Views
3 years ago

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

jące długie łańcuchy

jące długie łańcuchy alkilowe, są odpowiedniejsze do rozdzielania cząsteko charakterze mniej hydrofobowym [34].Wskazane jest, aby sorbenty o modyfikowanej chemicznie powierzchnisorpcyjnej były zabezpieczone przed oddziaływaniem resztkowych gruphydroksylowych z fazą ruchomą, tzn. aby miały tzw. „end-capping” - zastąpieniewolnych grup OH grupami OCH 3 , albo poprzez silanizację. Polepszato symetrię pików, a stąd stopień rozdzielenia w przypadku mniejszych peptydówi umożliwia wysoki stopień odzysku w przypadku białek [35].Szeroko badany był wpływ rozkładu wielkości ziaren i porowatościwypełnienia kolumny na rozdzielanie peptydów i białek [36]. Stwierdzonowpływ takich parametrów jak rozmiar i kształt ziaren, średnica i kształt poróworaz powierzchnia wymiany masy. W zależności od wielkości rozdzielanychpeptydów i białek, dobiera się złoże o odpowiednich średnicach porów. I tak,dla małych peptydów (do 10 aminokwasów) Krstulovic i Brown [37] zalecająkolumny z wypełnieniem o średnicy porów do 60Å. Dla średnich peptydów(10-30 aminokwasów) i małych białek najskuteczniejsze są kolumny o średnicyporów 100Å, 120Å i 150Å. Natomiast dla większych peptydów (ponad30 aminokwasów) i dla białek polecają sorbenty o porach 300Å i większych.Tweeten i Tweeten [29] stwierdzili w przypadku kolumn wypełnionychmakroporowatym poli -styrenem-diwinylobenzenem, że dalszy wzrost wielkościporów (do 1000Å) nie wpływa na polepszenie retencji białek o dużejmasie cząsteczkowej (do 335 kD). W celu maksymalizacji sprawności kolumnydo zastosowań analitycznych wykorzystuje się sorbenty o małychziarnach (o średnicy 5 i 3 μm), a nawet coraz częściej, wspomniane wyżej,nieporowate sorbenty o średnicy ziarna 1 μm. Wtedy stosowane kolumnymogą mieć nawet tylko 10 mm długości [21]. Jednakże, najczęściej stosujesię kolumny o długościach 125, 150 i 250 mm. Przy czym, im mniejsza wielkośćziaren sorbentu, tym krótsza może być kolumna. Obecnie duże zainteresowaniebudzą tzw. monolityczne kolumny o porowatym wypełnieniu zajmującychcałą objętość kolumny. Charakteryzują się one szczególnie niskimiwartościami tzw. impedancji rozdzielania [38]. Bez wątpienia w najbliższymczasie kolumny monolityczne będą powszechnie stosowane.ELUENTY, MODYFIKATORY ELUENTU I PROGRAMY ELUCJISTOSOWANE W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCHW układach faz odwróconych głównym czynnikiem wpływającym naretencję jest zawartość organicznych składników w eluencie, takich jak acetonitryl(AcCN), metanol (MeOH), etanol (EtOH), izopropanol (iPrOH), tetrahydrofuran(THF), czy dioxan (DX) [39]. Dodatkowo, w celu optymalizacjiwarunków rozdzielania należy wpływać na retencję substancji o charakterzezarówno kwaśnym jak i zasadowym, do których należą peptydy i białka, poprzezdodatek kwaśnego lub zasadowego modyfikatora do eluentu.Rozdzielanie peptydów i białek najczęściej przeprowadza się w warunkachelucji gradientowej. Program zmian stężenia organicznego składni-120

