Вестник биотехнологиии физико-химической биологииимени Ю.А. ОвчинниковаНаучно-практический журналОснован в 2005 году2006, Т. 2, № 2Главный редакторР.Г. ВасиловРедакционная коллегияЕ.Г. Борисенко, В.С. Воробьев, С.И. Матаев, Ю.В. Махотин, О.Я. МезеноваРедакционный советВ.А. Быков (Москва), В.А. Вахитов (Уфа), А.А. Воробьев (Москва),В.Г. Дебабов (Москва), В.В. Зверев (Москва), А.И. Иваненко (Москва),В.Т. Иванов (Москва), Л.В. Калакуцкий (Пущино), М.П. Кирпичников (Москва),О.И. Киселев (Санкт-Петербург), А.И. Мирошников (Москва), Т.В. Овчинникова (Москва),О.Н. Озолинь (Пущино), Е.Н. Орешкин (Москва), А.Н. Панин (Москва),Е.В. Пименов (Киров), В.О. Попов (Москва), Л.С. Сандахчиев (Новосибирск),К.Г. Скрябин (Москва), Г. Хаммерлинг (Германия), Р.М. Хаитов (Москва),В.И. Швец (Москва), Н.К. Янковский (Москва)Журнал зарегистрирован в РосохранкультуреРег. ПИ № ФС77-19745 от 11 апреля 2005 г.Зав. редакцией О.В. ВоробьеваАдрес: 119296 Москва, Университетский пр-т, 9Тел.: 8-916-640-76-18, 8-903-143-99-14E-mail: obr@biorosinfo.ru, ptashka095@rambler.ruУчредитель и издатель:АНО «Информационно-аналитический центрмедико-социальных проблем»Адрес: 127581 Москва, Керамический проезд, 53, кор. 1Тел.: 8-916-251-64-13E-mail: raifvasilov@hotmail.comИздается при поддержкеОбщества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова© Информационно-аналитический центрмедико-социальных проблем, 2006.

Вестник биотехнологиии физико-химической биологииимени Ю.А. Овчинникова2006, Т. 2, № 2СОДЕРЖАНИЕКолонка главного редактораК читателям. Р.Г. Василов..................................................................................................................................4Оригинальные статьиРазработка лекарственного препарата Дельтаферон на основе аналога рекомбинантногогамма-интерферона человека. П.Н. Мирошников, Л.Р. Лебедев ....................................................................5Синтезированный в E. coli лектин гороха посевного (PSL) способен инициироватьклубенькообразование на люцерне посевной при ее инокуляции Rhizobium leguminosarum bv. viciae.И.И. Губайдуллин, Ал.Х. Баймиев, Ан.Х. Баймиев, А.В. Чемерис, В.А. Вахитов ....................................11АТР-зависимый транспорт сукцината в везикулы плазматических мембран дрожжейSaccharomyces cerevisiae. В.В. Петров.......................................................................................................... 17Особенности полиморфизма генов HLA II класса у пациентов с воспалительными заболеваниямипародонта. Е.Н. Николаева, В.Н. Царев, Е.А. Горбачева, Е.В. Ипполитов, Т.Н. Царева.......................... 21Новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI из Arthrobacter species 7М06 узнаетоктануклеотидную палиндромную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’.В.А. Чернухин, Ю.Г. Каширина, Ю.Э. Томилова, Д.А. Гончар, В.С. Дедков,Н.А. Михненкова, С.Х. Дегтярев...............................................................................................................29Ускорение процесса биотермической санации и последующего компостирования твердыхкоммунальных отходов при механизированной переработке.А.В. Гарабаджиу, В.А. Галынкин, Г.В. Козлов, Г.Г. Няникова.................................................................... 35Краткие сообщенияПовышение антимикробной активности цефалоспоринов препаратами РНК.Т.А. Терещенко, Г.М. Левагина, В.И. Масычева, А.О. Белкина ................................................................. 41ОбзорыКлонирование и экспрессия генов в молекулярных колониях.Т.Р. Саматов, Е.В. Четверина, А.Б. Четверин..........................................................................................45Концепция создания международной коалиционной программы по биобезопасности.А.А. Воробьев, В.И. Евстигнеев, Е.В. Пименов, Р.Г. Василов, В.В. Кутырев...........................................50Врожденный иммунитет и защита от патогенов. Б.Ф. Семенов....................................................................54Вакцинопрофилактика: прошлое, настоящее, будущее. В.В. Зверев..............................................................58Страницы историиК 50-летию важной вехи в развитии молекулярной биологии – открытия Артуром КорнбергомДНК-полимеразы. В.С. Воробьев, О.В. Воробьева.....................................................................................63Юбилейные и знаменательные даты 2006 года................................................................................................68ХроникаСобытия первого полугодия 2006 года.............................................................................................................70ИнформацияПредстоящие мероприятия 2006 года..............................................................................................................85Правила для авторов................................................................................................................................862

Колонка главного редактораК читателямВторой номер журнала за 2006 год готовился к печати, когда в конце марта пришла скорбная весть о неожиданнойсмерти от тяжелой непродолжительной болезни президента Общества биотехнологов России имениЮ.А. Овчинникова, члена редакционного совета нашего журнала, академика РАМН Анатолия АндреевичаВоробьева. Это большая потеря для энтузиастов, объединившихся в последнее время с целью возрождения былойславы отечественной биотехнологии. За два с небольшим года было сделано много, но из команды ушел лидер,мудрый наставник и прекрасный русский, широкой души человек. Его будет очень не хватать всем оставшимся придальнейшем движении вперед.Отдавая дань уважения памяти А.А. Воробьева, редколлегия помещает некролог о нем, публикует его докладпо проблеме биобезопасности на III съезде Общества биотехнологов в октябре 2005 г. и представляет информационныематериалы о «лебединой песне» покойного ученого – задуманной им незадолго перед кончиной конференциипо биобезопасности, которую провели уже его ученики и товарищи в начале июня в отсутствие инициатора в еголюбимом городе – Санкт-Петербурге, где он учился в 40-е годы в Военно-морской медицинской академии. Печатаютсяв этой связи и доклады на данной конференции двух академиков РАМН – ученика и преемника на кафедреАнатолия Андреевича В.В. Зверева и коллеги и друга Б.Ф. Семенова.В номере традиционно выдерживается принятая структура оригинальных статей, кратких сообщений и обзоров.На этот раз также дается подборка работ фундаментального и прикладного характера. Высокий методическийи аналитический уровень характеризует работу Т.Р. Саматова, Е.В. Четвериной, А.Б. Четверина (Институт белкаРАН, Пущино) о клонировании и экспрессии генов. Очень четкое исследование проведено П.Н. Мирошниковым,Л.Р. Лебедевым из Института медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Новосибирская область) ополучении дельтаферона на основе рекомбинантного гамма-интерферона человека. Скрупулезно выполнена работаИ.И. Губайдуллина с соавт. (Уфимский научный центр РАН), посвященная выяснению роли лектинов у растений.Продолжается публикация цикла исследований по рестриктазам сотрудников НПО «СибЭнзим» (Новосибирск),в котором они делятся своими решениями преемственных задач в этой важной области молекулярной биологии:В.А. Чернухин с коллегами представили данные о новой сайт-специфической эндонуклеазе AbsI из бактерий. О том,как врачи-практики (стоматологи) пытаются применить генетические подходы к выяснению этиопатогенетическитрудных проблем медицины, излагается в статье Е.Н. Николаевой и др. из МГМСУ.Наряду с этим печатается работа профессора А.В. Гарабаджиу с соавт. из Санкт-Петербургского государственноготехнологического института об опыте применения биотехнологии в плане биодеградации, а точнее:решения задачи утилизации твердых коммунальных отходов с помощью биологических методов. Таков диапазонбиотехнологии – от хлебопечения и сыроварения до сверхтонкой биохимии, от решения глобальных экологическихпроблем до получения новых биологических модификаций и т.д.Читателям предлагается исторический материал об обстоятельствах обнаружения ДНК-полимеразы АртуромКорнбергом – это знаменательное открытие было сделано 50 лет назад.В информационно-хроникальном отделе помещены сведения о наиболее интересных мероприятиях по профилюжурнала, произошедших в первом полугодии с.г. Особенно хотелось бы обратить внимание на сообщение о состоявшемсяв апреле в Бостоне Международном конгрессе «БИО-2006» – беспрецедентном событии в современнойбиотехнологии, собравшем около 20000 специалистов из разных стран.Главный редактор,вице-президент Общества биотехнологов России,профессор Р.Г. ВАСИЛОВ4

оригинальные статьиУДК 578.245Разработка лекарственного препарата Дельтаферонна основе аналога рекомбинантного гамма-интерфероначеловекаП.Н. МИРОШНИКОВ * , Л.Р. ЛЕБЕДЕВИнститут медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»,Бердск-10, Новосибирская областьРазработана технология получения препарата Дельтаферон – аналога рекомбинантного гамма-интерферона человека.Получены партии высокоочищенного дельтаферона и исследована их специфическая активность. Оценено содержание высокополимерныхпримесей в полученных образцах. Созданы экспериментальные лекарственные формы, которые позволяютсохранять белок в нативном состоянии, без потери специфической активности.Ключевые слова: аналог человеческого гамма-интерферона, дельтаферон, рекомбинантные белки, E. coli.Иммунный интерферон (IFN-) может рассматриватьсяв качестве компонента лекарственных средств,предназначенных для лечения вирусных, онкологическихи аутоиммунных заболеваний. За рубежом создан рядлекарственных препаратов на его основе: «Иммунерон»(США), «Иммуномакс» (Япония), «Имукин»(Германия). В России технология получения препаратана основе IFN- разработана в Институте прикладноймикробиологии (г. Протвино Московской обл.), а такжев ООО «Фармаклон» (г. Пущино Московской обл.).Однако отечественные препараты на основе этого белкаеще проходят клинические испытания, а зарубежные аналогиимеют высокую цену, обусловленную сложностьюпроизводства IFN- и его повышенной лабильностью.Ранее в НИИ биоинженерии ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор»(п.г.т., Кольцово Новосибирской обл.) были проведеныработы по получению аналогов IFN- с улучшеннымисвойствами. Один из созданных аналогов имел укороченныйна 10 аминокислот С-конец молекулы и 3 аминокислотныезамены: аргинин 129 -лизин 130 -аргинин 131 наглицин 129 -серин 130 -аланин 131 [1]. Данный белок получилназвание дельта 10, или дельтаферон. Было показано,* Автор для переписки:© 2006 г. Мирошников Павел Николаевич,младший научный сотрудник Институтамедицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»633010 Новосибирская область, г. Бердск-10,а/я 112, НИКТИ БАВТел.: (38341) 5-19-60E-mail: pavmir@ngs.ruчто подобные изменения в белковой молекуле привелик 20-кратной потере антивирусной активности по сравнениюс полноразмерным IFN-, но не сказались на егоиммуномодулирующих свойствах [2]. Также в результатеданной модификации у дельтаферона появился ряд положительныхпо сравнению с IFN- признаков, среди которыхнаиболее интересными являются его устойчивостьк протеолитическим ферментам и микробный биосинтезбелка в растворимой форме. Эти свойства сделали дельтаферонудобным объектом для исследования. Даннаяработа посвящена разработке препаратов на его основес выраженным терапевтическим эффектом и изучениюбиохимических свойств.Материалы и методыВ работе была использована плазмида рIFN-10[1], несущая ген дельтаферона под контролем тандема изtrp-промоторов в качестве регуляторного элемента. Плазмидасодержит ген устойчивости к тетрациклину (tet). Вкачестве штамма-реципиента использовали Escherichiacoli MH-1 (ara-leu (araD139, (ara-leu) f697, lac x 74,gal U, gal K, hsr - , hsm + , strA), Tc r [3]. Трансформациюкомпетентных клеток проводили кальциевым методом,как описано в [3]. В качестве селективной среды дляотбора трансформированных клеток использовали L-агарс добавлением тетрациклина (10 мкг/мл). Ферментациюпроводили в колбах на среде М9 [4] с добавлением казаминовыхкислот (2 г/л) и тетрациклина (20 мкг/мл),при температуре +37 °С и частоте вращения качалки5

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2160 мин –1 до конца логарифмической фазы роста. Клеткисобирали центрифугированием. Разрушение клетокпроводили на ультразвуковом дезинтеграторе с частотойколебания стержня 22 кГц, при температуре суспензиине выше +10–12 °С. Для ионообменной хроматографиина стадии очистки белков использовали КM-сефарозу(Amersham Biosciences, Швеция).Электрофорез препаратов в денатурирующих условияхпроводили в 15%-ном полиакриламидном геле, какописано в [5]. Вычисление относительного содержанияцелевого белка осуществляли обработкой полученныхэлектрофореграмм в пакете программы «Gel-pro analyzerVer. 3.1» (Media Cybernetics Inc. США). Определениеконцентрации белка проводили по методам [6, 7]. Образцыполученных препаратов были проанализированына содержание примесных белков и нуклеиновых кислотметодами иммуноферментного анализа [8] и молекулярнойгибридизации [4]. Примеси эндотоксина определялипо методу [9]. Антивирусную активность препарата,выраженную в подавлении цитопатического действиявируса энцефаломиокардита на культуре диплоидныхфибробластов человека, определяли по методу [10].дельтаферон накапливался в супернатанте. На первойстадии очистки дельтаферона применяли ионообменнуюхроматографию на КM-сефарозе.Рис. 1. Электрофоретический анализ образцов биомассы,содержащей рекомбинантный дельтаферон. Номерадорожек соответствуют номеру образца биомассыРезультаты и обсуждениеКультивирование штамма-продуцента. Компетентныеклетки E. coli MH-1 трансформировали плазмидойрIFN-10 с последующим высевом на селективнуюагаризованную среду. Выросшие колонии трансформированныхклеток рассевали секторами на агаризованнуюсреду, содержащую тетрациклин. Клетки из каждогосектора отбирали микробиологической петлей и анализировалина содержание в них целевого белка. Клетки снаибольшим содержанием целевого белка использовалисьдля получения посевного материала и дальнейшей наработкибиомассы. Анализ клонов и их отбор по продуктивностипозволили стабилизировать процесс получениякондиционной биомассы и повысить в ней содержаниедельтаферона. Анализ 3 образцов биомассы представленна рисунке 1, где видно, что наблюдается стабильнаяпродукция дельтаферона в клетках штамма-продуцента.Относительное содержание дельтаферона составило всреднем 17% от общего клеточного белкаВыделение и очистка дельтаферона. Разрушениебиомассы клеток, содержащих дельтаферон, проводилиультразвуком сеансами по 20–25 с до сниженияоптической плотности суспензии при длине волны 550нм до 50–60% от исходного значения. Полученную суспензиюцентрифугировали при 12 тыс. об/мин., при этом6Рис. 2. Профиль первой хроматографии дельтаферонана КМ-сефарозе. Номера дорожек соответствуютномеру фракции

П.Н. Мирошников, Л.Р. Лебедев, с. 5–10При выбранных условиях дельтаферон практическиполностью сорбировался на колонке, в то время какзначительная часть балластных белков не была подверженасорбции и удалялась при отмывке колонки. Дляэлюции дельтаферона с колонки был разработан составградиента: 50 мМ Трис, рН 8,3 – 50 мМ цитрат, рН6,5 с 0,5 М NaCl. Профиль хроматографии и электрофоретическийанализ собранных фракций представлен нарисунке 2. Анализ фракций показал, что на этой стадииудалось достигнуть 80% чистоты целевого белка. Доочисткудельтаферона проводили рехроматографией наКM-сефарозе. Наносимый раствор белка подтитровывалидо значения рН 6,3. Элюцию белка осуществлялив градиентах NaCl от 0 до 1,0 М и значении рН от 6,3до 8,3. Профиль второй хроматографии представлен нарисунке 3. Дельтаферон элюировался с сорбента в видеузкого пика и имел чистоту более 98%. Электрофоретическиехарактеристики конечной субстанции дельтаферонаприведены на рисунке 4.Данные по выделению и очистке белка из 30 гклеток представлены в таблице 1.Таблица 1Данные по выделению и очистке дельтаферонаИз таблицы видно, что при использовании разработанногоспособа удается получить из 1 г влажных клетококоло 6 мг белка с чистотой не менее 98%. По описаннойвыше схеме были наработаны 4 серии субстанциидельтаферона. Противовирусная активность препаратовсоставила не менее 106 Ед./мг белка. Полученные образцысубстанций были проанализированы согласно методамконтроля для медицинских и иммунобиологическихпрепаратов, вводимых людям (МУК 4.1/4.2.588-96).Средние значения результатов анализов 4 серий, представленныев таблице 2, свидетельствуют о соответствиидельтаферона по чистоте, по содержанию примесей клеточныхбелков, ДНК и липополисахаридов, указаннымв МУК допустимым нормам.СтадияочисткиЭкстрактклеток1-я хроматография2-я хроматографияОбъеммлОбщий белок Дельтаферон Выход%мг/мл мг % мг510 7,5 3825 17,7 677 10070 3,67 256,9 90 231,21 3469 2,75 189 98 185 27,3Рис. 3. Профиль повторной хроматографии дельтаферонана КМ-сефарозе. Номера дорожек соответствуютномеру фракцииРис. 4. Электрофоретический анализ субстанциидельтаферона.1, 3 – дельтаферон (25 и 45 мкг);2 – белки-маркеры молекулярной массы7

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 28Таблица 2Содержание примесных веществ в полученныхпрепаратахПоказательЧистотаи гомогенностьПримеси белковштамма-продуцентаПримеси ДНКштамма-продуцентаПримеси липополисахаридовТребованияМУК4.1/4.2.588-96Дельтаферон(средниезначения)не менее 95% 98%не более200 нг/мгпрепаратане более100 пкг/мгпрепаратане более200 нг/мгпрепарата40 нг/мгпрепарата80 пкг/мгпрепарата30 нг/мгпрепаратаРазработка лекарственной формы препарата.Одним из важных этапов при создании медицинскогопрепарата является разработка его лекарственной формы,позволяющая сохранять исходную активность длительноевремя. Была предложена лекарственная форма дельтаферона,представляющая собой лиофильно высушенныйбелок с 5%-ным реополиглюкином в качестве наполнителя,а также проведены исследования по выбору условийхранения субстанции и лекарственной формы дельтаферона.На начальном этапе исследования предлагалосьхранить субстанцию в замороженном состоянии притемпературе -20 °С. Однако исследования показали, чтопри последующем размораживании большая часть белкавыпадает в осадок, что приводит к потере специфическойактивности. Было принято решение хранить субстанциюдельтаферона в температурном диапазоне температурот 0 °С до +5 °С, избегая замораживания растворабелка. При таком температурном режиме выпаденияосадка не наблюдалось в течение 12 мес. Параллельнос субстанцией дельтаферона на хранение в подобныхусловиях закладывалась лекарственная форма. Образцысубстанции и лекарственной формы в процессе хранениябыли проанализированы вертикальным SDS-ПААГэлектрофорезом.Картина анализа представлена на рисунке 5. Изприведенного рисунка видно, что наиболее близок к первоначальномусостоянию именно белок в лекарственнойформе; он образует значительно меньше димерных форми не подвергается распаду. Субстанция также хранитсяпри выбранных условиях без существенных ухудшенийкачества около 6 месяцев. На основании полученныхэкспериментальных данных было принято решение,хранить полученную субстанцию в растворе не болеемесяца при температуре не ниже 0 °С, после чего либопереводить ее в лекарственную форму, либо сразу посленаработки субстанции получать лекарственную формудельтаферона, что будет способствовать более полномусохранению его первоначальных свойств.Рис. 5. Электрофоретический анализ образцов субстанциидельтаферона и его лекарственной формы.1 – лек. форма дельтаферона (срок хранения 12 мес.);2 – субстанция дельтаферона (срок хранения 3 мес.);3 – субстанция дельтаферона (срок хранения 6 мес.)Были проведены также эксперименты по исследованиюспособности рекомбинантного дельтаферонаобразовывать мицеллы с полиненасыщенными жирами,в частности, с препаратом витамина А (ретинол ацетат8,4% масляный раствор по ФС 42-3183-95), чтобы вдальнейшем изучить возможность применения дельтаферонакак туберкулостатика с пероральным способомдоставки.Исследование проводилось методом гель-фильтрации.Профили элюции образцов дельтаферона свитамином А на «Сефакриле S300» представлены нарисунке 6. На нем видно, что более однородный пик далосоотношение белка к витамину А как 5:1, то есть можносделать вывод, что при данном соотношении происходитнаиболее полное связывание белка с ретинол ацетатоми образуется более гомогенная мицеллярная эмульсия.Об этом свидетельствует также уменьшениезначения показателя объема элюции – VR с 6 млдля исходной субстанции дельтаферона до 5,2 мл дляэмульсии с соотношением 5:1. Сохранность белка вмицелле оценивалась SDS-ПААГ электрофорезом.

П.Н. Мирошников, Л.Р. Лебедев, с. 5–10А Б ВРис. 6. Профили элюции образцов дельтаферона с витамином А на сефакриле S-300.А – исходная субстанция дельтаферона;Б – дельтаферон с витамином А (соотношение 10:1);В – дельтаферон с витамином А (соотношение 5:1)Картина электрофореза представлена на рисунке7, на котором можно видеть, что белок не подвергаетсядеградации в присутствии ретинол ацетата и сохраняетпервоначальное состояние.Рис. 7. Электрофоретический анализобразцов дельтаферона с витамином А.1 – исходный дельтаферон;2 – дельтаферон + витамин А (10:1);3 – дельтаферон + витамин А (5:1)ЗаключениеТаким образом, была разработана эффективнаясхема получения высокоочищенного дельтаферона, основаннаяна двух последовательных хроматографиях наодном сорбенте, но при разных значениях рН. Даннаясхема позволяет получать рекомбинантный дельтаферонв препаративных количествах с допустимым содержаниемвысокополимерных примесей. Были разработаныэкспериментальные лекарственные формы дельтаферона,которые позволяют сохранять белок в нативном состояниибез потери специфической активности. Проведенысравнительные биологические испытания лекарственныхформ гамма-интерферона и дельтаферона, которые показали,что лекарственная форма дельтаферона обладаетприсущими исходному гамма-интерферону иммуномодулирующимисвойствами (данные не представлены).Работа выполнена в рамках федеральной целевойпрограммы «Национальная технологическая база».Авторы статьи выражают признательность запомощь в работе сотрудникам НИКТИ БАВ ФГУПГНЦ ВБ «Вектор»: Т.А. Терещенко, Г.М. Сысоевой,С.А. Пьянкову, Т.Н. Гладченко, Т.Ф. Медиковой.9

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Литература1. Смирнова О. Ю., Татьков С. И., Петренко В. А.и др. // Докл. АН. – 1994. – Т. 337. – № 3. – С.405–406.2. Татьков С. И., Смирнова О. Ю., Цивковский Р. Ю.,Ильичев А. А. // Мол. биология. – 1995. – Т. 29. – С.1095–1101.3. Casadaban M.J., Cohen S.N. // J. Mol. Biol. – 1980 Apr.– Vol. 138(2). – P. 179–207.4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Молекулярноеклонирование. – М.: Мир, 1984. –480 с.5. Laemmli U. K. // Nature. – 1970. – Vol. 227. – P.680–685.6. Spector T. et al. // Anal.. Biochem. – 1978. – Vol. 86.– P. 142–146.7. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. / Справочникбиохимика. – М.: Мир, 1991.8. Новое в клонировании ДНК. Методы / Под ред. Д.Гловера. – М.: Мир, 1989.9. Денисова Л.Я., Батурина И.И., Закабунин А.И. идр. // Журн микробиол. эпидемиол. и иммунобиологии.– 1999. – № 5. – С. 109–112.10. Yousefi S., Escobar M.R., Gouldin C.W // Am. J. ClinicalPathol. – 1985. – Vol. 83. – P. 735–740.THE DEVELOPMENT OF THE DRUG DELTAFERON ON THE BASISOF THE RECOMBINANT HUMAN GAMMA-INTERFERON ANALOGUEP.N. MIROSHNIKOV, L.R. LEBEDEVInstitute of Medical Biotechnology, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»,Berdsk-10, Novosibirsk regionThe technology for production of the drug, Deltaferon, recombinant human gamma-interferon analogue, has been developed.Several experimental of highly purified batches of deltaferon were obtained and their specific activity was studied. The content of highlypolymerous contaminants in the samples was estimated. The experimental drug forms maintaining native protein without loosing itsspecific activity were developed.Keywords: human gamma-interferon analogue, deltaferon, recombinant proteins, E. coli.10

оригинальные статьиУДК 579.25 579.262;579.64СИНТЕЗИРОВАННЫЙ В E. COLI ЛЕКТИН ГОРОХА ПОСЕВНОГО (PSL)СПОСОБЕН ИНИЦИИРОВАТЬ КЛУБЕНЬКООБРАЗОВАНИЕНА ЛЮЦЕРНЕ ПОСЕВНОЙ ПРИ ЕЕ ИНОКУЛЯЦИИRHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. VICIAEИ.И. ГУБАЙДУЛЛИН * , Ал.Х. БАЙМИЕВ, Ан.Х. БАЙМИЕВ, А.В. ЧЕМЕРИС, В.А. ВАХИТОВИнститут биохимии и генетики Уфимского научного центра РАНКлонирован полноразмерный ген лектина гороха посевного. Лектин гороха, синтезированный в штаммах клетокE. coli одним полипептидом, в виде пролектина, проявил функциональную активность: при экзогенной обработке им ризобийR. leguminosarum bv. viciae в ризосфере люцерны обнаружены неинфицированные большие гроздевидные клубеньки, ненаблюдавшиеся в контрольных вариантах без обработки. Таким образом, пролектин гороха PSL, синтезированный в экспрессионнойпрокариотической системе, сохраняет не только углеводсвязывающие, но также и некоторые свои физиологическиесвойства, вызывающие специфические реакции клубенькообразования.Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, лектины, Pisum sativum.Роль лектинов бобовых в становлении бобово-ризобиальногосимбиоза пока еще до конца не выяснена.На основании ряда полученных результатов по трансформациирастений генами лектинов, показавших участиелектина в таких важных симбиотических процессах, какадгезия бактерий к корневой поверхности растений, инфицированиекорневых волосков и клубенькообразование[1–5], можно было уже более определенно говоритьо роли лектина. Однако остается непонятным, почемув одних случаях интродукция гена лектина в растенияприводит к возможности гетерологичной инокуляцииризобиями, а в других – нет.Здесь следует отметить, что бобовые умеренногоклимата характеризуются строгой специфичностью к своиммикросимбионтам, обуславливая тем самым существованиенебольшой группы клубеньковых бактерий, из которыхрастение-хозяин в тех или иных почвенно-климатическихусловиях не всегда может выбрать наилучшего партнерадля симбиоза. Поэтому весьма актуально исследовать* Автор для переписки:© 2006 г. Губайдуллин Ирек Ильясович,к.б.н., сотрудник лаборатории молекулярной биологиии биотехнологии Института биохимии и генетикиУфимского научного центра РАН450054 Уфа, пр-т Октября, 71Тел.: (3472) 35-54-79Факс: (3472) 35-61-00E-mail: irekg@rambler.ruпроблему расширения специфичности симбионтов растения-хозяина,которая позволит в перспективе повыситьсимбиотическую эффективность бобово-ризобиальнойсистемы и, в конечном счете, повысить урожайностьсельскохозяйственных бобовых культур.Исследования симбиотической роли лектинов экспрессиейэкзогенных лектинов в клетках корней растенийдовольно сложны, поскольку процедура трансформациибобовых растений представляет собой достаточно трудоемкийпроцесс. Поэтому параллельно ведутся исследованияпутем экзогенной обработки лектинами как растений,так и микроорганизмов. Кроме того, довольно сложновыделить лектины в исключительно чистом виде израстительного экстракта, в котором имеются, например,флавоны-активаторы и изофлавоны-ингибиторы, определяющиеиндукцию ризобиальных генов нодуляции [6]и способные исказить результаты воздействия лектина.В этой связи интересным представляется использованиелектинов растений, синтезированных в прокариотическихсистемах. В ряде работ по экспрессии генов лектинабобовых в E. coli показано, что синтезируемый при этомбелок может связывать сахариды. Более того, он способенассоциироваться в димеры и тетрамеры [7–10],что имеет большое значение, поскольку только при олигомеризациисубъединиц лектины бобовых проявляютактивность в таких процессах, как стимуляция митоза,рецепция гликоконъюгатов, агглютинация клеток и др.[11]. В растительных клетках пролектин гороха в про-11

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2цессе синтеза подвергается дальнейшему созреванию,с образованием неравных - и -субъединиц; при этомаминокислотные остатки, образующие линкерный пептид,теряются. Семенной лектин Pisum sativum (PSL),синтезированный в E. coli в виде отдельных цепей,согласно тестам агглютинации эритроцитов, проявлялуглеводспецифичность, почти сходную с растительным[8]. Кроме того, Хиггинс с соавт. показали, что лектин,синтезированный в клетках E. coli в виде пролектина,одним полипептидом, сохраняет углеводсвязывающиесвойства [7]. То есть не возникает проблемы, связаннойс расщеплением - и -цепей лектина и их ассоциацией вфункциональный белок в гетерологичном окружении.Цель настоящего исследования – оценить возможностьприменения синтезированных в экспрессионныхпрокариотических системах лектинов в экзогеннойобработке ими ризобий в ризосфере бобовых для выясненияих значения в расширении хозяйской специфичностирастений.12Материалы и методыОбъектами исследования влияния являлисьлюцерна посевная (Medicago sativa), а также ризобииSinorhizobium meliloti и Rhizobium leguminosarum bv.viciae, из коллекции ризобий ИБГ УНЦ РАН.Последовательность гена лектина Pisum sativum(AN Y00440) взята из международного банка данныхGenBank. ДНК из 2-суточных проростков выделялифенольно-детергентным методом [12]. Полноразмерныйген PSL с хромосомной ДНК амплифицировалипраймерами, содержащими сайт рестрикции Bgl II,один из которых приходился на ATG кодон гена, адругой отжигался чуть ниже кодона терминации. Ампликонырестрицировали по Bgl II сайту и клонировалипо Bam HI сайту экспрессионного вектора pET-15b,предварительно обработав его липкие концы щелочнойфосфатазой. При анализе рекомбинантных клонов дляопределения размера вставки применяли быстрый методщелочного лизиса бактериальных колоний. Результатыклонирования проверяли секвенированием на автоматическомсеквенаторе «ABI PRISM 310 Genetic Analyzer»(Applied Biosystems, США). Процедуры лигированияДНК, приготовления компетентных клеток E. coli итрансформации рекомбинантной ДНК также проводилипо стандартным прописям, изложенным в лабораторномруководстве Сэмбрука и соавт. [13].Для синтеза белка 30 мл питательной среды TY(0,1% дрожжевой экстракт, 1% бакто-триптон, 0,1%CaCl 2) засевали 2 мл ночной культуры штаммов клетокE. coli, наращивали при 37 °С до OD 600= 0,6. Экспрессиюгена лектина индуцировали добавлением IPTGдо 0,7 мМ и инкубировали в течение 4 ч при 30 °С синтенсивной аэрацией. Бактерии, выросшие до OD 600=2,0 центрифугировали и промывали в SE буфере (0,3 МNaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 6,9). Клетки ресуспендировалив 4 мл буфера B (10 мМ имидазол, 0,15 М NaCl,25 мМ Трис-HCl, рН 6,9) и замораживали при –70 °С.Через 12 ч суспензию клеток фильтровали через нитроцеллюлозныефильтры SMWP («Millipore», США) сразмером пор 5 мкм. Затем аффинной хроматографиейна HisTag колонках («Amersham», США) проводилиэлюцию белка по протоколу фирмы-изготовителя.Диализовали раствор белка против TBS буфера (0,15М NaCl, 5 мМ CaCl 2, 5 мМ MnCl 2, 10 мМ Трис-HCl,рН 6,9) в течение 12 ч при 4 °С.Ризобии выращивали на чашках Петри с агаризованнойсредой TY в течение 2–3 сут при 28 °С.Обработку ризобий лектинами проводили в ризосферепроростков бобовых растений. Для этого в стерильныепробирки вносили по 100 мкл суспензии клубеньковыхбактерий в среде TY, OD 600= 2,0 и добавляли лектиндо конечной концентрации 10 мкг/мл. Затем в них помещалистерильные 2–5 сут проростки, погружая корни враствор. Инкубировали в течение 15 ч при 28 °С, послечего проростки с инокулятом пересаживали в стаканчикисо стерилизованным вермикулитом, насыщенным солямираствора Хогланда – Арнона, и выращивали 40 сут.Бактерии из клубеньков люцерны выделялиследующим образом. Клубеньки стерилизовали в 10%гипохлорите натрия в течение 2–3 мин и промывали3–4 раза в дистиллированной воде. Затем клубенькираздавливали в 100 мкл TY среды, суспензию осветлялина вортексе и высевали на чашках Петри с агаризованнойсредой TY.Результаты и обсуждениеСинтез лектина в штаммах клеток E. coli и еговыделение. Как уже было отмечено, в клетках растенийпролектин гороха в процессе синтеза подвергается процессингус удалением пептида 180Pro – 188Val и образованием- и -субъединиц. Вместе с тем у некоторыхпредставителей рода Lathyrus, например, L. nissolia, тойже трибы Viciae, что и P. sativum, обнаружен одноцепочечныйлектин, аминокислотная последовательностькоторого очень схожа с последовательностями двухцепочечныхлектинов других представителей этого рода. При

И.И. Губайдуллин и др., с. 11–16обработке его неочищенным экстрактом незрелых семянL. ohrus (лектин которого является двухцепочечным) онпревращался в двухцепочечную форму [14]. Кроме того,трехмерные структуры одноцепочечных лектинов (конканавалинаА, Griffonia simplifolia) и двухцепочечных(P. sativum, Vicia faba, Lathyrus ohrus) обнаруживаютудивительное сходство [15, 16]. Интересно было выяснить,проявляет ли функциональную активность лектингороха в одноцепочечной форме, для чего полноразмерныйген этого белка был клонирован в экспрессионномвекторе pET-15b.Клетки трансформировали кальциевым методомплазмидой pET-15b с геном лектина горохапосевного. Поиск наиболее оптимального уровнясинтеза лектина был проведен среди штаммов клетокE. coli: BL21(DE3)pLysS, BL21trxB(DE3)pLysS иOrigamiB(DE3)LysS.Наработку лектина в клетках оценивали с помощьюэлектрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующихусловиях. Довольно высокий уровень наработкибелка обнаружен в штамме OrigamiB(DE3)LysS.У штамма BL21trxB(DE3)pLysS отмечен небольшойуровень синтеза целевого белка. В клетках E. coliBL21(DE3)pLysS детектировать лектин не удалось,несмотря на разнообразные условия индукции экспрессиигена (рис. 1а).Рис. 1. а) Электрофореграмма препаратов тотального белка (ТБ) штаммовклеток E. coli в SDS-PAAG: 1 – ТБ OrigamiB(DE3)LysS pET-15b;2 – ТБ OrigamiB(DE3)LysS pET-15bPSL; 3 – ТБ OrigamiB(DE3)LysS; 4 – ТБBL21trxB(DE3)pLysS pET-15b; 5 – ТБ BL-21trx(DE3)pLysS pET-15bPSL; 6 – ТБBL21trxB(DE3)pLysS; 7 – ТБ BL21(DE3)pLysS pET-15b; 8 – ТБ BL21(DE3)pLysS pET-15bPSL; 9 – ТБ BL21(DE3)pLysS; 10 – лектин Pisum sativum; Стрелкой показан лектинб) Электрофореграмма препаратов белка клеток E. coli: 1 – ТБ клеток без гена лектина; 2– ТБ клеток с геном лектина; 3 и 4 – I и II фракция элюции белка из клеток без гена лектина;5 и 6 – I и II фракция элюции белка из клеток c геном лектина; 7 – маркер молекулярноймассы, кДаХотя наиболее высокий уровень синтеза лектинаобнаружен в штамме OrigamiB(DE3)LysS, в которомобразовывалось наименьшее количество нерастворимыхбелковых агрегатов, наработку белка проводили вBL21trxB(DE3)pLysS, поскольку именно с использованиемэтого штамма удалось добиться наилучшего выделениялектина аффинной хроматографией. По нашимоценкам, данные штаммы E. coli продуцируют приблизительноот 2 до 5 мг лектина на литр культуральной средыв поздней логарифмической фазе роста.Экспрессионный вектор pET-15b имеет шестьповторов гистидинового кодона САТ, локализованныхмежду его T7 промотором и сайтом Bam HI, покоторому был клонирован ген лектина, что позволяетэлюировать его аффинной хроматографией и детектироватькак целевой в результате выделения. Как виднона рисунке 1б, белка массой 28 kDa нет в тотальнойбелковой фракции клеток без гена лектина (дорожка1) и в элюатах белка из этих клеток (дорожки 3 и 4).Напротив, в рекомбинантных клетках с геном лектина13

