SV 86.qxd - Sigma-Aldrich

AVSEDD ANVÄNDNING
Sigma-Aldrich fosfatassatser är avsedda för histokemisk semikvantitativ påvisning
av alkalisk fosfatasaktivitet i leukocyter. Alkaliska fosfatasreagenser är avsedda för “in vitrodiagnostik”.
Alkaliskt fosfatas verkar begränsat till band och segmenterade neutrofiler i
hematopoetisk vävnad. 1–2 Påvisning av detta, genom samtidig infångning med användning
av substituerade naftoler och diazoniumsalter, är kanske det tidigaste exemplet på ett
cytokemiskt enzymtest med klinisk signifikans. 3
De flesta procedurer, inklusive de som tillhandahålls av Sigma-Aldrich, använder
stabila diazoniumsalter. Dessa framställs genom att reagera en arylamin med natriumnitrit
i ett surt medium. 4 Den resulterande diazoniumkloriden (vanligen instabil) kan sedan
behandlas med föreningar såsom zinkklorid, zinksulfat eller naftalen-1-6-disulfonat, för att
bilda stabila salter. Dessa stabiliseringsmedel kan utöva markant inhibition på vissa
enzymatiska system, medan diazoniumkloriderna är mindre hämmande. 4 Av denna
anledning tillhandahåller Sigma-Aldrich nu stabila lösningar för Fast Red Violet LB
standard, Fast Blue BB standard och natriumnitrit för alkalisk fosfatascytokemi. För att
vidare förenkla dessa metoder, inkluderas en stabil lösning av naftol AS-BI-fosfat.
För att utföra detta test inkuberas fixerade blodfilmer vid rumstemperatur (18–26 °C) i
en lösning som innehåller naftol-AS-BI-fosfat och färskberett Fast Red Violet LB-salt eller
Fast Blue BB-salt, buffrat vid pH 9,5 med 2-amino-2-metyl-1,3-propandiol (AMPD).
Aktivitetsställen är antingen röda eller blåa, beroende på valet av diazoniumsalt.
Proceduren, som inkorporerar Fast Red Violet LB, liknar en föreslagen NCCLS
referensmetod. 5
REAGENSER
ALKALISKT FOSFATAS
(AP), LEUKOCYT
(Procedurnummer 86)
NAFTOL-AS-BI ALKALISK LÖSNING, katalognummer 86-1
Naftol-AS-BI-fosfat, 4 mg/ml, i AMPD-buffert, 2 mol/l, pH 9,5.
FRV-ALKALISK LÖSNING, katalognummer 86-2
Fast Red Violet LB standard, 5 mg/ml, i saltsyra, 0,4 mol/l, med stabiliseringsmedel
FBB-ALKALISK LÖSNING, katalognummer 86-3
Fast Blue BB standard, 5 mg/ml, i saltsyra, 0,4 mol/l, med stabiliseringsmedel
NATRIUMNITRITLÖSNING, katalognummer 91-4
Natriumnitrit, 0,1 mol/l.
CITRATLÖSNING, katalognummer 91-5
Citronsyra, 18 mmol/l, natriumcitrat, 9 mmol/l, natriumklorid, 12 mmol/l, med ytaktiv
substans, buffrad vid pH 3,6.
HEMATOXYLINLÖSNING, GILLNUMMER 3, katalognummer GHS-3
Certifierat hematoxylin, 6,0 g/l, natriumjodat, 0,6 g/l, aluminiumsulfat, 52,8 g/l med
stabiliseringsmedel.
NEUTRALT RÖTT LÖSNING, BUFFRAD, katalognummer N 6264
Neutralt rött, certifierat, 0,5 % v/v, i acetatbuffert, pH 5,2. konserveringsmedel tillsatt.
FÖRVARING OCH STABILITET:
Förvara naftol-AS-BI alkalisk lösning, FRV-alkalisk lösning, FBB-alkalisk lösning och
natriumnitritlösning i kylskåp (2–8 °C). Reagenser är stabila tills utgångsdatum.
Förvara citratlösning i kylskåp (2–8 °C). Lösningen är lämplig för användning i
avsaknad av mikrobiell tillväxt.
Förvara hematoxylinlösning och neutralt rött-lösning i rumstemperatur (18–26 °C).
Skydda hematoxylinlösning mot ljus. Reagenser är stabila tills utgångsdatum.
FÖRSÄMRING:
Kasta hematoxylinlösning om lösningen färgas brun (överoxiderad av luft) eller purpur
(förlust av aciditet).
BEREDNING:
Reagenser tillhandahålls bruksfärdiga.
