> lucru ................................................................... 1667.3.6. Interpretarea rezultatelor ....................................................... 1677.4. Platelia ® Candida Ag ........................................................................... 1697.4.1. Introducere ............................................................................ 1697.4.2. Pr<strong>in</strong>cipiul testului .................................................................. 1697.4.3. Materiale furnizate odată cu kitul ......................................... 1697.4.4. Materiale necesare dar nefurnizate odată cu kitul ................ 1697.4.5. Tehnica <strong>de</strong> lucru ................................................................... 1707.4.6. Maniera <strong>de</strong> calcul şi <strong>in</strong>terpretarea rezultatelor ...................... 1717.5. I<strong>de</strong>ntificarea speciei Candida dubl<strong>in</strong>iensispr<strong>in</strong> latex-aglut<strong>in</strong>are .............................................................. 172Bibliografie selectivă ........................................................................... 173Cap. 8 Teste biochimice şi fiziologice ................................................................. 1798.1. Fermentarea zaharurilor ...................................................................... 1798.2. Capacitatea <strong>de</strong> asimilare a surselor <strong>de</strong> carbon ..................................... 1808.3. Capacitatea <strong>de</strong> asimilare a surselor <strong>de</strong> azot ......................................... 180VIII


8.4. Testul <strong>de</strong> hidroliză a ureei (producerea <strong>de</strong> urează) la levuri ................ 1808.5. Testul <strong>de</strong> hidroliză a ureei (producerea <strong>de</strong> urează) la <strong>de</strong>rmatofiţi ........ 1818.6. Testarea rezistenţei la cicloheximidă ................................................... 1818.7. Producerea <strong>de</strong> fenol-oxidază ................................................................ 1828.8. Testarea producerii altor enzime .......................................................... 1828.9. Testul <strong>de</strong> <strong>de</strong>pistare a necesităţilor nutritive speciale ............................ 1828.10. Testul <strong>de</strong> cultivare pe Agar BCP-lapte-glucoză. .................................. 1838.11. Testul <strong>de</strong> perforare a firului <strong>de</strong> păr <strong>in</strong> vitro. ......................................... 1848.12. Testul <strong>de</strong> cultivare pe boabe <strong>de</strong> orez .................................................... 1858.13. Testul <strong>de</strong> filamentare (testul <strong>de</strong> blasteză sau germ-tube test) ............... 1858.14. Testul <strong>de</strong> termotoleranţă / termostimulare ........................................... 186Bibliografie selectivă ........................................................................... 188Cap. 9 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> micologie moleculară ............................................................ 1919.1. Extracţia ADN-ului pentru PCR .......................................................... 1919.2. Extracţia ADN-ului cu ajutorul kit-uluiHigh Pure Template Preparation Kit (levuri) .................................... 1919.3. Extracţia ADN-ului pr<strong>in</strong> crioprecipitare (fungi filamentoşi) ............... 1929.4. Controlul calităţii acizilor nucleici extraşi ........................................... 1939.5. I<strong>de</strong>ntificarea speciei Candida dubl<strong>in</strong>iensis pr<strong>in</strong> PCR duplex ............... 1949.6. I<strong>de</strong>ntificarea moleculară a levurilor pr<strong>in</strong> PCR şisecvenţializarea regiunilor ITS ......................................................... 1969.7. Reactivi utilizaţi în tehnicile <strong>de</strong> biologie moleculară ........................... 200Bibliografie selectivă ........................................................................... 201Cap. 10 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> evaluare a sensibilităţii la antifungice ............................... 20310.1. Tehnica <strong>de</strong> lucru pentru levuri ............................................................. 20310.2. Tehnica <strong>de</strong> lucru pentru fungi filamentoşi ........................................... 20610.3. Testarea sensibilităţii la antifungice pr<strong>in</strong> metodadifuzimetrică Kirby-Bauer ................................................................ 208Bibliografie selectivă ........................................................................... 210Cap. 11 <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> aeromicologie ...................................................................... 21111.1. Caseta AIR-O-CELL ........................................................................ 21211.2. Caseta MICRO-5.................................................................................. 21411.3. Caseta CYCLEX-D .............................................................................. 21511.4. Caseta BIOCELL ................................................................................. 21511.5. Caseta LARO 100 ................................................................................ 21611.6. Impactorul Zefon Z-A6 ........................................................................ 21711.7. Dispozitivul CIP 10M .......................................................................... 21911.8. Aprecierea încărcăturii fungice aeropurtate ......................................... 22411.9. <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> recoltare/exam<strong>in</strong>are directă a probelor ............................... 22511.9.1. Banda a<strong>de</strong>zivă BIO TAPETM (Zefon International) ............ 22511.9.2. Recoltarea fragmentelor <strong>in</strong>erte .............................................. 22611.9.3. Recoltarea cu ajutorul tamponului tip exsudat ...................... 226Bibliografie selectivă ........................................................................... 227IX


In<strong>de</strong>xCap. 12 Norme generale <strong>de</strong> biosecuritate înlaboratoarele <strong>de</strong> micologie medicală ................................................ 22912.1. Clasificarea fungilor în funcţie <strong>de</strong> clasele <strong>de</strong> risc biologic .................. 22912.2. Norme generale <strong>de</strong> biosecuritate .......................................................... 23012.2.1. <strong>Tehnici</strong> <strong>de</strong> <strong>laborator</strong> folosite în zona <strong>de</strong> lucru ....................... 23212.3. Meto<strong>de</strong> <strong>de</strong> protecţie primară ................................................................ 23212.3.1. Hote <strong>de</strong> protecţie biologică ................................................... 23212.4. Substanţe <strong>de</strong>contam<strong>in</strong>ante folosite înlaboratoarele <strong>de</strong> micologie medicală ................................................. 23312.5. Măsuri <strong>de</strong> protecţie împotriva substanţelor chimice ........................... 235Bibliografie selectivă ........................................................................... 236Anexă .................................................................................................................... 237In<strong>de</strong>x ..................................................................................................................... 245X

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!