CamSep 1
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
POSTĘPY CHROMATOGRAFII<br />
Praca zbiorowa pod redakcją<br />
Bronisława K. Głoda<br />
Monografie nr 111<br />
WYDAWNICTWO<br />
AKADEMII PODLASKIEJ<br />
SIEDLCE 2009
Komitet Wydawniczy:<br />
Zofia Chyra-Rolicz (przewodnicząca), Stanisław Jaczyński, Mirosław<br />
Jakubiak, Iwona Kiersztyn, Marek Kucharski, Ryszard Mojak, Ryszard<br />
Rosa, Janina Skrzyczyńska, Stanisław Socha, Janusz Toruński,<br />
Izabela Trzpil, Janusz Uchmański, Hanna Wadas-Woźny, Andrzej<br />
Wiśniewski, Krystyna Wojtczuk, Kazimierz Żegnałek<br />
Komitet Redakcyjny (recenzenci):<br />
Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński<br />
– Gdańsk, Teresa Kowalska – Katowice, Mieczysław Sajewicz – Katowice,<br />
Andrzej Stołyhwo – Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos<br />
– Lublin, Zygfryd Witkiewicz – Kielce, Paweł Zarzycki – Koszalin<br />
Żaden fragment tej publikacji nie może być reprodukowany, umieszczany w systemach przechowywania<br />
informacji lub przekazywany w jakiejkolwiek formie – elektronicznej, mechanicznej,<br />
fotokopii czy innych reprodukcji – bez zgody posiadacza praw autorskich.<br />
© Copyright by Wydawnictwo Akademii Podlaskiej, Siedlce 2009<br />
Monografie nr 111<br />
PL ISSN 0860-2719<br />
Wydawnictwo Akademii Podlaskiej<br />
08-110 Siedlce, ul. Bema 1, tel. (025) 643 15 20<br />
e-mail: wydawnictwo@ap.siedlce.pl<br />
www.wydawnictwo.ap.siedlce.pl<br />
Wyd. I. Format B-5.<br />
Ark. wyd. 7,2. Ark. druk. 8,6.<br />
Łamanie: Zofia Chudek (Wydawnictwo AP)<br />
2
SPIS TREŚCI<br />
Przedmowa.................................................................................................... 5<br />
Piotr M. Słomkiewicz, Zygfryd Witkiewicz<br />
Dozownik laserowy do dozowania próbek ciekłych do kolumn<br />
pakowanych w chromatografii gazowej.......................................................... 7<br />
Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Tomasz Zieliński, Paweł Zarzycki<br />
Zastosowanie HPLC w badaniach choroby Parkinsona .............................. 15<br />
Monika Asztemborska<br />
Zastosowanie metod separacyjnych w badaniu enancjomeryzacji.............. 33<br />
Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Iwona Kiersztyn,<br />
Anna Lamert, Paweł Zarzycki<br />
Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów<br />
oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego.......................................... 41<br />
Józef Rzepa<br />
Oznaczanie leków i pestycydów w wodach powierzchniowych ................... 67<br />
Marian Kamiński<br />
Preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa .................................. 79<br />
Daniel Jastrzębski, Grażyna Romanik, Marcin M. Kamiński, Maciej<br />
Trznadel, Anita Skrzypczak, Aleksandra Królicka, Marian Kamiński<br />
Kolumnowa chromatografia cieczowa w rozdzielaniu i analizie peptydów<br />
i białek......................................................................................................... 113<br />
3
4
PRZEDMOWA<br />
Postępy Chromatografii to pierwsza z cyklu monografia poświęcona<br />
najnowszym trendom w chromatografii, wydana przy okazji organizowanych<br />
Podlaskich Spotkań Chromatograficznych. Adresowana jest przede wszystkim<br />
do pracowników nauki, studentów oraz wszystkich, którzy na co dzień<br />
zajmują się chromatografią. Autorzy zawarli w tej pozycji praktyczne przykłady<br />
zastosowań z zakresu różnych dziedzin chromatografii.<br />
Pragniemy podziękować wszystkim, którzy przyczynili się do powstania<br />
tej książki oraz chcemy zachęcić innych, aby w przyszłości stali się<br />
współautorami kolejnych wydań.<br />
KOMITET REDAKCYJNY
6
Piotr M. SŁOMKIEWICZ 1 , Zygfryd WITKIEWICZ 1,2,3<br />
1)<br />
Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego, Kielce,<br />
2)<br />
COBRABiD, Warszawa,<br />
3)<br />
Instytut Chemii, Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa<br />
DOZOWNIK LASEROWY DO DOZOWANIA<br />
PRÓBEK CIEKŁYCH DO KOLUMN PAKOWANYCH<br />
W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ<br />
Opisano dozownik umożliwiający dozowanie próbek ciekłych do kolumn pakowanych<br />
w chromatografii gazowej. Dozowane próbki są bardzo szybko odparowywane za<br />
pomocą promienia laserowego w kontrolowanych warunkach.<br />
WPROWADZENIE<br />
Dozowanie ciekłych próbek do chromatografów gazowych polega na<br />
wstrzykiwaniu cieczy za pomocą mikrostrzykawki do ogrzewanej komory dozownika,<br />
który znajduje się bezpośrednio przed kolumną chromatograficzną.<br />
W wyniku tego próbka ulega odparowaniu w przepływającym przez komorę<br />
gazie nośnym i jej pary wraz z tym gazem są wprowadzane do kolumny.<br />
Konstrukcje komór dozowników, służących do odparowywania ciekłych<br />
próbek, powinny spełniać dwa podstawowe warunki. Powinny charakteryzować<br />
się krótkim czasem odparowania, czyli bardzo szybko dostarczać<br />
ciepło potrzebne do odparowania próbki oraz mieć taką budowę, żeby rozcieńczanie<br />
par próbki gazem nośnym było możliwie najmniejsze. Warunki te<br />
są konieczne, albowiem początkowa szerokość pasma próbki w gazie nośnym<br />
mierzona w jednostkach czasu ma wpływ na rozdzielanie i rozmywanie<br />
pików chromatograficznych rejestrowanych u wylotu kolumny. Oprócz<br />
spełnienia tych podstawowych warunków minimalizacji początkowej szerokości<br />
pasma sprzyja minimalizacja wielkości dozowanej próbki.<br />
Dozowanie cieczy o wysokiej temperaturze wrzenia powoduje chwilowe<br />
obniżenie temperatury strumienia gazu nośnego i komory dozownika.<br />
W wyniku tego zmniejsza się prędkość odparowywania próbki i w rezultacie<br />
prowadzi to do znacznego rozcieńczenia gazem nośnym par cieczy dopływających<br />
do kolumny. Próbka dopływa do kolumny w postaci szerokiego,<br />
rozmytego gazem nośnym pasma i rozdzielenie pików chromatograficznych<br />
może nie być zadowalające. Efekt ten jest szczególnie wyraźny, gdy jest dozowana<br />
mieszanina dwóch cieczy znacznie różniących się temperaturą<br />
wrzenia. Wówczas pik składnika o wysokiej temperaturze wrzenia jest<br />
znacznie bardziej rozmyty w porównaniu z pikiem składnika o niższej temperaturze<br />
wrzenia.<br />
7
W niniejszym artykule opisano dozownik do chromatografii, w którym<br />
do odparowania ciekłej próbki wykorzystuje się energię światła laserowego.<br />
Zaletą tego rozwiązania jest natychmiastowe, krótkotrwałe odparowywanie<br />
próbki. Możliwa jest przy tym regulacja mocy światła laserowego i czasu nagrzewania<br />
próbki w trakcie odparowywania, tak, aby uzyskać wąski prostokątny<br />
kształt impulsu odparowywanej próbki. Dozownik ten przeznaczony<br />
głownie do dozowania próbek o wysokich temperaturach wrzenia do kolumn<br />
pakowanych [1,2].<br />
DOZOWNIK PRÓBEK O WYSOKIEJ TEMPERATURZE WRZENIA<br />
DO KOLUMN PAKOWANYCH<br />
Dozownik ma kształt walca (rys. 1), jego korpus 1 jest wykonany ze<br />
stali kwasoodpornej. Wewnątrz korpusu znajduje się cylindryczna ogrzewana<br />
komora 2. Komorę 2 od góry zamyka pokrywa 3, w której umieszczono<br />
kwarcową szybkę 4, przez którą do jej wnętrza przechodzi promień światła<br />
laserowego 5. Do komory 2 jest doprowadzany gaz nośny przez wlot górny<br />
6 lub wlot dolny 7. Gaz nośny przez przyłącze 8 wpływa do kolumny chromatograficznej.<br />
Wlot dolny 7 służy do zasilania kolumny chromatograficznej<br />
gazem nośnym z pominięciem komory 2 dozownika. Wlot górny 6 służy do<br />
zasilania gazem nośnym komory 2 poprzez dysze 9 umieszczone w pierścieniu,<br />
który znajduje się w górnej części komory 2. Dysze rozdzielają<br />
strumień gazu nośnego na kilka strumieni, co ułatwia tworzenie się laminarnego<br />
przepływu gazu nośnego w całym przekroju komory 2 niezależnie od<br />
szybkości przepływu i ciśnienia gazu nośnego. Dzięki temu unika się zawirowań<br />
i „martwych stref”, co mogłoby niekorzystnie wpływać na kształt pasma<br />
początkowego wprowadzanej próbki.<br />
9<br />
4<br />
5<br />
2<br />
3<br />
12<br />
6<br />
10<br />
11<br />
14<br />
13<br />
7<br />
8<br />
15<br />
1<br />
Rys. 1. Dozownik próbek o wysokiej temperaturze<br />
wrzenia do kolumn pakowanych:<br />
1 – korpus, 2 – komora, 3 – pokrywa,<br />
4 – szybka kwarcowa, 5 – promień światła<br />
laserowego, 6 – wlot górny, 7 – wlot dolny,<br />
8 - przyłącze kolumny chromatograficznej,<br />
9 – dysze w pierścieniu, 10 – pojemnik<br />
próbki, 11 – śruba regulacyjna, 12 – membrana,<br />
13 – oprawa, 14 – nakrętka,<br />
15 – grzałka elektryczna<br />
8
W komorze 2 znajduje się pojemnik próbki 10, który jest umieszczony<br />
na osi promienia światła laserowego. Regulacji położenia pojemnika próbki<br />
10 na osi promienia światła laserowego dokonuje się za pomocą mikrometrycznej<br />
śruby regulacyjnej 11. Przekłuwając igłą mikrostrzykawki membranę<br />
12 z gumy silikonowej umieszczonej w oprawie 13 z nakrętką 14 wprowadza<br />
się próbkę cieczy do pojemnika próbki 10. Oprawa 13 i nakrętka 14 mają radiatory,<br />
aby chronić membranę 12 przed nadmierną temperaturą. Korpus<br />
dozownika 1 jest ogrzewany i termostatowany grzałką elektryczną 15. Pojemnik<br />
próbki 10 znajduje się na osi wylotu kanalika, przez który przechodzi<br />
igła mikrostrzykawki po przekłuciu membrany dozownika. Wprowadzana igła<br />
przechodzi przez boczny otwór 16 (rys. 2) w pojemniku próbki 10 i opiera się<br />
o przeciwległą ściankę. Wówczas można wstrzyknąć próbkę cieczy do zagłębienia<br />
17 w pojemniku próbki 10. Takie rozwiązanie zapewnia prawidłowe<br />
napełnianie pojemnika próbki 10 i chroni wlot kolumny chromatograficznej<br />
przed przypadkowym skapnięciem ciekłej próbki. Zastosowanie otworu 16<br />
na igłę mikrostrzykawki z boku pojemnika próbki 10 ułatwia odtwarzalność<br />
wprowadzania próbki do pojemnika w trakcie wykonywania wielokrotnych<br />
dozowań podczas rutynowych analiz.<br />
16 17<br />
11<br />
10<br />
18<br />
Rys. 2. Układ pojemnika próbki:10 – pojemnik próbki, 11 – śruba regulacyjna, 16 – otwór doprowadzenia<br />
igły mikrostrzykawki, 17 – zagłębienie, 18 – złącze termopary<br />
Na dnie zagłębienia 17 znajduje się złącze termopary 18. Termopara<br />
służy do kontroli temperatury próbki w trakcie jej odparowywania promieniem<br />
światła laserowego. Możliwe jest wykonanie wstępnej charakterystyki zależności<br />
temperatury nagrzewania pojemnika próbki 10 od mocy wiązki laserowej<br />
i czasu naświetlania. Umieszczenie termopary 18 na dnie pojemnika<br />
próbki 10 pozwala precyzyjnie mierzyć temperaturę w punkcie odparowywania<br />
próbki, dzięki czemu można uniknąć silnego przegrzania, które może<br />
doprowadzić do rozkładu termicznego jej składników.<br />
Na rys. 3 przedstawiono schemat podłączenia dozownika z chromatografem<br />
gazowym. W trakcie wprowadzania mikrostrzykawką próbki cieczy<br />
do dozownika gaz nośny, którego wielkość strumienia reguluje się za pomocą<br />
zaworu iglicowego 19, przepływa przez otwarty zawór elektromagnetyczny<br />
20 do wlotu 7 dozownika i wypływa przez przyłącze 8 do kolumny chromatograficznej.<br />
Równocześnie jest zamknięty zawór elektromagnetyczny 21<br />
i gaz nośny omija komorę 2. Zastosowanie dwóch torów gazowych pozwala<br />
na wstrzymanie przepływu gazu przez komorę 2 dozownika w trakcie wprowadzania<br />
próbki do pojemnika 10. Dzięki temu unika się porywania niewiel-<br />
9
kich ilości par (szczególnie składników analizowanej mieszaniny o niższych<br />
temperaturach wrzenia) przez gaz nośny przed rozpoczęciem właściwego<br />
procesu odparowywania. Po wprowadzeniu próbki do pojemnika 10, zamyka<br />
się zawór elektromagnetyczny 20 i otwiera się zawór elektromagnetyczny<br />
21. Wówczas gaz nośny zaczyna przypływać przez komorę 2. W tym momencie<br />
włącza się laser 23 i promień światła laserowego pada na zagłębienie<br />
17 w pojemniku próbki 10 i znajdująca się w zagłębieniu 17 ciecz zostaje<br />
gwałtownie odparowana.<br />
Temperaturę procesu odparowywania można odczytać na mierniku<br />
temperatury 24, który jest podłączony do termopary 18. Regulując moc promienia<br />
laserowego, można kontrolować temperaturę, w jakiej odbywa się<br />
odparowywanie próbki cieczy. W ten sposób można uzyskać dużą szybkość<br />
odparowywania próbki, a jednocześnie uniknąć jej silnego przegrzania, które<br />
mogłoby być przyczyną termicznego rozkładu składników próbki. Pary próbki<br />
wraz z gazem nośnym przepływają do kolumny chromatograficznej.<br />
22<br />
23<br />
21<br />
6<br />
2<br />
10<br />
18<br />
17<br />
24<br />
20<br />
7<br />
19<br />
8<br />
Rys. 3. Schemat połączeń gazowych dozownika do kolumn pakowanych: 2 – komora, 6 – wlot<br />
górny, 7 – wlot dolny, 8 – przyłącze kolumny chromatograficznej, 10 – pojemnik próbki,<br />
17 – zagłębienie, 18 – czujnik temperatury, 19 – zawór iglicowy, 20, 21, 22 – zawór elektromagnetyczny,<br />
23 – laser, 24 – miernik temperatury<br />
Możliwe jest także usuwanie rozpuszczalnika z wprowadzonej próbki<br />
do pojemnika 10 przez zamknięcie zaworu elektromagnetycznego 21<br />
i otwarcie zaworów elektromagnetycznych 20 i 22. Wówczas gaz nośny za-<br />
10
czyna przypływać przez komorę 2 i wypływa z parami rozpuszczalnika przez<br />
zawór elektromagnetyczny 22 na zewnątrz dozownika.<br />
DOZOWNIK LASEROWY A DOZOWNIK KLASYCZNY<br />
W opisywanym dozowniku laserowym zastosowano laser argonowy<br />
firmy Spectra Physics o ciągłej lub impulsowej oraz o regulowanej długości<br />
i mocy wiązki światła. Działanie tego dozownika porównano ze zwykłym dozownikiem<br />
chromatografu gazowego Chrom 5.<br />
2<br />
napięcie [mV]<br />
1<br />
0 2 4 6 8 10<br />
czas [min]<br />
Rys. 4. Porównanie kształtu piku. Kolumna 0,5 m, średnica wewnętrzna 2 mm wypełniona granulkami<br />
szklanymi 60/80 mesh, temperatura kolumny 280 0 C, detektor (FID) 280 0 C, 0,3 μl oleju<br />
parafinowego. 1 – pik otrzymany za pomocą dozownika klasycznego, temperatura dozownika<br />
280 0 C, 2 – pik otrzymany za pomocą dozownika - laser argonowy λ=514,5 nm, 5W<br />
Na rysunku 4 przedstawiono przykładowe kształty pików chromatograficznych<br />
otrzymanych po dozowaniu próbki oleju parafinowego do dozownika<br />
klasycznego i laserowego w tych samych warunkach. Pik otrzymany z dozownika<br />
laserowego jest mniej rozmyty w porównaniu z pikiem otrzymanym<br />
przy użyciu dozownika klasycznego. Obliczony za pomocą programu Origin<br />
[3] narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika laserowego wynosi<br />
0,07 mV/s, a narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika klasycznego<br />
0,3 mV/s.<br />
11
1<br />
2<br />
3<br />
A<br />
2<br />
3<br />
B<br />
napięcie [mV]<br />
napięcie [mV]<br />
0 1 2 3 4 5 6<br />
czas [min]<br />
0 1 2 3 4 5 6<br />
czas [min]<br />
Rys. 5. Chromatogram fenantrenu (2) i antracenu (3) w toluenie (1). Kolumna 1,6% SP-301 na<br />
Supelcoporcie 100/200 o długości 2,5 m i średnicy wewnętrznej 3 mm. Temperatura kolumny<br />
i detektora (FID) 275 o C, gaz nośny azot 20 cm 3 /min. A – dozownik klasyczny temperatura<br />
260 o C, B – dozownik - laser argonowy 514,5 nm, 10W<br />
Rysunek 5 przedstawia dwa chromatogramy fenantrenu i antracenu<br />
w toluenie. Chromatogram otrzymany przy użyciu dozownika klasycznego<br />
(rys. 5A) przedstawia nakładanie się piku rozpuszczalnika na piki fenantrenu<br />
i antracenu. Natomiast dozownik laserowy umożliwia wstępne odparowanie<br />
toluenu z dozownika a następnie szybkie odparowanie fenantrenu i antracenu<br />
za pomocą wiązki laserowej do kolumny chromatograficznej. W wyniku<br />
tego otrzymane WWA są lepiej rozdzielone.<br />
