Metody identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego w oparciu ...

Konferencja szkoleniowa
Metody identyfikacji leśnego
materiału rozmnożeniowego
w oparciu o markery molekularne
DNA
Organizatorzy:
Uniwersytet Kazimierza Wielkiego, Bydgoszcz
Instytut Dendrologii PAN, Kórnik
Instytut Badawczy Leśnictwa, Warszawa
Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary
27. 11. 2009 r.
Konferencja szkoleniowa 1

Program konferencji:
8.00 – Rejestracja uczestników
8.15 – Potrzeba badao identyfikacyjnych leśnego materiału rozmnożeniowego - J. Burczyk
8.30 – Uwarunkowania prawne dotyczące obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym – J.
Matras
8.45 – Metodyka zbioru materiałów do badao - J. Kowalczyk
9.00 – Markery molekularne – podstawowe definicje, opis metod laboratoryjnych - A. Jagielska
9.15 – Parametry statystyczne wykorzystywane do opisu zmienności genetycznej populacji, ze
szczególnym uwzględnieniem problemów identyfikacji osobniczej - I. Chybicki
9.45 – Wizyta w laboratorium analiz genetycznych – A. Jagielska
10.15 – przerwa (kawa)
10.30 - Podstawowe wyniki badao zmienności genetycznej wybranych gatunków drzew
Zmiennośd genetyczna sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) w oparciu o wybrane markery
DNA - A. Dzialuk
Zmiennośd genetyczna świerka pospolitego (Picea abies [L.] Karst.) w oparciu o wybrane
markery DNA - A. Dzialuk
Zmiennośd genetyczna rodzimych dębów *Quercus petraea (Lieb.), Quercus robur (L.)]
w oparciu o wybrane markery DNA - M. Deging
Zmiennośd genetyczna buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w oparciu o wybrane
markery DNA – J. Burczyk
Tendencje przestrzennego rozkładu zmienności genetycznej badanych gatunków w
skali całego kraju – I. Chybicki
12.00-13.30 Obiad
13.30 - 15.30 Przykłady praktycznych zastosowao markerów molekularnych w badaniach identyfikacyjnych
Identyfikacja osobnicza
Wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji przynależności
szczepów do poszczególnych klonów na przykładzie klonalnej plantacji nasiennej
sosny zwyczajnej – A. Dzialuk
Możliwości wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych sosny zwyczajnej
w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych
- A. Dzialuk
Przykład wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w celu weryfikacji
poprawności zbioru nasion przechowywanych w zasobach LBG, pozyskanych z
drzew matecznych sosny zwyczajnej - M. Pałucka
Możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności
zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych dębów – J. Burczyk
Ocena liczby drzew matecznych
Ocena liczby drzew matecznych wykorzystanych do pozyskania materiału rozmnożeniowego
u sosny zwyczajnej – I. Chybicki
Identyfikacja populacyjna
Możliwości weryfikacji pochodzenia nasion z drzewostanów dębowych w oparciu o
markery cytoplazmatyczne – J. Burczyk
Identyfikacja pochodzenia świerka pospolitego w oparciu o markery cytoplazmatyczne,
na przykładzie Nadleśnictwa Gołdap – A. Lewandowski
Identyfikacja gatunkowa
Możliwości identyfikacji gatunków dębów w oparciu o wybrane jądrowe markery mikrosatelitarne
– I. Chybicki
15.30 - 16.00 Dyskusja
16.00 – Zakooczenie konferencji
Konferencja szkoleniowa 2

Informacje o zespole realizującym projekt badawczy:
Uniwersytet Kazimierza Wielkiego, Bydgoszcz (jednostka koordynująca)
Prof. dr hab. Jarosław Burczyk (kierownik projektu)
Dr Igor Chybicki
Dr Artur Dzialuk
Dr Magdalena Trojankiewicz
Mgr Elżbieta Koralewska
Mgr Katarzyna Kowalkowska
Mgr Ewa Sztupecka
Instytut Badawczy Leśnictwa, Warszawa
Dr inż. Jan Kowalczyk (koordynator zespołu IBL)
Mgr inż. Jan Matras
Dr hab. Justyna Nowakowska
Dr Małgorzata Sułkowska
Jolanta Bieniek
Jerzy Przyborowski
Instytut Dendrologii PAN, Kórnik
Prof. dr hab. Andrzej Lewandowski (koordynator zespołu ID PAN)
Dr Monika Dering
Mgr Monika Litkowiec
Maria Ratajczak
Konferencja szkoleniowa 3

Potrzeba badao identyfikacyjnych leśnego materiału rozmnożeniowego
Jarosław Burczyk
Jednym z podstawowych zadao współczesnego leśnictwa jest utrzymanie funkcji produkcyjnej
lasów, a także zapewnienie ich trwałości w kontekście zrównoważonego rozwoju.
Trwałośd ekosystemów leśnych uwarunkowana jest m.in. zachowaniem różnorodności genetycznej
drzew leśnych. Zasoby genowe drzew leśnych stanowią podstawę hodowli lasu oraz
utrzymania zdolności adaptacyjnych gatunków, co ma szczególne znaczenie w obliczu rosnącego
popytu na drewno oraz zmian globalnych o charakterze klimatycznym i antropopresyjnym.
Ochrona leśnych zasobów genowych wymaga stosowania odpowiednich procedur w
zakresie wykorzystania leśnego materiału rozmnożeniowego. Ustawa o leśnym materiale rozmnożeniowym
(Dz U. Nr 73, poz. 761) reguluje zasady wykorzystania populacji i drzewostanów,
jako źródła pozyskania nasion oraz zasady obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym.
Tym niemniej, kontrola produkcji materiału rozmnożeniowego począwszy od zbioru nasion do
wysadzenia sadzonek z nich otrzymanych dotyczy głównie kontroli administracyjnej od strony
dokumentacji, a za naruszenie przepisów ustawy przewidziane są sankcje. Na skutek świadomych
działao lub nieświadomych zaniedbao, niezależnie od prowadzonej kontroli administracyjnej,
może dojśd do sytuacji, gdy dokumentacja materiału rozmnożeniowego odbiegad będzie
od stanu faktycznego (zbiór nasion z niewłaściwych drzew matecznych, nieadekwatna liczba
drzew matecznych wykorzystanych do zbioru nasion, itd). Może to w konsekwencji prowadzid
do negatywnych zmian genetycznych populacji drzew leśnych, których skutki doświadczad będziemy
za wiele lat. Niewłaściwe pozyskanie i oznakowanie materiału rozmnożeniowego jest
szczególnie niekorzystne w wypadku tworzenia leśnych banków genów.
Współczesna genetyka drzew leśnych pozwala na wykorzystanie wiedzy dotyczącej
zmienności genetycznej (zmiennośd DNA) do identyfikacji i badania tożsamości leśnego materiału
rozmnożeniowego. Celem projektu badawczego finansowanego przez Dyrekcję Generalną
Lasów Paostwowych było opracowanie metodyki analiz laboratoryjnych w oparciu o polimorfizm
markerów molekularnych (markery DNA), oraz metodyki analiz statystycznych umożliwiających
identyfikację leśnego materiału rozmnożeniowego. Podstawą badao było wstępne rozpoznanie
zmienności genetycznej wybranych gatunków drzew leśnych o dużym znaczeniu lasotwórczym
(sosna zwyczajna, świerk pospolity, buk zwyczajny, rodzime dęby) oraz dokonanie
optymalizacji procedur umożliwiających identyfikację i ocenę LMR. Przeprowadzono szereg
badao pilotażowych, z których częśd zaprezentowana jest w ramach niniejszego szkolenia.
Wiedza na temat możliwości i metod identyfikacji leśnego materiału rozmnożeniowego
będzie szeroko rozpowszechniana wśród jednostek Lasów Paostwowych oraz wśród instytucji,
które z uwagi na zaplecze aparaturowe i dotychczasowe doświadczenia w zakresie badao genetyki
drzew leśnych będą mogły stosowad w praktyce metody identyfikacji LMR. Opracowane
metody identyfikacyjne po ich udoskonaleniu będą mogły byd powszechnie stosowane do
identyfikacji LMR.
Konferencja szkoleniowa 1