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2можно видеть целевой белок (дорожка 2) и в его элюате(дорожки 5 и 6). Таким образом, элюируемый белокне принадлежит клеткам E. coli, а является целевымбелком, лектином.Экзогенная обработка лектином бактерий вризосфере бобовых растений. Во многих работахпредобработку ризобий исследователи проводили лектином,содержащимся в грубом семенном экстракте.Это обусловлено тем, что индукция ответов клеток осуществляетсяне только лектином, являющимся одним изкомпонентов сложного сигналинга двух симбионтов, нои рядом других факторов, секретируемых растением.Так, например, Олсон с соавт. [17] сообщили,что в присутствии корневого экстракта сои наблюдалсяповышенный уровень -галактозидазы, ген lacZ которойбыл помещен под промоторы генов Rhizobium fredii. В тоже время экстракты других бобовых подобного эффектане вызывали. Также у некоторых штаммов B. japonicumлектин-связывающие рецепторы в составе липополисахаридовпоявлялись лишь после инкубации бактерий вэкссудатах корней сои [18]. То есть инициация и развитиеклубеньков требуют синтеза белка de novo в ризобиях ирастениях. Минимальная концентрация лектина в опытах,составлявшая приблизительно 10 мкг/мл, должна бытьдостаточной для насыщения лектин-связывающих сайтовповерхности клеток ризобий. При данной концентрацииобнаруживался индуцирующий эффект лектина [19].Кроме того, возраст бактерий влияет на эффективностьинициации инфицирования – связывание лектина сризобиальной клеточной поверхностью существенно изменяетсяс изменением условий культивирования клеток,а также с их возрастом [20]. Возможно, что лектиновыерецепторы на поверхности ризобий транзиентны и их наличиезависит от условий роста и возраста бактерий [18].Мы попытались преодолеть эти трудности совместнойэкзогенной обработкой лектинами и растений и бактерийв течение 15 ч, снижая тем самым риск пропустить наиболееблагоприятную фазу роста бактерий для индукцииих компетентности клубенькообразования.Было поставлено три контроля. Первый – наспонтанное образование клубеньков и контаминацию. Вданном варианте вместо суспензии бактерий в пробиркудобавляли стерильную среду TY. Второй – на нодуляциюсвоим штаммом, без обработки лектином. Третий – нанодуляцию гетерологичными штаммами, без лектина. Вовсе контрольные варианты вместо лектина в пробиркидобавляли элюат белковой фракции клеток E. coli безгена лектина.Рис. 2. Клубеньки, сформировавшиеся на корнях люцерны при инокуляции ее:а), б), в) – неспецифическими R. leguminosarum bv. viciae, обработанными лектином PSL;г) – ризобиями люцерны (S. meliloti) – контрольный вариантВлияние пролектина PSL на симбиоз Medicagosativa с ризобиями. Некоторые линии люцерны формируютв стерильных условиях псевдоклубеньки, близкиепо структуре к нормальным, возникающим при инокуляциирастений штаммами S. meliloti [21].В контрольном варианте на спонтанное образованиеклубеньков и контаминацию без обработкиинокулятом и лектином, а также в варианте с инокуляциейрастений гетерологичным штаммом без лектина,клубенькообразования замечено не было. При обработкеM. sativa своими штаммами S. meliloti наблюдали нормальнуюнодуляцию с образованием инфицированныхризобиями клубеньков.При обработке лектином PSL ризобийR. leguminosarum bv. viciae в ризосфере люцерны мыобнаружили пустые клубеньки необычайно большихразмеров, имевшие особенную гроздевидную форму, ненаблюдавшуюся в других вариантах (рис. 2). Известно,что форма клубеньков может меняться, например, улюцерны вместо активных веретеновидных клубеньковформируются неактивные, мелкие шаровидные или,напротив, крупные гроздевидные клубеньки.14

И.И. Губайдуллин и др., с. 11–16Данные нарушения симбиоза вызываются либорастением-хозяином (как это наблюдал Брилл с соавт.на люцерне при интродукции в нее гена ее собственноголектина MsLEC1 в антисенс ориентации [20], что свидетельствуетоб участии лектина люцерны в инициацииклубенькообразования), либо мутациями ризобий [23] иизменениями их симбиотических факторов.При интродукции гена лектина PSL вM. sativa трансформант инокулировался бактериямиR. leguminosarum bv. viciae (симбионт P. sativum), содержащимиплазмиду с nod генами S. meliloti с образованиеминфекционных нитей и псевдоклубеньков [3]. То естьответные реакции, наблюдаемые на люцерне при инокуляцииее неспецифичными штаммами R. leguminosarumbv. viciae, схожи как при экспрессии гена лектина горохав ее корневых клетках, так и при экзогенной обработкеее лектином гороха.Подобное расширение лектинами чувствительностирастений к гетерологичным ризобиям обнаруженотакже, например, на трансгенном по гену лектина PSLкрасном клевере. Клевер не только становился отзывчивымна ризобии R. leguminosarum bv. viciae, но, болеетого, формировал псевдоклубеньки при инокуляции егоMesorhizobium loti и S. meliloti [4].ЗаключениеТаким образом, лектин P. sativum, синтезированныйв штаммах E. coli, сохранял не только своюуглеводспецифичность, почти идентичную выделенномуиз семян этого растения [9], но и, как было показанонами, сохраняет, будучи одноцепочечным полипептидом,также некоторые свои физиологические свойства, вызывающиеспецифические реакции клубенькообразованияпри экзогенной обработке им клубеньковых бактерий вризосфере люцерны. Данные результаты свидетельствуюто возможности выяснения синтезированными впрокариотических системах лектинами их функциональнойзначимости в тех или иных симбиотических системахпутем экзогенной обработки, что может значительно облегчитьисследования их роли, не прибегая к трудоемкойпроцедуре трансформации растений.Работа получила финансирование по программе«Государственная поддержка ведущих научных школРоссии» (НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4),Российского фонда фундаментальных исследований(04-04-48884) и РФФИ-Агидель (02-04-97903).Литература1. Diaz C.L., Logman T.J.J., Stam H.C., Kijne J.W. Sugar-Binding activity of pea lectin expressed in white clover hairyroots // Plant Physiol. – 1995. – Vol. 109. – P. 1167–1177.2. van Eijsden R.R., Diaz C.L., de Pater B.S., Kijne Y.W.Sugar-binding activity of pea (Pisum sativum) lectin isessential for heterologous infection of transgenic white cloverhairy roots by Rhizobium leguminosarum biovar viciae //Plant. Mol. Biol. – 1995. – Vol. 29. – P. 431–439.3. van Rhijn P., Fujishige N.A., Lim P.O., Hirsh A.M. Sugarbindingactivity of pea lectin enhances heterologous infectionof transgenic alfalfa plants by Rhizobium leguminosarumbv. viciae // Plant Physiology. – 2001. – Vol. 126. – P.133–134.4. Diaz C. L., Spaink H.P., Kijne J.W. Heterologous rhizoballipochitin oligosaccharides and chitin oligomers induce corticalcell divisions in red clover root, transformed with the pea lectingene // Mol. Plant Microbe Interact. – 2000. – Vol. 13.– P. 268–276.5. van Rhijn P., Goldberg R.B., Hirsch A.M. Lotus corniculatusnodulation specificity is changed by presence of a soybean lectingene // Plant Cell. – 1998. – V. 10. – P. 1233–1250.6. He X.G. Signal molecules of plant-induced of gene expressionof bacteria // Acta Bot. Sin. –1990. – Vol. 32. – P.896–900.7. Higgins T.J.V., Chandler P.M., Zurawski G., Button S.C.,Spencer D. The biosynthesis and primary structure of peaseed lectin // J. Biol. Chem. – 1983. – Vol. 258. – P.9544–9549.8. Stubbs M.E., Carver J.P., Dunn R.J. Production of lectin inEscherichia coli // J. Biol. Chem. –1986. – Vol. 261. – P.6141–6144.9. Longstaff M., Powell K.S., Gatehouse J.A. Production andpurification of active snowdrop lectin in Escherichia coli //Eur. J. Biochem. – 1998. – Vol. 252. – P. 59–65.10. Jorrdan E.T., Goldstein I.J. The sequence of second memberof the Lima Bean lectin gene family and the expression andcharacterization of recombinant lectin in Escherichia coli //J. Biol. Chem. – 1993. – Vol. 269. – P. 7674–7681.11. Elgavish S., Shaanan B. Chemical characteristics of dimmerinterfaces in the legume lectin family // Protein Science.– 2001. – Vol. 10. – P. 753–761.12. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNAfrom whole organisms or large tissue masses // Anal. Biochem.– 1978. – Vol. 85. – P. 609–613.13. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: alaboratory manual. Second ed. – Cold Spring Harbor, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989. – 1682 p.14. Rouge P., Pere D., Bourne Y. Single- and two-chain legumelectins: a revisited question / Lectins: Biology, Biochemistry,Clinical Biochemistry, 1990. – P. 105–112.15

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 215. Rouge P., Cambillau C., Bourne Y. The three-dimensionalstructure of legume lectins / Lectin Reviews. – St. Louis,Sigma Chem. Comp., 1991. – Vol. 1. – P. 143–159.16 Sharon N. Lectin-carbohydrate complexes of plants andanimals: an atomic view // Trends Biochem. Sci. – 1993.– Vol. 18. – P. 221–226.17. Olson E.R., Sadowsky M. J., Verma D.P.S. Identification ofgenes involved in the Rhizobium-legume symbiosis by Mu-di(Kan, Lac)-generated transcription fusions // Biotechnology.– 1985. – Vol. 3. – P. 143–149.18. Bhuvaneswari T.V., Bauer W.D. Role of lectins in plantmicroorganisminteractions // Plant Physiol. – 1978. – Vol.62. – P. 71–74.19. Lodeiro A.R., Lopez-Garcia S.L., Vazquez T.E.E.,Favelukes G. Stimulation of adhesiveness, infectivity, andcompetitiveness for nodulation of Bradyrhizobium japonicumby its pretreatment with soybean seed lectin // FEMSMicrobiol. Lett. – 2000. – Vol. 188. – P. 177–184.20. Bhuvaneswari T.V., Mills K.K., Crist D.K., Evans W.R.,Bauer W.D. Effect of culture age on symbiotic infectivity ofBradyrhizobium japonicum // J. Bacteriol. – 1983. – Vol.153. – P. 443–451.21. Joshi P.A., Caetano-Anolles G., Graham E.T., GresshoffP.M. Ontogeny and ultrastructure of spontaneous nodules inalfalfa (Medicago sativa) // Protoplasma. – 1991. – Vol.162. – P. 1–11.22. Brill L.M., Fujishige N.A., Hackworth C.A., Hirsch A.M.Expression of MsLEC1 transgenes in alfalfa plants causessymbiotic abnormalities // Mol. Plant Microbe Interact.– 2004. – Vol. 17. – P. 16–26.23. Федоров С.Н., Симаров Б.В. Получение мутантов с измененнымисимбиотическими свойствами у Rhizobium melilotiпод действием УФ-лучей // С.-х. биология. – 1987. – Т.9. – С. 44–49.THE SYNTHESIZED IN E. COLI PEA LECTIN is CAPABLETO INITIATE a NODULATION OF ALFALFA PRETREATEDBY R. LEGUMINOSARUM BV. VICIAEI.I. GUBAYDULLIN, Al.Kh. BAYMIEV, An.Kh. BAYMIEV, A.V. CHEMERIS, V.A. VAKHITOVInstitute of Biochemistry and Genetics, Ufa Scientific Center of Russian Academy of SciencesThe full-size Pisum sativum lectin gene was cloned. The pea lectin, synthesized as a single polypeptide chain uncleaved prolectinin E. coli has shown functionality; under pre-treatment by this lectin Rhizobium leguminosarum bv. viciae we have found giantnoninfection multilobed nodules not observed in control variants in roots of alfalfa. Thereby, this prolectin produced in the expressionprokaryotic system saves not only sugar binding properties, as well as also some their own physiological characteristics, causing specificnodulation reactions.Keywords: legume-rhizobial symbiosis, lectins, Pisum sativum.16

оригинальные статьиУДК 577.1:576.3.342АТР-ЗАВИСИМЫЙ ТРАНСПОРТ СУКЦИНАТА В ВЕЗИКУЛЫ ПЛАЗМАТИ-ЧЕСКИХ МЕМБРАН ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAEВ.В. ПЕТРОВ *Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,Пущино Московской обл.Сукцинат – один из ценных метаболитов, накапливающихся в среде роста дрожжей. С помощью флуоресцентных методови радиоизотопного анализа изучали поглощение сукцината везикулами плазматических мембран Saccharomyces cerevisiae.Обнаружена система поглощения сукцината в везикулы, соответствующая системе его выброса in vivo, осуществляемого черезпереносчик для сукцината, при транспорте которого используется энергия электрохимического градиента протонов.Ключевые слова: плазмалемма, транспорт, H+, АТРаза, сукцинат, дрожжи, везикулы.Сукцинат – один из продуктов центрального метаболизмаклеток, который при определенных условиях(например, при недостатке азота) может в значительномколичестве экскретироваться дрожжами в культуральнуюжидкость [1]. На способности ряда микроорганизмовнакапливать внеклеточный сукцинат основаны микробиологическиеметоды получения этого ценного метаболита,используемого при производстве лекарств, продуктов,красителей, детергентов [1, 2]. Вместе с тем механизм егоэкскреции у дрожжей до сих пор не изучен, а сведения омеханизме выхода из клеток дрожжей других органическихкислот противоречивы, несмотря на то, что этот процессначал изучаться давно [3, 4]. В частности, имеется указаниена наличие активного выброса малата у дрожжейSaccharomyces cerevisiae [5], в то время как показано, чтоАТРаза плазмалеммы не участвует в экскреции цитрата изклеток Yarrowia lipolytica [6]. Приведенные выше данныебыли получены в условиях in vivo, что не позволяло детальноразграничить различные транспортные процессы,происходящие в дрожжевой клетке, затрудняя тем самыминтерпретацию результатов.Поэтому целью данной работы являлась характеристикатранспорта сукцината в условиях in vitro с* Автор для переписки:© 2006 г. Петров Валерий Валериевич,канд. биол. наук, научный сотрудник Института биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН142290 Пущино Московской обл.Тел.: (496) 773-0815Факс: (495) 956-3370E-mail: vpetrov06@mail.ruиспользованием модельной системы, представлявшейсобой инвертированные везикулы плазматических мембрандрожжей S. cerevisiae. Ранее нами был разработанметод выделения таких везикул, обладавших низкой неспецифичнойионной проницаемостью и удерживающихпротонный градиент длительное время, что делало ихпригодными для проведения транспортных исследований[7]. Н + -АТРаза таких инвертированных везикул,являющаяся первичной транспортной системой, былаориентирована наружу, при этом создавая и поддерживаяна них электрическую (E m) и химическую (pH)составляющие электрохимического градиента протонов( H+), направленные внутрь везикул. Известно [8,9], что работа вторичных транспортных систем обеспечиваетсяза счет энергии H+; поэтому такие везикулыможно использовать для выяснения механизма экскрециисукцината. В наших экспериментах внутреннее пространствотаких везикул моделировало культуральнуюжидкость. Таким образом, транспорт сукцината внутрьвезикул соответствовал экскреции этого метаболита издрожжевой клетки в ситуации in vivo.Материалы и методыВыращивание дрожжей S. cerevisiae, выделениесферопластов и получение из них везикул плазматическихмембран проводили, как описано [7, 10. 11]. Определениебелка осуществляли модифицированным методом Лоури[12]. Измерение активности АТРазы везикул (в присутствии250 мМ сахарозы) и листов (везикул в отсутствиесахарозы, то есть подвергнутых осмотическому шоку)17

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2плазматических мембран проводили по высвобождениюортофосфата при ферментативном гидролизе 1 мМMg-ATP (1 мМ MgSO 4+ 1 мМ Na 2ATP) [7, 10, 11].Генерируемые АТРазой рН и мембранный потенциалрегистрировали с помощью флуоресцентных красителей9-амино-6-хлоро-2-метоксиакридина (ACMA) и бис(3-фенил-5-оксоизоксазол-4-ил)пентаметин оксонола(оксонол V), соответственно, на спектрофлуориметреМ850 (Hitachi, Япония), используя при определениирН длины волн возбуждения и эмиссии 415 и 485 нм,соответственно, и 609 и 640 нм – при определении Em,как описано ранее [7, 10, 11].В опытах по поглощению сукцината к 1 мл раствора,содержащего 0,25 мМ сахарозу, 10 мМ MES-NaOH, 1 мМ Na 2АТР, 1 мМ MgSO 4, рН 6,5, добавляливезикулы и инкубировали при 30 °С 1–3 мин. Затемтуда же вносили раствор [ 14 C]сукцината, доведенныйNaOH до рН инкубационной среды. Вновь инкубировалив течение 0,5–5 мин., после чего разводили в 10раз холодным раствором 0,25 мМ сахарозы в 10 мМMES-NaOH, рН 6,5 и отфильтровывали везикулы черезпредварительно смоченные тем же буфером стекловолокнистыефильтры GF/F (Whatman, Великобритания)в установке для фильтрования (Millipore, США) придавлении 20–30 см рт. столба. Фильтры с везикуламидважды промывали 10 мл холодного раствора 0,25 мМсахарозы в 10 мМ MES-NaOH, pH 6,5, после чего ихсушили. Радиоактивность [ 14 C]сукцината на фильтрах(в импульсах в секунду) измеряли на счетчике фирмы«Intertechnique» (Франция).Рис. 1. Действие сукцината, нитрата и сульфата натрияна АТР-зависимое образование рН на плазмалеммеS. cerevisiae. Масштаб флуоресценции (F/F) указанв процентах. Добавлены до Mg-ATP (указана конечнаяконцентрация): 10 мМ NaNO 3; 10 мМ Na 2SO 4;0,2 мМ сукцинат натрия. Стрелками указано внесение(до конечной концентрации) 1 мМ Mg-ATP, 1 мМNaNO 3и сукцината (цифрами обозначена его концентрацияв мМ)Результаты и их обсуждениеВ экспериментах по изучению транспорта сукцинатас помощью флуоресцентных методов было показано,что при добавлении 1 мМ Mg-ATР к везикулам наблюдаетсягашение флуоресценции АСМА (рис. 1) и оксонолаV (рис. 2). Это свидетельствовало об образовании намембране pH (кислый внутри) и Em (положительныйзаряд внутри), соответственно. Натриевые соли сукцината,нитрата и сульфата добавляли или до Mg-ATР, когда H+ еще был не создан, или после внесения субстратаATРазы, когда оба компонента H+, рН и Е m, былисформированы.Использованные анионы обладали различнымдействием на формирование H+. Нитрат, являющийсяпроникающим анионом, стимулировал формированиерН (pиc. 1) и практически полностью разрушал Е m(pиc. 2). В отличие от него сукцинат вызывал уменьше-18Рис. 2. Действие сукцината, нитрата и сульфата натрияна АТР-зависимое образование E mна плазмалеммеS. cerevisiae. Масштаб флуоресценции (F/F) указанв процентах. Добавлен до Mg-ATP: 2 мМ NaNO 3.Стрелками указано внесение (до конечной концентрации)1 мМ Mg-ATP, 2 мМ NaNO 3, 10 мМ Na 2SO 4и 2 мМ сукцината

В.В. Петров , с. 17–20ние рН, если был добавлен до MgATP, или разрушениерН, если протонный градиент уже был сформирован(pиc. 1), причем процесс разрушения характеризовалсякинетикой насыщения (см. ниже). Сукцинат разрушалодновременно и Е m, что указывает на его проникновениевнутрь везикул в форме аниона (рис. 2). Сульфат натрия,являющийся непроникающим анионом и используемыйкак контроль, не только не уменьшал рН, но дажеувеличивал его (рис. 1), в то же время разрушая Е m(рис. 2). Однако разрушение H+ не характеризовалоськинетикой насыщения, а действие сульфата проявлялосьпри значительно более высоких концентрациях, чемв случае сукцината. В концентрациях, вызывающихэффективное разрушение H+, сукцинат не влиял наАТРазную активность листов плазматических мембран иувеличивал ее в случае везикул, когда АТРаза находитсяпод протонным контролем (табл. 1). Подобным же образом,за счет частичного снятия протонного контроля,на АТРазную активность везикул действовал и сульфат(табл. 1). Очевидно, уменьшение сукцинатом рН и Е mне может быть вызвано торможением им Н + -АТРазы.Таблица 1Влияние сукцината и сульфата натрияна активность АТРазы везикул и листовплазматических мембран (в %)Анион Везикулы ЛистыКонтроль 1 100 2 100 3Сульфат, 10 мМ 140 111Сукцинат, 2 мМ 105 92Сукцинат, 10 мМ 135 1101– 10 мМ MES-NaOH, 1 mM MgSO 4, 1 mM Na 2ATP(листы) + 250 мМ сахароза (везикулы), рН 6,5;2– 0,7 мкмоль Pi/мин на 1 мг белка;3– 1,3 мкмоль Pi/мин на 1 мг белкаПолученные факты могут быть объяснены следующимобразом. При работе Н + -АТРазы, накачивающейвнутрь инвертированных везикул ионы Н + , рНв них понижается до 3,5 [5], в то время как константыдиссоциации янтарной кислоты равны 4,21 и 5,63 (при25 °С). Поэтому внутри везикул сукцинат связываетсяс Н + в слабодиссоциируемую форму, что и объясняетуменьшение H+, в отличие от нитрата, при поступлениикоторого внутрь везикул происходит перераспределениеэнергии между химической (увеличение) и электрической(уменьшение) составляющими H+ (рис. 1, 2).Рис. 3. График Лайнуивера – Берка для АТР-зависимогопоглощения [ 14 С]сукцината в везикулы плазматическихмембран дрожжей S. cerevisiaeПроцессы уменьшения и разрушения протонногоградиента характеризуются кинетикой насыщения. K 1/2разрушения рН сукцинатом равна 0,54 мМ и близкак K 1/2уменьшения рН при внесении сукцината доMgATP (0,40 мМ). Это указывает на то, что в плазматическоймембране дрожжей S. cerevisiae имеетсяпереносчик, через который осуществляется транспорт(выброс) сукцината из клетки.В дальнейших экспериментах функционированиесистемы активного транспорта сукцината былоподтверждено с помощью радиоизотопного анализа.Было показано, что везикулы плазматических мембранмогли поглощать меченый [ 14 С]сукцинат в присутствииMg-ATP; причем кинетика накопления и в этом случаеподчинялась уравнению Михаэлиса – Ментен. На рисунке3 в координатах Лайнуивера – Берка представлентранспорт [ 14 С]сукцината в везикулы в зависимости отего концентрации, наблюдаемый в присутствие MgАТР.Km поглощения сукцината составила 0,47 мМ и былаблизка к величинам, полученным в опытах по влияниюсукцината на формирование H+.Таким образом, данные, полученные двумя независимымиметодами, свидетельствуют о наличии вплазматической мембране дрожжей S. cerevisiae переносчикасукцината, который осуществляет выброс данногометаболита из клеток дрожжей в культуральную среду, асам процесс происходит с использованием энергии H+.Этот вывод согласуется с данными по экскреции другогометаболита – малата, которая зависела от энергизацииплазматической мембраны у дрожжей S. cerevisiae [5],что дает основание предполагать, что выброс других19

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2анионов дикарбоновых кислот также осуществляетсяэнергозависимо с участием переносчиков для этих анионов.Изучение систем выхода органических анионов,продуктов метаболизма дрожжевой клетки, представляетдополнительный интерес в связи с предполагаемой возможностьюзапасания части энергии, высвобождающейсяпри окислении глюкозы, в форме градиента соответствующейкислоты. Такое предположение заслуживает вниманияв связи с работами на бактериях, в которых было показано,что при окислении глюкозы энергия генерируется не тольков виде АТР и H+, но и в виде электрохимическогоградиента метаболитов, образующегося за счет выбросалактата [13]. Не исключено, что в дрожжевой клетке энергия H+ дополняется и частично заменяется на энергиюэлектрохимического градиента метаболитов в условиях ихизбыточного образования в клетке.Автор благодарит Т.В. Кулаковскую и И.С. Кулаеваза обсуждение результатов.Работа поддержана грантом РФФИ НШ-4318.2006.4.Литература1. Zeikus J.G., Jain M.K., Elankovan P. Biotechnology ofsuccinic acid production and markets for derived industrialproducts // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1999. – Vol.51. – P. 545–552.2. Кондрашова М.Н. Гормоноподобное действие янтарнойкислоты // Bonp. биол. мед. фарм. химии. – 2002. – №1. – C. 7–12.3. Rothstein A., Enns L.H. The relationship of potassium tocarbohydrate metabolism in backer’s yeast // J. Cell Comp.Physiol. – 1946. – Vol. 28. – P. 231–252.4. Conway E.J., Brady T.G. Biological production of acids andalkali // Biochem. J. – 1950. – Vol. 47. – P. 360–369.5. Salmon J.M. L-malic-acid permeation in resting cells ofanaerobically grown Saccharomyces cerevisiae // Biochim.Biophys. Acta. – 1987. – Vol. 901. – P. 30–34.6. Кулаковская Т.В., Матяшова Р.Н., Петров В.В., КурановаЕ.В. АТФаза плазматической мембраны не участвуетв процессе выхода лимонной кислоты из клеток дрожжейYarrowia lipolytica // Микробиология. – 1994. – Т. 63.– С. 23–28.7. Окороков Л.А., Петров В.В. Выделение везикулплазматических мембран дрожжей Saccharomycescarlsbergensis, пригодных для исследования транспортавеществ // Биол. мембраны. – 1986. – № 3. – С.549–556.8. Goffeau A, Slayman C.W. The proton-translocating ATPaseof the fungal plasma membrane // Biochim. Biophys. Acta.– 1981. – Vol. 639. – P. 197–221.9. Serrano R. Plasma membrane ATPase of fungi and plants as anovel type of proton pump // Cur. Top. Cell. Regul. – 1984.– Vol. 23. – P. 87–126.10. Petrov V.V., Okorokov L.A. Increase of the anion and protonpermeability of Saccharomyces carlsbergensis plasmalemma byn-alcohols as a possible cause of its deenergization // Yeast.– 1990. – Vol. 6. – P. 311–318.11. Petrov V.V., Smirnova V.V., Okorokov L.A. Mercaptoethanoland dithiothreitol decrease the electrochemical potentialgradient of protons across the yeast plasma and vacuolarmembranes and activate their ATPases // Yeast. – 1992.– Vol. 8. – P. 589–598.12. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert N.E.A modification of the Lowry procedure to simplify proteindetermination in membrane and lipoprotein samples // Anal.Biochem. – 1978. – Vol. 87. – P. 206–210.13. Konings W.N. Generation of metabolic energy by end-productefflux // TIBS. – 1985. – Vol. 10. – P. 317–319.20ATP-DEPENDENT TRANSPORT of succinate INto PLASMATICMEMBRANE vesicles of yeast SACCHAROMYCES CEREVISIAEV.V. PETROVG.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, RAS, Puschino Moscow RegionSuccinate is one of the valuable metabolites accumulating in the yeast growth medium. Succinate uptake into plasma membranevesicles of the yeast Saccharomyces cerevisiae was studied by means of fluorescence methods and radioactive isotope analysis. A systemfor succinate influx was found in vesicles, which corresponds to its efflux system in vivo. Succinate transport is supported by the energyof the electrochemical proton gradient and occurs via succinate carrier.Keywords: plasmalemma, transport, H+, АТРase, succinate, yeast, vesicles.

оригинальные статьиУДК 612.118.221.2:612.112].08:575Особенности полиморфизма генов HLA II класса у пациентовс воспалительными заболеваниями пародонтаЕ.Н. НИКОЛАЕВА, В.Н. ЦАРЕВ, Е.А. ГОРБАЧЕВА, Е.В. ИППОЛИТОВ * , Т.Н. ЦАРЕВАНаучно-исследовательский институт и кафедра микробиологииМосковского государственного медико-стоматологического университетаУстановлены характерные для представителей смешанной популяции г. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту,особенности аллельного полиморфизма генов HLA II класса. Каждому из генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1присущ широкий спектр аллельного полиморфизма. Выявлено 13 различных специфичностей гена DRB1, 8 аллелей генаDQA1 и 12 аллелей гена DQB1. Характер распределения специфичностей аллелей генов HLA II класса у мужчин и женщинуказанной популяции в целом соответствует аналогичным данным для лиц европеоидной расы, описанным в литературе. Показаныслабые положительные ассоциации специфичности гена DRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301 (RR>2, pc

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2распределение полиморфных признаков [1]. Первуюгруппу составили 48 пациентов в возрасте до 35 летс устойчивым, не поддающимся лечению хроническимгенерализованным пародонтитом тяжелой степени. Вовторую группу было включено 69 пациентов старше38 лет с хроническим генерализованным пародонтитомтяжелой степени. В контрольную группу были отнесены54 здоровых человека в возрасте от 20 до 64 лет безвидимых заболеваний пародонта.При объективном обследовании обращали вниманиена состояние слизистой оболочки рта, десны,зубных рядов. Определяли характер прикуса, наличиезубных отложений, наличие и глубину пародонтальногокармана, обнажение корней зубов, их чувствительностьи подвижность.Оценку состояния тканей пародонта проводили,используя упрощенный гигиенический индекс УИГ- OHI-S (Green J.C., Vermilion J.R., 1960); индекс кровоточивостидесневой борозды ИК - SBI (MuehlemanH.R., Son S., 1971); пародонтальный индекс ПИ - PI(Russel A., 1956). Глубину пародонтального карманаизмеряли с помощью градуированного пуговчатогопародонтального зонда. Для уточнения клиническогоанализа всем больным назначали рентгенологическоеисследование [7].Для типирования генов HLA класса II (DRB1,DQA1, DQB1) применяли наборы реактивов HLA-ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-технология», Россия),позволяющие выявлять 13 специфичностей генаHLA - DRB1, 8 аллелей гена HLA - DQA1 и 12аллелей гена HLA - DQB1. В качестве исследуемогоматериала использовали эпителиальные клетки со слизистойщеки. Геномную ДНК выделяли из соскобовпо описанному в [6] методу Higuchi R. H. и ErlichH. (1989) c некоторыми модификациями. Реакциюамплификации проводили в амплификаторе «ТерцикMC2» (фирма «НПФ ДНК-технология») по программам,рекомендованным производителем набора.Детекцию продуктов амплификации проводили в ультрафиолетовомсвете после электрофореза в 3%-номагарозном геле.Достоверность различий в частоте встречаемостиаллелей генов HLA рассчитывали с помощью точногодвустороннего критерия Фишера для четырехпольныхтаблиц с поправкой на количество выявленных аллелей(pc) по методу Бонферони [8]. Наличие HLA-ассоциацийоценивали по величине относительного риска(RR) с расчетом для него 95%-ного доверительногоинтервала (CI).22Результаты и обсуждениеВо всех обследованных группах женщин былобольше, чем мужчин. В 1-ю группу пациентов вошли 48человек (21 мужчина и 27 женщин, соотношение 1:1,29)со следующими клиническими признаками агрессивныхформ пародонтита: возраст больного до 35 лет, наличие8 или более зубов с потерей зубодесневого прикрепления 4 мм; по крайней мере, 3 пораженных зуба, неотносящихся к молярам и резцам; на рентгенограммахвертикальная и горизонтальная резорбция кости; кровоточивостьпри зондировании [2, 7]. У 69 человек 2-йгруппы (28 мужчин и 41 женщина, соотношение 1:1,46)диагноз хронического генерализованного пародонтитабыл поставлен на основании следующих критериев:возраст свыше 38 лет; сохранено, по крайней мере, 10зубов; наличие 5 или более зубов с потерей зубодесневогоприкрепления 4 мм; детекция потери альвеолярнойкости на рентгенограммах; кровоточивость призондировании; увеличенная подвижность некоторыхзубов; высокий индекс налета. У 34 (71%) пациентов1-й группы и 41 (60%) пациента 2-й группы отмеченысопутствующие заболевания желудочно-кишечноготракта. В контрольную группу вошли 54 человека (22мужчины и 32 женщины, соотношение 1:1,45) старше40 лет без признаков гингивита, клинических и рентгенологическихпоказателей потери зубодесневого соединения.Обследованные группы больных статистическидостоверно различались по возрасту (табл. 1). Индексныеоценки клинических показателей у пациентов 1-йгруппы незначительно превышали средние показателипациентов 2-й группы, и только средние значения индексакровоточивости десневой борозды у пациентов1-й группы были статистически достоверно выше, чему пациентов 2-й группы. При этом все эти показателиу пациентов с пародонтитом статистически достоверноотличались от показателей у представителей контрольнойгруппы. Средние показатели УИГ - OHI-S и ПИ- PI у мужчин и женщин во всех группах сравнениябыли одинаковыми. Однако средние значения индексакровоточивости десневой борозды ИК – SBI и пародонтальногоиндекса были статистически достоверновыше у женщин обеих групп, чем у мужчин (табл. 2).В результате проведенных исследований полиморфизмагенов HLA II класса нами выявлены характерныедля представителей смешанной популяцииг. Москвы, чувствительных и резистентных к пародонтиту,особенности аллельного полиморфизма геновHLA II класса.

