Survivin geni - Journal of Cell and Molecular Biology

jcmb.halic.edu.tr

Survivin geni - Journal of Cell and Molecular Biology

Journal of Cell and Molecular Biology 10(1):27-32, 2012 Research Article 27

Haliç University, Printed in Turkey.

http://jcmb.halic.edu.tr


Survivin geni -625G/C polimorfizminin Küçük Hücreli Dışı Akciğer

Kanseri ile ilişkisinin araştırılması

Engin AYNACI 1 , Ender COŞKUNPINAR 2 , Ayşe EREN 2 , Onur KUM 1 , Yasemin

MÜŞTERİ OLTULU 2 , Nergiz AKKAYA 2 , Akif TURNA 3 , İlhan YAYLIM 2 , Pınar

YILDIZ *1 .

1 Yedikule Chest Diseases and Thoracic Surgery Training Hospital, Istanbul, Turkey

2 Department of Molecular Medicine, Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, Istanbul,

Turkey

3 Cerrahpaşa Medicine Faculty, Department of Thoracic Surgery, Istanbul University, Istanbul, Turkey

(*author for correspondence; pinary70@yahoo.com)

Received: 14 February 2012; Accepted: 21 May 2012

Özet

Akciğer kanseri tüm kanser türleri arasında görülme sıklığı olarak ikinci sırada, kanser sebepli ölümler

arasında ise ilk sırada gelmektedir. Survivin geni 17q25 kromozomal bölgesinde lokalizedir ve 142 amino

asitten oluşan bir protein kodlar. Survivin (BIRC5) apoptozu düzenleyen önemli bir protein ailesi olan

apoptoz proteinlerinin inhibitörü (IAPs) olarak ilk bulunan inhibitörlerden biridir ve özellikle kanser

hücrelerinde ifadesi gerçekleşir. Survivin genindeki polimorfizm survivin üretimi ve aktivitesine etki

edebilir, bu nedenle akciğer kanserine hassasiyet sağlar. Survivin genindeki aşırı ifadenin çok çeşitli

maligniteleri içeren kanser türlerinde hastalık gelişimi, nüksü ve prognozu ile ilişkili olduğu bilinmektedir.

Bu çalışmada bir Türk popülasyonunda survivin geni promotör bölgesi üzerinde bulunan -625G/C gen

polimorfizmi ile küçük hücreli dışı akciğer kanseri arasında, hastalığın gelişimi ile ilgili olası ilişkilerin

araştırılması amaçlandı. Çalışmaya 146 hasta, 98 kontrol olgu dahil edildi. Yöntem olarak PCR-RFLP tekniği

kullanıldı. Sonuç olarak survivin -625G/C genotip dağılımları incelendiğinde hasta ve kontrol grupları

arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olmadığı tespit edilmiştir.

Anahtar kelimeler: Küçük hücreli dışı akciğer kanseri, survivin, gen polimorfizmi, PCR-RFLP, biyobelirteç.

Investigation of the association of survivin gene -625G/C polymorphism in non-small cell

lung cancer

Abstract

Lung cancer is the second most common cancer type diagnosed and first in cancer related deaths among all

cancers worldwide. The survivin gene is located on human chromosome 17q25, encoding a protein consisting

of 142 amino acids. Survivin is one of the first reported inhibitors of apoptosis proteins, which is an

important family of proteins that regulate apoptosis. Survivin gene polymorphism may affect the survivin

production and activity, thus providing sensitivity for the development of lung cancer. The overexpression of

survivin gene was found to be associated with disease development, recurrence and prognosis in various

malignancies, including cancers. In this study the demonstration of the prognosis related associations

between the -625G/C gene polymorphism located on the survivin promoter region and non small cell lung

cancer in a Turkish population was aimed. 146 patients and 98 control subjects included to the study. PCR-

RFLP technique was used as the method. According to survivin -625G/C genotype distribution analysis, no

statistically significant difference between patients and controls were found.

Keywords: Non small cell lung cancer, survivin, gene polymorphism, PCR-RFLP, biomarker.