CITRATACETONFORMALDEHYDFIXATIV: Till 25 ml citratlösning, katalog-nummer 91-5,
tillsätts 65 ml aceton och 8 ml 37 % formaldehyd. Placera i glasflaska och förslut väl.
Förvaras i kylskåp (2–8 °C). Värm till 18–26 °C före användning. Stabil upp till 4 veckor om
den förvaras väl försluten i kylskåp.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER:
Normala försiktighetsåtgärder vid hantering av laboratoriereagenser ska iakttas. Kasta
avfall enligt lokala lagar och bestämmelser. Se Faktablad om materialsäkerhet för
uppdaterad information om risker, faror eller säkerhet.
Amerikanska risk- och säkerhetsbestämmelser
Naftol-AS-BI alkalisk lösning och neutralt rött-lösning. Försiktighet: substansen är inte
fullständigt testad ännu.
FRV-alkalisk lösning är FRÄTANDE. Farligt vid förtäring. Giftig vid inandning. Frätande.
Vid kontakt med ögon, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd
lämpliga skyddskläder, skyddshandskar och skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vid
olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt
etiketten. Målorgan: lever och njurar.
FBB-alkalisk lösning är GIFTIG. Giftig vid inandning. Frätande. Vid kontakt med ögon,
spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder,
skyddshandskar och skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vid olycksfall, illamående eller annan
påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. Målorgan: lever och njurar.
1-SE
Gills 3 hematoxylinlösning är FARLIG. Farligt vid förtäring. Irriterar ögon,
andningsorgan och hud. Vid kontakt med ögon, spola genast med mycket vatten och
kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar och skyddsglasögon eller
ansiktsskydd. Målorgan: lever och njurar.
Aceton är BRANDFARLIGT och IRRITERANDE. Irriterar ögonen. Upprepad
exponering kan orsaka torr hud eller hudsprickor. Ångor kan göra att man blir dåsig och
omtöcknad. Förpackningen förvaras på väl ventilerad plats. Förvaras åtskilt från
antändningskällor – rökning förbjuden. Vid kontakt med ögon, spola genast med mycket
vatten och kontakta läkare. Målorgan: lever och njurar.
Formaldehydlösning är GIFTIG. Giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring.
Frätande. Misstänks kunna ge cancer. Kan orsaka sensibilisering vid hudkontakt. Kan ge
ärftliga genetiska skador. Vid kontakt med ögon, spola genast med mycket vatten och
kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar och skyddsglasögon eller
ansiktsskydd. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare.
Visa om möjligt etiketten. Sörj för god ventilation.
Risk- och säkerhetsbestämmelser enligt EU
Naftol-AS-BI alkalisk lösning och neutralt rött-lösning. Försiktighet: substansen är inte
fullständigt testad ännu.
FRV-alkalisk lösning och FBB-alkalisk lösning är FARLIGA. Farligt vid förtäring.
Använd lämpliga skyddskläder.
Gills 3 hematoxylinlösning är FARLIG. Farligt vid förtäring. Irriterar ögon,
andningsorgan och hud. Vid kontakt med ögon, spola genast med mycket vatten och
kontakta läkare. Använd lämpliga skyddskläder.
Aceton är MYCKET BRANDFARLIGT och IRRITERANDE. Mycket brandfarligt. Irriterar
ögonen. Upprepad exponering kan orsaka torr hud eller hudsprickor. Ångor kan göra att
man blir dåsig och omtöcknad. Förpackningen förvaras på väl ventilerad plats. Förvaras
åtskilt från antändningskällor – rökning förbjuden. Vid kontakt med ögon, spola genast med
mycket vatten och kontakta läkare.
Formaldehydlösning är GIFTIG. Giftigt vid inandning, hudkontakt och förtäring.
Frätande. Misstänks kunna ge cancer. Kan orsaka sensibilisering vid hudkontakt. Vid
kontakt med ögon, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga
skyddskläder, skyddshandskar och skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vid olycksfall,
illamående eller annan påverkan, kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten.
Sörj för god ventilation.
PROCEDUR
PROVTAGNING:
Provtagningen bör utföras i enlighet med NCCLS dokument M29-A2. Ingen känd
testmetod ger fullständig garanti för att blodprov eller vävnad inte överför infektion. Alla
blodderivat och vävnadsprov bör därför anses vara potentiellt smittsamma.
Färskt blod eller benmärgsfilmer eller prov som antikoagulerats med heparin kan
användas. 5 UNDVIK EDTA. 5 Blodutstryk bör färgas för enzymaktivitet inom 8 timmar efter
framställning. Om detta inte är möjligt, kan emellertid gradvis förlust av alkalisk
fosfatasaktivitet fördröjas genom fixering och förvaring över natten i frys. 5 Filmer bör torkas
minst 1 timme före fixering och 3 timmar efter fixering före nedfrysning.