Uwarunkowania prawne dotyczące obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym
Jan Matras
Zasady tworzenia i wykorzystania leśnej bazy nasiennej w Polsce oparte są na dwóch zasadniczych
dokumentach:
Dyrektywie UE 1999/105/EC o obrocie LMR,
Ustawie z dnia 7 czerwca 2001 r. o leśnym materiale rozmnożeniowym.
Dyrektywa reguluje obrót leśnym materiałem rozmnożeniowym (LMR) w UE, określa zasady
zatwierdzania i selekcji materiału podstawowego oraz produkcji i wprowadzania do obrotu
leśnego materiały rozmnożeniowego. Dyrektywa wprowadziła jednolite definicje i klasyfikacje
LMR, zobowiązując kraje członkowskie do ich stosowania. W dyrektywie określone zostały
rodzaje materiału podstawowego służące do produkcji materiału rozmnożeniowego, a także
minimalne wymagania, jakie musi spełniad LMP i LMR. Dyrektywa odnosi się tylko do gatunków,
które są wykorzystywane dla celów leśnych. Ponadto Dyrektywa obliguje do wyznaczania
regionów pochodzenia (regionów proweniencji) dla materiału podstawowego (LMP) przeznaczonego
do produkcji LMR oraz tworzenia map tych regionów w oparciu o granice opisane w
prawie.
Ustawa z dnia 7 czerwca 2001 r. o leśnym materiale rozmnożeniowym (Dz. U. Nr 73, poz.
761, z 2004 r. Nr 96, poz. 959) oraz przepisy wykonawcze do tej ustawy regulują szczegółowo
sprawy związane z pozyskiwaniem, produkcją i obrotem materiału rozmnożeniowego drzew i
ich sztucznych krzyżówek, wykorzystywanych w lasach i na gruntach przeznaczonych do zalesienia
bez względu na formę ich własności, jej przepisom podlegają osoby fizyczne i prawne
oraz jednostki paostwowe nie posiadające osobowości prawnej, prowadzące produkcję w celu
wprowadzenia do obrotu i obrót leśnym materiałem rozmnożeniowym. W szczególności ustawa
reguluje sprawy:
rejestracji leśnego materiału podstawowego,
obrotu leśnym materiałem rozmnożeniowym,
regionalizacji nasiennej - wyznaczania regionów pochodzenia materiału podstawowego
przeznaczonego do produkcji materiału rozmnożeniowego,
kontroli leśnego materiału rozmnożeniowego.
Przepisów ustawy nie stosuje się do materiału rozmnożeniowego, który nie jest przeznaczony
dla leśnictwa, jak również do materiału rozmnożeniowego przeznaczonego na export do
paostw nie będących członkami Unii Europejskiej. Obowiązujące w Polsce uregulowania prawne
dotyczące zasad funkcjonowania leśnej bazy nasiennej są w pełni zgodne z cytowaną wyżej
Dyrektywą UE.
Konferencja szkoleniowa 2

Metodyka zbioru materiałów do badao
Jan Kowalczyk
Celem badao było zbadanie zmienności genetycznej najważniejszych gatunków lasotwórczych
zarówno iglastych jak i liściastych, a także określenie genotypów badanych drzew.
Zgromadzone informacje będą wykorzystane w pracach nad inwentaryzacją genetyczną drzew
matecznych i w przyszłości będą mogły byd też wykorzystane w analizie potomstwa drzew matecznych.
Do badao jako gatunki modelowe z drzew iglastych wybrano sosnę zwyczajną i
świerk pospolity, a z liściastych dęby szypułkowy i bezszypułkowy oraz buk zwyczajny. Wybór
ich wynikał z założeo początkowych i celów projektu badawczego.
Materiał roślinny do badao zbierano z drzew matecznych (doborowych). Drzewa mateczne
są rejestrowane w rejestrze LMP i na trwałe oznaczane w terenie. Służą jak baza do
zakładania PN i PUN, a ich wartośd genetyczno – hodowlana jest badana w programie testowania.
Dla wybranych gatunków na podstawie informacji o rozmieszczeniu bazy nasiennej w
Lasach Paostwowych opracowano metodykę zbioru materiału roślinnego do badao. Główne
założenia były następujące:
Drzewa i ich lokalizacja były dobierane tak, aby odzwierciedlały rozmieszczenie badanego
gatunku na terenie Lasów Paostwowych
Do zbioru materiału dla sosny, świerka, buka i dębu szypułkowego wyznaczono 200
drzew. Dla dębu bezszypułkowego wyznaczono 100 drzew. Wynikało to z przyjętej metodyki
badao i możliwości finansowych projektu. Wybrana liczba drzew zapewniła możliwośd
rozpoznania zmienności genetycznej gatunku oraz pozwoliła na optymalizację procedur
laboratoryjnych i statystycznych
Drzewa wybrano i zbiór prowadzono w porozumieniu z administracją Lasów Paostwowych
Z drzew iglastych zbierano 1 lub 2 gałązki o długości od 10 do 15 cm, a z drzew liściastych
od 4 do 8 zdrowych liści. Zestrzeliwano je przy użyciu strzelby myśliwskiej
Po zbiorze, w czasie transportu do laboratoriom materiał roślinny przechowywano w lodówkach
chłodzonych suchym lodem.
Dla każdego drzewa mierzono pierśnicę i wysokośd, opisywano jego aktualny stan, i zapisywano
adres leśny.
Zbiór wykonano w 2007 i 2008 roku. Zebrano 892 próbek. W tym: dla sosny materiały zebrano
z 207 drzew, dla świerka z 195, dla buka z 201, dla dębu szypułkowego z 201 drzew, a dla
bezszypułkowego z 88. Ustalono lokalizację geograficzną drzew matecznych na podstawie
współrzędnych geograficznych odczytanych z leśnych map numerycznych w układzie 1992.
Współrzędne uśredniono dla oddziałów. Materiał roślinny po zbiorze podzielono na trzy równe
części i przechowywano równolegle w trzech laboratoriach IBL, ID PAN i UKW.
Konferencja szkoleniowa 3

Markery molekularne – podstawowe definicje, opis metod laboratoryjnych
A. Jagielska
Identyfikacja leśnego materiału rozmnożeniowego była wykonana w oparciu o badanie
markerów genetycznych. Są to fragmenty DNA, które identyfikują różnice w genomie. Obecnie
znanych jest wiele różnych markerów DNA, które umożliwiają badanie zmienności genetycznej
osobników i populacji. Markery molekularne znajdują szerokie zastosowanie w identyfikacji
różnic genetycznych między drzewami oraz między drzewostanami.
W prezentowanych badaniach wykorzystane zostały markery PCR- RFLP oraz mikrosatelity
(SSR).
Podstawową techniką detekcji markerów DNA jest reakcja łaocuchowa polimerazy
(PCR), która umożliwia szybką amplifikację (powielenie) w probówce wystarczającej do badao
ilości DNA. Czułośd tej metody jest bardzo wysoka i teoretycznie pozwala na wielokrotne powielenie
nawet jednej cząsteczki DNA obecnej w ekstrakcie. W czasie reakcji PCR wybrane
odcinki DNA są namnażane w specjalnym urządzeniu (termocyklerze) zaprogramowanym na
cykle, których liczba, czas i zakres temperatury dostosowane są do wielkości amplikowanego
fragmentu oraz specyfiki gatunku. Powielane fragmenty DNA są następnie identyfikowane
poprzez rozdział w żelu agarozowym (elektroforezę), podczas której następuje rozdziału fragmentów
DNA według ich wielkości i masy cząsteczkowej. Reakcja PCR może byd łączona z analizą
restrykcyjną (PCR- RFLP), podczas której produkty amplifikacji poddaje się działaniu enzymów
restrykcyjnych i następnie porównuje wielkośd i wzór powstałych prążków.
Oparta na PCR analiza „krótkich powtórzeo tandemowych”(mikrosatelit, SSR) stanowi
obecnie najbardziej precyzyjne narzędzie badawcze stosowane do określenia tożsamości genetycznej
badanych osobników. Mikrosatelity składają się z krótkich powtórzonych sekwencji (np.
ATC)n (AT)n, (TG)n(AG)n) ułożonych kolejno (tandemowo) w określonym miejscu w chromosomie.
Zaletą markerów SSR jest możliwośd szybkich analiz wykonywanych w automatycznym
sekwenatorze.
Konferencja szkoleniowa 4