A<br />
B<br />
1<br />
2<br />
napięcie [mV]<br />
napięcie [mV]<br />
3<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />
czas [min]<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />
czas [min]<br />
12
4<br />
C<br />
napięcie [mV]<br />
3<br />
Rys. 6. Chromatogramy metanolu z zastosowaniem dozownika laserowego o różnych długościach<br />
fali i mocy wiązki. A – laser argonowy λ=514,5 nm, 5W, B - laser argonowy λ=351,5 nm,<br />
3W, C - laser argonowy λ=351,5 impuls 50 W. Kolumna chromatograficzna o długości 2,5 m<br />
i średnicy wewnętrznej 3 mm z Porapakiem Q 80/100 mesh, temperatura kolumny 160 o C,<br />
przepływ gazu nośnego (azot) 50 cm 3 /min, temperatura detektora (TCD) 160 o C. 1 – metanol,<br />
2 – metan, 3 – woda, 4 – wodór<br />
W zależności od użytej do odparowywania energii wiązki laserowej<br />
jest możliwa zmiana chemicznej postaci wprowadzanej próbki. Przedstawiono<br />
to na przykładzie chromatografowania metanolu. Dozowanie z użyciem<br />
niewielkiej energii wiązki laserowej metanolu do kolumny wypełnionej Porapakiem<br />
Q daje pojedynczy pik (rys. 6A). Zwiększenie energii wiązki sprawia,<br />
że następuje rozkład cząsteczki metanolu na metan i wodę i na chromatografie<br />
obserwuje się dwa piki (rys. 6B). Przy znacznym zwiększeniu energii<br />
wiązki, możliwy jest także rozkład metanu, na węgiel i wodór, i wówczas obserwuje<br />
się dwa piki wodoru i wody (rys. 6C). Węgiel pozostaje w dozowniku.<br />
WNIOSKI<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />
czas [min]<br />
1. Zastosowanie dozownika laserowego do kolumn pakowanych w chromatografii<br />
gazowej umożliwia zmniejszenie rozmycia pasma początkowego<br />
i pików składników dozowanej próbki.<br />
2. Dozownik laserowy pozwala wstępnie odparować rozpuszczalnik i następnie<br />
za pomocą wiązki laserowej odparować wysokowrzące składniki<br />
próbki.<br />
3. Stosowanie wiązki laserowej o zróżnicowanej energii pozwala nie tylko<br />
odparować próbkę, ale także rozkładać anality na części składowe. Takie<br />
postępowanie może być przydatne w chromatografii gazowej z detektorem<br />
masowym.<br />
13
LITERATURA<br />
1. P.M. Słomkiewicz, Dozownik do chromatografu gazowego, zwłaszcza<br />
do próbek o wysokiej temperaturze wrzenia, PL - 192882, (5 stycznia<br />
2007).<br />
2. P.M. Słomkiewicz, Z. Witkiewicz, Dozowniki laserowe w chromatografii<br />
gazowej, Aparatura Badawcza i Dydaktyczna, 11/4(2006)264 – 272.<br />
3. Origin User`s Manual, Microcal Software. Inc., Northampton MA, USA.<br />
14
Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Tomasz ZIELIŃSKI 1 ,<br />
Paweł ZARZYCKI 2<br />
1)<br />
Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska<br />
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce<br />
e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl<br />
2)<br />
Zakład Toksykologiii Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,<br />
Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 Koszalin<br />
ZASTOSOWANIE HPLC W BADANIACH<br />
CHOROBY PARKINSONA<br />
W pracy przedstawiono podstawowe informacje o chorobie Parkinsona. Omówiono<br />
zastosowanie HPLC w oznaczaniu profilu dziennego leków stosowanych w jej leczeniu,<br />
oznaczaniu całkowitego potencjału antyoksydacyjnego oraz ich korelacje z testem<br />
Webstera i natężeniem tremoru.<br />
PODSTAWOWE INFORMACJE O CHOROBIE PARKINSONA<br />
Pierwszy opis klinicznych objawów choroby Parkinsona (ChP) pochodzi<br />
z egipskich papirusów z XIII wieku p.n.e. W czasach nowożytnych chorobę<br />
ponownie opisał w 1817 roku brytyjski lekarza Johna Parkinsona w artykule<br />
An Essay on the Shaking Palsy.<br />
ChP spowodowana jest niewydolnością pozapiramidowego układu ruchowego.<br />
Głównym procesem patologicznym jest postępujące zwyrodnienie<br />
neuronów dopaminergicznych w warstwie zbitej istoty czarnej [1]. Podobnie<br />
do choroby Alzheimera należy do grupy chorób zwyrodnieniowych układu<br />
nerwowego. Ma charakter przewlekły, a jej objawy pogłębiają się wraz<br />
z rozwojem choroby. Na ChP choruje prawie 1,5% populacji powyżej 65 roku<br />
życia. Jest więc bardzo ważnym problemem nie tylko medycznym, ale<br />
i społecznym [1]. Dotyka ona w podobnym stopniu różnych ludzi, bez względu<br />
na ich płeć, zamożność, pochodzenie społeczne i geograficzne. Klinicznie<br />
objawia się ona spowolnieniem ruchowym, sztywnością mięśni i drżeniem<br />
spoczynkowym.<br />
Udział wolnych rodników w ChP nie jest całkowicie wyjaśniony. Istota<br />
czarna ma duże tempo metabolizmu, dlatego też charakteryzuje się wysoką<br />
zawartością utleniaczy przy jednoczesnym niskim stężeniem antyoksydantów.<br />
Nawet niewielki stres oksydacyjny może z łatwością zniszczyć jej naturalną<br />
obronę powodując powstanie wolnych rodników tlenowych, które ze<br />
względu na przeważające stężenie utleniaczy utrzymują powstający stres,<br />
a także zapoczątkowują apoptozę neuronów dopaminergicznych przejawiającą<br />
się obniżoną zawartością cytochromu c w mitochondriach komórek nerwowych<br />
zaatakowanych chorobą. Zmniejsza to aktywność mitochondrialne-<br />
15
go kompleksu I. Powoduje to zmniejszenie ilości wytwarzanej energii, obniżenie<br />
ilości stężenia antyutleniaczy oraz wzrost tempa powstawania wolnych<br />
rodników i nasilenie procesów utlenienia. O tym, że w istocie czarnej w ogóle<br />
dochodzi do stresu oksydacyjnego świadczą zwiększone ilości dialdehydu<br />
malonowego będącego końcowym produktem peroksydacji lipidów, a także<br />
zmniejszenie ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych [2].<br />
Osobnym zagadnieniem są zmiany stężenia zarówno rodników jak<br />
i antyoksydantów we krwi chorego. Spowodowane są one z jednej strony<br />
zwiększonym metabolizmem, spowodowanym m.in. charakterystycznym<br />
drżeniem kończyn, przyczyniającym się do produkcji rodników. Z drugiej zaś<br />
podawane pacjentom jako leki aminy katecholowe są antyoksydantami.<br />
Zniszczenie komórek nerwowych istoty czarnej zmniejsza wydzielanie<br />
dopaminy, neuroprzekaźnika chemicznego odpowiedzialnego za transmisję<br />
sygnałów pomiędzy istotą czarną, a ciałem prążkowanym w kresomózgowiu.<br />
Sygnały przekazywane z istoty czarnej są odpowiedzialne za zależne od naszej<br />
woli ruchy, które dzięki prawidłowemu przekaźnictwu są płynne i przebiegają<br />
bez zakłóceń. Jeśli zniszczeniu ulegnie ponad 80% komórek produkujących<br />
dopaminę, zostaje utracona zdolność kontroli nad takim typem<br />
ruchów. Przyczyna zwyrodnienia komórek istoty czarnej nie jest dokładnie<br />
znana. Jedną z hipotez jest mechanizm wolnorodnikowy. Inne mówią o toksynach,<br />
czynnikach genetycznych (szczególnie mitochondrialnych) czy ekscytotoksyczności<br />
(nadprodukcji dopaminy).<br />
Dominującym, chociaż nie jedynym zaburzeniem w chorobie Parkinsona<br />
jest przedwczesne, postępujące zwyrodnienie neuronów dopaminoergicznych.<br />
Wynikiem tego jest obniżenie stężenia dopaminy i jej metabolitów,<br />
a także spadek aktywności enzymów związanych z jej syntezą. Opracowane<br />
zostały trzy główne strategie w walce z tą chorobą (i) uzupełnić niedobór dopaminy,<br />
(ii) zahamować proces jej rozkładu w mózgu oraz (iii) dostarczyć organizmowi<br />
substancje, które działają podobnie do dopaminy.<br />
Najprostszym sposobem leczenia tego schorzenia byłoby zastosowanie<br />
pierwszej z wymienionych strategii, czyli podanie dopaminy. Dopamina<br />
jednakże nie przekracza bariery krew – mózg. Z tego względu najprostszym<br />
obecnie sposobem leczenia tej choroby jest podawanie bezpośredniego jej<br />
prekursora – L-dopy (lewodopy), zdolnej przechodzić przez barierę krew –<br />
mózg.<br />
Wprawdzie wprowadzenie L-dopy było przełomem w walce z chorobą<br />
Parkinsona jednakże, niestety nie zapobiega ona obumieraniu komórek produkujących<br />
dopaminę. Z tego względu próbuje się zastosować drugą z wymienionych<br />
wcześniej strategii – zahamować procesy przemiany dopaminy<br />
w inne substancje, stosując np. inhibitor enzymu MAO-B (monoaminooksydazy<br />
B) odpowiedzialnego za rozkład dopaminy (rys. 1). Stymulację układu<br />
dopaminoergicznego można uzyskać poprzez zwiększenie produkcji endogennej<br />
dopaminy w układzie nigro-strialnym przez zablokowanie jej metabolizmu<br />
lub przez bezpośrednią stymulację receptora dopaminoergicznego [3].<br />
16
Rys. 1. Metabolizm dopaminy<br />
L-dopa po raz pierwszy została zastosowana w leczeniu choroby Parkinsona<br />
na początku lat 60. Dziś L-dopa jest uznawana jako „złoty standard”<br />
leczenia [4]. Jest najsilniejszym lekiem przeciwparkinsonowskim, jedynym,<br />
który jest skuteczny w każdym stadium zaawansowania choroby. Pod<br />
względem chemicznym jest to lewoskrętna 3,4-dihydroksy-L-fenyloalanina,<br />
bezpośredni prekursor dopaminy przechodzący przez barierę krew-mózg.<br />
Powstaje ona w ustroju z egzogennej tyrozyny (przy udziale hydroksylazy tyrozynowej)<br />
i ulega przemianie do dopaminy przy pomocy dekarboksylazy<br />
aromatycznych aminokwasów (rys. 1).<br />
Pod wpływem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) L-dopa metabolizowana<br />
jest do 3-metoksy-DOPA (3-OMD) (na rys. 1 etap ten został pominięty).<br />
Dopamina natomiast może być metabolizowana zgodnie z trzema<br />
szlakami (rys. 1). Pierwszy przebiega przez kwas dihydroksyfenylooctowy<br />
(DOPAC), katalizowany przez monoaminooksydazę (MAO), do kwasu homowanilinowego<br />
(HVA) katalizowanego przez COMT. W drugim natomiast<br />
pod wpływem COMT dopamina jest metabolizowana do 3-metoksytyraminy<br />
(3-MT), a następnie również do HVA pod wpływem MAO. Z wyjątkiem<br />
dopaminy, pozostałe metabolity L-dopy są farmakologicznie nieaktywne.<br />
Oba szlaki metabolizmu występują zarówno w narządach obwodowych,<br />
jak i w mózgu. Trzeci szlak prowadzi do powstania hormonów i dlatego nie<br />
będzie szerzej omawiany.<br />
Mimo wieloletniego już stosowania L-dopy mechanizm jej działania<br />
budzi wiele niejasności. Według klasycznej hipotezy egzogenna L-dopa<br />
podana doustnie zostaje wchłonięta w jelicie cienkim i poprzez system<br />
transportu dużych aminokwasów (LNAA) szybko trafia do innych tkanek<br />
i przekracza barierę krew – mózg, gdzie jest wychwytywana przez neurony<br />
17
dopaminoergiczne i tam poddawana działaniu dekarboksylazy aromatycznych<br />
aminokwasów i dopiero jako dopamina uwalniana do synapsy. Na obwodzie,<br />
a także w śluzówce przewodu pokarmowego L-dopa ulega także<br />
szybkiej dekarboksylacji. Dlatego też w narządach obwodowych powstają<br />
duże ilości dopaminy nieprzechodzącej do mózgu, a tylko niewielka ilość<br />
L-dopy (ok. 1-3%) przedostaje się przez barierę wykazując działanie terapeutyczne.<br />
Zależy to od wielu czynników m.in. od zawartości białka w diecie<br />
i czasu przejścia przez żołądek. Aby wyeliminować szybką zmianę L-dopa<br />
w dopaminę już w błonie śluzowej żołądka, a tym samym zwiększyć jej możliwość<br />
dotarcia do mózgu, doustne preparaty zawierają inhibitory obwodowej<br />
dekarboksylazy, karbidopę lub benserazyd. Pośrednio zwiększa to przenikanie<br />
L-dopy do mózgu i pozwala na znaczną redukcję dawki leku i jego<br />
obwodowe działanie niepożądane takie jak nudności, wymioty i spadki ciśnienia<br />
[3].<br />
Wprowadzenie L-dopy do lecznictwa spowodowało wyraźny spadek<br />
śmiertelności chorych. Dane epidemiologiczne sugerują, że chorzy z dobrze<br />
leczoną chorobą Parkinsona mają szansę żyć równie długo jak ich zdrowi<br />
rówieśnicy. Tłumaczy się ono zarówno zmniejszeniem śmiertelnych powikłań<br />
z unieruchomienia, jak i neuroprotekcyjnym działaniem L-dopy [5]. W ostatnich<br />
latach badania eksperymentalne zaczęły dostarczać jednak coraz więcej<br />
danych na to, że L-dopa może być toksyczna dla neuronów dopaminoergicznych.<br />
W skojarzeniu z wolnorodnikową hipotezą etiopatogenezy choroby<br />
Parkinsona oraz z faktem występowania ruchowych objawów niepożądanych<br />
po długotrwałym podaniu L-dopa problem jej toksycznego działania<br />
wzbudza duży niepokój. Mimo intensywnie prowadzonych badań nadal nie<br />
udało się ostatecznie ustalić ani uzyskać jednoznacznych dowodów na to,<br />
że L-dopa w dawkach terapeutycznych powoduje śmierć komórek nerwowych.<br />
U chorych słabo reagujących na leczenie farmakologiczne stosuje się<br />
leczenie chirurgiczne. Czynione są także próby wszczepienia stymulatorów,<br />
które pozwolą modelować aktywność upośledzonych struktur mózgu.<br />
FARMAKOKINETYKA AMIN KATECHOLOWYCH<br />
0,8<br />
*<br />
c [μM]<br />
0,4<br />
#<br />
0<br />
0 1 2 3 4<br />
czas [h]<br />
Rys. 2. Zmiany stężenia L-dopy w surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona przed podaniem<br />
leku, po godzinie, dwóch, trzech i pięciu po podaniu preparatu.* p
Dopamina, której niedobór w części zbitej istoty czarnej jest czynnikiem<br />
wyzwalającym objawy choroby Parkinsona, należy do amin katecholowych.<br />
Ponieważ jednak nie przedostaje się przez barierę krew-mózg, dlatego<br />
też wprowadzona do krążenia obwodowego nie daje efektu<br />
terapeutycznego. Uzyskuje się go jednak poprzez podanie bezpośredniego<br />
prekursora dopaminy – L-dopy, która należy także do amin katecholowych.<br />
Przedostający się do mózgu tylko niewielki procent (1-3%) jest często niewystarczającą<br />
dawką do uzyskania efektów terapeutycznych. Z kolei zwiększenie<br />
podawanej dawki powoduje szereg niepożądanych objawów. Okazało<br />
się, że równoczesne podawanie L-dopy z inhibitorami dekarboksylazy<br />
aromatycznych aminokwasów, zwiększa jej biodostępność poprzez zmniejszenie<br />
jej obwodowego metabolizmu. L-dopę, jak i inne aminy katecholowe,<br />
można w surowicy oznaczać stosując HPLC z detekcją amperometryczną.<br />
Maksymalne stężenie L-dopy w surowicy występuje po ok. godzinie od chwili<br />
zażycia leku (rys. 2 [6]) [6-8]. Po 90 min. stężenie L-dopy w surowicy jest<br />
śladowe. W leczeniu niezwykle istotna jest więc optymalizacja dawki. Zarówno<br />
zbyt niskie jak i zbyt wysokie stężenia leku skazują pacjenta na niepowodzenie<br />
w trakcie terapii. Niskie stężenia mogą być następstwem zaburzeń<br />
wchłaniania L-dopy z przewodu pokarmowego, wysokie natomiast<br />
mogą osiągać wartości dawki toksycznej. Przeprowadzone badania potwierdzają,<br />
że maksymalne L-dopy stężenie występuje po około godziny od zażycia<br />
preparatu. Zmiany stężenia L-dopy po godzinie, dwóch, trzech i pięciu<br />
w stosunku do godziny zerowej są statystycznie znamienne. Zmiany stężenia<br />
L-dopy powinny mieć odzwierciedlenie w zmniejszeniu drżenia, głównego<br />
objawu parkinsonizmu, a także na poprawę parametrów fizjologicznych<br />
określanych za pomocą testu Webstera. Maksymalne stężenie karbidopy<br />
(rys. 3 [6]) występuje także po godzinie od podania preparatu, po czym<br />
zmniejsza się, ale po trzeciej godzinie ponownie wzrasta. Pomimo podobnej<br />
dynamiki współczynnik korelacji pomiędzy karbidopą, a grupą nierozdzielonych<br />
reduktorów jest bardzo niski.<br />
9<br />
8<br />
c [μM] 7<br />
6<br />
5<br />
0 1 2 3 5<br />
t [h]<br />
Rys. 3. Farmakodynamika karbidopy. Zmiany stężenia karbidopy w surowicy pacjentów z chorobą<br />
Parkinsona. Pozostałe warunki jak na rys. 2. * p
WŁASNOŚCI ANTYOKSYDACYJNE AMIN KATECHOLOWYCH<br />
W literaturze można znaleźć sprzeczne informacje na temat dopaminy.<br />
Z jednej strony dopamina przyczynia się do stresu oksydacyjnego,<br />
z drugiej zaś ma właściwości antyoksydacyjne. Zarówno enzymatyczne utlenianie<br />
dopaminy przy udziale MAO B jak i jej samoutlenianie prowadzą do<br />
powstania nadtlenku wodoru, będącego źródłem najbardziej reaktywnego<br />