SPECIELLA MATERIAL SOM BEHÖVS, MEN INTE MEDFÖLJER:
ACETON, ACS-reagens
FORMALDEHYD, 37 %, ACS
ANMÄRKNINGAR:
Utför proceduren med användning av positiva kontroller. Dessa kan erhållas från
patienter med pyogen leukocytos, kvinnor som befinner sig i de tre sista
graviditetsmånaderna eller under de första dagarna efter förlossning. Alkaliska
fosfatasvärden i leukocyter från dessa personer överskrider vanligen 100. En negativ
kontroll kan framställas från ett normalt fixerat utstryk genom att sänka ned det i kokande
vatten i 1 minut för att inaktivera enzymet. Kontrollfilmer kan bevaras upp till 1 år om de
förvaras fixerade, inlindade i Parafilm ® vid -70 °C Dessa filmer bör torkas minst 1 timme före
fixering och 3 timmar efter fixering före nedfrysning.
Varje laboratorium bör etablera sitt eget förväntade område, karakteristiskt för den
lokala populationen.
Proceduren är beroende av subjektiv utvärdering av färgade celler. Detta kan resultera
i en stor variation av erhållna utvärderingar. Reaktionsblandningens temperatur måste
hållas mellan 18–26 °C. Lägre temperaturer kommer att resultera i betydligt lägre värden.
Över 30 °C sker en påfallande ökning av aktivitet. Eosinofiler färgas inte men kan kännas
igen genom att de har tvålobiga kärnor och stora, refraktila granulat.
Det finns mycket lite data om föreningar som kan interferera med alkalisk
fosfatasaktivitet i leukocyter (LAPA). Vissa läkemedel och andra substanser är kända för att
påverka cirkulerande alkalisk fosfatasaktivitet. 6 Orala preventivmedel, kortisol och stress
kan resultera i förhöjda alkaliska fosfatasvärden i leukocyter. 3
Hos människor är alkalisk fosfatasaktivitet begränsad till mogna och bandformiga
granulocyter. Svag färgning kan ibland observeras i lymfocyter. Benmärgsosteoblaster och
endotelceller färgas starkt. En påfallande ökning av alkaliskt fosfatas i perifera blodleukocyter
ses i multipelt myelom, Hodgkins sjukdom, pylocytaemia vera och infektiös leukocytos. Låg
eller utebliven aktivitet ses i kronisk myelocytisk leukemi, ärftlig hypofosfatasi och paroxysmal
nokturn hemoglobinuri.
Data som erhållits från denna procedur tjänar endast som ett hjälpmedel vid diagnos
och bör granskas tillsammans med andra kliniska, diagnostiska tester eller information.
PROCEDUR:
OBS: För användning med Columbiaburkar delas reagensvolymerna med 5.
1. Mät upp 45 ml avjoniserat vatten och justera temperaturen till 18–26 °C
2. Bered diazoniumsaltlösning:
Tillsätt 1 ml natriumnitritlösning till 1 ml FRV-alkalisk lösning
ELLER
Tillsätt 1 ml natriumnitritlösning till 1 ml FBB-alkalisk lösning.
Blanda genom varsam inversion. Låt stå i 2 minuter.

3. Tillsätt lösningen, som framställts i steg 2 till det avjoniserade vattnet från steg 1.
4. Tillsätt 1 ml naftol-AS-BI alkalisk lösning, till den utspädda diazoniumsaltlösningen
(steg 3). Blanda väl och häll i Coplinburk.
5. Värm citratacetonformaldehydfixativlösningen till rumstemperatur (18–26 °C). Fixera
objektglasen genom nedsänkning i fixativlösning i 30 sekunder. Skölj försiktigt i
avjoniserat vatten i 45 sekunder. Låt inte objektglasen torka.
6. Tillsätt objektglasen till den alkaliska färgblandningen (steg 4) och inkubera vid
18–26 °C i 15 minuter. Skydda nedsänkta objektglas mot direkt ljus. Kasta den
alkaliska färgblandningen efter användning.
7. Ta efter 15 minuters inkubation ut objektglasen ur Coplinburken och skölj i 2 minuter i
avjoniserat vatten. Låt inte objektglasen torka.
8. Motfärga i 2 minuter. Om FRV-alkalisk lösning används, motfärga med hematoxylinlösning,
Gillnummer 3. Om FBB-alkalisk lösning används, motfärga med buffrad
neutralt rött-lösning.