Е.Н. Николаева и др., с. 21–28Демографические показатели обследованных пациентовТаблица 1ГруппаОбследовано лицВозраст, летВсего Женщин Мужчин Средний Минимальный МаксимальныйПервая 48 27 21 29,3 22 34Вторая 69 41 28 48,7 38 58Контрольная 54 32 22 40,8 20 58Всего: 171 102 69 44,2 20 60Результаты индексной оценки пациентов с генерализованным пародонтитоми у лиц контрольной группыТаблица 2ПоказательУИГ (OHI-S)мужчиныженщиныПИ (PI)мужчиныженщиныИК (SBI)мужчиныженщиныПК (PD)мужчиныженщиныГруппа1 2 Контрольная4,23 ± 0,30*4,04 ± 0,244,42 ± 0,216,04 ± 0,62*5,68 ± 0,306,40 ± 0,6687,00 ± 3,30*81,04 ± 3,0293,12 ± 3,44**7,22 ± 0,34*6,66 ± 0,287,56 ± 0,40**3,87 ± 0,30*3,94 ± 0,243,80 ± 0,215,68 ± 1,10*5,23 ± 0,966,13 ± 1,2481,16 ± 2,30*76,84 ± 2,5685,48 ± 2,04**6,80 ± 0,19*6,14 ± 0,247,46 ± 0,21**1,50 ± 0,201,64 ± 0,221,36 ± 0,180,41 ± 0,200,37 ± 0,240,45 ± 0,21*13,00 ± 1,2011,36 ± 0,2414,64 ± 0,21**1,20 ± 0,300,96 ± 0,241,44 ± 0,46Примечание: * статистически достоверные отличия от контроля,** статистически достоверные отличия показателей у мужчин и женщин, р1 условно называют «протективными», 1

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2На рисунке 1 представлены данные распределениячастот специфичностей локуса HLA-DRB1 в группахпациенток с различными формами течения пародонтита ирезистентных к нему женщин. При ДНК-типированиичисло исследованных специфичностей эти показателиоказались статистически недостоверными.У мужчин контрольной группы были выявленывсе типы DRB1 специфичностей. Специфичность *14 неопределена у пациентов 1-й группы. Характер распределенияспецифичностей локуса HLA-DRB1 у мужчинс различными формами пародонтита незначительноотличался от распределения частот специфичностей упредставителей контрольной группы (рис. 2). Отмеченатенденция снижения частоты специфичности *01 у пациентов1-й группы (4,8 %) по сравнению с контролем (20%), р = 0,049, рс = 0,64 и отрицательные ассоциациис пародонтитом (RR = 0,2, CI:0,05,1,02).Рис. 1. Распределение частот специфичностей генаDRB1 и показателей относительного риска у пациентокс агрессивной формой течения пародонтита(RR1) и хроническим генерализованным пародонтитом(RR2).Примечание: здесь и на рис. 2–6 стрелками отмеченыстатистически достоверные отличия от контрольныхзначений частот встречаемости специфичностей илиаллелей генов HLAу женщин контрольной группы было выявлено 12 типовспецифичностей DRB1, за исключением специфичности*09. Наиболее частыми из них были специфичности *01(35,9%), *15 (15,6%), *11 (15,6%), *03 (10,9 %), редкими,каждая по 1,6% - *08, *10 *13, и *14. У пациенток1-й группы не выявлены специфичности 02 (*16), *09и *12, а у пациенток 2-й группы – специфичность *14.У пациенток обеих групп было показано статистическидостоверное снижение частоты специфичности *01(11%) по сравнению с контролем (рс < 0,05). Отмеченатенденция роста частоты встречаемости специфичности*07 (22,2%) по сравнению с контролем (4,7%), р =0,005, рс = 0,07, и специфичности *13 (14,8%) против1,6% в контроле (р = 0,011, рс = 0,143) у пациенток 1-йгруппы. Статистически достоверное увеличение частотыспецифичности *04 выявлено у пациенток 2-й группы(25,6 и 3,1% в контроле, рс < 0,05). Высокие значенияотносительного риска могли указывать на возможныеположительные ассоциации заболевания у представительниц1-й группы со специфичностями *07 (RR =4,7, СI: 1,41; 15,96) и *13 (RR = 9,5, СI: 1,22;73,84),а также *04 (RR = 8,2, СI: 1,99; 33,75) у представительниц2-й группы. Однако при введении поправки на24Рис. 2. Распределение частот специфичностей генаDRB1 и показателей относительного риска у пациентовс агрессивной формой течения пародонтита(RR1) и хроническим генерализованным пародонтитом(RR2)Наиболее частыми аллелями локуса HLA-DQA1у представительниц контрольной группы были аллели*0101 (34,4%), *0501 (26,6%), *0102 (18,8%) и *0301(9,3%); у мужчин – *0101 (25,0%), *0501(25,0%),*0301 (18,2%) и *0102 (15,9%). Основные отличия вхарактере распределения аллелей гена HLA-DQA1 упациентов с пародонтитом и здоровых людей были такжевыявлены подгруппах, состоящих только из женщин(рис. 3). Так, у пациенток 1-й группы частота аллеля*0101 (9,3%) была снижена в 3,7 раза по сравнениюс частотой встречаемости этого аллеля у женщин, резистентныхк пародонтиту (34,4%), р = 0,0017, рс =0,014. Этот аллель был выявлен только у 1% женщин2-й группы (р = 0,0004, рс = 0,0032). Значения относительногориска свидетельствовали об отрицательныхассоциациях аллеля *0101 с пародонтитом. У пациентов1-й группы была отмечена тенденция увеличения частотывстречаемости аллеля *0301 (14,8%) по сравнению с

Е.Н. Николаева и др., с. 21–28Рис. 3. Распределение частот аллелей гена DQA1 и показателейотносительного риска у пациенток с агрессивнойформой течения пародонтита (RR1) и хроническимгенерализованным пародонтитом (RR2)контрольной группой (3,1 %), р = 0,042, рс = 0,336.Частота встречаемости аллеля *0301 у пациентов 2-йгруппы была статистически достоверно выше (25,6%),р = 0,0004, рс = 0,0032, чем в контрольной группе.Выявлены положительные ассоциации аллеля *0301 схроническим генерализованным пародонтитом (RR =8,2, CI:1,99;33,75). Различия в частоте встречаемостиаллелей локуса HLA-DQА1 у мужчин со здоровымпародонтом и различными формами пародонтита былистатистически недостоверными (рис. 4).В распределении частот аллелей локуса HLA-DQВ1 были выявлены наименьшие отклонения отконтрольных значений как у мужчин, так и у женщин.Так, в контрольной группе у женщин чаще всего выявлялиаллель *0301 (23,4%), в 1-й группе пациенток егочастота составила 18,5%, а во 2-й – 29,3%. У мужчиналлель *0301 выявляли с частотой 23,5, 21,4 и 10,7%,соответственно. Аллель *0304 был выявлен только у однойженщины контрольной группы (1,6%) и полностьюотсутствовал у всех обследованных людей. Аллель *0305также не был выявлен ни в одной группе, за исключением1 мужчины 1-й группы. У пациентов 2-й группы такжене были выявлены аллели *0503 и *0601. Так как этимаркеры были выявлены с низкой частотой и в другихгруппах, мы не рассматривали их в качестве факторовчувствительности или резистентности к пародонтиту.Нами также отмечена тенденция к увеличению частотыаллеля *0302 у женщин с хроническим генерализованнымпародонтитом (17,1%) по сравнению с частотой аллеля уженщин, резистентных к пародонтиту (1,9%), р = 0,035,рс = 0,385; RR = 3,64, CI:1,1, 12,2 (рис. 5). У мужчин схроническим генерализованным пародонтитом выявленатенденция к увеличению частоты аллеля *0601 (10,7%)при полном его отсутствии у здоровых индивидуумов, р= 0,033, рс = 0,363 (рис. 6).Рис. 5. Распределение частот аллелей гена DQB1 и показателейотносительного риска у пациенток с агрессивнойформой течения пародонтита (RR1) и хроническимгенерализованным пародонтитом (RR2)Рис. 4. Распределение частот аллелей гена DQA1 и показателейотносительного риска у пациентов с агрессивнойформой течения пародонтита (RR1) и хроническимгенерализованным пародонтитом (RR2)Рис. 6. Распределение частот аллелей гена DQB1 и показателейотносительного риска у пациентов с агрессивнойформой течения пародонтита (RR1) и хроническимгенерализованным пародонтитом (RR2)25

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Таким образом, в результате проведенных исследованиймы не выявили значительных различий враспределении специфичностей и аллелей генов HLAII класса (DRB1, DQA1 и DQB1) у здоровых людей ипациентов с различными формами пародонтита в зависимостиот пола индивидуума. По-видимому, это связано смалочисленностью обследованных групп. Было показаностатистически достоверное увеличение частоты специфичностиDRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301 у пациенток2-й группы (рс < 0,05). Так как относительный риск приэтом был равен 8,2 (СI:2 – 34), можно предполагатьналичие положительных ассоциаций специфичностиDRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301 с хроническим генерализованнымпародонтитом у женщин. Низкая частотавстречаемости специфичности DRB1 *01 и аллеля DQA1*0101 у пациенток с различными формами пародонтитаможет указывать на их протективные свойства. Поэтомуналичие этих маркеров у пациента может являться хорошимпрогностическим признаком.При сравнении этих показателей у лиц контрольнойгруппы и в объединенной группе пациентов с различнымиформами пародонтита (табл. 3) сохранялась такаяже тенденция распределения частот аллелей HLA, каки при оценке по группам. Вместе с тем было показанопреобладание специфичности DRB1 *01 и аллеля DQA1*0101 не только у женщин, но и у мужчин контрольнойгруппы по сравнению с больными, а также маркеровпредрасположенности к пародонтиту DRB1 *04 и DQA1*0301 как у женщин, так и мужчин.Полученные нами результаты частично совпадаютс данными Reichert S. et al. [9]. Они также не обнаружилизначительных различий по сравнению с контролемв распределении генов HLA у мужчин с агрессивным ихроническим генерализованным пародонтитом. Однакоони выявили пониженную частоту встречаемости HLA-DRBblank* (не-DRB3/4/5*) и DQB1*05 у женщин сагрессивным пародонтитом. Только у женщин с хроническимгенерализованным пародонтитом отсутствовалТаблица 3Распределение некоторых аллелей генов HLA II классаи показателей относительного риска в общей группе больных с пародонтитом и здоровых лицСпецифичностьHLA-DRB1*01HLA-DRB1*04HLA-DRB1*07ДостоверностьHLA-DQA1*0101HLA-DQA1*0301HLA-DQA1*0401HLA-DQB1*0602-8ПодгруппаЗдоровые лицаПациентыс пародонтитомОтносительный рискn доля n доля p RR 95% CIженщины 23/64 0,359 15/136 0,110 0,000 * 0,31 0,17–0,55мужчины 9/22 0,205 6/98 0,061 0,000 * 0,30 0,11–0,79женщины 2/64 0,031 24/136 0,176 0,031 5,65 1,38–23,21мужчины 8/22 0,182 18/98 0,184 0,015 1,01 0,48–2,15женщины 3/64 0,047 23/136 0,169 0,115 3,61 1,12–11,59мужчины 3/22 0,068 6/98 0,061 0,479 0,90 0,24–3,43женщины 22/64 0,344 13/136 0,096 0,000 * 0,28 0,15–0,52мужчины 11/22 0,250 13/98 0,133 0,038 0,531 0,26–1,09женщины 2/64 0,031 29/136 0,213 0,007 6,82 1,68–27,78мужчины 8/22 0,182 22/98 0,224 0,004 * 1,23 0,60–2,56женщины 1/64 0,016 5/136 0,037 0,678 2,35 0,28–19,77мужчины 0/22 0,000 4/98 0,041 0,632 4,97 1,9–12,99женщины 15/64 0,234 28/136 0,206 0,197 0,88 0,51–1,53мужчины 8/22 0,182 14/98 0,143 0,028 0,79 0,36–1,74Примечание: n – частота аллеля = количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот учитывался дважды) / общееколичество обследованных индивидуумов х 2,* рс

Е.Н. Николаева и др., с. 21–28HLA-DQB1*0303 и чаще встречался HLA-DQB1*06 вгомозиготном состоянии. Гомозиготный HLA-DQB1*06присутствовал чаще и в целом у женщин с различнымиформами пародонтита – в нашей работе мы этого неподтвердили.Следует отметить, что типирование гена DRB1 мыпроводили методом ПЦР синтеза ДНК с использованиемнабора реактивов HLA-ДНК-Тех, позволяющеговыявлять специфичности, то есть определенные вариантыгенного локуса, которые могут включать в себя еще целыйряд полиморфных участков, выявляемых другими, болеечувствительными, но значительно более дорогостоящимиметодами. Известно, что аллели гена DRB1*04 – 0401,0402, и 0405 – ассоциированы с высокой чувствительностьюк развитию таких заболеваний, как ревматоидныйартрит и инсулин-зависимый сахарный диабет, а аллели0403, 0404 и 0406 определяют резистентность к ним[1, 5]. HLA-белковые специфичности или кодирующиеих аллели не только являются генетическими маркерамиаутоиммунных заболеваний, но и сами принимаютучастие в запуске и развитии патологического процесса.Возможно, изучение популяционного полиморфизмааллелей гена DRB1*04 позволит выявить более строгиеположительные или отрицательные ассоциации с различнымиформами пародонтита, чем выявленные нами.Таким образом, в представленной работе былипоказаны некоторые различия в системе HLA у пациентовс различными формами пародонтита в зависимостиот пола индивидуума. Причем, у женщин, страдающихпародонтитом, но не у мужчин, различия были болеезначимыми. Поэтому было бы полезно исследоватьвозможные связи между некоторыми маркерами HLA иполовыми гормонами. Подтверждено мнение о том, чтосуществуют не только прямые взаимосвязи между поломи заболеванием, но также и непрямые по отношению кнекоторым факторам HLA системы. Так как ни нами, нидругими авторами не было выявлено сильных ассоциаций,возможно, имеются другие более важные генетическиефакторы в качестве реальных этиологических факторов.Это означает, что сама система HLA или близко расположенныегены могут влиять, но не полностью определятьчувствительность или резистентность к пародонтиту, вчастности, колонизацию десен представителями анаэробнойпародонтопатогенной флоры. В связи с отсутствиемпрогностических данных о связях HLA с различнымиформами пародонтита и видовым составом колонизирующихпародонтопатогенов в настоящее время диагностическуюзначимость маркеров HLA нельзя оценитьокончательно. Тем не менее эти результаты могут бытьважными для дифференцированного диагноза агрессивныхи вялотекущих форм заболеваний пародонта.ЗаключениеТаким образом, в результате проведенного исследованияустановлены характерные для представителейсмешанной популяции города Москвы, чувствительныхи резистентных к пародонтиту, особенности аллельногополиморфизма генов HLA II класса:- каждому из генов HLA-DRB1, -DQA1 и -DQB1присущ широкий спектр аллельного полиморфизма;- выявлено 13 различных специфичностей генаDRB1, 8 аллелей гена DQA1 и 12 аллелей генаDQB1.При этом было отмечено, что характер распределенияспецифичностей аллелей генов HLA II классау мужчин и женщин смешанной популяции г. Москвы,резистентных и чувствительных к пародонтиту, в целомсоответствует аналогичным данным для лиц европеоиднойрасы, описанным в литературе.Показаны слабые положительные ассоциацииспецифичности гена DRB1 *04 и аллеля DQA1 *0301(RR>2, pc

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 26. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., Трофимов Д.Ю. и др.Изучение роли респираторных вирусов в этиологии и патогенезебронхиальной астмы // Иммунология. – 2003.– № 2. – C. 96–99.7. Armitage G.C. Periodontal diseases: diagnoses // Ann.Periodontol. – 1996. – Vol. 1. – P. 37–215.8. Armitage P., Berry G., Matthews J.N.S. Statistical methodsin medical research. 4 th ed. – Blackwell Science Ltd, London,2002.9. Reichert S., Stein J., Gautsch A., Langner J., Schaller H.G.,Machulla H.K.G. Gender differences in HLA phenotypefrequencies found in German patients with generalizedaggressive periodontitis and chronic periodontitis // OralMicrobiol Immunol. – 2002. – Vol. 17. – P. 360–368.10. Stein J., Reichert S., Gautsch A., Machulla H.K.G. Arethere HLA combinations typical supporting for or makingresistant against aggressive and/or chronic periodontitis? //J. Periodont. Res. – 2003. – Vol. 38. – P. 508–517.11. Takashiba S., Ohyama H., Oyaizu K., Kogoe-Kato N.,Murayama Y. HLA genetics for diagnosis of susceptibility toearly-onset periodontitis // J. Periodontal. Research. – 1999.– Vol. 34. – P. 374–378.Features of HLA class II genes polymorphism in patientswith inflammatory diseases of the parodentiumE.N. NIKOLAYEVA, V.N. TSAREV, E.A. GORBACHEVA, E.V. IPPOLITOV, T.N. TSAREVAScientific Research Institute and Faculty of Microbiology of the Moscow State Medico-Stomatologic UniversityIt was established that features of allelic polymorphism of HLA class II genes were characteristic for representatives of the mixedpopulation of Moscow, sensitive and resistant to periodontitis. The wide spectrum allelic polymorphism was inherent to each of HLA-DRB1,-DQA1 and-DQB1 genes. 13 various specificity of DRB1 gene, 8 DQA1 gene allele and 12 DQB1 gene allele were revealed.Mode of distribution of the specificity of HLA class II genes allele in men and women of the above population as a whole correspondedto similar data for persons of the europeoid race, described in the literature. Weak positive associations of specificity of DRB1 *04gene and DQA1 *0301 allele (RR> 2, pc

оригинальные статьиУДК 576.8:577.1Новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsIиз Arthrobacter species 7М06 узнает октануклеотиднуюпалиндромную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’В.А. ЧЕРНУХИН * , Ю.Г. КАШИРИНА, Ю.Э. ТОМИЛОВА, Д.А. ГОНЧАР,В.С. ДЕДКОВ, Н.А. МИХНЕНКОВА, С.Х. ДЕГТЯРЕВНПО «Сибэнзим», НовосибирскОбнаружен бактериальный штамм Arthrobacter species 7М06, который является продуцентом новой сайт-специфическойэндонуклеазы AbsI. Фермент AbsI узнает палиндромную октануклеотидную последовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’ и гидролизует ее после второго цитозина, образуя, таким образом, 5’-выступающие «липкие» концы, которые совместимыс концами, образующимися при гидролизе ДНК эндонуклеазами рестрикции XhoI (5’-C^TCGAG-3’), PspXI (5’-VC^TCGAGB-3’) и SalI (5’-G^TCGAC-3’). Среди всех известных редкощепящих эндонуклеаз рестрикции AbsI являетсяединственным ферментом, не имеющим сайтов узнавания на стандартных субстратах, таких как ДНК фагов лямбда и Т7, атакже аденовирусной ДНК типа 2.Ключевые слова: сайт-специфическая эндонуклеаза, эндонуклеаза рестрикции.Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы, ЭР)являются сайт-специфическими бактериальными ДНКэндонуклеазамии входят обычно в состав так называемыхсистем рестрикции-модификации (РМ систем). Наиболееширокое практическое применение в молекулярной биологиии биотехнологии нашли ЭР второго типа, которыеузнают короткую (как правило, 4-8 п.н.) последовательностьДНК и расщепляют ее внутри или вблизи сайта узнавания.В настоящее время описано более 250 различныхсайтов узнавания ЭР второго типа, из которых только9 представляют собой невырожденные палиндромныевосьминуклеотидные последовательности [1].В данной работе описаны получение и изучениесвойств новой сайт-специфической эндонуклеазы AbsI,сайтом узнавания которой является восьминуклеотиднаяпоследовательность ДНК 5’-CC^TCGAGG-3’ .Материалы и методыМорфологические и биофизические свойстваштамма бактерии Arthrobacter species 7М06 определяли* Автор для переписки:© 2006 г. Чернухин Валерий Алексеевич,сотрудник НПO «Сибэнзим»,630117 Новосибирск, ул. Тимакова 2/12,Тел. (3833) 33-49-91,E-mail: valera@sibenzyme.ruстандартным образом [2]. GC-состав хромосомнойДНК этого микроорганизма определяли, как описаноранее [3].Выращивание клеток штамма Arthrobacter species7М06. В качестве компонентов питательной среды длявыращивания бактериальных клеток использовалась продукцияфирмы «Organotechnie» (Франция). Культивированиепроводили при 28 °С в колбах емкостью 700 млс 300 мл среды LB (1% триптон, 0,5% дрожжевойэкстракт, 0,5% NaCl, (pH 7,6)) в термостатированныхвоздушных качалках G-25 («New Brunswick», США)со встряхиванием (170 об/мин). Клетки выращивались втечение двух суток до достижения оптической плотности2,5 ед. при измерении на длине волны =550 нм. Клеткиосаждали центрифугированием в течение 30 мин. при3000 g на центрифуге «Beckman J2-21» («Beckman»,США) и замораживали.Очистка препарата фермента AbsI. Все стадииочистки фермента проводили при 4 °С или на льду.Замороженную биомассу (30 г) суспендировали в течение3 часов в 120 мл буфера А, содержащего 10 мМK-фосфат (pH 7,2), 0,2 М KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ2-меркаптоэтанол. Клетки разрушали ультразвуком надезинтеграторе Soniprep 150 («MSE», Великобритания)десятью 1-минутными импульсами с 1-минутнымиинтервалами. Клеточный дебрис удаляли центрифугированиемпри 12000 g в течение 30 мин. на центрифуге29

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2«Beckman J2-21». Из полученного супернатанта выделялифермент AbsI путем хроматографической очисткина трех сорбентах. На первой стадии использовали 40мл фосфоцеллюлозы P11 («Whatman», Великобритания).Элюцию фермента проводили 400 мл линейногоградиента KCl (0,2–0,9 М) в буфере А. На второйстадии использовали 5 мл гидроксиапатита («BioRad»,США). Фермент вымывали 120 мл линейного градиентаK-фосфата (0,01–0,2 М) в буфере А. На третьей стадиииспользовали 4 мл гепарин-сефарозы («Sigma», США).Элюцию фермента проводили 60 мл линейного градиентаKCl (0,3–1 М) в буфере А.Для тестировании активности ЭР AbsI в хроматографическомпрофиле аликвоты по 1 мкл из фракцийдобавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,8мкг ДНК pBlueScriptSK(+), предварительно линеаризованнойрестриктазой ZrmI, в SE-буфер 5 «G» (10мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10 мМ MgCl 2, 50 мМ NaCl,1 мМ ДТТ), смесь инкубировали 15 мин. при 37 °С.Реакцию останавливали добавлением 5 мкл стоп-раствора,содержащего 0,1 М ЭДТА, 0,05% бромфеноловогосинего и 40% агарозы. Электрофоретическое разделениепродуктов реакции проводили в 1%-ном агарозном гелев трис-боратном буфере.После очистки на гепарин-сефарозе к фракциям,содержащим фермент, добавили БСА до концентрации0,05 мг/мл и концентрировали диализом против буфера,содержащего 10 мМ K-фосфат (pH 7,2), 0,2 М KCl, 0,1мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол и 50% глицерин.В результате получили 2,5 мл препарата фермента.Препарат AbsI хранили при -20 °С.Определение специфичности эндонуклеазырестрикции AbsI. В качестве субстратов для определениясайта узнавания AbsI использовали ДНК фагов лямбдаи Т7, аденовирусную ДНК типа 2 (Ad2), плазмидуpBlueScriptSK(+) (pBS) [4] и специально сконструированнуюплазмиду pUC19SE, получение которой описанониже. Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в1%-ном агарозном геле в трис-ацетатном буфере.Для определения позиции гидролиза узнаваемойпоследовательности рестриктазой AbsI использовалиолигонуклеотидный ДНК-дуплекс, одну из цепей которогометили с помощью -[32P]-АТФ и Т4-полинуклеотидкиназы.Исходные олигонуклеотиды были синтезированыв НПО «СибЭнзим» (Россия). Продуктыферментативного гидролиза разделяли электрофорезом в20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Радиоавтографиюгеля проводили с помощью прибора Cyclone StorageSystem («Packard Instrument Co.», USA).30Все использованные ферменты и маркеры молекулярноймассы ДНК произведены в НПО «СибЭнзим».Первичную последовательность ДНК определялиметодом Сенгера на автоматическом секвенатореABI Prism 310 Genetic Analyzer («Applied Biosystems»,США).Результаты и обсуждениеШтамм Arthrobacter species 7М06 был выделен изприродных изолятов в ходе поиска продуцентов рестриктаз,как описано ранее [5]. Определение штамма далоследующие результаты. Клетки штамма сферические,диаметром 0,5 мкм, в парах или одиночные. Грамположительные.Облигатно аэробные. Колонии на агаре Луриабледно-желтые, гладкие, блестящие, непрозрачные,выпуклые, круглые, 1–2 мм в диаметре. В бульоне совстряхиванием образуют гомогенную муть. Каталазоположительные,оксидазоотрицательные. Клетки растутпри температуре от 4 до 40 °С. GC-состав хромосомнойДНК составляет 75%. Данный штамм определили какArthrobacter species 7М06, а сайт-специфическую эндонуклеазу,выделенную из него, назвали AbsI.На рисунке 1 приведены данные по расщеплениюсайт-специфической эндонуклеазой AbsI различныхсубстратов. Как видно из рисунка, AbsI не гидролизуетДНК фагов лямбда и Т7, а также Ad2 ДНК, однакоспособен расщеплять плазмиду pBlueScriptSK(+),линеаризованную ферментом ZrmI (сайт узнавания5’-AGT^ACT-3’). При совместном гидролизеpBlueScriptSK(+) рестриктазами Sfr274I (сайт узнавания5’-С^TCGAG-3’) и AbsI новые рестрикционныефрагменты не образуются. В связи с этим мы предположили,что AbsI имеет расширенный сайт узнавания ферментаSfr274I. В ДНК плазмиды pBlueScriptSK(+) сайтузнавания Sfr274I (5’-CTCGAG-3’) является частьюпалиндромной последовательности 5’-CCTCGAGG-3’,и эта последовательность нуклеотидов в дальнейшем рассматриваласькак возможный сайт узнавания ферментаAbsI. Для проверки этого предположения нами былисинтезированы комплементарные олигонуклеотиды K61и К62, образующие ДНК-дуплекс (палиндромная восьминуклеотиднаяпоследовательность выделена жирнымшрифтом):K61: 5’-gtatcctcgaggtcctgatcaaggt-3’K62: 5’-accttgatcaggacctcgaggatac-3’

В.А. Чернухин и др., с. 29–34Рис.1. Электрофорез препаратов ДНК фага лямбда (A), фага Т7 (B), Ad2 (C)и плазмиды pBS/ZrmI (D), обработанных рестриктазами Sfr274I, PspXI и AbsI.Дорожки: 1 – исходная ДНК; 2 – гидролиз Sfr274I; 3 – гидролиз PspXI;4 – гидролиз AbsI; 5 – гидролиз Sfr274I и AbsI; M – 1kb ДНК-маркерРис. 2. Определение позиции расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции AbsIс использованием -[ 32 P]-меченных олигонуклеотидных дуплексов K62*/K61(A)и Xho3*/Xho4(B).Дорожки: 1 – исходный дуплекс; 2 – гидролиз рестриктазой AbsI;3 – гидролиз рестриктазой Sfr274I; M – гидролиз экзонуклеазой III из E. coliОбщей частью первичной структуры данногодуплекса и плазмиды pBlueScriptSK(+) являетсяименно последовательность ДНК 5’-CCTCGAGG-3’.В том случае, если данный олигонуклеотид будет расщеплятьсяферментом AbsI, последовательность ДНК5’-CCTCGAGG-3’ будет являться сайтом узнаванияэтого фермента. На рисунке 2b приведен радиоавтографэлектрофоретического разделения продуктов гидролизаолигонуклеотидного дуплекса K62*/K61 рестриктазамиAbsI, Sfr274I, а также экзонуклеазой III из E.coli.Как видно из этого рисунка, AbsI расщепляет олигонуклеотидныйдуплекс K62*/K61, а длина фрагментаДНК, полученного в результате расщепления дуплекса,совпадает с длиной фрагмента ДНК, образованного врезультате расщепления рестриктазой Sfr274I.Следовательно, фермент AbsI узнает последовательностьДНК 5’-CCTCGAGG-3’, а место гидролизаолигонуклеотида ферментами AbsI и Sfr274I совпадает,то есть оба фермента расщепляют ДНК в последовательности5’-CC^TCGAGG-3’ после второго цитозина.Для определения возможности вырожденияустановленного сайта узнавания фермента AbsI мы31

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2проанализировали наличие в различных субстратахпоследовательностей ДНК, отличающихся от последовательности5’-CCTCGAGG-3’ на один нуклеотид.В таблице 1 приведены данные по существованиютаких нуклеотидных последовательностей в ДНКфагов лямбда и Т7 и в Ad2 ДНК. С учетом симметричностипоследовательности 5’-CCTCGAGG-3’ всеготаких замен возможно 12, из которых 11 содержатсяв упомянутых субстратах (табл. 1). Так как AbsI негидролизует ДНК фагов лямбда и Т7 и Ad2 ДНК,следовательно, присутствующие в них 11 последовательностейДНК не являются сайтами узнаванияAbsI. Последовательность ДНК 5’-TCTCGAGG-3’является единственной, отсутствующей в субстратныхДНК, использованных в данной работе (табл. 1).Для проверки способности фермента AbsI гидролизоватьэту последовательность мы синтезировали следующиеолигонуклеотиды, образующие ДНК-дуплекс:Xho3: 5’-gca ata atc tcg agg cct aga gga ata agc-3’Xho4: 5’-gct tat tcc tct agg cct cga gat tat tgc-3’В указанной первичной структуре последовательность5’-TCTCGAGG-3’ и комплементарная ей5’-CCTCGAGA-3’ выделены жирным шрифтом.На рис. 2а приведена радиоавтография геля послеэлектрофоретического разделения продуктов обработкиэтого дуплекса ферментами. Как видно на рисунке,фермент AbsI не гидролизует дуплекс Xho3*/Xho4( 32 P-меченная цепь обозначена символом *).Однонуклеотидные замены в сайте 5’-CCTCGAGG-3’и их наличие в ДНК фагов лямбда и Т7 и Ad2 ДНКТаблица 1Однонуклеотидные заменыв сайте5’-CCTCGAGG-3’ДНК-субстраты, в которых присутствует сайт(в скобках указаны позиции, с которых начинается последовательность)5’-ACTCGAGG-3’* Фаг лямбда (33497)5’-GCTCGAGG-3’ Ad2 (5777, 8243)5’-TCTCGAGG-3’ –5’-CATCGAGG-3’ Фаг T7 (23430, 31496), Ad2 (24884)5’-CGTCGAGG-3’ Фаг лямбда (17654), фагT7 (23202), Ad2 (23849, 24203)5’-CTTCGAGG-3’ Фаг T7 (6057, 8975, 18705)5’-CCACGAGG-3’ Ad2 (930)5’-CCGCGAGG-3’ Фаг лямбда (10, 3159), Ad2 (11342, 13090, 19053)5’-CCCCGAGG-3’ Ad2 (16880)5’-CCTAGAGG-3’ Фаг Т7 (10310)5’-CCTGGAGG-3’ Ad2 (12167, 13183, 14981, 25421)5’-CCTTGAGG-3’ Фаг Т7 (82, 13863, 14655, 14982, 19021, 32888, 39006, 39858), Ad2 (9199)* жирным шрифтом обозначены нуклеотиды, которые отличаются при сравнении с последовательностьюДНК 5’-CCTCGAGG-3’32

В.А. Чернухин и др., с. 29–34Таким образом, AbsI не расщепляет последовательностейДНК, полученных изменением одного изнуклеотидов в сайте 5’-CCTCGAGG-3’. Полученныеданные подтверждают, что именно невырожденнаяпоследовательность нуклеотидов 5’-CCTCGAGG-3’является сайтом узнавания фермента AbsI.Для проверки сайта узнавания фермента AbsI иполучения еще одного субстрата для этой эндонуклеазымы изменили первичную структуру широко используемойплазмиды pUC19, заменив последовательность5’-GC-3’ в положении 437-438 на последовательность5’-CG-3’. Для этого были синтезированы комплементарныеолигонуклеотиды Xho1 и Xho2, формирующиеДНК-дуплекс с выступающими липкими концами,совместимыми с липкими концами, образуемыми прирасщеплении рестриктазами XbaI (5’-T^CTGAG-3’)и HindIII (5’-A^AGCTT-3’):Среди всех известных редкощепящих эндонуклеазрестрикции AbsI является единственной эндонуклеазой,не имеющей сайтов узнавания ни на одном из стандартныхсубстратов (ДНК фагов лямбда и Т7, а также ДНКаденовируса типа 2), используемых при поиске новыхферментов рестрикции.Xho1: 5’-ctagagtcgactgtttaaacctcgaggcatgca-3’Xho2: 5’-agcttgcatgcctcgaggtttaaacagtcgact-3’Олигонуклеотидный дуплекс сшивался с pUC19,гидролизованой ферментами XbaI и HindIII, и продуктомлигазной сшивки трансформировали компетентныеклетки E. coli RR1. Среди полученных в результатетрансформации клонов выбрали один, из которого былавыделена плазмида pUC19SE. Плазмида pUC19SEсодержит последовательность 5’-CCTCGAGG-3’ в положении434-441, что было подтверждено определениемнуклеотидной последовательности данной плазмиды. Нарисунке 3 приведены результаты расщепления плазмидыpUC19SE, линеаризованной ферментом DriI (сайтузнавания 5’-GACNNN^NNGTC-3’). Как видно изрисунка, AbsI расщепляет линеаризованную плазмидуpUC19SE, тогда как исходная плазмида pUC19 этимферментом не гидролизуется (данные не приводятся).Для определения активности фермента AbsI мытакже использовали плазмиду pUC19SE. AbsI проявляетмаксимальную активность в специальном реакционномбуфере следующего состава: 20 мМ ТрисHCl (при pH8,0), 20 мМ MgCl 2, 0,01% Тритон X-100, 1 мМ ДТТ.За одну единицу активности данной сайт-специфическойэндонуклеазы принималось такое минимальное количествофермента, при котором происходит полный гидролиз1 мкг ДНК плазмиды pUC19SE, предварительно линеаризованнойрестриктазой DriI, в 50 мкл реакционнойсмеси, содержащей AbsI-реакционный буфер при 37 °С.Полученный нами препарат фермента имел концентрацию1000 ед/мл.Рис. 3. Расщепление ферментом AbsI ДНК плазмидыpUC19SE, линеаризованной DriI.Дорожки: 1 – 1kb ДНК-маркер; 2 – pUC19SE/DriI;3 – pUC19SE/DriI, обработанная эндонуклеазойAbsIПоскольку XhoI и AbsI содержат в сайте узнаванияодну и ту же палиндромную шестинуклеотиднуюпоследовательность 5’-CTCGAG-3’ и расщепляютее в одном и том же месте, можно предположить, чтоэволюционно эндонуклеаза AbsI произошла из ЭР,узнающей сайт 5’-CTCGAG-3’. Помимо AbsI, XhoIи его изошизомеров известно еще несколько ферментовс другой специфичностью, имеющих сайты узнаванияс внутренней последовательностью 5’-C^TCGAG-3’.Среди них можно отметить недавно открытую рестриктазуPspXI, узнающую вырожденную восьминуклеотиднуюпоследовательность 5’-VC^TCGAGB-3’, котораяможет рассматриваться как промежуточное звено междуферментами, имеющими шестинуклеотидные и невырожденныевосьминуклеотидные сайты узнавания [6]. Крометого, известен изошизомер XhoI, который гидролизуетсайт 5’-C^TCGAG-3’ при условии, что перед ним с 5’-конца нет динуклеотида СТ, то есть этот фермент не расщепляетпоследовательность 5’-СТC^TCGAG [7].AbsI является новым и перспективным инструментомдля генно-инженерных работ, который может быть33

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2использован при крупноблочной фрагментации ДНК.Помимо этого, поскольку при расщеплении по сайтуузнавания AbsI образуются такие же липкие концы, какпри гидролизе рестриктазами XhoI (5’-C^TCGAG-3’),PspXI (5’-VC^TCGAGB-3’) и SalI (5’-G^TCGAC-3’), новая сайт-специфическая эндонуклеаза AbsI можетприменяться совместно с этими ферментами при клонированиифрагментов ДНК.Литература1. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. REBASErestriction enzymes and methyltransferases // Nucleic AcidsResearch. – 2003. – Vol. 31. – P. 418–420.2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоултаи др.: 9-е издание в 2-х томах: Пер. с англ. под ред. акад.РАН Г.А. Заварзина. – М., 1997.3. Дедков В.С. Определение GC-cостава в ДНК бактерийпри помощи эндонуклеаз рестрикции // Биотехнология.– 2004. – № 4. – С. 77–82.4. Short J.M., Fernandez J.M., Sorje J.A., Huse W.D. LambdaZAP: a bacteriophage lambda expression vector with in vivoexcision properties // Nucleic Acids Research. – 1988.– Vol. 16. – P. 7583–7600.5. Белавин П.А., Дедков В.С., Дегтярев С.Х. Метод определенияэндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий// Прикладная биохимия и микробиология. – 1988. – Т.24. – № 1 – С. 50–51.6. Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Беличенко О.А., ДедковВ.С., Мезенцева Н.В., Томилова Ю.Э., Дегтярев С.Х.Новая эндонуклеаза рестрикции PspXI узнает необычнуюпоследовательность ДНК 5’-VCTCGAGB-3’ // Вестникбиотехнологии и физико-химической биологии имениЮ.А. Овчинникова. – 2005. – Т. 1 – № 1. – С. 18–23.7. Gingeras T.R. and Brooks J.E. Cloned restriction/modificationsystem from Pseudomonas aeruginosa // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. – 1983. – Vol. 80. – P. 402–406.Список сокращений:РМ система – система рестрикции-модификации,ЭР – эндонуклеаза рестрикции,Трис – трис-(оксиметил)-аминометан,ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота,ДТТ – дитиотрейтол,п.н. – пары нуклеотидов,Ad2 – аденовирус типа 2,pBS – плазмида pBlueScriptSK(+),БСА – бычий сывороточный альбумин.New Eight Bases Cutter AbsI from Arthrobacter speciesRecognizes Palindromic DNA Sequence 5’-CC^TCGAGG-3’V.A. CHERNUKHIN, Ju.G. KASHIRINA, Ju.E. TOMILOVA, D.A. GONCHAR,V.S. DEDKOV, N.A. MIKHNENKOVA, S.Kh. DEGTYAREVSibEnzyme Ltd., NovosibirskBacterial strain Arthrobacter species 7М06 producing site-specific endonuclease AbsI has been discovered. AbsI recognizedpalindromic octanucleotide DNA sequence 5’-CC^TCGAGG-3’ and hydrolyzes it after second cytosine, producing 5’- stickyends, which were compatible with sticky ends after DNA cleavage by restriction endonucleases XhoI (5’-C^TCGAG-3’), PspXI(5’-VC^TCGAGB-3’) and SalI (5’-G^TCGAC-3’). Among all known rare-cutting site-specific endonucleases AbsI was the onlyenzyme which has no recognition sequences in standard substrates Lambda and T7 DNA and Adenovirus type 2 DNA.Keywords: site-specific endonuclease, restriction endonuclease.34