wolnego rodnika – hydroksylowego. Tak więc, metabolizm dopaminy prowadzi<br />
do powstania uszkodzeń w komórkach nerwowych oraz ich śmierci<br />
w procesie apoptozy. System dopaminowy broni się przed skutkami deficytu<br />
neuromediatora zwiększając jego metabolizm. Przeprowadzone pośmiertnie<br />
badania w mózgach parkinsoników wykazały specyficzne, wielokrotne nasilenie<br />
metabolizmu w strukturach układu pozapiramidowego. Zwiększony metabolizm<br />
dopaminy, powoduje zwiększoną produkcję nadtlenku wodoru<br />
i rodnika hydoksylowego. Zwiększone uwalnianie, wychwyt i presynaptyczny<br />
metabolizm dopaminy może przyczyniać się do postępującej destrukcji neuronów<br />
obserwowanej w chorobie Parkinsona. Powstający nadmiar rodników<br />
jest przyczyną wzmożonej peroksydacji lipidów, co w konsekwencji prowadzi<br />
do indukcji procesu apoptozy. Podobną rolę pełnią produkty metabolizmu<br />
dopaminy (np.: 6-hydroksydopamina).<br />
Rys. 4. Anty- i prooksydacyjne właściwości dopaminy w stosunku do rodników hydroksylowych<br />
Istnieje kilka mechanizmów, które z jednej strony nadają dopaminie<br />
właściwości prooksydacyjne: zdolność redukcji żelaza (III) do żelaza (II)<br />
i samoutlenianie dopaminy do pochodnej chinonowej. Z drugiej zaś strony<br />
dopamina wykazuje właściwości antyoksydacyjne dzięki obecności grupy<br />
20
katecholowej oraz kompleksowaniu żelaza (II), uniemożliwiającemu zajście<br />
reakcji Fentona.<br />
Stosując chromatograficzną metodę oznaczania całkowitego potencjału<br />
antyoksydacyjnego (CPA) przebadano własności dopaminy w stosunku<br />
do rodników hydroksylowych [6]. Rodniki hydroksylowe, które generowano<br />
w reakcji analogicznej do Fentona, pułapkowano kwasem p-hydroksybenzoesowym.<br />
Gdy do układu, zawierającego dopaminę, dodawano ADP<br />
(rys. 4B), który katalizuje reakcję redukując żelazo z +3 stopnia utlenienia na<br />
+2 pik kwasu 3,4-DHBA (którego wysokość świadczyła o właściwościach<br />
prooksydacyjnych dopaminy) był niższy w stosunku do kontroli (rys. 4A), która<br />
zawierała wodę zamiast dopaminy. Wynik ten był spowodowany tym, że<br />
gdy w układzie reakcyjnym znajdowała się, dopamina wygenerowane rodniki<br />
hydroksylowe reagowały zarówno z pHBA jak i dopaminą. Otrzymane wyniki<br />
sugerują, że dopamina jest słabym zmiataczem rodników hydroksylowych.<br />
Brak ADP w układzie powodował, że pik chromatograficzny pochodzący od<br />
3,4-DHBA był znacznie niższy niż w obecności ADP (rys. 4C). Oznacza to,<br />
że reduktor w mieszaninie jest niezbędny, aby stale zapewniona była obecność<br />
żelaza (II). W końcu, gdy do układu zawierającego dopaminę nie dodano<br />
ADP wielkość piku 3,4-DHBA była większa niż w układzie bez ADP<br />
i bez dopaminy (rys. 4D). Oznacza to, że dopamina przejęła rolę reduktora<br />
Fe 3+ do Fe 2+ . Doświadczenie to potwierdziło sugestie, że w zależności od<br />
warunków dopamina może z antyoksydanta stać się oksydantem (rys. 5).<br />
Ponadto metoda ta pozwoliła ustalić jeden z prawdopodobnie kilku istniejących<br />
mechanizmów prooksydacyjnego działania dopaminy.<br />
40<br />
30<br />
((–) ADP<br />
(+) ADP<br />
h [nA] 20<br />
10<br />
0<br />
0 50 100 150 200<br />
C [μM]<br />
Rys. 5. Wpływ stężenia dopaminy na<br />
zmiany wysokości pików chromatograficznych<br />
3,4-DHBA. Zmniejszenie wysokości<br />
oznacza antyoksydacyjne działanie<br />
badanego związku<br />
21
Autooksydacja amin katecholowych może zachodzić nie tylko pod<br />
wpływem enzymów czy jonów metali, ale także pod wpływem tlenu w powietrzu.<br />
Okazało się, że z amin katecholowych obecnych w lekach antyparkinsonowskich<br />
najszybciej samoutlenianiu ulegał benserazyd, najwolniej zaś<br />
L-dopa (rys. 6). Oznacza to, że za zmianę barwy rozpuszczonego w wodzie<br />
leku odpowiada samoutlenianie benserazydu (inhibitora), zaś spadek stężenia<br />
substancji czynnej w postaci L-dopy jest nieznaczny.<br />
Rys. 6. Zmiany stężenia amin katecholowych w zależności od czasu ich przechowywania<br />
w temp. 25ºC<br />
HIPERMETABOLIZM W CHOROBIE PARKINSONA, TREMOR<br />
I JEGO POMIAR<br />
Drżenia są najbardziej istotnym elementem symptomatologii i diagnostyki<br />
wielu chorób układu pozapiramidowego (w tym również parkinsonizmu<br />
i choroby Parkinsona). Wykorzystywane są zarówno w rozpoznawaniu wielu<br />
chorób, dla których drżenie jest objawem typowym, jak i w diagnostyce różnicowej,<br />
w której badane są charakterystyki różnych rodzajów drgań. Warunkiem<br />
szerszego ich wykorzystania jest udoskonalenie metod pomiaru odpowiednich<br />
charakterystyk, powiązanie wyników ich pomiaru z konkretnymi<br />
jednostkami chorobowymi, na podstawie uzyskanych rozkładów prawdopodobieństwa,<br />
a następnie przypisanie im odpowiednich procedur terapeutycznych.<br />
Ze względu na coraz częstsze występowania schorzeń układu pozapiramidowego<br />
wydaje się to bardzo istotne. Oryginalne urządzenie tego<br />
22
typu skonstruowano w Instytucie Elektroniki WAT we współpracy z Kliniką<br />
Neurologii CSK WAM. Pozwala ono na podniesienie efektywności diagnozy<br />
schorzenia, przyspieszenie rozpoznania, a więc i wcześniejsze rozpoczęcie<br />
leczenia. Podnosi to standard życia jednostek i zmniejsza całościowe koszty<br />
leczenia populacji.<br />
Przy nadmiernych wydatkach energetycznych w organizmie następuje<br />
szereg zmian metabolicznych, wśród nich niedostateczna podaż glukozy<br />
w mięśniach i konieczność glukoneogenezy. Zjawiska te prowadzą do utleniania<br />
aminokwasów i nasilenia zużycia tlenu [9]. Objawy wyniszczenia i wychudzenia<br />
ciała – typowe dla parkinsoników, są bezpośrednimi dowodami<br />
długotrwałego występowania u chorych hipermetabolizmu prowadzącego do<br />
ujemnego bilansu energetycznego. Wartość energetyczna spożywanej diety<br />
nie pokrywa wówczas w pełni wydatków energetycznych, w wyniku, czego<br />
początkowo spalany jest tłuszcz zapasowy, a następnie białka mięśniowe.<br />
Zwiększony wydatek energetyczny powoduje również uszkodzenie układu<br />
dopaminoergicznego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) powodujące<br />
uogólnione zaburzenia metabolizmu energetycznego ustroju. Parkinsonicy<br />
często wykazują hypertermię i znaczną potliwość. Przyczyną tego może być<br />
zablokowanie ośrodkowych receptorów dopaminoergicznych, a konsekwencją<br />
dodatkowy wydatek energetyczny [10]. Drżenie (tremor) może mieć charakter<br />
fizjologiczny, stanowiąc przejaw działania układu pozapiramidowego,<br />
który jest najlepiej wykształconym układem generowania ruchów mimowolnych<br />
w okresie noworodkowym i niemowlęcym, a także odruchów bardziej<br />
złożonych. Mogą być także przejawem patologicznym i być skutkiem nieprawidłowych<br />
impulsów z jądra czerwiennego i wzgórzomózgowia, jak<br />
w chorobie Parkinsona [11-13].<br />
Drżenia możemy charakteryzować za pomocą rozmaitych parametrów:<br />
lokalizacji, regularności występowania, stopnia nasilenia, wpływu<br />
czynników wewnętrznych, wpływu czynników środowiskowych, częstotliwości,<br />
amplitudy, energii całkowitej czy widma. Ostatnie cztery parametry są<br />
mierzalne w sposób obiektywny. Ich wartości są powiązane z wymienionymi<br />
wcześniej czynnikami. Lokalizacja drżenia ma oczywisty wpływ na amplitudę.<br />
Części ciała odleglejsze od jego osi mają większą amplitudę niż części<br />
ciała bliskie osi. Z kolei podparcie (a więc, fizycznie rzecz biorąc, przesunięcie<br />
osi ruchu w kierunku obwodowym) zmniejsza amplitudę drżenia, o ile nie<br />
wiąże się z powstaniem dodatkowych napięć spowodowanych wymuszonym<br />
(czyli nie fizjologicznym) ułożeniem. Regularność i częstość występowania<br />
wiążą się z amplitudą i energią drżenia. Włókno mięśniowe po wykonaniu<br />
ok. 80 drgań traci większość lub nawet całość ATP i wskutek tego nie może<br />
przez pewien czas wykonywać ruchów. Tak więc regularność i duża częstotliwość<br />
drżeń powoduje, przynajmniej okresowo, spadek amplitudy i energii<br />
sygnału. Nasilenie drżenia jest niespecyficznym wskaźnikiem obejmującym<br />
takie jego składowe jak lokalizacja, regularność, częstotliwość i charakterystyka<br />
widmowa. Jego stosowanie jest związane z brakiem możliwości dokładnego<br />
pomiary pewnych charakterystyk obiektywnych; wydaje się, że<br />
średnia energia na ustaloną jednostkę czasu (być może wraz z charaktery-<br />
23
styką amplitudową) byłaby rzetelnym i wystarczającym miernikiem tego<br />
wskaźnika. Czynniki wewnętrzne i zewnętrzne mogą w rozmaity sposób<br />
wpływać na mierzalne parametry drżenia. Mogą je także wywoływać (drżenie<br />
spowodowane chłodem, tzw. dreszcze) lub znosić (ustępowanie u alkoholika<br />
drżenia po wypisu alkoholu). Mogą także modyfikować jego charakterystyki.<br />
Z kolei oczywisty jest wpływ czynników wewnętrznych na<br />
występowanie i intensywność drżeń. Łączny wpływ tych czynników na obraz<br />
drżeń jest złożony i niejednoznaczny. W zakresie mierzalnych charakterystyk<br />
drżenia najczęściej stosowaną jest częstotliwość. W zależności od niej<br />
dzielimy je na następujące pasma:<br />
- 1,5 – 3 Hz: pasmo drżeń ataktycznych, dotyczących głównie<br />
głowy i tułowia, spotykanych w chorobach demielizacyjnych;<br />
- 4 – 5 Hz: pasmo najbardziej nieokreślone, drżenia postawne<br />
o częstotliwości 4 Hz występują w przypadkach uszkodzenia<br />
móżdżku lub jądra czerwiennego, w przypadku drżenia spoczynkowego<br />
jest identyfikowane jako symptom choroby Parkinsona<br />
(drżenie postawne i spoczynkowe różni się amplitudą);<br />
- 6 Hz: pasmo drżeń głównie kończyn; a także drżeń zamiarowych<br />
i klonicznych (np. klonus typowy dla uszkodzeń drogi pozapiramidowej<br />
ma częstotliwość 6 Hz);<br />
- 8 – 12 Hz: pasmo drżeń o rozmaitej etiologii, tak fizjologicznej<br />
jak i patologicznej, np. z powodu udarów mózgu, zwyrodnienia<br />
oraz neuropatii obwodowych.<br />
Inną mierzalną charakterystyką drżenia jest amplituda. Jej pomiar, ze<br />
względu na jej niewielką wartość, zazwyczaj wymaga specjalnej aparatury<br />
pomiarowej i wobec tego nie jest ona dokładnie opisana w funkcji rodzaju<br />
schorzenia. Wykazuje się wyraźną zmiennością w zależności od pory dnia,<br />
wpływu stosowanych leków, pozycji ciała badanego, a także rozmaitych<br />
czynników wewnętrznych i zewnętrznych, w związku z czym jej opisowe<br />
określenie jest trudne.<br />
Drżenia samoistne (ET) są uważane za łagodną, skąpo-objawową<br />
chorobę układu nerwowego. Charakteryzują się częstotliwością 6 – 11 Hz<br />
i amplitudą 25 – 600 μV. Najczęściej spotykanym wyrazem tej choroby jest<br />
drżenie głosu. Mogą także występować równolegle inne objawy, jak drżenie<br />
rąk czy głowy, sporadycznie także innych części ciała. W zakresie drżeń patologicznych<br />
dzieli się je przede wszystkim w zależności od funkcji piramidowego<br />
układu ruchowego, odpowiedzialnego za ruchy dowolne. Funkcje te<br />
to spoczynek, pozycja wyjściowa do ruchu zamierzonego oraz ruch zamierzony<br />
(dowolny) odpowiednio do tego wyróżnia się (i) drżenie spoczynkowe,<br />
(ii) drżenie pozycyjne i (iii) drżenie zamiarowe. Drżenie spoczynkowe stało<br />
się podstawą definicji przez Jamesa Parkinsona choroby, nazywanej dzisiaj<br />
jego nazwiskiem. Polega na występowaniu w pozycji spoczynku drżeń,<br />
ustępujących po rozpoczęciu ruchów czynnych. Drżenia te występują wyłączne<br />
w trakcie czuwania i pojawiają się po przebudzeniu przy próbie wykonania<br />
pierwszych ruchów dowolnych. Ich amplituda zależy od stopnia zaawansowania<br />
choroby, a także od czynników zewnętrznych i wewnętrznych<br />
24
takich jak zmęczenie czy stres. Drżenie pozycyjne jest wywoływane ustawieniem<br />
kończyn, powodującym napinanie się pewnych grup mięśniowych.<br />
Może mieć charakter fizjologiczny, zwłaszcza u ludzi starszych lub w przypadku<br />
niewygodnej pozycji – głównie kończyn – występować jako tzw. drżenie<br />
pozycyjne fizjologiczne (u sportowców bywa obiektem odrębnych badań).<br />
Jest także typowe dla choroby Parkinsona i innych chorób<br />
zwyrodnieniowych. Występuje jednak również w przypadku zaburzeń o zupełnie<br />
odmiennej etiologii, jak alkoholowe zaburzenie pracy wątroby czy<br />
nadczynność tarczycy. Drżenie zamiarowe jest związane z wykonywaniem<br />
ruchów dowolnych. Odznacza się niską częstotliwością (3 – 5 Hz) oraz narastającą<br />
w czasie amplitudą. Jest wyraźniejsze w bliskości osi ciała. Oprócz<br />
choroby Parkinsona może wskazywać na wrodzone procesy zwyrodnieniowe,<br />
zatrucia metaboliczne, zaburzenia funkcji wątroby i nerek, stwardnienie<br />
rozsiane.<br />
Rys. 7. Sfygmograf Petersena oraz tambur Eschnera<br />
Ze względu na obiektywny, tj. mierzalny, charakter drżeń próby ich<br />
pomiaru miały miejsce już w XIX wieku [15]. Mimo niezbyt wyszukanej techniki<br />
prace takich uczonych jak Charcot i Vulpian we Francji czy Petersen,<br />
Dana i Eschner w Stanach Zjednoczonych pozwoliły na realizację pierwszych<br />
badań mierzalnych charakterystyk drżeń. Aparatami, stosowanymi<br />
pierwotnie w innych badaniach, a następnie do celu pomiarów drżeń były<br />
sfygmograf oraz tambur (rys. 7). Pierwszy z nich działał na zasadzie mechanicznej,<br />
drugi – pneumatycznej. Rozwój techniki spowodował, że obecnie<br />
zostały one zastąpione przez nowocześniejsze systemy elektroniczne,<br />
w pełni skomputeryzowane.<br />
Równolegle z pomiarami drżenia przeprowadza się także badania fizjologiczne<br />
chorych za pomocą testu Webstera. Składa się on z oceny<br />
10 parametrów fizjologicznych, np. trudności z poruszaniem się czy z mówieniem.<br />
Stosuje się przy tym czterostopniową całkowitoliczbową skalę porządkową,<br />
od 0 (brak objawów negatywnych) do 3 (bardzo duże ich nasilenie).<br />
Wynik testu jest sumą tych dziesięciu ocen. Ponieważ drżenie<br />
powiązane jest z wynikiem testu Webstera (im większe drżenia tym gorsze<br />
25
samopoczucie badanego, a więc wyższy wynik testu), dlatego też test ten<br />
wykonuje się kilka minut po pomiarze drżenia [16].<br />
Poprawa stanu pacjentów powinna się zatem wyrażać zarówno w poprawie<br />
parametrów fizjologicznych mierzonych testem Webstera jak<br />
i zmniejszoną mocą drżenia. W trakcie badań, prowadzonych w ramach wieloośrodkowego<br />
zespołu badawczego podjęliśmy próbę powiązania wymienionych<br />
wyżej płaszczyzn. Wykonywano równocześnie ilościowe badania<br />
stanu fizycznego pacjenta: klinicznie oceny drżenia, parametrów chemicznych:<br />
stężenie L-dopy w surowicy i pomiaru CPA oraz parametrów fizjologicznych<br />
(trudności w wykonywaniu podstawowych czynności, objawy patologiczne<br />
funkcjonowania organizmu itp.). Pomiary w zakresie wymienionych<br />
wskaźników były wykonywane równolegle (rys. 8). Pozwoliło to określić korelacje<br />
miedzy nimi. Wyniki eksperymentalnych badań dowodzą, że występuje<br />
efekt przesunięcia w czasie maksymalnego zmniejszenia mocy drżenia<br />
w odniesieniu do czasu uzyskania maksymalnego stężenia L-dopy w surowicy.<br />
Przesunięcie to wynika z faktu metabolizmu (absorbcji w układzie trawiennym,<br />
przekraczanie bariery krew- mózg i jej konwersji do dopaminy)<br />
L-dopy i upływu czasu, po którym L-dopa wywiera swój terapeutyczny efekt<br />
(rys. 2). W przypadku korelacji między testem Webstera, mocą drżenia<br />
i CPA badania wykazały, że podobnie jak w przypadku L-dopy występuje<br />
efekt przesunięcia między osiąganym maksymalnym CPA a poprawą parametrów<br />
fizjologicznych i mocą drżenia. Przesunięcie to spowodowane jest<br />
także metabolizmem L-dopy. Uzyskanie efektu terapeutycznego w postaci<br />
