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本科生化实验补充讲义 - 南方医科大学精品课程

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溶 液 II: 200 mmol/L NaOH1% SDS溶 液 III: 3 mol/L NaAc (pH4.8) 溶 液TE 缓 冲 液 :10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.51 mmol/L EDTA实 验 方 法 :1. 将 大 肠 杆 菌 菌 落 挑 取 一 环 接 种 在 含 有 2 毫 升 加 入 抗 菌 素 的 LB 液 体 培 养 基 的 10 毫 升试 管 里 ,37℃ 振 培 过 夜 ,16~18 小 时2. 转 移 以 上 菌 液 1.5 毫 升 于 EP 管 中 ,8000rpm 离 心 30 秒3. 小 心 去 除 上 清 , 并 用 吸 水 纸 吸 干 残 余 液 体 , 再 将 沉 淀 物 在 振 荡 器 上 振 匀4. 加 入 溶 液 I 100μl, 盖 紧 EP 管 盖 , 翻 转 数 次 , 冰 上 放 置 10 分 钟5. 加 入 溶 液 II 200μl, 温 和 翻 转 EP 管 5 次 ( 可 观 察 到 溶 液 逐 步 由 混 浊 变 为 透 明 ), 冰 上放 置 5 分 钟6. 加 入 溶 液 III 150μl, 将 EP 管 盖 紧 后 来 回 翻 转 2~3 次 , 混 匀 后 冰 上 放 置 20 分 钟7. 12000rpm 离 心 15 分 钟8. 将 上 清 转 移 到 另 一 个 EP 管 中 ( 吸 取 时 不 可 吸 入 底 部 的 沉 淀 )。 加 入 等 体 积 的 酚 和 氯 仿 :异 戊 醇 各 抽 提 一 次9. 加 入 1 毫 升 预 冷 的 无 水 乙 醇 和 1/10 体 积 的 NaAc(3 mol/L,pH5.2), 盖 紧 , 并 翻 转 EP管 数 次 混 匀10. 置 于 -20℃ 冰 箱 1~2 小 时11. 15000rpm 离 心 15 分 钟 , 去 除 上 清 , 收 集 管 底 白 色 沉 淀12. 70% 乙 醇 洗 涤 一 次 , 空 气 干 燥 或 真 空 抽 干13. 将 沉 淀 溶 于 50μl TE 缓 冲 液 或 去 离 子 水 , 完 全 溶 解 后 ,-20℃ 保 存14. 取 样 5μl, 在 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 , 观 察 DNA 条 带 。( 二 ) 紫 外 吸 收 检 测 DNA 的 浓 度 和 纯 度主 要 试 剂 : 提 取 的 质 粒 DNA实 验 方 法 :1. 分 光 光 度 计 先 用 水 在 260nm 和 280nm 两 个 波 长 下 校 零 。2. 取 质 粒 DNA 样 品 5μl, 用 水 稀 释 50~100 倍 , 转 入 分 光 光 度 计 的 石 英 比 色 杯 中 。3. 在 260nm 和 280nm 分 别 读 出 样 品 OD 值 。 根 据 260nm 时 1 OD 单 位 的 双 链 DNA =50μg/ml 和 稀 释 倍 数 , 可 以 计 算 出 样 品 DNA 的 浓 度 。4. 若 OD 260 /OD 280 大 于 1.8, 说 明 仍 有 RNA, 可 以 考 虑 用 RNA 酶 处 理 样 品 , 若 小 于 1.8,说 明 样 品 中 含 有 蛋 白 质 或 酚 , 应 再 用 酚 / 氯 仿 抽 提 , 以 乙 醇 沉 淀 纯 化 DNA。( 三 ) 质 粒 DNA 的 双 酶 切 鉴 定主 要 试 剂 :纯 化 的 质 粒 DNA(100ng/μl)18

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