оригинальные статьиУДК 504.064.47; 573.6.086.83УСКОРЕНИЕ ПРОЦЕССА БИОТЕРМИЧЕСКОЙ САНАЦИИ ИПОСЛЕДУЮЩЕГО КОМПОСТИРОВАНИЯ ТВЕРДЫХ КОММУНАЛЬНЫХОТХОДОВ ПРИ МЕХАНИЗИРОВАННОЙ ПЕРЕРАБОТКЕА.В. ГАРАБАДЖИУ 1 * , В.А. ГАЛЫНКИН 2 , Г.В. КОЗЛОВ 1 , Г.Г. НЯНИКОВА 11Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет),2Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академияВ работе предложен оригинальный метод ускорения процессов биотехнологического компостирования твердых коммунальныхотходов. Разработан новый подход к выбору активаторов и расчету их количества. Использование этих подходовна практике позволило сократить сроки созревания компоста в два раза. Расход активаторов снижен с традиционных 5–15%до 0,00007–0,00025% от массы отходов.Ключевые слова: твердые коммунальные отходы, механизированное компостирование, кинетика роста микроорганизмов,биотехнология.В настоящее время весь мир и, в частности, нашастрана находится в стадии стремительного роста городов.Применительно к России урбанизация проходитна фоне значительного расслоения населения и массовоймиграции сельского населения в крупные города. Ростнаселения городов сопровождается резким увеличениемколичества бытовых отходов. Стабилизация экономическойситуации в стране также ведет к росту потребленияи соответственно увеличению количества твердыхкоммунальных отходов (ТКО). Таким образом, всегдасуществовавшая проблема ТКО становится сегодня ещеболее актуальной.Основным способом переработки ТКО являютсябиотехнологические процессы и сжигание. Ксожалению, отсутствие достаточного количества современныхбиотехнологических производств приводитк тому, что основная масса отходов захоранивается наполигонах или сжигается. Сгорание органической частиТКО, вопреки утверждениям сторонников метода, не* Автор для переписки:© 2006 г. Гарабаджиу Александр Васильевич,д.х.н., профессор, заведующий кафедройтехнологии микробиологического синтезаСанкт-Петербургского государственноготехнологического института198013 Санкт-Петербург, Московский пр-т, 26Тел.: (812) 495-74-01Тел./факс: (812) 315-14-36E-mail: gar@siteks.spb.ruсокращает, а увеличивает их массу (на 1 кг углеродарасходуется более 2,5 кг кислорода) и переводит в газообразноесостояние; при этом образуется токсичнаязола и супертоксичные диоксины. Происходит потеряорганических веществ, которые можно переработать вудобрения и использовать для озеленения и сельскогохозяйства.Очевидно, что самым экологически и экономическиперспективным является биотехнологический способпереработки, при котором обеззараживание ТКО происходитбез затрат энергоносителей (за счет активноститермофильных микроорганизмов), а органические компонентыперерабатываются в компост.Материалы и методыЭксперименты проводились на базе предприятия«Опытный завод механизированной переработки бытовыхотходов» (ОЗ МПБО) с использованием штатногооборудования (рис. 1–3).Для приготовления и внесения в ТКО растворовпитательных веществ была разработана и изготовленаспециальная установка (рис. 2).Измерения температуры ТКО в биобарабана проводилипирометром с учетом поправки (корректироваласьраз в смену), температуру компоста в буртах (рис. 4)на глубине 0,5 м – максимальным термометром, физико-химическиепараметры компоста – по стандартнымметодикам.35

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Рис. 1. Внешний вид барабанного биореактора(биобарабана)Рис. 3. Установка для приготовления питательныхрастворовРис. 2. Расположение пробоотборников на биобарабанеРис. 4. Дозревание компоста в штабеле36Результаты и обсуждениеЕсли рассмотреть процесс механизированного компостированияс точки зрения кинетики роста микроорганизмов,то становится ясным, что при компостированииотходов – периодическом культивировании микроорганизмов,содержащихся в исходных ТКО – питательнойсредой выступает органическая часть отходов.Обычно все 4 фазы протекают в одном реакторе.На заводе МПБО эти стадии разделены. Лаг-фаза ифаза экспоненциального роста, а также часть стационарнойфазы протекает в биобарабане. По сути дела лаг-фазаи фаза экспоненциального роста – это выход процессана температурный режим, а собственно санация ТКОпротекает в начале стационарной фазы. Разумеется, этоотносится лишь к доминирующей на конечном этапе биотермическойсанации, целевой группе микроорганизмов– термофилам. Микроорганизмы мезофильной группы,которые доминируют на начальном этапе, обеспечиваютразогрев массы ТКО до температур, когда в дело вступаюттермофилы, в дальнейшем и гибнут в биобарабане.Роль мезофилов и скорость выхода процесса на температурныйрежим различны в зависимости от исходнойтемпературы ТКО. В плане кинетики роста следуетотметить, что мезофилы не успевают перейти в стационарнуюфазу роста – при повышении температуры онисразу переходят в фазу лизиса.Численность микроорганизмов сильно зависитот условий в биореакторе, которые неодинаковы по егодлине.В таблице 1 приведено количество микроорганизмовв различных участках биореактора.В условиях резкого снижения интенсивности перемешиванияи аэрации микроорганизмы продолжаютразрушать остаточные органические субстраты и поддерживатьтемпературу компоста. Эта стадия называется«дозревание». По мере исчерпания запасов питательныхвеществ микроорганизмы переходят в фазу лизиса, чтосопровождается остыванием компоста. Процесс продолжаетсяот 8 месяцев до 1,5 лет. В течение этого временизавершаются процессы разложения органическихвеществ, происходит падение температуры до 30 °С иниже. Микробное число снижается с 9х10 10 до 4х10 7 , рНстабилизируется на уровне 8,13–8,17. По завершении

А.В. Гарабаджиу и др., с. 35–40стадии дозревания количество микроорганизмов падаети стабилизируется к моменту остывания компоста науровне 10 7 (табл. 2).ПараметрТаблица 1Содержание микроорганизмов в пробахПробоотборник (см. рис. 2)1 2 3 4ОМЧ 6,0х10 7 1,7х10 6 2,3х10 6 Более 10 93,3х10 4 – – –Таблица 2Изменение микробиологических показателейкомпоста при дозревании в штабеляхПробаСвежий(менее 1 месяца)0,5 года 1,5 годаОМЧ 7,8х10 8 3,8х10 8 4,6х10 7МикромицетыМикромицеты4,3х10 5 6,0х10 4 1,8х10 5Ввиду многообразия микроорганизмов на начальномэтапе процесса и смене микробных сообществпо мере его протекания некорректно использовать содержаниемикроорганизмов того или иного вида (илиОМЧ) в качестве параметра, по которому можно судитьо кинетике процесса. Более универсальным параметром,отражающим интенсивность протекания микробиологическихпроцессов, является температура компостируемогосубстрата. График ее изменения повторяет, разумеется, снекоторым временным сдвигом, кривую роста микроорганизмов.Поэтому в качестве основного контрольногопараметра мы использовали температуру компоста.Ознакомившись с тем, что сделано в области активациикомпостирования до нас, мы пришли к выводу отом, что все исследователи данной проблемы подошли кней стереотипно, приняв как данность, что соотношениеуглерод/азот/фосфор нужно довести до 20/5/1 на всюмассу отходов и то, что делать это нужно с помощьюдругих отходов, главным образом, навоза или иловогоосадка станций аэрации. Второй стереотип – для активациинужно вносить извне микроорганизмы деструкторы(классические дозировки – 10 6 к.о.е. на г (см 3 ) или5–15% от объема инокулируемой среды). Разработаннаяна основе стереотипного подхода технология ускорениякомпостирования ТКО [1, 2], несмотря на хорошиерезультаты, так и не была внедрена в производство поэкономическим соображениям.Никто не отметил того обстоятельства, что собственноглавным препятствием для роста микроорганизмов,которые в изобилии содержатся в ТКО, являетсянизкая растворимость питательных веществ субстрата.Этим и объясняется длительная лаг-фаза процесса инизкая физиологическая активность микрофлоры мусора,которая и является движущей силой процесса разогреваотходов. Мы предположили следующее:- необходимо вносить в качестве активаторовтолько самые доступные источники питания (сахара ибелковые гидролизаты) в виде водных растворов, чтопозволит до минимума сократить лаг-фазу процесса;- количество питательных веществ должно бытьэквивалентно тому количеству, которое будет затраченона приготовление инокулюма, исходя из классическихдозировок – 1х10 6 к.о.е./см 3 .Следуя логике, для экспериментов следовало бывзять стандартный состав среды для определения ОМЧ,однако мы поступили следующим образом. Мы создалидва варианта среды: первая – смесь сусла с пептоном исахарозой (наиболее легкодоступные источники питания),второй вариант представлял собой стереотипнуюпитательную среду (углерод/азот/фосфор = 20/5/1)на основе сахарозы и минеральных удобрений; в составсреды был также включен в качестве активатора лигногумат.Состав сред на одну загрузку биобарабана (300тонн ТКО):Среда 1Концентрат квасного суслаСахарозаПептонСреда 2СахарозаАммиачная селитраАзофоскаЛигногумат сухой– 1 кг– 1 кг– 0,2 кг– 4 кг– 1,5 кг– 0,1 кг– 0,2 кгРезультаты экспериментов (рис. 5), проведенныхпри различных температурах исходных ТКО (в разныевремена года), говорят о том, что внесение активаторовэффективно при любых исходных температурах,однако наибольший эффект наблюдается при низкихтемпературах. Особенно ярко видно это на графиках сисходной температурой 15 °С – максимум температур,наблюдаемый на 20-й час ферментации есть ни что иное,37

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2как следствие подогрева биобарабана ИК излучателями.Однако физиологическая активность исходной микрофлорынизка, а ее количество мало, поэтому процесспереходит в экспоненциальную фазу лишь через 8 чпосле разогрева до оптимальных температур. В случаеактиватора, созданного на основе сусла и пептона, процессначинается сразу после искусственного разогрева.Наблюдения за температурой компоста при дозревании(рис. 6) и его физико-химическими характеристиками(табл. 3) при дозревании в штабелях показали, что до-бавки, как и предполагалось, влияют лишь на интенсивностьпротекания процессов. Особенности изменениятемпературы, рН и органического вещества одинаковыдля обеих добавок и контроля, однако скорость их протеканияразлична.Полученные результаты позволяют говорить о том,что внесение активаторов сокращает время созреваниякомпоста в буртах в 2 раза, а сроки пребывания ТКОв биобарабане (за счет сокращения времени выхода натемпературный режим) – на 20–38%.Влияние активирующих добавок на основные показатели компоста при дозреванииТаблица 3ПоказательВремя дозревания, месяцы1 2 3 4 5 6 7 8 9Компост с активатором на основе пептона и углеводовОрганическое вещество, % 42 40 39 32 31t, °С 60 56 58 30 29pH водной вытяжки 6,80 7,91 7,80 8,10 8,13Компост с активаторами на основе минеральных удобрений и углеводовОрганическое вещество, % 45 45 44 42 38 34 31t, °С 65 52 43 55 65 55 32pH водной вытяжки 6,60 7,70 6,86 7,80 7,70 8,50 8,14Контрольный штабельОрганическое вещество, % 52 48 44 41 38 36 33 31 29t, °С 47 50 40 30 45 35 45 45 25pH водной вытяжки 6,80 7,90 7,60 7,70 7,25 7,89 7,50 7,98 8,1738Заключение1. При поиске способов оптимизации биотехнологическихпроцессов следует избегать стереотипов ирассматривать протекание процесса с точки зренияфундаментальных основ биотехнологии.2. Лимитирующей стадией процесса биотехнологическойпереработки твердых коммунальных отходов являетсяфаза адаптации к источникам питания, или лаг-фаза.Эта стадия процесса является лимитирующей и длядругих процессов деструкции трудно растворимыхвеществ, а, следовательно, метод, предложенный в

А.В. Гарабаджиу и др., с. 35–40статье, может быть использован и при активациидругих биотехнологических процессов.3. Внедрение метода позволило без капиталовложенийувеличить производительность предприятия на20%.Рис. 6. Влияние активаторов на скорость дозревания(остывание до 30 °С и ниже) компоста из ТКОЛитератураРис. 5. Влияние добавок и исходной температуры ТКОна выход биобарабана на температурный режим1. Архипченко И.А., Федашко М.Я., Орлова О.В. и др.Применение микробных удобрений для интенсификациипроцесса ферментации муниципальных отходов / Тез.докл. конференции «Экология и промышленность России».– М., 2000. – С. 16–19.2. Архипченко И.А., Орлова О.В. Способы повышениякачества компоста из муниципальных отходов / Экологическиеаспекты переработки отходов большого города: Тез.докл. – СПб.: СПбГУ НИИХ, 2001. – С. 102–118.39

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2An acceleration of the bioterm sanation process andfollowing composting of the hard everyday rubbishin the time of mechanized treatmentA.V. GARABADGIU, V.A. GALINKIN,G.V. KOZLOV, G.G. NANIKOVASt.-Petersburg State Technological Institute (Technical University),St.-Petersburg Chemically-Pharmaceutical AcademyAn original method for acceleration of the composting processes of the hard everyday rubbish was provided according to thepresent work. New method for a choice of activators and calculation of their quantity were provided as well. The use of such methods inpractice enabled to reduce the composting ripening period by half. The quantity of activators was decreased from conventional 5–15%of the rubbish mass to 0.00007–0.00025%.Keywords: the hard everyday rubbish, mechanized composting, microorganisms growth speed.40

Краткие сообщенияУДК 577.18.03ПОВЫШЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕФАЛОСПОРИНОВПРЕПАРАТАМИ РНКТ.А. ТЕРЕЩЕНКО, Г.М. ЛЕВАГИНА, В.И. МАСЫЧЕВА, А.О. БЕЛКИНА *Институт медицинской биотехнологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»,Бердск-10, Новосибирской областиВ настоящее время в лечении инфекционныхзаболеваний человека ведущая роль принадлежит антибиотикам.Основным терапевтическим действиемантибиотиков является подавление жизнедеятельностивозбудителя инфекции в результате угнетения более илименее специфического для микроорганизмов метаболическогопроцесса. Угнетение происходит в результатесвязывания антибиотика с мишенью, в качестве которойможет выступить либо фермент, либо структурная молекуламикроорганизма.Однако бактерии способны синтезировать ферменты,инактивирующие некоторые антибиотики. Поэтому вклинической химиотерапии имеется тенденция применятькомбинации двух и более средств. При этом возможнорешение следующих задач: расширение спектра антимикробногодействия, снижение токсичности препаратов врезультате уменьшения доз, уменьшение формированиярезистентности штаммов патогенных микроорганизмов,увеличение проницаемости клеточной стенки микроорганизмадля антимикробного средства, вовлечение другихмеханизмов противомикробной защиты и т.д. Поисктаких комбинаций препаратов – одна из актуальныхзадач химиотерапии.В данной работе представлялось перспективнымизучить влияние препарата Ридостин, действующим началомкоторого является двуспиральная РНК (дсРНК)из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, на антимикробнуюактивность ципрофлоксацина.* Автор для переписки:© 2006 г. Белкина Альбина Олеговна,начальник отдела Института медицинской биотехнологииФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»633010 Новосибирская область, г. Бердск-10, а/я 112,НИКТИ БАВТел.: 8 (38341) 5-19-60E-mail: belkina@sibmail.ruМатериалы и методы. Na-соль двуспиральнойрибонуклеиновой кислоты (ФСП 42-0197076901)(субстанция Ридостина) – производство ООО «Диафарм»,г. Бердск, Новосибирской обл., представляетсобой смесь двуспиральной – дсРНК и высокополимерной– впРНК киллерного штамма S. cerevisiae ссоотношением 18–20% и 78–80% РНК, соответственно.Тест-штамм Pseudomonas aeruginosa АТСЕ9027 получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва).Ципрофлоксацин – производство фирмы Promed Export(Индия). Антимикробное действие антибиотика в сочетаниис РНК исследовали на плотной и жидкой среде.Изучение антимикробного действия на плотной средепроводили методом диффузии в агар луночным способом.Среды в чашки Петри заливали двумя слоями. Верхнийслой содержал суспензию бактерий Ps. aeruginosa.Контрольные и испытуемые растворы вносили по 100мкл в лунки диаметром 8 мм. Контрольные растворысодержали антибиотик в количестве 2,5; 5,0; 10,0 50,0и 100,0 мкг/мл; испытуемые растворы содержали комбинациииз такого же количества антибиотика и препаратРНК – 5,0 или 10,0 мг/мл. Чашки Петри помещалив термостат при температуре 37 °С на 24 ч. Результатдействия ципрофлоксацина и его комбинаций с РНК оценивалипо величине диаметра зоны задержки роста Ps.aeruginosa. Исследование влияния ципрофлоксацина и егокомбинаций с препаратом РНК на рост Ps. aeruginosa вжидкой питательной среде проводили следующим образом.Жидкие питательные среды, содержащие 10, 5 и 2,5мкг/мл антибиотика служили контролем. Испытуемыесреды содержали такие же количества антибиотика и 5мг/мл нуклеиновых кислот. Все растворы разливали в 5мл пробирки и вносили в них суспензию Ps. aeruginosa израсчета 1000 микробных тел в 1 мл питательной среды.Пробирки с растворами инкубировали при температуре37 °С в течение 24 ч. Через 1, 2, 3, 4, 5 и 24 ч из проби-41

Т.А. Терещенко и др., с. 41–44Результаты изучения антимикробного действияципрофлоксацина и его комбинаций с препаратом нуклеиновыхкислот на рост Ps. aeruginosa на плотной средепредставлены на рисунках 1 и 2.Показано, что подавляющее действие ципрофлоксацинана клетки Ps. aeruginosa при увеличенииконцентрации ципрофлоксацина в 10 раз (от 10 мкг/млдо 100 мкг/мл) изменяется незначительно (диаметрызон задержки роста Ps. aeruginosа 20 и 24 мл, соответственно).При низких концентрациях антибиотика (10, 5и 2,5 мкг/мл) внесение нуклеиновых кислот значительноусиливает ингибирующее действие ципрофлоксацина нарост Ps. aeruginosa: при его концентрации 10 мкг/мл– в два раза.При исследовании влияния ципрофлоксацина и егокомбинаций с препаратом НК на рост Ps. aeruginosa вжидкой питательной среде также показано (табл. 1), чтодействие ципрофлоксацина в сочетании с рибонуклеиновымикислотами на рост Ps. aeruginosa. эффективнее, чемдействие одного антибиотика. Раствор ципрофлоксацинас содержанием 2,5, 5 и 10 мкг/мл не является бактерицидным,в то время как при внесении 5 мг/мл препаратаНК комбинация даже с концентрацией антибиотика 2,5мкг/мл становится бактерицидной для Ps. aeruginosaуже через 4 ч инкубации (табл. 1).Как видно из таблицы, композиция антибиотикаи препаратов НК оказывает более выраженный антимикробныйэффект по сравнению с антибиотиком в тойже концентрации. Подобный синергетический эффект invitro обуславливает возможность снижения дозы антибиотиковпри лечении бактериальных инфекций, что весьмаактуально, поскольку антибиотики имеют, как правило,обширный спектр побочных эффектов.Механизм действия дсРНК, как и вообще экзогенныхРНК, в различных клетках до конца не изучен.Например, помимо индукции интерферона, интерфероногеннаяРНК дрожжей снижает синтез ДНК, РНКи белка в первичной культуре мононуклеарных клетоккрови человека, о чем свидетельствует уменьшение включенияв них тимидина, урацила и лейцина, меченных потритию. Показано, что олигонуклеотиды могут влиятьна экспрессию генов, блокировать трансляцию мРНК спомощью различных, до конца не изученных механизмов.Одним из возможных механизмов представляетсяторможение функции рибосом. Важным моментом приэтом является возможность проникновения антимикробныхпрепаратов в клетку. Бактериальные клетки, вотличие от клеток высших организмов (в особенностиживотных), имеют клеточную оболочку, обладающуюдостаточной толщиной и высокой прочностью. Клеточнаястенка играет существенную роль в избирательностидействия различных антимикробных средств. Активностьантимикробного средства зависит от его способностипроникать в клетку.Таблица 1Влияние ципрофлоксацина и его комбинацийс препаратом НК на рост Ps. aeruginosaв жидкой питательной средеДлительностьэкспозиций,ч1БезРНКСпл.ростКонцентрация антибиотика10 мкг/мл 5 мкг/мл 2,5 мкг/мл5мг/млРНКСпл.ростБезРНКСпл.рост2 2•10 7 1,8•10 7 Спл.рост5мг/млРНКСпл.ростСпл.рост3 1,1•10 7 2•10 6 7•10 6 Спл.рост4 3•10 6 Отс 7•10 6 Отс5 2,5•10 6 Отс 7•10 6 Отс24 2•10 6 Отс 7•10 6 ОтсБезРНКСпл.ростСпл.ростСпл.ростСпл.ростСпл.ростСпл.рост5мг/млРНКСпл.ростСпл.ростСпл.рост1,8•10 6ОтсОтсИзвестно, что клеточная стенка грамотрицательныхбактерий обеспечивает большую «устойчивость»к диффузии антибиотика, чем клеточная стенка грамположительныхмикроорганизмов. Проницаемостьклеточной стенки микроорганизма для антимикробныхсредств может быть повышена добавлением определенныхвеществ.Например, проникновение олигонуклеотидов изкультуральной среды в растущие клетки микобактерийможет быть увеличено добавлением некоторых молекул,например, этамбутола или биотина [8–9]. А 19-мерныерибоолигонуклеотиды различной структуры, в том числеимеющие двуспиральные участки, достаточно легко проникаютиз культуральной среды в клетки C. albicans и ингибируютрост культуры [10]. Возможным объяснениемпоказанного в нашей работе синергетического действияантибиотика и РНК может быть тот факт, что ципрофлоксацинлизирует клеточную стенку Ps. aeruginosa испособствует тем самым эффективному проникновениюрибонуклеиновых кислот в бактерии.43

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2При использовании НК в клеточных культурах иin vivo всегда возникает вопрос и о сохранности структурынуклеиновой кислоты. Так, в работе [10] показано,что 19-мерные олигонуклеотиды не разрушаются вкультуральной среде при культивировании C. albicans втечение 12 ч.С другой стороны, в настоящее время полученыновые варианты индукторов интерферона на основедсРНК, обладающие повышенной устойчивостью кнуклеазам крови, пролонгированным действием на макрофагальнуюактивность, сниженным уровнем токсичностипо сравнению с Ридостином [1, 4]. Такие вариантытакже могут быть успешно использованы при созданиитерапевтических препаратов на основе дсРНК.Изучение механизмов проникновения и воздействиярибонуклеиновых кислот на размножениеPs. aeruginosa в комбинации с антибиотиком являетсяпредметом нашего дальнейшего изучения.Таким образом, в работе показано, что ципрофлоксацинв сочетании с препаратом НК оказывает болеевыраженное ингибирующее действие на рост культурыPs. aeruginosa на плотной и жидкой питательной среде,чем один антибиотик в той же концентрации. Этиданные позволяют сделать вывод о том, что, используякомбинацию антибиотика и рибонуклеиновых кислот,можно снизить применяемые дозы ципрофлоксацинапри лечении бактериальных инфекций у пациентов и темсамым уменьшить ряд побочных эффектов, связанных сприменением антибиотика.Литература1. Alikin Yu., Danilenko E., Levagina G., Masycheva V.,Duchovskiy A., Prudnikov S., Shchelkunov I. Biologicaleffects of the prolonged forms of interferon inducers at higherand lower vertebrates / Новые информационные технологиив медицине и экологии: 9-я междунар. конф. и дискус.науч. клуб, 1–10 июня 2001 г., Украина, Гурзуф...– Запорожье,2001.– С. 173, К. 4.2. Бондарь И.А., Масычева В.И. Индуктор интерферонаридостин в комплексной терапии сахарного диабета /Инновации в охране здоровья людей: Материалы науч.-практич. конф. 22–23 ноября 2001 г. Новосибирск, 2001.– С. 19–20.3. Karpov O.V., Antonenko S.V., Barbasheva O.V. et al.Effect of interferonogenic molecular complex of yeast RNA– tilorone on DNA, RNA and protein synthesis in vitro //Ukr. Biochim. Zh. 2001. – Vol. 73. – N 2. – P. 33–38.4. Levagina G.M., Masycheva V.I., Karpova S.F., DanilenkoE.D., Fadina V.A., Alikin Ju.S. The technology for productionof interferon inducers with a prolonged effect / Новые информационныетехнологии в медицине и экологии: 8-ямеждунар. конф. и дискус. науч. клуб, 1–10 июня 2000,Украина, Гурзуф. ... – Запорожье, 2000. – С. 93–94.5. Лосева М.И., Масычева В.И., Букин В.Н., БельцоваА.И., Космачева Т.А., Садовская О.Б., Левагина Г.М.,Усова С.В., Мишенин А.В., Круппа О.И. Ридостин влечении и профилактике гриппа и ОРВИ / Инновациив охране здоровья людей: Материалы науч.-практич.конф. 22–23 ноября 2001 г. Новосибирск, 2001. – С.115–116.6. Масычева В.И., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., АндреевскаяС.Н., Даниленко Е.Д., Фадина В.А., СизовА.А. Влияние препаратов двуспиральных РНК на функциональнуюактивность макрофагов и жизнеспособностьфагоцитированных микобактерий / Новые информационныетехнологии в медицине, биологии, фармакологиии экологии: Материалы 11-й междунар. конференции идискус. научн. клуб (Ялта, Гурзуф, Крым, 1–10 июня2003 г.). – Запорожье, 2003. – С. 248–249 (К 6).7. Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Литвяков Н.В.,Масычева В.И. Пероральное использование интерферона:терапевтический эффект и механизмы действия / Цитокины.Воспаление. Иммунитет: Материалы междунар.науч.-практич.школы-семинара. СПб, 23–26 июня 2002г. – СПб., 2002. – Т. 1 – № 2. – С. 39–40.8. Rapaport E., Levina A., Metelev V., Zamecnick P.C.Antimycobacterial activities of antisense oligodeoxynucleotidephosphorothioates in drug-resistant strains // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. – 1996. – Vol.93. – P. 709–713.9. Harth G., Zamecnick P.C. Jin-Yan Tang, Tabatadze D.,Horwitz M. Treatment of Mycobacterium tuberculosis withantisense oligonucleotides to glutamine synthetase mRNAinhibits glutamine synthetase activity, formation of the poly-L-glutamate/glutamine cell wall structure, and bacterialreplication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – Vol.97. – N 1. – P. 418–423.10. Disney M.D., Haidaris C.G., Turner D.H. Uptake andantifungal activity of oligonucleotides in Candida albicans //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol.100. – N 4.– P. 1530–1534.44

ОбзорыУДК 616-092:612.6.05]-07:577.21Клонирование и экспрессия геновв молекулярных колонияхТ.Р. САМАТОВ, Е.В. ЧЕТВЕРИНА, А.Б. ЧЕТВЕРИН *Институт белка РАН, Пущино, Московская областьКлонирование генов in vivo и in vitroОбщепринятый метод клонирования генов включаетв себя встраивание гена в векторную молекулу итрансформацию бактериальных клеток полученной генетическойконструкцией (клонирование in vivo). При этомв одну клетку попадает и далее размножается не болееодной рекомбинантной молекулы ДНК. В результатеразмножения в селективных условиях на твердой агаризованнойсреде (на чашке Петри) образуются колониибактерий, представляющие собой потомство единичныхклеток, то есть клоны. Помимо исследуемого гена, бактериальныеклоны содержат компоненты самих клеток,что обуславливает необходимость последующей очисткиинтересующей исследователя ДНК с целью полученияпрепарата, пригодного для анализа и дальнейших манипуляций.Использование живых клеток для клонированиягенов имеет и другие недостатки. Так, продолжительностьэксперимента определяется скоростью роста клетоки может составлять до нескольких суток. Кроме того,в процессе клонирования исследуемый ген неизбежноподвергается естественному отбору. И, наконец, однимиз наиболее существенных ограничений является эффективностьвстраивания генов в вектор и собственнотрансформации: в клетки проникает и затем дает началоиндивидуальным клонам от 0,0001 до 0,01% исходногопрепарата ДНК (содержимого генной библиотеки)(Roberts & Ja, 1999).К настоящему моменту описан ряд бесклеточныхподходов, с использованием которых в принципе можно* Автор для переписки:© 2006 г. Четверин Александр Борисович,д.б.н., член-корреспондент РАН, заведующий лабораториейбиохимии вирусных РНК Института белка РАН142290 Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 4Тел.: (496) 773-2524Факс: (495) 632-7871E-mail: alexch@vega.protres.ruполучить индивидуальные клоны и которые лишены вышеперечисленныхнедостатков. Эти подходы основанына той идее, что при истощающем разведении экспериментальногообразца в одном сортировочном компартментеокажется единичная молекула исследуемой геннойбиблиотеки. В качестве компартментов могут выступать,например, реакционная ячейка (Lukyanov et al., 1996[10]; Vogelstein & Kinzler, 1999 [22]), элемент микрочипа(Chetverin & Kramer, 1994) [4], микрошарик (Brenneret al., 2000) [3] или капля водно-масляной эмульсии(Tawfik & Griffiths, 1998 [21]; Dressman et al., 2003[7]). В результате размножения ДНК с использованиембесклеточной системы, например, ПЦР, данный компартментс некоторой долей вероятности будет содержатьмолекулярный клон. Однако сами разработчики этихметодов вынуждены в каждом случае проверять чистотуполученных клонов при помощи обычного клонированияс использованием векторов и живых клеток.Функциональный скрининг генов in vitroВажным компонентом бесклеточной биотехнологииявляется функциональный скрининг генных библиотек,то есть отбор из множества последовательностейименно тех, продуктами экспрессии которых являютсябелки с искомыми свойствами. В основе такого скринингалежит технология бесклеточных генетических дисплеев.Их суть заключается в том, что в результате экспрессиигенной библиотеки in vitro новосинтезированный белококазывается связанным с кодирующей его молекулойнуклеиновой кислоты. Исследователь осуществляетселекцию ДНК или РНК по свойствам синтезированногопродукта и вместе с этим продуктом автоматическивыделяет соответствующий генотип.Среди бесклеточных генетических дисплеев можновыделить несколько основных групп. В одной из них новосинтезированныйполипептид оказывается связаннымс кодирующей его мРНК. Связь может быть нековален-45

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2тной, как в случае полисомного (Mattheakis et al., 1994)[11] и рибосомного (Hanes & Plueckthun, 1997) [9] дисплеев,либо ковалентной, как в мРНК-дисплее (Roberts& Szostak, 1997) [18], схожем с ним «in vitro вирусе»(Nemoto et al., 1997) [13] и при использовании «бифункциональнойтРНК» (Merryman et al., 2002) [12].Позднее были разработаны дисплеи, в которыхсинтезируемый белок связывается не с РНК, а с гораздоболее стабильной ДНК. В результате при анализеотобранных последовательностей отпадает надобностьв обратной транскрипции, которая малоэффективна ив процессе которой РНК-зависимой ДНК-полимеразоймогут быть внесены мутации. Большинство этихподходов основано на так называемой «cis-активности»некоторых белков, то есть их способности связываться сопределенными участками именно той молекулы ДНК,которая их кодирует. Здесь также возможно образованиекак нековалентного комплекса, например, при использованиибелка RepA (Odegrip et al., 2004) [15], так иковалентной связи в случае белков VirD2 (de Figueiredoet al., 2004) [8] и P2А (Reiersen et al., 2005) [17]. Существуетметод, в котором за основу взяты микрошарики– сферы из полистирола диаметром около 1 мкм, покрытыестрептавидином. Со стрептавидином связываютсябиотинилированные молекулы ДНК генной библиотекии биотинилированные антитела против специфическихпептидов, последовательности которых присутствуют вовсех новосинтезированных белках и благодаря которымэти белки оказываются присоединенными к данномумикрошарику (Nord et al., 2003) [14].В отдельную группу можно выделить метод,названный авторами «компартментализация in vitro» иоснованный на использовании водно-масляной эмульсии(Tawfik & Griffiths, 1998) [21]. В данном случае физическоеразделение последовательностей, составляющихгенную библиотеку, происходит за счет ее истощающегоразведения, в результате чего в большинстве капель оказываетсяне более одной молекулы ДНК. При экспрессиимолекула ДНК и кодируемый ею белок оказываютсяв одной и той же капле, за счет чего и осуществляетсясвязь генотипа и фенотипа. В некотором смысле этикомпартменты – капли эмульсии – можно рассматриватькак мини-клетки, в которых происходит экспрессиятолько одного гена.Генетические дисплеи in vitro обладают всемипреимуществами, свойственными для бесклеточных методов,однако ни один из таких дисплеев не гарантирует,что в результате проведенной селекции будут полученыистинные молекулярные клоны. Поэтому неизбежной46конечной стадией является обычное клонирование invivo отобранных последовательностей, что обесцениваетпреимущества подходов in vitro.Метод молекулярных колонийИстинные молекулярные клоны можно получитьin vitro с помощью метода молекулярных колоний(Четверин и Четверина, 1998) [1], экспоненциальноразмножая нуклеиновые кислоты в тонком слое иммобилизованнойсреды (например, в пластинке геля).В результате, по аналогии с ростом бактерий на чашкеПетри, в геле образуются колонии, каждая из которыхпредставляет собой истинный клон, то есть потомствоодной-единственной исходной молекулы. Ранее былапродемонстрирована возможность клонировать такимобразом молекулы РНК, размножая их с помощьюQ-репликазы (Chetverina & Chetverin, 1993) [5], ипоказана точность и количественность этого метода, названного«методом молекулярных колоний». РазработкаПЦР-версии этого метода сделала возможным клонированиелюбого генетического материала в виде ДНК,при этом специфичность размножения ограничиваетсялишь используемыми олигонуклеотидными праймерами(Chetverina et al., 2002 [6]; Samatov et al., 2005 [19]).Нами была разработана следующая схема выращиванияи детекции колоний ДНК (рис. 1; Chetverinaet al., 2002) [6]. ПЦР проводили в полиакриламидномгеле, находящемся в лунке микроскопного предметногостекла. Новосинтезированную ДНК переносили на нейлоновуюмембрану и выявляли колонии путем гибридизациис радиоактивно меченным зондом с последующейрадиоавтографией.Недавно нами была продемонстрирована возможностьобнаружения молекулярных колоний путемгибридизации на фильтре с флуоресцентными зондами(Четверина и др., в печати), а также бесконтактногообнаружения молекулярных колоний ДНК непосредственнов геле с использованием «гомогенных» флуоресцентныхсистем детекции (Samatov et al., 2006) [20]. Врезультате процедура клонирования стала значительнобыстрее, проще и дешевле.Колония ДНК содержит до 108 молекул продуктаПЦР длиной свыше 1500 пар оснований, а число колонийпропорционально и близко к числу добавленных молекулматрицы (Samatov et al., 2005) [19]. Иными словами,в отличие от клонирования in vivo с использованиемвекторов и трансформации клеток, в виде колонии ДНКвыявляется почти каждая исходная молекула гена. Таким

Т.Р. Саматов и др., с. 45–49образом, разработанный подход позволяет исследователюизбежать значительных потерь содержимого геннойбиблиотеки.Экспериментальная схема клонирования и экспрессиигенов в молекулярных колониях, реализованнаяна примере гена GFP, приведена на рисунке 1. Послепроведения ПЦР полиакриламидный гель промываютв спиртово-солевом растворе, затем в 50% этаноле ивысушивают. В процессе этой обработки из геля вымываютсянизкомолекулярные вещества, а ДНК остаетсяв виде компактных колоний. Данный способ можно использоватьдля того, чтобы в одном и том же геле последовательнопроводить несколько реакций, оптимальныеусловия которых сильно различаются. В частности, такимобразом нам удалось освободить гель от компонентовсмеси для ПЦР, ингибирующих синтез белка.Далее гель пропитывают бесклеточной системойтранскрипции-трансляции. В указанной работе (Samatovet al., 2005) [19] использовали систему на основе пшеничногоэкстракта и гель инкубировали при 25 °С. Впроцессе инкубации детектировали флуоресценциюновосинтезированного GFP в геле с использованиемлазерного сканера микрочипов.Как можно видеть на рисунке 2, изображениягелей, полученные при детекции флуоресценции и пригибридизации колоний ДНК с радиоактивным зондом,практически совпадают. Это означает, что флуоресцируютмолекулярные колонии, содержащие ген GFP, тоесть экспрессия in situ привела к образованию функциональноактивного белка. Колонии содержат в среднем10 9 молекул зрелого GFP (40 пг/мм 2 ), то есть около 10молекул белка на молекулу матричной ДНК (Samatov etal., 2005) [19]. Такого количества белка достаточно дляего обнаружения in situ по связыванию с антителами илилигандами, а также по его ферментативной активности.Рис. 1. Схема эксперимента по размножениюи экспрессии генов в молекулярных колонияхЭкспрессия в молекулярных колониях:генетический дисплейСинтез белка в молекулярной колонии и его детекцияпо функциональной активности означали созданиепервого бесклеточного метода клонирования генов,позволяющего проводить скрининг клонов по свойствамкодируемых продуктов экспрессии (Samatov et al., 2005)[19].Рис. 2. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях.После ПЦР в геле провели транскрипцию-трансляцию.Регистрировали флуоресценцию GFP (слева),а затем в том же геле детектировали колонии ДНК,содержащие ген GFP (справа)47

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 248Разработанный метод позволяет осуществлятьбыстрый функциональный скрининг большого числаклонов одновременно. Благодаря отсутствию клеточныхстенок, мембран, капель водно-масляной эмульсии и т.д.имеется прямой доступ к новосинтезированным белкам,что облегчает и ускоряет тестирование их функции. Крометого, исследователь имеет возможность вводить в гельпосле экспрессии различные реагенты и, таким образом,тестировать специфическую активность клонов в условиях,отличных от условий транскрипции-трансляции.Полученные результаты позволяют рассматриватьразработанный метод как новую разновидность генетическогодисплея, обладающую рядом существенныхпреимуществ перед используемыми в настоящее времяподходами. В частности, физическая связь фенотипа игенотипа осуществляется за счет того, что ген и соответствующийему белковый продукт находятся в однойи той же молекулярной колонии. Это позволяет обойтисьбез модификаций белка, обеспечивающих ковалентнуюсвязь с собственной матрицей либо образование с нейнековалентного комплекса, как у большинства бесклеточныхгенетических дисплеев. Таким образом, нативнаяструктура белкового продукта клонов не нарушается.Известно, что бесклеточные системы синтеза белкатранслируют только каждую десятую молекулу мРНК,внесенную в реакционную смесь (Pavlov & Ehrenberg,1996) [16]. Это означает, что в результате экспрессиибиблиотеки, в которой последовательности могут бытьпредставлены всего в одном экземпляре, часть клоновнеизбежно останется вне поля зрения исследователя.В то же время предлагаемый нами подход обеспечиваетразмножение каждой молекулы библиотеки в видемолекулярной колонии, которая содержит до 100 миллионовкопий исходной матрицы. Следовательно, дажепри малоэффективном вовлечении матриц в трансляциюэкспрессирован будет каждый клон.Более того, в результате экспрессии в молекулярнойколонии оказывается до 10 9 молекул белковогопродукта данного клона. Таким образом, белок имеетвозможность формировать олиго- или даже мультимерныекомплексы, если этого требует проявление егофункциональной активности.В заключение хотелось бы отметить, что в определенномсмысле молекулярные колонии можно рассматриватькак некие клетки, лишенные оболочки. Онипредставляют собой отдельные компартменты, где происходятбиохимические процессы. Их геном представленмногими копиями одного гена, который они реплицируюти экспрессируют. Подобно живым организмам, они добываютиз окружающей среды энергию и материал дляпроизводства своих компонентов.Работа выполнена при финансовой поддержкепрограммы Президиума Российской академии наук«Молекулярная и клеточная биология».Литература1. Четверин А.Б. и Четверина Е.В. Способ клонированиянуклеиновых кислот. Патент РФ № 2 114 175 – 1998.2. Четверина Е.В., Кравченко А.В., Фалалеева М.В.,Четверин А.Б. Экспресс-гибридизация молекулярныхколоний с флуоресцентными зондами (в печати – «Биоорган.химия»).3. Brenner S., Williams S.R., Vermaas E.H., Storck T., MoonK., McCollum C., Mao J.-I., Luo S., Kirchner J.J., EletrS., DuBridge R.B., Burcham T. and Albrecht G. In vitrocloning of complex mixtures of DNA on microbeads: physicalseparation of differentially expressed cDNAs // Proc. NatlAcad. Sci. USA. – 2000. – Vol. 97. – P. 1665–1670.4. Chetverin A.B. and Kramer F.R. Oligonucleotide arrays:new concepts and possibilities // Bio/Technology. – 1994.– Vol. 12. – P. 1093–1100.5. Chetverina H.V. and Chetverin A.B. Cloning of RNAmolecules in vitro // Nucleic Acids Res. – 1993. – Vol.21. – P. 2349–2053.6. Chetverina H.V., Samatov T.R., Ugarov V.I. and ChetverinA.B. Molecular colony diagnostics: detection and quantitationof viral nucleic acids by in-gel PCR // BioTechniques.– 2002. – Vol. 33. – P. 150–157.7. Dressman D., Yan H., Traverso G., Kinzler K.W. andVogelstein B. Transforming single DNA molecules intofluorescent magnetic particles for detection and enumeration ofgenetic variations // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2003.– Vol. 100. – P. 8817–8822.8. De Figueiredo P., Roberts R.L. and Nester E.W. DARTs:A DNA-based in vitro polypeptide display technology //Proteomics. – 2004. –Vol. 4. – P. 3128–3140.9. Hanes J. and Pluckthun A. In vitro selection and evolution offunctional proteins by using ribosome display // Proc. NatlAcad. Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. – P. 4937–4942.10. Lukyanov K.A., Matz M.V., Bogdanova E.A., GurskayaN.G. and Lukyanov S.A. Molecule by molecule PCRamplification of complex DNA mixtures for direct sequencing:an approach to in vitro cloning // Nucleic Acids Res. – 1996.– Vol. 24. – P. 2194–2195.11. Mattheakis L.C., Bhatt R.R. and Dower W.J. An in vitropolysome display system for identifying ligands from very largepeptide libraries // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1994.– Vol. 91. – P. 9022–9026.