Przegląd parametrów statystycznych wykorzystywanych do opisu zmienności genetycznej
populacji, ze szczególnym uwzględnieniem problemów identyfikacji osobniczej
Igor Chybicki
Celem referatu jest przedstawienie i omówienie podstawowych parametrów wykorzystywanych
w ramach niniejszego projektu do opisu zmienności genetycznej. Polimorfizm markerów
genetycznych stwarza możliwośd rozróżniania osobników w populacji, przez co umożliwia
genetyczną analizę pochodzenia (genealogii) osobnika. Ponadto zmiennośd w obrębie
markerów genetycznych pozwala na charakteryzowanie takich właściwości populacji, jak poziom
wsobności (efekt kojarzenia krewniaczego), (efektywnej) wielkości populacji rodzicielskiej,
a także przynależności populacji do danej linii kolonizacyjnej (np. u dębów, świerka). Im
większym polimorfizmem charakteryzują się markery genetyczne, tym więcej informacji dostarczają
na temat osobnika czy populacji. Podstawową miarą polimorfizmu jest liczba alleli (A)
(różnych wariantów w ramach danego locus markerowego). Do innych miar opisu zmienności
należą tzw. efektywna liczba alleli (Ae) oraz różnorodnośd genetyczna (D) mierzona prawdopodobieostwem
wylosowania dwóch różnych alleli. Ważna z punktu widzenia opisu struktury
genetycznej populacji jest również ocena obecności tzw. alleli zerowych (p 0 ), których definicja,
sposób oceny a także konsekwencje dla innych zastosowao markerów genetycznych będą
również przedmiotem referatu.
Jednym z celów niniejszego projektu była analiza polimorfizmu DNA wybranych gatunków
drzew w celu ustalenia unikalności genetycznej drzew, mierzonej za pomocą tzw. prawdopodobieostwa
identyczności (PID). Unikalnośd genetyczna przekłada się również na możliwośd
identyfikacji drzewa matecznego dla próby nasion (lub siewek). Szansę przypadkowej
zgodności (tj. nie wynikającej z pokrewieostwa matka-dziecko) genotypu nasienia i drzewa
ocenia się za pomocą prawdopodobieostwa wykluczenia (PE). Odpowiednie definicje oraz interpretacje
obu wskaźników zostaną przedstawione. Ponadto, celem referatu będzie również
wskazanie różnic w podejściu statystycznym stosowanym podczas analizy markerów jądrowego
DNA i cytoplazmatycznego DNA (tj. mitochondrialnego i chloroplastowego).
Konferencja szkoleniowa 5

Zmiennośd genetyczna sosny zwyczajnej (Pinus sylvestris L.) w oparciu o wybrane markery
DNA
Artur Dzialuk
Badania zmienności genetycznej sosny zwyczajnej przeprowadzono w oparciu o analizę
206 drzew matecznych zlokalizowanych w 17 RDLP na terenie całego kraju. Przeprowadzono je
z wykorzystaniem 13 polimorficznych loci mikrosatelitarnych w jądrowym DNA. Średnia liczba
alleli w locus dla badanego zestawu loci wynosiła A=20,77, wahając się w zakresie od 4 do 39
alleli, średnia efektywna liczba alleli Ae=4,98 (1,73-20,83), średnia heterozygotycznośd obserwowana
Ho=0,666 (0,176-0,930), natomiast współczynnik różnorodności genetycznej (czyli
heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił średnio D=0,799 (0,422-0,952). Współczynnik wsobności
Wrighta wyniósł F=0,166, wahając się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie od -
0,021 do 0,584, co miało częściowo związek z występowaniem tzw. alleli zerowych (null), których
częstośd wahała się od 0 do 0,266, przy średniej 0,076. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa
identyczności określającego szansę, że dwa losowo wybrane osobniki będą
miały taki sam genotyp dla wszystkich 13 loci wyniósł PID 13 =1,69305E-18, natomiast kumulatywne
prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica (np. siewkadrzewo
mateczne) wyniosło EP 13 =0,9999. W celu zoptymalizowania przyszłych analiz identyfikacyjnych
zaprojektowano dwie reakcje multiplex-PCR: (a) dla zestawu 2 loci (PtTX3107 oraz
PtTX3116) oraz (b) dla zestawu 3 loci (Spac11.6, Spac12.5 oraz Spag7.14). Dla amplifikacji pozostałych
loci stosowano pojedyncze reakcje PCR.
Przeprowadzono również badania polimorfizmu dziesięciu chloroplastowych sekwencji
mikrosatelitarnych (Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314,
PCP41131, PCP102652 oraz Pt71936) dziedziczących się u sosny w linii ojcowskiej. Zaobserwowano
występowanie średnio 5,6 alleli w locus (A od 4 do 9 alleli), średnia efektywna liczba alleli
wyniosła Ae=2,14 (1,11-4,08), średnia różnorodnośd haplotypowa D=0,431 a średnie prawdopodobieostwo
identyczności haplotypowej PID=0,569. Te same parametry obliczone dla całej
próby drzew doborowych wyniosły odpowiednio: A=154, Ae=113,47, D=0,996 oraz PID=0,004.
Wszystkie loci chloroplastowe amplifikowane podczas jednej reakcji multiplex-PCR.
Analiza polimorfizmu dwóch loci w genomie mitochodnrialnym (nad1 oraz nad7), który
dziedziczony jest u sosny w linii matecznej, wykazała występowanie łącznie 5 haplotypów. Locus
nad1 okazało się byd niemalże monomorficzne (odnaleziono zaledwie 1 osobnika w RDLP
Lublin posiadającego allel 248 pz), z kolei w locus nad7 zidentyfikowano występowanie 4 alleli.
Efektywna liczba haplotypów mitochondrialnych wśród badanych drzew doborowych wyniosła
Ae=2,56, różnorodnośd haplotypowa D=0,616 a prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej
PID=0,387.
Dla zestawu wszystkich badanych loci u sosny (genom jądrowy, chloroplastowy oraz
mitochondrialny), kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności wyniósł
PID 25 =2,64938E-21, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa
dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 25 = 0,999999.
Konferencja szkoleniowa 6

Zmiennośd genetyczna świerka pospolitego (Picea abies [L.] Karst.)
w oparciu o wybrane markery DNA
Artur Dzialuk
Badania zmienności genetycznej świerka pospolitego przeprowadzono w oparciu o
analizę 195 drzew doborowych zlokalizowanych w 9 RDLP na obszarze całego zasięgu występowania
tego gatunku w Polsce. Przeprowadzono je z wykorzystaniem 9 polimorficznych loci
mikrosatelitarnych w jądrowym DNA. Średnia liczba alleli w locus dla badanego zestawu loci
wynosiła A=26,56, wahając się w zakresie od 12 do 49 alleli, średnia efektywna liczba alleli
Ae=5,81 (2,63-37,04), średnia heterozygotycznośd obserwowana Ho=0,733 (0,508-0,953), natomiast
współczynnik różnorodności genetycznej (czyli heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił
średnio D=0,828 (0,619-0,973). Współczynnik wsobności Wrighta wyniósł F=0,114, wahając
się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie od -0,025 do 0,374, co miało częściowo związek
z występowaniem tzw. alleli zerowych (null), których częstośd wahała się od 0 do 0,163, przy
średniej 0,056. Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określającego
szansę, że dwa losowo wybrane osobniki będą miały taki sam genotyp dla wszystkich 9 loci
wyniósł PID 9 =1,96637E-14, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa
dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 9 =0,9996. Dla amplifikacji
wszystkich badanych loci stosowano pojedyncze reakcje PCR.
Przeprowadzono również badania polimorfizmu pięciu chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych
(Pt 26081, Pt 71936, Pt 63718, Pt 15169, Pt 30204) dziedziczących się u świerka
w linii ojcowskiej. Zaobserwowano występowanie średnio 4,8 alleli w locus (A od 2 do 7
alleli), średnia efektywna liczba alleli wyniosła Ae=1,74 (1,01-2,41), średnia różnorodnośd haplotypowa
D=0,360 a średnie prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej PID=0,639. Te
same parametry obliczone dla całej próby drzew doborowych świerka wyniosły odpowiednio:
A=36, Ae=7,76, D=0,876, PID=0,124 oraz EP 5 =0,876. Wszystkie loci chloroplastowe amplifikowano
w pojedynczej reakcji multiplex-PCR.
Analiza polimorfizmu dwóch loci w genomie mitochondrialnym (MT15 D02 oraz nad1),
który dziedziczony jest u świerka w linii matecznej, wykazała występowanie łącznie 5 haplotypów.
W locus MT15 D02 zaobserwowano 3 allele, a w locus nad1 2 allele. Pozostałe parametry
przyjęły odpowiednio następujące wartości: efektywna liczba alleli Ae=2,04 i 1,53, różnorodnośd
haplotypowa D=0,512 i 0,348 a prawdopodobieostwo identyczności haplotypowej
PID=0,488 i prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica EP 2 =0,512.
Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności obliczony dla zestawu
wszystkich badanych loci u świerka (genom jądrowy, chloroplastowy oraz mitochondrialny),
wyniósł PID 16 =1,19907E-15, natomiast kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa
dla pierwszego rodzica (np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 16 = 0,99998.
Konferencja szkoleniowa 7

