NA 2007B.pdf

● 分 子 構 造 :
核 酸
N1
核 苷 酸 核 酸 雙 螺 旋 三 級 構 造 Palindrome
質 體 RNA 基 因 表 現 N2
● 功 能 性 質 :
N3
參 加 重 要 生 理 功 能 Central Dogma 變 性 與 復 性
鹼 基 組 成 的 影 響 雜 合 反 應 Intron 與 exon
● 研 究 技 術 :
N4
核 酸 之 純 化 限 制 脢 核 酸 轉 印 法 基 因 操 作
基 因 庫 建 構 PCR DNA 定 序 定 點 突 變 RFLP
核 酸 是 細 胞 內 的 巨 分 子 之 一 , 分 成 DNA ( 去 氧 核 糖 核 酸 ) 及 RNA ( 核 糖 核 酸 ) 兩 大 類 , 是 由 核
苷 酸 的 小 單 位 分 子 所 組 成 。 同 樣 的 , 核 酸 部 份 也 是 先 說 明 其 分 子 構 造 後 , 再 以 構 造 為 基 礎 ,
來 認 識 其 種 種 生 理 性 質 。
學 習 核 酸 的 構 造 , 要 清 楚 辨 別 核 酸 巨 分 子 , 是 如 何 以 單 位 小 分 子 連 接 起 來 , 兩 條 DNA 分 子 如
何 配 對 成 為 雙 螺 旋 鏈 。 這 幾 乎 是 所 有 生 命 現 象 的 核 心 , 在 五 十 年 前 Watson 及 Crick 發 現 雙 螺
旋 的 構 造 , 同 時 也 開 啟 了 分 子 生 物 學 的 研 究 。 目 前 我 們 只 能 簡 短 說 明 核 酸 的 構 造 與 一 般 性
質 , 至 於 圍 繞 著 Central Dogma 所 發 生 的 種 種 分 子 遺 傳 學 知 識 , 只 能 留 待 分 子 生 物 學 中 講 述 。
雖 然 如 此 , 我 們 還 是 把 基 因 操 作 的 一 些 基 本 方 法 與 原 理 , 在 適 當 的 段 落 , 做 精 要 說 明 。
希 望 同 學 在 這 段 課 程 打 下 良 好 基 礎 , 以 便 未 來 面 對 種 種 複 雜 的 分 子 生 物 學 問 題 時 , 能 夠 清 楚
地 對 應 ( 當 你 搞 不 清 楚 5‘ 及 3’, 或 不 知 何 為 sense 何 為 anti-sense, 那 就 粉 慘 的 啦 )。
N1-1

象 形 文 字
核 苷 酸
鹼 基 五 碳 糖 磷 酸
Juang RH (2007) BCbasics
核 苷 酸 這 三 個 字 有 點 像 象 形 文 字 。 因 為 它 剛 好 指 出 了 nucleotide 單 位 分 子 中 的 三 個 主 要 部
分 : 鹼 基 、 五 碳 糖 、 磷 酸 。 當 核 苷 酸 去 掉 磷 酸 時 , 中 文 直 接 變 成 核 苷 , 英 文 則 改 了 一 個 字 母
成 為 nucleoside, 見 次 頁 的 構 造 說 明 。
N1-2

核 苷 酸 的 基 本 構 造
Acid
磷 酸
Monophosphate
Diphosphate
Triphosphate
5’
4’
3’
Sugar
五 環 糖
Ribose (-OH),
Deoxyribose (-H)
Base
鹼 基
Adenine
Guanine
Thymine
Cytosine
Uracil
Purine
Pyrimidine
核 苷
核 苷 酸 Nucleoside (Adenosine)
Nucleotide (Adenosine monophosphate, AMP)
1’
2’
Juang RH (2007) BCbasics
核 苷 酸 是 由 三 部 份 構 造 所 組 成 , 每 一 部 份 又 有 數 種 選 擇 ; 例 如 五 碳 糖 部 分 , 可 能 是 核 糖
(ribose) 或 是 去 氧 核 糖 (deoxyribose), 此 種 差 別 造 成 了 DNA 與 RNA 在 性 質 與 構 造 上 的 不 同 。
我 們 所 常 見 的 ATP 分 子 , 是 含 有 核 糖 , 若 核 糖 改 成 去 氧 核 糖 , 則 寫 成 dATP。 上 圖 只 是 畫 出
大 略 的 構 造 關 係 , 請 自 行 在 課 本 上 找 出 確 實 的 分 子 構 造 , 要 能 自 己 默 寫 出 詳 細 構 造 才 可 以 ;
尤 其 各 種 鹼 基 之 間 , 以 氫 鍵 連 結 的 配 對 情 形 , 一 定 要 十 分 清 楚 。 生 命 的 奧 祕 , 幾 乎 盡 藏 於
此 。
DNA 與 RNA 所 使 用 的 鹼 基 幾 乎 一 樣 ..DNA 用 ATCG,RNA 用 AUCG, 只 有 T, U 不 同 , 而 T 與 U 在 構 造 上 也
很 相 似 , 都 能 夠 與 A 配 對 。
■ 請 自 己 列 一 張 表 , 慢 慢 整 理 出 RNA 與 DNA 在 構 造 與 功 能 上 的 異 同 點 。
N1-3

分 子 扁 平 可 緊 密 堆 疊
單 環 與 雙 環 配 對
密 實
配 對
防 水
不 溶 於 水 可 穩 定 貯 藏
四 種 鹼 基
牛 頓 (1985) no. 25 p. 74
為 何 自 然 界 會 選 用 這 幾 種 鹼 基 作 為 遺 傳 密 碼 ? 可 能 有 幾 個 理 由 ..
(1) 鹼 基 分 子 扁 平 , 可 以 緊 密 堆 疊 在 雙 螺 旋 長 鏈 中 。
(2) 鹼 基 一 類 為 單 環 , 一 類 為 雙 環 , 單 環 配 雙 環 成 一 鹼 基 對 , 不 易 弄 錯 。
(3) 鹼 基 分 子 相 當 疏 水 性 , 藏 在 兩 股 磷 酸 長 鏈 中 , 可 保 安 定 。
絕 對 還 有 其 他 理 由 , 可 以 自 己 再 思 索 。
■ 上 圖 各 種 鹼 基 的 構 造 , 其 氫 原 子 與 雙 鍵 位 置 並 沒 有 畫 得 很 清 楚 , 請 自 行 參 考 課 本 上 的 構 造 , 把 四 種 鹼 基 與 兩
種 配 對 的 氫 鍵 仔 細 畫 好 。
N1-4

-
PO 4
2-
O
O-P=O
O
核 苷 酸 以 磷 酯 鍵 連 結 成 長 鏈 核 酸
5’
3’
1
OH
PO 4
2-
Phosphodiester bond
5’
2
3’ OH
5’
P
R
1
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
2
3
4
3’
5
6
是
一
種
磷
酸
多
醣
Juang RH (2007) BCbasics
兩 個 核 苷 酸 之 間 , 前 一 個 (1) 以 3‘-OH 與 次 一 個 (2) 的 5’- 磷 酸 進 行 脫 水 反 應 , 連 結 形 成 磷 酸
二 酯 鍵 (phosphodiester bond)。 如 此 一 直 連 接 下 去 , 就 成 為 核 酸 的 長 鏈 。 但 最 後 有 一 個 磷 酸 及
一 個 -OH 基 是 不 被 作 用 的 , 因 此 核 酸 的 長 鏈 具 有 方 向 性 , 可 寫 成 5’-P → 3’-OH 兩 端 , 就 像 蛋
白 質 有 N- 端 及 C- 端 一 樣 。
又 如 同 蛋 白 質 的 N-C-C-N-C-C-N-C 骨 架 , 核 酸 長 鏈 也 有 分 子 脊 骨 , 它 是 以 磷 酸 - 核 糖 輪 流 出 現
的 P-R-P-R-P-R 骨 架 , 所 有 的 核 酸 都 一 樣 , 是 屬 constant 的 部 份 ; 同 時 在 核 糖 分 子 上 一 個 個 加
上 各 種 鹼 基 , 組 成 特 定 的 核 酸 序 列 , 是 variable 的 部 份 。
N1-5

核 酸 長 鏈 紀 錄 方 式 之 演 進
A T C G A T C G
5’ 3’
P
OH
B
R
P
5’
1’
2’
3’
5’ pApTpCpGpApTpCpG-OH 3’
5’ pATCGATCG-OH 3’
ATCGATCG
Juang RH (2007) BCbasics
核 酸 巨 分 子 長 鏈 的 記 錄 法 , 當 然 不 能 每 次 都 把 整 個 構 造 寫 出 來 。 方 便 的 筆 記 法 是 把 核 糖 變 成
一 直 線 (R), 從 上 到 下 分 別 是 1’ → 5’, 而 1’ 接 有 鹼 基 (B),5’ 接 有 磷 酸 (P); 各 核 苷 酸 間 以 斜
線 表 示 磷 酸 二 酯 鍵 。
後 來 覺 得 這 樣 還 是 很 麻 煩 , 就 省 去 直 線 及 斜 線 , 以 p 代 替 雙 磷 酯 鍵 , 只 留 下 各 個 不 同 的 鹼 基
序 列 , 最 後 又 去 掉 鹼 基 間 的 p; 有 時 特 別 標 出 5’ 及 3’ 端 , 以 作 為 提 醒 , 因 為 核 酸 的 方 向 性 極
為 重 要 。 到 最 後 , 只 剩 下 鹼 基 排 列 。
N1-6

兩 股 核 酸 的 方 向 相 反
5’ 3’
5’ pApTpCpGpApTpCpG-OH 3’
5’ pCpGpApTpCpGpApT-OH 3’
3’ 5’
Juang RH (2007) BCbasics
兩 條 DNA 核 酸 配 對 在 一 起 時 , 其 5’-3’ 方 向 剛 好 相 反 ; 有 點 像 馬 路 有 來 回 兩 向 的 車 道 一 樣 。
這 兩 股 DNA 互 相 捲 繞 成 為 有 名 的 雙 螺 旋 構 造 。 這 種 方 向 性 , 對 核 酸 的 複 製 及 轉 錄 很 重 要 , 因
為 這 些 活 動 都 有 一 定 方 向 。
N1-7

DNA 以 核 苷 酸 小 單 位 連 結 成 長 條 巨 分 子
(1) Purine = Pyrimidine (2) Helical structure (3) Hydrogen bonding
T
A
兩 股 DNA 間 的 密 碼 互 補
C
G
牛 頓 (2000) no. 201 p. 36
A=T 與 C≡G 間 是 以 氫 鍵 連 結 , 其 立 體 的 分 子 構 造 , 在 很 多 書 上 都 有 。
雙 螺 旋 是 由 Watson 與 Crick 在 劍 橋 大 學 發 現 的 , 他 們 根 據 所 收 集 的 研 究 資 料 , 即 推 出 DNA 的
雙 螺 旋 構 造 。 這 些 資 料 如 下 :
(1) DNA 是 遺 傳 物 質 , 其 所 含 鹼 基 當 中 ,A 的 含 量 等 於 T,C 等 於 G (Chargaff Rule)。
(2) 由 X 光 繞 射 分 析 結 果 得 知 ,DNA 是 螺 旋 狀 , 含 有 兩 條 磷 酸 脊 骨 ; 並 且 得 知 許 多 有 關 DNA
分 子 空 間 排 列 的 數 據 。
(3) A 與 T 之 間 可 以 用 兩 個 氫 鍵 結 合 ,C 與 G 之 間 有 三 個 氫 鍵 。
N1-8

每 一 鹼 基 配 對 有 如 階 梯 的 一 層
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.195
雙 螺 旋 分 子 有 點 像 扭 曲 的 樓 梯 , 而 A=T 與 C≡G 就 是 水 平 的 踏 板 , 一 階 一 階 排 列 在 兩 條 磷
酸 脊 骨 之 間 。 請 注 意 扁 平 的 鹼 基 配 對 , 可 以 很 經 濟 地 堆 疊 在 兩 股 核 酸 之 間 , 每 一 單 糖 分 子 都
與 鹼 基 垂 直 , 而 磷 酸 則 裸 露 在 外 側 。 再 強 調 一 次 , 兩 股 分 子 的 方 向 相 反 ( 箭 頭 )。
N1-9