28 Engin AYNACI et al.

Giriş

Akciğer kanseri tüm dünyada kansere bağlı

ölümlerin önde gelen sebebi olarak bilinmektedir.

Bununla birlikte özellikle Amerika’da kansere bağlı

ölüm oranları arasında akciğer kanseri sıklığı

gitgide azalmakta, fakat Çin gibi sigara tüketiminin

özellikle son 20 yılda arttığı bazı ülkelerde akciğer

kanseri sebepli ölüm oranının arttığı

gözlenmektedir. Amerika’da 2008 yılında 215.020

yeni vaka belirlenirken, 161.840 kişinin bu hastalık

sebebiyle öldüğü, kayıtlarda yer almaktadır.

Akciğer kanserinin küçük hücreli (KHAK) ve

küçük hücreli dışı (KHDAK) olmak üzere iki tipi

vardır. Son 60 yıldır akciğer kanserinde hastalık

gelişiminin kalıtsal bir temele oturduğu

belirtilmektedir. (Julian et al., 2008).

Programlanmış hücre ölümü olarak bilinen apoptoz,

önemli bir hücre büyüme kontrol mekanizmasıdır

(Yuan-Hung et al., 2009; Thompson, 1995).

Survivin (BIRC5 olarak da bilinir) apoptozu

düzenleyen önemli bir protein ailesi olan apoptoz

proteinlerinin inhibitörü (IAP) olarak ilk bulunan

inhibitörlerden biridir ve özellikle kanser

hücrelerinde ifadesi gerçekleşir (Reed,1997).

Survivin terminal tetikleyici kaspaz-3 ve kaspaz-9

aktivitesini inhibe ederek her iki apoptoz yolunun

baskılanmasını bloke eder (Nicholson and

Thornberry, 1997). Ayrıca survivin apoptotik

uyarıcıyla indüklenen interlökin (IL-3), Fas

(CD95), Bax, tümör nekroz faktörü α, kaspazlar ve

antikanser ilaçlarınının etkisini yok eder (Chan et

al., 2009; Yun-Hong et al., 2004). Mitozda

düzenleyici rol oynadığı da çeşitli yayınlarda (Chan

et al., 2009) bildirilmiş olan survivin geni 17q25

kromozomal bölgesinde lokalizedir ve 142 amino

asitten oluşan bir protein kodlar (Chiou et al., 2003;

Deveraux et al., 1997; Uren et al., 1998).

Survivin ayrıca mikrotübül dinamiklerinin

düzenlenmesinde de önemli rol oynar (Li et al.,

1998; Li and Altieri, 1999; Altieri, 2006; Giodini et

al., 2002). Survivin geni promotör bölgesindeki

polimorfizmler genin transkripsiyonuna etki ettiği

için gen aktivitesini ve ekspresyonunu değiştirerek

akciğer kanserine yatkınlık sağlayabilir (Jin Sung et

al., 2008).

Survivin hücre döngüsünde G2/M fazında bol

miktarda eksprese olur ve G1 fazında hızlı

regülasyon sergiler (Li et al., 1998). Bu durum

transkripsiyonel basamakta kontrol edilir ve hücre

döngüsüne bağlı elementler (CDE) ve hücre

döngüsü homoloji bölgeleri (CHR) survivin

promotörünün proksimal bölgesinde lokalize olur

(Masayuki et al., 2000; Li and Altieri, 1999).

Survivin geni ekspresyon düzeylerindeki artışın

bazı hastalıklar için prognostik belirteç olabileceği

düşünülmektedir (Chun-Hua et al., 2010). Survivin

genellikle embriyonik dokularda ifade olur ve

görülen homozigot mutasyonların erken

embriyonik dönemde ölümle sonuçlanması bu gen

ailesinin hücre gelişimi, farklılaşması ve homeostaz

sürecinde çok önemli rol oynadığını göstermektedir

(Chan et al., 2009).

Çeşitli tek-nükleotit polimorfizmleri survivin

gen bölgesi promotöründe tespit edilmiştir.

