AF-21 Rappfotometer - Umeå universitet

Umeå Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet
Årskull:
Laborationsrapport
Absorbansmätningar
XXXXXX och YYYYYY
Laborationsdatum: Inlämnad Godkänd
Handledare:

Moment I: Ljusabsorption i kyvetter
1)
Tabell 1. Uppmätta absorbansvärden för en plastkyvett,
glaskyvett och kvartskyvett vid olika våglängder.
Våglängd Abs Abs Abs
(nm) plastkyvett glaskyvett kvartskyvett
200 3,381 3,344 0,696
205 3,584 3,536 0,494
210 3,708 3,489 0,398
215 3,562 3,386 0,315
220 3,615 3,534 0,266
225 3,587 3,653 0,239
230 3,871 3,7 0,212
235 3,671 3,486 0,17
240 3,601 3,488 0,13
245 3,643 3,676 0,105
250 3,913 3,703 0,099
255 3,91 3,645 0,068
260 4,024 3,638 0,066
265 3,913 3,548 0,064
270 3,708 3,578 0,065
275 3,752 3,452 0,064
280 3,537 3,345 0,06
285 3,453 2,79 0,06
290 2,289 1,924 0,057
295 1,532 1,278 0,056
300 0,91 0,86 0,056
305 0,725 0,577 0,057
310 0,633 0,385 0,051
315 0,578 0,264 0,05
320 0,536 0,19 0,048
325 0,501 0,136 0,049
330 0,472 0,102 0,049
335 0,446 0,08 0,048
340 0,421 0,069 0,049
345 0,402 0,06 0,048
350 0,385 0,053 0,048

2)
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
200 220 240 260 280 300 320 340
Figur 1. Visar absorption som funktion av våglängden för de olika kyvettyperna.
Abs
plastkyvett
Abs
glaskyvett
Abs
kvartskyvett
3)
Kvartskyvetten går att använda i nästan hela våglängdsspektrat som undersöktes. Möjligtvis
att den absorberar lite för mycket i sig själv vid våglängderna mellan 200 och 250 nm.
Plastkyvetten och glaskyvetten däremot, som följdes åt ganska bra, absorberade väldigt
mycket i sig själv från 200 nm till cirka 280 nm. Därefter skedde en kraftig minskning av
absorbansen. Dock var absorbansvärdena nere under 0,5 först vid våglängden 305 nm
(glaskyvett) respektive 330 nm (plastkyvett). Skulle man fortsätta mätningen upp på längre
våglängder ser det ut som att både glas- och plastkyvetten skulle komma ner närmare noll i
absorbansvärde. Alltså lämpar sig plast- och glaskyvetter bäst vid absorbansmätningar över
cirka 300 nm.
Moment II: Våglängdsscanning med U1100
1)
Tabell 2. Uppmätta absorbansvärden för proteinlösning vid olika
våglängder efter blank med H20 respektive Bio-Rad
Abs prov med Abs prov med
Våglängd H2O som Bio-Rad som
(nm)
blank
blank
400 0,561 -0,096
410 0,605 -0,113
420 0,681 -0,137
430 0,766 -0,167
440 0,84 -0,193
450 0,89 -0,213
460 0,915 -0,224
470 0,918 -0,227
480 0,899 -0,221
490 0,866 -0,208
500 0,823 -0,182
510 0,785 -0,146

2)
absorbans
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,4
520 0,758 -0,091
530 0,755 -0,012
540 0,783 -0,095
550 0,834 0,214
560 0,884 0,32
570 0,919 0,396
580 0,938 0,44
590 0,947 0,459
600 0,956 0,457
610 0,967 0,442
620 0,985 0,417
630 1,001 0,384
640 1,003 0,349
650 0,982 0,314
660 0,931 0,281
670 0,853 0,252
680 0,751 0,226
690 0,641 0,205
700 0,527 0,184
710 0,422 0,164
720 0,33 0,144
730 0,255 0,125
740 0,194 0,105
750 0,15 0,091
-0,2400
500 600 700
våglängd (nm)
Abs prov med H2O
som blank
Abs prov med Bio-Rad
som blank
Figur 2. Visar absorptionen som funktion av våglängden för mätningarna av provet
med H2O resp. Bio-Rad som blank.
3)
Absorbansmätning av proteinlösningar blandade med Bio-Rad bör mätas vid cirka 600 nm
eftersom båda graferna uppvisar höga absorbansvärden där. Anledningen till att grafen som är
blankad med H2O uppvisar så mycket högre absorbansvärden än den andra grafen är att den
även visar Bio-Rads absorbans i provlösningen. Därför är den övre grafen ej användbar när
man vill räkna ut proteinkoncentrationen i provet. Grafen som är blankad med Bio-Rad visar
däremot endast proteinets absorbans och kan därför användas vid beräkning av proteinets
koncentration i provet. Vid våglängder mellan 400 nm och 540 nm absorberar provlösningen