解 出 DNA 構 造 的 二 人 組
Darnell et al (1990) Molecular Cell Biology (2e) p.11
1962
F Crick
JD Watson
1953 Cambridge
Judson (1996) The Eighth Day of Creation
雙 螺 旋 的 整 個 發 現 過 程 充 滿 戲 劇 性 ,Watson 把 它 寫 成 偵 探 小 說 般 的 Double Helix, 出 版 後 雖
然 爭 議 不 斷 , 但 也 可 描 繪 出 這 個 世 紀 大 發 現 的 驚 險 過 程 。
Watson 的 行 事 風 格 一 向 怪 異 , 有 自 己 的 想 法 與 強 烈 個 性 。 後 來 長 久 主 掌 有 名 的 冷 泉 港 實 驗 室
(Cold Spring Harbor Laboratory), 並 且 推 動 人 類 基 因 體 計 畫 , 相 當 活 躍 。 他 有 幾 本 著 名 的 教 科
書 , 其 中 Molecular biology of the gene (2003, 5th ed) 及 Molecular biology of the cell (2002 4th
ed), 都 是 很 重 要 的 經 典 著 作 。
Crick 是 英 國 人 , 後 來 則 轉 到 美 國 , 主 持 加 州 聖 地 亞 哥 的 Salk Institute, 主 要 以 分 子 層 次 及 細
胞 機 制 , 探 討 人 類 的 思 考 與 意 識 問 題 。
N1-10

雙 螺 旋 有 A, B, Z 三 種 形 式
A DNA B DNA Z DNA
Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.366
Watson 與 Crick 所 發 現 的 雙 螺 旋 , 是 稱 為 B 型 的 水 結 合 型 DNA, 在 細 胞 中 最 為 常 見 。 另 外
也 有 A 型 及 Z 型 兩 種 。Z 型 DNA 早 期 是 實 驗 室 中 的 人 工 產 物 , 當 GC 配 對 重 複 較 多 的 片 段 容
易 產 生 ; 最 近 發 現 細 胞 中 可 能 也 有 存 在 , 也 許 可 調 節 基 因 的 表 現 或 重 組 。
N1-11

核
酸
二
級
構
造
的
特
徵
Small groove
5’
4
5
1
2
3
6
7
3’
36 Å
Large groove
8
9
10
1 Twist = 10.5 bp
5’
3’
Juang RH (2007) BCbasics
雙 螺 旋 是 一 條 雙 股 重 複 扭 曲 的 螺 旋 鏈 , 其 重 複 出 現 的 單 位 如 上 圖 所 示 ; 以 常 見 的 B 型 DNA
而 言 , 每 10.5 bp 形 成 一 個 扭 曲 單 位 , 長 度 3.6 nm; 注 意 每 一 個 扭 曲 單 位 中 ,DNA 的 一 股 會
交 過 另 一 股 一 次 。 因 為 分 子 的 扭 曲 並 非 對 稱 , 因 此 分 子 表 面 會 形 成 大 小 凹 谷 , 這 些 凹 谷 對 核
酸 與 蛋 白 質 的 相 互 作 用 關 係 , 有 很 大 的 貢 獻 。
同 時 因 為 磷 酸 脊 骨 露 在 外 面 , 因 此 核 酸 的 外 側 有 相 當 大 的 負 電 聚 集 。 若 把 DNA 溶 在 純 水 裡 ,
則 兩 股 磷 酸 脊 骨 會 互 相 排 斥 , 造 成 DNA 的 兩 股 分 開 而 變 性 沈 澱 , 故 DNA 都 要 溶 在 含 有 陽 離
子 的 緩 衝 溶 液 中 (TE buffer)。
N1-12

染
色
體
緊
密
包
裹
核
酸
核 酸 緊 密 纏 繞 在 histone 上 面
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.980
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.230
在 真 核 細 胞 中 ,DNA 捲 繞 在 帶 有 強 正 電 的 蛋 白 質 上 ( 如 histone), 除 了 抵 消 負 電 性 外 , 還 有 利
於 DNA 的 包 裝 , 以 便 容 納 在 細 胞 核 的 有 限 空 間 中 。 這 種 包 裝 方 式 , 在 真 核 細 胞 的 染 色 體 中 ,
有 極 為 複 雜 的 組 織 與 控 制 。
N1-13

核
酸
骨
架
的
自
由
度
比
蛋
白
質
高
但 是 DNA 有 雙 股
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.337
雙 螺 旋 的 磷 酸 脊 骨 , 雖 然 比 起 蛋 白 質 長 鏈 有 較 大 的 彈 性 , 可 以 較 為 自 由 地 活 動 , 但 仍 有 一 定
的 限 制 。 因 此 , 整 條 雙 螺 旋 分 子 並 不 能 很 自 由 地 平 攤 成 一 直 線 , 會 以 雙 螺 旋 為 軸 心 再 度 捲
繞 , 稱 為 超 捲 曲 (supercoil) 的 構 造 。
N1-14

兩 股 核 酸 捲 繞 仍 有 立 體 限 制
用 毛 巾 也 可 以 觀 察 超 捲 曲 之 螺 旋 構 造
Supercoil 超 捲 曲 (Writhing)
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.917
雙 螺 旋 的 實 際 構 造 可 用 橡 皮 圈 做 簡 單 的 模 型 .. 把 兩 股 橡 皮 筋 捲 繞 作 成 雙 螺 旋 的 樣 子 , 若 把 捲
繞 的 程 度 加 大 , 則 這 條 雙 股 橡 皮 筋 會 再 度 捲 繞 起 來 , 成 為 超 捲 曲 ( 下 圖 )。
你 也 可 以 用 毛 巾 做 實 驗 , 先 把 一 條 毛 巾 捲 起 來 , 好 像 一 條 雙 螺 旋 , 但 不 要 捲 太 緊 , 適 度 即
可 。 然 後 , 握 住 兩 頭 , 試 著 再 度 把 這 條 毛 巾 再 捲 繞 幾 圈 , 則 毛 巾 就 會 繞 成 超 捲 曲 。 這 樣 做 出
來 的 毛 巾 雙 螺 旋 , 也 可 以 顯 示 出 DNA 的 (+) 超 捲 曲 或 (-) 超 捲 曲 (N1-17), 完 全 取 決 於 再 度 捲
繞 時 的 方 向 ; 這 很 不 容 易 以 文 字 說 明 , 請 在 課 堂 上 看 示 範 。 可 以 的 話 , 請 自 己 帶 一 條 毛 巾 來
上 課 , 邊 看 示 範 邊 練 習 。
N1-15

控
制
核
酸
三
級
構
造
的
基
本
元
素
T
Twist
L
L = T + W
Writhing
Linking
1 Twist = 10.5 bp
DNA 之 超 捲 曲 構 造 可 用 數 學 描 述
Juang RH (2007) BCbasics
超 捲 曲 的 數 目 (W), 與 其 所 含 鹼 基 長 度 及 扭 曲 數 目 (T) 有 關 , 可 用 L = T + W 表 示 之 ; 也 請
參 考 下 頁 的 例 子 。
在 最 穩 定 的 狀 況 下 , 每 一 個 單 位 扭 曲 (T) 含 有 10.5 對 鹼 基 , 請 記 住 10.5 這 個 魔 術 數 字 。 而
Linking (L) 是 以 兩 股 中 的 一 股 為 主 , 當 這 股 跨 過 另 一 股 一 次 時 , 就 會 產 生 一 個 Linking
number; 因 此 像 上 圖 含 有 10.5 個 鹼 基 對 , 紅 色 那 股 跨 過 藍 色 股 一 次 , 就 有 一 個 Linking ( 但 上
下 兩 端 的 交 點 , 因 為 是 藍 色 股 跨 過 紅 色 股 , 因 此 不 計 )。
若 核 酸 的 序 列 為 一 級 構 造 , 則 雙 螺 旋 為 二 級 構 造 , 超 捲 曲 則 是 其 三 級 構 造 。 請 注 意 凡 是 螺 旋
構 造 都 會 有 左 手 或 右 手 旋 之 分 別 , 而 兩 者 有 點 像 是 鏡 像 物 ; 一 般 的 DNA 都 是 右 手 旋 的 , 請 見
上 圖 。 老 實 說 , 螺 旋 的 左 右 手 旋 構 造 , 很 難 說 明 , 請 自 行 看 圖 辨 認 。
N1-16

核 酸 的 三 級 構 造 說 明 實 例
105 bp = 10 Twists (T = 10) 11.6 bp = 1 Twist
Unwind
one turn
L = 9
T = 9
W = 0
Close circle
L 先 減 為 9
L = 9
T = 9
W = 0
L = 10
T = 10
W = 0
Turn once
(9 = 10 -1)
L = T + W
L = 9
T = 10
W = -1
L = 9
T = 10
W = -1
Close circle
Equivalent
topologically
T 一 直 保 持 10
10.5 bp = 1 Twist
Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.733
超 捲 曲 之 目 的 是 想 把 核 酸 擠 到 擁 擠 的 細 胞 核 內 : 如 何 把 兩 股 DNA 再 捲 繞 成 更 緊 密 的 構 造 ,
但 又 不 會 增 加 DNA 分 子 構 造 內 的 緊 張 度 。
DNA 分 子 是 右 手 旋 的 螺 旋 狀 , 超 捲 曲 是 整 條 核 酸 螺 旋 再 度 捲 繞 , 這 種 二 次 捲 繞 稱 writhing
(W)。 若 沒 有 超 捲 曲 , 則 DNA 就 不 會 有 writhing, 在 數 學 上 就 是 W = 0。 通 常 一 條 線 性 DNA
兩 端 自 由 開 放 時 , 都 不 會 有 超 捲 曲 , 而 其 最 穩 定 構 造 就 是 每 10.5 鹼 基 對 繞 一 圈 ; 一 條 105 鹼
基 對 的 核 酸 有 10 個 單 位 , 因 此 T 與 L 都 是 10, 上 面 的 L = T + W 公 式 寫 成 10 = 10 + 0。 天 下
太 平 , 一 切 沒 事 ( 上 圖 最 左 邊 )。 注 意 T 儘 量 保 持 為 10, 以 便 讓 每 圈 的 鹼 基 對 數 目 為 10.5 ( 魔 術
數 字 )。 但 這 樣 的 核 酸 太 鬆 散 , 整 體 體 積 很 龐 大 。
因 此 , 若 要 把 DNA 擠 入 細 胞 核 內 , 一 定 要 再 度 捲 繞 起 來 , 勢 必 造 成 DNA 分 子 的 緊 張 。 而 整
條 DNA 分 子 再 度 捲 繞 的 方 向 有 兩 種 , 一 種 是 如 上 圖 下 排 的 中 圖 , 長 條 核 酸 分 子 捲 成 圓 圈 , 且
由 此 圓 圈 之 下 方 繞 過 , 這 種 往 下 的 繞 法 稱 為 negative supercoil,W 記 為 -1 ( 因 此 9 = 10 - 1)。 反
之 , 若 繞 到 圓 圈 的 上 方 , 則 為 positive supercoil (W = 1, 則 L = 11, 因 為 11 = 10 + 1)。Negative
supercoil 等 於 雙 螺 旋 鬆 開 一 圈 , 然 而 T 仍 為 10, 維 持 每 圈 10.5 鹼 基 。
Negative supercoil 超 捲 曲 的 繞 法 , 等 於 先 把 長 條 核 酸 先 解 開 一 圈 (L = T = 9 即 9 = 9 + 0), 然 後
頭 尾 連 接 起 來 ( 上 排 兩 圖 ); 這 樣 的 環 形 DNA 會 自 動 以 negative supercoil 再 轉 一 圈 , 變 成 9 =
10 - 1 的 超 捲 曲 ,T 保 持 為 10, 也 就 是 每 單 位 有 10.5 對 鹼 基 , 最 為 安 定 。 如 此 ,DNA 有 了 超
捲 曲 , 可 以 擠 入 細 胞 核 , 而 其 分 子 構 造 也 不 會 太 緊 張 。
N1-17

