Н.И. Калинина

Стромальные клетки
жировой ткани :
перспективы использования в
медицине
Калинина Н.И., ., Рубина К.А., ., Сысоева В.Ю., .,
Цоколаева З.И., ., Ефименко А.Ю., ., Трактуев Д.О., .,
Марч К.Л., ., Чаусская И.Ю, Дробышев А.Ю., .,
Парфенова Е.В., ., Ткачук В.А.
Факультет фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова
Российский кардиологический научный центр
Московский государственный медико-стоматологический университет
ООО «Генная и клеточная терапия»
Университет Индианы, США
1

Жировая ткань – доступный источник
прогениторных клеток
Нервная ткань
Трансплантация в
поврежденный орган
Миокард
Сосуды
жировая
ткань
выделение клеток
многократное увеличение
числа клеток
2

Выделение стромальных клеток из жировой ткани
Жировая ткань
Ферментативная обработка
Разделение на фракции
Лизис эритроцитов в осадке
Осадочная фракция:
клетки стромы, сосудов,
лейкоциты, эритроциты
Фильтрация
Осаждение
Культивирование
через 2 дня после выделения
3

Свежевыделенные СКЖТ содержат
прогениторные клетки
83,8%
11,4%
1,6%
34,6%
1,4%
0,4%
Зеленый – изотипический контроль; красный – антитела
4

Cтромальные клетки жировой ткани
обладают пластичностью
Кардиомиоциты
Эндотелий
(Planat-Benard, et al 2004)
Нейроны и глия
(Yang et al, 2004)
Гепатоциты
(M. Seo et al, 2005)
β-клетки
поджелудочной железы
(Timper et al, 2006)
СКЖТ
Хондроциты
Остеобласты
Адипоциты
(Zuk et al, 2002)
Использование в реконструктивной хирургии
5

Развитие сосудистой сети под влиянием СКЖТ
Контроль bFGF СКЖТ человека
100 мкм 100 мкм 100 мкм
ОкрасканаСD31 мыши
6

Введение стромальных клеток жировой ткани
стимулирует восстановление кровотока
Количество сосудов
2.5
p

Введение СКЖТ после инфаркта
миокарда улучшает функцию сердца
СКЖТ в периинфарктной зоне сердца
крысы через 7 дней после введения
Фракция выброса левого желудочка
(ЭХОКГ) через 1 месяц после ИМ у крыс
% ФВ
60
p< 0,01
40
20
- СКЖТ, меченные DAPI
0
Контроль
СКЖТ
Облученные
СКЖТ
8

Формирование капилляро-подобных структур в
культуре кардиомиоцитов
CD31
5.0
Колтчество капилляроподобных
структур
2.5
0.0
1день 3 день 5 день
9

СКЖТ стабилизируют капилляро-подобные
структуры в культуре кардиомиоцитов
Количество сосудов в поле
зрения
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Количество сосудов через 8 дней
культивирования
СКЖТ КМЦ КМЦ
+
СКЖТ
*
КМЦ
+
Конд.
среда
50мкм
CD31
10

СКЖТ стимулируют формрование капилляроподобных
структур в культуре кардиомиоцитов
не содержащей зрелых сосудистых клеток
Количество сосудов в поле зрения
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Количество сосудов через 8 дней
культивирования
СКЖТ КМЦ КМЦ
+
СКЖТ
КМЦ
+
Конд.
среда
КМЦ
+
mitC
СКЖТ
депл. обогащ.
КМЦ КМЦ
+ +
СКЖТ СКЖТ
2%

СКЖТ стимулируют рост кровеносных сосудов
Активация эндотелиальных клеток:
продукция ангиогенных и подавляющих апоптоз
факторов роста (VEGF,
bFGF, , HGF, TGFβ)
Стабилизация формирующихся сосудов:
взаимодействие перицитов с
растущими сосудами
Cтимуляция дифференцировки:
резидентных прогениторных клеток
Использование для восстановления кровоснабжения тканей
12

Проблемы клеточной терапии
• Гибель трансплантированных клеток
• Трансплантация на носителях
• Обработка клеток перед трансплантацией
• Перенос инфекций животных
• Иммунная реакция на белки животных
• Использование собственной сыворотки
крови пациента
• Использование синтетических
заместителей сыворотки
13

Аутологичная сыворотка стимулирует
пролиферацию СКЖТ
14
Митотический индекс %
(на 1000 клеток)
Апоптотический индекс %
(на 1000 клеток)
5,68
2,09
4,12
1,69
3,5
1,26
Аутологическая
сыворотка
Аллогенная
Сыворотка
Среда с
синтетическими
добавками
Аутологическая
сыворотка
Аллогенная
Сыворотка
Среда с
синтетическими
добавками

Гипоксия стимулирует
пролиферацию СКЖТ человека
Прирост клеток
+150
+100
+50
%
р

Гипоксия стимулирует экспрессию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
160
мРНК, ПЦР в реальном времени
140
Относительные единицы
120
100
80
60
40
20
0
СКЖТ нормоксия
(21%
О2)
VEGF HGF c-met PLGF FGF2CD34 Ang1TGF-β1GM-CSF
*
* * *
СКЖТ гипоксия
(1%
О2)
VEGF HGF c-met PLGF FGF2CD34 Ang1TGF-β1GM-CSF
16

Гипоксия стимулирует секрецию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
Фактор роста , нг/ 10 6 клеток, ELISA
50
40
30
20
10
p

Кондиционированная среда СКЖТ, культивированных в
условиях гипоксии, стимулирует образование
капилляроподобных структур
СКЖТ
Кондиц.
среда
Эндотел.
клетки
Формирование
трубочек на
Матригеле
0% FBS
normASC
A
20% FBS
hypASC
Суммарная длина трубочек, мкм
B
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
*
0%FBS 20%FBS normASC hypASC
p

СКЖТ, культивированные в условиях гипоксии
стимулируют васкуляризацию имплантатов Матригеля
- контроль норм СКЖТ гип СКЖТ
A Б В
Г
CD31 (зеленый)
Д
20 μm 20 μm 20 μm
NG2 (красный)
Е
19

СКЖТ, культивированные в условиях гипоксии
стимулируют рост кровеносных сосудов
Капилляры
Количество сосудов / площадь
среза (DAPI)
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
p

Носители позволяют повысить
эффективность трансплантации СКЖТ
коллапан
гидроксиапатит
21

Ближайшие перспективы применения СКЖТ
в медицине
На пленках и носителях
для лечения язв,
восстановления костной
ткани
Раневые повязки
Культивирование
на аутологичной
сыворотке
Инкубация в
условиях гипоксии
перед
трансплантацией
протезов сосудов
Восстановление
кровоснабжения
ишемизированных
тканей
22

Спасибо за внимание !
23

Культивированные СКЖТ более эффективно
стимулируют рост капилляров по сравнению
со свежевыделенными клетками
24

26
CD73- CD49a+ sort
CD73+ CD49a- sort

Гипоксия стимулирует продукцию
про-ангиогенных факторов СКЖТ
%, mRNA
700
600
Р