uzupełnienia deficytu dopaminy, poprawy samopoczucia pacjentów i zmniejszenie<br />
mocy drżenia jest wynikiem działania farmakologicznego L-dopy<br />
i wymaga upływu czasu. Nie stwierdzono natomiast korelacji pomiędzy CPA,<br />
a pozostałymi parametrami. Brak korelacji wynika z braku zależności pomiędzy<br />
zmianami CPA, a stężeniem L-dopy w surowicy.<br />
c L-dopy [μM]<br />
0,6<br />
0,5<br />
0,4<br />
0,3<br />
0,2<br />
0,1<br />
0<br />
0 1 2 3 4 5<br />
czas od podania L-dopy [h]<br />
0,0004<br />
0,0003<br />
0,0002<br />
0,0001<br />
0<br />
moc drżenia [W]<br />
Rys. 8. Dynamika zmian stężenia L-dopy i mocy drżenia u pacjentów z chorobą Parkinsona<br />
26
CPA SUROWICY KRWI PACJENTÓW Z CHOROBĄ PARKINSONA<br />
Całkowity Potencjał Antyoksydacyjny (CPA) jest miarą zdolności antyoksydacyjnych<br />
próbek biologicznych, w szczególności krwi. W literaturze<br />
[17] można znaleźć opisy oznaczania rodników hydroksylowych metodą pułapki<br />
spinowej polegającej na wprowadzeniu do materiału biologicznego<br />
względnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczania produktów<br />
ich reakcji z rodnikiem. Wygenerowane, w reakcji Fentona, rodniki hydroksylowe<br />
reagują zarówno ze związkami obecnymi we krwi jak i detektorem. Wysokość<br />
piku chromatograficznego produktu reakcji detektora z rodnikiem zależy<br />
od ilości antyoksydantów obecnych w badanym materiale i ich<br />
reaktywności. Miarą CPA jest zmniejszenie się wysokości tego piku pod<br />
wpływem próbki. W przypadku surowicy krwi parkinsoników obserwowano<br />
efekt odwrotny, wzrost wysokości tego piku (rys. 9). Uzyskane wyniki sugerują,<br />
że surowica posiada właściwości prooksydacyjne w stosunku do rodników<br />
hydroksylowych, czyli generuje rodniki. Największym CPP (Całkowity<br />
Potencjał Prooksydacyjny) cechowała się surowica pobrana od pacjentów<br />
po godzinie od podania L-dopy czyli w czasie gdy stężenie L-dopy w surowicy<br />
u pacjentów było największe (rys. 2). Prawdopodobnie istnieje kilka mechanizmów<br />
w wyniku których powstaje zwiększona ilość wolnych rodników.<br />
W surowicy występuje szereg niskocząsteczkowych antyoksydantów (np.<br />
kwas askorbinowy), które z jednej strony zmiatają wolne rodniki, z drugiej<br />
zaś mogą redukować żelazo z +3 na +2 stopień utlenienia, dzięki czemu zapewniony<br />
jest stały dopływ żelaza(II) (reakcja Fentona) i wzrost stężenia<br />
rodników. Powstałe w reakcji Fentona Fe(III) jest utleniaczem, mogącym<br />
zwiększać CPP. Podobnie zachowują się obecne w surowicy aminy katecholowe.<br />
Utlenianie ich prowadzi do powstania semichinonów, rodników<br />
peroksylowych i anionorodnika ponadtlenkowego.<br />
-0,1<br />
czas [h]<br />
0 1 2 3 5<br />
CPA[min]<br />
-0,3<br />
-0,5<br />
-0,7<br />
*<br />
Rys. 9. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodników<br />
hydroksylowych. Wykres przedstawia wartości średnie z pięciu pomiarów w trzech powtórzeniach<br />
± błąd standardowy (SEM), * p
W warunkach fizjologicznych żelazo i miedź występujące w surowicy<br />
związane są z białkami takimi jak celuroplazmina czy transferryna. W wyniku<br />
przebiegu procesów patologicznych jony tych metali zostają oddzielone od<br />
białek [17] i tym samym w wyniku reakcji Fentona i Habera – Weissa generować<br />
rodniki hydroksylowe. Istnieją sugestie, że stężnie rodników hydroksylowych<br />
w surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona jest znacznie wyższy<br />
niż u zdrowych ludzi. Prooksydacyjne właściwości surowicy pacjentów z choroba<br />
Parkinsona mogą mieć także inne podłoże. Sugeruje się [18], że obniżone<br />
stężenia ubichinonu, α-tokoferolu, askorbinianu i glutationu przyczynia<br />
się do pogłębienia istniejącego już stresu oksydacyjnego u chorych w wyniku<br />
zaburzeń równowagi pro- i antyoksydacyjnej. Dodatkowo sam metabolizm<br />
L-dopy przez enzym MAO-B prowadzi także do zwiększonej generacji<br />
reaktywnych form tlenu. Zwiększoną jej autooksydację w surowicy zaobserwowano<br />
u pacjentów u których stosowano monoterapię L-dopą, w stosunku<br />
do zdrowych ludzi i pacjentów u których L-dopa nie była zastosowana.<br />
Prawdopodobnie zwiększone stężenie L-dopy w surowicy było przyczyną<br />
wzmożonej jej autooksydacji, podczas której generowane są wolne rodniki.<br />
Prooksydacyjne właściwości mogą wynikać także z obecności w surowicy<br />
niezidentyfikowanych jeszcze prooksydantów generujących w pośredni sposób<br />
rodniki hydroksylowe [18-20]. Rolę nadmienionego, niezidentyfikowanego<br />
oksydanta może pełnić żelazo lub miedź.<br />
CPA[μMTroloks]<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
* *<br />
#<br />
0<br />
1 2 3 4 5<br />
czas [h]<br />
Rys. 10. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodników<br />
peroksylowych. .* p
mo wyższych stężeń w surowicy enzymów antyoksydacyjnych (SOD, katalaza)<br />
zaobserwowano wzrost stężenia produktów reakcji wolnorodnikowych,<br />
MDA/TBARS, i spadek wartości CPA. Potwierdza to hipotezę, że u pacjentów<br />
z chorobami neurodegeneracyjnymi deficyt enzymów zmiatających wolne<br />
rodniki w mózgu jest kompensowany zwiększonymi ich stężeniami w surowicy.<br />
Oznacza to, że u chorych system antyoksydacyjny nie działa tak<br />
sprawnie jak u zdrowych ludzi, a zwiększone stężenia enzymów w surowicy<br />
są jednym z etapów obrony organizmu przed powstającym stresem oksydacyjnym<br />
w mózgu. W wyniku wzmożonego stresu oksydacyjnego u chorych<br />
po pewnym czasie powstają mechanizmy adaptacyjne przeciwdziałające<br />
nadmiernemu powstawaniu rodników.<br />
Reasumując, CPA, odniesione do rodników peroksylowych (wyznaczony<br />
tradycyjną metodą fotometryczną), pacjentów z chorobą Parkinsona<br />
jest mniejszy niż u osób zdrowych. Z drugiej strony wyznaczony chromatograficznie<br />
CPA odniesiony do rodników hydroksylowych jest większy od grupy<br />
kontrolnej (podobny efekt zaobserwowano w stosunku do tlenku azotu).<br />
Oznacza to, że pomiary chromatograficzne dostarczają dodatkowych, istotnych<br />
informacji, pozwalających lepiej zrozumieć stres oksydacyjny, tym bardziej,<br />
że odnoszą się one do najbardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego.<br />
CPA odniesione do rodników peroksylowych zmieniało się (rys. 10)<br />
wprost proporcjonalnie do zmian karbidopy w surowicy (rys. 3). CPA odniesione<br />
do rodników hydroksylowych zmieniało się (rys. 9) odwrotnie proporcjonalnie<br />
do zmian L-dopy w surowicy (rys. 2).<br />
L-dopa<br />
karbidopa<br />
karbidowa<br />
białka<br />
antyoksydanty<br />
ty<br />
całkowity CPA<br />
CPA<br />
czas[h]<br />
400<br />
350<br />
300<br />
250<br />
200<br />
150<br />
100<br />
50<br />
0<br />
Rys. 11. CPA surowicy, obrazujące wpływ poszczególnych składników<br />
Pomiary chromatograficzne przydatne były również w interpretacji<br />
zmian wyznaczanego fotometrycznie CPA odniesionego do rodników peroksylowych<br />
(rys. 11). Pozwoliły one na wyznaczenie stężeń leków we krwi pacjentów.<br />
Po przemnożeniu tych stężeń przez odpowiadające im CPA można<br />
29
yło wyznaczyć udział składników surowicy w jej CPA (rys. 11). Okazało się,<br />
że maksymalne stężenie L-dopy w surowicy było zbyt niskie, aby mogło<br />
znacząco wpływać na zmiany CPA. Prawdopodobnie L-dopa wykazuje tylko<br />
efekt farmakologiczny, natomiast wpływ jej na zmiany CPA jest nieznaczny.<br />
Największy udział w CPA mają antyoksydanty niskocząsteczkowe (w tym<br />
kwas moczowy). CPA chorych był niższy od ludzi zdrowych głównie z powodu<br />
niższego CPA białek (rys. 12). Zmiany CPA skorelowane są ze zmianami<br />
stężeń L-dopy i tremoru (rys. 13).<br />
CPA [μ MTroloks]<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
CPA całkowity<br />
antyoksydanty<br />
białka<br />
chorzy<br />
zdrowi<br />
CPA<br />
Rys. 12. Porównanie udziału antyoksydantów i białek w całkowitym CPA, odniesionym do rodników<br />
peroksylowych, u ludzi zdrowych i parkinsoników leczonych substytucyjnie L-dopą, przed<br />
podaniem leku<br />
pacjenci<br />
380<br />
15<br />
CPA [μM<br />
[ MTroloks]<br />
]<br />
moc drżenia [μM]<br />
moc drżenia [ W]<br />
350<br />
320<br />
290<br />
260<br />
14<br />
13<br />
12<br />
Nw<br />
230<br />
0 1 2 3 4 5<br />
czas od podania L-dopy [h]<br />
11<br />
Rys. 13. Dynamika zmian CPA (•), wartości punktów w skali Webstera (•), mocy drżenia (▲)<br />
30
LITERATURA<br />
1. C. Courderot-masuyer, F. Dallozo, V. Maupoil, L. Rochette, Fundam.<br />
Clin. Pharmacol., 13(1999)535.<br />
2. F. Visioli, C. Galli, Anal. Biochem., 249(1997)244.<br />
3. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warszawa), 47(2002)399.<br />
4. D.R. Dufield, G.S. Wilson, R.S. Glass, C. Schoneich, J. Pharm. Sci.,<br />
93(2004)1122.<br />
5. T.W. Yu, C.N. Ong, Anal. Biochem., 275(1999)217.<br />
6. B.K. Głód, K. Stańczyk, Acta Chromatogr., 15(2005)276.<br />
7. T. Yakabe, H. Yoshida, H. Nohta, M. Yamaguchi, Anal. Sci.,<br />
18(2002)1375.<br />
8. K. Stańczyk, praca mag., SGGW 2004.<br />
9. G. Bartosz, M. Bartosz, Acta Biochim. Pol., 46(1999)23.<br />
10. I.N. Popov, G. Lewin, Free Radic. Biol. Med., 17(1991)267.<br />
11. B.A. Collingham, M.A. Barrand, J. Pharm. Pharmacol., 28(1976)356.<br />
12. U.S von Euler, Pharmacol. Rev., 6(1954)15.<br />
13. G.R. Kelman Applied Cardivascular Physiology, Butterworths, London<br />
1971.<br />
14. M. Jouvet, Science, 163(1969)32.<br />
15. A.M. Krustulovic, The current state of the art. in the analysis of catecholamines,<br />
Chemistry Deparment Manhattanville College Purchase, New<br />
York 1999.<br />
16. Y. Kondo, M. Ohnishi, M. Kawaguchi, J. Agr. Ford. Chem., 47(1999)1781.<br />
17. M.A. Raggi, V. Pucci, C. Sabbioni, S. Furlanetto, G. Gerra, J. Sep. Sci.,<br />
24(2001)275.<br />
18. B.K. Głód, P.R. Haddad, Czapski G.A., Trends Anal. Chem., 19(2000)492-<br />
-497.<br />
19. P. Kumarathasan, R. Vincent, J. Chromatogr. A, 987(2003)349.<br />
20. P.T. Kissinger, C.S. Bruntlett, R.E. Shoup, Life Sci., 28(1981)455.<br />
21. H. Wang, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.<br />
31
32
Monika ASZTEMBORSKA<br />
Instytut Chemii Fizycznej PAN<br />
ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa<br />
ZASTOSOWANIE METOD SEPARACYJNYCH<br />
W BADANIU ENANCJOMERYZACJI<br />
WPROWADZENIE<br />
Związki chiralne są w naturze bardzo powszechne. Najbardziej istotne<br />
dla życia biopolimery tj. białka i DNA są zbudowane z chiralnych aminokwasów<br />
i cukrów.<br />
Wiele innych substancji należących do grupy flawonoidów, alkaloidów,<br />
terpenoidów i steroidów jest związkami optycznie czynnymi. Co ciekawsze<br />
większość z tych naturalnych substancji jest biosyntezowana tylko w postaci<br />
jednej z dwu możliwych form. O takich związkach mówi się, że są homochiralne.<br />
Homochiralne są peptydy i DNA zbudowane z L-aminokwasów<br />
i D-cukrów. Flawanony syntezowane w świecie roślinnym są lewoskrętne.<br />
Taki wysoki stopień homochiralności w żywych organizmach jest entropowo<br />
niekorzystny. Proces racemizacji homochiralnej substancji prowadzi<br />
do wzrostu entropii systemu. Tak więc wraz ze śmiercią organizmu homochiralne<br />
substancje powinny racemizować powodując wzrost nieuporządkowania<br />
systemu.<br />
W zależności od struktury chiralnej biomolekuły proces racemizacji<br />
może być bardzo szybki jak w przypadku atropiny [1] lub wystarczająco powolny<br />
jak w przypadku kwasu aspartamowego [2] aby być użytecznym<br />
w wyznaczaniu wieku organizmów. Czasami jest też tak, że cząsteczka zostaje<br />
rozłożona lub zdegradowana zanim ulegnie racemizacji.<br />
Innym istotnym problemem związanym ze związkami chiralnymi jest<br />
fakt, że dwa enancjomery chiralnej substancji chociaż tak podobne pod<br />
względem budowy chemicznej mogą mieć drastycznie różną aktywność biologiczną.<br />
Nie jest to szczególnie dziwne gdy uświadomimy sobie, że organizmy<br />
żywe zbudowane z chiralnych białek i cukrów stanowią chiralne środowisko<br />
rozróżniające dwa enancjomery tej samej substancji. Szczególnie istotne jest<br />
to w przypadku leków. Znanych jest wiele chiralnych substancji farmakologicznych<br />
z których tylko jeden z enancjomerów ma właściwości lecznicze,<br />
drugi w najlepszym przypadku może być nieaktywny a w najgorszym może się<br />
okazać toksyczny. Np. atropina jest komercyjnie dostępna jako mieszanina<br />
racemiczna (DL-hioscyamina) jednakże tylko L-hioscyamina ma aktywność<br />
farmakologiczną. D-hioscyamina jest nieefektywna i powstaje jako produkt racemizacji<br />
podczas ekstrakcji L-hioscyaminy z surowców roślinnych.<br />
Znajomość stabilności konfiguracyjnej substancji staje się więc koniecznością<br />
gdy chodzi o rejestrację chiralnych leków. Instytucje rządowe<br />
33
dopuszczające leki jak np. FDA nie tylko kontrolują sprzedaż leków racemicznych<br />
ale wymagają jednoznacznych danych na temat konfiguracyjnej<br />
stabilności czystych enancjomerów. W konsekwencji producenci leków są<br />
zobowiązani do oszacowania stereochemicznej trwałości enancjomerów<br />
i zbadania ich potencjalnej podatności na konwersję.<br />
Z drugiej strony znajomość szybkości reakcji enancjomeryzacji substancji<br />
występujących naturalnie może być wykorzystana praktycznie do sprawdzania<br />
jakości, stopnia świeżości i zafałszowań produktów spożywczych.<br />
Stopień racemizacji aminokwasów w białkach zębów (głównie jest to<br />
kwas aspartamowy) jest np. wykorzystywany do oznaczenia wieku denata<br />
w naukach sądowych [3, 4]. Jest on również wykorzystywany w oznaczaniu<br />
wieku próbek archeologicznych i geochemicznych [5, 6]. Ma również zastosowanie<br />
w paleotermometrii [7].<br />
Znajomość barier racemizacji substancji chiralnych może więc być<br />
istotna z punktu widzenia zastosowań praktycznych.<br />
DEFINICJE<br />
Przez enancjomeryzację rozumiemy mikroskopowy proces odwracalnej<br />
interkonwersji enancjomerów.<br />
R<br />
k enant<br />
k enant<br />
Racemizacja to z kolei makroskopowy proces nieodwracalnej transformacji<br />
enancjomerycznie wzbogaconej lub czystej próbki do mieszaniny racemicznej.<br />
S<br />
R<br />
k rac<br />
rac<br />
k rac<br />
S<br />
Przy czym stała szybkości racemizacji jest dwukrotnie większa od stałej<br />
szybkości enancjomeryzacji (k enant =2k rac ). Można to wytłumaczyć w ten sposób,<br />
że na każdą cząsteczkę (-) utworzoną z cząsteczki (+) dwie molekuły<br />
ulegają racemizacji, jako, że utworzona w ten sposób cząsteczka (-) równoważy<br />
skręcalność optyczną innej nie przekształconej cząsteczki (+).<br />
Diastereomeryzacja to z kolei molekularny proces transformacji jednego diastereomeru<br />
w drugi, przy czym stałe szybkości diastereomeryzacji nie są<br />
sobie równe (k diastAB ≠k diastBA )<br />
Diast A<br />
k diastAB<br />
k diastBA<br />
Diast B<br />
Do badania kinetyki enancjomeryzacji i diastereomeryzacji substancji<br />
można stosować wiele różnych metod m.in. polarymetria, dichroizm kołowy<br />
34
(CD), dyspersja zdolności skręcającej (ORD), protonowy rezonans magnetyczny<br />
1 H-NMR [8].<br />
Wśród tych metod istotne miejsce zajmują metody chromatograficzne<br />
(wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia gazowa) oraz metody<br />
elektroforezy kapilarnej, które ogólnie można nazwać analitycznymi metodami<br />
separacyjnymi. Ze względu na pewne uproszczenia czasami obie<br />
techniki będą określane jako techniki chromatograficzne, chociaż metoda<br />
elektroforezy kapilarnej zasadniczo zalicza się do technik elektromigracyjnych.<br />
Metody separacyjne służące do badania barier enancjomeryzcji można<br />