Palindrome, Restriction Enzyme, Sticky Ends
Arber, Nathans, Smith (1978)
CIVIC, Madam
Sticky Ends
(Cohesive Ends)
GAATTC
G
AATTC
G
AATTC
GAATTC
EcoRI
GAATTC
Get An Apple To The Class
G AATTC
Juang RH (2007) BCbasics
核 酸 的 構 成 序 列 中 , 有 一 種 特 殊 鹼 基 序 列 , 其 鹼 基 的 排 列 是 前 後 互 補 ( 如 GAATTC), 稱 之 為
palindrome ( 迴 文 ); 此 字 是 文 學 用 字 , 指 文 句 可 以 隨 意 自 前 向 後 念 , 或 由 後 向 前 念 者 ( 如
madam)。
有 一 大 類 酵 素 , 可 以 辨 認 核 酸 序 列 上 的 這 種 特 殊 構 造 並 水 解 之 , 統 稱 為 限 制 脢 (restriction
enzyme); 這 是 因 為 含 有 某 種 限 制 脢 的 大 腸 菌 , 會 限 制 某 入 侵 病 毒 的 攻 擊 。
天 字 第 一 號 的 限 制 脢 為 EcoRI, 是 從 大 腸 桿 菌 分 離 出 來 的 , 可 把 GAATTC 序 列 不 對 稱 地 切
開 , 切 口 會 形 成 sticky ends (cohesive ends)。 具 有 相 同 sticky ends 的 核 酸 片 段 , 可 以 互 相 準 確
地 黏 在 一 起 , 這 在 基 因 重 組 技 術 上 有 很 大 貢 獻 。
■ 本 圖 在 網 頁 上 有 動 畫 。
N1-18

EcoRV 可 產 生 鈍 端 Blunt ends
EcoRV
GATATC
GATATC
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.792
有 些 限 制 脢 (EcoRV) 是 在 palindrome 序 列 的 正 中 央 對 稱 地 切 開 , 成 為 平 口 的 鈍 端 (blunt
ends)。 兩 個 鈍 端 間 雖 然 也 可 以 進 行 連 結 , 其 效 率 差 很 多 , 但 在 基 因 重 組 上 也 有 其 用 途 。
■ 本 圖 在 網 頁 上 有 動 畫 。
N1-19

核 酸 的 Hairpin 或 Cruciform 構 造
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.339
因 為 palindrome 的 核 酸 序 列 是 對 稱 的 , 所 組 成 的 DNA 構 形 會 在 長 條 雙 螺 旋 上 造 成 一 個 對 稱
的 小 轉 折 , 限 制 脢 即 可 認 識 這 種 對 稱 的 轉 折 , 並 且 結 合 到 該 處 , 再 以 非 Watson-Crick 的 鍵 結
方 式 , 在 雙 螺 旋 分 子 的 外 側 凹 谷 (grooves), 探 索 其 所 含 鹼 基 序 列 , 看 是 否 為 其 所 能 水 解 者 。
較 長 的 palindrome 序 列 可 以 形 成 同 一 股 DNA 分 子 內 的 鹼 基 配 對 , 因 而 形 成 了 特 殊 的 十 字 形
(cruciform) 構 造 , 兩 者 之 間 也 可 以 互 相 變 換 ; 可 能 作 為 DNA 分 子 上 的 標 記 位 置 , 以 便 在 DNA
分 子 上 進 行 各 種 反 應 。
N1-20

DNA 的
外
圍
可
以
被
蛋
白
質
辨
識
A A D H
A D A
A A D H
A D A M
H D A A
M A D A
A D A
A H A
A D A
A H A
A
D
A
D
H
M
A
A H A
M
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.381
蛋 白 質 與 DNA 之 間 經 常 要 互 相 辨 認 , 以 便 進 行 許 多 生 理 功 能 ; 尤 其 是 這 些 辨 認 都 是 專 一 性
的 , 蛋 白 質 必 須 要 結 合 到 核 酸 上 面 的 特 定 序 列 , 才 能 正 確 進 行 生 理 功 能 。 那 麼 , 蛋 白 質 是 如
何 辨 認 核 酸 序 列 的 ? 需 不 需 要 把 兩 股 核 酸 打 開 , 以 辨 識 其 鹼 基 序 列 ?
答 案 是 不 一 定 , 也 就 是 說 蛋 白 質 可 以 在 雙 股 核 酸 配 對 結 合 的 情 況 下 , 認 出 裡 面 的 鹼 基 是 什
麼 。 有 點 像 認 人 不 一 定 要 看 到 對 方 面 孔 , 許 多 熟 人 你 看 側 影 甚 或 背 影 , 就 可 以 叫 出 名 字 。 同
樣 的 , 蛋 白 質 要 辨 認 鹼 基 不 一 定 要 把 雙 螺 旋 打 開 , 只 要 看 鹼 基 側 面 各 種 基 團 的 排 列 , 就 可 以
認 出 , 因 為 每 一 對 鹼 基 的 外 側 輪 廓 都 不 太 相 同 , 請 見 上 面 的 對 照 密 碼 就 可 明 白 。
■ 有 許 多 種 可 與 DNA 結 合 的 蛋 白 質 區 塊 , 請 先 到 Lehninger Principles of Biochemistry (4e) p. 1088 前 後 查 看 這 幾
種 蛋 白 質 的 構 造 特 徵 。
N1-21

DNA 的 限 制 脢 圖 譜 檢 定
CK A
Restriction
enzymes
B A+B M
A B? 10 kb
A
B
A
+
B
8 kb
2 kb
7 kb
3 kb
5 kb
3 kb
2 kb
Juang RH (2007) BCbasics
因 為 限 制 脢 可 以 辨 認 核 酸 序 列 上 的 特 定 序 列 , 因 此 對 某 段 固 定 的 核 酸 , 每 次 用 相 同 限 制 脢 所
切 的 位 置 是 固 定 的 , 所 得 到 的 大 小 片 段 也 都 是 恆 定 的 , 這 些 片 段 可 用 電 泳 分 離 之 , 稱 為 限 制
脢 圖 譜 。 當 然 , 使 用 不 同 的 限 制 脢 會 切 在 不 同 的 地 方 , 因 此 A, B 兩 種 限 制 脢 所 切 得 的 電 泳 圖
譜 也 會 不 同 。 若 同 時 使 用 這 兩 種 限 制 脢 , 則 由 所 得 到 的 圖 譜 , 可 推 出 這 兩 種 限 制 脢 在 該 段 核
酸 上 的 切 點 位 置 。
例 如 上 面 的 兩 種 限 制 脢 分 別 切 出 2 + 8 (A) 以 及 3 + 7 (B) 兩 種 圖 譜 , 合 起 來 都 是 10 kb, 對 其 切
點 的 預 測 有 兩 種 可 能 ; 但 經 由 混 合 水 解 所 得 到 的 2 + 3 + 5 片 段 , 可 以 推 出 兩 個 限 制 脢 切 點 之
間 相 隔 5 kb, 若 不 做 混 合 水 解 則 無 法 得 知 。
N1-22

以 限 制 脢 及 連 結 脢 進 行 核 酸 剪 接
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
G AATTC
CTTAA G
G
CTTAA
EcoRI sticky end
G AATTC
CTTAA G
DNA Ligase
G AATTC
CTTAA G
AATTC
G
EcoRI sticky end
Juang RH (2007) BCbasics
限 制 脢 所 切 出 來 的 sticky ends, 可 與 另 一 相 同 的 sticky end 相 連 結 , 再 用 DNA ligase 連 結 脢
把 各 股 補 滿 , 這 使 得 DNA 的 剪 接 非 常 精 準 有 效 , 是 基 因 操 作 的 最 基 本 工 具 之 一 。 任 何 兩 個 鈍
端 (blunt ends) 也 可 相 互 連 接 , 沒 有 專 一 性 , 而 且 其 連 結 效 率 非 常 低 。
這 些 工 具 提 供 了 在 核 酸 序 列 上 的 精 確 剪 接 動 作 , 可 以 像 編 輯 錄 音 帶 一 樣 , 把 所 要 的 核 酸 片 段
剪 出 , 然 後 接 到 另 一 段 核 酸 上 , 開 啟 了 基 因 操 作 的 大 門 , 科 學 家 也 快 樂 地 打 開 了 潘 多 拉 的 盒
子 。
N1-23

CsCl ultracentrifugation
質 體 Plasmid
DNA
plasmid
RNA
質 體 是 環 狀 的 獨 立 核 酸
質 體 可 以 大 量 製 備
Kleinsmith & Kish (1995) Principles of
Cell and Molecular Biology (2e) p.101
質 體 是 一 種 小 型 環 狀 DNA, 可 以 進 出 宿 主 細 菌 。 質 體 上 面 帶 有 可 以 表 現 的 遺 傳 信 息 ; 最 有
名 的 是 產 生 抗 藥 性 的 質 體 , 它 所 轉 譯 出 來 的 酵 素 會 水 解 抗 生 素 。 傳 統 上 純 化 質 體 都 是 利 用 超
高 速 離 心 法 , 因 質 體 為 超 捲 曲 構 造 , 構 形 較 為 緊 密 , 因 此 密 度 比 染 色 體 DNA 要 大 一 點 , 離 心
後 會 在 主 要 的 DNA 色 帶 下 面 , 找 到 一 個 質 體 DNA 的 色 帶 。
N1-24

抗 藥 性 質 體 可 在 細 菌 間 傳 遞
抗 藥 基 因
質 體
mRNA
抗 藥 性 菌 種
質 體 可 進 出 宿 主 細 胞
抗 藥 性 新 菌 種
抗 藥 酵 素
水 解 抗 生 素
非 抗 藥 性 菌 種
Juang RH (2007) BCbasics
質 體 可 以 由 一 種 宿 主 傳 到 另 一 種 宿 主 菌 , 因 此 抗 藥 性 也 可 以 因 此 傳 播 開 來 , 使 得 很 多 細 菌 很
快 對 抗 生 素 產 生 抗 藥 性 。 遺 傳 工 程 也 是 利 用 質 體 的 這 種 傳 播 功 能 , 把 一 個 被 修 改 過 的 重 組 質
體 , 放 到 宿 主 細 菌 中 去 表 現 , 生 產 我 們 所 要 的 物 質 。
N1-25

目 標 基 因 殖 入 質 體 並 轉 形 宿 主 菌
限
制
脢
目 標 基 因
限
制
脢
染
色
體
重 組 基 因
目 標 基 因
殖 入 質 體
重 組 質 體
轉 型 宿 主
宿 主 菌
細 胞 轉 形
1 plasmid
1 cell
Juang RH (2007) BCbasics
質 體 用 限 制 脢 切 開 後 , 可 以 插 入 各 種 外 來 的 DNA, 形 成 重 組 質 體 , 後 者 可 以 轉 形 到 宿 主 細
胞 中 。 但 是 , 一 個 細 菌 只 能 接 受 一 種 重 組 質 體 , 而 這 個 轉 進 去 宿 主 的 質 體 , 可 以 在 細 菌 中 大
量 複 製 相 同 的 質 體 。
N1-26

目 標 基 因 的 放 大 與 篩 選
1
培 養 皿
塗 佈
1 cell line, 1 colony
菌 體 複 製
X1,000
X100
質 體 複 製
挑 出 單 一 菌 落
含 有 目 標 質 體
=100,000
Juang RH (2007) BCbasics
質 體 在 細 菌 中 會 大 量 複 製 , 大 約 每 一 隻 細 菌 可 以 累 積 5~200 個 質 體 ( 以 100 計 算 ); 若 把 這 些
轉 形 菌 途 佈 在 培 養 皿 上 , 則 由 單 一 細 菌 所 形 成 的 菌 落 , 將 只 含 有 一 種 轉 形 菌 , 也 就 是 只 含 有
一 種 重 組 質 體 。
每 一 個 菌 落 若 有 1000 隻 細 菌 , 而 每 隻 細 菌 含 有 100 個 重 組 質 體 , 則 每 個 菌 落 就 有
1×100×1000 個 均 質 的 純 系 重 組 質 體 , 沒 有 雜 夾 其 他 的 質 體 ; 因 為 一 個 細 菌 只 能 包 容 一 種 質
體 , 而 一 個 菌 落 只 有 一 種 細 菌 。
因 此 這 種 分 子 群 殖 (molecular cloning) 手 法 , 有 點 像 在 『 種 植 分 子 』, 把 一 個 目 標 基 因 , 經 過
上 述 的 純 化 與 放 大 的 過 程 , 得 到 數 目 眾 多 的 複 製 DNA, 可 以 抽 取 出 來 應 用 。
最 後 所 得 到 的 群 落 , 可 以 用 探 針 進 行 雜 合 反 應 , 挑 選 出 含 有 目 標 基 因 的 菌 落 (N3-13)。
N1-27