Zmiennośd genetyczna rodzimych dębów *Quercus petraea (Lieb.), Quercus robur (L.)]
w oparciu o wybrane markery DNA.
Monika Dering
Zmiennośd genetyczna dwóch rodzimych gatunków dębów analizowana była w oparciu
o drzewa mateczne dębu szypułkowego i bezszypułkowego zlokalizowane w 13 Regionalnych
Dyrekcjach Lasów Paostwowych. Badania nad strukturą genetyczną przeprowadzono wykorzystując
trzy rodzaje markerów DNA o różnym wzorcu dziedziczenia. Było to 10 jądrowych loci
mikrosatelitarnych (nSSR) dziedziczonych po obojgu rodzicach oraz markery chloroplastowego
DNA dziedziczone w linii matecznej: 9 loci mikrostarelitarnych (cpSSR) oraz 2 rejony niekodujące
zlokalizowane między genami trnD i trnT (DT) oraz trnC i trnD (CD) poddane analizie restrykcyjnej
enzymem TaqI (PCR-RFLP).
Średnia liczba alleli w locus dla analizowanych jądrowych loci mikrosatelitarnych wynosiła
dla dębu szypułkowego A=23,7 i A=20 dla dębu bezszypułkowego. Udział w niektórych loci
znaczącej liczby alleli o niskiej częstości spowodował, że efektywna liczba alleli była niższa i
wynosiła odpowiednio dla dębu szypułkowego i bezszypułkowego A e =7,23 oraz A e =6,66. Średnia
heterozygotycznośd obserwowana wynosiła dla dębu szypułkowego i bezszypułkowego
odpowiednio H o =0,832 i H o =0,738, natomiast współczynnik różnorodności genetycznej wynosił
średnio D=0,862 i D=0,85. U obu gatunków w przypadku niektórych loci stwierdzono istotny
statystycznie udział loci zerowych, co bezpośrednio wpływa m. in. na wartości współczynnika
wsobności osiągającego wartośd F= 0,034 dla dębu szypułkowego i F=0,132 dla dębu bezszypułkowego.
Kumulatywny współczynnik prawdopodobieostwa identyczności określający szansę,
że dwa wybrane losowo drzewa będą miały ten sam genotyp wyniósł dla analizowanych 10
loci PID=2,722E-16 dla dębu szypułkowego i PID=1,047E-14 dla dębu bezszypułkowego. Kumulatywne
prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica wyniosło dla
dębu szypułkowego EP1=0,99986 i EP1=0,99962 dla dębu bezszypułkowego. Jakkolwiek nie
stwierdzono wyraźniej gatunkowej specyficzności badanych loci nSSR, to zaobserwowane
istotne statystycznie różnice w częstościach niektórych alleli.
Analiza chloroplastowych loci mikrosatelitarnych pozwoliła na wyróżnienie dla obu
gatunków 18 haplotypów, przy czym u dębu szypułkowego stwierdzono 16 haplotypów i 8 dla
dębu bezszypułkowego. Niższa liczba haplotypów odnotowana u dębu bezszypułkowego najprawdopodobniej
ma związek z niskim udziałem tego gatunku w ogólnej puli analizowanych
osobników. Ze względu na znacznie niższy polimorfizm loci cpSSR w porównaniu do loci nSSR,
średnia wartośd współczynnika określającego prawdopodobieostwo, że dwa losowe osobniki
będą miały ten sam genotyp cpSSR wynosił dla dębu szypułkowego PID=0,1905 i PID=0,2265
dla dębu bezszypułkowego.
Analiza PCR-RFLP dwóch rejonów cpDNA wykazała obecnośd w badanej grupie drzew
doborowych 6 haplotypów należących do trzech linii kolonizacyjnych: haplotypy 4, 5 i 7 z linii
bałkaoskiej, 1 i 2 z linii apenioskiej oraz haplotyp 12 z linii iberyjskiej. Ten typ markerów charakteryzował
się najniższym polimorfizmem, stąd nie może byd wykorzystywany do identyfikacji
osobniczej, aczkolwiek może wnosid istotne informacje na temat pochodzenia drzewostanu.
Konferencja szkoleniowa 8

Zmiennośd genetyczna buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w oparciu o wybrane markery
DNA.
Jarosław Burczyk
Badania zmienności genetycznej buka zwyczajnego przeprowadzono w oparciu o 201
drzew doborowych zlokalizowanych w 12 RDLP, odzwierciedlających rozmieszczenie tego gatunku
w Polsce. Do wstępnych analiz wybrano 31 markerów mikrosatelitarnych zlokalizowanych
w DNA jądrowym. Do badao zmienności genetycznej wytypowano 13 loci polimorficznych,
dających wyraźne produkty amplifikacji pozwalające na jednoznaczne określenie genotypu
osobnika.
Dla tych 13 loci średnia liczba alleli w locus wynosiła A=15,08, wahając się w zakresie
od 4 do 30 alleli, średnia efektywna liczba alleli Ae=3,90 (1,39-10,75), średnia heterozygotycznośd
obserwowana Ho=0,670 (0,291-0,910), natomiast współczynnik różnorodności genetycznej
(czyli heterozygotycznośd oczekiwana) wynosił średnio D=0,743 (0,278-0,907). Współczynnik
wsobności Wrighta wyniósł F=0,099, wahając się dla poszczególnych loci w szerokim zakresie
od -0,142 do 0,405, co miało częściowo związek z występowaniem tzw. alleli zerowych
(null), których częstośd wahała się od 0 do 0,187, przy średniej 0,054. Kumulatywny współczynnik
prawdopodobieostwa identyczności określającego szansę, że dwa losowo wybrane
osobniki będą miały taki sam genotyp dla wszystkich 13 loci wyniósł PID 13 =3,451E-15, natomiast
kumulatywne prawdopodobieostwo wykluczenia rodzicielstwa dla pierwszego rodzica
(np. siewka-drzewo mateczne) wyniosło EP 13 =0,9987. W celu zoptymalizowania przyszłych
analiz identyfikacyjnych zaprojektowano reakcję multiplex-PCR dla zestawu 9 loci charakteryzujących
się optymalnym poziomem zmienności i niską częstością alleli null (CsCAT14, FS1-15,
mfc5, sfc0007-2, sfc0018, sfc0036, sfc0161, sfc1063, sfc1143). Dla takiego zestawu 9 loci
PID 9 =2.914E-11, natomiast EP 9 =0.9967. Wysoki poziom polimorfizmu tak zaprojektowanego 9-
plexu oraz stabilnośd i powtarzalnośd wyników umożliwiają jego dalsze wykorzystanie do celów
identyfikacji osobniczej u buka.
Przeprowadzono również badania polimorfizmu chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych
(ccmp4, ccmp7, ccmp10) dziedziczących się u buka w linii matecznej. Loci te okazały
się wysoce monomorficzne dając łącznie jedynie 2 haplotypy, przy czym rzadszy haplotyp zidentyfikowano
tylko dla jednego drzewa matecznego z RDLP Wrocław. Stwierdzenie niskiego
polimorfizmu genomu chloroplastowego buka jest zgodne z innymi badaniami prowadzonymi
dla tego gatunku.
Konferencja szkoleniowa 9