Bunlardan en çok bilineni ve literatürde en fazla

çalışması yapılmış olan CDE/CHR reseptör

bağlayıcı bölgede lokalize olan -31G/C gen

polimorfizmidir. Survivin geninin promotör

bölgesindeki bu mutasyon sonucu hücre

döngüsünden bağımsız olarak genin

transkripsiyonu ve bunun sonucunda da aşırı ifadesi

görülür (Xu et al., 2004).

Bu çalışmada KHDAK hastalarında PCR-RFLP

tekniği kullanılarak survivin geni promotör

bölgesindekiki -625G/C (rs8073069)

polimorfizminin bir Türk popülasyonunda KHDAK

hastalığına yatkınlığı araştırılmıştır.

Akciğer kanseri ile ilgili olarak eldeki verilerin

doğru olarak kullanılması ve buna ek olarak

hastalık oluşumu ya da gelişiminin anlaşılmasına

yönelik belirteçlerin ve genetik mekanizmaların

anlaşılması özellikle hastalığın erken tanısı ve

tedavi sürecinde bu hastalar için anlamlı olacaktır.

Materyal ve metod

Örneklerin tanımı

Çalışma ile ilgili olarak öncelikle İstanbul

Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Etik

Değerlendirme Komisyonu’ndan 09.06.2010 tarih

ve 2010/228-36 dosya numarası ile etik kurul onayı

alındı. Çalışmaya Yedikule Göğüs Hastalıkları ve

Göğüs Cerrahisi Eğitim ve Araştırma Hastanesi 3.

Klinikte ve İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp

Fakültesi Göğüs Cerrahisi Kliniğinde tanı konulan

toplam 146 KHDAK olgusu ile yine aynı

kliniklerde tetkik edilen ve kronik hastalık veya

malignite bulgusu saptanmayan 98 sağlıklı kontrol

olgusu alındı. Çalışmaya girmeyi kabul edenlere

gönüllü olur imzaladıktan sonra 1 adet EDTA’lı

tüpe 10 ml kanları alınarak soğuk zincirle

laboratuvara ulaştırıldı.

DNA izolasyonu

Gönüllülerden alınan kanlardan High Pure PCR

Template Preparation Kit (Roche, Manheim)

protokolüne uygun olarak genomik DNA


izolasyonu yapıldı ve daha sonra Nano Drop

Spektrofotometre kullanılarak, elde edilen

DNA’ların konsantrasyonları ölçüldü. DNA’lar

konsantrasyonları 100 ng/μl olacak şekilde

seyreltildi.

PCR

Survivin geni promotör bölgesindeki -625G/C

polimorfizmine özgü primerler (Tablo 1) dizayn

edildi. PCR, total hacim 25 µl ve 10X PCR Buffer

(MBI Fermentas), 1mM MgCl2, 0.2 mM dNTP,


KHDAK’de survivin polimorfizmi 29

0.375 mM her bir primer, 100 ng genomik DNA ve

1 U Taq DNA polimeraz (MBI Fermentas) olacak

şekilde dizayn edildi. Amplifikasyon şartları,

95°C’de 10 dakika ilk denatürasyondan sonra

95°C’de 45 saniye, 72°C’de 60 saniye 5 döngü,

takiben 94°C’de 45 saniye, 60°C’de 45 saniye ve

72°C’de 60 saniye 30 döngü, uzama aşamasında da

10 dakika 72°C’de olacak şekilde düzenlendi.

Optimum amplifikasyon şartları sağlanarak PCR

ürünleri %2 lik agaroz jel elektroforezinde

yürütüldü.

Tablo 1. Survivin geni promotör -625 G/C bölgesi primerleri (FP: İleri Primer, RP: Geri Primer)

Polimorfizm Primer Dizileri PCR Ürün boyu

-625C/G

(rs8073069)

Restriksiyon analizi

FP: 5’-TGTTCATTTGTCCTTCATGCGC-3’

RP: 5’-CCAGCCTAGGCAACAAGAGCAA-3’

Amplifiye olan PCR ürünleri BstUI restriksiyon

enzimi ile uygun tamponu içeren karışım

hazırlandıktan sonra 37°C de 4 saat inkübe edildi.