核
酸
構
造
核
酸
表
現
性
質
功
能
核 苷 酸
Central
Dogma
變 性 復 性
一 級 構 造
二 級 構 造
三 級 構 造
DNA 到 RNA
限 制 脢
分 子 群 殖
L = T + W
EcoRI → sticky ends
EcoRV → blunt ends
基 因 的 放 大 與 純 化
Template Antisense Intron Exon cDNA
生 理 功 能
Hyperchroism
Hybridization
mRNA, rRNA, tRNA
Hemoglobin
Libraries
ATP, UDPG, NADH, cAMP, Adenosine
核 酸 組 成
核 酸 探 針
C o t
Southern blotting
N1
N2
N3
研 究 技 術 PCR 核 酸 抽 取 核 酸 定 序 生 物 晶 片
N4
■ 本 圖 是 核 酸 部 份 講 義 的 架 構 圖 , 僅 作 為 參 考 之 用 。
N1-28

Central Dogma
複 製
Replication
轉 錄
Transcription
DNA
反 轉 錄
Reverse
Transcription
RNA
轉 譯
Translation
Protein
Juang RH (2007) BCbasics
Central Dogma 是 生 物 界 運 作 的 中 心 基 本 法 則 , 其 重 要 角 色 就 是 核 酸 , 包 括 DNA 及 RNA。
Central dogma 說 明 了 遺 傳 信 息 由 DNA 流 到 RNA 再 到 蛋 白 質 的 過 程 , 而 其 運 作 機 制 與 核 酸 的
分 子 構 造 有 極 大 的 關 係 。 分 子 生 物 學 就 是 以 分 子 的 層 次 , 探 討 整 個 Central Dogma 的 作 用 機
制 , 當 然 比 上 圖 要 複 雜 很 多 。
問 題 : 反 轉 錄 現 象 主 要 發 生 在 病 毒 , 很 多 病 毒 基 因 是 RNA, 要 反 轉 錄 成 DNA, 以 便 入 侵 細
菌 或 動 植 物 的 染 色 體 DNA。 這 個 事 實 , 能 否 給 你 一 些 暗 示 , 以 便 推 得 下 面 兩 個 假 說 :
(1) 地 球 上 最 早 出 現 的 核 酸 , 應 該 是 RNA 而 非 DNA。
(2) 若 (1) 所 述 為 真 , 那 麼 DNA 可 能 是 如 何 出 現 的 ?
由 DNA 到 RNA 的 transcription 中 文 翻 成 轉 錄 , 有 抄 錄 的 意 思 , 非 常 傳 真 。 也 就 是 把 DNA 上
的 信 息 , 一 一 抄 錄 成 RNA, 就 像 『 全 錄 』 影 印 機 一 樣 。 但 是 由 RNA 到 蛋 白 質 是 translation,
是 一 種 『 翻 譯 』 的 關 係 , 有 點 像 把 英 文 翻 成 中 文 , 乃 兩 種 不 同 的 語 文 。 真 是 如 此 , 蛋 白 質 是
以 胺 基 酸 單 位 一 個 一 個 接 起 來 , 不 同 於 DNA 或 RNA, 後 兩 者 是 以 A, T (U), C, G 為 字 母 。
問 題 : 因 此 ,Central Dogma 好 像 有 兩 個 層 次 , 一 個 是 以 核 酸 序 列 為 信 息 貯 藏 的 工 具 , 另 外
則 是 以 蛋 白 質 為 功 能 或 構 造 單 位 。 以 如 此 方 式 安 排 , 有 何 重 要 意 義 ?
N2-1

核 酸 的 複 製
牛 頓 (1985) no. 25 p. 76
DNA 的 雙 股 構 造 , 不 但 能 夠 說 明 其 複 製 的 機 制 , 也 使 其 信 息 更 能 妥 善 保 存 ; 同 時 也 能 夠 複 製
成 各 種 RNA, 以 便 行 使 轉 譯 蛋 白 質 的 功 能 。 這 一 切 流 程 , 都 設 計 得 極 為 巧 妙 , 而 且 有 效 。
N2-2

mRNA 可 獨 立 表 現 出 蛋 白 質
Acetabularia
( 大 傘 藻 )
Starr & Taggart (1987) Biology (4e) p.225
RNA 雖 然 也 是 核 酸 , 但 其 構 造 與 DNA 有 很 大 的 不 同 , 以 致 於 其 生 理 功 能 也 有 相 當 的 差 異 。
RNA 與 DNA 最 大 的 不 同 點 , 在 於 RNA 是 單 股 分 子 , 而 且 分 子 也 比 DNA 小 ; 因 此 RNA 是 從
長 條 的 DNA 分 子 所 拷 貝 下 來 的 一 小 段 功 能 單 位 , 也 帶 有 DNA 上 的 密 碼 指 令 , 並 依 此 指 令 行
事 。 主 要 的 RNA 有 三 大 類 , 是 為 mRNA, tRNA, rRNA 等 , 每 個 都 與 蛋 白 質 的 合 成 有 關 。
上 圖 以 一 種 特 殊 的 單 細 胞 植 物 為 例 , 說 明 即 使 在 隔 離 開 DNA 的 情 況 下 , 由 該 DNA 所 指 導 做
出 來 的 mRNA, 也 能 夠 完 全 地 把 遺 傳 指 令 忠 實 執 行 。 難 怪 DNA 在 mRNA 完 成 任 務 後 就 馬 上
銷 毀 之 , 而 且 有 打 不 死 的 RNase 去 追 殺 細 胞 內 外 的 游 離 RNA, 以 免 RNA 上 面 的 信 息 流 出 細
胞 外 。
N2-3

RNA 具
有
固
定
構
形
核
糖
體
催
化
蛋
白
質
合
成
連 接 所 轉 運 的 胺 基 酸
( 二 級 構 造 )
W-C pairs
( 三 級 構 造 )
Non W-C pairs
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.347
Alberts et al (1994) Molecular Biology of the Cell (3e) p.107
DNA 是 雙 股 核 酸 , 而 且 其 分 子 量 非 常 巨 大 , 因 此 無 法 自 由 捲 繞 成 特 定 構 形 , 都 只 是 形 成 長 長
的 雙 螺 旋 , 或 捲 成 超 捲 曲 構 造 , 也 可 以 再 度 纏 繞 組 成 染 色 體 的 構 造 。 而 RNA 分 子 內 的 鹼 基 ,
除 了 正 常 的 Watson-Crick 配 對 以 外 , 還 有 非 W-C 配 對 的 鍵 結 , 這 樣 使 RNA 得 以 形 成 種 種 構
形 , 以 配 合 某 種 特 定 的 催 化 反 應 。 核 醣 體 由 許 多 分 子 的 RNA 及 蛋 白 質 共 同 組 成 , 這 些 RNA
都 是 ribozyme, 可 協 助 轉 譯 蛋 白 質 的 功 能 。
所 有 的 RNA 真 的 是 鞠 躬 盡 瘁 , 努 力 地 為 細 胞 製 造 蛋 白 質 , 然 而 五 十 年 來 分 子 生 物 學 的 光 芒 都
給 DNA 搶 去 。
N2-4

RNA 很
容
易
被
水
解
而
斷
裂
微 鹼
斷 裂
RNase
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.35
Nelson & Cox (2000)
Lehninger Principles of
Biochemistry (3e) p.176
RNA 在 其 核 糖 分 子 的 2‘ 位 置 上 , 比 DNA 多 了 一 個 氧 原 子 , 亦 即 其 2’ 位 置 為 -OH 官 能 基 ,
因 此 在 微 鹼 情 況 下 ,OH - 會 攻 擊 此 醇 基 , 導 致 3‘ 上 面 磷 酯 鍵 的 斷 裂 , 因 而 瓦 解 RNA 分 子 。 所
以 RNA 分 子 比 起 DNA 不 穩 定 , 容 易 被 破 壞 掉 ; 同 時 無 所 不 在 的 RNase 也 隨 時 在 細 胞 內 外 等
著 水 解 RNA, 因 此 RNA 的 半 衰 期 比 較 短 ( 尤 其 是 mRNA)。
N2-5

有 一 面 模 板 即 可 大 量 生 產 複 製 品
模 板
template
複 製
Juang RH (2007) BCbasics
DNA 的 一 股 像 是 一 個 模 板 , 打 開 這 個 模 板 後 , 就 可 以 大 量 複 製 出 互 補 的 形 狀 出 來 。 而 這 個
模 板 平 時 不 用 時 , 還 會 有 一 個 與 其 互 補 的 蓋 子 保 護 , 以 免 模 板 損 壞 。
N2-6

可 轉 錄 RNA 那 段 DNA 稱 template (-) 股
nontemplate strand (+) strand coding strand
5’ 3’
ATG
TAG
Start
Codon 決 定 於 所 轉 錄 mRNA 的 序 列
這 兩 條
序 列 一 樣
AUG
UAG
5’ 3’ RNA
TAC
ATC
3’ 5’
template strand (-) strand
Juang RH (2007) BCbasics
兩 股 DNA 中 只 有 一 股 能 轉 錄 出 RNA, 稱 為 template strand 或 (-) strand; 另 一 股 則 稱
nontemplate strand, (+) strand 或 coding strand。 兩 股 上 的 核 酸 序 列 , 都 可 能 成 為 template, 決 定
於 3’ 端 上 游 是 否 有 轉 錄 起 始 的 信 號 。
RNA 的 轉 錄 合 成 , 一 定 是 從 RNA 的 5’ 端 向 3’ 端 複 製 , 而 模 板 DNA 則 是 由 DNA 的 3’ 向 5’
方 向 讀 取 密 碼 。 這 些 方 向 性 一 定 要 徹 底 瞭 解 , 並 且 最 好 記 得 很 清 楚 , 因 為 分 子 生 物 學 將 由 這
些 反 應 開 始 。
同 時 , 我 們 一 般 所 知 的 遺 傳 密 碼 (codon), 是 根 據 所 合 成 mRNA 編 的 ; 也 就 是 說 mRNA 上 面
的 序 列 就 是 遺 傳 密 碼 。 而 mRNA 的 序 列 是 與 nontemplate (+) 相 同 的 , 而 與 template (-) 互 補 。
N2-7

兩 股 DNA 都 可 能 轉 錄 出 RNA
DNA
5’ 3’
3’ 5’
RNA 的 合 成 方 向 是 5’→ 3’
RNA
RNA
5’ 3’
3’ 5’
Promotor
充 分 利 用 空 間
的 腺 病 毒 基 因
DNA
Juang RH (2007) BCbasics
雖 然 只 有 一 股 DNA 是 template, 但 是 兩 股 DNA 的 任 何 一 股 都 有 可 能 成 為 template, 甚 至 可
能 互 相 重 疊 。 但 同 一 條 DNA 上 的 所 有 templates, 其 閱 讀 方 向 都 一 樣 ,RNA 都 由 5’ 端 向 3’ 端
複 製 。 每 一 個 基 因 的 前 面 , 都 有 promotor 序 列 , 作 為 開 始 轉 錄 的 信 號 。
N2-8

Antisense RNA 可 抑 制 特 定 基 因 的 表 現
非 模 板 股
+
反 義 基 因
反 義 RNA
RNA/RNA
混 成 後 抑 制
Promotor
X
模 板 股
RNAi
mRNA
+ -
+
-
Juang RH (2007) BCbasics
2006
抑 制 pectinase
Nature Biotechnology
雖 然 只 有 template strand 可 以 轉 譯 出 RNA, 但 也 可 以 用 人 工 的 手 法 , 把 nontemplate strand 選
殖 出 來 , 並 且 送 入 細 胞 中 表 現 。 則 所 轉 錄 出 來 的 antisense RNA, 將 會 與 正 常 的 mRNA 互 補 ,
形 成 RNA/RNA 雜 合 分 子 , 因 而 抑 制 了 該 基 因 的 表 現 。
RNA/RNA 雜 合 分 子 在 細 胞 內 無 法 久 留 , 並 經 由 一 個 機 制 誘 生 RNase, 把 這 段 雙 股 RNA 切 成
大 約 23 鹼 基 對 的 片 段 , 因 而 抑 制 了 該 基 因 的 表 現 , 誘 發 RNAi (interference)。 上 述 的 RNase
以 及 所 切 下 來 的 單 股 23 鹼 基 片 段 , 還 會 繼 續 連 結 在 一 起 , 並 且 由 那 段 有 23 個 鹼 基 的 片 段 做
引 導 ( 報 馬 仔 ), 繼 續 去 找 其 他 具 有 互 補 序 列 的 單 股 或 雙 股 RNA, 然 後 降 解 之 ( 真 是 趕 盡 殺
絕 )。 這 樣 的 過 程 , 還 可 以 有 放 大 的 機 制 , 使 得 清 除 效 果 擴 大 。
RNAi 可 能 是 細 胞 用 來 抵 抗 外 來 的 RNA 病 毒 , 以 免 受 病 毒 之 害 ; 或 者 要 消 除 細 胞 內 自 行 生 出
的 一 些 雙 股 RNA, 以 免 這 些 RNA 的 遺 傳 信 息 干 擾 細 胞 運 作 。
N2-9