Tendencje przestrzennego rozkładu zmienności genetycznej badanych gatunków
w skali całego kraju
Igor Chybicki
U większości gatunków drzew zmiennośd genetyczna wykazuje tendencje przestrzenne
polegające na skupianiu się podobnych genetycznie osobników i populacji. Skupiskowa struktura
jest efektem zarówno naturalnych procesów (ograniczone rozprzestrzenianie oraz dobór
naturalny) jak również działalności człowieka (np. regionalizacja nasienna). Polimorficzne markery
DNA stwarzają możliwośd analizy przestrzennej struktury genetycznej. Ze względu na neutralny
charakter odzwierciedlają one jednak jedynie procesy demograficzne, które nie są związane
z dostosowaniem osobnika.
W ramach niniejszego projektu przeprowadzono analizy zmienności genetycznej pięciu
gatunków drzew w oparciu o drzewa doborowe rozmieszczone na terenie całego kraju. Taki
schemat rozmieszczenia stworzył okazję do przeprowadzenia analiz przestrzennej struktury
genetycznej. Analizy przestrzennej struktury genetycznej przeprowadzono dla markerów DNA
jądrowego (nDNA), chloroplastowego (cpDNA) i mitochondrialnego (mtDNA). Ze względu na
typ dziedziczenia markery te można podzielid na dziedziczone oburodzicielsko (rozprzestrzenianie
przez pyłek i przez nasiona; nDNA wszystkich badanych gatunków), w linii matczynej
(rozprzestrzenianie tylko przez nasiona; cpDNA i mtDNA dębu i buka, ale u sosny i świerka tylko
mtDNA) i w linii ojcowskiej (rozprzestrzenianie przez pyłek i przez nasiona; cpDNA sosny i
świerka).
Analizy przeprowadzono z wykorzystaniem odpowiednich metod autokorelacji przestrzennej.
W przypadku markerów dziedziczonych oburodzicielsko (nDNA) najsilniejszą tendencję
skupiskową stwierdzono u buka, w drugiej kolejności u dębu szypułkowego. Zdecydowanie
słabszą strukturę przestrzenną wykazywały gatunki iglaste. Na uwagę zwraca brak struktury
przestrzennej u dębu bezszypułkowego. Prawdopodobną przyczyną może byd zdecydowanie
mniejsza próba oraz specyficzne rozmieszczenie drzew. Zgodnie z oczekiwaniami, markery
dziedziczone w linii matczynej wykazały najsilniejszą autokorelację. Spośród badanych gatunków,
jedynie dla sosny nie zanotowano przestrzennej struktury genetycznej. Dla pozostałych
gatunków stwierdzono klinalną zmiennośd przestrzenną wykazującą pewne różnice skali między
poszczególnymi gatunkami. Analizy markerów dziedziczonych w linii ojcowskiej wykazały
najsłabszą autokorelację przestrzenną. Pomimo tego można było odnotowad istotną statystycznie
dodatnią autokorelację przestrzenną u świerka, co może byd odzwierciedleniem
mniejszych zdolności do rozprzestrzeniania pyłku u tego gatunku w porównaniu z pyłkiem sosny
zwyczajnej.
Zestawiając badane gatunki, struktura przestrzenna jest wyraźniejsza wśród gatunków
liściastych niż iglastych. Szczególnie interesujące w świetle regionalizacji nasiennej (lub identyfikacji
pochodzenia) mogą byd dalsze badania obu gatunków dębu pod kątem zmienności w
obrębie markerów dziedziczonych w linii matczynej (cpDNA i mtDNA). Z drugiej strony, brak
jakiejkolwiek struktury przestrzennej w przypadku sosny zwyczajnej uniemożliwia wykorzystanie
neutralnych markerów DNA do identyfikacji pochodzenia lub wyznaczania regionów nasiennych
u tego gatunku.
Konferencja szkoleniowa 10

Wykorzystanie chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji przynależności
szczepów do poszczególnych klonów na przykładzie klonalnej plantacji nasiennej
sosny zwyczajnej
Artur Dzialuk
Plantacje nasienne są specjalnym rodzajem upraw leśnych zakładanych w celu produkcji
nasion o wysokich wartościach użytkowych. Zamieszanie szczepów mogące nastąpid przy
zbiorze zrazów, szczepieniu oraz sadzeniu na plantacji lub wynikające z obecności drzew wyrosłych
z podkładek, obok zanieczyszczenia obcym pyłkiem, jest główną przyczyną obniżenia jakości
genetycznej nasion produkowanych przez plantacje klonalne.
Badania zmienności próby 206 drzew matecznych sosny zwyczajnej zebranych z terenu
całej Polski wykazały, że prawdopodobieostwo identyczności dwóch losowo wybranych drzew
uzyskane na podstawie analizy 10 markerów mikrosatelitarnych w chloroplastowym DNA
(Pt26081, Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP102652
oraz Pt71936) amplifikowanych w pojedynczej reakcji multiplex-PCR jest stosunkowo niskie
(PID 10 = 0,004039621). Oznacza to możliwośd zastosowania tej metody genotypowania do uzyskania
unikalnych profili genetycznych, umożliwiających identyfikację osobniczą.
Zestaw dziesięciu mikrosatelitów chloroplastowych został wykorzystany do określenia
genotypów wszystkich szczepów w jednej z trzech kwater plantacji nasiennej sosny zwyczajnej
w Gniewkowie. Uzyskane profile genetyczne porównano z danymi dotyczącymi rozmieszczenia
klonów na plantacji dostarczonymi przez Nadleśnictwo Gniewkowo (gospodarza obiektu).
Wśród 190 szczepów tworzących badaną kwaterę, stwierdzono występowanie 27 haplotypów
(w tym 24 haplotypów unikalnych, tj. występujących tylko u jednego klonu). W przypadku 50
szczepów (26,3%) stwierdzono błędne przypisanie do klonów. Dla 32 szczepów (64% błędnie
opisanych) udało się odnaleźd odpowiedni klon i dokonad stosownej korekty w opisie. 18
szczepów (36% błędnie opisanych) nie udało się przyporządkowad do żadnego z klonów.
Uzyskane wyniki wskazują, że technika analizy 10 chloroplastowych loci mikrosatelitarnych
w pojedynczej reakcji multiplex-PCR, jest metodą umożliwiającą nie tylko identyfikację
błędów w opisie przynależności szczepów do klonów, ale także dokonanie stosownych korekt
w opisie plantacji oraz wskazanie osobników nieznanego pochodzenia, które powinny byd usunięte
podczas najbliższej trzebieży. Jej zastosowanie nie ogranicza się jednak tylko do eliminowania
błędów na istniejących plantacjach. Istnieje również możliwośd zapobiegania powstawania
błędów przy zakładaniu plantacji poprzez porównanie zgodności haplotypów szczepów z
domniemanym źródłem zrazów (drzewem matecznym) oraz dodatkowo podnoszenia wartości
genetycznej plantacji poprzez odpowiednie planowanie rozmieszczenia klonów, tak aby zapobiegad
wzrostowi wsobności pokolenia potomnego w wyniku samozapłodnienia (kojarzenia
pomiędzy szczepami tego samego klonu).
Konferencja szkoleniowa 11