Т.Р. Саматов и др., с. 45–4912. Merryman C., Weinstein E., Wnuk S.F. and Bartel D.P.A bifunctional tRNA for in vitro selection // Chem. Biol.– 2002. – Vol. 9. – P. 741–746.13. Nemoto N., Miyamoto-Sato E., Husimi Y. and YanagawaH. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded proteinon the ribosome in vitro // FEBS Lett. – 1997. – Vol. 414.– P. 405–408.14. Nord O., Uhlen M. and Nygren P.- A ° .Microbead displayof proteins by cell-free expression of anchored DNA // J.Biotechnol. – 2003. – Vol. 106. – P. 1–13.15. Odegrip R., Coomber D., Eldridge B., Hederer R.,Kuhlman, P.A., Ullman C., FitzGerald K. and McGregorD. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries ofprotein-DNA complexes // Proc. Natl Acad. Sci. USA.– 2004. – Vol. 101. – P. 2806–2810.16. Pavlov M.Y. and Ehrenberg M. Rate of translation of naturalmRNAs in an optimized in vitro system // Arch. Biochem.Biophys. – 1996. – Vol. 328. – P. 9–16.17. Reiersen H., Lobersli I., Loset G. A., ° Hvattum E., SimonsenB., Stacy J.E., McGregor D., FitzGerald K., Welschof M.,Brekke O.H. and Marvik O.J. Covalent antibody display-anin vitro antibody-DNA library selection system // NucleicAcids Res. – 2005. – Vol. 33. – E10.18. Roberts R.W. and Szostak J.W. RNA-peptide fusions for thein vitro selection of peptides and proteins // Proc. Natl Acad.Sci. USA. – 1997. – Vol. 94. – P. 12297–12302.19. Samatov T.R., Chetverina H.V. and Chetverin A.B.Expressible molecular colonies // Nucleic Acids Res.– 2005. – Vol. 33. – E145.20. Samatov T.R., Chetverina H.V. and Chetverin A.B. Real-timemonitoring of DNA colonies growing in a polyacrylamide gel //Anal. Biochem. – 2006. – Vol. 356. – P. 300–302.21. Tawfik D.S. and Griffiths A.D. Man-made cell-likecompartments for molecular evolution // Nat. Biotechnol.– 1998. – Vol. 16. – P. 652–656.22. Vogelstein B. and Kinzler K.W. Digital PCR // Proc. NatlAcad. Sci. USA. – 1999. – Vol. 96. – P. 9236–9241.49

ОбзорыУДК 575.1Концепция создания международной коалиционнойпрограммы по биобезопасностиА.А. Воробьев 1 , В.И. Евстигнеев 2 , Е.В. Пименов 3 , Р.Г. Василов 1 * , В.В. Кутырев 41Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова,2ОАО «Биопрепарат», Москва;3Вятский государственный университет, Киров;4Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов* Автор для переписки:© 2006 г. Василов Раиф Гаянович,д.б.н., профессор, вице-президент Обществабиотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова119296 Москва, Университетский пр-т, 9Тел.: 8-916-640-76-18E-mail: obr@biorosinfo.ru50По заявлению государственных деятелей многихстран, в том числе Президента Российской ФедерацииВ.В. Путина, на нашей планете началась третья мироваявойна. Она носит в основном террористический характер.При этом идеологи и непосредственные исполнителипридают определенное значение биотерроризму, то естьприменению в террористических целях биологическихагентов (БА).В качестве биологических агентов, поражающихлюдей, в принципе могут быть использованы:1. Бактерии, вирусы, грибы, простейшие и их генетическиизмененные варианты.2. Токсины микробов.3. Токсины растений.4. Переносчики возбудителей болезней.5. Яды пресмыкающихся и членистоногих.6. Поведенческие синтетические пептиды.Однако по поражающему эффекту представители2–6-й групп БА не имеют преимуществ перед другимисовременными способами массового поражения людей:химического, радиационного, огнестрельного оружия,взрывчатых веществ. Они могут быть использованы восновном для психологического воздействия на население,с целью устрашения. Значительно более опаснуюугрозу представляет применение в качестве поражающихагентов микробов. Даже специалисты-атомщикипризнают, что некоторые микробы в случае их применениямогут вызвать массовые поражения населения,превосходящие по эффективности атомную бомбу. ЭтиБА наиболее опасны и могут применяться для массовогоуничтожения людей.Действительно, если коснуться истории, то микробывызывали опустошительные эпидемии. В средние векатолько чума и оспа уносили сотни миллионов жизней.В наше время от вирусных гепатитов за 15 лет погиблобольше людей, чем во Вторую мировую войну. Ежегодново всем мире от кори, малярии, туберкулеза, гепатита Вумирает 2–3 млн. человек от каждой инфекции. Из 51миллиона смертей от всевозможных болезней 16 миллионовприходится на инфекционные болезни.В 30–60-е годы прошлого столетия высокая поражающаясила микробов была использована некоторымистранами для разработки нового, альтернативного атомному,оружия массового поражения людей. Когда сталоясно, что биологическое оружие таит угрозу человечеству,Генеральная ассамблея ООН в 1972 г. приняла конвенцию,запрещающую разработку, производство и применениебиологического (токсинного) оружия. Однако этаконвенция подписана не всеми государствами и в любоймомент может быть нарушена. Об этом свидетельствует«конвертная» война с применением спор возбудителейсибирской язвы в США в 2002 году.Поэтому необходимо иметь надежную глобальнуюсистему противодействия биологическомуоружию. Эта система должна включать в себя решениеи осуществление многих проблем: политических,экономических, организационных, специальных профилактическихсредств, обеспечивающих безопасностьнародов всех стран, поскольку биологическое оружиеимеет свойство распространяться, преодолевая кордоныи границы.

От каких же БА следует, прежде всего, создаватьсистему защиты?На нашей планете «проживает» свыше миллионавидов бактерий, 1,5·10 6 видов грибов, сотни тысяч видоввирусов и простейших (большинство из них пока неописано – >95%). Общая биомасса микробов, живущихна планете, превосходит биомассу всего остального мираживых существ.Без микробов жизнь человека на планете была быневозможна, так как они обеспечивают условия существованиялюдей: определяют газовый состав атмосферы,плодородие почв, наличие полезных ископаемых (нефть,уголь, газ и др.), очистку планеты от накапливаемыхпродуктов жизнедеятельности человека, растений и животных.Подавляющее большинство микробов не представляетопасности для человека и только доли процентаот существующих на планете видов микробов, примерно3500 видов, могут вызывать болезни человека.По степени опасности патогенные микробы широковарьируют. Поэтому систему защиты надо создавать,прежде всего от особо опасных бактерий и вирусов. Разработаннаяавторами критериально-рейтинговая оценкаопасности и вероятности использования БА включает10–15 видов возбудителей инфекционных болезней. Это– вирус натуральной оспы, возбудители чумы, сибирскойязвы, туляремии, токсины ботулизма, возбудители сапа,мелиоидоза, геморрагической лихорадки, болезни Марбурга,сыпного тифа, Ку-лихорадки, гриппа, бруцеллеза,холеры. Конечно, следует предусматривать и возможностьиспользования в качестве БА генетически модифицированныемикроорганизмы и не только перечисленныевыше, но и другие, которые в виде природных штаммовне представляют опасности. Примером может служитьвирус атипичной пневмонии (SARS), происшедший избезобидного для человека коронавируса.Генетическая модификация микробов возможна сцелью: повышения вирулентности, изменения антигенности,что затрудняет идентификацию и диагноз; полученияштаммов, вызывающих атипичные клиническиепроявления, усиление поражающего эффекта, неэффективностьтрадиционных средств лечения; повышенияустойчивости БА в окружающей среде; приобретения БАнесвойственных путей передачи и др. Однако необходимоотметить, что генетически измененные штаммы микробовдовольно нестабильны, а их получение является сложнымнаукоемким процессом.Система специфического противодействия каждомуиз перечисленных БА должна включать в себя: наличиесредств экспресс-индикации, экспресс-диагностики,средств деконтаминации, дезинфекции, дератизации,дезинсекции, методов специфической и неспецифическойпрофилактики, способов лечения, проведения и организациикарантинных и других противоэпидемическихмероприятий. Если проанализировать применительно квышеназванным БА наличие комплекса перечисленныхсредств защиты, имеющихся на сегодняшний день, товыявятся большие «прорехи» в цельной системе противодействиянаиболее опасным видам БА. Из таблицы 1видно, что для защиты от вируса натуральной оспыотсутствуют средства лечения; от возбудителя чумы вакцинане удовлетворяет требованиям по эффективности;от сапа – отсутствует вакцинопрофилактика, требуеттакже улучшения экспресс-диагностика; от вирусаМарбурга – неэффективного лечения и вакцинации; оттоксинов ботулизма – необходимо улучшение экспрессдиагностикии лечения; требуют совершенствованиявакцины против сыпного тифа, Ку-лихорадки, гриппа,бруцеллеза, холеры.Конечно, это узловые проблемы, которые надорешать, используя накопленные данные и научныйпотенциал, однако и другие проблемы не должны бытьоставлены без внимания. Вполне понятно, что решитьпроблемы быстро и эффективно не под силу ни однойдаже богатой стране (хотя в США в 2004 г. принят проект«Биощит»). Поэтому требуется объединение усилийвсех цивилизованных стран, с учетом их готовности иопыта по решению отдельных проблем в общей системебиобезопасности. Для этого необходимо создать международнуюкоалиционную программу противодействиябиотерроризму, которая обязывала бы отдельные страны,желающие в ней участвовать, разрабатывать нерешенныепроблемы защиты от наиболее опасных БА.Исходя из той информации, которой мы располагаем,целесообразно поручить разработку отдельныхнерешенных проблем в общей системе защиты от БАследующим образом:- по натуральной оспе – России, США;- по чуме – Индии, Республике Корея, России;- по сибирской язве – России, США;- по токсинам ботулизма – России, США, Великобритании;- по туляремии – США, Швеции, России;- по сапу и мелиоидозу – США, России;- по сыпному тифу и Ку-лихорадке – США, Чехии,Бразилии, России;- по гриппу – России, США, Китаю, Франции;- по бруцеллезу – Великобритании;- по геморрагической лихорадке – ФРГ, ЮАР.51

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Состояние специальных средств защитыот наиболее опасных БАТаблица 1БАЛечениеЭкспрессиндикацияЭкспрессдиагностикаДеконтаминацияСпецпрофилактикаПротивоэпидемиологическиемероприятияНатуральная оспа + + ++ ++ +++ ++Чума ++ ++ ++ ++ + ++Сибирская язва ++ ++ + + ++ ++Ботулизм + ++ + ++ ++ +Сап, мелиоидоз + ++ ++ +++ + +Болезнь Марбурга ++ ++ ++ +++ +++ +Сыпной тиф + ++ ++ + ++ ++Ку-лихорадка + + + ++ + +Грипп + + ++ ++ ++ ++Бруцеллез + + + ++ ++ +Туляремия + ++ + + + ++ наличие средств, удовлетворяющих требованиям++ наличие средств, не удовлетворяющих требованиям+++ отсутствие средствБезусловно, важно определить перечень стран,участвующих в коалиционной программе. Пока он указансугубо ориентировочно и должен окочательно устанавливатьсяпосле проведенного комплекса политических,экономических, организационных и других форм решенийи согласований на международном уровне.Перечень таких решений представлен в таблице 2.В ней можно ясно видеть, какие проблемы и на какомуровне необходимо решить для создания международнойкоалиционной программы по биобезопасности, отвечающейсовременным требованиям.Разработка международной коалиционной программыпротиводействия биотерроризму должна начатьсякак можно быстрее, иметь превентивный характер, неожидая развязывания биотеррористических действий.К превентивному действию против террористов всехмастей призывает и Президент Российской ФедерацииВ.В. Путин.Первоочередные проблемы, которые надо решить,представлены в таблице 3. Они основаны на тщательноманализе существующей ситуации.Решение научно-исследовательских, опытно-конструкторских,производственных и других задач, предусматриваемыхуказанной международной коалиционнойпрограммой, не будет затратным, так как повысит уровеньпротивоэпидемической службы в целом, то есть небудет ненужным экономическим бременем для населениявсех стран, – в отличие от огромных, подчас неоправданныхзатрат на вооруженные силы, предусмотренныхв каждой стране.Надеюсь, что поднятая нами проблема созданиямеждународной коалиционной программы противодействиябиотерроризму, привлечет внимание руководстванашей страны и оно проявит приоритетную инициативупо созданию этой программы.52

А.А. Воробьев и др., с. 50–53Актуальные задачи и потенциальные исполнители программыТаблица 2ПроблемаПолитические и дипломатические решенияСоздание рабочей группы по разработке программыЭкономическая база программыГармонизация законодательной и нормативно-правовойбазы, унификация средств защитыНа каком уровне должно приниматьсярешениеРуководители государств, ООНВсемирная организация здравоохраненияПравительства стран-участницЗаконодательные органы, министерстваи ведомства стран-участницОбоснование приоритетов в рамках программы – “ –Структурно-функциональная схема взаимодействияПодготовка высококвалифицированных кадровИнформационное обеспечениеПринципы создания международного банка средствпротиводействия биотерроризмуКонтроль над работами с особо опасными возбудителямиСоздание международных сил быстрого реагированиядля работы в очагах инфекцииРазработчики программыСтраны-участницыСтраны-участницыВОЗВОЗВОЗ, правительства стран-участницпрограммыТаблица 3Первоочередные проблемы, которые нужно решить применительно к наиболее опасным БАБАПроблемыНе решеныТребуют совершенствованияНатуральная оспа Лечение ВакцинацияЧумаВакцинацияСибирская язваВакцинацияБотулизм Экспресс-диагностика ЛечениеТуляремияЭкспресс-диагностикаСап, мелиоидоз Лечение Экспресс-диагностикаБолезнь МарбургаЭкспресс-индикацияСыпной тифВакцинацияКу-лихорадкаВакцинацияГрипп Лечение ВакцинацияБруцеллез Лечение ВакцинацияХолераВакцинацияДанная статья представляет собой доклад,сделанный А.А. Воробьевым на III съезде Обществабиотехнологов России 27 октября 2005 г.53

ОбзорыУДК 612.017.1.33ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ И ЗАЩИТА ОТ ПАТОГЕНОВБ.Ф. СЕМЕНОВ *Российское научно-практическое общество эпидемиологов,микробиологов и паразитологов, МоскваСогласно консолидированному мнению многих экспертовВОЗ, России, США, в любой момент, в любойточке земного шара может возникнуть тяжелая эпидемия,возбудителем которой станет ранее неизвестный патоген.За последнюю треть истекшего столетия человечествостолкнулось с рядом таких неизвестных патогенов.В течение 1972–1981 гг. было идентифицировано11 патогенов (в их числе вирус Эбола, вирус Ханта,Legionella pneumoniae); с 1982 по 1991 гг. было выявлено13 патогенов, среди них ВИЧ – возбудительСПИД, вирус гепатита Е; в 1992–2001 гг. – 13 патогенов,в том числе патогенные для человека прионы,вирус птичьего гриппа типа А (H5N1); в 2002–2004гг. – 2 патогена: коронавирус – возбудитель тяжелогоострого респираторного синдрома (атипичная пневмония)и вирус птичьего гриппа типа А (H7N7). Всего запериод 1972–2004 гг. выделено и идентифицировано39 новых патогенов.Современные иммунологические методы борьбыс эпидемиями основаны на следующих представлениях.Вакцинация против известного патогена возможна,неизвестного – нет. Иммунотерапия при известномвозбудителе проводится, при неизвестном – только вконце эпидемии. Проблема активации врожденного иммунитетав отношении известного патогена обсуждается,неизвестного – разрабатывается.Среди указанных методологических подходовв последнее время привлекает внимание и интенсивноразрабатывается вопрос о механизмах активации врожденногоиммунитета (ВИ). Последний характеризуетсяследующими особенностями:* Автор для переписки:© 2006 г. Семенов Борис Федорович,академик РАМН, председатель Российскогонаучно-практического общества эпидемиологов,микробиологов и паразитологов105064 Москва, Малый Казенный пер., 5аТел.: (495) 917-49-0054- Это древняя система распознавания и защиты отчужого. Выявлена у растений, беспозвоночных иу всех позвоночных (от мыши до человека).- Она распознает с помощью генетически закодированныхрецепторов консервативные, присущиетолько микроорганизмам, молекулярныеструктуры (pathogen associated molecular patterns– PAMPs).- После распознавания PAMPs начинается выполнениеэффекторных функций ВИ. Это происходитбез пролиферации клеток-эффекторов, поэтомузащита формируется быстро (часы).- Активация ВИ является первым и обязательнымэтапом развития адаптивного иммунитетаЭффекторная система врожденного иммунитетавключает в себя кожу и слизистые, гуморальные факторы(комплемент, лизоцим, растворимые рецепторыдля патогенов – C-реактивный белок, сурфактанты ит.д.), фагоцитирующие клетки (дендритные, макрофаги,моноциты, нейтрофилы, эозинофилы), клетки-продуцентывоспалительных медиаторов (базофилы, тучныеклетки), естественные киллеры, B-1 лимфоциты, Tгамма дельта.Сейчас разрабатывается концепция экстреннойзащиты от патогенов (в течение несколькихчасов), которая основана на предположении о том, чтостимуляция созревания дендритных клеток с помощьюносителя PAMPs (иммуномодуляторов бактериальногопроисхождения) приведет к активации эффекторныхмеханизмов врожденного иммунитета (24 часа) иформированию протективного иммунитета против конкретногопатогена (7–14 дней).Ведущими факторами при этом являются рецепторныеструктуры. В таблице 1 приведены рецепторыврожденного иммунитета, распознающие патоген-ассоциированныеструктуры микроорганизмов.К настоящему времени получены довольно подробныеданные о TOLL-подобных рецепторах и ихлигандах (табл. 2).

Рецепторы врожденного иммунитета,распознающие патоген-ассоциированные структуры микроорганизмовТаблица 1РецепторыToll-подобныеNODМаннозныеМусорщикиАктивация NKЭкспрессированыНа мембранах МФ, ДК, моноцитов, тучных клеток, нейтрофилов и т.д.В цитоплазмеНа мембранах МФ, ДК, соматических клеток и .т.дНа мембранах, МФ, ДК и т.д.На мембранах NK, МФТОLL-подобные рецепторы (TLRs) и их лиганды (PAMPs)Таблица 2TLRs PAMPs НосительTLR 1 / TLR 2 Липопротеин грам + , грам - бактерииЛипопротеинграм + , грам - бактерииЛипотейхоевая кислота грам + , грам - бактерииTLR 2ЗимозандрожжиЛипоарабиманнанM. tuberculosisФосфолипидытрипаносомыTLR 3 ds RNK вирусыTLR 4 ЛПС грам - бактерииTLR 5 Флагеллин грам + , грам - бактерииTLR 6 Липопептиды грам + , грам - бактерииTLR 7 ss RNK вирусыTLR 8 ???TLR 9ss RNKвирусыYCpY - DNKбактерииTLR 10–13 ???Особое место в системе врожденного иммунитетапринадлежит дендритным клеткам, которые, по мнениюряда авторов, являются ее ключевым элементом.К наиболее важным функциям дендритных клетокотносятся:- Они распознают патоген-ассоциированные молекулярныеструктуры (ПАМС) микроорганизмов.- После распознавания ПАМС начинается экспрессия:костимулирующих молекул (CD40, CD80,CD86); молекул антигенного представления(MHCI, MHCII); секреция цитокинов.- Передают сигнал активации нативным Т-лимфоцитам(формирование приобретенного иммунитета.- Определяют развитие иммунного ответа по Th1 иTh2 типу.Ведется активный поиск эффективных средствпротив различных патогенов. Так, например, осуществленоисследование влияния рекомбинантных интерлейкиновна развитие экспериментальных инфекций (табл. 3).55

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Влияние рекомбинантных интерлейкиновна развитие экспериментальной инфекцииТаблица 3Патоген IL-1 TNFa IFNg IL-12Pseudomonas aeroginosa n n nKlebsiella pneumoniae n n n nSalmonella typhimurium n n n nEscherichia coli n n nStaphylococcus aureus n n n nStreptococcus pneumoniae n nStreptococcus suisnListeria monocytogenes n n n nCandida albicans n n nLegionella pneumophila n nMycobacterium spp n n nChlamydia trachomatis n nChlamydia psittacinAspergillus fumigatus n nBrucella abortus n nYersinia enterocolitica n nCryptococcus neoformans n nПредполагаемый набор распознающих рецепторов (PRPs),с которыми могут реагировать PAMPs антигенных комплексовполикомпонентной вакцины «Иммуновак ВП-4»Таблица 4PAMPsРецепторы PAMPsЛипопептиды TLR 1, TLR 6Липоротеины TLR 2Липотейхоевые кислоты TLR 2ЛПС TLR 4, TLR 2 *CpG-DNA TLR 7, TLR 8Пептидокгликан NOD 2 *** Leptospira interrogans** Внутриклеточный рецептор, распознает мурамилдипептидстенки практически всех бактерий56

Б.Ф. Семенов, с. 54–57Из данных, приведенных в таблице 3, можнозаключить, что IL-1 предупреждает развитие 9 инфекций,TNFa (альфа) – 10, IFNg (гамма) – 14, IL-12– 11. Суммарно четыре интерлейкина защищают от 17патогенов.В Институте вакцин и сывороток им. И.И. МечниковаРоссийской академии медицинских наук разработанаполикомпонентная вакцина «Иммуновак ВП-4»,которая состоит из антигенных комплексов S. aureus,E. coli, K. pneumoniae, P. vulgaris. Определен предполагаемыйнабор распознающих рецепторов (PRPs), скоторыми могут реагировать патоген-ассоциированныемолекулярные структуры (pathogen associated molecularpatterns, PAMPs) антигенных комплексов этой вакцины(табл. 4).В целом последовательность развертывания системыиммунологической защиты от патогенов представленана нижеследующей обобщенной схеме.Безусловно, в обсужденной проблеме многие теоретическиеи методологические аспекты еще требуюттщательной разработки, однако жизнь в лице новыхпатогенов ставит конкретные практические задачи,которые требуется незамедлительно решать. Нам представляется,что доктрина активации врожденного иммунитетапозволяет делать положительные шаги в данномнаправлении.Материалы доклада, сделанного 1 июня 2006года в Санкт-Петербурге на Научно-практическойконференции «Актуальные проблемы биобезопасности»,посвященной памяти академика РАМНА.А. Воробьева.57

ОбзорыУДК 614.47Вакцинопрофилактика: прошлое, настоящее, будущееВ.В. ЗВЕРЕВ *НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, МоскваВ настоящее время в мире существует более 100различных вакцин, которые защищают от более чемсорока различных инфекций вызываемых бактериями,вирусами, простейшими [2].До середины 80-х годов прошлого столетия всевакцинные препараты, которые были разработаны,базировались на трех основных методологических подходах:1. Живые вакцины – препараты, в которыхдействующим началом являются ослабленные тем илииным способом патогенные микроорганизмы, потерявшиеспособность вызывать заболевание, но сохранившиеспособность вызывать иммунный ответ на возбудитель.Примером таких вакцин являются вакцины против кори,краснухи, полиомиелита, эпидемического паротита, гриппаи др. Кроме того, как было в случае натуральной оспы,иногда используются микроорганизмы близкие по своейструктуре к возбудителю инфекционного заболеваниялюдей.2. Инактивированные (убитые) вакцины, которыевключают в себя убитые тем или иным способомпатогенные для человека микроорганизмы или ихфрагменты. На таком подходе созданы вакцины противгриппа, клещевого энцефалита, бешенства, брюшноготифа.3. Анатоксины (токсоиды), содержащие бактериальныетоксины в измененной нетоксичной форме,способные вызывать защитный эффект организма.Примером таких вакцин являются хорошо известные ишироко применяемые вакцины против дифтерии, столбняка,коклюша.С середины 80-х годов прошлого столетия с началомбурного развития молекулярной биологии, генетики и* Автор для переписки:© 2006 г. Зверев Виталий Васильевич,академик РАМН, директор НИИ вакцин и сыворотоким. И.И. Мечникова РАМН105064 Москва, Малый Казенный пер., 5аТел.: (495) 917-49-0058методов генной инженерии появился новый класс вакцин– молекулярные вакцины, в которых используются рекомбинантныебелки или фрагменты белков патогенныхмикроорганизмов искусственно синтезированные в клеткахлабораторных штаммов бактерий, вирусов, дрожжей.В практику пока вошли только три таких препарата: рекомбинантнаявакцина против гепатита В, предложеннаянесколькими компаниями (1986, 1989); рекомбинантнаявакцина против болезни Лайма (1998) и детоксицированныйкоклюшный токсин, который включен в составАКДС-вакцины, применяемой в Италии.Применение всех этих вакцинных препаратовпозволило человечеству достичь невероятных результатовв борьбе с инфекционными заболеваниями. Так,в мире полностью ликвидирована натуральная оспа,заболевание, ежегодно уносившее миллионы человек.Практически ликвидирован на большинстве континентовполиомиелит. Продолжается глобальная ликвидациикори. В сотни и даже тысячи раз снижена заболеваемостьдифтерией, краснухой, коклюшем, эпидемическимпаротитом, вирусным гепатитом В и целым рядом другихопасных инфекционных заболеваний. И все это благодарявакцинам.Однако несмотря на все достигнутые успехи, всовременном мире инфекционные болезни до сих поростаются одной из главных причин смертности: на ихдолю приходится до 30% ежегодно регистрируемыхлетальных исходов на планете, что составляет 14–17млн. случаев [3, 4].Согласно прогнозу экспертов ВОЗ, России иСША, в первой половине XXI века в любое время, влюбой точке земного шара следует ожидать возникновениеэпидемии или вспышки инфекций, возбудителямикоторых могут быть новые или возвращающиеся инфекционныезаболевания [5, 6, 7, 8].Источником новых возбудителей инфекционныхзаболеваний являются природные очаги, из которых в человеческуюпопуляцию практически ежегодно заносятсянеизвестные микроорганизмы. В течение последних 30

лет человечество столкнулось с 40 новыми патогеннымидля человека микроорганизмами, которые в ряде случаевстали реальной угрозой для жизни и здоровья сотен тысячлюдей. Среди вновь обнаруженных возбудителей вирусы,бактерии, и прионы. Существует твердое убеждение, чтозанос из природы неизвестных до сих пор микроорганизмовбудет происходить и в дальнейшем [5, 6, 7].Возвращение управляемых с помощью вакцинацииинфекций происходит в тех случаях, когда на фонеэпидемиологического благополучия прекращаются прививки,предусмотренные национальным календарем, илиуменьшается охват прививками контингентов риска. Этотфеномен в современной литературе описывается понятием«вакцинозависимость человеческого сообщества».Возвращение управляемых детских инфекций впоследние десятилетия наблюдали в Японии, России,Азербайджане, Грузии, Таджикистане, Украине, на Гаити,в Венесуэле и Колумбии, где были зарегистрированыэпидемии коклюша, дифтерии, полиомиелита и кори.Появление известных патогенных для человекамикроорганизмов на новых территориях описывали неоднократно.Так, в 1942–1945 гг. на территории Япониизарегистрировали, по меньшей мере, 200 000 случаевлихорадки Денге, а во Вьетнаме в июле-сентябре 1960г. возникла эпидемия этой лихорадки, жертвами которойстали 2 млн. человек [9]. В 1999 г. в Нью-Йорке зарегистрировалислучаи лихорадки Западного Нила. К 2002 г.это заболевание наблюдали на территории 44 штатов [7].По неполным данным, к концу 2002 г. было известно о4156 случаях лихорадки Западный Нил, из которых 284завершились летальным исходом. В мае 2003 г. появилисьсообщения о заболеваниях в США, ассоциированныхс вирусом оспы обезьян. Зарегистрировали около 50случаев. Вспышка не получила распространения, так каквирус не передавался от человека к человеку.Занос известных микроорганизмов на новыетерритории связывают с миграцией людей (Денге), переносчиков(Денге, Западный Нил) или перемещениемэкзотических животных, приобретаемых для домашнихили общественных зоопарков (Западный Нил, оспаобезьян) [7, 9].В последние годы стало общепризнанным, чтодля построения эффективной системы защиты от новыхи возвращающихся инфекций необходимо созданиеглобальной системы мониторинга инфекционной заболеваемостии мониторинга свойств, значимых для медицинымикроорганизмов. Такой мониторинг позволилдостаточно быстро выявить первые случаи тяжелогоострого респираторного синдрома (ТОРС – русскийэквивалент английского SARS), вызываемого новымвариантом коронавирусов.Материалы мониторинга используются для подготовкипрогнозов, в которых называют ожидаемые вближайшем или отдаленном времени вероятные возбудителиэпидемии или вспышки.На основании представленного прогноза и опытаего реализации в практике представляется возможнымсделать ряд выводов о перспективах иммунопрофилактикиожидаемых инфекций, имея в виду использованиесуществующих и создание новых вакцин.Кроме того, в последнее время важность усовершенствованиястарых и разработки новых вакцинныхпрепаратов обусловлена предпосылкой их более широкогои масштабного применения в тех областях медицины, вкоторых вакцины ранее не использовались.К сожалению, далеко не всегда старые испытанныетехнологии получения вакцинных препаратов позволяютсоздавать вакцины против новых инфекций. В некоторыхслучаях они оказываются неэффективными или опаснымидля применения. Как уже говорилось выше, большиенадежды возлагались на вакцины, полученные на основерекомбинантных антигенов. В настоящее время сталоочевидным, что в большинстве случаев с помощью рекомбинантныхтехнологий получают препараты, обладающиеслабой иммуногенностью. Современная иммунологияобъясняет слабую иммуногенность продуктов, получаемыхс помощью рекомбинантных технологий, тем, чтоони лишены ассоциированных с микроорганизмом молекулярныхструктур, распознавание которых необходимодля запуска ответа сначала врожденного иммунитета, азатем развития адаптивного иммунного ответа.Прогнозируется, что рекомбинантные вакциныполучат широкое применение в практике только тогда,когда будут лицензированы для применения на людяхновые адъюванты (усилители), потенцирующие антигеннуюактивность этих вакцин.За последние 10 лет в вакцинологии сформировалосьновое направление, основанное на принципе, когдав организм вводится не белок, а нуклеиновая кислота(ДНК или РНК). Данное направление называют «генетическойиммунизацией», «вакцинацией нуклеиновымикислотами», «ДНК-вакцинацией» и связывают с этимнаправлением революционные изменения в вакцинологииближайшего будущего. Несмотря на то, что способностьДНК и РНК инициировать синтез кодируемых имибелков после проникновения в клетку известна давно,только в середине 90-х годов прошлого века были осознаныи сформулированы возможности этой технологии59