w zasadzie podzielić na dynamiczne metody separacyjne [9-13] i metody<br />
separacyjne z zatrzymanym przepływem (stopped-flow) [14-16].<br />
Wykorzystanie metod separacyjnych do wyznaczania barier enancjomeryzacji<br />
labilnych enancjomerów zapoczątkowano w latach 80-tych ubiegłego<br />
wieku wraz z rozwojem enancjoselektywnych metod separacyjnych.<br />
Oba rodzaje metod zostały opisane w pracach przeglądowych [17, 18].<br />
Przy pomocy DHPLC można mierzyć bariery enancjomeryzacji w granicach<br />
65-105 kJ/mol, DGC 70-130 kJ/mol, natomiast przy pomocy<br />
SFMDGC 70-180 kJ/mol a SFMDCE 100-130 kJ/mol.<br />
DYNAMICZNE METODY SEPARACYJNE<br />
Chromatografia dynamiczna jest definiowana jako metoda służąca do<br />
badania procesów odwracalnej interkonwersji zachodzących w czasie chromatografowania.<br />
Została ona wykorzystana do wyznaczania barier enancjomeryzacji.<br />
W chromatografii enancjoselektywnej szybka interkonwersja enancjomerów<br />
powoduje tworzenie się plateau pomiędzy rozdzielonymi pikami.<br />
Przy dostatecznie szybkiej reakcji obserwuje się nakładanie się pików.<br />
20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 29.0<br />
Minutes<br />
Rys. 1. Przykładowy chromatogram z widocznym plateau tworzącym się pomiędzy rozdzielanymi<br />
enancjomerami<br />
35
W przypadku przeprowadzania analizy enancjoselektywnej zjawiska<br />
te są niepożądane i stanowią komplikacje, które likwiduje się poprzez dodatek<br />
modyfikatora organicznego bądź zmianę chiralnej fazy stacjonarnej.<br />
W dynamicznej chromatografii natomiast charakterystyczny profil piku nie<br />
tylko stanowi źródło diagnostyczne zachodzącego w kolumnie procesu interkonwersji<br />
enancjomerów ale jest warunkiem do ilościowego wyznaczenia<br />
bariery enancjomeryzacji.<br />
Stałe szybkości oraz bariery enancjomeryzacji wyznacza się poprzez<br />
porównanie symulowanych komputerowo profilów elucji z uzyskanymi eksperymentalnie<br />
chromatogramami [19, 20].<br />
Rys. 2. Schemat równowag zachodzących w kolumnie w czasie procesu chromatograficznego<br />
Odwracalna pseudo-pierwszorzędowa reakcja enancjomeryzacji na<br />
kolumnie przebiega z różnymi stałymi szybkości k s w fazie stacjonarnej i k m<br />
w fazie ruchomej. Dla enancjomerów stałe szybkości reakcji enancjomeryzacji<br />
w achiralnej fazie ruchomej są jednakowe dla obu enancjomerów.<br />
W chiralnej fazie stacjonarnej sytuacja się zmienia stałe szybkości enancjomeryzacji<br />
są różne dla obu enancjomerów z uwagi na tworzenie się diasteromerycznych<br />
kompleksów pomiędzy rozdzielanymi enancjomerami i chiralnym<br />
selektorem. Nie obserwujemy jednak w rezultacie enancjomerycznego<br />
wzbogacenia próbki gdyż enancjomer który reaguje wolniej przebywa dłużej<br />
w fazie stacjonarnej.<br />
K S i K R są współczynnikami podziału enancjomerów R i S pomiędzy<br />
fazę ruchomą i stacjonarną.<br />
Z danych chromatograficznych możemy wyliczyć pozorne stałe szybkości<br />
enancjomeryzacji, które są średnimi ważonymi stałych szybkości w fazie<br />
stacjonarnej i ruchomej. Stałe szybkości w fazie ruchomej można wyznaczyć<br />
niezależnie za pomocą innych metod.<br />
Dynamiczna chromatografia gazowa [21-23], dynamiczna chromatografia<br />
cieczowa [24-27], dynamiczna elektroforeza kapilarna oraz micelarna<br />
elektrokinetyczna chromatografia cieczowa [28, 29] jak również dynamiczna<br />
chromatografia w stanie nadkrytycznym [30] zostały wykorzystane do wyznaczania<br />
barier enancjomeryzacji wielu stereolabilnych związków.<br />
36
METODY SEPARACYJNE Z ZATRZYMANYM PRZEPŁYWEM<br />
W metodach chromatograficznych z zatrzymanym przepływem racemiczna<br />
mieszanina jest wstępnie rozdzielana na kolumnie z fazą chiralną<br />
w temperaturze, w której nie obserwuje się procesu enancjomeryzacji.<br />
W momencie gdy wiadomo, że enancjomery zostały rozdzielone zostaje zatrzymany<br />
przepływ fazy ruchomej i kolumna jest ogrzewana w określonej<br />
temperaturze przez określony czas. Następuje wtedy enancjomeryzacja<br />
rozdzielonych pików w środowisku chiralnym. Następnie schładza się kolumnę<br />
do temperatury analizy, przywraca się przepływ fazy ruchomej i kontynuuje<br />
się analizę. Na uzyskanym chromatogramie oprócz rozdzielonych<br />
enancjomerów pojawiają się dodatkowe piki pochodzące z ulegających<br />
enancjomeryzacji rozdzielonych związków.<br />
35<br />
30<br />
25<br />
R<br />
S<br />
[mV]<br />
20<br />
15<br />
10<br />
5<br />
S<br />
R<br />
0<br />
0 10 20 30 40 50<br />
[min]<br />
Rys. 3. Przykładowy chromatogram rozdzielania enancjomerów otrzymany za pomocą chromatografii<br />
z zatrzymanym przepływem<br />
W metodach chromatografii wielowymiarowej z zatrzymanym przepływem,<br />
racemiczna mieszanina jest wstępnie rozdzielana na chiralnej fazie<br />
stacjonarnej, następnie jeden z enancjomerów jest kierowany do achiralnej<br />
kolumny reakcyjnej gdzie podczas podgrzewania następuje enancjomeryzacja<br />
w achiralnym środowisku. Potem zenancjomeryzowana próbka jest kierowana<br />
na drugą chiralną kolumnę w celu rozdzielana jej na enancjomery.<br />
Zaletą tej metody jest to, że enancjomeryzacja zachodzi w warunkach achiralnego<br />
otoczenia a nie w środowisku chiralnym.<br />
37
pompa<br />
HPLC<br />
kolumna chiralna<br />
kolumna<br />
reakcyjna<br />
detektor<br />
80.00<br />
60.00<br />
[mV]<br />
40.00<br />
pompa<br />
HPLC<br />
20.00<br />
0.00<br />
kolumna<br />
reakcyjna<br />
[mV]<br />
10<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
-2<br />
0.00 5.00 10.00 15.00<br />
[m in]<br />
kolumna chiralna<br />
0 5 10 15 20 25<br />
[m in ]<br />
detektor<br />
Rys. 4. Schemat wielowymiarowej chromatografii cieczowej z zatrzymanym przepływem<br />
Parametry kinetyczne reakcji enancjomeryzacji i diastereomeryzacji<br />
niestabilnych stereoizomerów zostały również wyznaczone za pomocą metod<br />
separacyjnych z zatrzymanym przepływem, m. in. chromatografii cieczowej<br />
z zatrzymanym przepływem [31] oraz dwuwymiarowej chromatografii<br />
gazowej z zatrzymanym przepływem [32].<br />
PODSUMOWANIE<br />
Podsumowując można powiedzieć, że obydwie metody znajdują zastosowanie<br />
do wyznaczania barier enancjomeryzacji. Pierwsza z nich to<br />
znaczy chromatografia dynamiczna wymaga bardziej skomplikowanych obróbki<br />
matematycznej i symulacji komputerowej za to nie wymaga dodatkowego<br />
sprzętu chromatograficznego. W przypadku metody z zatrzymanym<br />
przepływem wymagana jest bardziej skomplikowana aparatura za to same<br />
obliczenia są proste.<br />
Obie metody posiadają wiele zalet:<br />
• nie wymagają substancji optycznie czystych lub wzbogaconych, racemat<br />
wystarcza do badań,<br />
• wymagana jest bardzo mała ilość próbki ok. 10 -8 g,<br />
• zanieczyszczenia są na ogół oddzielone od próbki na kolumnie<br />
w związku z tym nie przeszkadzają,<br />
• w przypadku GC mogą być badane próbki gazowe lub też bardzo<br />
lotne,<br />
38
• pomiary mogą być prowadzone w szerokim zakresie dobrze kontrolowanej<br />
temperatury,<br />
• metody są szybkie, proste a wyniki są powtarzalne.<br />
Jednak metody chromatograficzne nie składają się z samych zalet.<br />
Podstawową wadą tych metod jest to, że konieczne jest do ich zastosowania<br />
uzyskanie bardzo dobrego rozdzielenia enancjomerów co oczywiście w wielu<br />
przypadkach jest sprawą trudną. Tam gdzie rozdzielenie enancjomerów<br />
jest wystarczające do określenia czystości optycznej niekoniecznie jest wystarczające<br />
do wyznaczenia bariery enancjomeryzacji.<br />
LITERATURA<br />
1. A. Huhtikangas, T. Lehtola, R. Virtanen, P. Peura, Finn. Chem. Lett.,<br />
5(1982)63.<br />
2. S. Ritz, H. Schütz, J. Forensic Sci., 38(1993)633.<br />
3. S. Ohtani, K. Yamamoto, J. Forensic Sci., 36(1991)792.<br />
4. E. Waite, M. Collins, S. Ritz-Time, H. Schutz, C. Cattaneo, H. Borrman,<br />
Forensic Sci. Int., 103(1999)113.<br />
5. G. Goodfriend, M. Kashgarian, M. Harasevych, Cosmochim. Acta,<br />
59(1995)1125.<br />
6. M. Collins, E. Waite, A. van Duin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B,<br />
354(1999)51.<br />
7. G. Miller, J. Magee, A. Jull, Nature, 385(1997)241.<br />
8. M. Reist, B. Testa, P.-A. Carrupt, Enantiomer, 2(1997)147.<br />
9. J. Veciana, M. Crespo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30(1991)74.<br />
10. F. Gasparrini, D. Misiti, M. Pierini, C. Villani, Tetrahedron Assym.,<br />
8(1997)2069.<br />
11. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Org. Chem., 64(1999)1483.<br />
12. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Anal. Chem., 72(2000)2758.<br />
13. F. Gasparrini, M. Pierini, C. Villani, J. Org. Chem., 68(2003)3173.<br />
14. K. Rossen, J. Sager, Y. Sun, Chem. Commun., 1(1998)115.<br />
15. S. Reich, O. Trapp, V. Schurig, J. Chromatogr. A, 892(2000)487.<br />
16. O. Trapp, G. Schoetz, V. Schurig, J. Pharm. Biomed. Anal.,<br />
27(2002)497.<br />
17. J. Krupcik, P. Oswald, P. Majek, P. Sandra, D.W. Armstrong, J. Chromatogr.<br />
A, 1000(2003)779.<br />
18. Ch. Wolf, Chem. Soc. Rev., 34(2005)595.<br />
19. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.<br />
20. O. Trapp, V. Schurig, Chirality, 14(2002)465.<br />
21. W. Bürkle, H. Karfunkel, V. Schurig, J. Chromatogr., 288(1984)1.<br />
22. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.<br />
23. D. Hochmuth, W. König, Tetrahedron Asymmetry, 10(1999)1089.<br />
24. T. Nishikawa, Y. Hayashi, S. Suzuki, H, Kubo, H. Ohtani, J. Chromatogr.<br />
A, 767(1997)93.<br />
39
25. K. Lorenz, E. Yashima, Y. Okamoto, Angew. Chem. Int. Ed.,<br />
37(1998)1922.<br />
26. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2(1999)1587.<br />
27. J. Oxelbark, S. Claeson, S. Allenmark, Enantiomer, 5(2000)413.<br />
28. D. Wistuba, O Trapp, N. Gel-Moreto, R. Galensa, V. Schurig, Anal.<br />
Chem., 78(2006)3424.<br />
29. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Enantiomer, 5(2000)391.<br />
30. Ch. Wolf, W. Pirkle, Ch. Welch, D. Hochmuth, W.A. König, G.-L. Chee,<br />
J. Charlton, J. Org. Chem., 62(1997)5208.<br />
31. M. Asztemborska, J. Żukowski, J. Chromatogr. A, 1134(2006)95.<br />
32. Ph. Marriott, K. Aryusuk, R. Shellie, D. Ryan, K. Krisnangkura, V. Schurig,<br />
O. Trapp, J. Chromatogr. A, 1033(2004)135.<br />
40
Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Iwona KIERSZTYN 1 ,<br />
Anna LAMERT 1 , Paweł ZARZYCKI 2<br />
1)<br />
Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska<br />
ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce<br />
e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl<br />
2)<br />
Zakład Toksykologii i Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,<br />
Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 Koszalin<br />
ZASTOSOWANIE HPLC DO OZNACZANIA<br />
WOLNYCH RODNIKÓW, ANTYOKSYDANTÓW<br />
ORAZ CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU<br />
ANTYOKSYDACYJNEGO<br />
W pracy przedstawiono podstawowe informacje o wolnych rodnikach, ich wytwarzanie,<br />
oddziaływanie z podstawowymi składnikami organizmów żywych, udział w wielu<br />
stanach chorobowych, a także starzeniu organizmu. Ponadto omówiono metody<br />
oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego<br />
za pomocą HPLC.<br />
INFORMACJE PODSTAWOWE<br />
Tlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. Odpowiada<br />
za mniej więcej jedną czwartą jej masy. W dolnych warstwach atmosfery<br />
objętościowa zawartość tlenu wynosi 21%. Pierwotna atmosfera ziemska<br />
była mieszaniną gazów o właściwościach redukujących. Wolny tlen<br />
w postaci cząsteczkowej pojawił się w niej wraz z rozwojem pierwszych organizmów<br />
fotosyntezujących, ok. 2 miliardów lat temu. Rozpuszczając się<br />
w wodzie był on niezbędnym czynnikiem powstania i rozwoju organizmów<br />
wyższych. Znacznie wyższa niż w wodzie jest jego rozpuszczalność w rozpuszczalnikach<br />
organicznych, co wpływa na lokalizację rodników tlenowych<br />
w hydrofobowych częściach błon biologicznych. W organizmach aerobowych<br />
znaczna część pobieranego tlenu wykorzystywana jest jako akceptor<br />
elektronów. Takie enzymy jak dioksygenaza tryptofanowa i oksydaza ksantynowa<br />
katalizują reakcje utleniania polegające na przenoszeniu pojedynczych<br />
elektronów z substratów na cząsteczkę tlenu. W trakcie redukcji tlenu<br />
wytwarzane są tzw. reaktywne formy tlenu (ang. ROS - reactive oxygen species).<br />
Jest to pojecie szersze, gdyż oprócz wolnych rodników zalicza się do<br />
nich m.in. wzbudzony tlen singletowy i nadtlenek wodoru. Wolne rodniki zaś<br />
są to atomy, cząsteczki (lub ich fragmenty) bądź też jony posiadające niesparowane<br />
elektrony, nadające im własności paramagnetyczne.<br />
41
Tlen, chociaż jest konieczny do życia, paradoksalnie ma on jednocześnie<br />
działanie toksyczne dla organizmów żywych [1, 2]. Przykładowo, oddychanie<br />
czystym tlenem przez dłużej niż 48 godzin prowadzi do śmierci.<br />
Olbrzymia jego większość wykorzystywana jest jako akceptor elektronów<br />
w komórkowych procesach energetycznych. Tym niemniej, w trakcie redukcji,<br />
niewielka część tlenu przekształcana jest w reaktywne formy tlenu, do<br />
których zalicza się również rodniki tlenowe. Ocenia się, że do ROS przekształcane<br />
jest 1÷4% tlenu zużywanego przez organizm człowieka [3]. Przy<br />
dziennym jego zużyciu wynoszącym ok. 10 l oznacza to wytworzenie ok.<br />
4,5÷18 mmoli rodników. Jest to ilość znaczna, zwłaszcza, jeśli uwzględni się<br />
fakt, że wiele uszkodzeń wolnorodnikowych ma tendencję do gromadzenia<br />
się w organizmach żywych. W żywym organizmie wolne rodniki są wytwarzane<br />
w warunkach zarówno fizjologicznych jak i patologicznych. W warunkach<br />
fizjologicznych nie gromadzą się w tkankach gdyż są stale unieczynniane,<br />
„zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.<br />
W patologicznych mogą prowadzić do degeneracji i obumierania komórek [1].<br />
Kolejnym paradoksem tlenowym jest fakt, że chociaż obecnie powszechnie<br />
wiadomo, że tlen w nadmiarze jest szkodliwy to jednakże nie ma<br />
spójnej teorii tłumaczącej, który z rodników jest za tę toksyczność odpowiedzialny<br />
[2]. Wspomniany, paradoks tlenowy na tym się nie kończy. Okazało<br />
się, że niektóre wolne rodniki pełnią istotne funkcje fizjologiczne, np. inhibitorów<br />
niektórych enzymów [4]. Do tego można dodać dalsze paradoksy. Niejasny<br />
jest wpływ rodników na przebieg niektórych zmian patologicznych, jak<br />
miażdżycy [5] czy choroby Alzheimera [6]. Często występują nawet kłopoty<br />
z odpowiedzią na pytanie czy rodniki są przyczyną czy skutkiem owych<br />
zmian. Jeszcze większe problemy sprawia odpowiedź na pytanie czy podawanie<br />
antyoksydantów zapobiega tym zmianom [7, 8]. Wynika z tego, że<br />
choć jest to tematyka bardzo szeroko ostatnio dyskutowana to jej podstawowe<br />
problemy są wciąż nierozwiązane.<br />
WYTWARZANIE RODNIKÓW<br />
Występowanie reaktywnych form tlenu jest charakterystyczne nie tylko<br />
dla organizmów żywych. W warstwach przypowierzchniowych naturalnych<br />
zbiorników wodnych ich stężenie jest znacznie większe niż we wnętrzu organizmów<br />
żywych, gdzie mogą się przedostawać. Najprostszym zaś rodnikiem<br />
(dokładnie – birodnikiem w stanie trypletowym) jest tlen atmosferyczny<br />
którym oddychamy.<br />
Wolne rodniki mogą być indukowane in vitro i in vivo przez różne<br />
czynniki: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe, widzialne i podczerwone<br />
oraz wszelkie reakcje utleniania i redukcji. Do reakcji tych zaliczyć można<br />
autooksydację tioli, katecholamin, flawin i hydrochinonów oraz niektóre reakcje<br />
