Enzymy - Ústav lékařské chemie a biochemie

Reagencie:1) škrobový maz 10 g/l (1 g škrobu třepat nebo zahřívat s vodou, suspenzi lít pomalu do100 ml vroucí vody, povařit 2 - 3 min)2) sacharosa 10 g/l (roztok denně čerstvý)3) sacharasa4) α-amylasa: sliny zředěné v poměru 1 : 10 (denně čerstvý roztok)5) Fehling I: CuSO 4 . 5 H 2 O 70 g/l6) Fehling II: NaOH 250 g a vinan draselno-sodný 350 g v 1 l deionizované vody7) Lugolův roztok I 2 20g a Kiv 1 l deionizované vodyPracovní postup:a. Připravte reakční směsi do 4 zkumavek podle tohoto schématu:1 2 3 4škrob 10 g/l 5 ml - 5ml -sacharosa 10 g/l - 5 ml - 5mlamylasa 1 ml 1 ml - -sacharasa - - 1 ml 1 mlb. Všechny zkumavky inkubujte 30 minut v termobloku při 37 °C.c. Určete, kde proběhlo štěpení substrátu, redukční zkouškou s Fehlingovým činidlem aoznačte specifický enzym pro každý substrát. Zároveň proveďte slepou zkoušku, zdaFehlingův roztok není redukován roztokem škrobu a sacharosy.d. Ve zkumavce, kde je škrob jako substrát, se přesvědčte také o štěpení zkouškou sLugolovým roztokem (silně zředit: cca 4 kapky/10 ml vody).Vyhodnocení:Výsledky štěpení uveďte do tabulky v protokolu symboly + (substrát rozštěpen) a −(substrát se neštěpí).3. Vliv pH na aktivitu enzymůPrincip:Vliv pH bude demonstrován na příkladu pepsinu. Jsou různé formy aktivního pepsinu,které se poněkud druhově liší a které jsou také různě označovány. Všechny patří dopodpodtřídy aspartátových endopeptidas (EC 3.4.23), tj. mají dva proti sobě orientovanézbytky kyseliny asparagové ve svém aktivním centru, podílející se na acidobazické katalýze,a mají kyselé pH optimum. Dalšími příbuznými vlastnostmi vytvářejí tzv. peptidasovourodinu A1 (EC 3.4.23.1, EC 3.4.23.2, EC 3.4.23.3). Původně udávaným vlastnostem lidskéhopepsinu odpovídá enzym charakterizovaný u vepřů jako pepsin A (EC 3.4.23.1), který setvoří v kyselém prostředí v žaludečním lumen limitovanou proteolýzou z neaktivníhoprekurzoru - pepsinogenu A, produktu hlavních (zymogenních) buněk žaludeční sliznicepředevším ve fundu, a to intramolekulární reakcí (autoaktivací) při pH nižším než 5, neboaktivním pepsinem (autokatalýza). Při pH vyšším než 2 uvolněné peptidy zůstávají navázány4