Możliwości wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych sosny zwyczajnej
w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych
Artur Dzialuk
Nasiona sosny zwyczajnej oraz innych drzew iglastych posiadają haploidalną tkankę
megagametofitu, której genotyp jest identyczny z genotypem komórki jajowej tworzącej zarodek
nasienia. Ponadto, genom cytoplazmatyczny megagametofitu jest identyczny z genomem
cytoplazmatycznym drzewa matecznego. Stwarza to możliwośd wykorzystania markerów chloroplastowych
w celu weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych
sosny zwyczajnej.
Dokonano wyboru 10 polimorficznych loci mikrosatelitów chloroplastowych (Pt26081,
Pt36480, Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP102652 oraz
Pt71936). Dla tych loci zaprojektowano i zoptymalizowano reakcję multiplex-PCR umożliwiającą
przeprowadzenie pojedynczej reakcji PCR dla zestawu 10 markerów genetycznych jednocześnie.
Badania zmienności próby 206 drzew matecznych sosny zwyczajnej zebranych z terenu
całej Polski wykazały, że chociaż zmiennośd w poszczególnych loci jest umiarkowana (od 4 do 9
alleli), to dla badanego zestawu drzew matecznych otrzymano łącznie aż 154 różne haplotypy
rozumiane jako kombinacje alleli w poszczególnych loci. Prawdopodobieostwo identyczności
dla tego zestawu loci wynosi PID 10 = 0,004039621, co jest równoważne z prawdopodobieostwem,
że dwa losowo wybrane osobniki sosny zwyczajnej mają taki sam haplotyp.
Zaproponowano, by weryfikację poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych
sosny prowadzid poprzez porównanie haplotypów megagametofitów pięciu nasion
(wybranych losowo z próby deklarowanej, jako pochodzącej z danego drzewa matecznego) z
haplotypem drzewa matecznego (DNA wyizolowany z igieł). Analiza pięciu nasion daje prawdopodobieostwo,
że w 80% przypadków wykryte będzie zanieczyszczenie próby nasion większe
niż 20%, pozwala zatem na wykrycie rażących zanieczyszczeo, tolerując zanieczyszczenie niewielkie.
Badania pięciu nasion są jednocześnie wyrazem kompromisu pomiędzy dokładnością
analiz, a ich kosztochłonnością. Procedura ta została wdrożona przy gromadzeniu zasobów
genowych drzew matecznych sosny zwyczajnej w Leśnym Banku Genów Kostrzyca. Na bazie tej
metody opracowano także całościową koncepcję weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych
drzew matecznych sosny zwyczajnej prowadzonych przez LBG Kostrzyca. Obejmuje
ona nie tylko testowanie już istniejących zasobów nasion, ale także bieżącą kontrolę nasion
dostarczanych przez nadleśnictwa pod kątem zgodności genetycznej danej porcji nasion z deklarowanym
drzewem matecznym. Taka strategia zapobiega przechowywaniu nasion nieznanego
pochodzenia, przyczyniając się przy tym do wydajniejszej ochrony ex-situ zasobów genowych
sosny zwyczajnej z terenu całej Polski.
Konferencja szkoleniowa 12

Przykład wykorzystania chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w celu weryfikacji
poprawności zbioru nasion przechowywanych w zasobach LBG, pozyskanych z drzew matecznych
sosny zwyczajnej.
Małgorzata Pałucka
W Leśnym Banku Genów Kostrzyca przeprowadzono badania genetyczne, mające na
celu sprawdzenie poprawności zbioru nasion z drzew matecznych Pinus sylvestris, dla zasobów
genowych pochodzących z terenu czterech południowych Regionalnych Dyrekcji Lasów Paostwowych
oraz jednej RDLP z terenu centralnej Polski.
Badania polegały na amplifikacji chloroplastowych sekwencji mikrosatelitarnych w DNA
izolowanym z tkanki megagametofitu pięciu losowo wybranych nasion z każdego badanego
zasobu genowego oraz z igieł pozyskanych przez pracowników LBG podczas wyjazdów terenowych.
DNA wyizolowano metodą Doyle and Doyle (1986). Reakcje multipleks PCR prowadzono
wykorzystując 9 sekwencji mikrosatelitarnych w chloroplastowym DNA: Pt26081, Pt36480,
Pt45002, Pt15169, Pt30204, PCP1289, PCP87314, PCP41131, PCP102652. Dzięki połączeniu
dziewięciu markerów mikrosatelitarnych w jedną mieszaninę multipleks (Dzialuk i Burczyk
2004), możliwe było efektywne i precyzyjne określenie haplotypów danej partii nasion sosny
zwyczajnej i porównanie ich z haplotypem drzewa matecznego. Wynik zgodny uznawano w
tych próbach, w których megagametofity wszystkich 5 nasion posiadały haplotyp chloroplastowy
identyczny jak haplotyp drzewa matecznego (igła).
W sumie przeprowadzono analizy dla 254 zasobów genowych sosny zwyczajnej. Wyniki,
jakie uzyskano były następujące:
1. 157 (62%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako „zgodne”,
2. 28 (11%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako „niezgodne” (od jednego do czterech
spośród pięciu badanych megagametofitów posiadało inny haplotyp),
3. 69 (27%) zasobów genowych zaklasyfikowano jako „niezgodne” (każdy z pięciu badanych
megagametofitów posiadał inny haplotyp).
W marcu 2009 r. LBG Kostrzyca przesłał do DGLP obszerne sprawozdanie dotyczące otrzymanych
wyników badao. W odpowiedzi, Dyrektor Generalny LP wydał decyzję o wycofaniu z LBG
Kostrzyca wszystkich zasobów genowych utworzonych z drzew matecznych P.sylvestris, które
zostały zaklasyfikowane jako „niezgodne” oraz polecił nadleśnictwom ponowny, poprawny
zbiór w celu odtworzenia zasobów genowych. W LBG Kostrzyca prowadzone są analizy laboratoryjne
kolejnych zasobów genowych utworzonych z drzew matecznych P.sylvestris.
Konferencja szkoleniowa 13

Możliwości wykorzystania jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności
zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych dębów.
Jarosław Burczyk
Jądrowe markery mikrosatelitarne u rodzimych dębów charakteryzują się stosunkowo
wysokim polimorfizmem, co umożliwia ich wykorzystanie w celu prowadzenia analiz identyfikacji
osobniczej. U organizmów diploidalnych osobnik potomny w ramach każdego locus posiada
jeden allel pochodzący od osobnika matecznego, a drugi allel pochodzący od osobnika
ojcowskiego. W związku z tym, osobniki potomne danego drzewa matecznego, w każdym locus
powinny posiadad przynajmniej jeden allel obecny u osobnika matecznego. Jeśli chociaż w jednym
locus stwierdza się niezgodnośd genetyczną pomiędzy osobnikiem matecznym a domniemanym
osobnikiem potomnym (brak wspólnych alleli), oznacza to, że domniemany osobnik
potomny pochodzi od innego osobnika matecznego (wykluczenie rodzicielstwa).
Przeprowadzono pilotażowe badania, których celem było określenie możliwości wykorzystania
jądrowych sekwencji mikrosatelitarnych do weryfikacji poprawności zbioru nasion
z pojedynczych drzew matecznych dębów. Badania przeprowadzono w mieszanym drzewostanie
nasiennym dębów w Nadleśnictwie Jamy (RDLP Toruo). Genotypy 421 drzew oraz 1280
osobników potomnych (nasiona) pochodzących z 18 drzew matecznych określono dla zestawu
5 loci mikrosatelitarnych tworzących multiplet-PCR (MSQ 4, ssrQpZAG 9, ssrQpZAG 110,
ssrQrZAG 7, ssrQrZAG 20), który dla przebadanych w projekcie drzew matecznych z terenu
całej polski dał PID 5 =1,033E-7 oraz EP 5 =0,983. Do dalszych badao wybrano jedynie nasiona 10
drzew matecznych (czyli 10 rodów z wolnego zapylenia, half-sib), o liczebności ponad 50 nasion/drzewo
(od 52 do 232). Wykorzystując metody analizy rodzicielstwa każdy z 10 rodów
próbowano przypisad do każdego z 421 drzew oceniając proporcję nasion, dla których nie dokonano
wykluczenia rodzicielstwa (czyli proporcję nasion, które można przypisad do danego
drzewa matecznego).
Sto procent nasion należących do poszczególnych rodów przypisad można było jedynie
dla jednego rzeczywistego drzewa matecznego danego rodu. Dla każdego rodu jedno lub więcej
nasion było zgodnych genetycznie ze 107 do 177 drzewami obecnymi w drzewostanie nasiennym,
jednak proporcja nasion zgodnych genetycznie z tymi drzewami wynosiła średnio
zaledwie 0,031 (od 0,016 do 0,049). Tym niemniej, w pojedynczych przypadkach, dla niektórych
rodów wartośd ta wynosiła nawet 0,35, co wynikało z podobieostwa pomiędzy genotypem
rzeczywistego drzewa matecznego danego rodu, a genotypem drzewa, do którego ród ten
próbowano przypisad.
Metoda weryfikacji poprawności zbioru nasion z pojedynczych drzew matecznych w
oparciu o wysoce polimorficzne markery mikrosatelitarne genomu jądrowego może byd skutecznie
stosowana dla wszystkich gatunków drzew pod warunkiem dysponowania odpowiednim
zestawem mikrosatelitów.
Konferencja szkoleniowa 14