反 義 基 因 的 利 用
Target gene
Gene Addition
Transcription
Normal mRNA
RNA double helix
Antisense RNA
RNAi
mRNA translation inhibited
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.537
可 以 用 人 為 的 方 式 , 把 一 段 基 因 以 相 反 的 方 向 , 硬 插 入 這 段 基 因 的 下 游 , 則 可 表 現 出 與 正 常
mRNA 序 列 剛 好 互 補 的 anti-sense RNA, 兩 段 RNA 可 以 互 補 結 合 , 因 而 抑 制 了 該 基 因 的 表
現 。
若 在 試 管 中 置 備 如 此 的 RNA double helix (dsRNA), 再 注 入 細 胞 中 , 則 也 會 對 目 標 基 因 產 生 更
強 的 抑 制 作 用 , 就 是 RNAi。 Nature 電 子 期 刊 有 非 常 詳 細 的 動 畫 , 說 明 RNAi 的 前 因 後 果 , 可
由 生 化 網 頁 連 結 進 入 。
[Lau NC, Bartel DP (2003 九 月 ) RNAi - 神 秘 的 基 因 糾 察 隊 。 科 學 人 19: 48~56]
N2-10

cap
真 核 細 胞 的 Intron 與 Exon
exon exon exon
promotor intron intron DNA
3’ 5’
Transcription
Processing
Splicing
start codon
去 除 intron
5’ 3’
stop codon
mRNA
poly A
tail
都 在 細 胞 核 中 進 行
mature mRNA
送 至 細 胞 質
Juang RH (2007) BCbasics
真 核 細 胞 的 基 因 構 造 有 一 點 與 原 核 細 胞 差 別 很 大 , 就 是 其 基 因 當 中 , 插 入 有 將 來 不 會 被 表 現
出 來 的 片 段 , 稱 為 intron。 當 轉 錄 RNA 時 , 這 些 intron 也 會 如 數 被 合 成 出 來 , 形 成 初 生
RNA, 後 者 先 經 capping 及 polyA tail 的 頭 尾 修 飾 , 再 以 spliceosome 切 出 intron, 得 到 成 熟
mRNA, 送 出 細 胞 核 , 以 便 在 細 胞 質 中 轉 譯 蛋 白 質 。
目 前 還 不 確 知 為 何 有 intron 的 存 在 , 但 若 以 遺 傳 工 程 手 法 去 除 intron, 則 此 基 因 可 能 無 法 正 常
在 原 來 的 細 胞 核 中 表 現 。
N2-11

周 芷 發 現 Intron
Roberts, Sharp (1993)
[ 周 芷 ]
First intron
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.992
第 一 次 發 現 基 因 並 非 連 續 , 是 生 化 科 技 系 前 身 農 化 系 系 友 周 芷 用 電 子 顯 微 鏡 觀 察 到 的 。 她 把
某 基 因 與 其 cDNA 混 合 , 則 兩 者 的 相 似 序 列 可 以 互 相 雜 合 , 但 卻 發 現 在 原 來 的 基 因 上 , 有 些
『 多 出 來 』 的 核 酸 片 段 , 整 個 露 在 外 頭 , 無 法 與 cDNA 雜 合 。
周 芷 的 老 闆 Roberts 起 先 不 相 信 , 以 為 實 驗 有 問 題 , 後 來 證 實 真 核 細 胞 的 基 因 中 , 的 確 含 有 一
些 不 會 表 現 的 片 段 , 稱 之 為 intron ( 內 隱 子 ); 而 那 些 會 表 現 出 來 的 片 段 , 稱 為 exon ( 外 顯 子 )。
Roberts 因 此 獲 得 諾 貝 爾 獎 , 而 周 芷 卻 無 緣 , 說 來 實 在 有 點 不 太 公 平 。
■ 更 詳 細 的 報 導 可 以 參 考 中 研 院 網 頁 http://www.sinica.edu.tw/as/weekly/83/478/person.txt, 或 由 生 化 科 技 系 首 頁
連 結 。
N2-12

肌 紅 蛋 白 由 三 個 Exons 所 組 成
Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.153
Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.231
上 圖 以 肌 紅 蛋 白 Mb 為 例 , 說 明 exon 與 所 表 現 蛋 白 質 的 關 係 。Mb 基 因 由 三 個 exons 所 組
成 , 其 中 第 二 部 份 所 表 現 的 蛋 白 質 , 便 是 與 heme 結 合 的 區 塊 ; 很 可 能 在 幾 億 年 前 , 就 是 由 這
一 個 區 塊 來 負 責 攜 帶 heme, 然 後 在 演 化 過 程 中 , 先 後 加 入 第 一 及 第 三 部 份 。 用 基 因 操 作 的 方
法 , 可 以 把 第 二 個 exon 單 獨 分 出 來 表 現 , 發 現 也 有 結 合 heme 的 能 力 。
N2-13

cDNA 由 mRNA 反 轉 錄 合 成
Baltimore, Dulbecco, Temin (1975)
Reverse
transcription
mature mRNA
5’ 3’
TTTT
3’ 5’
RNA
hydrolysis
poly A tail
3’ 5’
DNA polymerase
3’ CCC
5’
5’ GGG
3’
Juang RH (2007) BCbasics
成 熟 的 mRNA 是 去 除 intron 的 修 飾 後 基 因 , 含 有 完 整 的 基 因 信 息 ; 因 此 若 以 mRNA 為 模
板 , 經 反 轉 錄 所 得 到 的 DNA, 稱 之 為 互 補 DNA (cDNA)。 cDNA 可 以 殖 入 載 體 , 並 且 大 量 表
現 之 ; 以 某 細 胞 全 部 mRNA 所 得 的 cDNA 庫 , 含 有 該 細 胞 正 在 表 現 中 的 基 因 。 cDNA 選 殖 株
可 以 表 現 蛋 白 質 , 因 此 可 以 用 抗 體 篩 選 之 。
N2-14

兩 種 基 因 庫 : cDNA 基 因 庫 vs 染 色 體 基 因 庫
表 現 中 基 因
mRNA
染 色 體 DNA
全 體 基 因
Reverse
transcription
Restriction digestion
cDNA
完 整 基 因
基 因 片 段
使 用 質 體 為 載 體
基
因
庫
較
小
基
因
庫
較
大
使 用 質 體 或
噬 菌 體 為 載 體
Juang RH (2007) BCbasics
基 因 庫 的 建 構 依 基 因 來 源 的 不 同 而 有 兩 種 方 法 : 其 一 是 由 mRNA 反 轉 錄 所 得 的 cDNA 來 建
庫 ( 上 圖 左 ), 另 一 則 由 全 部 染 色 體 DNA 的 限 制 脢 片 段 來 建 庫 ( 上 圖 右 )。 兩 者 在 基 因 庫 的 大 小
與 用 途 上 , 有 相 當 差 別 , 要 依 使 用 目 的 做 適 當 選 擇 。 許 多 常 用 的 生 物 或 細 胞 , 都 有 已 經 建 立
好 的 基 因 庫 出 售 , 只 要 買 回 來 篩 選 , 即 可 得 到 所 要 的 基 因 。 當 然 , 自 己 必 須 準 備 好 適 當 的 探
針 , 以 便 準 確 挑 選 。
上 圖 雖 然 都 使 用 質 體 當 作 載 體 (vector), 但 是 染 色 體 基 因 庫 中 所 攜 帶 的 核 酸 片 段 都 很 大 , 因 此
多 改 用 噬 菌 體 基 因 , 可 以 容 納 較 長 的 片 段 。
N2-15

N2-16

● 分 子 構 造 :
核 酸
核 苷 酸 核 酸 雙 螺 旋 三 級 構 造 Palindrome
質 體 RNA 基 因 表 現
● 功 能 性 質 :
N3
參 加 重 要 生 理 功 能 Central Dogma 變 性 與 復 性
鹼 基 組 成 的 影 響 雜 合 反 應 Intron 與 exon
● 研 究 技 術 :
核 酸 之 純 化 限 制 脢 核 酸 轉 印 法 基 因 操 作
基 因 庫 建 構 PCR DNA 定 序 定 點 突 變 RFLP
DNA 的 性 質 當 然 與 其 雙 螺 旋 構 造 有 密 切 關 係 , 當 雙 螺 旋 鏈 解 開 之 後 , 即 為 DNA 分 子 的 變
性 。 但 DNA 分 子 很 容 易 復 性 , 回 復 原 來 的 雙 螺 旋 構 造 。 在 這 一 開 一 合 之 間 , 若 加 入 其 他 的 核
酸 分 子 , 即 可 做 雜 合 反 應 hybridization, 可 以 檢 定 兩 種 核 酸 分 子 的 序 列 是 否 相 似 。
N3-1

核 苷 酸 直 接 參 加 重 要 生 理 功 能
為 何 核 酸 無 所 不 在 ?
能 量 分 子 : ATP, GTP
及 其 活 化 分 子 : UDP-Glc
輔 脢 : FAD, NAD + , CoA
第 二 傳 信 者 : cAMP
其 他 : Adenosine
H 3 C
O
N
O
N
CH 3
N
N
-
Receptor 休 息 信 號
Caffeine
CH 3
Juang RH (2007) BCbasics
除 了 作 為 遺 傳 信 息 的 傳 遞 外 , 核 苷 酸 的 單 位 小 分 子 也 在 很 多 的 生 理 功 能 上 , 扮 演 重 要 角 色 ,
而 且 其 影 響 範 圍 非 常 廣 泛 。 上 面 所 提 示 的 三 種 功 能 , 是 很 多 生 物 都 具 有 的 基 本 功 能 , 顯 示 核
苷 酸 在 演 化 史 上 的 時 間 非 常 久 遠 , 更 加 強 了 核 酸 可 能 在 早 期 地 球 演 化 過 程 中 , 是 最 早 具 有 演
化 及 複 製 功 能 的 巨 分 子 。 另 外 , 腺 嘌 呤 (adenine) 一 直 活 躍 地 參 與 這 些 生 理 功 能 (ATP, cAMP,
NAD + ), 暗 示 腺 嘌 呤 在 早 期 分 子 演 化 上 的 主 角 地 位 。
Adenosine 可 結 合 到 人 類 某 種 神 經 細 胞 表 面 的 受 體 , 接 著 引 發 一 連 串 信 息 , 主 要 是 cAMP 及 其
下 游 的 磷 酸 化 及 去 磷 酸 化 梯 瀑 反 應 , 最 後 導 致 該 神 經 元 細 胞 反 應 遲 鈍 , 因 此 是 一 種 催 促 『 休
息 』 的 信 號 。 而 咖 啡 所 含 的 咖 啡 因 , 構 造 很 類 似 adenosine, 可 阻 礙 後 者 與 此 受 體 結 合 , 因 此
防 止 神 經 細 胞 之 遲 鈍 化 , 導 致 咖 啡 有 提 神 的 效 果 。
■ 有 關 咖 啡 的 提 神 效 果 研 究 可 參 考 Nature (2002) 418: 734。
N3-2

