Views
3 years ago

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej

cej zmiany stężenia

cej zmiany stężenia detektora lub produktu jego reakcji w czasie (rys. 4). Toprzesunięcie spowodowane jest tym, że antyoksydanty zawarte w próbcenie dopuszczają do reakcji rodnika z detektorem. Stąd podstawowym wymogiemtej metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem była znacznie szybszaod analogicznej reakcji detektora.Duża ilość metod pomiaru CPA powoduje, że ten sam materiał mierzonyza pomocą różnych metod może dawać odmienne wyniki. W celuujednolicenia wyników w większości przypadków stosuje się przeliczanie ichna jeden ze standardów, przeważnie stężenie Troloksu, syntetycznego, rozpuszczalnegow wodzie analogu witaminy E.CHROMATOGRAFICZNY POMIAR STRESU OKSYDACYJNEGOCPA jest odwrotnie skorelowany z inną sumaryczną wielkością, mianowicieze stresem oksydacyjnym. Pośrednią grupę technik oznaczaniastresu oksydacyjnego jest analiza niektórych związków naturalnie występującychw układach biologicznych. Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznegostężenia tioli, stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaciczy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego. Wolne rodniki reagująz praktycznie wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi (najbardziejistotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami). Produkty tych reakcjisłużą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków. Ponieważ sąone nietrwałe ich bezpośrednie oznaczanie w próbkach materiału biologicznego(np. w osoczu, czy w homogenatach tkankowych) nie jest zazwyczajmożliwe, dlatego też pośrednią metodą oznaczania stresu oksydacyjnegojest analiza produktów tych reakcji. Uszkodzenie wolnorodnikowe białekmierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny w bityrozynę lub stężeniemgrup karbonylowych. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodzeńzasad purynowych i pirymidynowych. Wśród istotnych wskaźników uszkodzeniakwasów nukleinowych wyróżnić należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninęi 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę. Inne podejście polega na określeniu aktywnościenzymu reperującego nici DNA, poli-ADP-rybozy. Wydaje się, żew chwili obecnej największe zainteresowanie wzbudza określenie stopniaperoksydacji lipidów. Oznaczanymi produktami ich peroksydacji jest dialdehydmalonowy (MDA) [7], 4-hydroksy-2-nonenal (HNO), oksysterole (7α-,7β-, 24, 25- i 27-hydroksycholesterol oraz epoksycholesterol [8a]), hydroksynadtlenki,sprzężone dieny czy też ostatnio intensywnie badane izomeryprostaglandyny F 2 . F 2 -izoprostany (w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstająprzede wszystkim w procesie peroksydacji kwasu arachidonowego i eikozanoidów(prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany).Produktami peroksydacji, głównie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych(PUFA), są aldehydy, hydroksynadtlenki i ketony, a ich produktemkońcowym jest dialdehyd malonowy (MDA). Pomiar jego stężenia jest powszechnieuznawany za miarę wolnorodnikowego uszkodzenia lipidów [7].Najczęściej stosuje się do tego, ze względu na prostotę obsługi i wysoką54

czułość, test kwasu tiobarbiturowego, TBA [7]. Niestety test TBA jest wysoceniespecyficzny i trudny do zastosowania w próbkach biologicznych. Dodatniwynik otrzymuje się także z cukrami, niektórymi aminokwasami, kwasamiżółciowymi, alkenami, alkadienami, itp. Pewne udoskonalenie uzyskano stosującchromatografię w układzie faz odwróconych z detekcją fluorometryczną[10, 11] lub fotometryczną przy długości fali 535 nm [13-16]. W tym przypadkuderywatyzacja (kwasem tiobarbiturowym) wpływa zarówno narozdział, jak i na detekcję. Ciągle jednak etap derywatyzacji związany z opisanąniejednoznacznością, jest wymagany. Metodę tę próbowano zmodyfikowaćstosując derywatyzację 2,4-dinitrofenylohydrazyną [17-19] lub diaminonaftalenem[20] z detekcją fotometryczną przy 310 nm. Etapderywatyzacji usunięto stosując tzw. chromatografię par jonowych [21, 22](dialdehyd jest kwasem i dlatego jest on słabo zatrzymywany na fazieRP-18). Detekcja fotometryczna przy 267 nm pozwala na jednoczesną analizęMDA z dwoma powszechnie występującymi w surowicy krwi antyoksydantami,tzn. kwasem askorbinowym i moczowym. Na rysunku 5 przedstawionoanalogiczny chromatogram uzyskany metodą chromatografiiwykluczania jonowego (jest to technika predysponowana do rozdziału słabychkwasów), takich jak MDA (pK a ~4.5) [23]. Porównany on zostałz chromatogramem uzyskanym po derywatyzacji MDA.AAAUA267nmMDAB535nm20 minRys. 5. Chromatogram jonowo-wykluczający 100 μM kwasu (AA) – askorbinowego,(UA) – moczowego, (MDA) – dialdehydumalonylowego i - 25 μM MDA . TBA (dolny wykres).Warunki: kolumna – 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL SCH(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma:(A) - 3 mM H 2 SO 4 , 3 mM TBABr, 5% ACN, temp. – 40°C; (B) – 1 mM H 2 SO 4 , 15% ACN,temp. – 20°C; detektor UV-267/535 nm55

Volume 4/Number 2/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
Camera Separatoria - Zakład Chemii Analitycznej - Uniwersytet ...
Volume 4/S/2012 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 3/S/2011 - Zakład Chemii Analitycznej
Joanna Czajka M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
POSTĘPY CHROMATOGRAFII - Zakład Chemii Analitycznej
Bronislaw K. Glod D.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Program ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Pawel Piszcz M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Monika Suszko M.Sc. - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus licentiate 3 years - Zakład Chemii Analitycznej
Pytania na egzamin magisterski - Zakład Chemii Analitycznej
wymagania do ćwiczeń - Zakład Chemii Analitycznej
Wstęp do Analizy Instrumentalnej - Zakład Chemii Analitycznej
Chemia Wolnych Rodników - Zakład Chemii Analitycznej
Sylabus MSc 5 years - Zakład Chemii Analitycznej
Analiza Instrumentalna I - Zakład Chemii Analitycznej
Chromatografia II - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 4/Number 1/2012 - Zakład Chemii Analitycznej ...
WYZWANIA DLA CHEMII ANALITYCZNEJ
analiza instrumentalna - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej ...
Volume 1/S/2009 - Zakład Chemii Analitycznej
Volume 2/S/2010 - Zakład Chemii Analitycznej
3 nd Podlasie's Chromatographic Meeting - Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A2_kationy_gr_III - Katedra i Zakład Chemii ...
Regulamin dydaktyczny - Katedra i Zakład Chemii Fizycznej
Chemia Analityczna Ćwiczenie A12 Katedra i Zakład Chemii ...
Analiza jakościowa_A1_kationy_gr_I_II - Katedra i Zakład Chemii ...
Analiza jakosciowa_A5_aniony_gr_III_IV - Katedra i Zakład Chemii ...