Ocena liczby drzew matecznych wykorzystanych do pozyskania materiału rozmnożeniowego
u sosny zwyczajnej
Igor Chybicki
Różnorodnośd genetyczna jest podstawą zachowania zdolności adaptacyjnych populacji.
Dla zachowania dużej różnorodności genetycznej populacji zbiór nasion w celu ochrony
zasobów genowych metodami ex situ (np. zasoby genowe poszczególnych drzewostanów przechowywane
w Leśnym Banku Genów) lub w celu bezpośredniego wykorzystania nasion do
odnowieo i zalesieo powinien byd prowadzony w oparciu o stosunkowo dużą liczbę drzew.
Ostatnie zalecenia Rady Naukowej Leśnego Banku Genów wskazują, by liczba drzew wykorzystywanych
do zbioru nasion nie była mniejsza niż 100 osobników. Tym niemniej, poza możliwością
prowadzenia kontroli w trakcie zbioru nasion, nie istnieją obecnie metody badawcze pozwalające
na określenie liczby drzew, z których pozyskano daną próbę nasion.
U sosny zwyczajnej (oraz innych iglastych) nasiona zbudowane są z makrogametofitu,
którego genom chloroplastowy jest identyczny z genomem chloroplastowym gamety żeoskiej
(a zatem drzewa matecznego) oraz z zarodka, którego genom chloroplastowy jest identyczny z
genomem chloroplastowym gamety męskiej (czyli drzewa ojcowskiego). Dzięki temu, losowa
próba nasion może byd poddana analizie genetycznej prowadzącej do ustalenia polimorfizmu
genomu chloroplastowego osobno dla puli gamet żeoskich i męskich. Wiatropylnośd, masowa
produkcja pyłku oraz krzyżowy system zapłodnienia u sosny sprawiają, że zarodki nasion pochodzących
z pojedynczego drzewa matecznego charakteryzują się dużą zmiennością genomu
chloroplastowego, porównywalną ze zmiennością całej populacji. Z kolei makrogametofity
nasion pochodzących od jednego drzewa posiadają jeden genotyp chloroplastowy. Można
wykazad, że przy założeniu losowego kojarzenia, różnica w polimorfizmie między dwoma typami
gamet jest funkcją liczby drzew matecznych, od których pochodzi próba nasion.
Aby ocenid liczbę drzew matecznych z których pozyskano daną próbę nasion należy porównad
różnorodnośd haplotypów cpDNA obserwowanych w puli makrogametofitów nasion z
różnorodnością haplotypów cpDNA obserwowanych w puli zarodków tych nasion. W tym celu
opracowano metodę badawczą wykorzystującą polimorfizm chloroplastowych markerów mikrosatelitarnych
(cpSSR) umożliwiającą ocenę efektywnej liczby drzew matecznych, z których
pozyskano nasiona. Właściwości estymatora efektywnej liczby drzew matecznych, a tym samym
dokładnośd metody zostały zweryfikowane poprzez serię symulacji komputerowych w
oparciu o polimorfizm 10 loci cpSSR obserwowany wśród drzew matecznych sosny zwyczajnej
zbadanych w ramach niniejszego projektu. Symulacje wykazały dużą dokładnośd oceny efektywnej
liczby drzew matecznych, szczególnie w sytuacji, gdy nasiona otrzymane były z niewielkiej
liczby drzew. Dokładnośd oceny wzrastała wraz ze zwiększaniem liczebności próby badanych
nasion, tym niemniej próba 100 nasion w przypadku sosny zwyczajnej wydaje się wystarczająca
do precyzyjnej oceny parametru.
Opracowaną metodę zastosowano do oceny efektywnej liczby drzew matecznych wykorzystanych
do utworzenia zasobów genowych przechowywanych w Leśnym Banku Genów
Kostrzyca, pochodzących z trzech wybranych drzewostanów nasiennych. Efektywna liczba haplotypów
cpSSR w puli zarodków nasion wyniosła odpowiednio 70,3 , 60,7 , 62,3 i była znacznie
wyższa niż efektywna liczba haplotypów cpSSR obserowana w puli megagametofitów (12,9,
6,8, 20,0). Oceny efektywnej liczby drzew matecznych wyniosły odpowiednio 15,6 , 7,5 oraz
28,9. Tak niskie oceny efektywnej liczby drzew matecznych, z których pozyskano nasiona mogą
wynikad ze zbioru nasion z niewielkiej liczby drzew, bądź z rażących dysproporcji liczby nasion
pozyskanych nawet ze znacznej liczby drzew matecznych. Przedstawione wyniki dyskwalifikują
badane partie nasion jako zasób genowy danego drzewostanu, który powinien byd przechowywany
w Leśnym Banku Genów.
Konferencja szkoleniowa 15

Możliwości weryfikacji pochodzenia nasion z drzewostanów dębowych w oparciu o markery
cytoplazmatyczne
Jarosław Burczyk
Genom cytoplazmatyczny (zarówno chloroplastowy, jak i mitochondrialny) u dębów
dziedziczy się w linii matecznej. Dotychczasowe badania rozkładu zmienności genomu chloroplastowego
prowadzone w skali europejskiej oraz fragmentaryczne badania prowadzone na
terenie Polski (w tym badania w ramach niniejszego projektu) wykazują na skupiskowe rozmieszczenie
haplotypów genomu chloroplastowego. Z uwagi na ograniczony zakres dyspersji
nasion, naturalne odnowienie u dębów powinno sprzyjad jednorodności struktury genetycznej
genomów cytoplazmatycznych w ramach poszczególnych drzewostanów oraz istnieniu różnic
pomiędzy drzewostanami wywodzącymi się z odmiennych linii kolonizacyjnych.
Poszczególne chloroplastowe loci mikrosatelitarne (cpSSR) wykazują niewielki polimorfizm,
tym niemniej, z uwagi na brak rekombinacji genomu chloroplastowego warianty alleliczne
poszczególnych loci tworzą specyficzne kombinacje traktowane jako odmienne, odróżnialne
haplotypy. Biorąc pod uwagę znaczną różnorodnośd haplotypową stwierdzoną u dębów w
ramach niniejszego projektu oraz skupiskowe rozmieszczenie haplotypów w Polsce, przeprowadzono
badania zmienności cpSSR w 9 wybranych drzewostanach nasiennych.
W tym celu wykorzystano 9 loci cpSSR (ccmp4, ccmp7, cmcs10, cmcs3, cmcs5, cmcs6,
mcd4, mcd5, mdt1), które dla drzew matecznych zbadanych w niniejszym projekcie dały 18
różnych haplotypów. Wśród badanych drzewostanów nasiennych stwierdzono 9 haplotypów
znanych wcześniej wśród przebadanych drzew matecznych, ponadto jednak stwierdzono 11
nowych haplotypów występujących głównie w drzewostanie Legnica (4 haplotypy łącznie u 20
drzew) oraz drzewostanie Smolarz (5 haplotypów u 13 drzew). Niektóre drzewostany posiadały
wyłącznie jeden rodzaj haplotypu (Kaczory, Krotoszyn), lub zdecydowaną przewagę jednego
haplotypu (Dziadów, Scytów). Dwa haplotypy o porównywalnej, przeważającej częstości
stwierdzono w drzewostanie Białowieża oraz Legnica, natomiast w drzewostanie Smolarz
stwierdzono obecnośd aż 10 haplotypów, przy czym przeważały 3 o podobnej częstości. O różnorodności
haplotypowej poszczególnych drzewostanów nasiennych może decydowad ich
lokalizacja w stosunku do szlaków migracyjnych dębów, przy czym drzewostany zlokalizowane
u zbiegu odmiennych linii migracyjnych mogą wykazywad dużą różnorodnośd haplotypową.
Rozkład zmienności haplotypów na terenie Polski oraz ich zróżnicowanie pomiędzy
różnymi drzewostanami może byd podstawą do weryfikacji pochodzenia nasion z poszczególnych
drzewostanów. W tym celu należy przeprowadzid szczegółowe badania rozkładu zmienności
cpSSR u dębów w skali całego kraju, co w przyszłości umożliwi określenie rejonów jednorodnych
genetycznie uwzględniających szlaki migracyjne dębów.
Konferencja szkoleniowa 16