Kesim ürünleri % 3’lük agaroz jelde 100 volt

elektrik altında, 20 dakika yürütüldükten sonra UV

altında incelenerek genotipler tespit edildi.

İstatistiksel analiz

AJJC tarafından yayınlanmış olan evrelendirme

sistemine göre tümör evrelendirmesi yapılan hasta

olguları ve kontrollere ait veriler SPSS 15.0

programına yüklendi ve kategorik verilerin

karşılaştırılmasında ki-kare testi ve parametrik ttesti

kullanıldı.

Şekil 1. Survivin geni -625 G/C bölgesi PCR

görüntüsü

Sonuçlar

125 bç

BstUI kesimi sonrası

ürün boyları

CC: 125

CG: 125/104/21

GG: 104/21

Çalışmaya 146 KHDAK hastası ve 98 kontrol olgu

dahil edildi. Hastaları yaş ortalaması 60,41 yaş

(±9,71), kontrol olgularının yaş ortalaması 55,23

yaş (±8,8.) di. Çalışmaya dahil edilen hastalardan

132’si erkek (%90,4), 14’ü kadın (%9,6), kontrol

grubu olgularının ise 56’sı erkek (%57,1), 42’si

kadındı (%42,9). Hasta ve kontrol grubuna ait

genotip ve alel dağılımları Tablo 2’de verilmiştir.

PCR sonucu elde edilen bant boyu 125 baz çifti

büyüklüğünde (Şekil 1); BstUI restriksiyon enzimi

kesimi sonucu elde edilen bant büyüklükleri ise

125, 104 ve 21 baz çifti olarak görüntülendi (Şekil

2).

Şekil 2. BstUI kesimi %3’lük

jel elektroforezi görüntüsü. M: 50 bp DNA markörü


30 Engin AYNACI et al.


Tablo 2. Hasta ve kontrol grubuna ait genotip ve alel dağılımları

Genotipler ve Alel

dağılımları

Kontrol

Grubu

N=98

Hasta

Grubu

N=146

-625G/C N % N %

GG 56 57.1 72 49.3

GC 32 32.7 57 39.1

CC 10 10.2 17 11.6

Aleller

P değeri χ2

0.484 1.45

tamamlamış

yapmış

yapmış

G

C

144

52

56.06

43.94

201

91

58.59

41.41

0.27 1.21

Tartışma

düzeyindeki artışın -31G/C polimorfizmi ile ilişkili

olduğunu ve bu artışın hem mRNA düzeyinde hem

de protein düzeyinde meydana geldiğini

Kanser oluşumunda apoptoz mekanizmasındaki

bozukluklar önemli rol oynamaktadır. Apoptoz,

farklı inhibe ve aktive edici ajanlar tarafından

kontrol altında tutulan önemli bir olaydır. Kanserde

apoptozun çeşitli anti-apoptotik proteinler

tarafından inhibisyonu söz konusudur.

Survivin, hücre döngüsünün düzenlenmesinde

temel rol oynayan başlıca anti-apoptotik faktördür.

Ayrıca survivinin Bcl-2 ve diğer IAPlerin aksine

farklılaşmasını normal dokularda

anlatımı olmayan ancak çeşitli kanser tiplerinde

ifade edilen bir protein olduğu bilinmektedir. Bu

durum survivin genindeki anormal ifadenin

transkripsiyonel regülasyon bozukluğuna sebep

olduğunun açık bir göstergesidir. Apoptozu inhibe

eden diğer proteinlerde de bulunan BIR

(“Baculovirus IAP Repeat”) bölgesi ile kaspazlara

bağlanarak etkisini göstermektedir. Dai ve ark.

2010 yılında yaptıkları çalışmada survivin geni

promotor bölgesindeki polimorfizmlerin

KHDAK’de gen modifikasyonuna neden

olabileceğini ileri sürmüşlerdir.

Jang ve ark. tarafından yapılan çalışmada -31 G

alelinin -31 C aleline göre önemli derecede düşük

transkripsiyonel aktiveye sahip olduğu ve bu

durumun -31G/C polimorfizminden etkilenerek

ortaya çıktığı ve buna bağlı olarak -31G/C

polimorfizminin akciğer kanserine yatkınlıkta

önemli bir rolü olduğu belirtilmektedir. (Jang et al.,

2008). Xu ve ark. kanser hücre hatları ile

oldukları bir çalışmada survivin gen ifadesi

.

bildirmişlerdir.