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2применительно к медицине, ветеринарии и фундаментальнойнауке. Такой новый подход достаточно прост,дешев и самое главное дает возможность унифицироватьметоды. После разработки относительно безопасныхвекторных систем, повышения эффективности доставкинуклеиновых кислот в ткани и обнаружения возможностидлительной (до года) экспрессии чужеродной ДНК втрансформированных клетках in vivo стал ясен потенциалуказанной технологии в генотерапии и созданиивакцинных препаратов. В 1993 г. было показано, чтоДНК-вакцинация приводит к полноценному иммунномуответу, то есть к образованию антител (гуморальныйответ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (клеточныйответ), и обеспечивает у животных высокий уровеньзащиты от вирусной инфекции.Экспериментальная работа по конструированиюДНК-вакцины ведется очень активно, особенно в областиконструирования вирусных систем. С января 2000 г.по март 2003 г. опубликованы результаты исследованияна мышах 139 конструкций, созданных на основе 18 вирусов,включая ВИЧ-1 и ВИЧ-2, дельта вирус, вирусыгриппа, кори, гепатита С и т.д.В рамках указанных исследований изучали разныеДНК-системы, возможность повышения их эффективностиза счет использования новых адъювантов и применениядля ревакцинации генно-инженерной вакциныдругого типа. Для ревакцинации, которая проводитсяпосле первичного применения ДНК-вакцины, предлагаютиспользовать или рекомбинантный белок илирекомбинантный вирусный вектор.Интерес к ДНК-вакцинам стимулирует и ряд перспективныхсвойств, которыми они обладают. Используяодин и тот же плазмидный или вирусный вектор, можносоздавать вакцины, против различных инфекционныхзаболеваний, меняя только последовательность, кодирующуюнеобходимые антигены. При этом отпадаетнеобходимость манипулирования с патогенными вирусамии бактериями. Отпадает сложная и дорогостоящаяпроцедура очистки антигенов. Важно также то, что препаратыДНК-вакцин не требуют специальных методовдоставки и стабильны длительное время при комнатнойтемпературе. ДНК-вакцины содержат структуры, распознаваемыесистемой врожденного иммунитета какчужие. Поэтому от них ожидают высокую иммунологическуюэффективность.В настоящее время разработаны и испытываютсяДНК-вакцины против инфекций вызываемых вирусамигепатитов В и С, вирусом гриппа, вирусом лимфоцитарногохориоменингита, вирусом бешенства, вирусом60иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом японскогоэнцефалита, а также возбудителями сальмонеллеза,туберкулеза и некоторых паразитарных заболеваний(лейшманиоз, малярия). Выбор инфекций связан нетолько с их высокой актуальностью для человечества, нои с безуспешными попытками создать надежные вакцинныепрепараты классическими, широко используемымив настоящее время методами.ДНК-вакцинация представляется одним из самыхперспективных направлений в борьбе с раком. Разработаныследующие методологические подходы к вакцинотерапииразличных опухолей при помощи различныхрекомбинантных ДНК:1. Введение в организм (опухоль) ДНК, кодирующихраковые антигены.2. Активация антиген представляющих клеток.3. Введение в раковые клетки генов цитокинов ииммуномодуляторов.4. Комбинированные подходы, которые заключаетсяв одновременном использовании векторных систем,кодирующих раковые антигены, гены «убийства» клеткии цитокины.Однако прежде чем ДНК-вакцинация войдетв медицинскую практику, следует решить целый рядвопросов, связанных с безопасностью введения такихпрепаратов в организм человека, изучить длительностьиндуцируемого ими иммунитета и последствия для иммуннойсистемы нового способа представления антигена.Поэтому, для того чтобы этот метод получил широкоеприменение, необходимо решить целый ряд принципиальныхнаучных вопросов.Безуспешные попытки создания новых вакцинныхпрепаратов против некоторых инфекционных заболеваний,таких как ВИЧ-инфекция, гепатит С, малярия,стрептококковая инфекция, а также бурное развитиев последнее десятилетие геномики, биоинформатики ипротеомики привели к возникновению совершенно новогоподхода к созданию вакцин, получившего название«обратная вакцинология» («reverse vaccinology»).Предложенный термин «обратная вакцинология»четко выражает суть нового технологического приема.Если раньше при создании кандидатов в вакцинныепрепараты шли по нисходящей от целого микроорганизмак его составляющим, то теперь предлагаетсяпротивоположный путь – от генома к его продуктам.Такой подход основан на том, что большинство защитныхантигенов являются белковыми молекулами. Поэтомуполные знания обо всех белковых компонентах любоговозбудителя заболевания могут позволить определить

В.В. Зверев, с. 58–62те из них, которые являются потенциальными кандидатамина включение в состав вакцинного препарата. Донедавнего времени разработка вакцин на базе данных ополной структуре геномов и белков была невозможнаиз-за недостаточного количества знаний и отсутствиянекоторых технологий. Однако геномная и постгеномнаяреволюция резко изменила ситуацию. Определение нуклеотиднойпоследовательности полного генома возбудителейинфекционных заболеваний – в настоящее времявопрос если не нескольких дней, то нескольких недель.Причем, предварительная работа по получению библиотекклонов ДНК возбудителя уже давно проводится спомощью стандартных коммерческих наборов ферментов.Современные приборы для автоматического определениянуклеотидной последовательности позволяют проводитьв год до 14 000 000 реакций. Таким образом, за периодс 1997 по 2003 гг. определена полная нуклеотиднаяпоследовательность 78 микроорганизмов [1]. Полнаякомпьютерная сборка генома и его описание с полнымсписком кодируемых белков при помощи компьютерныхпрограмм занимает в настоящее время несколько месяцев.В результате этого анализа исследователь имеетне только список возможных кодируемых белков, нои некоторые их характеристики. Такие, например, какпринадлежность к определенным группам на основепредполагаемых их функций, возможная локализациявнутри бактериальной клетки, секреторная способность,связь с мембраной, антигенные свойства. Поэтому такойкомпьютерный анализ («in silico») определяет первуюважную стратегию по отбору возможных кандидатов ввакцинный препарат [1].Другим важнейшим критерием для отбора антигеновявляется анализ транскрипционной активностиотдельных генов микроорганизмов, используя изучениемикростроения ДНК. Цель этой технологии одновременноеизмерение уровней синтеза мРНК всех продуктовгенов, экспрессирующихся в живой клетке. Для этихцелей используется целый ряд методов, суть которыхзаключается в том, что на нейтральных носителях спомощью специально синтезированных фрагментовДНК исследуются все возможные рамки считыванияисследуемого микроорганизма. Разработаны и специальныекомпьютерные программы, позволяющие рисоватьтранскрипционные профили всех изучаемых генов. Этатехнология дает полную картину транскрипционнойактивности возбудителя заболевания и позволяет провестисравнительную характеристику экспрессии геновв различных условиях роста и определить гены, специфическирегулируемые во время инфекции. Очень частопродукты таких генов представляют наибольший интересдля создания вакцинных препаратов.Третий подход к отбору кандидатов в вакциныбазируется на протеомной технологии, методы которойпозволяют в значительной мере детализировать количественнуюи качественную характеристику белков вразличных клеточных компонентах микроорганизма.В настоящее время разработан целый ряд методов выделения,очистки и исследования белковых молекул. Впротеомике используются практически все известныеметоды количественного и качественного анализа белков,начиная с обычного и двумерного электрофореза, хроматографии,которые могут дать только предварительныехарактеристики молекулярной массы и количества белка вклетке. Однако полный переворот в протеомике произвелметод масспектрографии и его различные модификации.С помощью этого метода можно сейчас дать полнуюколичественную и качественную характеристику белковыхпродуктов, определить принадлежность белка ктой или иной группе, указать его локализацию в клетке.Кроме того, существуют компьютерные программы,которые, используя базы данных об известных и хорошоизученных белках, могут по аминокислотной последовательностипредсказать не только трехмерную структуруизучаемого белка, но и его свойства и функции.Используя эти три стратегии, можно отобрать тотпул генов (белков), которые представляют определенныйинтерес для создания вакцинного препарата. Какправило, этот пул включает около 20–30% всех генов(белков) бактериального генома.Эта отобранная группа нуждается в дальнейшейпроверке на возможность вызывать защитный ответ ворганизме. Для этого необходимо синтезировать отобранныйантиген в различных системах и очистить его внеобходимых для иммунизации животных количествах.Уже разработан целый ряд векторных систем и методовдля клонирования и экспрессии клонированного генав бактериальных и эукариотических клетках, которыепозволяют нарабатывать белок в любых количествах.Для очистки необходимого белка в настоящее времяиспользуются специальные полностью автоматизированныеприборы, которые позволяют выделить и очиститьбольшое количество исследуемых белков в количествах,достаточных для иммунизации. Так, например, используяэти технологии, лаборатория, состоящая из трех исследователей,может в течение месяца выделить и очиститьболее 100 различных исследуемых белков.Впервые этот подход был использован длясоздания вакцины против менингококков группы В.61

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2В результате работы была создана комбинация антигенов,способных защищать от инфекции, и разработанвакцинный препарат.Используя описанный подход, создали вакцинныепрепараты против инфекций, вызываемых Streptococcusagalactiae (2002), Staphylococcus aureus (2002),Streptococcus рneumoniae (2001), Porphyromonasgingivalis (2001), Chlamydia pneumoniae (2002) иPlasmodium falciparum (2000) [1].Интенсивные работы проводятся не только поразработке современных вакцинных препаратов, но и поспособу их введения в организм, усиления их действия.Разрабатываются новые адъюванты и системы доставкизащитных антигенов. Все большее внимание специалистовработающих в этих областях привлекают такназываемые «мукозальные» вакцины, которые вводятсяне инъекционно, а местно на слизистые (пероральные,назальные) или чрезкожно. Такой способ введениявакцинного препарата через входные ворота инфекциистимулирует помимо общего еще и местный иммунитети представляется весьма перспективным.Международные эксперты и правительствабольшинства стран ныне рассматривают вакцинопрофилактикукак наиболее доступный и экономическиэффективный способ снижения детской смертности,увеличения ожидаемой продолжительности жизни идостижения активного долголетия во всех социальныхгруппах развитых и развивающихся стран.В 1998 году в России принят Федеральный закон«Об иммунопрофилактике инфекционных болезней», вкотором устанавливаются правовые основы государственнойполитики в области иммунопрофилактики инфекционныхболезней, осуществляемой в целях охраныздоровья и обеспечения санитарно-эпидемиологическогоблагополучия населения Российской Федерации.В ближайшее десятилетие будет существеннорасширена сфера применения вакцин. Это расширениепроизойдет в нескольких направлениях:1. За счет сохранения и расширения прививок врамках национальных календарей.2. Создания вакцин для предупреждения новыхи возвращающихся инфекций, а также для защиты отбактериологических актов.3. Разработки препаратов для иммунопрофилактикии иммунотерапии онкологических заболеваний.4. Создания средств для иммунологической защитыи лечения наркозависимости и курения.5. Конструирования вакцин, предупреждающих инормализующих болезни иммунной системы (аллергия,аутоиммунные процессы).6. Увеличения удельного веса терапевтическихвакцин, применяемых в рамках комплексного леченияхронических болезней разной этиологии.7. Применения вакцин для профилактики соматическихзаболеваний (инсулинозависимый диабет,миокардит, атеросклероз, инфаркт и т.д.).Для решения перечисленных задач будут использоватьсядостижения геномики и протеомики с учетомновых идей иммунологии, связанных с признанием ведущейроли системы врожденного иммунитета в созданиизащиты от возбудителя.Литература1. Genomics, proteomics and vaccines / Ed. G.Grandi. – JohnWiley & Sons, Ltd, England, 2004. – 313 p.2. Таточенко В.К., Озерецковский Н.А., Соколова А.Ф.,Алексина С.Г., Федоров А.М. Иммунопрофилактика-2000. – М.: Изд-во «Остоженка-Инвест», 2000.3. World Health Report 1996: Fighting disease, fosteringdevelopment. – Geneva, 1996.4. World Health Report 2002: Reducing risks, promotinghealthy life. – Geneva, 2002.5. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л.Эволюция инфекционных болезней в России в XXI веке.– М.: ГЭОТАР-Мед, 2003. – 664 с.6. Сергиев В.П., Малышев Н.А., Дрынов И.Д. Инфекционныеболезни и цивилизация. Прошлое, настоящее,будущее. – М., 2000. – 207 с.7. Microbial threats to health: emergence, detection, and response/ M.S. Smolinski, M.A. Hamburg, J. Lederberg (eds).– Washington, The National Academies Press, 2003. – 398p.8. Lederberg J. Infectious diseases as an evolutionary paradigm// Emerg. Infec. Dis. – 1997. – Vol. 3. – N 4. – P.417–423.9. Hotta S. Dengue and related hemorrhagic diseases – St.Louis, Missouri: Warren H. Green, Inc., 1969. – 166 p.62

СТРАНИЦЫ ИСТОРИИУДК 57 (028); 57 (029)К 50-ЛЕТИЮ ВАЖНОЙ ВЕХИ В РАЗВИТИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ– ОТКРЫТИЯ АРТУРОМ КОРНБЕРГОМ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫВ.С. Воробьев * , О.В. ВоробьеваОбщество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, МоскваЕсть даты в истории науки, мимо которых нельзяпроходить равнодушно, и уж если имеется какой-либоформальный повод для повышенного интереса к ней,например, в связи с юбилеем, то, безусловно, на неенужно откликаться. К таким рубежным, знаковым датамотносится получение в 1956 году Артуром Корнбергомпервого в мире доказательства возможности биосинтезаДНК in vitro с последующим выделением фермента этогосинтеза – ДНК-полимеразы.Нужно заметить, что и сам первооткрывательхорошо знал цену своему проникновению в глубочайшуютайну жизни. Не случайно он выстраивает его в одинряд с эпохальным открытием бесклеточного брожения* Автор для переписки:© 2006 г. Воробьев Вадим Сергеевич,к.м.н., член Центрального Правления ОБР119296 Москва, Университетский пр-т, 9E-mail: obr@biorosinfo.ruЭ. Бухнером в 1897 г. В самом деле, воспроизведениежизненных процессов в пробирке было величайшим завоеваниемчеловеческого разума. Это не были фантазииГ.М. Бошьяна или О.Б. Лепешинской, а строгое научноезнание. В 50-е годы величие первопроходческой работыА. Корнберга ощущалось не так, как сейчас, при ретроспективнойоценке, но от этого значение ее не умаляетсянисколько.А. Корнберг совершил свое выдающееся открытиев 38 лет. К этому времени он был известным биохимиком,профессором и руководителем кафедры микробиологиив Вашингтонском университете (Сент-Луис).Он окончил университет в Рочестере в 1941 г. Вгоды войны служил судовым врачом, пока его не приметилРолла Юджин Дайер, директор Национальногоинститута здоровья (1942–1950), и не пригласил наработу в исследовательскую группу лаборатории питанияэтого института. Здесь он трудился в 1942–1945 гг.,после чего в 1946 г. перешел в лабораторию СевероОчоа в Нью-Йоркском университете. Далее его научнаякарьера опять связывается с Национальным институтомздоровья в Бетесде, где он в течение 1947–1953 гг. возглавлялотдел ферментов и метаболизма. В это время онзанимался проблемой получения коэнзимов, что послужилов дальнейшем хорошей основой для исследованийбиосинтеза ДНК из более простых молекул.Будет крайне некорректно, если не будет с историческойточки зрения проанализировано его формированиекак энзимолога. Об Очоа уже упоминалось. От него,бывшего к тому времени довольно опытным биохимикоми энзимологом, Корнберг из первых рук получилважные базовые знания о ферментах. Без сомнения,Очоа рассказывал начинающему исследователю о выдающихсянемецких биохимиках Варбурге, Мейергофе,у которых он трудился, об их методах работы и идеях. Вдальнейшем это было закреплено работой Корнберга в1947 г. в лаборатории супругов Кори в Вашингтонскомуниверситете, в Сент-Луисе. Общеизвестен авторитет63

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Нобелевских лауреатов 1947 года Карла и Герти Кори вобласти энзимологии. Кроме того, молодой энтузиаст влетнее время стажировался в Колумбийском университетес целью восполнить пробелы в области органическойи физической химии при работе с методами очисткиферментов. Все это привело ученого к правильной оценкезначения ферментов в исследовании жизненных процессов.Больше того, он стал стойким приверженцем данногонаучного направления, посвятил этому серию книг, статейи оставил ряд интересных высказываний [1, 7]. Вот какон говорит о ферментах в своей статье «Воспоминания онаших учителях» [7]:«Получив воспитание у супругов Кори, Очоа идругих звезд в галактике того времени, я стал адептомидеи, что энзимология – самый эффективный путь кпониманию явлений жизни. Я обнаружил ферменты,которые синтезируют коэнзимы (НАД, НАДФ, ФАД)и пиримидиновые и пуриновые нуклеотиды, и после этогонадеялся пойти дальше, чтобы найти фермент синтезаДНК. Я имел в виду фермент, который так же, как игликогенфосфорилаза Кори, будет наращивать цепочкуДНК последовательным добавлением соответствующимобразом активированного нуклеотида. Я никогдане представлял себе, что мои попытки могут привести кферменту, не похожему на других, который направлял быдействие от субстрата и собирал бы нуклеотиды паройоснований по модели Уотсона–Крика, для того чтобысоздать комплементарную копию материнской цепочкиДНК».Итак, обосновавшись в Сент-Луисе, 35-летнийпрофессор стал постепенно подбираться к главному делусвоей жизни. В Нобелевской лекции и других своих трудахон, по крайней мере, частично раскрывает «кухню»динамики открытия.Ясно, что открытие состоялось не на пустомместе. И из вышеприведенной цитаты, и из анализацикла трудов ученого до 1956 года следует, что у негопосле приобретения достаточного опыта в энзимологиивозникли серьезные намерения осуществить ферментативныйсинтез и молекулы ДНК, структура которойстала понятной после публикации статьи Дж. Уотсона иФ. Крика в 1953 г. Однако подход к этому у А. Корнбергабыл на основе реакции конденсации, которуюон наблюдал при синтезе дифосфопиридиннуклеотида(ДФН) – ныне НАД – и флавинадениннуклеотида(ФАД), а также других коферментов (коэнзим А ит.д.). Рабочая гипотеза состояла в постулировании механизмаудлинения молекулы ДНК с помощью реакцииконденсации: при этом дезоксинуклеозид 5-трифосфат64на растущем конце полидезоксинуклеотидной цепочкиатакуется 3-гидроксильной группой с высвобождениемнеорганического пирофосфата и удлинением цепочки наодну единицу.На деле все произошло не так. Кроме того, нужнобыло решиться на априорное признание возможностисамого принципа синтеза наследственной молекулы впробирке. Артур Корнберг констатировал в лекции наНобелевских торжествах 1959 года, что еще 5 лет назад(в 1954 г.) синтез ДНК рассматривался как «витальный»процесс, то есть протекающий внутриклеточно.Предстояло преодолеть этот барьер. Как всегда бываету биохимиков, все оказалось очень просто: взял одно,добавил другое, получил третье.В декабре 1955 года Корнберг обнаружил, чтопод действием экстракта логарифмической фазы ростаE. coli 14 C-тимидин превращается в присутствии АТФв нерастворимый в холодной трихлоруксусной кислотепродукт. Специфическая радиоактивность меченного14C тимидина была низкой, при этом менее 100 cpm[counts per minute] выше фона включалось из 10 6cpm, прибавленного для проведения реакции. Однакообработка продукта кристаллической ДНКазойподжелудочной железы, которая тогда становиласьдоступной, переводила всю радиоактивность в кислоторастворимоесостояние. Это была первая демонстрациявозможности биосинтеза ДНК in vitro. Публикация оданном факте последовала в июле 1956 г. в «Biochimicaet Biophysica Acta». Далее в течение 3 лет вышла сериястатей Корнберга с коллегами под общим названием«Ферментативный синтез ДНК», в которых последовательнопредставлялись доказательные факты обочистке ДНК-полимеразы, о множественной функцииполучаемой ДНК, о выделении ДНК-полимеразы,об инициации действия ДНК-полимеразы с шаблона(или «затравки») ДНК (то есть доказательстве тогоошеломляющего факта, что ферментативный синтезДНК-полимеразой E. coli представляет собой репликациюматрицы ДНК) и т.д. Следует заметить, чтопубликации под указанным стереотипным названиемпродолжались и в 60-е годы. Однако решающее делобыло сделано в 1956 году, и с этого времени биосинтезДНК in vitro стал реальностью. Хотя в 50-е годы А.Корнбергу не удалось получить биологически активнуюформу ДНК вне организма, тем не менее дорога, покоторой надо идти, была указана. И поэтому не зряученый в Нобелевской речи сравнил ДНК с «магнитофоннойлентой, на которой записаны точные инструкциипо выполнению той или иной работы» и с которой можно

В.С. Воробьев, О.В. Воробьева, с. 63–67«снимать точные копии, так что эту информацию можноиспользовать в любом месте и в любое время».Нельзя сказать, что путь признания открытияКорнберга был усыпан розами. Достаточно привестифакт, что такой старейший (в 2005 году ему исполнилось100 лет) и авторитетный журнал, как «Journal ofBiological Chemistry», отклонил осенью 1957 года двестатьи Корнберга с сотрудниками, посвященные частичнойочистке и общим свойствам ДНК-полимеразыиз кишечной палочки. Однако вмешательство ДжонаЭдсолла, ставшего главным редактором журнала в мае1958 г., помогло восстановить справедливость, и в июлеэтого года обе статьи вышли в свет [6, 7].Надо напомнить, что в это время шел параллельнымкурсом великий Очоа, который в 1955 г. открылфермент полинуклеотидфосфорилазу, синтезировавшийin vitro РНК-подобные полимеры (впоследствии былапоказана его РНК-расщепляющая функция).Всеобщее признание их открытий в научной средепоследовало незамедлительно, и в 1959 году оба выдающихсяисследователя, учитель и ученик, были удостоеныНобелевской премии по медицине «за открытиемеханизмов биологического синтеза рибонуклеиновой идезоксирибонуклеиновой кислот».Триумф не ослабил мотивации Корнберга к исследовательскойработе. В 1959 г. он организовал кафедрубиохимии в Стенфордском университете (Пало-Альто,Калифорния) и возглавлял ее до 1969 г., после чего сталздесь же профессором. С 1988 г. является заслуженнымпрофессором этой кафедры, продолжая активно трудитьсядо сих пор. На этой же кафедре работают и другиезнаменитости, в их числе и Нобелевский лауреат 1980 г.Пол Берг, ученик А. Корнберга.В стенфордский период Корнбергом было продолженоисследование ферментов метаболизма ДНК,ответственных за инициацию и удлинение цепочек ДНКи хромосом. Эти ферменты послужили основой для приближенияэры генетической инженерии. Важной датойв этом цикле исследований является 1967 год, когда А.Корнберг вместе со своим сотрудником М. Гулианом,используя вирус Синшеймера, поражающий E. coli,впервые синтезировали биологически активную кольцевуюдвухцепочечную ДНК. Наконец, венцом в этойпоследовательности событий является получение рекомбинантнойДНК стенфордским профессором П. Бергомв 1972 г., что, по сути, совершило биотехнологическуюреволюцию.Таким образом, несмотря на то, что в молекулярнойбиологии блистает множество ярких имен, наключевом направлении биосинтеза ДНК и РНК внеорганизма во времени выстраивается триада имен:Очоа (1955) – Корнберг (1956) – Берг (1972),или открытий: РНК-аза (1955) – ДНК-полимераза(1956) – рекомбинантная ДНК (1972). Эти имена,даты и открытия вбирают в себя все существенное,достигнутое современниками, и являются золотыми ступеняминаучно-технического прогресса XX века. Чтоудивляет в этом ряду, так это цепь «учитель – ученик– ученик ученика», то есть налицо эстафета преемственногопознания истины. А. Корнберг стажировалсяпосле окончания университета у С. Очоа в 1946 г. вНью-Йорке, а П. Берг был сотрудником А. Корнбергав Вашингтонском и Стенфордском университетах в50–60-е годы.Научная деятельность Корнберга отражена вмногочисленных статьях. Особо надо отметить его книги,выход каждой из которых был событием в научноммире. Так, его книга «Синтез ДНК» вышла в свет наанглийском языке в 1974 г., а в 1977 г. была переведенаи издана на русском языке. Огромной популярностьюу англоязычных читателей пользуется его автобиографическаякнига «Ради любви к ферментам: одиссеябиохимика» (1989), отличающаяся незаурядным беллетристическимталантом, искренностью и потребностью всамовыражении, свойственным творческим личностям.В последнее время вышла его книга сходного жанра обиотехнологии (1995).Окажется необъективным и обеднит биографическийанализ, если не упомянуть об обращении ученого ктеме неорганических полифосфатов. Он переключился сисследований репликации ДНК (кстати, им предложенагипотеза механизма репликации ДНК в интактной клетке)на их изучение в 1991 году. Надо сказать, что на Западенеорганические полифосфаты традиционно считалиископаемыми молекулами; правда, хотя и рассматривалиих в контексте пребиотической эволюции, отмечали ихналичие у всех ныне встречающихся бактерий, растительныхи животных клеток. Резонно заметить, что вРоссии им уделял большое внимание Андрей НиколаевичБелозерский (надо отдать должное его беспрецедентнойинтуиции!), он сам занимался этим в экспериментальномплане и передал данную тему своему ученику И.С.Кулаеву, который осветил результаты своих работ всерии публикаций, в том числе и в книге на английскомязыке в 1979 году. А. Корнберг по достоинству оценилвклад российских ученых в данную проблему, поместивблагодарность профессору И.С. Кулаеву в журнале«Биохимия» (2000).65

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2А. Корнбергу удалось изучить разнообразныефункции неорганических полифосфатов: резервуарыэнергии и фосфатов, хелатирование металлов (Mn 2+ ,Ca 2+ ), буферные антищелочные свойства, образованиекапсулы бактерий, подвижность и вирулентность некоторыхпатогенов и многие другие. Им исследованыферменты синтеза и утилизации неорганических полифосфатов.Конечно, Корнберг удостоен различных наград ипочестей как у себя на родине, так и за рубежом. Понятно,что их больше всего в США. Помимо Нобелевскойпремии, он избран членом Лондонского королевскогообщества (1970), почетным членом Парижского университета(1960), докладчиком Рамон-и-Кахалевскойлекции (2001) и др. Его вклад в науку и профессиональноедолголетие восхищают и служат примером дляследующих поколений исследователей.В заключение надо подчеркнуть истинное благородствоученого и его бесконечное уважение к предшественниками товарищам по работе. Известны высказываниеНьютона о том, что он видел дальше, потому чтостоял на плечах гигантов [Галилея и Кеплера – авт.],или афоризм Клода Бернара: «Искусство – это я, наука– это мы». А вот что сказал А. Корнберг в конце своейНобелевской лекции: «В заключение позвольте повторитьто, что я сказал на вчерашнем банкете. Любая оценкамоего труда должна быть разделена с моими коллегамив Нью-Йорке, Бетесде, Сент-Луисе и Стенфорде, атакже со всем международным сообществом химиков,генетиков и физиологов, которое действительно ответственноза прогресс в биохимии нуклеиновых кислот».Конечно, нельзя не упомянуть и о его признательностиучителям, которую он многократно выказывал в своихпубликациях, находя для этого точные и красивые слова,соответствующие его несомненному литературному даруи безукоризненному стилю.Литература1. Корнберг А. Синтез ДНК: Пер. с англ. – М., 1977.2. Корнберг А. – БМЭ, 3-е изд., 1979. – Т. 11. – С. 377.3. Корнберг А. Дань уважения профессору Игорю С. Кулаеву// Биохимия. – 2000. – Т. 65. – № 3. – С. 334.4. Лауреаты Нобелевской премии. Энциклопедия: Пер. сангл. В 2-х т. – М.: Прогресс, 1992. – 775 + 861 с.5. Bessman M. J., Lehman I. R., Simms E. S., and Kornberg A.Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. II. Generalproperties of the reaction // J. Biol. Chem. 1958. – Vol. 233(1). – P. 171–177.6. Brown M.R.W. and Kornberg A. Inorganic polyphosphatein the origin and survival of species // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. – 2004. – Vol. 101. – P. 16065–16087.7. Goulian M., Kornberg A., Sinsheimer R.L. Enzymaticsynthesis of DNA. XXIV. Synthesis of infectious phagePhiX174 DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1967.– Vol. 58. – P. 2321–2328.8. Kornberg A. Enzymatic synthesis of DNA. – John Wiley &Sons, 1961.9. Kornberg A. DNA synthesis. – W.H. Freeman and Co.,San Francisco, 1974.10. Kornberg A. The biologic synthesis of deoxyribonucleic acid /In: Nobel Lectures in Molecular Biology 1933–1975. – N.-Y.: Elsevier, 1977. – 534 p. (имеется на сайте: http://www.nobelprize.org/).11. Kornberg A. DNA replication. – W.H. Freeman andCo., San Francisco, 1980 (2 nd ed., 1992, Baker T. – coauthor).12. Kornberg A. The early history of DNA polymerase: acommentary on «Enzymic Synthesis of DeoxyribonucleicAcid» // Biochim. Biophys. Acta. – 1989. – Vol. 1000.– P. 53–56.13. Kornberg A. For the love of enzymes: The Odyssey ofbiochemist. – Cambridge, Mass.: Harvard University Press,1989. – 336 p. (reprint ed., 1991).14. Kornberg A. The golden helix: Inside biotech ventures.– University Science Books, 1995.15. Kornberg A. Remembering our teachers // J. Biol. Chem.– 2001, January 5. – Vol. 276 (1). – P. 3–11.16. Kornberg A. How I became a biochemist // IUBMB Life.– 2002. – Vol. 53. – P. 185–186.17. Kornberg A. Ten commandments of enzymology, amended //Trends in Biochem. – 2003. – Vol. 28. – P. 515–517.18. Kornberg A. and Fraley C.D. Inorganic polyphosphate: amolecular fossil come to life // ASM News. – 2000. – Vol.66. – P. 275–280.19. Kornberg A., Lehman I.R., Bessman M.J., Simms E.S.Enzymic synthesis of deoxyribonucleic acid // Biochim.Biophys. Acta. – July 1956. – Vol. 21 (1). – P. 197–198(reprinted in Biochim. Biophys. Acta. – 1989. – Vol. 1000.– P. 57–58).20. Kresge N., Simoni R.D., and Hill R.L. Arthur Kornberg'sdiscovery of DNA polymerase I // J. Biol. Chem. – 2005.– Vol. 280 (49). – e46–e48 (http://www.jbc.org/cgi/content/full/280/49/e46).21. Lehman I.R. Discovery of DNA polymerase // J. Biol.Chem. – 2003. – Vol. 278 (37). – P. 34733–34738.22. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., and Kornberg A.Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparationof substrates and partial purification of an enzyme from Escherichiacoli // J. Biol. Chem. – 1958. – Vol. 233 (1).– P. 163–170.66

В.С. Воробьев, О.В. Воробьева, с. 63–6723. Lehman I.R., Zimmerman S.B., Adler J., BessmanM.J., Simms E.S., and Kornberg A. Enzymatic synthesisof deoxyribonucleic acid. V. Chemical composition ofenzymatically synthesized deoxyribonucleic acid // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. – 1958. – Vol. 44 (12). – P.1191–1196.24. Sourkes T.L. Nobel Prize Winners in Medicine andPhysiology 1901–1965. – London etc.: Aberland-Schuman,1966. – 464 p.Были использованы Интернет-материалы, втом числе:http://biochemistry.stanford.edu/http://www.jbc.orghttp://en.wikipedia.org/Резюме. Статья посвящена 50-летию со дня открытия ДНК-полимеразы Артуром Корнбергом. По этому случаюпроанализированы исторические факты жизни и деятельности ученого.Ключевые слова: история биологии, персоналия, биографии ученых, Артур Корнберг, ДНК-полимераза.TO 50 th ANNIVERSARY OF THE IMPORTANT MILESTONE IN THEDEVELOPMENT OF MOLECULAR BIOLOGY – A DISCOVERY OF DNAPOLYMERASE BY ARTHUR KORNBERGV.S. VOROBYEV, O.V. VOROBYEVAOvchinnikov Society of Biotechnologists of Russia, MoscowThe article was devoted to 50 th anniversary of the discovery of DNA polymerase by Arthur Kornberg. Some historical detailsand vital events were analyzed on this occasion.Keywords: biology history, personnel, scientists biographies, Arthur Kornberg, DNA polymerase.67

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Юбилейные и знаменательные даты 2006 годаСОБЫТИЯ, ФАКТЫ68К 35-летию НИКТИбиологически активных веществ *1 января 2006 г. Научно-исследовательскомуконструкторско-технологическому институту биологическиактивных веществ (НИКТИ БАВ) исполнилось35 лет.В 1966 г. было создано Главное управление микробиологическойпромышленности при Совете МинистровСССР. В 1970 г. было организовано Специальноеконструкторско-технологическое бюро биологическиактивных веществ (СКТБ БАВ) как подразделениеБердского химического завода, которое в 1971 г. превратилосьв отдельную самостоятельную структуру.Основные задачи СКТБ БАВ были связаны с созданиемотечественной базы по получению широкой номенклатурыбиохимических препаратов.На начальном этапе деятельности предприятиерешало задачи создания отечественной биотехнологии,разрабатывая новые технологические приемы и методыполучения биологических веществ из микробиологическогосырья. За период с 1972 по 1986 гг. сотрудникамибыли разработаны лабораторные методики и опытно-технологическиерегламенты на получение более 100 биохимическихреагентов микробиологического происхождениядля научных исследований в областях фундаментальнойи прикладной биологической науки. Получено 142 авторскихсвидетельства, 24 медали ВДНХ.В 1981 г. организация была преобразована в Научно-исследовательскийконструкторско-технологическийинститут биологически активных веществ (НИКТИБАВ). Первым директором НИКТИ БАВ стал к.х.н.(ныне д.х.н.), профессор С. Н. Загребельный.В 1985 г. Управлением микробиологической промышленностипри СМ СССР было создано НПО «Вектор»(п.г.т. Кольцово, Новосибирской обл.), в состав котороговошел НИКТИ БАВ. Вхождение в НПО «Вектор»позволило сконцентрировать усилия на созданиипротивовирусных препаратов, основанных на дсРНК.* Материал подготовлен В.И. Масычевой,профессором, д.б.н., директором ИМБТ ФГУН ГНЦВБ «Вектор»Результатом такого взаимодействия явилась разработкаи производство противовирусного препарата ридостин,действующее начало которого – дсРНК киллерных пекарскихдрожжей. Были созданы также мазевые формыпрепарата Ридостин и препараты, обладающие пролонгированнымдействием на систему неспецифической защиты.С конца 80-х годов и до настоящего временидеятельность НИКТИ БАВ связана с развитием направленияпо созданию терапевтических и диагностическихсредств. Достижения биотехнологии позволилиразработать принципиально новое поколение фармакологическихпрепаратов, основанных на рекомбинантныхбелках человека. К 1984 году совместными усилиямиученых ВНИИ молекулярной биологии (Новосибирск),Института биоорганической химии им. М.М. Шемякинаи ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмовбыл осуществлен синтез гена интерферона-2,создан бактериальный штамм-продуцент и получен генно-инженерныйбелок – интерферон-2. Впоследствиииз состава НИКТИ БАВ выделилось предприятие– Научная опытно-производственная база (НОПБ),(п.г.т. Кольцово, Новосибирской области), которое иосуществило промышленный выпуск этого препарата в90-х годах.Приобретенный опыт в дальнейшем был использованНИКТИ БАВ для получения субстанций и лекарственныхформ препаратов, активным началом которыхявились такие цитокины, как фактор некроза опухолей, b, интерферон-g, колониестимулирующие факторы(гранулоцит-колониестимулирующий и гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующийфактор).В настоящее время препарат, содержащий факторнекроза опухолей a (коммерческое название – Альнорин),проходит клинические испытания как противоопухолевоесредство в Российском онкологическомнаучном центре им. Н.Н. Блохина РАМН, факторнекроза опухолей-b (коммерческое название – Бефнорин)как противогерпетическое средство исследуется вНИИ клинической иммунологии СО РАМН. На стадиирегистрации находится гемостимулирующий препаратНейтростим, действующим началом которого являетсягранулоцит-колониестимулирующий фактор, которыйпредполагается для применения у онкологических больныхпри химиотерапии, лучевой терапии.

