Views
3 years ago

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

stość izolowanych

stość izolowanych substancji. Peptydy i białka można otrzymać w sposóbtradycyjny, wyodrębniając je z tkanek zwierzęcych (w tym ludzkich), a niekiedyz roślin. W ostatnich latach rośnie znaczenie chemicznych, a szczególniebiotechnologicznych metod syntezy peptydów i białek.Dobór metody rozdzielania peptydów i białek od zanieczyszczeń,a następnie takich warunków wyodrębniania, które zapewniają otrzymanieproduktu o najwyższej aktywności biologicznej, stanowi z reguły trudny problemrozdzielczy i technologiczny. Najczęściej łatwiejsze jest opracowaniemetodyki oznaczania zawartości izolowanych substancji w poszczególnychetapach syntezy, czy biosyntezy. Jednak, rozwiązanie każdego z tych problemówwymaga z reguły znacznego nakładu pracy eksperymentalnej.Wśród różnych metod rozdzielania peptydów i białek, dominująceznaczenie identyfikacyjne oraz analityczne posiadają metody elektroforetyczne[5]. Ważne i rosnące znaczenie posiada też wysokosprawna chromatografiacieczowa (HPLC). Dla przykładu kolumnowa chromatografia cieczowabardzo często stosowana jest w przemyśle farmaceutycznym doizolowania peptydów i białek na dużą skale.Obecnie, do rozdzielania białek i peptydów metodami chromatografiicieczowej wykorzystywane są praktycznie wszystkie układy chromatograficzne.Stosowana jest chromatografia żelowa (GPC - gel permeation chromatography,albo SEC – size exclusion chromatography) [6,7], chromatografiajonowymienna (IEC – ion exchange chromatography) [8,9], z chromatografiąwykluczania jonowego (ion exclusion chromatography), włącznie.Chromatografia w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) jak i chromatografiaoddziaływań hydrofobowych (HIC) są bardzo często stosowane do rozdzielaniabiałek o wysokiej masie molekularnej. Nawet chromatografia adsorpcyjnaw układzie faz normalnych (NP-HPLC – normal phase high performancechromatography), szczególnie, z chemicznie związaną faząstacjonarną w układzie oddziaływań hydrofilowych (HILIC). W dodatku, szerokiezastosowanie znajdują metody chromatografii powinowactwa (AffinityChromatography – AC), jako odrębna grupa metod separacyjnych o szczególniewysokiej selektywności i specyficzności [10,11].W literaturze można znaleźć wiele procedur dotyczących rozdzielaniakonkretnych peptydów, białek i innych substancji, stanowiących zanieczyszczenia.Nie opracowano, jednak, dotąd takich uogólnionych reguł, któreumożliwiałyby dobór optymalnych warunków rozdzielania zależnie od pierwszo-i wyżej - rzędowej struktury peptydów i białek. Analiza literatury, prezentującejprocedury rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem chromatografiicieczowej, pozwala zauważyć pewne dominujące kierunkipostępowania i uogólnione zasady doboru najkorzystniejszych warunkówrozdzielania tych substancji.W pracy przedstawiono najczęściej stosowane sposoby wpływania naselektywność i sprawność układu w przypadku najważniejszych metod rozdzielaniapeptydów i białek z wykorzystaniem elucyjnej chromatografii cieczowej.114