Klinik perspektiften bakıldığında kişisel

paternlerle klinik özelliklerin öngörülmesinde

hastaların genetik parmak izinde survivin geni

ifadesi düzeylerinde ve genetik varyantlarda oluşan

değişikliklerin olası tedaviye yanıtta erken bir

belirteç olabileceğini söylemek mümkündür.

Örneğin plevral efüzyondaki yüksek survivin

düzeylerinin kötü prognoz göstergesi olduğu Lan

ve ark. 2010 yılındaki yayınında gösterilmiştir.

Yang ve ark 2009 yılında özefagus kanserli

hastalarda yaptıkları bir çalışmada C alleline sahip

olmanın hastalık riskini 1.4 kat arttırdığını

söylemektedirler. Özefagus kanseri hastalarında

survivin -625G/C promotor polimorfizminin p53

düzeyine bağlı olan survivin yüksek ifadesi

olasılığını artırdığı düşünülmektedir.

Sonuç olarak bir Türk popülasyonu üzerinde

olduğumuz bu çalışmada survivin geni -625

G/C bölgesi (rs8073069) polimorfizminin küçük

hücreli dışı akciğer kanseri hastalığına yatkınlık

sağladığına dair herhangi bir bulgu elde edilemedi.

Ancak olgu sayısının artırılması ve polimorfik

bölgenin özellikle transkripsiyonun aktivitesine etki

eden promotör bölgesinde olmasından dolayı

yapılabilecek ekspresyon çalışmaları ile özellikle

tanı öncesi ve sonrası gen anlatım ifadesine bağlı

değişikliklerin öngörülmesine yardımcı olabilecek

daha anlamlı sonuçlara ulaşılabileceği

kanaatindeyiz.


Kaynaklar

Altieri DC. Survivin apoptosis: an interloper

between cell death and proliferation in cancer.

Lab Invest. 79: 1327-1333, 1999.

Altieri DC. The case for survivin as a regulator of

microtubule dynamics and cell-death decisions.

Curr Opin Cell Biol. 18: 609-615, 2006.

Chan H. Han, Qingyi Wei, Karen K. Lu,

Zhensheng Liu, Gordon B. Mills, Li-E Wang.

Polymorphisms in the survivin promoter are

associated with age of onset of ovarian cancer.

Int J Clin Exp Med. 2: 289-299, 2009.

Chiou SK, Jones MK, Tarnawski AS. Survivin an

anti-apoptosis protein: its biological roles and

implications for cancer and beyond. Med Sci

Monit. 9:I25-I29, 2003.

Chun-Hua Dai, Jian Li, Shun- Bing Shi, Li- Chao

Yu, Li-Ping Ge, Ping Chen, Survivin and Smac

Gene Expressions but not Livin Are Predictors

of Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer

Patients Treated with Adjuvant Chemotherapy

Following Surgery. Jpn J Clin Oncol. 2-9,

2010.

Dai J, Jin G, Dong J, Chen Y, Xu L, Hu Z, Shen H.

Prognostic significance of survivin

polymorphisms on non-small cell lung cancer

survival. J Thorac Oncol. 2010

Nov;5(11):1748-54. PubMed PMID: 20881643.

Deveraux QL, Takahashi R, Salvesen GS and Reed

JC. X-linked IAP is a direct inhibitor of celldeath

proteases. Nature. 388: 300-304, 1997.

Giodini A, Kallio MJ, Wall NR, Gorbsky GJ, Tognin

S, Marchisio PC, Symons M and Altieri

DC. Regulation of microtubule stability and

mitotic progression by survivin. Cancer Res.

62: 2462-2467, 2002.

Jang JS, Kim KM, Kang KH, Choi JE, Lee WK,

Kim CH, Kang YM, Kam S, Kim IS, Jun JE,

Jung TH, Park JY. Polymorphisms in the

survivin gene and the risk of lung cancer. Lung

Cancer. Apr;60(1):31-9, 2008.