lankad med Bio-Rad mindre ljus än blanklösningen vilket ger negativa absorbansvärden.
Därav grafens utseende.
Metod III : Val av våglängdsfilter
1)
Tabell 3. De färgade lösningarnas absorbansvärde
vid 405 nm.
Absorbans vad 405 nm
grön blå röd gul
prov lösning lösning lösning lösning
1 0,225 0,17 0,064 0,157
2 0,222 0,172 0,063 0,161
3 0,226 0,169 0,06 0,156
4 0,228 0,171 0,066 0,157
5 0,23 0,173 0,065 0,169
6 0,225 0,17 0,062 0,155
7 0,226 0,173 0,066 0,156
8 0,226 0,173 0,062 0,158
9 0,229 0,175 0,064 0,157
10 0,229 0,171 0,063 0,156
medel 0,227 0,172 0,064 0,158
median 0,226 0,172 0,064 0,157
std 0,0024 0,0018 0,0019 0,0041
Tabell 4. De färgade lösningarnas absorbansvärde
vid 450 nm.
Absorbans vad 450 nm
grön blå röd gul
prov lösning lösning lösning lösning
1 0,198 0,067 0,188 0,14
2 0,198 0,068 0,188 0,142
3 0,202 0,068 0,188 0,147
4 0,203 0,068 0,186 0,142
5 0,203 0,068 0,187 0,142
6 0,202 0,068 0,187 0,14
7 0,202 0,068 0,188 0,14
8 0,203 0,068 0,187 0,14
9 0,203 0,068 0,188 0,14
10 0,204 0,068 0,188 0,138
medel 0,202 0,068 0,188 0,141
median 0,203 0,068 0,188 0,140
std 0,0021 0,0003 0,188 0,138

Tabell 5. De färgade lösningarnas absorbansvärde
vid 492 nm.
Absorbans vad 492 nm
grön blå röd gul
prov lösning lösning lösning lösning
1 0,104 0,19 0,561 0,058
2 0,105 0,193 0,563 0,058
3 0,106 0,194 0,561 0,058
4 0,107 0,193 0,564 0,058
5 0,107 0,196 0,56 0,058
6 0,107 0,195 0,56 0,058
7 0,106 0,194 0,562 0,058
8 0,107 0,194 0,559 0,058
9 0,107 0,194 0,561 0,057
10 0,107 0,194 0,561 0,057
medel 0,106 0,194 0,561 0,058
median 0,107 0,194 0,561 0,058
std 0,0011 0,0016 0,0015 0,0004
Tabell 6. De färgade lösningarnas absorbansvärde
vid 540 nm.
Absorbans vad 540 nm
grön blå röd gul
prov lösning lösning lösning lösning
1 0,061 0,519 0,59 0,008
2 0,061 0,524 0,593 0,007
3 0,062 0,52 0,59 0,007
4 0,064 0,519 0,595 0,007
5 0,063 0,527 0,589 0,007
6 0,063 0,524 0,59 0,007
7 0,063 0,522 0,592 0,007
8 0,063 0,523 0,59 0,007
9 0,063 0,522 0,59 0,007
10 0,063 0,523 0,592 0,007
medel 0,063 0,522 0,591 0,007
median 0,063 0,522 0,590 0,007
std 0,0009 0,0025 0,0019 0,0003
2) Se under respektive tabell
3) Vi bedömer att vi inte har några extremvärden som behöver testas med Q-test.

4)
absorbans
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Medelvärde
vid 405 nm
Medelvärde
vid 450 nm
Medelvärde
vid 492 nm
Medelvärde
vid 540 nm
grön lösning
blå lösning
röd lösning
gul lösning
Figur 3. Diagrammet visar medelvärdet av de olika färglösningarnas absorbans vid de
olika våglängderna.
Den gröna lösningen bör mätas vid 405 nm eftersom den uppvisar högst absorbans då. Dess
absorbans minskar sedan med ökande våglängd. Den blå lösningen skall mätas vid 540 nm.
Absorbansen där är betydligt högre än vid de andra våglängderna. Absorbansen vid de olika
våglängderna följer inget tydligt mönster. Den röda lösningen kan mätas vid 492 nm eller
540 nm, men har lite högre absorbans vid 540 nm. Absorbansen vid de här våglängderna är
betydligt högre än vid 405 nm och 450 nm. Den gula lösningen bör mätas vid 405 nm men har
relativt låga absorbansvärden vid alla fyra våglängderna.