Publikacja opisuje zjawiska, efekty oraz oddziaływania towarzyszące procesomchromatografii cieczowej oraz możliwości wpływania na retencje peptydówi białek, jak również na selektywność rozdzielania. Przedstawiono równieżodpowiednie przykłady procedur rozdzielania.Peptydy i białka są, jak wiadomo, kwasami i zasadami. W strukturzecząsteczki złożonej z ‘n’ aminokwasów występuje n-1 wiązań peptydowych.Często w cząsteczkach tych substancji występują też często tzw. mostki disiarczkoweoraz wewnętrzne wiązania wodorowe, determinujących drugoitrzecio- rzędową strukturę molekuły. Obecność aminokwasów zawierającychhydrofobowe fragmenty wpływa na wzrost ogólnej hydrofobowości cząsteczkipeptydu lub białka. W zależności od pH rozpuszczalnika cząsteczkipeptydów i białek mogą ulegać kilku ważnym procesom. W pH wyższym odpunktu izoelektrycznego może mieć miejsce dysocjacja protonu od zewnętrznejgrupy karboksylowej. Co więcej, w pH poniżej punktu izoelektrycznegomoże mieć miejsce protonowanie n-terminalnej grupy aminowej.Przy pH bliskim punktowi izoelektrycznemu następuje szczególnie silne obniżenierozpuszczalności peptydu.W zależności od pH eluentu i jego kompozycji (np. modyfikatory eluentupowodujące powstanie par jonowych, sole, modyfikatory) peptydyi białka podlegać następującym procesom:- dysocjacji elektrolitycznej,- tworzeniu par jonowych z innymi peptydami oraz z jonowymidodatkami do eluentu,- pozornemu spadkowi hydrofobowości peptydów i białek na częścipowierzchni przy stężeniu soli bliskiemu „punktu wysolenia”,- solwatacji przez akceptory protonów lub kwasy,- formowaniu się agregatów białek (dimerów i trimerów).Wszystkie te zjawiska mają wpływ na zachowanie się cząsteczek peptydówi białek w roztworach oraz na ich oddziaływania z fazą stacjonarnąw różnych układach chromatograficznych.Na retencję i stopień rozdzielenia peptydów i białek ma wpływ szeregparametrów układu chromatograficznego, takich, jak: typ powierzchni sorpcyjneji uboczne oddziaływania na powierzchni sorbentu, rodzaj liganduzwiązanego z sorbentem, powierzchnia właściwa fazy stacjonarnej, wielkośći porowatość ziaren wypełnienia kolumny, a także, skład, pH, temperatura,prędkość przepływu eluentu, oddziaływania dodatkowych składników eluentunp. stężenie soli w eluencie, przebieg programu elucji i inne parametry,w tym nawet ciśnienie podczas rozdzielania [12].W tabeli 1 przedstawiono przykłady często wykorzystywanych warunkówstosowania chromatografii cieczowej do rozdzielania peptydów / białekw różnych układach chromatograficznych. Dane te mogą być przydatne dlawstępnego doboru warunków przy rozwiązywaniu problemów rozdzielczych,dotyczących peptydów i białek.Najczęściej stosowane są układy faz odwróconych oraz chromatografiajonowymienna. Jednakże, wstępna separacja wykonywana jest z wykorzystaniemchromatografii żelowej (GPC) lub chromatografia wykluczania115

Volume 4/Number 2/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
Camera Separatoria - Zakład Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...
Volume 4/S/2012 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 3/S/2011 - Zakład Chemii Analitycznej
Joanna Czajka M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Bronislaw K. Glod D.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej
Program ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Pawel Piszcz M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Monika Suszko M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus licentiate 3 years - Zakład Chemii Analitycznej
Pytania na egzamin magisterski - Zakład Chemii Analitycznej
wymagania do ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Chemia Wolnych Rodników - Zakład Chemii Analitycznej
Wstęp do Analizy Instrumentalnej - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus MSc 5 years - Zakład Chemii Analitycznej
Chromatografia II - Zakład Chemii Analitycznej
Analiza Instrumentalna I - Zakład Chemii Analitycznej
WYZWANIA DLA CHEMII ANALITYCZNEJ
Volume 4/Number 1/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
analiza instrumentalna - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej ...
Volume 2/S/2010 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 1/S/2009 - Zakład Chemii Analitycznej
3 nd Podlasie's Chromatographic Meeting - Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A2_kationy_gr_III - Katedra i Zakład Chemii ...
Chemia Analityczna Ćwiczenie A12 Katedra i Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A1_kationy_gr_I_II - Katedra i Zakład Chemii ...
Regulamin dydaktyczny - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej
Instrukcja obsługi - Zakład Chemii Fizycznej. Politechnika ...