9. Skölj objektglasen noggrant i kranvatten och luftorka.
10. Undersök i mikroskop. Om täckglas krävs, använd endast vattenhaltigt monteringsmedium.
PRESTANDAEGENSKAPER
POÄNGSÄTTNING:
Skanna filmen (900X) och välj ut ett tunt område där erytrocyterna knappt vidrör
varandra. Ställen med fosfatasaktivitet kommer att framträda som blåa eller röda granulat,
beroende på vilken färg som används. Välj ut 100 på varandra följande segmenterade och
bandformiga neutrofila granulocyter. Poängsätt från 0 till 4+ på basis av kvantitet och
intensitet hos de utfällda färgerna i cytoplasman hos dessa celler. För poängsättning, se
tabell 1. Summan av utvärderingen för 100 celler anses som poängen.
TABELL 1. POÄNGSÄTTNING*
Utfälld azofärg i cytoplasma
Cell- Mängd** Färgnings- Cytoplasmapoäng
( %) Granulatstorlek intensitet bakgrund
0+ Ingen — Ingen Ingen
1+ 50 Ringa Svag till Färglös till mycket
Måttligt svagt rosa eller blå
2+ 50–80 Ringa Måttlig Färglös till mycket
till stark rosa eller blå
3+ 80–100 Medelstor till stor Stark Färglös till rosa
eller blå
4+ 100 Medelstor och stor Lysande Ej synbar
* Tabell 1 visar en modifikation av Kaplows observationer. 2,3
** Volymprocent av cytoplasma, som upptas av azofärgprecipitat.
För att erhålla poängen för alkalisk fosfatasaktivitet i leukocyter, multipliceras antalet
räknade celler med värdet för cellutvärdering. Dessa tal summeras för att erhålla poängen
för alkalisk fosfatasaktivitet i leukocyter, som visas i följande exempel.
Cell- Beräknade LAPApoäng
poäng poäng
0 60 0
1+ 20 20
2+ 14 28
3+ 5 15
_____ 4+ _____ 1 _____ 4
Totalt 100 67
Följande poäng från 40 friska försökspersoner erhölls hos Sigma-Aldrich med
användning av den beskrivna proceduren.
__________________ Fast Red Violet LB ____________
Fast Blue BB
LAPA-medelvärde ± 1 SD 76 ± 31 94 ± 39
LAPA-område 44–106 55–133
Området för normalpoäng är brett och varierar från 20 till 180. Följande poängområden
erhölls från de 40 normala försökspersonerna:
__________________ Fast Red Violet LB ____________
Fast Blue BB
20–146 25–180
Om observerade resultat skiljer sig från förväntade resultat, kontakta Sigma-Aldrich
tekniska service för assistans.
2-SE
REFERENSER
1. Kay HD: Plasma phosphatase in osteitis deformans and in other diseases of the
bone. Br J Exp Pathol 10:253, 1929
2. Kaplow LS: A histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline
phosphatase activity in smears of blood and marrow. Blood 10:1023, 1955
3. Elias JM: Principles and Techniques in Diagnostic Histopathology, Noyes
4.
Publications, Park Ridge (NJ), 1982, pp 248–250
Burstone MS: IN Enzyme Histochemistry and Its Application in the Study of
Neoplasms. Academic Press, New York, 1962, pp 88–113
5. Proposed Standard: Histochemical Method for Leukocyte Alkaline Phosphatase H22-
P, Vol 4, No. 14, National Committee for Clinical Laboratory Standards
6. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd ed. DS Young, Editors, AACC Press,
Washington (DC), 1990
7. Kaplow LS: Leukocyte alkaline phosphatase cytochemistry: Applications and
methods. Ann New York Acad Sci 155:911, 1968
Parafilm is a registered trademark of American Can Company, Greenwich, CT
Sigma-Aldrich, Inc. garanterar att deras produkter överensstämmer med informationen i
denna och andra Sigma-Aldrich-publikationer. Kunden måste avgöra produktens(ernas)
lämplighet för deras speciella användning. Ytterligare villkor kan gälla. Se baksidan av
fakturan eller packsedeln för ytterligare försäljningsvillkor.
Procedurnummer 86
Föregående revidering: 2003-02
Reviderad: 2003-09
AR-MED Ltd., Runnymede Malthouse
Egham, TW20 9BD Storbritannien
SIGMA-ALDRICH, INC.
3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA+1 314 771 5765
Teknisk service: +1 314 771 3122 SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH
eller e-post till clintech@sial.com P.O. 1120, 89552 Steinheim, Tyskland +49-7329-970
För beställning: mottagaren betalar samtalet: +1 314 771 5750
www.sigma-aldrich.com