UDP 參 與 醣 類 分 子 的 活 化
Leloir (1970)
Glycogen synthase
UTP + Glucose-1-P → UDP-glucose → Glycogen biosynthesis
Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.756, 757
細 胞 內 有 許 多 合 成 方 向 的 反 應 , 都 需 要 核 苷 酸 的 參 與 。 例 如 肝 糖 的 合 成 路 徑 中 , 葡 萄 糖 是 以
一 種 活 化 的 形 態 加 入 的 , 稱 為 UDP-Glc, 它 又 是 由 UTP 與 Glc-1-P 經 催 化 而 成 。 在 上 述 的 例
子 中 , 葡 萄 糖 要 經 兩 次 修 飾 , 第 一 次 是 磷 酸 化 , 由 葡 萄 糖 與 ATP 受 hexokinase 催 化 變 成 Glc-
1-P; 再 來 便 是 和 UTP 結 合 成 UDP-Glc。
問 題 : 上 述 兩 種 把 葡 萄 糖 活 化 的 步 驟 , 都 要 消 耗 不 少 能 量 , 為 何 要 如 此 麻 煩 ?
可 以 把 上 圖 葡 萄 糖 加 入 肝 糖 的 反 應 過 程 , 看 作 小 朋 友 (Glc) 到 主 題 樂 園 去 玩 , 首 先 要 在 門 口 花 錢 (ATP) 買 票 , 在
手 臂 上 蓋 了 一 個 章 ( 成 為 Glc-1-P), 便 可 進 入 園 區 ; 然 後 , 看 到 一 種 把 很 多 小 朋 友 一 個 接 一 個 連 接 起 來 的 遊 戲 ,
但 又 必 須 花 錢 (UTP) 變 成 UDP-Glc, 才 能 進 去 玩 。 做 這 些 修 飾 的 目 的 , 有 些 是 要 限 制 出 入 的 自 由 (Glc-1-P), 有 些
是 要 變 成 有 資 格 的 基 質 (UDP-Glc), 可 以 被 負 責 催 化 的 酵 素 辨 認 。 請 注 意 , 一 旦 買 了 第 二 段 票 變 成 UDP-Glc, 事
實 上 還 有 很 多 遊 戲 可 以 玩 , 除 了 上 述 的 肝 糖 合 成 遊 戲 , 也 可 進 行 其 它 主 題 的 反 應 ( 例 如 纖 維 素 合 成 、 蔗 糖 合 成
等 )。
N3-3

核 酸 的 變 性 與 復 性
260 nm
Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.373
DNA 的 功 能 主 要 是 貯 藏 遺 傳 訊 息 , 而 其 最 重 要 的 生 化 性 質 , 就 是 兩 股 核 酸 長 鏈 以 加 熱 方 式 分
開 , 稱 為 變 性 。 兩 股 核 酸 分 開 後 的 最 大 改 變 , 就 是 鹼 基 全 部 暴 露 出 來 , 而 鹼 基 在 紫 外 線 260
nm 附 近 , 有 強 烈 的 吸 光 , 稱 為 核 酸 變 性 的 hyperchromic effect。
經 加 熱 變 性 後 的 核 酸 , 若 慢 慢 回 復 室 溫 , 則 兩 股 核 酸 上 的 鹼 基 , 會 自 行 尋 找 正 確 配 對 , 因 而
捲 繞 回 原 來 的 雙 螺 旋 構 造 , 稱 為 復 性 。 核 酸 的 變 性 復 性 現 象 與 蛋 白 質 很 相 像 , 並 非 所 有 的 蛋
白 質 分 子 都 可 以 正 確 復 性 , 但 核 酸 卻 可 以 相 當 正 確 地 找 回 原 來 的 配 對 。 注 意 回 復 溫 度 的 速 度
不 能 太 快 , 以 免 失 去 配 對 的 正 確 性 。
N3-4

Hyperchromic Effect 核 酸 變 性 觀 察
Relative absorbance (260 nm)
1.3
1.2
1.1
1.0
T m
50 70 90
Temperature (C)
Adapted from Voet et al (1999) Fundamental of Biochemistry p.739
若 把 DNA 逐 漸 加 溫 , 分 子 間 的 活 動 力 越 來 越 大 , 也 越 難 維 持 兩 股 間 的 吸 引 力 ( 是 由 哪 一 種 力
量 所 構 成 ?), 當 到 達 某 一 溫 度 後 , 兩 股 一 下 子 分 開 來 , 期 間 的 鹼 基 對 全 部 外 露 , 會 增 加 此
DNA 對 紫 外 光 的 吸 收 能 力 , 稱 為 hyperchromic effect。 其 實 兩 股 DNA 間 的 吸 引 力 還 算 相 當
強 , 因 此 不 到 一 定 溫 度 , 兩 股 不 會 散 開 來 。 而 每 一 種 DNA 兩 股 間 的 吸 引 力 大 小 不 同 , 各 有 其
特 定 的 解 開 溫 度 , 稱 為 T m (melting temperature), 是 每 種 DNA 的 特 性 。
N3-5

核 酸 G+C 組 成 分 越 高 者 Tm 越 大
Relative absorbance (260 nm)
1.4
1.2
Pneumococcus
(38%) G+C E. coli (52%)
M. Phlei
(66%)
1.0
70 80 90 100
Temperature (C)
S. Marcescens
(58%)
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372
為 何 每 種 DNA 的 T m 都 不 一 定 相 同 ? 因 為 兩 股 間 吸 引 力 比 較 大 的 , 其 T m 就 比 較 高 ; 而 兩 股
間 的 吸 引 力 為 何 有 大 小 之 別 ? 那 是 因 為 兩 種 鹼 基 對 中 ,AT 之 間 只 有 兩 個 氫 鍵 , 而 CG 間 有 三
個 氫 鍵 , 因 此 GC 含 量 越 多 的 DNA,T m 就 越 大 。
N3-6

陽 離 子 中 和 核 酸 的 負 電 荷 而 使 Tm 增 大
100
80
0.01 M phosphate
0.001 M EDTA
5’
3’
G + C (%)
60
40
20
0
0.15 M NaCl
0.015 M Na citrate
60 70 80 90 100 110
Tm (C)
5’
3’
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.372
除 了 GC 含 量 會 影 響 T m
外 , 溶 液 中 的 離 子 濃 度 也 有 很 大 影 響 。 若 溶 液 的 離 子 濃 度 低 , 則
DNA 的 T m 也 會 降 低 。 因 為 離 子 可 中 和 兩 股 DNA 分 子 上 的 強 大 負 電 基 團 ( 磷 酸 ), 若 離 子 濃 度
太 低 , 則 兩 股 磷 酸 負 電 無 法 有 效 中 和 , 造 成 兩 股 互 斥 而 使 得 T m 下 降 。 因 此 , 注 意 不 要 把
DNA 溶 在 純 水 中 , 純 水 中 沒 有 離 子 中 和 效 果 , 兩 股 DNA 互 斥 造 成 變 性 而 沈 澱 。
問 題 : RNA 則 無 此 問 題 , 可 以 溶 在 純 水 中 , 為 什 麼 ?
N3-7

核 酸 G+C 組 成 分 越 高 者 密 度 越 大
80
G + C (%)
60
40
E. coli
Calf thymus
Salmon sperm
Pneumococcus
20
1.69 1.70 1.71 1.72 1.73 1.74
Density (ρ)
Serratia
M. phlei
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.375
GC 含 量 較 高 造 成 兩 股 之 間 的 吸 引 力 加 強 , 因 此 DNA 分 子 密 度 會 顯 得 比 較 高 。 另 外 , 由 上 圖
可 發 現 各 種 生 物 的 DNA 中 , 所 含 的 GC 成 份 可 能 相 差 很 大 , 有 低 至 40%, 也 有 高 至 60% 以
上 。
問 題 : 有 一 大 類 古 生 菌 , 專 門 生 長 在 溫 泉 地 區 , 生 活 環 境 的 溫 度 很 高 , 請 預 測 這 種 生 物 的 核
酸 當 中 ,GC 的 百 分 比 應 該 如 何 ?
N3-8

核 酸 復 性 的 速 度 與 其 基 因 複 雜 度 有 關
基 因 體 大 小
0
1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 10 9 10 10
Fraction reassociated
0.5
Poly U/
Poly A
Mouse
satellite
MS2
T4
E. coli
Calf
1.0
10 -6 10 -5 10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 1 10 100 1K 10K
c 0 t (mole/L • sec)
復 性 所 需 時 間 ( 長 ) 濃 度 × 時 間
Adapted from Garrett & Grisham (1999) Biochemistry (2e) p.374
若 把 各 種 生 物 的 基 因 體 取 出 , 經 變 性 分 開 兩 股 後 , 再 慢 慢 降 溫 復 性 , 則 發 現 各 種 生 物 復 性 所
需 要 的 時 間 不 同 。 可 以 預 測 越 複 雜 的 基 因 , 其 復 性 時 間 越 長 , 上 圖 結 果 的 確 支 持 此 一 預 測 。
圖 中 的 C 0 t 代 表 測 試 核 酸 的 濃 度 (C 0 ) 與 復 性 所 需 時 間 (t) 的 乘 積 , 通 常 若 把 核 酸 濃 度 固 定 , 則
只 需 考 慮 時 間 , 因 此 橫 座 標 可 直 接 看 成 復 性 所 需 要 的 時 間 。 每 一 條 曲 線 , 由 左 上 到 右 下 方
看 , 顯 示 復 性 的 比 例 越 來 越 多 ( 圖 的 下 方 1.0 代 表 全 部 都 復 性 成 功 ), 而 以 其 中 點 (0.5) 作 為 比
較 的 基 準 點 。
問 題 : 由 這 個 實 驗 請 整 理 出 , 有 哪 些 因 素 會 影 響 DNA 的 復 性 速 度 ?
N3-9

核 酸 分 子 間 的 雜 合 反 應 hybridization
DNA1
DNA2
RNA
探 針
Northern
hybridization
Southern
hybridization
Juang RH (2007) BCbasics
DNA 變 性 後 可 再 黏 合 復 性 , 回 復 原 來 的 雙 股 核 酸 。 若 取 兩 種 不 同 來 源 的 DNA, 經 變 性 後 混
合 在 一 起 , 假 如 兩 種 DNA 的 序 列 同 質 性 高 , 則 可 能 會 雜 合 為 混 成 的 雙 股 核 酸 。 也 可 使 用 已 知
序 列 的 核 酸 小 片 段 , 作 為 探 針 (probe) 與 DNA 雜 合 。
一 般 實 驗 操 作 上 可 先 把 樣 本 DNA 經 電 泳 分 離 後 , 轉 印 至 尼 龍 膜 上 , 再 以 放 射 性 探 針 進 行 雜
合 , 稱 之 為 Southern hybridization。 RNA 雖 是 單 股 , 但 也 可 以 在 電 泳 後 , 與 其 互 補 的 DNA 探
針 雜 合 , 則 稱 為 Northern hybridization。
N3-10

傳 統 核 酸 探 針 的 製 備 與 應 用
Amino acid sequence
GLY-ASP-GLU-SER-SER-VAL-LEU-----
GGG-GAC-GAG-TCC-TCC-GTT-CTC---
* * * * * * *
Nucleic acid sequence
* Codon degeneracy
由 胺 基 酸 序 列 推 得 核 酸 序 列
人 工 合 成
Synthesizing
oligonucleotide
PROBE: GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
Juang RH (2007) BCbasics
探 針 的 來 源 有 很 多 , 上 圖 舉 出 一 例 , 說 明 可 以 由 已 知 蛋 白 質 的 一 小 段 胺 基 酸 序 列 , 回 推 其 核
苷 酸 序 列 , 並 依 此 序 列 進 行 人 工 合 成 探 針 。
注 意 對 應 同 一 種 胺 基 酸 的 核 酸 密 碼 , 可 能 有 數 種 , 例 如 Ser 就 有 UCU, UCC, UCA, UCG , AGU,
AGC 等 六 種 可 能 , 稱 為 密 碼 不 確 定 性 (codon degeneracy)。 這 樣 合 成 人 工 探 針 時 就 會 比 較 麻
煩 , 有 幾 個 對 應 之 道 :(1) 把 所 有 可 能 的 密 碼 全 部 合 成 , 則 探 針 成 為 一 種 混 合 物 , 各 種 可 能 的
序 列 都 有 , 其 精 確 度 降 低 ;(2) 調 查 該 種 生 物 的 密 碼 使 用 習 慣 , 並 選 擇 較 常 使 用 的 密 碼 ;(3) 參
考 不 同 生 物 來 源 的 同 源 基 因 序 列 , 抄 襲 所 用 的 密 碼 。 當 然 , 這 些 方 法 都 各 有 缺 點 , 好 消 息 是
DNA 的 復 性 , 有 時 不 太 計 較 兩 股 序 列 是 否 百 分 之 百 互 補 , 有 時 只 要 大 部 份 序 列 配 對 正 確 , 就
可 以 順 利 復 性 。 而 我 們 可 以 控 制 雜 合 的 條 件 ( 溫 度 、 離 子 濃 度 ), 來 調 整 復 性 的 嚴 苛 度
(stringency), 以 便 得 到 我 們 想 要 的 配 對 精 確 度 。
問 題 : 假 如 你 利 用 上 述 原 理 製 備 探 針 , 是 由 已 知 的 胺 基 酸 序 列 回 推 核 苷 酸 序 列 , 那 麼 在 使 用
此 種 探 針 進 行 雜 合 時 , 應 該 要 用 高 嚴 苛 度 , 或 是 低 嚴 苛 度 的 復 性 條 件 ?
N3-11