enzymatyczne, np. oksydazy ksantynowej, dysmutazy ponadtlenkowej<br />
stymulującej mitochondrialny system transportu elektronów, oksydazy cytochromowej<br />
P-450 i b-5 systemu mikrosomalnego.<br />
42
Rys. 1. Schemat transportu elektronów, tworzenia ATP oraz utlenianie zredukowanego<br />
koenzymu Q wraz z towarzyszącą mu redukcją cytochromu b<br />
Rodniki mogą również generować pobudzone komórki fagocytujące<br />
(makrofagi, monocyty i granulocyty) podczas tzw. wybuchu oddechowego.<br />
W tym przypadku odgrywają one pozytywną rolę. Jednakże długotrwałe ich<br />
wytwarzanie (np. w przewlekłych stanach zapalnych) ma działanie kancerogenne.<br />
W błonach komórkowych tworzą się one głównie w wyniku metabolizmu<br />
kwasu arachidonowego przy udziale cyklooksygenazy i lipooksygenazy.<br />
Z czynników zewnętrznych wymienić można przykładowo fenacytynę czy też<br />
parakwat oraz cały szereg leków (haloperidol, salsolinol, cytostatyki itp.).<br />
Najważniejszym generatorem wolnych rodników wydaje się być mitochondrialny<br />
łańcuch oddechowy (rys. 1). Należy sobie również zdać sprawę z tego,<br />
że w komórkach żywych zwierząt i roślin wolne rodniki są stale obecne<br />
jako konieczny etap przejściowy przebiegu szeregu reakcji.<br />
TLEN I PRODUKTY JEGO REDUKCJI<br />
Cząsteczki o spinach połówkowych opisuje statystyka Fermiego-Diraca.<br />
Zgodnie z funkcją rozkładu prawdopodobieństwo występowania elektronu<br />
(fermionu) wzrasta ze spadkiem energii nie przekraczając 1. To znaczy, że<br />
w danym stanie energetycznym określonym energią, pędem oraz spinem może<br />
znajdować się tylko jeden elektron. Rozkład elektronów w cząsteczce tlenu<br />
i produktach jego redukcji przedstawiono na rys. 2. W stanie podstawowym<br />
tlen występuje jako dwurodnik trypletowy, co tłumaczy jego względnie dużą<br />
reaktywność ale jednocześnie stosunkowo małą, jak na rodnik.<br />
43
σ2<br />
∗<br />
p<br />
π * 2p<br />
π 2p<br />
σ 2p<br />
singletowy O2<br />
1<br />
Δ g O<br />
2<br />
singletowy O2<br />
1 +<br />
ΣgO<br />
2<br />
anionorodnik<br />
.-<br />
ponadtlenkowy O 2<br />
jon<br />
nadtlenkowy O 2<br />
2-<br />
tlen atomowy<br />
σ2<br />
∗<br />
s<br />
σ 2s<br />
σ1<br />
∗<br />
s<br />
σ 1s<br />
stan podstawowy<br />
3<br />
O ΣgO (tryplet)<br />
2 2<br />
ΔgΟ Σg<br />
Ο<br />
1 1 +<br />
2 2<br />
92 kJ 155 kJ<br />
3 e .−<br />
g<br />
_ e _ e _<br />
e _<br />
2 2 2 2 2<br />
Σ Ο Ο Η Ο ΟΗ Η Ο<br />
H +<br />
ΗΟ<br />
.<br />
2<br />
Rys. 2. Rozkład elektronów na orbitalach tlenu i produktach jego redukcji.<br />
- orbital molekularny, * - orbitale antywiążące, ↑↓ - spiny elektronowe<br />
W stanie wzbudzonym tlen występuje w postaci singletu. Jego stężenie<br />
w cytoplazmie jest na poziomie 10 -15 M, podczas gdy tlenu trypletowego<br />
10 -5 M. Wyróżniamy dwa stany singletowe - delta i sigma. Czas życia tlenu<br />
w stanie 1 Σg + O 2 (antyrównoległe spiny na różnych orbitalach) w roztworach<br />
wodnych wynosi 10 -11 s, zaś tlenu delta 1 ΔgO 2 – 10 -6 s. W gazach czasy te<br />
wynoszą odpowiednio 12 s i 45 min.<br />
Pierwszym produktem redukcji tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy<br />
(O 2 •- ) i jego zprotonowana forma – rodnik nadhydroksylowy (HO 2<br />
•<br />
). W roku<br />
1954 Gershman, Gilbert i Fridovich wysunęli hipotezę, że za toksyczność<br />
tlenu odpowiedzialny jest właśnie anionorodnik ponadtlenkowy. Niestety,<br />
okazało się, że jest on wprawdzie bardzo reaktywny ale jednocześnie krótko-żyjący<br />
oraz mało reaktywny w środowisku aprotycznym i w stosunku do<br />
aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Rodnik nadhydroksylowy jest znacznie<br />
silniejszym utleniaczem niż anionorodnik ponadtlenkowy. Sugeruje się<br />
nawet [9], że za szkodliwe działanie tlenu i uszkadzanie błon komórkowych<br />
odpowiedzialny jest układ rodników O 2·- /HO 2·, a nie rodnik hydroksylowy.<br />
HO 2· charakteryzuje się długim czasem życia przez co może dyfundować on<br />
do sąsiednich struktur komórkowych. Przy pH fizjologicznym 7,4 ok. 1%<br />
anionorodnika występuje w postaci zhydratowanej (pK a = 4,88). W wyniku<br />
przebiegu reakcji dysmutacji oba te rodniki wytwarzają nadtlenek wodoru.<br />
W obecności jonów metali grup przejściowych (żelaza i miedzi) nadtlenek<br />
wodoru ulega rozpadowi z wytworzeniem reaktywnego rodnika hydroksylowego,<br />
zgodnie z reakcją opisaną po raz pierwszy w roku 1884 przez<br />
Fentona:<br />
+<br />
2 + n<br />
3+<br />
(n+<br />
1) +<br />
- •<br />
(1) Fe (M ) + H O = Fe (M ) + OH + OH<br />
.<br />
2<br />
2<br />
Utleniony metal może zostać następnie zredukowany, co oznacza, że pełni<br />
on rolę katalizatora:<br />
44
•−<br />
3+<br />
2+<br />
(2) Fe + O2<br />
= Fe + O2<br />
.<br />
W sumie obie reakcje przedstawia się jako reakcję Habera-Weissa (1934 r.):<br />
(3)<br />
O<br />
•-<br />
- •<br />
2<br />
+ H<br />
2O2<br />
= O2<br />
+ OH + OH .<br />
Bez katalizatora (jonów metali) reakcja (3) przebiega bardzo wolno. Znacznie<br />
przyśpiesza ją niewielka nawet obecność żelaza na plus drugim stopniu<br />
utlenienia. Żelazo trójwartościowe również może ją katalizować gdyż jest<br />
ono łatwo redukowalne w organizmie, np. w obecności kwasu askorbinowego,<br />
cysteiny lub glutationu. Przyśpieszają ją również niektóre kompleksy<br />
(EDTA, cytrynian). Kompleksy te mogą przyśpieszać jego utlenianie gdyż<br />
eliminują konieczność zmiany jego powłoki hydratacyjnej. W świetle powyższego<br />
problematyczne jest podawanie żelaza w postaci kompleksu z askorbinianem<br />
i EDTA, stosowane przez niektóre firmy farmaceutyczne.<br />
Powstały w reakcjach (1 - 3) rodnik hydroksylowy jest wyjątkowo reaktywny.<br />
Wchodzi on w reakcje z wieloma związkami organicznymi (addycja,<br />
substytucja wolnorodnikowa, przenoszenie elektronów). Rodnik ten jest bardzo<br />
słabym kwasem, uwalniając alkaliczny jon nadtlenkowy O - . Jego stała<br />
dysocjacji porównywalna jest ze stałą nadtlenku wodoru i wynosi 11,85. Nie<br />
penetruje on jednak komórki. Reaguje tylko z cząsteczkami obecnymi<br />
w bezpośrednim ich sąsiedztwie, np. z jonem węglanowym tworząc rodnik<br />
węglanowy będący silnym reduktorem.<br />
Bardzo intensywnie badanym ostatnio rodnikiem jest tlenek azotu.<br />
Jest to związek wyjątkowo ciekawy gdyż, z jednej strony, jest on poszukiwanym<br />
od dawna śródbłonkowym czynnikiem rozluźniającym (ang. EDRF - endothelial<br />
derived relaxing factor), neurotransmiterem i zmiataczem wolnych<br />
rodników (przez to związkiem antykancerogennym). Z drugiej strony, będąc<br />
sam wolnym rodnikiem, jest on również neurotoksyczny, kancerogenny<br />
i może wytwarzać inne wolne rodniki.<br />
Tlenek azotu jest zmiataczem anionorodnika ponadtlenkowego,<br />
a w szczególności skutecznym (silniejszym niż witamina E) przeciw utleniaczem<br />
lipidów. Co ciekawe, po przejściu do nadtlenoazotynu z przeciwutleniacza<br />
staje się on silnym utleniaczem. Nadtlenoazotyn utlenia grupy tiolowe<br />
reszt tryptofanowych i metionylowych w białkach (powoduje to ich fragmentacje),<br />
indukuje powstawanie grup karbonylowych, nitruje reszty tyrozylowe,<br />
utlenia kwasy nukleinowe i lipidy. Te oddziaływania z biologicznie czynnymi<br />
związkami mają aspekt pozytywny, mianowicie – antykancerogenny, chociaż<br />
mechanizm jego działania jest nieznany. Związany jest on m.in. z blokadą<br />
reduktazy rybonukleinowej, co uniemożliwia wytwarzanie DNA i podział komórek<br />
nowotworowych. Z drugiej strony nitrozuje on aminy drugorzędowe<br />
do toksycznych, rakotwórczych N-nitrozoamin. Tlenek azotu oddziaływuje<br />
również z centrami Fe-S różnych białek tworząc klastery nitrozylowe. Jest on<br />
inhibitorem enzymów mitochondrialnych, akonitazy i kompleksu I (NADPH -<br />
oksydorektuza ubichinowa).<br />
45
Rozpuszczalność tlenku azotu w wodzie wynosi 1,8⋅10 -3 M, a stężenie<br />
w komórce jest rzędu 3⋅10 -6 M, okres półtrwania w wodzie od 4 min do<br />
3 godzin, we krwi 0,1 sek., a w tkankach 3 - 30 sek. W komórce wytwarzany<br />
jest podczas utleniania (w obecności NADPH jako donora elektronów) przez<br />
syntazę tlenku azotu (NOS), zależną od cytochromu P-450, argininy do cytruliny<br />
i NO. Jest on następnie szybko degradowany z powodu reakcji z tlenem,<br />
dwutlenkiem azotu i anionorodnikiem ponadtlenkowym. Zmiatając<br />
anionorodnik wytwarza anion peroksyazotawy, będący silnym utleniaczem<br />
i rozpadającym się na dwa rodniki, hydroksylowy i dwutlenek azotu. Wytwarzają<br />
one z małą szybkością azotany i azotyny.<br />
Cytotoksyczność tlenku azotu wywołują anion peroksyazotawy i powstający<br />
z jego rozpadu rodnik hydroksylowy. Oddziaływają one m.in. z lipidami,<br />
DNA i wpływają na mitochondrialne kanały wapniowe (oddziaływanie<br />
na kompleksy żelaza w błonie mitochondrialnej). Uszkodzenia DNA aktywują<br />
poli(ADP-rybozo)polimerazę, PARP. Enzym ten odpowiedzialny jest za<br />
energetyczną śmierć komórki poprzez zużywanie ATP podczas naprawy<br />
uszkodzonego DNA. Jego nadprodukcja jest przyczyną śmierci neuronów<br />
podczas zawałów naczyniowych, w chorobie Huntingtona i Alzheimera.<br />
NO jest też neurotransmiterem w obwodowym układzie nerwowym<br />
(sercowo-naczyniowym, płciowo-moczowym, oddechowym i trawiennym).<br />
Przykładowo, kontroluje on rozkurcz mięśni jelit podczas ruchów perystaltycznych<br />
i rozkurcz mięśni ciał jamistych ułatwiających napływ krwi do prącia<br />
podczas erekcji oraz rozkurcz mięśni naczyń krwionośnych. To ostatnie powoduje<br />
spadek ciśnienia krwi. Dlatego chorym na serce podawana jest nitrogliceryna,<br />
metabolizowana w organizmie do NO. eNOS z komórek śródbłonka<br />
aktywowany jest przez kompleks Ca 2+ -kalmodulina, tworzący się po wniknięciu<br />
jonów wapnia do wnętrza komórki. Otwarcie kanałów jonowych następuje<br />
po związaniu przez receptory powierzchniowe np. acetylocholiny. NO dyfunduje<br />
do wnętrza naczynia krwionośnego i jako czynnik EDRF do komórek<br />
mięśni gładkich. Uaktywnia cyklazę guanylową, cGMP, fosforylację protein<br />
transportujących jony wapnia (spadek ich stężenia) przez kinazę białkową, co<br />
prowadzi do rozkurczu. Podobny efekt dają S-nitrozole, [Fe(CN) 5 (NO)] 2- ,<br />
[Fe 4 S 4 (NO) 7 ] - , organiczne azotyny i azotany, np. nitrogliceryna.<br />
WPŁYW WOLNYCH RODNIKÓW NA PODSTAWOWE SKŁADNIKI<br />
KOMÓREK<br />
Wolne rodniki reagują w zasadzie ze wszystkimi składnikami komórek.<br />
Największe uszkodzenia powodują w lipidach, białkach i DNA. Z organelli<br />
komórkowych najbardziej narażone na atak wolnych rodników są mitochondria.<br />
Ich uszkodzenie prowadzić może nawet do śmierci komórek.<br />
Należy w tym miejscu zaznaczyć, że mimo ich negatywnego wpływu<br />
na organizmy żywe, wolne rodniki są koniecznymi etapami przejściowymi<br />
przebiegu szeregu reakcji biochemicznych, jak też mają szereg działań pozytywnych.<br />
Przykładowo wspomnieć tu można o tym, że szereg enzymów<br />
46
eperujących DNA (polimerazy) aktywowanych jest wolnymi rodnikami, często<br />
indukowanych światłem. Rodniki umożliwiają również spełnianie funkcji<br />
biologicznych cyklazie guanylynowej (receptor NO aktywujący cGMP, PKG<br />
i fosforylujący NOS), oksydazie glukozy, S-transferazie glutationu. Wolne<br />
rodniki są również stosowane w terapii nowotworów – tlenek azotu oraz wytwarzane<br />
przez promieniowanie rodniki hydroksylowe. Duże ilości wolnych<br />
rodników wytwarzają również pobudzone komórki fagocytujące (granulocyty,<br />
monocyty i makrofagi) w trakcie tzw. – wybuchu oddechowego.<br />
Wyjątkowo aktywnym organem, zużywającym ponad 20% dostarczanego<br />
organizmowi tlenu, jest mózg. Jest on również szczególnie narażony<br />
na uszkodzenia wolnorodnikowe gdyż w dużym stężeniu występują w nim<br />
wielonienasycone kwasy (PUFA) i żelazo, a w małym - antyutleniacze. Ma<br />
on ponadto małe możliwości wiązania metali i nie posiada możliwości regeneracji<br />
neuronów. Ich nadmierne stężenie wpływa na starzenie się mózgu,<br />
jest przejawem choroby Alzheimer’a i syndromu Downa.<br />
Wolne rodniki odgrywają też ważną rolę w wielu teoriach procesu starzenia.<br />
Sam proces starzenia nie jest obecnie dokładnie poznany. Prawdopodobnie<br />
starzenie się związane jest w jakiś sposób ze zmianami genetycznymi.<br />
Nawet nieśmiertelne organizmy musiały umierać z przyczyn losowych.<br />
Dlatego nie przekazywały one swojemu potomstwu cech umożliwiających<br />
zwalczanie chorób starczych. 2 000 lat temu przewidywana długość życia<br />
człowieka wynosiła 19 lat. Oznacza to, że geny które byłyby korzystne<br />
w wieku 50 lat nie były wówczas przekazywane. Chociaż więc starzenie nie<br />
jest korzystne z punktu widzenia poszczególnej jednostki to nie było ewolucyjnego<br />
nacisku jeżeli tylko nieliczne jednostki dożywały wieku sędziwego.<br />
Jak wiadomo wolne rodniki rodniki oddziaływają z DNA. Trudno jest jednakże<br />
jednoznacznie stwierdzić ich wpływ na rozwój ewolucjny. Wraz z rozwojem,<br />
„program” genetyczny coraz to bardziej komplikował się, a przez to był<br />
bardziej narażony na uszkodzenia. Tym można wytłumaczyć dlaczego znane<br />
są nieśmiertelne organizmy jednokomórkowe, a nie np. ludzie. W latach<br />
pięćdziesiątych L. Hayflick i P. Moorhead wysunęli koncepcję o ograniczonej<br />
liczbie podziałów komórki diploidalnej i występowaniu tzw. limitu Hayflicka.<br />
Zauważono w tym przypadku ścisłą korelację między oczekiwaną długością<br />
życia różnych organizmów, a ich limitem Hayflicka. Tę teorię jest wyjątkowo<br />
trudno połączyć z wolno-rodnikową teorią starzenia. Ostatnio sugeruje się<br />
jednakże, że limit Hayflicka zależy również od środowiska w którym przebywa<br />
komórka. Mogłoby to oznaczać udział wolnych rodników w starzeniu, tym<br />
bardziej, że zaobserwowano, że komórki pochodzące od organizmów długożyjących<br />
są bardziej odporne na ich ataki. Faktycznie udało się wydłużyć<br />
długość życia nicieni poprzez zamianę jednego z genów zwiększającą jego<br />
funkcje anty-oksydacyjne.<br />
ZMIATACZE WOLNYCH RODNIKÓW I ANTYUTLENIACZE<br />
Organizmy żywe w trakcie ewolucji wytworzyły szereg mechanizmów<br />
zapobiegających lub naprawiających uszkodzenia powstałe wskutek działa-<br />
47
nia wolnych rodników. Dlatego nie gromadzą się one w tkankach gdyż są<br />
stale unieczynniane, „zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.<br />
Bardzo często stanowią one niedostateczną ochronę i co więcej, ich<br />
efektywność maleje z wiekiem. Generalnie można je podzielić na systemy<br />
naprawcze białek, lipidów i DNA oraz antyutleniacze enzymatyczne lub nieenzymatyczne,<br />
jak to zostało zestawione poniżej.<br />
Rys. 3. Równowaga oksydacyjna<br />
1. Systemy naprawcze<br />
1.1. Naprawa białek - proteinazy (odcinają utlenione białka), proteazy<br />
(tną produkty aktywności proteinaz), peptazy (tną produkty aktywności<br />
proteaz na aminokwasy).<br />
1.2. Naprawa lipidów - fosfolipazy (usuwają utleniane fragmenty lipidów<br />
z błon), acetylotransferazy (wymieniają kwasy tłuszczowe oddzielone<br />
od lipidów), peroksydaza glutationowa i transferaza (wspomagają<br />
naprawę utlenionych kwasów tłuszczowych).<br />
1.3. Naprawa DNA - egzo- i endonukleazy (usuwają zniszczone fragmenty<br />
DNA), glikozylazy i polimerazy (wypełniają ubytki powstałe po<br />
działaniu nukleaz), ligazy (łączą naprawione fragmenty).<br />
2. Antyutleniacze (zmiatacze wolnych rodników)<br />
2.1. Enzymatyczne<br />
48
2.1.1. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – składa się ona z dwóch<br />
dimerów o M = 32000, każdy zawiera Cu(II) i Zn(II), przy czym<br />