ka eluentu (AcCN, MeOH) ustala się w zakresie od 10-25% v/v do 75-90% v/v,dodając do eluentu A i B modyfikatora zmieniającego pH eluentu i cofającegodysocjację kwasowo-zasadową, w konsekwencji modyfikującego hydrofobowośći polarność cząsteczek peptydów / białek.Najczęściej wykorzystywanym organicznym składnikiem eluentu jestacetonitryl. Powodem tego jest jego wysoka transparentność przy niskichdługościach fali w zakresie UV. Ponadto jego niska lepkość oraz wysoka lotność,która ułatwia dalszą izolację produktu [40]. Rozpuszczalność peptydówi białek jest, także lepsza w acetonitrylu niż w innych organicznychskładnikach eluentu, stosowanych w RP-HPLC.Znacznie rzadziej wykorzystywane są alkohole. Niekiedy stosuje sięizopropanol, aby zwiększyć rozpuszczalność w fazie ruchomej solwatów dużychpeptydów i białek [41]. Użycie izopropanolu lub jego mieszaniny z acetonitrylem(w proporcji od 1:2 do 2:1) jest uzasadnione w przypadku rozdzielaniapeptydów i białek stosunkowo bardzo hydrofobowych. Izopropanol,jako rozpuszczalnik o wyższej sile elucyjnej w układach faz odwróconych odAcCN, silniej oddziałuje z centrami alkilo - siloksanowymi sorbentu [42] niżnp. metanol.Najczęściej stosowaną szybkością narostu objętościowego udziałuskładnika organicznego do rozdzielania peptydów i białek jest 2-5%/min.Zbyt wolny narost stężenia hydrofobowego składnika eluentu może powodowaćzbytnie rozcieńczenie otrzymywanych frakcji eluatu [43]. Końcowestężenie rozpuszczalnika organicznego w programie elucji nie powinno prowadzićdo całkowitego usunięcia wody z kolumny. Utrudniałoby to doprowadzaniefazy stacjonarnej do równowagi z początkowym eluentem. To możeprowadzić do braku powtarzalności retencji peptydów i białek, szczególniewcześnie eluowanych substancji. Najczęściej nie przekracza się 95% substancjiorganicznej w eluencie.Natężenie przepływu fazy ruchomej przez kolumnę klasycznie pakowanąo średnicy 4-4,6 mm jest rzędu 0,8-2,0 ml/min oraz dla kolumny monolitycznejaż do 5 ml/min. Od natężenia przepływu zależy sprawność rozdzielaniaoraz ciśnienie na wlocie do kolumny. Bylina i współpracownicyzauważyli wpływ ciśnienia panującego w kolumnie na retencję podczas rozdzielaniainsuliny w warunkach izokratycznych [12]. Wzrost ciśnienia w kolumnieo 1 bar powodował wzrost czasu retencji białka o 1-5 s. Ostatnio Guiochoni współpracownicy [44] potwierdzili występowanie tych efektówi podjęli próby ich wyjaśnienia. Najważniejsze modyfikatory fazy ruchomej,stosowane w układach faz odwróconych, zestawiono w tabeli 2.121

Volume 4/Number 2/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
Camera Separatoria - Zakład Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...
Volume 4/S/2012 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 3/S/2011 - Zakład Chemii Analitycznej
Bronislaw K. Glod D.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej
Program ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Pawel Piszcz M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Joanna Czajka M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Monika Suszko M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus licentiate 3 years - Zakład Chemii Analitycznej
Pytania na egzamin magisterski - Zakład Chemii Analitycznej
wymagania do ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Chemia Wolnych Rodników - Zakład Chemii Analitycznej
Wstęp do Analizy Instrumentalnej - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus MSc 5 years - Zakład Chemii Analitycznej
Analiza Instrumentalna I - Zakład Chemii Analitycznej
Chromatografia II - Zakład Chemii Analitycznej
WYZWANIA DLA CHEMII ANALITYCZNEJ
Volume 4/Number 1/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
analiza instrumentalna - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej ...
Volume 2/S/2010 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 1/S/2009 - Zakład Chemii Analitycznej
3 nd Podlasie's Chromatographic Meeting - Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A2_kationy_gr_III - Katedra i Zakład Chemii ...
Chemia Analityczna Ćwiczenie A12 Katedra i Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A1_kationy_gr_I_II - Katedra i Zakład Chemii ...
Regulamin dydaktyczny - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej
Instrukcja obsługi - Zakład Chemii Fizycznej. Politechnika ...