探 針 標 以 放 射 性 核 種
32
P
雜 合 反 應
GGGGACGAGTCCTCCGTTCT
GGATCCATCCCCTGCTCAGGAGGCAAGAGGCAT
DNA
denaturation
Target gene
Single colony
Lysed
Juang RH (2007) BCbasics
合 成 探 針 經 放 射 性 磷 酸 標 定 後 , 可 用 在 Southern blotting 上 , 與 未 知 樣 本 中 的 核 酸 進 行 雜 合
反 應 。 目 標 基 因 在 細 菌 染 色 體 中 , 實 驗 時 必 須 先 把 細 菌 溶 解 , 然 後 以 化 學 反 應 使 核 酸 變 性 ,
露 出 單 股 DNA, 才 能 與 探 針 進 行 雜 合 反 應 。
N3-12

菌 落 轉 印 到 濾 紙 後 以 探 針 雜 合
蓋
上
濾
紙
轉 印 中
Colony hybridization
取 出 濾 紙
溶 解 細 胞
顯
像
呈
色
核 酸 變 性
加 入 探 針
Juang RH (2007) BCbasics
探 針 雜 合 反 應 的 做 法 實 例 。
菌 落 在 培 養 皿 長 出 來 之 後 , 先 以 濾 紙 複 印 得 菌 落 , 利 用 氯 仿 把 細 菌 溶 並 解 釋 出 核 酸 , 然 後 以
變 性 解 開 核 酸 雙 股 , 再 加 入 標 有 放 射 線 的 探 針 , 進 行 雜 合 反 應 。 若 某 菌 落 中 含 有 目 標 基 因 ,
便 會 與 探 針 成 功 雜 合 , 該 菌 落 的 位 置 便 會 出 現 放 射 線 影 像 ; 然 後 再 回 去 挑 出 原 來 培 養 皿 上 面
的 菌 落 , 大 量 培 養 後 可 純 化 目 標 基 因 。
■ 本 圖 接 續 N1-27 頁 分 子 群 殖 , 在 培 養 基 生 長 的 各 個 菌 落 , 可 以 用 探 針 經 雜 合 反 應 挑 出 所 要 的 目 標 菌 落 。
N3-13

Southern Blotting 的 轉 印
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499
Southern blotting 轉 印 方 法 : (1) 將 核 酸 以 洋 菜 電 泳 分 離 開 來 ;(2) 利 用 毛 細 作 用 把 電 泳 片
上 的 核 酸 色 帶 轉 印 到 尼 龍 膜 上 。 下 頁 :(3) 取 下 轉 印 膜 並 使 核 酸 變 性 ;(4) 加 入 放 射 性 探 針 進 行
雜 合 反 應 ;(5) 以 放 射 性 顯 像 觀 察 所 雜 合 到 的 色 帶 。
N3-14

取
出
轉
印
紙
以
探
針
雜
合
呈
色
Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.499
Southern hybridization 到 現 在 都 還 是 分 子 生 物 學 實 驗 室 的 必 備 工 具 , 數 十 年 來 在 基 本 做 法
上 沒 有 太 多 改 變 。 而 基 因 晶 片 所 根 據 的 原 理 , 還 是 類 似 Southern hybridization 的 雜 合 反 應 , 只
是 雜 合 對 象 的 數 目 變 得 很 多 。
N3-15

核 酸 晶 片 也 是 利 用 雜 合 反 應
樣 本 DNA
或 mRNA
生 物 晶 片
互 補 的 核 酸 序 列 會 互 相 雜 合
每 一 點 上 塗 佈 有 已 知 DNA
Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31
產 生
訊 號
Juang RH (2007) BCbasics
基 因 晶 片 的 基 本 原 理 , 就 是 利 用 類 似 Southern blotting 的 核 酸 雜 合 反 應 。 但 是 比 起 一 般 的 毛
細 管 轉 印 雜 合 , 有 幾 點 不 同 :(1) 以 極 細 微 的 色 點 替 代 電 泳 色 帶 ;(2) 一 次 可 以 處 理 上 千 萬 個 核
酸 色 點 , 因 此 對 同 一 樣 本 可 有 上 千 萬 個 測 試 ;(3) 樣 本 所 需 的 量 極 小 ;(4) 偵 測 方 式 簡 便 快 速 ,
也 配 合 電 腦 比 對 分 析 。
基 因 晶 片 看 起 來 很 炫 , 也 有 其 實 質 的 效 用 。 但 晶 片 最 重 要 的 靈 魂 , 還 是 在 那 一 公 分 見 方 的 小
玻 片 , 上 面 所 點 的 到 底 是 何 種 DNA。 也 就 是 說 , 每 一 個 點 上 的 DNA 是 什 麼 , 才 是 最 重 要 的
關 鍵 因 素 ; 若 這 些 DNA 能 夠 明 確 指 示 某 種 關 鍵 性 疾 病 的 有 無 , 則 這 塊 晶 片 便 是 無 價 之 寶 。 這
些 重 要 的 DNA 要 從 哪 裡 來 ? 當 然 還 是 要 經 由 無 數 的 基 礎 研 究 , 獲 得 對 生 物 的 深 刻 瞭 解 後 , 所
得 到 的 基 本 知 識 。
晶 片 製 作 過 程 是 一 種 技 術 (technology), 而 晶 片 上 必 須 點 上 何 種 DNA, 便 要 靠 基 礎 科 學 (science) 來 提 供 , 兩 者 是
不 一 樣 的 , 但 絕 對 相 輔 相 成 。 其 他 很 多 方 面 也 有 類 似 的 情 形 , 例 如 大 學 裡 的 教 學 與 研 究 必 須 並 進 , 不 能 偏 廢 , 大
家 都 知 道 。 然 而 , 目 前 台 灣 有 個 很 嚴 重 的 問 題 , 可 能 會 影 響 國 本 。 那 就 是 在 研 究 上 , 大 家 只 重 視 可 以 馬 上 應 用 的
技 術 , 不 太 支 持 長 期 的 基 礎 科 學 研 究 ; 在 大 學 裡 , 教 授 又 只 重 視 如 何 發 表 大 量 論 文 ( 不 管 有 沒 有 用 ), 不 太 花 時 間
在 教 學 的 努 力 與 改 進 上 。
■ 可 參 閱 Friend SH, Stoughton RB (2002 四 月 ) 神 奇 的 DNA 晶 片 。 科 學 人 2: 40~48。
N3-16

ABC 型 離 子 幫 浦 會 排 出 藥 物
ABC (ATP-binding cassette) pump
Protein hydrophathic plot
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.32
ABC type (ATP-binding cassette) pump 是 一 大 群 細 胞 膜 上 的 輸 送 幫 浦 , 消 耗 能 量 以 便 主 動 運 輸
物 質 通 過 細 胞 膜 。 其 中 的 某 些 pump 可 以 被 癌 細 胞 利 用 來 輸 出 化 學 治 療 的 藥 物 , 因 而 產 生 抗
藥 性 。 這 種 膜 幫 浦 的 構 造 與 胺 基 酸 序 列 , 都 有 一 定 的 特 徵 , 就 是 都 要 有 許 多 穿 透 細 胞 膜 的 疏
水 性 片 段 , 並 且 一 起 圍 繞 成 一 個 通 道 。
■ 請 複 習 P3-17 有 關 膜 蛋 白 的 特 殊 構 造 ,ABC type pump 就 是 一 個 很 好 的 實 例 。
N3-17

癌 細 胞 會 誘 生 離 子 幫 浦 抵 抗 藥 物
打 破 細 胞
分 離 蛋 白 質
抗 藥 性 細 胞
電 泳 轉 印
抗 體 偵 測
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.30
若 癌 症 病 人 的 化 學 治 療 不 成 功 , 則 殘 存 下 來 的 癌 細 胞 會 啟 動 基 因 中 某 ABC type pump, 把 化
學 治 療 的 藥 物 送 出 細 胞 , 成 為 可 以 抵 抗 化 學 療 法 的 突 變 株 。 上 圖 a, b 分 別 標 出 化 學 療 法 前 後 ,
癌 細 胞 中 ABC type pump 的 改 變 , 可 用 專 一 性 抗 體 辨 認 之 。 先 把 樣 本 經 過 電 泳 , 然 後 轉 印 到
硝 化 纖 維 紙 上 , 再 用 抗 體 標 定 出 pump 的 位 置 。 這 種 類 似 Southern blotting 轉 印 方 式 , 並 且 用
抗 體 來 偵 測 蛋 白 質 的 方 法 , 稱 為 Western blotting。 除 了 Southern 是 真 的 有 此 人 物 之 外 ,
Northern 與 Western 都 是 科 學 家 後 來 故 意 創 造 的 名 詞 。
N3-18

抗 藥 基 因 被 誘 導 開 啟 而 表 現 出 來
分 離 核 酸 轉 印 雜 合 探 針 檢 測
表 現 基 因
原 有 基 因
Kartner & Ling (1989 March) Sci Am (260: 3) p.32
其 實 這 些 ABC type pump 的 基 因 一 直 存 在 細 胞 內 , 由 Southern blotting 可 以 看 出 , 癌 細 胞 產
生 抗 性 的 前 後 , 都 可 偵 測 得 到 此 基 因 , 只 是 含 量 有 點 不 同 (a → b)。 但 是 由 Northern blotting 檢
查 mRNA 改 變 量 , 發 現 只 有 具 抵 抗 性 的 細 胞 , 才 會 表 現 出 mRNA ( 右 上 圖 )。
N3-19

N3-20

● 分 子 構 造 :
核 酸
核 苷 酸 核 酸 雙 螺 旋 三 級 構 造 Palindrome
質 體 RNA 基 因 表 現
● 功 能 性 質 :
參 加 重 要 生 理 功 能 Central Dogma 變 性 與 復 性
鹼 基 組 成 的 影 響 雜 合 反 應 Intron 與 exon
● 研 究 技 術 :
N4
核 酸 之 純 化 限 制 脢 核 酸 轉 印 法 基 因 操 作
基 因 庫 建 構 PCR DNA 定 序 定 點 突 變 RFLP
核 酸 的 研 究 技 術 , 大 多 已 散 佈 在 上 述 構 造 與 性 質 的 說 明 中 , 因 此 只 補 充 說 明 未 提 及 的 部 分 。
以 下 整 理 這 幾 十 年 來 , 有 關 基 因 操 作 方 面 , 在 生 物 技 術 應 用 上 的 重 大 發 展 方 向 ..
(1) 基 因 轉 殖 生 物 體 (genetic modified organism, GMO)
(2) 基 因 治 療 法 (gene therapy)
(3) 生 物 個 體 複 製 (somatic cell cloning)
(4) 幹 細 胞 分 化 及 人 造 器 官 (stem cell differentiation)
(5) 基 因 體 計 畫 (genome projects)
(6) 生 物 資 訊 學 (bioinformatics)
(7) 蛋 白 質 體 研 究 (proteomics)
(8) 生 物 晶 片 (biochips)
N4-1