Identyfikacja pochodzenia świerka pospolitego w oparciu o markery cytoplazmatyczne, na
przykładzie Nadleśnictwa Gołdap.
Andrzej Lewandowski
Wykorzystując dziedziczący się w linii matecznej, mitochondrialny marker mt15-D02
zweryfikowano pochodzenie świerka pospolitego na terenie Nadleśnictwa Gołdap. Teren Nadleśnictwa
leży w krainie Mazursko-Podlaskiej, a jego znaczną częśd obejmuje Puszcza Romincka
z bogatymi gatunkowo drzewostanami mieszanymi. Lite drzewostany jednogatunkowe zajmują
tylko niecałe 7% powierzchni leśnej, a drzewostany cztero i więcej gatunkowe aż ponad 44%.
Podstawowym gatunkiem lasotwórczym na tym terenie jest świerk. Szczególnie cenne są jego
lokalne ekotypy charakteryzujące się wysoką jakością i zwiększoną odpornością na szkodniki.
Biorąc to pod uwagę teren ten został uznany jako region mateczny (203) dla świerka pospolitego.
Badaniami objęto 24 drzewa mateczne oraz 29 populacji rozlokowanych w miarę równomiernie
na terenie całego Nadleśnictwa. W skład badanych populacji wchodziły 4 rezerwaty
przyrody, 4 wyłączone drzewostany nasienne oraz 21 drzewostanów gospodarczych.
W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że 7 drzew matecznych było obcego
pochodzenia. Również w 11 na 29 badanych populacjach występowały drzewa obcego pochodzenia,
zawierające mitotypy 1 i 2. Skala tego zjawiska jest zróżnicowana, chociaż obejmuje
cały region Nadleśnictwa. We wszystkich przypadkach, obok drzew obcego pochodzenia, występowały
drzewa posiadające lokalny mitotyp 3. Najlepiej sytuacja wygląda w rezerwatach
przyrody. Na cztery badane rezerwaty (łącznie 75 drzew), nie znaleziono ani jednego drzewa z
obcym mitotypem. W drzewostanach gospodarczych u 291 na 467 badanych drzew stwierdzono
obecnośd obcego mitotypu. W tej grupie 12 przebadanych drzewostanów nie zawierało
drzew obcego pochodzenia. Najbardziej niepokojącym zjawiskiem było znalezienie wśród 4
badanych WDN-ów, dwóch ze znacznym udziałem drzew obcego pochodzenia.
W drzewostanie z oddziału 35f, skala tego zjawiska nie była bardzo duża. Obcy mitotyp 1 występował
u 16% drzew a mitotyp 2 w 11%. Natomiast w WDN-ie z oddziału 170j aż 85% drzew
było obcego pochodzenia, odpowiednio 16% i 69% posiadało mitotyp 1 lub 2.
Zakrojone na dużą skalę badania na terenie Nadleśnictwa Gołdap wykazały użytecznośd
zastosowanego markera genetycznego dla określenia pochodzenia świerka pospolitego, w
zależności od jego refugialnej przynależności. Jednoznacznie wykazano niejednorodne pochodzenie
świerka w regionie matecznym 203, dlatego wątpliwym wydaje się zasadnośd funkcjonowania
tego regionu jako bazy nasiennej. Jednocześnie należy podjąd działania ochronne
mające na celu zachowanie ekotypu świerka gołdapskiego.
Konferencja szkoleniowa 17

Identyfikacja gatunków dębów w oparciu o wybrane jądrowe markery mikrosatelitarne
Igor Chybicki
Dąb szypułkowy (Quercus robur) i bezszypułkowy (Q. petraea) należą w Polsce do najważniejszych
gatunków drzew liściastych o znaczeniu lasotwórczym. Pomimo znacznego pokrewieostwa
między tymi gatunkami, istnieje szereg różnic natury ekologicznej. Dla przykładu
dąb szypułkowy ma duże wymagania świetlne, zacienienie znosi tylko we wczesnej młodości.
Ponadto gatunek ten preferuje gleby świeże, głębokie i żyzne, dobrze znosi okresowe zalewanie,
zaś na glebach suchych i ubogich rośnie zdecydowanie słabiej. Dla porównania, dąb bezszypułkowy
jest gatunkiem bardziej ciepłolubnym od dębu szypułkowego oraz ma mniejsze
wymagania glebowe pod względem żyzności i wilgotności siedliska. Rośnie dobrze na płytszych,
suchszych i uboższych glebach, często występuje na piaskach morenowych. Dośd długo
znosi ocienienie w młodości. Pomimo istnienia różnic morfologicznych między typowymi (przeciętnymi)
okazami omawianych dębów, cechy diagnostyczne (szczególnie cechy liści) wykazują
dużą zmiennośd osobniczą, co często uniemożliwia poprawne zidentyfikowanie przynależności
gatunkowej. Identyfikacja przynależności gatunkowej stanowi szczególny problem w praktyce
leśnej, bowiem niewłaściwe oznaczenie gatunku może obniżyd efektywnośd hodowli czy odnowy
lasu.
Intensywne badania ostatnich lat w zakresie genetyki pozwoliły zidentyfikowad regiony
genomu charakteryzujące się istotnym zróżnicowaniem między Q. robur i Q. petraea. Wykazano
ponadto, że pięd opracowanych wcześniej loci mikrosatelitarnych występuje w bliskim sąsiedztwie
regionów wysokiego zróżnicowania międzygatunkowego. Dzięki temu zaistniała możliwośd
opracowania narzędzia do identyfikacji przynależności gatunkowej dębów w oparciu o
analizy DNA.
Wykorzystując opracowane w ramach niniejszego projektu metody molekularne zaproponowano
metodę genetycznej identyfikacji przynależności gatunkowej dębów. W zarysie
metoda ta polega na analizie genotypów jednocześnie w 10 loci mikrosatelitarnych z wykorzystaniem
bayesowskiej techniki grupowania zaimplementowanej w programie STRUCTURE.
STRUCTURE dąży do takiego pogrupowania osobników, aby zmaksymalizowad różnice genetyczne
między grupami przy jednoczesnym zminimalizowaniu odchylenia od stanu równowagi
Hardy’ego-Weinberga oraz równowagi sprzężeniowej wewnątrz grup. Dlatego konieczne jest
analizowanie jednocześnie wielu osobników, natomiast ostatecznym wynikiem jest ocena
prawdopodobieostwa przynależności każdego osobnika do danej grupy.
Metodę STRUCTURE zastosowano do analizy przynależności gatunkowej drzew doborowych
obu gatunków dębu. Analizę wykonano pod założeniem nieznanego statusu gatunkowego
drzew doborowych. Analizy wykazały, że mieszanina drzew doborowych składała się z
dwóch różnych genetycznie grup osobników. Ustalono, że uzyskany podział odpowiada w dużym
stopniu znanej przynależności gatunkowej. Stwierdzono przy tym, że spośród 88 drzew
opisanych jako Q. petraea 81 osobników zostało przyporządkowane do wspólnej grupy z
prawdopodobieostwem większym niż 90%, natomiast genotypy dwóch drzew Q. petraea
wskazywały na pochodzenie mieszaocowe. W przypadku 201 drzew doborowych opisanych
jako Q. robur 172 osobniki zostały przyporządkowane do wspólnej grupy, w tym 168 z prawdopodobieostwem
większym niż 90%. Dla 9 drzew metoda STRUCTURE wskazała na prawdopo-
Konferencja szkoleniowa 18

dobnie mieszaocowe pochodzenie, natomiast dla 20 drzew (10%) metoda wskazała na przynależnośd
do drugiego gatunku dębu (tj. do Q. petraea). Należy podkreślid, że dla 14 spośród 20
drzew prawdopodobieostwo przynależności do Q. petraea przekraczało 90%.
Uzyskane wyniki wskazują na możliwośd błędnego przyporządkowania gatunkowego
drzew doborowych szczególnie w obrębie dębu szypułkowego. Wobec ryzyka propagowania
niewłaściwie oznaczonego materiału rozmnożeniowego konieczna jest zatem weryfikacja przynależności
gatunkowej wskazanych drzew z wykorzystaniem metod biometrycznych. W świetle
uzyskanych wyników konieczna wydaje się również analiza genetyczna pozostałych drzew doborowych
obu gatunków.
Konferencja szkoleniowa 19