miedź znajduje się w centrum katalicznym, a cynk pełni rolę<br />
strukturalną. Występuje w cytozolu i mitochongriach (magnezo-zależna).<br />
Katalizuje dysmutację anionorodnika ponadtlenkowego<br />
w nadtlenek wodoru, powodując obniżenie jego stężenia<br />
do poziomu poniżej 10 -11 M. Wstrzyknięta do chorej<br />
tkanki z przewlekłym stanem zapalnym powoduje szybkie jej<br />
wyleczenie. Daje to lepsze wyniki leczenia reumatyzmu niż<br />
dotychczasowa terapia polegająca na naświetlaniu, powodująca<br />
wzrost stężenia rodników i tylko przejściową ulgę.<br />
2.1.2. Katalaza (M = 240 000) - składa się z 4 podjednostek, każda<br />
zawiera grupę hemową z wysokospinowym żelazem Fe(III).<br />
Jest reaktywna w peroksyzomach, obniża stężenie nadtlenku<br />
wodoru. Osłabienie funkcji SOD i katalazy jest przyczyną<br />
szybkiego starzenia się. Przy ich prawidłowym rozwoju człowiek<br />
mógłby, prawdopodobnie, żyć znacznie dłużej.<br />
2.1.3. Peroksydaza glutationowa (M = 90 000) zawiera atom selenu,<br />
stąd niektórzy mylnie zaliczają selen do antyutleniaczy. Występuje<br />
w mitochondriach i cytozolu, redukuje hydronadtenki organiczne<br />
i nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego.<br />
2.1.4. Ceruloplazmina - niebieska miedzioproteina występująca<br />
w surowicy krwi (M = 132000; 7,8 jonów Cu(II)). Katalizuje<br />
ona utlenianie jonów żelaza, przez co zapobiega tworzeniu się<br />
rodników hydroksylowych, likwiduje anionorodnik ponadtlenkowy.<br />
Mniej reaktywna od SOD, nie wytwarza nadtlenku wodoru.<br />
W przeciwieństwie do SOD jest zewnątrzkomórkowa<br />
w układzie krążenia.<br />
2.2. Nieenzymatyczne<br />
2.2.1. Witamina E i beta-karoten – reagując z wolnymi rodnikami wytwarzają<br />
trwałe rodniki oddziaływujące następnie z witaminą<br />
C. Jako rozpuszczalne w tłuszczach chronią głownie błony<br />
plazmatyczne. Usuwają NO 2 . chroniąc płuca przed dymem tytoniowym.<br />
2.2.2. Witamina C – reduktor zaangażowany w reakcje hydroksylacji<br />
(tworzenie hydroksyproliny w kolagenie). Chelatuje metale,<br />
w tym żelazo. Chroni witaminy A i E przed utlenianiem. Reaguje<br />
z wolnymi rodnikami w cytoplaźmie. Działa antyutleniająco<br />
wspólnie z witaminą E.<br />
2.2.3. Kwas moczowy – likwiduje rodniki w cytoplaźmie. Jest on<br />
końcowym produktem metabolizmu puryny u człowieka i naczelnych.<br />
Jego duże stężenie (> 0,5 mM) u naczelnych tłumaczy<br />
ich dużą żywotność.<br />
2.2.4. Chelatory metali (transferyna, laktoferyna, w tym białkowe:<br />
hemoglobina, mioglobina, ferrodyksyna) – zapobiegają katalizowaniu<br />
reakcji utleniania przez żelazo i miedź Zaliczyć moż-<br />
49
na do nich również poliaminy biogenne (spermina) – produkty<br />
metabolizmu (podobnie do NO) argininy.<br />
2.2.5. Związki zawierające grupy sulfhydrylowe -SH (cysteina, cysteamina,<br />
glutation).<br />
2.2.6. Kwas liponowy (tiooktanowy) – lek podawany diabetykom<br />
(normalizuje poziom cukru we krwi). Usuwa z organizmu metale<br />
ciężkie (Fe, Cu) i toksyczne (Cd, Pb, Hg). Ostatnio okazało<br />
się, że regeneruje on system nerwowy i wątrobę oraz spowalnia<br />
rozwój wirusa HIV, choroby Parkinsona i Alzheimera.<br />
Wiąże się to z jego silnym działaniem antyutleniającym (zarówno<br />
w wodzie jak i w tłuszczach) oraz z ochroną przed rozkładem<br />
witamin C i E.<br />
2.2.7. Melatonina – hormon wytwarzany w szyszynce. Ponieważ zanika<br />
ona z wiekiem stąd wysunięto koncepcję, że podawanie<br />
melatoniny może zapobiec, a nawet odwrócić procesy starzenia.<br />
Faktycznie, w roku 1994r. Pierpaoli i Regalson przedłużyli<br />
maksymalną długość życia myszy (z 23 do 28 miesięcy) poprzez<br />
podawanie im melatoniny w pożywieniu lub przeszczep<br />
szyszynki. Działanie melatoniny nie jest dokładnie poznane.<br />
Wiadomo, że jest ona 15 razy silniejszym antyutleniaczem niż<br />
witamina E. Jest stężenie (10 -9 M) jest jednakże za małe, aby<br />
mogła ona skutecznie usuwać wolne rodniki. Problematyczna<br />
wydaje się również możliwość „bezkarnej” kuracji hormonalnej.<br />
Wiąże się to z wysuniętą jeszcze w latach dwudziestych,<br />
przez Steinacha, koncepcją, według której główną przyczyną<br />
starzenia jest niedobór hormonów. Spektakularne wyniki okazały<br />
się bardzo niekorzystne w dłuższym okresie czasu.<br />
2.2.8. Koenzym Q 10 (ubichinon) – występuje w komórkowym układzie<br />
oddychania, na wewnętrznej membranie mitochondriów<br />
oraz w cytoplaźmie w połączeniu z lipoproteinami. Chroni<br />
przed utlenianiem lipidów.<br />
2.2.9. Fito-związki – zmiatacze rodników pochodzenia roślinnego<br />
(polifenole, flawonoidy, antocyjany, proantocyjanidy, pytoestrogeny).<br />
CAŁKOWITY POTENCJAŁ ANTYOKSYDACYJNY<br />
W literaturze można znaleźć opisy wielu metod oznaczania zarówno<br />
poszczególnych wolnych rodników [32-54] jak też antyoksydantów [32,<br />
54-57]. Wolne rodniki wytwarzane są w trakcie przebiegu całego łańcucha<br />
przemian. W rezultacie dochodzi do wytworzenia wielu rodników o różnej<br />
trwałości i reaktywności. Istnieje, więc potrzeba oznaczania sumarycznej ilości<br />
wolnych rodników lub stresu oksydacyjnego spowodowanego przez nie<br />
[41, 42, 51-53]. Z drugiej strony w trakcie przebiegu zmian patologicznych<br />
zmieniają się stężenia różnych antyoksydantów. Spowodowane jest to<br />
50
z jednej strony ich zużywaniem się w czasie reakcji z wolnymi rodnikami,<br />
z drugiej zaś akcją obronną organizmu. Okazało się, że oznaczanie sumarycznego<br />
stężenia wszystkich antyoksydantów często lepiej pozwala ocenić<br />
poziom mocy antyoksydacyjnej badanego układu biologicznego niż oznaczanie<br />
stężenia poszczególnych antyoksydantów osobno [58-67]. Obie te<br />
wielkości, tzn. stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny, są ze<br />
sobą ściśle powiązane, a nawet czasami, utożsamiane [67]. M.in. zmiana<br />
stężenia antyoksydantów w surowicy krwi pozwala badać wpływ wolnych<br />
rodników na przebieg szeregu stanów patologicznych [68-70]. Okazało się,<br />
że współdziałanie między różnymi antyoksydantami daje większą protekcję<br />
niż związki te osobno. Przykładowo, wymienić tu można synergizm glutationu<br />
regenerującego askorbinian [71], czy askorbinianu regenerujacego<br />
α-tokoferol [27, 72]. Te zdolności zmiatania rodników w literaturze definiowane<br />
i nazywane są bardzo różnorodnie (ang. TAC – total antioxidant capacity,<br />
FRAP – ferric reducing ability of plasma, TRAP – total peroxyl radical<br />
trapping antioxidant parameter, TRAP – total redox antioxidant potential,<br />
ORAC – oxygen radical absorbance capacity, TEAC – Trolox-equivalent antioxidant<br />
capacity czy TAR – total antioxidant reactivity) [59, 64, 73]. W opracowaniu<br />
stosujemy skrót CPA pochodzący od terminu - całkowity potencjał<br />
antyoksydacyjny.<br />
Za przybliżoną miarą stresu oksydacyjnego jest stężenie najbardziej<br />
reaktywnych rodników - hydroksylowych. Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałe<br />
dlatego do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Metoda<br />
ta polega na wprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznych<br />
związków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji<br />
(substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym.<br />
Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującą fenyloalaninę,<br />
kwas tereftalowy [74] lub egzogenne pochodne aspiryny. Produkty ich<br />
reakcji z rodnikiem hydroksylowym oznaczane są chromatograficznie.<br />
Chromatografia może być również zastosowana do pomiaru CPA.<br />
Wówczas układ pomiarowy zawiera badany związek lub próbkę biologiczną<br />
oraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwas p-hydroksybenzoesowy)<br />
[75]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostają w reakcji analogicznej do<br />
Fentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodoru i ADP [76, 77]. Rodniki te<br />
są zmiatane zarówno przez detektor jak i badaną próbkę. Jeśli próbka charakteryzuje<br />
się większą reaktywnością z rodnikami wówczas spowoduje to<br />
zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego produktu reakcji detektora<br />
z rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiatania rodników hydroksylowych<br />
przez różne próbki.<br />
Rodniki są wytwarzane m.in. pod wpływem działania promieniowania<br />
elektromagnetycznego na niektóre związki. Podczas reakcji odwrotnej, np.<br />
rekombinacji rodników lipidowych dochodzi do wydzielenia kwantu promieniowania<br />
elektromagnetycznego (chemiluminescencji). Dzięki temu metodą<br />
chemiluminescencji można badać niestabilne rodniki lipidowe, niemożliwe<br />
do bezpośredniej ich analizy, nawet w żywym materiale biologicznym [78].<br />
Inna metoda polega na dodaniu do badanego układu związku tworzącego<br />
51
trwały rodnik, możliwy do oznaczenia fotometrycznego [62, 64] lub za pomocą<br />
elektronowego rezonansu paramagnetycznego [79, 80]. Olbrzymia większość<br />
rodników mających istotne znaczenie biologiczne jest utleniaczami.<br />
Dlatego też sumaryczne stężenie rodników niskocząsteczkowych można<br />
oznaczać metodami elektrochemicznymi [81, 82].<br />
Oddzielną grupę technik oznaczania stresu oksydacyjnego jest analiza<br />
niektórych związków naturalnie występujących w układach biologicznych.<br />
Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznego stężenia tioli [99, 100],<br />
stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaci [101, 102] czy kwasu<br />
askorbinowego do dehydroaskorbinowego [103]. Wolne rodniki reagują<br />
praktycznie z wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi. Najbardziej<br />
istotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami. Produkty tych reakcji<br />
służą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków [104]. Uszkodzenie<br />
wolnorodnikowe białek mierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny<br />
w bityrozynę lub stężeniem grup karbonylowych [105]. Znanych jest ponad<br />
20 wolnorodnikowych uszkodzeń zasad purynowych i pirymidynowych.<br />
Wśród istotnych wskaźników uszkodzenia kwasów nukleinowych wyróżnić<br />
należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninę i 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę<br />
[106]. Inne podejście polega na określeniu aktywności enzymu reperującego<br />
nici DNA, Poli-ADP-rybozy [107]. Najwięcej prac poświęconych jest jednak<br />
określeniu stopnia peroksydacji lipidów [60, 108]. W tym przypadku oznacza<br />
się dialdehyd malonowy (MDA) [108, 109], 4-hydroksy-2-nonenal [110],<br />
oksysterole [111], hydroksynadtlenki [112] czy też sprzężone dieny [113].<br />
Ostatnio stwierdzono, że izomery prostaglandyny F 2 są również wskaźnikami<br />
generacji wolnych rodników i peroksydacji lipidów. F 2 -izoprostany<br />
(w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstają przede wszystkim w procesie peroksydacji<br />
kwasu arachidonowego i eikozanoidów (prostoglandyny, leukotrieny<br />
i tromboksany) [114-117].<br />
Jednym z pierwszych oznaczeń aktywności antyoksydacyjnej była<br />
wprowadzona w Instytucie Fizyki Chemicznej byłego ZSRR w Moskwie metoda<br />
polegająca na ocenie wpływu ekstraktów tkanek otrzymanych w wyniku<br />
działania rozpuszczalników organicznych na utlenianie nienasyconego kwasu<br />
tłuszczowego w standardowych warunkach (przedmuchiwanie tlenem,<br />
stała temperatura 37°C). Jeśli w ekstrakcie znajdowały się antyoksydanty,<br />
utlenianie kwasu tłuszczowego (monitorowane przez jodometryczny pomiar<br />
zawartości nadtlenków) rozpoczynało się z opóźnieniem, po czasie indukcji,<br />
który był zależny od sumarycznego stężenia antyoksydantów. Metoda ta pozwalała<br />
na oznaczenie zawartości antyoksydantów hydrofobowych i zdolnych<br />
do oddziaływania z hydrofobowym kwasem tłuszczowym. Wraz z rozwojem<br />
nauki powstały coraz to nowocześniejsze i bardziej czułe metody<br />
oznaczania CPA. Większość tych metod opiera się na tej samej zasadzie.<br />
Utleniacz inicjuje reakcję której przebieg można łatwo śledzić, np. fotometrycznie.<br />
Obecność antyoksydantów w próbce spowalnia reakcję utleniania,<br />
a mierzony parametr (np. czas indukcji) charakteryzujący to spowolnienie<br />
jest miarą zawartości antyoksydantów w próbce [118].<br />
52
Jednym z najpowszechniejszych oznaczeń jest TAS (Total Antioxidant<br />
Status), zaproponowane przez Rice-Evans [118]. Opiera się ono na następującej<br />
zasadzie. W środowisku reakcji znajduje się 2,2’-azynobis-<br />
-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian) (ABTS), nadtlenek wodoru i peroksydaza<br />
lub mioglobina działająca jako pseudoenzym. Peroksydaza katalizuje<br />
reakcje jednoelektronowego utleniania ABST przez nadtlenek wodoru.<br />
W wyniku reakcji powstaje kationorodnik ABTS .+ charakteryzujący się zielononiebieską<br />
barwą. Im więcej antyoksydantów znajduje się w środowisku<br />
reakcji tym wolniej powstaje zielone zabarwienie i tym jest ono słabsze. Zahamowanie<br />
zielenienia próbki mierzonego spektrofotometrycznie po określonym<br />
czasie inkubacji jest miarą zawartości przeciwutleniaczy w próbce.<br />
Metoda ta ma wiele wad, jednak jej ogromną zaletą jest wykonanie oznaczeń<br />
w ściśle określonych warunkach, gdyż zestaw odczynników do przeprowadzenia<br />
testu jest powszechnie dostępny [118].<br />
Rys. 4. Schemat pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego metodą fotometryczną.<br />
1 – hipotetyczna zmiana sygnału przy braku próbki w mieszaninie reakcyjnej, 2 – przebieg<br />
rzeczywistej zmiany sygnału w obecności próbki charakteryzującej się dużo większą stałą<br />
szybkości reakcji z rodnikiem niż „detektor” i 3 – stałą szybkości reakcji porównywalną z nim<br />
Pomiar CPA jest szczególnie często stosowany do badań skomplikowanych<br />
próbek biologicznych, głównie surowicy lub osocza krwi [59-67].<br />
Oparty on jest na fotometrycznym pomiarze wytworzonych trwałych rodników<br />
[62, 99] lub redukcji żelaza przez składniki surowicy [60]. Najczęściej<br />
jednak wykorzystuje się metodę opartą o generację rodników wskutek termicznego<br />
rozpadu związków dwuazowych, najczęściej AAPH (2,2-diazobis-<br />
(2-amidinopropano)-dihydrochlorek). Początkowo AAPH rozpada się samorzutnie<br />
na dwa rodniki alkilowe, które następnie reagując z tlenem wytwarzają<br />
rodniki ponadtlenkowe. Powstałe rodniki monitoruje się za pomocą tzw.<br />
detektora, tzn. związku, który po przereagowaniu z rodnikami zmienia sygnał<br />
luminescencyjny [63], fluorometryczny [59, 119] lub fotometryczny [61, 65].<br />
Miarą potencjału antyoksydacyjnego jest czas opóźnienia krzywej obrazują-<br />
53
cej zmiany stężenia detektora lub produktu jego reakcji w czasie (rys. 4). To<br />
przesunięcie spowodowane jest tym, że antyoksydanty zawarte w próbce<br />
nie dopuszczają do reakcji rodnika z detektorem. Stąd podstawowym wymogiem<br />
tej metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem była znacznie szybsza<br />
od analogicznej reakcji detektora.<br />
Duża ilość metod pomiaru CPA powoduje, że ten sam materiał mierzony<br />
za pomocą różnych metod może dawać odmienne wyniki. W celu<br />
ujednolicenia wyników w większości przypadków stosuje się przeliczanie ich<br />
na jeden ze standardów, przeważnie stężenie Troloksu, syntetycznego, rozpuszczalnego<br />
w wodzie analogu witaminy E.<br />
CHROMATOGRAFICZNY POMIAR STRESU OKSYDACYJNEGO<br />
CPA jest odwrotnie skorelowany z inną sumaryczną wielkością, mianowicie<br />
ze stresem oksydacyjnym. Pośrednią grupę technik oznaczania<br />
stresu oksydacyjnego jest analiza niektórych związków naturalnie występujących<br />