Mullis (1993)
PCR 基 因 放 大 連 鎖 反 應
染 色 体
PCR 可 以 把 指 定 的 基 因 片 段 數 量 放 大
↓
生 物 親 緣 鑑 定
Juang RH (2007) BCbasics
PCR 是 聚 合 脢 連 鎖 反 應 的 縮 寫 , 可 以 把 指 定 的 基 因 片 段 數 量 放 大 。 但 必 須 知 道 目 標 基 因 的 起
始 及 終 結 的 部 分 序 列 , 以 便 分 別 製 得 界 定 起 點 與 終 點 的 兩 個 引 子 。 如 此 , 聚 合 脢 便 會 在 兩 個
引 子 之 間 複 製 DNA, 所 得 到 的 複 製 品 , 可 在 變 性 後 再 度 黏 合 引 子 , 進 行 次 番 複 製 ; 如 此 來 回
重 複 多 次 , 即 可 得 到 大 量 介 於 兩 個 引 子 之 間 的 核 酸 片 段 。
PCR 技 術 剛 被 發 展 出 來 的 時 候 , 居 然 不 受 重 視 , 後 來 發 現 越 來 越 多 的 重 要 應 用 ; 不 但 在 研 究
上 有 貢 獻 , 在 分 子 診 斷 與 法 醫 學 上 更 是 大 放 異 彩 。
■ 網 頁 動 畫 http://ccms.ntu.edu.tw/~juang/BCbasics/Animation2.htm#N28PCR。
N4-2

抽
取
核
酸
先
用
乙
醇
沉
澱
(1) 打 破 細 胞
(2) 加 入 乙 醇
(3) 以 玻 棒 撈 取 DNA
(4) 乾 燥 後 溶 出 DNA
(5) 以 限 制 脢 切 開 DNA
(6) 以 電 泳 檢 視
Wikipedia
Pharmacia
核 酸 的 純 化 方 法 相 當 固 定 , 除 了 因 材 料 不 同 所 可 能 導 致 的 特 殊 抽 取 問 題 外 , 處 理 核 酸 的 方 法
大 致 都 相 同 。 所 有 核 酸 都 可 以 被 乙 醇 沈 澱 , 但 其 中 只 有 DNA 因 其 分 子 很 長 , 可 以 使 用 玻 璃 棒
撈 取 之 , 乾 燥 後 再 以 緩 衝 液 溶 出 , 就 可 以 得 到 粗 的 DNA 材 料 。 利 用 限 制 脢 可 以 把 DNA 切 成
特 定 片 段 , 再 以 電 泳 檢 視 。 不 同 種 類 的 DNA 在 抽 出 後 進 行 限 制 脢 水 解 , 所 得 到 片 段 的 電 泳 圖
譜 , 大 概 都 不 會 相 同 , 是 一 種 重 要 的 生 物 鑑 定 方 法 。
N4-3

核 酸 定 序 原 理
膠 體 電 泳 可 以 分 開 各 種 不 同 長 度
的 核 酸 , 在 電 泳 膠 片 依 序 排 開 ..
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
32
P
ATCGATCGAT
ATCGATCGA
ATCGATCG
ATCGATC
ATCGAT
ATCGA
ATCG
ATC
AT
A
但 這 樣 的 圖 譜 不 能 判 別 出
各 核 酸 端 點 的 核 苷 酸 種 類
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
T A G C
G
C
T
A
若 能 把 尾 端 核 苷 酸 相 同 的 片 段
提 出 , 跑 在 同 一 行 , 則 比 較 這
樣 的 四 行 , 即 可 讀 出 序 列 。
Juang RH (2007) BCbasics
核 酸 定 序 方 法 的 關 鍵 方 法 , 在 於 如 何 製 得 一 系 列 的 核 酸 片 段 , 而 這 些 片 段 各 中 止 於 不 同 的 鹼
基 位 置 ; 一 個 鹼 基 的 差 異 , 即 可 用 電 泳 分 析 出 來 ( 上 圖 左 )。 其 次 , 要 把 具 有 相 同 尾 端 鹼 基 的 片
段 提 出 來 ( 例 如 T), 放 在 一 起 進 行 電 泳 , 則 分 別 有 A, T, C, G 四 條 電 泳 ( 上 圖 右 )。 比 較 這 樣 的
四 條 電 泳 圖 譜 , 依 序 判 讀 色 帶 出 現 的 先 後 , 即 可 推 出 序 列 。 有 兩 種 方 法 可 製 備 一 系 列 長 度 不
同 的 核 酸 片 段 , 請 見 下 一 頁 。
目 前 大 多 定 序 工 作 已 經 自 動 化 , 並 且 利 用 新 的 螢 光 標 示 物 質 , 以 及 靈 敏 螢 光 檢 測 器 , 可 以 直
接 以 顏 色 辨 認 鹼 基 的 種 類 。 另 外 , 也 改 用 毛 細 管 電 泳 或 HPLC 進 行 核 酸 片 段 的 分 離 , 使 得 定
序 的 進 行 更 為 快 速 而 精 確 , 請 看 下 右 圖 以 彩 色 標 示 如 此 分 離 出 來 的 片 段 , 馬 上 可 以 唸 出 核 酸
序 列 (Wikipedia) 。
N4-4

做 出 不 同 長 短 核 酸 的 方 法
Maxam-Gilbert's Method:
化 學 法
破 壞 → 斷 裂
32
P
ATCGATCGAT
Specific Reaction to G
32
P ATCGATCG
32
P ATCG
破 壞 → 斷 裂
AT
ATCGAT
無 放 射 線 片 段
不 能 顯 像
Sanger's Method:
32
P A,T,C,G
ATCG
TAGCTAGCTA
Template
生 合 成 法
A Analogue
or
32
P
ATCGA
TAGCTAGCTA
STOP
ATCG
TAGCTAGCTA
A
繼 續 合 成
產 生 各 種 片 段
中 止 合 成
Juang RH (2007) BCbasics
(1) Maxam-Gilbert 法 :
以 四 種 化 學 反 應 分 別 對 四 種 鹼 基 作 用 , 每 一 反 應 只 對 單 一 種 鹼 基 進 行 修 飾 , 而 在 該 鹼 基 的 地
方 斷 開 , 得 到 一 系 列 長 度 不 同 的 核 酸 片 段 。 電 泳 可 依 照 這 些 DNA 片 段 的 大 小 , 在 膠 體 中 排
開 , 即 可 依 序 判 讀 DNA 分 子 上 核 苷 酸 的 序 列 ; 比 較 如 此 四 組 鹼 基 序 列 電 泳 , 即 可 組 合 成 整 段
DNA。
事 實 上 第 一 步 只 有 兩 種 反 應 , 分 別 對 purine 與 pyrimidine 反 應 , 然 後 再 利 用 其 他 方 法 分 辨 A, G ( 或 C, T)。
(2) Sanger 法 :
以 樣 本 DNA 為 模 板 , 使 用 DNA polymerase 進 行 試 管 中 DNA 生 合 成 。 有 四 個 反 應 , 每 個 反
應 各 缺 乏 一 種 核 苷 酸 , 而 代 以 其 類 似 物 (analogue), 可 以 被 接 納 進 入 反 應 , 但 是 無 法 繼 續 下 一
個 反 應 , 因 此 合 成 會 停 在 該 類 似 物 的 核 苷 酸 處 , 因 而 造 成 各 種 長 短 不 一 的 DNA 片 段 , 以 電 泳
分 離 如 上 頁 , 即 可 組 合 判 讀 DNA 的 序 列 。
上 述 兩 種 方 法 , 均 以 32 P 標 示 在 核 酸 分 子 上 , 以 便 顯 像 各 不 同 長 度 的 核 酸 片 段 。
N4-5

生
合
成
核
酸
定
序
法
的
反
應
5’
可
正
常
連
結
3’
1
OH
PO 4
2-
Phosphodiester
bond
dideoxynuceotide
5’
3’
H
2
H
ddNTP
A
無 法 再 接 下 去
5’
P
R 1
P
R
P
R
P
R
P
R
P
R
2
3
A
4
3’
5
中 止
6
Juang RH (2007) BCbasics
目 前 都 用 Sanger 的 生 合 成 法 , 以 目 標 核 酸 為 模 板 , 加 入 四 種 核 苷 酸 及 polymerase, 複 製 該 段
核 酸 ; 但 除 了 所 加 的 四 種 核 苷 酸 外 , 額 外 加 入 其 中 任 一 種 核 苷 酸 的 雙 去 氧 衍 生 物 ( 類 似 物
dideoxynucleotide), 合 成 反 應 可 能 止 於 這 種 核 苷 酸 的 位 置 , 因 而 可 得 到 各 種 長 短 不 同 的 片 段 ,
再 以 電 泳 依 序 排 列 出 來 。
問 題 : 現 在 有 很 多 人 要 想 出 更 方 便 的 核 酸 定 序 方 法 , 你 能 否 也 設 計 一 些 ?
N4-6

Site-directed mutagenesis 定 點 突 變
CAG
GTC
CAG
GTC
Wild type
(1)
(5)
translation
primer
(2)
(3)
Smith (1993)
CAG
+ primer
CAG
GCC
+ polymerase
CAG
GCC
(4)
replication
Val
Wild type protein
CGG
GCC
Mutant
(6) translation
Thr
Mutant protein
突 變 只 改 變 了 一 個 胺 基 酸
Val → Thr
Juang RH (2007) BCbasics
定 點 突 變 是 使 用 人 工 合 成 的 引 子 , 先 與 目 標 基 因 雜 合 (2), 而 此 引 子 的 核 苷 酸 序 列 與 目 標 基
因 互 補 , 但 其 上 有 一 個 核 苷 酸 變 異 (GTC→GCC)。 然 後 補 滿 雙 股 核 酸 (3), 再 把 此 混 成 基 因 轉
殖 進 入 宿 主 , 則 宿 主 菌 的 複 製 系 統 將 會 因 複 製 而 產 生 兩 種 質 體 (4), 其 一 為 原 來 的 野 生 型 , 轉
譯 可 得 原 來 的 蛋 白 質 (5); 另 一 則 為 突 變 型 , 轉 譯 則 得 到 突 變 的 蛋 白 質 , 但 只 改 變 了 一 個 指 定
位 置 的 胺 基 酸 (6)。
問 題 : 定 點 突 變 在 研 究 (1) 蛋 白 質 構 造 或 者 (2) 酵 素 催 化 反 應 , 非 常 有 用 。 你 能 否 舉 出 一 些
可 能 的 應 用 實 例 ?
N4-7

RFLP 限 制 脢 圖 譜 多 形 性
Gene insertion/duplication
Original gene
Single base mutation
Restriction enzyme
digestion
probe
Electrophoresis
Juang RH (2007) BCbasics
限 制 脢 圖 譜 多 形 性 (Restriction fragment length polymorphism) 可 用 來 檢 定 兩 種 生 物 或 個 體 在
分 子 演 化 上 的 親 疏 關 係 。 雖 然 同 一 群 族 內 的 每 個 個 體 , 其 基 因 組 成 大 同 小 異 , 但 是 個 體 間 仍
然 會 有 微 小 的 差 異 , 也 就 是 說 其 基 因 序 列 並 不 完 全 相 同 , 稱 為 多 形 性 。 而 基 因 序 列 的 不 同 ,
也 會 使 得 限 制 脢 所 能 辨 認 的 位 置 , 可 能 有 所 差 別 ; 因 此 兩 個 個 體 的 相 對 應 基 因 , 若 以 同 一 限
制 脢 水 解 , 就 可 能 切 出 不 同 的 片 段 出 來 。
生 物 染 色 體 的 核 酸 序 列 經 常 會 有 變 異 , 很 多 都 是 發 生 在 單 一 個 鹼 基 , 稱 為 single nucleotide
polymorphism (SNP)。 人 類 染 色 體 中 每 100~300 個 鹼 基 , 就 可 能 有 一 個 SNP。 這 些 單 點 變 異 可
能 根 本 不 會 影 響 到 後 來 表 現 出 來 的 蛋 白 質 ( 為 什 麼 ?), 但 也 有 可 能 是 某 些 疾 病 的 根 源 。 ( 右 圖
Wikipedia)
那 麼 , 人 類 基 因 計 畫 所 定 出 來 基 因 序 列 , 到 底 是 一 個 人 的 ? 或 者 是 許 多 人 的 ?
據 主 持 該 計 畫 的 Venter 說 , 賽 拉 雷 是 取 用 五 、 六 名 匿 名 自 願 者 的 基 因 , 進 行 選
殖 定 序 , 其 中 也 可 能 包 括 他 自 己 的 基 因 。
N4-8