Jin Sung Jang,,Kyung Mee Kim, Kyung Hee Kang,

Jin Eun Choi, Won Kee Lee, Chang Ho Kim,

Young Mo Kang, Sin Kam, In-San Kim, Jae

Eun Jun, Tae Hoon Jung, Jae Young Park.

Polimorphizms in the survivin gene and the risk

of lung cancer. Lung Cancer. 60:31-39, 2008.

KHDAK’de survivin polimorfizmi 31

Julian R. Molina, Ping Yang, Stephen D. Cassivi,

Steven E. Schild,, Alex A. Adjei, Non–Small

Cell Lung Cancer: Epidemiology, Risk Factors,

Treatment, and Survivorship. Mayo Clin

Proc.83(5): 584–594.,2008.

Lan CC, Wu YK, Lee CH, Huang YC, Huang CY,

Tsai YH, Huang SF, Tsao TC. Increased

survivin mRNA in malignant pleural effusion is

significantly correlated with survival. Jpn J Clin

Oncol. Mar;40(3):234-40, 2010.

Li F, Ambrosini G, Chu EY, Plescia J, Tognin S,

Marchisio PC and Altieri DC. Control of

apopto-sis and mitotic spindle checkpoint by

survivin. Nature. 396: 580-584, 1998.

Li F.,Altieri DC. The cancer antiapoptosis mouse

survivin gene: characterization of locus and

transcriptional requirements of basal and cell

cycle-dependent expression. Cancer Res.59:

3143-3151, 1999.

Masayuki Otaki, Masahiko Hatano, Koichi

Kobayashi, Takeshi Ogasawara, Takayuki

Kuriyama, Takeshi Tokuhisa Cell cyledependent

regulation of TIAP/m-survivin

expression. Biochim Biophys Acta. 1493:188-

194, 2000.

Nicholson DW,Thornberry NA. Caspase:killer

proteases. Trends Biochem Sci. 22:299-306,

1997.

Reed JC. X-linked IAP is a direct inhibitor of celldeath

proteases. Nature. 388: 300-304, 1997.

Thompson CB. Apoptosis is the pathogenesis and

treatment of disease. Science. 5267:1456-1462,

1991.

Uren AG, Coulson EJ and Vaux DL. Conserva-tion

of baculovirus inhibitor of apoptosis repeat

proteins (BIRPs) in viruses, nematodes, vertebrates

and yeasts. Trends Biochem Sci. 23: 159-

162, 1998.

Xu Y, Fang F, Ludewig G, Jones G, Jones D. A

mutation found in promoter region of the human

survivin gene is correlated to overexpression of

survivin in cancer cells. DNA Cell Biol.

23:419-429, 2004.

Yang X, Xiong G, Chen X, Xu X, Wang K, Fu Y,

Yang K, Bai Y. Polymorphisms of survivin

promoter are associated with risk of esophageal

squamous cell arcinoma. J Cancer Res Clin

Oncol. Oct;135(10):1341-9, 2009.


32 Engin AYNACI et al.

Yang X, Xiong G, Chen X, Xu X, Wang K, Fu Y,

Yang K, Bai Y. Survivin expression in

esophageal cancer: correlation with p53

mutations and promoter polymorphism. Dis

Esophagus. 2009;22(3):223-30.

Yuan-Hung Wang, Hung-Yi Chiou, Chang-Te Lin,

Hsiao-Yen Hsieh, Chia-Chang Wu, Cheng-Da

Hsu, Cheng-Huang Shen. Association Between

Survivin Gene Promoter -31C/G Polymorphism

and Urothelial Carcinoma Risk in Taiwanese

Population. Urology. 73 (3):670-674, 2009.

Yun-Hong Li, Chen Wang, Kui Meng, Long-Bang

Chen, Xiao-Jun Zhou, İnfluence of survivin and

caspase-3 on cell apoptosis and prognosis in

gastric carcinoma. World J Gastroenterol.

10(13):1984-1988, 2004

More magazines by this user
Similar magazines