Научно-технический потенциал НИКТИ БАВактивно используется в ГНЦ ВБ «Вектор» при разработкеряда различных препаратов. К ним относятсяранозаживляющие средства – хитогель и коллагель, накоторые получено разрешение на проведение клиническихиспытаний, гиалуроновая кислота, вакцины как на основерекомбинантных сальмонелл для профилактики гепатитаС и ВИЧ-инфекции, так и генно-инженерных антигеновс использованием средств адресной доставки.Следует также отметить достижения Институтав области разработки препаратов для ветеринарии.Препараты Поливедрим и Вестин, а также Эндоглюкин,Субалин, Альнорин, которые не имеют аналоговна отечественном рынке, разрешены для примененияВетфармсоветом РФ и используются в ветеринариикак средства повышения устойчивости к инфекционнымвоздействиям. В этих испытаниях большой объем работыбыл выполнен совместно с Институтом ветеринарииСибири и Дальнего Востока СО РАСХН, Аграрнымуниверситетом (Новосибирск).Отдельным направлением деятельности институтаследует считать создание иммунодиагностическихсредств. Начало этой деятельности относится к середине80-х годов, когда в стране возникла острая проблема диагностикиВИЧ/СПИД. В СССР первые образцы такогонабора были получены в НИКТИ БАВ в 1985 г., а в1986 г. было организовано производство 30000 наборовтест-систем на выявление антител к ВИЧ. За прошедшеевремя совместно с ЗАО «Медико-биологический союз»(Новосибирск) разработаны тест-системы для выявленияантител к хламидиям, гепатиту В, С, ведутся работыпо созданию диагностикумов для кори, паротита.За последние 5 лет было разработано 12 технологическихдокументов, 11 фармакопейных статей.Получено 14 дипломов 1- и 2-й степени. Опубликовано226 работ в отечественных и зарубежных журналах,материалах съездов, симпозиумов, конференций. Насегодняшний день 8 препаратов внедрены в медицинскуюи ветеринарную практику, на 16 препаратов послепроведения экспертизы соответствующими органамиМинистерства здравоохранения РФ получены разрешенияна клинические испытания.В 2004–2005 гг. осуществлен переход ФГУН«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии«Вектор» в структуру Федеральной службы понадзору в сфере защиты прав потребителей и благополучиячеловека. В 2006 г. НИКТИ БАВ переименован вИнститут медицинской биотехнологии.ПЕРСОНАЛИИК 125-летию со дня рожденияАлександра Флеминга6 августа 2006 г. исполняется 125 лет со днярождения Александра Флеминга (1881–1955), первооткрывателяпенициллина, лауреата Нобелевскойпремии. В связи с этим редколлегия журнала считаетдолгом кратко прокомментировать эту юбилейную дату.Флеминг родился и получил начальное образование вШотландии. В Лондоне он окончил Политехническуюшколу, после чего поступил в Медицинскую школу пригоспитале Св. Марии Лондонского университета. Поокончании учебы он стал работать в лаборатории патологиипод руководством А. Райта, известного ученого,открывшего опсонины. Упорный, молчаливый шотландецпервым приходил и последним уходил из лаборатории.Результат последовал: в 1921 г. Флеминг открыл ферментлизоцим. Через 7 лет, в 1928 г. наблюдательный ученыйзаметил, что в чашках с культурами стафилококка места,занятые плесенью, были свободны от бактерий. Изучивплесень (это был гриб из рода Penicillium), он выделилиз нее сильное антибиотическое вещество, названное импенициллином. Результаты наблюдений были опубликованыв 1929 г. Однако в научной среде эти факты осталисьбез внимания. Не помогло и публичное выступлениеисследователя на II Международном конгрессе микробиологовв 1936 г. Флеминг в течение 10 лет искал химика,который сумел бы выделить пенициллин в чистом виде,пока судьба не свела его с Хоуардом Флори и ЭрнстомЧейном. Они вместе в 1940 г. получили очищенныйпрепарат, экспериментальная и клиническая апробациякоторого показала высокую эффективность. Дальшепоследовала промышленная наработка пенициллина вCША к 1944 г., чему способствовали запросы армиив условиях войны. Затем пришло мировое признаниеи вручение Нобелевской премии по медицине в 1945 г.всем трем его участникам. Последовали награды и почетныезвания из многих стран мира. В ВеликобританииФлемингу также были оказаны всевозможные почести: в1944 г. Флеминг был возведен в рыцарское достоинство,в 1951 г. студенты Эдинбургского университета избралиего ректором. Умер А. Флеминг в 1955 г. и был похороненпо высшему национальному разряду – в Соборе СвятогоПавла, рядом с адмиралом Г. Нельсоном и герцогомА. Веллингтоном. Биография ученого описана АндреМоруа в книге «Жизнь Александра Флеминга» (Серия«ЖЗЛ», 1964).69

ХроникаСОБЫТИЯ первого ПОЛУГОДИЯ 2006 годаНекрологПамяти академика РАМН А.А. ВоробьеваОбщество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова,редколлегия и редакционный совет журнала«Вестник физико-химической биологии и биотехнологииим. Ю.А. Овчинникова» с глубоким прискорбием извещают,что 23 марта 2006 года после непродолжительнойтяжелой болезни скончался президент Общества биотехнологовРоссии, заведующий кафедрой микробиологии свирусологией и иммунологией ММА им. И.М. Сеченова,академик РАМН Анатолий Андреевич Воробьев.А.А. Воробьев родился в 1923 г. в Краснодарскомкрае. В 1945 году окончил Военно-морскую медицинскуюакадемию (Ленинград). В 1945–1948 гг. служил врачомна Военно-морском флоте. С 1948 по 1951 гг. обучалсяв адъюнктуре при кафедре физической и коллоиднойхимии Военно-морской медицинской академии. В 1951году защитил кандидатскую диссертацию «Очищенныйсорбированный гидратом окиси алюминия столбнячныйанатоксин» под руководством своего учителя к.м.н.А.В. Марковича. После защиты диссертации работал втечение 1951–1956 гг. старшим научным сотрудникомВоенно-морской медицинской академии.С 1956 по 1978 гг. состоял на разных должностяхв НИИ Министерства обороны СССР (от заместителяи начальника научного отдела до заместителя начальникаинститута по научной работе). В 1978–1987 гг. работалв должности первого заместителя начальника по научнойработе Главного управления «Биопрепарат» при ГлавмикробиопромеСССР (впоследствии при Министерствемедицинской и микробиологической промышленностиСССР). С 1987 г. до самой смерти заведовал кафедроймикробиологии с вирусологией и иммунологией ММАим. И.М. Сеченова.В 1959 г. А.А. Воробьев защитил докторскуюдиссертацию по проблеме конструирования сорбированныханатоксинов. В 1964 г. ему было присвоено званиепрофессора по специальности «Иммунология». В 1984году он был избран членом-корреспондентом, в 1990 г.– академиком АМН СССР (ныне – РАМН). С1990 г. по 1 марта 2006 г. являлся заместителем академика-секретаряОтделения профилактической медициныРАМН. В 2003 г. был избран Президентом Обществабиотехнологов России. Имел воинское звание генералмайорамедицинской службы (присвоено в 1975 г.).Научные интересы А.А. Воробьева находилисьв области иммунологии, микробиологии, вирусологии,биотехнологии. Им было опубликовано более 550научных работ, из них 25 книг. Под его руководствомзащищено 36 докторских и более 40 кандидатскихдиссертаций.Наряду с теоретическими исследованиями онучаствовал в практической разработке рекомбинантногоинтерферона альфа-2, в создании диагностических,лечебных и профилактических препаратов для борьбы свирусными заболеваниями.Он состоял членом редколлегии «Журнала микробиологии,эпидемиологии и иммунологии» (с 1967 г.),журнала «Иммунология» (с 1981 г.), журнала «Вакцинация»(с 1999 г.), заместителем главного редактора журнала«Вестник РАМН» (с 1994 г.). Он являлся членом экспертногоСовета ВАК СССР (затем России) (с 1968 г.),заместителем председателя специализированного СоветаВАК РФ (с 1999 г.), членом правления Всесоюзногообщества иммунологов (с 1983 г.), членом Комитета поЛенинским и Государственным премиям СССР (1985),членом Редсовета БМЭ (1988), членом Межведомственногосовета Комитета по науке и технике РФ «Науки ожизни и биотехнология» (1992), членом Президиума ируководителем секции Всероссийского общества эпидемиологов,микробиологов и паразитологов (с 1996 г.), членом70

экспертного Совета по биобезопасности при Госдуме РФ(2001), членом Совета РАН по проблемам химическогои биологического оружия (2001).А.А. Воробьев – лауреат Государственной премииСССР (1980), премии Правительства РФ (2000),Государственной премии РФ (2001). Он был удостоенименных премий: РАМН – имени Н.Ф. Гамалеи (1995),Российской академии медико-технических наук – имениМ.П. Чумакова (1997), имени А.Л. Чижевского(1999), имени И.Н. Блохиной (2001). Ему присужденасеребряная медаль им. И.П. Павлова РАЕН (1999).В 1997 г. ему присвоено звание «Заслуженный деятельнауки РФ». Он был избран членом и отмечен наградамиразличных академий (в том числе он избирался первымвице-президентом Российской академии медико-техническихнаук).А.А. Воробьев был награжден орденами ТрудовогоКрасного Знамени, Отечественной войны I степени,двумя орденами Красной Звезды, медалями.До последних дней своей жизни АнатолийАндреевич был активен, полон энергии и замыслов. Онбыл неординарной личностью с широким кругом интересов,добрым, мудрым, рассудительным человеком,обладал талантом рассказчика, писателя и даже поэта.Много сил отдавал делу возрождения отечественной биотехнологии,находясь более двух лет на посту президентаОбщества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова.В этом был его долг ученого и патриота. Не случайнов одном из последних интервью по поводу спорта онсказал, что лучшее лекарство от допинга – патриотизм.Утрата его болезненна и невосполнима для всех близкообщавшихся с ним и трудившихся вместе.Похоронен А.А. Воробьев на Троекуровскомкладбище г. Москвы.Незадолго до кончины Анатолий Андреевич задумалпровести в Петербурге, городе своей молодости,конференцию по биобезопасности. Она состоялась 1–2июня 2006 г., но уже без него и была посвящена егопамяти.Книги А.А. Воробьева• Статистические методы в микробиологических исследованиях(1962) – с соавт.• Анатоксины (1965) – с соавт.• Адъюванты (1969) – с соавт.• Специфическая профилактика риккетсиозов (1969)– с соавт.• Безыгольный способ введения биологических препаратовв организм (1972) – с соавт.• Общая и частная эпидемиология. Ред. Д.В. Волжинский(1973).• Аттенуация вирусов и риккетсий (1976) – с соавт.• Научные основы получения чистых культур микроорганизмовв технологии вакцин (1977) – с соавт.• Массовые способы иммунизации (1977) – с соавт.• Молекулярные основы иммуногенности антигенов(1982) – с соавт.• Краткий терминологический словарь микробиологабиотехнолога.Ред. Ю.А. Овчинников (1989) – ссоавт.• Основы медицинской биотехнологии (1990).• Методы и средства микроанализа биологическиактивных веществ (1990).• Неспорообразующие анаэробы и их роль в патологиичеловека (1990) – с соавт.• Эндогенные иммуномодуляторы (1992) – с соавт.• Клиническая иммунология. Ч. 1, 2 (1992, 1994)– с соавт.• Микробиология (1994), 2-е изд. – 1998 г.• Микробиология и иммунология. Учебник для сестерс высшим образованием (1999) – с соавт.• Микробиология и иммунобиология (2000).• Компьютерный атлас по микробиологии. Ред. А.А.Воробьев, А.С. Быков (2001).• Микробиология с вирусологией и иммунологией.Учебник для средних мед. учреждений. Ред. А.А.Воробьев, Ю.С.Кривошеин (2001).• Не подводя черты. Воспоминания академика – микробиологаи иммунолога (2003).• Двадцатый век моими глазами (2005).Ключевые статьи в журналах и сборниках• Основные итоги и перспективы исследований в областиразработки и усовершенствования бактерийныханатоксинов / В сб. Специфическая профилактикаинфекционных заболеваний (1964).• Опыт проведения вакцинации против оспы безыгольнымметодом // Военно-медицинский журнал,1969, № 6 – с соавт.• Итоги и перспективы разработки массовых способовиммунизации // Вестник АМН СССР, 1975, № 4– с соавт.• Итоги исследований по разработке и испытанию таблетированнойживой пероральной оспенной вакцины// ЖМЭИ, 1978, № 4 – с соавт.• Молекулярная биология дифтерийного токсина в связис проблемой механизма действия токсических белков// Успехи совр. биологии, 1978, т. 86, в. 3 (6).71

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2• Иммунная биотехнология: задачи и перспективы //Иммунология, 1986, № 3 – с соавт.• Успехи и перспективы генетической инженерии в областисоздания медицинских препаратов // ВестникРАМН, 1992, № 2.• Значение микробиологии в снижении инфекционнойзаболеваемости // Эпидемиология, 1996, № 1 – ссоавт.• Взгляды на развитие иммунологии в первой половинеXXI века // Вестник РАМН, 1999, № 11.• Иммунобиотехнология на пути в XXI век // ВестникРАМН, 1999, № 11.• Таксономия и классификация риккетсий // ЖМЭИ,2000, № 2 – с соавт.• Микробиология на рубеже XXI века // Врач, 2000,№ 8 – с соавт.72Международный конгресс «БИО-2006» *9–12 апреля 2006 г. в Чикаго (США) состоялсяМеждународный конгресс «БИО-2006». Это былосамое крупное мероприятие подобного рода в истории– в нем приняло участие около 20000 человек, 1600компаний из 30 стран мира. Состоялось около 200 симпозиумови круглых столов, 250 презентаций компаний.Все это происходило в комплексе с огромной выставкой.Нужно отметить высокий уровень мероприятия – нарядус руководителями крупнейших мировых биотехнологическихкорпораций и ведущих ученых в форумеучаствовали руководители государств и правительств,известные политики, бизнесмены, финансисты. Былобеспрецедентное освещение в СМИ – журналистскийкорпус, аккредитованный при «БИО-2006», насчитывалсвыше 500 человек. Мероприятие широко транслировалосьпо всем основным телеканалам мира. Надо сказать,что конгресс проводится ежегодно: следующие запланированытаким образом – 6–9 мая 2007 г. (Бостон),18–21 июня 2008 г. (Сан-Диего), 17– 20 мая 2009 г.(Атланта). Это лишнее свидетельство жизнеспособностии перспективности столь представительного, высокопрофессиональногособрания биотехнологов.Многообразной и насыщенной была тематиказаседаний: биозащита, биоэтика, развитие бизнеса,онкология, оборудование и диагностикумы, глобальныйбизнес, разработка лекарств, рынок и финансы, правои интеллектуальная собственность, питание, сельское* Материал подготовлен Р.Г. Василовымхозяйство, производство, экология, нанотехнологии,трансфер технологий и лицензирование и т.д.В течение трех дней прошел смотр того, что представляетсобой биотехнология в мире и каковы перспективыее развития. В этой связи необходимо отметитьследующее.1. Биотехнологическая наука и промышленностьявляются сегодня важнейшим экономическими политическим фактором развития в мире. Напротяжении последних лет (особенно после 2000 г.) этаотрасль демонстрирует небывалые темпы роста, прямыеинвестиции в нее за этот период превысили 120 млрд.долларов. С ней связывают решение глобальных проблемчеловечества – обеспечение питанием, решение проблемздравоохранения, энергетики, защиты окружающейсреды. По мнению экспертов, в 2005 г. биоэкономикастала свершившимся фактом, поскольку в одной точкесфокусировались интересы экономики, требования рынкаи возможности технологии. Биотехнология рассматриваетсякак существенный фактор развития экономикии решения социальных проблем, в частности, проблемыобразования и создания рабочих мест. Как отметил президентБИО (Biotechnology Industry Organization) Дж.Гринвуд, свыше 90% компаний, входящих в эту крупнейшуюбиотехнологическую организацию мира, – этомалые и средние фирмы. Поэтому развитие биотехнологииво многих государствах (включая США, Евросоюз,Китай, Индию, Бразилию и многие другие) объявленонациональным приоритетом, созданы соответствующиепрограммы. Наряду с этим внутри самих указанныхстран многие области (регионы) проводят собственнуюполитику всемерного развития биотехнологии: на форумебыло представлено свыше 100 таких биорегионов. Так,в США подобные региональные программы имеютсяпрактически во всех штатах – в особенности впечатляютуспехи Калифорнии, где эффективно функционируютдесятки биотехнологических компаний. Аналогичнообстоит дело в Германии. Идет настоящая «биотехнологическаягонка», соревнование между регионами. Вкачестве примера страны, которая сравнительно недавностала развивать биотехнологию и добилась реальныхпозитивных результатов, можно привести Ирландию.В этой стране, включившейся в «биотехнологическуюгонку» всего 5 лет назад, количество биотехкомпанийза данный период увеличилось с 6 до 72, большинствоведущих биотехкомпаний мира открыло там свои филиалы;ежегодный объем инвестиций в отрасль (включаягосударственные) составляет около 0,5 млрд. долларов вгод. Можно указать и на Малайзию, где для реализации

Национальной биотехнологической политики в 2005 годусоздана Малайзийская биотехнологическая корпорацияс бюджетом 1 млрд. долларов.2. Прогресс биотехнологической науки ипрактики сегодня охватывает практически все сферыдеятельности человека. В то же время следует отметитьнесколько основных направлений «прорыва», с которымисвязывают главные перспективы и на которые направленыосновные усилия: биотопливо, перевод химическойпромышленности на возобновляемое сырье, бионано-(или нанобио-) технологии.Биотопливо. Биоэтанол – рост производства15–20% в год. Всего в мире в 2005 году произведено42 млн. т, в том числе в Бразилии – 16 млн. т, в СШАи Канаде – 17 млн. т. Возник бум строительства заводовпо биоэтанолу. В США строятся 33 новых завода общеймощностью 7 млн. т, в странах Евросоюза планируется к2010 г. увеличить мощности по производству биоэтанолана 7 млн. т, в Китае строятся 100 новых заводов, срединих крупнейшие в мире мощностью 300 000 дал/сутки(1 млн. т в год). По мнению экспертов, в перспективе биоперерабатывающиезаводы будут играть для экономикине меньшую роль, чем сегодня играют нефтеперерабатывающиезаводы. Помимо энергетических и экологическихаспектов производство биоэтанола рассматривается какзначимый фактор развития сельскохозяйственных (какправило, депрессивных) регионов.Биодизель (биотопливо на основе растительныхмасел). Здесь также реализуется мощнейшая программа,во многом аналогичная биоэтанолу. Для выполнения этойпрограммы ежегодно осваиваются миллионы гектаровпод масличные культуры, внедряются новейшие агротехнологии.Сформирован огромный рынок (спрос) наэту продукцию.При производстве биотоплива одновременнорешается и другая важнейшая проблема – обеспечениебелковыми кормами животноводства.Следует отметить наличие этической проблемы,особенно в странах третьего мира, еще не решившихпроблему голода: использование пищевого сырья для индустриальныхнужд. В этой связи принимаются решенияиспользовать для производства биотоплива непищевуюбиомассу. Такой подход начал осуществлять Китай.Химия. Две конкурирующие тенденции: микробиологическийсинтез или переработка биомассы. Сегодняболее успешно производство на основе микробиологическогосинтеза. Уже 12 важнейших химических субстанций(1,3-пропандиол, молочная, лимонная, трегулоноваякислоты и др.) получают в промышленных масштабахс помощью микробиологического синтеза. С помощьюбиокатализа налажены промышленные производстваполиакриламида, стероидных гормонов и др.Бионанотехнология – важнейшая часть биотехнологии.Основные направления приложения– энергетика(топливные элементы), информатика (нанобиопроцессоры),медицина (биочипы, системы направленноготранспорта лекарств и др.), сельское хозяйство, экология,безопасность, новые материалы. Бионанотехнология являетсясильным стимулом развития науки и образования,выступает интегратором передовых достижений целогоряда смежных наук. Имеются госпрограммы развитиябионанотехнологий в США, Китае, Индии, Евросоюзе,еще в 10 странах такие программы создаются. Активнообсуждаются этические аспекты применения достиженийбионанотехнологий.3. Возможности для России. От России вфоруме «БИО-2006» участвовала большая делегация– свыше 40 человек, сформированная при поддержкеМНТЦ. От Общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова был командирован его вице-президентР.Г. Василов. Была предоставлена возможность принятьучастие во всех мероприятиях, получить наиболее полнуюинформацию. Анализ этой информации, встречи ипереговоры позволяют сделать следующее заключение.Сегодня у России имеется уникальная возможностьне только включиться в «биотехнологическуюгонку», но и стремительно продвинуться вперед и войтив группу лидеров по основным направлениям «прорыва».Этому способствуют: высокий образовательный инаучно-технологический потенциал; наличие ключевыхфакторов для развития микробиологической промышленности– дешевой энергии, пресной воды, возможностейдля интенсивного развития сельского хозяйства,обширная территория; благоприятная экономическаяконъюнктура. По совокупности этих параметров нашастрана имеет наиболее благоприятные условия для развитиябиотехнологической промышленности по такимнаправлениям, как биотопливо, микробиологическийсинтез, химия на основе возобновляемого сырья. Состоявшийсяв Москве буквально через несколько дней послеконгресса «БИО-2006» международный конгресс побиоэтанолу (более 250 участников) продемонстрировалвозможность развития данного направления в России.Это же касается и другого «прорывного» направления– бионанотехнологии. Здесь важнейшими факторамиуспеха могут служить высокий уровень отечественнойбиологической науки и образования, развитие нанотехнологийв целом и информатики.73

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Следует отметить роль международной кооперациив сфере биотехнологии, в которой наша страна моглабы участвовать в полной мере. Для этого существует взаимнаязаинтересованность, что было отмечено в сводноминформационном томе конгресса «БИО-2006».Для использования указанной возможности необходимосрочно решить ряд проблем. Биотехнологиядолжна быть признана (на деле, а не на словах) государственнымприоритетом. Необходима государственнаяпрограмма поддержки биотехнологии. Она должнавключать, среди прочего, принятие ряда законодательныхактов (в частности, по биотопливу), проведение скоординированнойработы различных федеральных ведомств(Минэкономразвития, Минобрнауки, Минпромэнерго,Минсельхоз, Минздравсоцразвития и др.) по осуществлениюперспективных биотехнологических проектов,создание соответствующих инвестиционных и венчурныхфондов, поддержку создания региональных программразвития биотехнологии. При этом необходимо в максимальнойстепени использовать наработки Обществабиотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, создавшегоНациональную программу развития биотехнологиив Российской Федерации на 10-летний период, а такжедругих организаций, представляющих отечественнуюбиотехнологическую науку и промышленность.Принятие и реализация этих мер позволят вкратчайшие сроки (3–5 лет) получить существенныеэкономические и социальные результаты. Среди них:резкое изменение ситуации в аграрном секторе – толькона программу по биотопливу можно активно задействоватьне менее 5 млн. га из ныне заброшенных 22 млн. гапахотных земель, создать сотни тысяч рабочих мест населе, внедрить современные агротехнологии. Возможносоздание новой (топливной и химической) агроиндустриис объемом рынка не менее 3–5 млрд. долларов в ближайшие5–10 лет. Получат ощутимый стимул для развития итрадиционные сферы сельского хозяйства: животноводство– в результате получения достаточного количествавысококачественных кормов, – и растениеводство какследствие улучшения севооборота и внедрения современныхагротехнологий. В результате будут решены и ключевыезадачи продовольственной программы, обеспечениеимпортозамещения важнейших видов продовольствия.Внедрение биотоплива и прогрессивных биотехнологийв промышленность и жилищно-коммунальное хозяйствопозволит существенно улучшить экологическуюситуацию, особенно в крупных городах и мегаполисах,эффект от которого – оздоровление населения – будетизмеряться миллиардами рублей. Медицинские аспекты74в еще большей степени будут связаны с разработкой ивнедрением новейших средств диагностики и лечения сприменением достижений бионанотехнологии. В Европепрогнозируемый рынок этой продукции оценивается к2012 году в 4–8 млрд. евро, в России он может составить200–500 млн. евро. Важнейшим же результатомразвития бионанотехнологий явится существенноеулучшение качества отечественного здравоохранения,здоровья и благополучия граждан. Наконец, еще одноважное следствие развития отечественной биотехнологии– мощный толчок для развития образования и науки в целом,совершенствования инновационной системы. Такимобразом, приложив усилия к развитию биотехнологии,наше государство сделает решающий шаг в построенииэкономики, основанной на знаниях, обеспечении своейконкурентоспособности в условиях глобализации.Международный конгресс«Топливный биоэтанол-2006»20 апреля 2006 г. в Москве состоялся Международныйконгресс «Топливный биоэтанол-2006».Организаторы: Российская биотопливная ассоциациясовместно с компанией «Гененкор Интернэшнл» при поддержкеГосударственной Думы ФС РФ, Министерствасельского хозяйства РФ, Министерства промышленностии энергетики РФ, Министерства экономическогоразвития и торговли РФ, Российского зернового союза,Общества биотехнологов России, Ассоциации деловогоцентра «Агро-ЭкоПрогноз». В Конгрессе принялиучастие более 300 человек. С докладами выступили 15человек. Присутствовал значительный журналистскийкорпус (более 30 лиц). Мероприятие имеет первый порядковыйномер и планируется в будущем как регулярное(очередной второй Конгресс намечается в 2007 г.).Цель Конгресса – привлечь внимание бизнес-сообществак проблеме производства топлива (биоэтанола)из возобновляемого сырья. Россия еще только находитсяна пути к решению этой проблемы, тогда как весь мирпрошел достаточный путь.Основные вопросы, которые обсуждались наКонгрессе:- Мировой рынок этанола: состояние и перспективы.- Биозаводы и их роль в развитии биоэкономики.- Политика государства по стимулированию производствабиотоплива.- Производство этанола: технологии гидролиза иферментации, сырье.

- Как производителям зерна получать добавочнуюприбыль, производя биоэтанол для внутреннихрынков?- Позиция нефтяных и автомобильных компаний поиспользованию биоэтанола.- Новые ферментные технологии.- Производство биоэтанола: экономика производства,процессы и энергетика.- Как перестроить спиртзавод на производствобиоэтанола?- Рынок этанола и вторичных продуктов его производства(барда, клейковина, глютен).- Рынок зерна для производства этанола.- Финансирование проектов.- Будущее биотоплива (производство этанола избиомассы).- Производство этанола: что необходимо учесть пристроительстве биозаводов.- Другие актуальные для индустрии темы.Сайт Конгресса: www.biotoplivo.ruVII Международный Форум«Высокие технологии XXI века»24–27 апреля 2006 г. в Москве состоялась конференцияVII Международного Форума «Высокие технологииXXI века». Организатор мероприятия – Российскийфонд развития высоких технологий (РФРВТ).В рамках конференции 26 апреля прошло секционноезаседание «Формирование и реализация приоритетныхпроектов в области биотехнологии». Председательствовалина нем заместитель директора Института биоорганическойхимии им. М.М. Шемякина и Ю.А. ОвчинниковаРАН, академик РАН А.И. Мирошников, депутатГосударственной Думы Федерального Собрания РФА.А. Губкин, вице-президент Общества биотехнологовРоссии им. Ю.А. Овчинникова, профессор Р.Г. Василов.Было заслушано 14 докладов. Из них несколько докладоввызвали особенный интерес аудитории.Так, например, профессор Е.Г. Борисенко с коллегамииз Московского государственного университетапищевых производств (МГУПП) предоставили материалыоб инновационных биотехнологиях в производствепродовольствия, основанные на анализе современногосостояния проблемы в мире и собственных разработках.Сущность предложенных сотрудниками МГУПП технологийсводится к использованию дрожжей-суперпродуцентовбиомассы, отселектированных из нормальныхбиоценозов ягод, фруктов, молочнокислых продуктов.Исходным сырьем для дрожжевой биоконверсии служатзерно колосовых культур (шелушенное, дробленое), зерновойсолод. В результате получаются в большом объемебиологически ценные субстраты пищевого и кормовогоназначения с высоким содержанием белка, богатого незаменимымиаминокислотами, витаминными группамиB, PP и др. Производство дрожжевых функциональныхпродуктов разрешено Минздравсоцразвития России подторговой маркой «Фервитал» и Минсельхозом России– под торговой маркой «Фервистим».В сообщении А.С. Яненко (ГосНИИгенетика)сделан акцент на приоритеты отечественной промышленнойбиотехнологии. К их числу автор относит следующее:- глубокую переработку углеводородного сырья сцелью получения широкого спектра химикатов;- комплексную переработку зерна;- получение мономеров для полимерной химии спомощью ферментации сахаросодержащего сырьяи биоконверсии углеводородов (биокатализ).В.Н. Даниленко (консорциум «Биомак») привлеквнимание к актуальности для Российской Федерацииорганизации конкурентоспособного производства субстанцийантибиотиков. Он считает целесообразным дляреализации этого проекта создать БиотехнологическийХолдинг. В качестве перспективных продуцентов авторпредлагает разработанные Научно-исследовательскимцентром биотехнологии антибиотиков «БИОАН» авермектини эритромицин. Подчеркивается, что получениеуказанных препаратов проводилось на базе штаммовStreptomyces avermitilis и Saccharopolyspora erythraea,геномы которых недавно полностью секвенированы.Доклад А.Р. Аблаева (компания «GenencorInternational») был посвящен биоэтанолу и перспективамразвертывания его производства в России. При этомбыл дан полный анализ нынешней ситуации по странами континентам. Пока лидирующие позиции по производствуи потреблению биоэтанола занимают Северная иЮжная Америка. Есть прогресс и в странах ЕС. Следуетотметить, что в указанных регионах мира производствобиоэтанола находит государственную поддержку.Возможности оригинальной отечественной разработкидля производства глюкозных сиропов продемонстрировалиЮ.А. Рамазанов с соавт. (ЗАО «Саяны»,Новосибирск). Они использовали опытно-промышленнуюустановку с безградиентным газо-вихревымбиореактором собственной конструкции, что позволяетувеличивать выход сахаристых веществ при ферментативномгидролизе крахмала.75

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2В.К. Савенко (ЗАО «Экстрасиб», Томск) остановилсяна концепции создания биотехнологическихпроизводств на базе спиртовых заводов, которую планируетсяпровести в жизнь в рамках целевой региональнойпрограммы развития биотехнологии Томской области.Обобщающий доклад «Перспективные проектыфедерального и регионального уровней в Национальнойпрограмме «Развитие биотехнологии в РоссийскойФедерации на 2006–2015 гг.» сделал вице-президентОбщества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова,профессор Р.Г. Василов. Он на конкретныхпримерах проанализировал наиболее разработанные иподготов-ленные к реализации подпрограммы и проектыуказанной комплексной программы. В частности, речьшла о ряде региональных подпрограмм (Киров, Саратов),целевых проектах по морской биотехнологии,биотопливу и др.Сайт Форума: www.hitechno.ru76Научно-практическая конференция«Актуальные проблемы биобезопасности»1–2 июня 2006 г. в Санкт-Петербурге прошлаНаучно-практическая конференция «Актуальные проблемыбиобезопасности». Она была организована Обществомбиотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова,Российским научно-практическим обществом эпидемиологов,микробиологов и паразитологов, Российскимобществом гигиенистов, Национальным союзом медикобиологическойзащиты, Автономной некоммерческойобразовательной и просветительской организацией«Жизнь без инфекций», Ассоциацией врачей-инфекционистовСанкт-Петербурга и Ленинградской области,НИИ гриппа РАМН при поддержке ГосударственнойДумы ФС РФ, Правительства г. Санкт-Петербурга,Северо-Западного отделения РАМН, Северо-ЗападногоНМЦ РАСХН, Российской Военно-медицинскойакадемии им. С.М. Кирова, Санкт-ПетербургскогоНИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера,Санкт-Петербургской государственной медицинскойакадемии им. И.И. Мечникова.В работе конференции приняли участие более 100специалистов в области микробиологии, эпидемиологии,биотехнологии, сельского хозяйства, представителиорганов исполнительной власти, руководители научныхобществ и ассоциаций по указанным профилям. Участниковконференции приветствовали представителиисполнительных органов г. Санкт-Петербурга. В адресконференции пришло приветствие от первого вице-спикераГосударственной Думы ФС РФ О.В. Морозова.Главная цель конференции состояла в экспертнойоценке и выработке научно обоснованной позиции попроблеме биобезопасности и противодейстия биотерроризму.Эта проблема приобретает все большую актуальностьи требует объединения усилий государственных иобщественных организаций на национальном и международномуровнях.Участники конференции констатировали, что реальностисовременного мира выдвигают в число приоритетовбиологические проблемы – сохранение биоразнообразия,экологического равновесия, а в последнее время – такиеострые вопросы, как обеспечение биобезопасностии противодействия биотерроризму. Следует отметить,что на передний план выходит борьба с инфекционнойпатологией, приобретающей глобальный характер в видепандемий вирусных или иных заболеваний.В этой связи ведущие общественные организацииРоссии по профилю эпидемиологии и микробиологии,осознавая важность указанной проблемы для сохранениячеловечества, пришли к согласованному мнению о целесообразностисоздания Международной коалиционной программыобеспечения биобезопасности и противодействиябиотерроризму. Одним из активных генераторов этойидеи был покойный академик РАМН А.А. Воробьев,президент Общества биотехнологов России, до 1 марта2006 г. – заместитель академика-секретаря Отделенияпрофилактической медицины РАМН, известный специалиств данной области, который незадолго до смертивыступил с инициативой проведения настоящей конференции(конференция была посвящена его памяти).Учитывая такое значимое для международной жизнисобытие, как совещание «Большой восьмерки», проводимоев июле 2006 г. в России, участники конференциив качестве итогового документа выработали и обсудилипроект меморандума-обращения к Правительству РоссийскойФедерации. Участники конференции надеются,что руководители нашего государства, которые в последнеевремя проводят работу по созданию федеральнойпрограммы по биологической и химической безопасности,используют разработанный документ при представленииматериалов к заседанию «Большой восьмерки».В результате обсуждения научных, методических,организационных и иных аспектов проблемы биобезопасностиконференция приняла РЕШЕНИЕ:1. Обратиться к Правительству Российской Федерациис ходатайством о целесообразности разработки Международнойкоалиционной программы обеспечения

биобезопасности и противодействия биотерроризмуи вручить ему соответствующий меморандум-обращение(текст данного документа, подписанныйуполномоченными лицами, прилагается).2. Считать целесообразным доведение материалов иитогового документа конференции до сведения РАН,РАМН, РАСХН и других научных и общественныхорганизаций.3. Учитывая большой личный вклад покойного академикаРАМН А.А. Воробьева в означенную проблемуи в развитие отечественной биотехнологии, с цельюувековечения его памяти обратиться к Обществубиотехнологов России с предложением осуществитьследующие меры:- создать Биотехнологический научный центр имениА.А.Воробьева;- издать избранные труды ученого;- учредить стипендию его имени для последипломногообразования специалистов в области биотехнологии.МЕМОРАНДУМ-ОБРАЩЕНИЕк Правительству Российской Федерации«Об организации глобальной системы биобезопасностии противодействия биотерроризму»В связи с возрастанием роли международного сотрудничествав решении таких глобальных проблем, кактерроризм, национальная рознь, экология и т.д., важносвоевременное, научно обоснованное, организационнооформленное принятие мер на государственном уровне.За последние годы действенным инструментом такогосотрудничества стала деятельность «Большой восьмерки».Учитывая, что в нынешнем году заседание «Большойвосьмерки» проводится в России, принимающая странадолжна занять активную позицию по наиболее актуальнымвопросам.Мы, представители ведущих общественных организацийРоссии в сфере биотехнологии, микробиологии,эпидемиологии, специально собравшиеся в Санкт-Петербургена Научно-практической конференции «Актуальныепроблемы биобезопасности» с целью всестороннегообсуждения проблемы биобезопасности в современныхусловиях, констатируем следующее.Реальности наступившего столетия ставят передчеловечеством крайне сложные проблемы. Вместе снарастанием груза нерешенных вопросов в областиэкологии и демографии возникла в глобальном масштабеугроза терроризма, в том числе ее разновидности– биотерроризма. Биологические агенты в качествевредящего фактора могут действовать как в режимепреднамеренных диверсий или военных акций, так и врежиме несанкционированного распространения особоопасных инфекций или латентных, скрыто протекающихзаболеваний.Возможны и варианты антропогенного воздействияна природу в целом – имеются в виду недостаточнопроверенные биологические эксперименты на растениях,животных, микроорганизмах. Природа раскрыла человекуеще не все тайны, и в будущем возможно появлениеновых вредоносных биологических агентов в естественныхусловиях.Недавно мир уже столкнулся с подобными примерами:письма с возбудителями сибирской язвы, распространениевируса атипичной пневмонии (SARS), угрозапандемии птичьего гриппа (H5N1). Одна отдельновзятая страна сейчас не может только собственнымисилами обезопасить свое население. Поэтому встаетзадача создания глобальной международной системыбиобезопасности и превентивного противодействиябиотерроризму.Между тем ни в России, ни за рубежом пока не созданотакой системы на государственном и общественномуровнях. В связи с этим необходимо объединить усилиявсех стран по формированию этой системы, принятьряд политических, организационных, экономических испециальных противоэпидемических мер и, прежде всего,прийти к согласованной позиции (вплоть до уровняООН) по разработке Международной коалиционнойпрограммы обеспечения биобезопасности и противодействиябиотерроризму. В этой программе должны бытьпредусмотрены:1. Усиление действенного контроля над коллекциямиособо опасных микроорганизмов и работами с ними.2. Организация международного резерва (фонда)средств и способов защиты от биологических агентов(индикационных, диагностических, профилактических,лечебных и иных средств).3. Развертывание научно-исследовательских и опытноконструкторскихработ по созданию новейших илинедостающих средств защиты от особо патогенныхагентов.4. Формирование международных сил быстрого реагирования,подготовленных для работы в инфекционныхочагах.5. Налаживание оперативной связи и надежного обменаинформацией о случаях инфекционных заболеванийв различных странах и регионах земного шара.77

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 26. Создание международной базы данных и экспертноаналитическойгруппы по координации работ в сферебиобезопасности.7. Реализация образовательных и просветительскихпрограмм по данной проблеме.Следует иметь в виду, что создание международнойсистемы биобезопасности и противодействиябиотерроризму повысит уровень противоэпидемическойготовности для борьбы со случаями естественно возникающихи распространяющихся инфекционных болезней.Международная программа может опираться насоответствующие базовые национальные программы,которые уже имеются в ряде стран и которая в настоящеевремя формируются в России в соответствии с ПостановлениямиПравительства от 9 февраля 2005 г. № 64и от 16 мая 2005 г. № 303.Учитывая вышеизложенное, мы обращаемся кПравительству Российской Федерации выйти с инициативойк лидерам «Большой восьмерки» о формированииуказанной международной программы, использовав приэтом свой политический и административный ресурс смаксимальным привлечением общественных структур вкачестве экспертов и исполнителей. Именно тесное взаимодействиегосударственных и общественных организацийможет создать эффективную глобальную системубиобезопасности и противодействия биотерроризму.По поручению участников научно-практическойконференции:Вице-президент Общества биотехнологов Россииим. Ю.А. Овчинникова Р.Г. Василов,Председатель Российского научно-практическогообщества эпидемиологов, микробиологов и паразитологовБ.Ф. Семенов,Председатель Общества гигиенистов и санитарныхврачей Е.Н. Беляев,Президент Национального союза медико-биологическойзащиты В.И. Покровский,Директор Автономной некоммерческой образовательнойи просветительской организации «Жизнь безинфекций» Б.Л. Черкасский,Президент Ассоциации врачей-инфекционистовСанкт-Петербурга и Ленинградской области Ю.В. Лобзин.2 июня 2006 годаг. Санкт-Петербург,Российская Федерация78Круглый стол «Живые системы: оценканынешнего состояния и перспективы развития»2 июня 2006 г. в Москве состоялся круглыйстол «Живые системы: оценка нынешнего состоянияи перспективы развития». Организаторы: Министерствообразования и науки Российской Федерации,Федеральное агентство по науке и инновациям, Фонд«Центр экономических исследований и распространенияэкономической информации «Открытая экономика».Присутствовало более 100 человек, из них около 50экспертов из разных учреждений и регионов страны.Председательствовали: статс-секретарь – заместительминистра образования и науки РФ Д.В. Ливанов, заместительруководителя Федерального агентства по науке иинновациям И.П. Биленкина, исполнительный директорЦентра «Открытая экономика» А.И. Гордеев.Цель инициаторов собрания – выяснить точкизрения ведущих специалистов в области физико-химическойбиологии и биотехнологии на перспективы развитияданного научного направления в нашей стране, в томчисле на использование программно-целевого методапо типу федеральных программ по информатизации инанотехнологиям.Состоялся обмен мнениями о путях развитияотечественных исследований в сфере живых систем ибиотехнологии. Выступило более 20 человек, из них:уже упомянутые Д.В. Ливанов, И.П. Биленкина,А.И. Гордеев, проректор МГУ им. М.В. Ломоносова,декан и заведующий кафедрой биоинженерии биологическогофакультета, академик РАН М.П. Кирпичников,директор Института биоорганической химииим. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчииникова РАН,академик РАН В.Т. Иванов, директор ТИБОХДВО РАН, академик РАН В.А. Стоник, директорЦентра «Биоинженерия» РАН, академик РАСХНК.Г. Скрябин, президент группы компаний «Биопроцесс»М.А. Могутов, первый вице-президент РАМН,ректор ММА им. И.М. Сеченова, академик РАН иРАМН М.А. Пальцев, академик-секретарь Отделениябиологических наук РАН, директор Института медико-биологическихпроблем, академик РАН и РАМНА.И. Григорьев, вице-президент РАСХН, академикРАСХН Л.К. Эрнст, руководитель Центра высокихтехнологий «ХимРар» А.А. Иващенко, директор Институтабиологии гена РАН, академик РАН Г.П. Георгиев,вице-президент Общества биотехнологов Россииим. Ю.А. Овчинникова, профессор Р.Г. Василов,декан химического факультета Санкт-Петербургского

государственного университета, профессор А.Ю. Билибин,декан факультета фундаментальной медициныМГУ им. М.В. Ломоносова, член-корреспондентРАН и академик РАМН В.А. Ткачук, директор ГУНИИ биомедицинской химии им. В.Н. ОреховичаРАМН, академик РАМН А.И. Арчаков, директорГосНИИгенетика член-корреспондент РАН и академикРАСХН В.Г. Дебабов, директор Институтапроблем экологии и эволюции им. А.Н. СеверцоваРАН, академик РАН Д.С. Павлов, заместительдиректора по науке Всероссийского НИИ сельскохозяйственнойбиотехнологии РАСХН, член-корреспондентРАН Б.Ф. Ванюшин, сотрудник Российскогоонкологического научного центра им. Н.Н. БлохинаРАМН, д.б.н., профессор РАМН Ф.Л. Киселев идр. Позиции многих выступавших совпадали, посколькуприоритет биологии для XXI века ни у кого невызывал сомнений. Несколько разнились подходы взависимости от интересов того или иного ученого илируководителя. Все сходились на том, что требуетсядолговременная солидная поддержка со стороны государстваи в отношении развития фундаментальнойнауки, и инвестиций в прикладные проекты, как этопринято в развитых странах (информация о кругломстоле имеется также на сайте http://www.sciencerf.ru/client/doctrine.aspx?ob_no=2809&print=1).По материалам круглого стола были принятырекомендации.РЕКОМЕНДАЦИИ (проект)I. Констатирующая частьОбсудив состояние и перспективы исследованийи разработок в области живых систем и биотехнологии,участники круглого стола отмечают следующее.Науки о жизни и биотехнологии играют ключевуюроль в обеспечении национальной безопасности и конкурентоспособностистраны. В экономически развитыхстранах науки о жизни и биотехнология являются национальнымприоритетом, характеризуемым концентрациейинтеллектуальных, научных, технологических и финансовыхресурсов, промышленным протекционизмом.Эти направления важны с точки зрения укреплениянациональной безопасности и повышения экономическойконкурентоспособности страны.В Российской Федерации биотехнология и наукио жизни в целом развиваются в русле мировых тенденций,в стране имеются авторитетные научные школы иорганизации, работающие на мировом уровне. Но, вопервых,их количество весьма ограничено, во-вторых,сложившаяся система организации и контроля работ поданным направлениям в целом далека от эффективной.Не существует стратегии развития данных критическихнаправлений, что приводит к неэффективному расходованиюгосударственных средств, проблемам в формированиицелостных инновационных цепочек, сложностямв реализации механизмов частно-государственногопартнерства.С учетом складывающейся в России экономическойситуации можно говорить о перспективе существенногоувеличения государственных ассигнований вданные области и осуществлении перехода от политикисохранения научного потенциала к достижению прорывав создании новых биотехнологий. Однако необходимоизбежать распыления ресурсов, отдавая приоритет вфинансировании наиболее результативным организациями научным группам.II. Рекомендательная частьВ целях обеспечения эффективного развития вРоссии такого приоритета, как «Живые системы», включающегов себя науки о жизни и биотехнологии в целом,участники круглого стола рекомендуют:Для максимально полной реализации российскогопотенциала в области приоритетного направления«Живые системы» разработать совместными усилияминаучного сообщества, представителей деловых кругов ипредставителей органов власти Федеральную целевуюпрограмму на 2008–2015 гг. в предметной области(далее Программа). Эта Программа должна включатьв себя:• анализ реального состояния всех сегментов российскихбиотехнологий и наук о жизни, формирование постояннодействующих экспертных панелей по выработкенаправлений и механизмов дальнейшего развития;• перечень конкретных приоритетов, целей и задачПрограммы, а также механизмов и процедур внесениякорректив по ходу реализации Программы;• детальное описание механизмов реализации Программы,включая описание механизмов управления, регламентыэкспертизы проектов и результатов проектовв рамках Программы, инфраструктуры и источниковфинансирования;• механизмы развития практики формирования среднесрочных(срок реализации 3–5 лет) комплексныхпроектов, включающих всю «инновационную цепочку»от генерации новых знаний до создания на ихоснове новых технологий, продуктов, услуг;79

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2• конкретные механизмы государственно-частного партнерства,предложения и план по совершенствованиюнормативно-правовой базы такого партнерства;• план совершенствования системы подготовки научныхкадров в области биологии и биотехнологии, сприоритетом на создание научно-образовательныхцентров на базе ведущих научно-исследовательскихорганизаций и вузов.6–8 июня 2006 г. в Санкт-Петербурге состоялсяМеждународный симпозиум «ЕС – Россия: перспективысотрудничества в области биотехнологии в 7-й рамочнойпрограмме». Помимо научной программы в рамкахсимпозиума с 5 по 9 июня работала Международнаяшкола-конференция молодых ученых «Биотехнологиябудущего». В работе школы-конференции приняло участие60 молодых ученых более чем из 10 регионов РФ,стран СНГ и Европы.13–17 июня 2006 г. в Казани состоялась VIIIМеждународная конференция «Современные перспективыв исследовании хитина и хитозана».19–21 июня 2006 г. в Пущино прошла Третьямеждународная конференция из серии «Наука и бизнес»– «Международное сотрудничество в биотехнологии:Перспективы и реальность». Вышел в свет сборникматериалов конференции, в котором отражены основныедостижения зарубежных и российских ученых в таких областях,как биотехнология, биомедицина, биотехнологиязащиты окружающей среды, коммерциализация научныхразработок, трансфер технологий, подготовка специалистовсовременных биотехнологических производств,международные стандарты (GLP, GMP, ISO-9000),экспорт/импорт биологических материалов.80ПУБЛИКАЦИИКрик Ф. Жизнь как она есть: ее зарождение исущность / Пер. с англ. – М.: URSS, 2005. – 160 c.Аннотация. Книга известного английского физикаи биохимика Френсиса Крика, лауреата Нобелевскойпремии в области физиологии и медицины (1962),посвящена одной из самых больших тайн природы:зарождению жизни. Автор предлагает и обосновываетнеобычную гипотезу внеземного происхождения жизни:направленной панспермии. Материал излагается всвободной и интересной манере, с большим количествомпримеров. В книге 15 глав (времена и расстояния,большие и малые; космическая мистерия; единообразиебиохимии; сущность жизни; нуклеиновые кислоты имолекулярная репликация; первозданная Земля; статистическоезаблуждение; другие подходящие планеты;высшие цивилизации; как давно могла зародитьсяжизнь?; что они могли послать?; конструкция ракеты;противопоставление двух теорий; возвращаясь к вопросуФерми; почему это должно нас волновать?),эпилог, приложение. Эта книга, несомненно, будет интереснаширокому кругу читателей: биологам, химикам,биофизикам и просто тем, кто интересуется тайнамиприроды.Алексеев В.И., Каминский В.А. Прикладнаямолекулярная биология. Изд.2. – М.: URSS, 2005.– 200 c.Аннотация. В учебном пособии изложены основымолекулярной биологии, а также направления приложениязакономерностей молекулярной биологии для практическогоиспользования. Рассмотрены системная организацияживого вещества на биосферном и молекулярном уровнях,структурная организация макромолекул, функциибиополимеров, их комплексов и основные направленияпрактического использования молекулярной биологии.Пособие предназначено для студентов естественныхвузов – будущих биологов, химиков, технологов пищевыхпроизводств, а также аспирантов, преподавателей испециалистов.Пул Ч., Оуэнс Ф. Нанотехнологии / Пер. сангл. Изд.2. – М.: URSS, 2005. – 328 c.Аннотация. Первое руководство на русскомязыке, описывающее структуру и свойства наноматериаловот твердотельных до биологических объектов.Исчерпывающе изложены технологии изготовленияи методы исследования наноструктур, разнообразныеприменения – от оптоэлектроники до катализаи биотехнологий. Учебник-монография адресованширокому кругу научных работников, инженеровэлектронщиков,специалистов в областях химическихи биотехнологий.Biological science and biotechnology in Russia:controlling diseases and enhancing security. – The NationalAcademies Press, 2005. – 156 p.

Резюме. В обзоре, озаглавленном «Биологическаянаука и биотехнология в России: контроль заболеваемостии повышение безопасности», предлагаетсяряд рекомендаций, которые могли бы помочь Россииобъединиться вместе с Соединенными Штатами ишироким международным сообществом в проведенииглобальных действий по контролю над инфекционнымизаболеваниями. Предложенная двусторонняя межправительственнаякомиссия могла бы сыграть ключевуюроль, чтобы обоюдное взаимодействие обратить от одностороннейподдержки в партнерство. В обзоре предлагаетсяучредить два модельных Государственных центрасанитарно-эпидемиологического надзора в России,более сосре-доточенных на поддержке отобранных наконкурсной основе российских научно-исследовательскихгрупп как центров превосходства, на поощрениеинвестиций в ниши биотехнологии российских компанийи на расширении возможностей молодым ученымдостигать лидирующих позиций в России. Кроме того,в обзоре особо отмечается важность программ США,которые поддерживают интеграцию ученых бывшегоСССР, работавших в оборонной сфере, с гражданскимиисследователями, не вовлекавшимися в военнуюдеятельность.Meksem Khalid. The handbook of plant genomemapping: genetic and physical mapping. – Wiley-VCH,2005. – 402 p.Резюме. Несмотря на полное секвенирование геномовмодельных организмов, например, бактерий, дрожжей(Saccharomyces cerevisiae), червей (Caenorhabditiselegans), дрозофилы (Drosophila melanogaster), мыши,человека, расшифровка геномов растений пока отстает. Кнастоящему времени секвенированы два вида растений:модельный объект – Arabidopsis thaliana и зерновойвид – рис (Oryza sativa). Хотя в разработке находятсягеномы нескольких зерновых видов. Между тем секвенированиерастений имеет важное прикладное значениедля сельского хозяйства, равно как и фундаментальноезначение для понимания таких вопросов, как синтенияи биоразнообразие в целом. В книге ставится задачапривлечь внимание к проблеме картирования геномарастений.Plunkett Jack W. Plunkett’s biotech and geneticsindustry almanac 2006. – Plunkett Research , Ltd, 2005.– 562 p.Резюме. Книга является справочным пособием вобласти бизнеса в биотехнологии, генетике, протеомике исмежных отраслях. В ней содержатся сведения о ведущихбиотехнологических компаниях (около 450), о современныхтенденциях в развитии генетики, технологий,статистики, финансов, приводятся глоссарий и указатели.В книге содержатся рубрики: краткая история биотехнологии;состояние биотехнологической индустрии сегодня;финансирование и инвестиции в биотехнологию; патенты;биотехнологическая деятельность в Сингапуре и Китае;Управление по контролю над продуктами и лекарствамиСША (FDA); генотерапия; персонализированнаямедицина; системная биология; разработка лекарств;клинические испытания; дискуссия о ценах на лекарства;исследования стволовых клеток; терапевтическое клонирование;нанотехнология регенеративной медицины;сельскохозяйственная биотехнология; системы поставкилекарств; проект «HapMap» (International ProjectHapMap, http://www.hapmap.org), проект «Биощит»(Project BioShield, http://www.whitehouse.gov/infocus/bioshield); этические вопросы.Sasson A. Medical biotechnology: achievements,prospects and perceptions. – United Nations UniversityPress, 2006. – 154 p.Резюме. Рассматриваются последние достиженияи перспективы развития медицинской и фармацевтическойбиотехнологии. Анализируются различные аспектыэтого направления, такие как биоиндустрия и биоэкономика,вопросы управления, наиболее привлекательныедля бизнеса области и инновационные решения, медицинскаяи фармацевтическая биотехнология в развивающихсястранах в условиях глобализации, этические проблемы,социальное восприятие биотехнологии и др.BioWorld Biotechnology State of Industry Report2006. – BioWorld Online, 2006. – 429 p.Резюме. В книге – годичном обзоре BioWorld– прослежена динамика развития биоиндустрии в текущемгоду и исследованы тенденции в 2006–2007 гг. Вней содержатся четыре раздела:1. Анализ – перспективы и прогнозы экспертов попромышленности из Уолл-стрита, Вашингтона иакадемий.2. Финансовые данные – данные годовой стоимостипервичного размещения акций (IPO), венчурногокапитала, грантов и т.д.81

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 23. Корпоративные сделки – детали сотрудничества исоглашений между биотехнологическими, фармацевтическимии агробизнес-компаниями.4. Разработка биотехнологической продукции – продукцияв разработке, утвержденная в США и заокеаном и внесенная в список лицензированных наприменение.(Более подробно см. сайт http://www.mindbranch.com/products/R528-18.html)Biodefense Market Report 2006: Vaccines,Therapeutics and Diagnostics for Bioterror Agents.– BioWorld Today, 2006. – 237 p.Резюме. Материалы по биозащите подготовленыконсалтинговой фирмой BioAbility и напечатаныBioWorld Online. Даны базовые сведения о потенциальныхагентах биотерроризма: бактериях, вирусах, токсинах– возбудителях таких заболеваний, как сибирская язва,ботулизм, натуральная оспа, болезни Эбола и Марбурга,вирусные энцефалиты, 19 других групп патогенов, идентифированныхЦентром контроля заболеваний (CDC).Приведены справочные таблицы о различных вакцинах,диагностических и лечебных средствах для предотвращенияи борьбы с указанными заболеваниями в случаеих возникновения. Перечислены компании, занятые нарынке таких препаратов.(См. сайт http://www.bioworld.com/servlet/com.accumedia.web.Dispatcher?next=bioDefenseMarket)BioWorld Top 25 Biotechnology Drugs Report.– BioWorld, 2006. – 192 p.Резюме. Представлен обзор о 25 биотехнологическихпрепаратах, наиболее перспективных на этомрынке. Анализ проведен по ряду ключевых параметров,таких как категория, показания, описание заболевания,хронология разработки, патентная защита, конкурирующиепрепараты, протекционизм на ближайшую перспективуи т.д. Был критериальный отбор по следующимусловиям: препарат должен быть утвержден в пределахпоследних 20 лет, полная стоимость на биотехнологическоми фармацевтическом рынке, выручка и др. Лекарстваохватывают наиболее важные нозологии – рак, диабет,инфекционную патологию, болезни крови и др.(См. сайт http://www.ahcpub.com/products_and_services/?prid=502&spcid=0,2&mtyid=6&cetid=0&pdr=0&clntr=0&clnt…)82Аннонсированное в томе 1, № 2 за 2005 год журнала«Вестник биотехнологии …» третье издание «BasicBiotechnology» вышло в июне 2006 г. (см. ниже).Basic Biotechnology. 3 rd Ed. / Ed. by C. Ratledge,B. Kristiansen. – Cambridge University Press, 2006.– 682 p.Резюме. Книга состоит из 25 глав, сгруппированныхв 2 части: 1) «Основы и принципы», 2) «Практическоеприменение». Фундаментальные аспекты излагаютсяв первых 11 главах, в которых освещены такие проблемы,как общественное восприятие биотехнологии, стойхиометрияи кинетика роста микробов, анализ генома прокариот,генная инженерия дрожжей и волокнистых грибов,биореакторы, масс-перенос и др. Один из редакторов– Colin Ratledge – написал здесь главу «Биохимия ифизиология роста и метаболизма», а другой редактор– Bjorn Kristiansen – проанализировал значение экономикидля биотехнологии. В главах 12–25 второй частикниги обсуждены практические вопросы. Рассматриваютсятакие темы, как биотехнологический бизнес,биотехнология ферментов, аминокислот, органическихкислот, рекомбинантных белков и др. Уделяется такжевнимание экологическим вопросам, биотрансформациям,биотехнологии растительных клеток, иммунохимии.Комиссаров Г.Г. Фотосинтез: физико-химическийподход. Изд. 2, стереот. – М.: URSS, 2006.– 224 с.Аннотация. Подробно обосновывается предложеннаяавтором (1995) принципиально новая концепцияфотосинтеза. Согласно ей, источником кислорода(водорода) при фотосинтезе служит не вода, а пероксидводорода экзо- и эндогенного происхождения. Убедительнопоказана необходимость участия в фотосинтезетепловой энергии, введено представление о локальномразогреве хлоропласта. Новая концепция фотосинтезапозволила предложить экологически чистый принциппреобразования солнечной энергии, объяснить неудачнуюкислородную динамику в «Биосфере-2», выдвинутьновый подход к стимулированию роста и развитиярастений. Обсуждены также следствия, вытекающие изконцепции (связь фотосинтеза и дыхания, возможностьнового подхода к объяснению формирования атмосферыЗемли), затронут вопрос о происхождении жизни идр. Коротко рассмотрена история изучения фотосинтеза,его значение. Приведены этапы многолетних

(1960–2001) работ автора по физико-химическомумоделированию природных фотосинтетических систем(обоснование фотоэлектрохимической гипотезыфотосинтеза, создание первой в мире функциональноймодели хлоропласта и др.). Значительное место в книгезанимает изложение экспериментальных и теоретическихданных, полученных в лаборатории фотобионикиИнститута химической физики им. Н.Н. СеменоваРАН при изучении механизма генерации тока в пленкахфотосинтетических пигментов и их аналогов. Приведенаклассификация трех типов фотовольтаических эффектовв пленках органических полупроводников, контактирующихс электролитом. Форма изложения книгипозволяет читателю выборочно (по отдельным главам)знакомиться с материалом. Книга адресована химикам,физикам, биологам, а также студентам и аспирантамэтих специальностей, интересующимся проблемой фундаментальногои уникального биологического процесса– фотосинтеза.Суздалев И.П. Нанотехнология: физико-химиянанокластеров, наноструктур и наноматериалов. Серия«Синергетика: от прошлого к будущему». – М.:URSS, 2006. – 592 с.Аннотация. Книга включает круг вопросов, которыемогут составить область науки о нанообъектах,процессах и явлениях, проходящих на уровне размеров1–100 нм. В этой области наблюдаются эффекты,чувствительные как к отдельным атомно-молекулярнымуровням энергии, так и к коллективным свойствамтел. Развитие науки о нанокластерах и наносистемах иметодов их исследования привело к созданию нанотехнологии,наноматериалов и наноустройств, отличающихсяуникальными свойствами и перспективами применения.Книга представляет собой попытку соединения теоретическихи экспериментальных данных о нанокластерахи наносистемах с некоторыми вопросами более общего,вводного характера: методами исследования нанокластерови поверхности твердого тела и микроскопическими итермодинамическими подходами к изучению нанокластерови поверхности. Такая структура книги нашла своеотражение благодаря работам автора в Институте химическойфизики им.Н.Н. Семенова РАН и чтению курсалекций по физико-химии нанокластеров и наноструктур вМосковском государственном университете им.М.В. Ломоносова,на факультете наук о материалах. Книга можетбыть полезной как для студентов и аспирантов, так и длянаучных работников, ведущих исследования или начинающихработать в области нанотехнологий.Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химическиетест-методы анализа. Изд.2. – М.: URSS,2006. – 304 с.Аннотация. Монография посвящена химическимтестам, которые широко используются в экологической,промышленной, клинической, криминалистической сферахи обеспечивают возможность простого и недорогогокачественного, полуколичественного или количественногоанализа. Обсуждены общие характеристики тест-систем:дефиниции, достоинства тестов, их химические основы,изготовление и особенности технических средств, методологияиспользования. Детально описано применение экспресс-тестовво многих областях, указаны разнообразныетест-средства. Библиография насчитывает 691 ссылку,книга включает 89 обобщающих таблиц. Монографиярассчитана на специалистов в области химического анализа,экологии, криминалистики, медицины и может бытьполезна студентам и аспирантам химических вузов.Рогожин В.В. Практикум по биологическойхимии. – М.: URSS, 2006. – 256 с.Аннотация. Рекомендовано Учебно-методическимобъединением вузов РФ по образованию в областизоотехнии и ветеринарии для студентов вузов в качествеучебно-методического пособия по специальностям310700 – Зоотехния и 310800 – Ветеринария. Основнойцелью практикума является ознакомление студентовс практическими методами биохимических исследований,закрепление теоретических знаний в области биологическойхимии, развитие экспериментальных навыков ипривитие научного мировоззрения.Шамин А.Н. История биологической химии:Формирование биохимии. Серия «Из наследия А.Н.Шамина». Изд 2-е. – М.: URSS, 2006. – 264 c.Аннотация. Книга посвящена истории формированияклассической биохимии в период с середины XIXв. до 20-х гг. XX в., становлению исследований белков,углеводов, липидов, биокатализаторов, основного обменавеществ, истокам биоэнергетики, открытию и изучениюгормонов, витаминов, нуклеиновых кислот. В ней прослеженовозникновение основных концепций биохимии,уточнение ее предмета.83

Вестник биотехнологии, 2006, 2, № 2Шамин А.Н. История биологической химии:Истоки науки. Серия «Из наследия А.Н. Шамина».Изд 2-е. – М.: URSS, 2006. – 392 c.Аннотация. Книга посвящена первым шагамвзаимодействия химии с биологией и медициной. Вней впервые дано систематическое изложение историивозникновения биологического эксперимента, использованногодля изучения методами химии биологическихобъектов и процессов. Отдельная глава посвященапоявлению биохимии в России, первым биохимическимтрудам, учебникам и научным учреждениям, где проводилисьбиохимические исследования.Review of the Department of energy's genomics:GTL program. – The National Academies Press, 2006.– 102 p.Резюме. Департамент энергетики (ДЭ) СШАпродвигает научную и технологическую инновацию сцелью обеспечения прогресса в национальной, экономическойи энергетической безопасности СоединенныхШтатов. Осознавая потенциал микроорганизмов длясоздания новых альтернативных источников энергии иремедиации экологических загрязнений, ДЭ в 2000 г.выступил с инициативой формирования программы«Геномы – жизни» (ныне называется «Геномика»),или сокращенно «GTL» (от «Genomes to Life»). Впрограмме ставится цель способствовать прогностическойоценке микробных систем, которые можно будетиспользовать для создания инженерных устройств дляпроизводства биоэнергии и очистки окружающей среды,а также выяснению процессов обмена и накопленияуглерода. В настоящей работе проводится критическийанализ программы и ее инфраструктуры. В целомделается вывод, что программа «GTL» состоялась иобещает дать много научных решений, которые обеспечатдостижение ее целей. Однако текущий план ДЭпо созданию четырех независимых блоков для производствабелка, построения молекулярных изображений,протеомного анализа и системной биологии может статьне самым рентабильным, эффективным и оптимальнымс научной точки зрения путем, чтобы обеспечить этуинфраструктуру. В качестве альтернативы в работепредлагается сформировать четыре институтоподобныхструктуры, каждая из которых интегрировала бы мощностивсех четырех из первоначально запланированныхпроизводств и сфокусировалась бы на одной или двухглавных задачах программы «GTL». Альтернативнаяинфраструктура могла бы иметь особенно высокуюнаучную ценность, потому что потребность в технологияхбудет непосредственно связана с биологическимизадачами программы.The Impact of Globalization on Infectious DiseaseEmergence and Control: Exploring the Consequences andOpportunities, Workshop Summary – Forum on MicrobialThreats / S. Knobler, A. Mahmoud, S. Lemon (Eds).– The National Academies Press, 2006. – 246 p.Microbial Threats to Health: The Threat ofPandemic Influenza / M.S. Smolinski, M.A. Hamburg, J.Lederberg (Eds). – The National Academies Press, 2006.– 48 p.Ensuring an Infectious Disease Workforce: Educationand Training Needs for the 21 st Century – WorkshopSummary / S.L. Knobler, Th. Burroughs, A. Mahmoud,S.M. Lemon (Eds). – The National Academies Press, 2006.– 238 p.Addressing Foodborne Threats to Health:Policies, Practices, and Global Coordination, WorkshopSummary. – The National Academies Press, 2006.– 304 p.I m p l i c a t i o n s o f G e n o m i c s f o r P u b l i cHealth: Workshop Summary / Lyla Hernandez(Ed.). – The National Academies Press, 2006.– 98 p.84

информацияПРЕДСТОЯЩИЕ МЕРОПРИЯТИЯ 2006 ГОДАКОНФЕРЕНЦИИ, СЪЕЗДЫ20–21 сентября 2006 г. в Москве состоитсяcимпозиум «Биобезопасность микробиологических ресурсов»,который проводят Организация по экономическомусотрудничеству и развитию (OECD) и РоссийскаяФедерация. Цель симпозиума – привлечь внимание кпроблеме обеспечения безопасности при работе с опаснымыбиологическими агентами. В работе симпозиума будутпринимать участие известные специалисты и экспертыв данной области из России и США, Великобритании,Канады, Германии, Франции, Италии, Бельгии.Справки на сайте: www.oecd.org/sti/biotechnology25–27 сентября 2006 г. в Кливленде (штатОгайо, США) состоится форум «BIO Mid-AmericaVentureForum». Основное внимание уделяется экономическимаспектам биотехнологии. В работе форума будутучаствовать более 50 фирм.Справки на сайте: http://bma.bio.org/opencms/bma/2006/index.jsp24–25 октября 2006 г. в Москве будет проходитьМеждународный конгресс «Биодизель-2006».Организатор – Российская биотопливная ассоциацияпри поддержке Государственной Думы ФС РФ, Министерствасельского хозяйства РФ, Министерствапромышленности и энергетики РФ, Министерстваэкономического развития и торговли РФ, Российскогозернового союза, Общества биотехнологов России им.Ю.А. Овчинникова.Справки на сайте: www.biotoplivo.ru13–15 ноября 2006 г. в Москве состоится круглыйстол «Биологическая безопасность» в рамках Международногофорума «Проблемы природно-техногеннойбезопасности», организаторами которого являютсяРоссийская академия наук и Общественная палата РФпри поддержке Правительства Российской Федерации.Руководитель круглого стола – академик-секретарьОтделения биологических наук, директор Институтамедико-биологических проблем РАН, академик РАНи РАМН А.И. Григорьев, заместитель руководителя– вице-президент Общества биотехнологов России им.Ю.А. Овчинникова, профессор Р.Г. Василов. С докладамивыступят ведущие специалисты в данной области: академикРАН и РАМН А.И. Григорьев, член-корреспондентРАН, академик РАСХН В.Г. Дебабов, академикРАМН О.И. Киселев, академик РАН Е.Д. Свердлов,академик РАН C.Г. Инге-Вечтомов, академик РАМНА.Л. Гинцбург, профессор В.Н. Даниленко, член-корреспондентРАН Л.В. Калакуцкий, академик РАМНВ.А. Тутельян, академик РАСХН И.А. Тихонович, академикРАСХН А.Н. Панин, Н.Т. Васильев, профессорД.Н. Кавтарадзе, профессор Р.Г. Василов.Справки: 119991 Москва, Ленинский проспект,32А. Агентство научных и деловых коммуникацийпри РАН Тел.: (495) 938-18-51, 938-18-61. E-mail:safetyforum@conference.ras.ru85

ПРАВИЛА ДЛЯ АВТОРОВ1.Рукописи статей и других материалов представляются в редакцию набумажном носителе (формат А4) или в электронном виде (на дискетеили по электронной почте с обязательным уведомлением).2. Текст набирается в Microsoft Word, шрифт – Times New Roman,размер шрифта – 12, межстрочный интервал – полуторный. Размещениена листе формата А4 со стандартными полями.. Кроме текстастатьи, добавляются краткие сведения об авторе (ах): Ф.И.О.,место работы, должность, научные степень и звание, адрес дляпереписки и факсимильной и электронной связи).3.4.5.6.Объем рукописи: оригинальные статьи – не более 12 – 14 стр. (всреднем 22000 знаков без пробела), не более 25 цитированныхавторов; обзоры – не более 20 – 24 стр. (в среднем 40000 знаковбез пробела), список литературы – не более 50 авторов. Требованияк композиции рукописи: 1) оригинальные статьи – УДК, название,автор (ы), место работы, резюме на русском и английском языках,ключевые слова, введение, материалы и методы, результаты, обсуждение,заключение (выводы), литература, список сокращений; 2) краткиесообщения и обзоры строятся в виде сплошного текста, без вышеуказанныхрубрикаций, со списком литературы, но без резюме; 3) остальныематериалы (письма в редакцию, хроникальные сообщения, рецензии ит.д.) представляются в произвольной форме.Требования к оформлению содержания рукописи (таблицы, графики,формулы, фотографии, рисунки и др.). Рисунки прилагаютсяотдельно к тексту рукописи в бумажном и электронном виде вформате TIF или JPEG . Таблицы помещаются по ходу текста илиприлагаются отдельно. Порядок оформления иллюстративного ииного дополнительного (пояснений, примечаний, благодарностей ит.д.) материала к текстам обычный.Требования к цитированной литературе: Список литературыоформляется или в алфавитном порядке (вначале – литературана русском языке, затем – на иностранных), или по порядкуупоминания и ссылок в тексте при использовании цифр. В последнемслучае номер цитированного источника берется в текстев квадратные скобки. Оформление отдельного источника литературыосуществляется в соответствии с общепринятыми длянаучных изданий библиографическими требованиями, включаямеждународные установки (Index Medicus и др.).Не допускается публикация работ, уже напечатанных илипосланных в редакции других изданий.86

7.8.9.При несоблюдении указанных правил статьи редакцией непринимаются.Принятые к публикации рукописи проходят рецензирование,после чего принимается окончательное решение о возможностипечатания. Отклоненные рукописи не возвращаются.Редакция не несет ответственности за достоверность фактов,выводы и суждения, приведенные в представленном к печатии опубликованном материале авторов.10. Редакция оставляет за собой право делать научную и литературнуюправку, в том числе сокращать объем статей.11. Адрес редакции указан на титульном листе журнала.12. Журнал является безгонорарным. Редакция резервирует дляавтора статьи по 1 экземпляру журнала. По вопросам приобретенияотдельных номеров журнала следует обращаться вредакцию. Подписка на журнал в течение 2006 года проводитьсяне будет.Подписано к печати 30.06.06Формат 60/90 1 / 8. Бумага офсетная № 1.Печать офсетная. Гарнитура Академия.Печ. л. 5,5. Тираж 1000 экз.

Об Щес тВО би Отех НО лО ГОВ РОс сииИМ. Ю.А. ОВЧИННИКОВАОб щес тво би отех но ло гов Рос сии им. Ю.А. Овчинникова (ОБР) со зда нов 2003 г., за ре гис три ро ва но Ми нюс том РФ.Глав ны ми це ля ми де яте ль нос ти ОБР явля ются:• со дей ствие раз ви тию би отех но ло гии в Рос сии как при ори тет но го на правления на учнотех ни чес ко го про грес са, осно вы по вы ше ния уров ня жиз ни ибла го сос то яния ее граж дан;• со дей ствие со хра не нию на учно го и на учнотех но ло ги чес ко го по тен ци алаби отех но ло гии в раз лич ных от рас лях на род но го хо зяй ства, дос ти же ниюпри ори те та рос сий ской на уки;• об еспе че ние об ме на на учны ми иде ями и на учнотех ни чес ки ми дос ти же ниями,пе ред овым про извод ствен ным опы том;• со дей ствие раз ви тию со труд ни чес тва уче ных, инже не ров, спец иа лис тов сми ро вым на учным и об щес твен нопо ли ти чес ким со общес твом;• со зда ние усло вий для твор чес кой ра бо ты, рос та про фес си она лиз ма и компетен тнос ти, бо лее пол но го ис по ль зо ва ния интел лек ту аль но го по тен ци алачле нов орга ни за ции в инте ре сах раз ви тия на уки и про извод ства.Для дос ти же ния этих це лей ОБР осу щес твля ет раз лич ные ме роп ри ятия, втом чис ле про во дит кон фе рен ции, сим по зи умы, ра бо чие со ве ща ния. Еже год нопро во дит ся съезд Об щес тва би отех но ло гов России.Из да ется жур нал «Вес тник би отех но ло гии и фи зи кохи ми чес кой би оло гииим. Ю.А. Овчинникова» совместно с Информационно-аналитическим центроммедико-социальных проблем.ОБР име ет от де ле ния в 50 ре ги онах России и объ еди ня ет свы ше 1000чле нов.ОБР явля ется чле ном Евро пей ской фе де ра ции би отех но ло гии.ОБР тес но со труд ни ча ет с Со юзом би отех но ло гов и другими общественнымии государственными организациями, научными и образовательнымиучреждениями по профилю.Осно вой орга ни за ци онной де яте ль нос ти ОБР явля ются ре ги она ль ныеот де ле ния, тес но вза имо дей ству ющие с Цен тра ль ным Прав ле ни ем и сек ци ями(экс пер тны ми груп па ми).Член ство в ОБР явля ется бес плат ным для фи зи чес ких лиц.Кон так ты: Адрес: 119296 Мос ква, Уни вер си тет ский прт, 9Тел.: 89151795192Email: obr@biorosinfo.ru; www.biorosinfo.ru

Ð¢Ð¾Ð¼ 2 â2 - ÐÐ±ÑÐµÑÑÐ²Ð¾ ÐÐ¸Ð¾ÑÐµÑ Ð½Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¾Ð² Ð Ð¾ÑÑÐ¸Ð¸ Ð¸Ð¼. Ð®.Ð. ÐÐ²ÑÐ¸Ð½Ð½Ð¸ÐºÐ¾Ð²Ð°

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?

Ð¢Ð¾Ð¼ 2 â2 - ÐÐ±ÑÐµÑÑÐ²Ð¾ ÐÐ¸Ð¾ÑÐµÑÐ½Ð¾Ð»Ð¾Ð³Ð¾Ð² Ð Ð¾ÑÑÐ¸Ð¸ Ð¸Ð¼. Ð®.Ð. ÐÐ²ÑÐ¸Ð½Ð½Ð¸ÐºÐ¾Ð²Ð°