w układach biologicznych. Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznego<br />
stężenia tioli, stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaci<br />
czy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego. Wolne rodniki reagują<br />
z praktycznie wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi (najbardziej<br />
istotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami). Produkty tych reakcji<br />
służą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków. Ponieważ są<br />
one nietrwałe ich bezpośrednie oznaczanie w próbkach materiału biologicznego<br />
(np. w osoczu, czy w homogenatach tkankowych) nie jest zazwyczaj<br />
możliwe, dlatego też pośrednią metodą oznaczania stresu oksydacyjnego<br />
jest analiza produktów tych reakcji. Uszkodzenie wolnorodnikowe białek<br />
mierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny w bityrozynę lub stężeniem<br />
grup karbonylowych. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodzeń<br />
zasad purynowych i pirymidynowych. Wśród istotnych wskaźników uszkodzenia<br />
kwasów nukleinowych wyróżnić należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninę<br />
i 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę. Inne podejście polega na określeniu aktywności<br />
enzymu reperującego nici DNA, poli-ADP-rybozy. Wydaje się, że<br />
w chwili obecnej największe zainteresowanie wzbudza określenie stopnia<br />
peroksydacji lipidów. Oznaczanymi produktami ich peroksydacji jest dialdehyd<br />
malonowy (MDA) [7], 4-hydroksy-2-nonenal (HNO), oksysterole (7α-,<br />
7β-, 24, 25- i 27-hydroksycholesterol oraz epoksycholesterol [8a]), hydroksynadtlenki,<br />
sprzężone dieny czy też ostatnio intensywnie badane izomery<br />
prostaglandyny F 2 . F 2 -izoprostany (w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstają<br />
przede wszystkim w procesie peroksydacji kwasu arachidonowego i eikozanoidów<br />
(prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany).<br />
Produktami peroksydacji, głównie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych<br />
(PUFA), są aldehydy, hydroksynadtlenki i ketony, a ich produktem<br />
końcowym jest dialdehyd malonowy (MDA). Pomiar jego stężenia jest powszechnie<br />
uznawany za miarę wolnorodnikowego uszkodzenia lipidów [7].<br />
Najczęściej stosuje się do tego, ze względu na prostotę obsługi i wysoką<br />
54
czułość, test kwasu tiobarbiturowego, TBA [7]. Niestety test TBA jest wysoce<br />
niespecyficzny i trudny do zastosowania w próbkach biologicznych. Dodatni<br />
wynik otrzymuje się także z cukrami, niektórymi aminokwasami, kwasami<br />
żółciowymi, alkenami, alkadienami, itp. Pewne udoskonalenie uzyskano stosując<br />
chromatografię w układzie faz odwróconych z detekcją fluorometryczną<br />
[10, 11] lub fotometryczną przy długości fali 535 nm [13-16]. W tym przypadku<br />
derywatyzacja (kwasem tiobarbiturowym) wpływa zarówno na<br />
rozdział, jak i na detekcję. Ciągle jednak etap derywatyzacji związany z opisaną<br />
niejednoznacznością, jest wymagany. Metodę tę próbowano zmodyfikować<br />
stosując derywatyzację 2,4-dinitrofenylohydrazyną [17-19] lub diaminonaftalenem<br />
[20] z detekcją fotometryczną przy 310 nm. Etap<br />
derywatyzacji usunięto stosując tzw. chromatografię par jonowych [21, 22]<br />
(dialdehyd jest kwasem i dlatego jest on słabo zatrzymywany na fazie<br />
RP-18). Detekcja fotometryczna przy 267 nm pozwala na jednoczesną analizę<br />
MDA z dwoma powszechnie występującymi w surowicy krwi antyoksydantami,<br />
tzn. kwasem askorbinowym i moczowym. Na rysunku 5 przedstawiono<br />
analogiczny chromatogram uzyskany metodą chromatografii<br />
wykluczania jonowego (jest to technika predysponowana do rozdziału słabych<br />
kwasów), takich jak MDA (pK a ~4.5) [23]. Porównany on został<br />
z chromatogramem uzyskanym po derywatyzacji MDA.<br />
A<br />
AA<br />
UA<br />
267nm<br />
MDA<br />
B<br />
535nm<br />
20 min<br />
Rys. 5. Chromatogram jonowo-wykluczający 100 μM kwasu (AA) – askorbinowego,<br />
(UA) – moczowego, (MDA) – dialdehydumalonylowego i - 25 μM MDA . TBA (dolny wykres).<br />
Warunki: kolumna – 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL SCH(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma:<br />
(A) - 3 mM H 2 SO 4 , 3 mM TBABr, 5% ACN, temp. – 40°C; (B) – 1 mM H 2 SO 4 , 15% ACN,<br />
temp. – 20°C; detektor UV-267/535 nm<br />
55
Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo reaktywne. Dlatego też są stosunkowo<br />
często oznaczane i pośrednio świadczą o całkowitym stresie oksydacyjnym.<br />
Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałe, do ich oznaczania stosuje<br />
się metodę pułapki spinowej. Polega ona na wprowadzeniu do materiału biologicznego<br />
względnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczaniu<br />
produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem<br />
hydroksylowym. Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującą<br />
fenyloalaninę, kwas tereftalowy lub egzogenne pochodne aspiryny.<br />
W przypadku fenyloalaniny (D-izomer) jej produktami reakcji z rodnikami<br />
hydroksylowymi są tyrozyny [24]. Produkty ich reakcji z rodnikiem hydroksylowym<br />
oznaczane są chromatograficznie.<br />
Aspiryna (kwas o-acetylosalicylowy) jest lekiem powszechnie stosowanym<br />
m.in. przy leczeniu stanów zapalnych i złogów naczyń krwionośnych.<br />
W organizmach jest ona bardzo szybko hydrolizowana do kwasu salicylowego<br />
(rys. 9). Kwas ten w warunkach fizjologicznego pH = 7,4 reaguje<br />
z rodnikami hydroksylowymi dając trzy produkty reakcji: kwasy 2,3- (49%)<br />
i 2,5-dihydroksybenzoesowe (40%) (DHBA) oraz o-katechol (11%). Pułapkowanie<br />
rodników hydroksylowych kwasem salicylowym zostało wielokrotnie<br />
opisane w literaturze [24]. Kwas ten (ok. 5 mM) wprowadzany jest dootrzewnowo<br />
lub stereotaktycznie dokomorowo do komory mózgowej. Stężenie<br />
2,5-DHBA może być powiązane ze stężeniem cytochromu P-450. Zmiany<br />
stężenia 2,3-DHBA są zaś bezpośrednio powiązane ze zmianami stężenia<br />
rodników hydroksylowych. Kwasy te oznaczane są zwykle chromatograficznie<br />
w układzie faz odwróconych [25], jak przedstawiono to na rys. 6.<br />
Rys. 6. HPLC chromatogram 1 mM standardów kwasów (1) - 2,5-,<br />
(2) - 2,3-dihydroksybenzoesowych oraz (3) - kwasu salicylowego. Warunki chromatograficzne:<br />
kolumna - 250x4 mm śr. wew. Zorbax ODS 5 μm (Knauer); faza ruchoma - bufor octanowocytrynianowy<br />
pH = 4,3, 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA, 5% MeOH, 3 mM TBAP; temp. - 20ºC;<br />
szybkość przepływu - 0,9 ml/min; detektor - UV-205 nm<br />
56
Pułapka salicylanowa posiada szereg wad [26]:<br />
a) problematyczne jest oznaczanie kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego<br />
gdyż może on występować endogennie, np. wskutek działania<br />
cytochromu P-450,<br />
b) czułość układu jest zmniejszona na skutek tworzenia się dwóch produktów<br />
reakcji,<br />
c) pochodne aspiryny mogą występować w pożywieniu, a jej nieuzasadnione<br />
podawanie wpływa na stany zapalne.<br />
Aby uniknąć tych trudności SteMarie i wsp. zaproponowali zastąpienie salicylanów<br />
kwasem p-hydroksybenzoesowym [26]. Chociaż kwasy te oznaczać<br />
można fotometrycznie to zwykle stosuje się znacznie bardziej czułą (1 pg dla<br />
DHBA, 100 pg dla kwasu salicylowego) detekcję elektrochemiczną (elektroda<br />
pracująca: węgiel szklisty; 0,8 V vs Ag/AgCl) [25].<br />
Rys. 7. Chromatogram jonowo-wykluczający kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego oraz kwasu<br />
p-hydroksybenzoesowego. Warunki chromatograficzne: kolumna - 300x7,8 mm śr. wew.<br />
TSK-GEL SCX(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma - 1 mM H 2 SO 4 , 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA,<br />
13% ACN; detektor elektrochemiczny<br />
Rys. 8. Hydrodynamiczne woltamogramy 1 mM kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego<br />
i p-hydrosybenzoesowego. Warunki chromatograficzne jak na rysunku powyżej<br />
57
COOH<br />
OCOCH3<br />
aspiryna<br />
hydroliza<br />
COOH<br />
COC 6H 9O6<br />
OH<br />
COOH<br />
OH<br />
kwas salicylowy<br />
OH<br />
OH<br />
salicyloacyloglukoronid<br />
OH<br />
2,3-DHBA<br />
COOH<br />
CO 2<br />
OC 6H 9O6<br />
COOH<br />
OH<br />
salicylofenyloglukoronid<br />
CONHCH 2CO 2H<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
HO<br />
2,5-DHBA<br />
kwas salicylurowy<br />
Rys. 9. Metabolity i produkty reakcji ataku rodnika hydroksylowego na kwas salicylowy<br />
CHROMATOGRAFICZNY POMIAR CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU<br />
ANTYOKSYDACYJNEGO<br />
COOH<br />
COOH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
OH<br />
Rys. 10. Reakcja pułapkowania rodnika hydroksylowego kwasem p-hydroksybenzoesowym,<br />
w wyniku której powstaje kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy<br />
Ponieważ rodnik hydroksylowy jest najbardziej reaktywny z całej kaskady<br />
rodników jego oznaczanie pozwala uzyskać informacje o całkowitym<br />
stresie oksydacyjnym. Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo nietrwałe dlatego<br />
do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Polega ona na<br />
wprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznych związ-<br />
58
ków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa<br />
lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym. Jako pułapkę spinową<br />
wykorzystuje się m.in. naturalnie występującą fenyloalaninę, kwas tereftalowy,<br />
egzogenne pochodne aspiryny oraz, przedstawiony na rys. 10,<br />
kwas p-hydroksybenzoesowy (p-HBA) [25]. Kwasy hydroksybenzoesowe<br />
mogą być oznaczane metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej<br />
w układzie faz odwróconych z detekcja elektrochemiczną (węgiel szklisty;<br />
0,8 V vs Ag/AgCl).<br />
W tym miejscu warto zauważyć, że salicylany, czy szerzej hydroksybenzoesany,<br />
(np.: aspiryna - kwas o-acetylosalicylowy) występują w wielu<br />
roślinach. Wykorzystanie, z powodzeniem, tej grupy związków jako pułapki<br />
rodnika hydroksylowego udowadnia, że oprócz własności przeciwzapalnych<br />
związki te w organizmie mogą pełnić również rolę antyoksydantów.<br />
Rys. 11. Porównanie potencjał antyoksydacyjny metanolu, etanolu i dimetyosulfotlenku. Rodniki<br />
hydroksylowe zostały wygenerowane w układzie (ADP/Fe(II)/H 2 O 2, ) i pułapkowane kwasem<br />
p-hydroksybenzoesowym w obecności badanych rozpuszczalników o stężeniu 0.1%. Produkt<br />
reakcji (kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy) był oznaczany z zastosowaniem chromatografii<br />
wykluczania jonowego. Próbka kontrolna nie zawierała antyoksydantów, dlatego wysokość<br />
jej piku chromatograficznego przyjęto za 100%<br />
Rys. 12. Prównanie potencjału antyoksydacyjny poliamin biogennych (AGM – agmatyny,<br />
PUT – putrescyny, SPD – spermidyny i SPE – sperminy). Warunki jak na rys. 11<br />
59
W statycznej, chromatograficznej metodzie pomiaru całkowitego potencjału<br />
antyoksydacyjnego układ pomiarowy zawiera badany związek lub<br />
próbkę biologiczną oraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwas<br />
p-hydroksybenzoesowy) [28]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostają<br />
w reakcji analogicznej do Fentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodoru<br />
i ADP [29]. Rodniki te są zmiatane zarówno przez detektor jak i badaną<br />
próbkę. Jeśli próbka charakteryzuje się większą reaktywnością z rodnikami<br />
wówczas spowoduje to zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego<br />
produktu reakcji detektora z rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiatania<br />
rodników hydroksylowych przez różne próbki. Okazało się, że tak wyznaczony<br />
potencjał antyoksydacyjny skorelowany jest ze stałymi szybkości<br />
reakcji rodnika hydroksylowego z badanymi związkami.<br />
Na rys. 11 pokazano wysokości pików chromatograficznych uzyskanych<br />
w obecności niektórych rozpuszczalników organicznych (metanolu,<br />
etanolu i dimetylosulfotlenku – DMSO) w odniesieniu do próbki kontrolnej<br />
(wytworzony rodnik+detektor) [28]. Zmniejszenie wysokości pików wskazuje<br />
na to, że rozpuszczalniki te zmiatają rodniki hydroksylowe. Może to tłumaczyć<br />
protekcyjne własności DMSO obserwowane w czasie stresu oksydacyjnego<br />
mózgu [30, 31]. Obserwowane zmniejszenie wysokości pików<br />
chromatograficznych dihydroksybenzoesanów jest proporcjonalne do stężenia<br />
próbki, ale także i jej własności. Ta ostatnia jest prawdopodobnie zależna<br />
od wartości stałej szybkości reakcji próbki z rodnikiem hydroksylowym.<br />
Stałe szybkości wynoszą 8.3 x 10 8 , 2.2 x 10 9 i 7.0 x 10 9 mol L -1 s -1 odpowiednio<br />
dla metanolu, etanolu i DMSO.<br />
Podobne zależności uzyskane dla poliamin biogennych, putrescyny,<br />
spermidyny, sperminy i agmatyny przedstawiono na rys. 12 [11]. Związki te<br />
pełnią istotną rolę we wszystkich żywych organizmach, m.in. we wzroście<br />
i replikacji komórek. Poza tym pełnią rolę antagonistów niektórych kationów<br />
(takich jak K + , Mg 2+ czy Ca 2+ ) i antyoksydantów [12]. Jako substancje smakowe<br />
i zapachowe występują m.in. w winie, herbacie, grzybach, jabłkach itd.<br />
Pełnią one rolę też antygenów w komórkach niektórych bakterii, nowotworów,<br />
pasożytów i grzybów chorobotwórczych. Dlatego sugeruje się, że picie<br />
herbaty ma działanie antykancerogenne gdyż pobudza to aktywność komórek<br />
układu odpornościowego i wzrost produkcji np. interferonu gamma.<br />
Zmiany ich stężenia obserwowano w czasie ischemii i reperfuzji. Kontrowersje<br />
wzbudza w dalszym ciągu czy ich wytwarzanie ma w tym przypadku<br />
działanie neurotoksyczne czy neuroprotekcyjne [13]. Z przedstawionego rysunku<br />
wynika, że poliaminy są zmiataczami wolnych rodników. Podobnie do<br />
opisanych wcześniej rozpuszczalników organicznych ich potencjał antyoksydacyjny<br />
proporcjonalny jest do stałych szybkości ich reakcji z rodnikiem<br />
hydroksylowym (wynoszą one odpowiednio 1.1 x 10 8 , 1.2 x 10 8 i 1.3 x 10 8<br />
mol L -1 s -1 ). Mechanizm zmiatania rodników w tym przypadku oparty jest<br />
głównie na kompleksowaniu jonów żelaza, co zapobiega przebiegowi reakcji<br />
Fentona, a nie na konkurencyjnej reakcji z jonami hydroksylowymi.<br />
Ostatnio dużym zainteresowaniem cieszą się naturalne antyoksydanty<br />
do których zalicza się występujące w roślinach barwniki – flawonoidy w tym<br />
60
antocyjany. Do tych ostatnich należy m.in. barwnik C3G (3-O-β-D glukozyd<br />
cyjnidyny) oraz jego aglikol – cyjanidyna. Są to związki powszechnie występujące<br />
w warzywach i owocach. Duże ilości antocyjanów zawierają owoce<br />
o niebieskim bądź fioletowym zabarwieniu. Wyizolowano je m.in. z czerwonej<br />
i czarnej fasoli. Uważane są one za potencjalne wymiatacze wolnych<br />
rodników tlenowych in vivo [14]. W szczególności dużo antocyjanów zawartych<br />
jest w aronii czarnej (Aronia melanocarpa) [14-16]. W literaturze można<br />
znaleźć liczne opisy ich neuro- i cytoprotekcyjnego działania, m.in. w chorobie<br />
Alzheimera, udarze mózgu, zawale serca itp. [14]. Ekstrakt z owoców<br />
aronii jak i zawarte w niej antocyjany charakteryzują się silnymi własnościami<br />
antyoksydacyjnymi. Okazało się jednakże, że nie zmieniał on potencjału<br />
antyoksydacyjnego osocza krwi, co oznacza, że związki te nie są wchłaniane<br />
z przewodu pokarmowego. Wyjaśnieniem tego paradoksu może okazać<br />
się sugestia Tsudy i wsp., że cyjanidyna zawarta w aronii ulega w organizmach<br />
żywych alglikolizacji, a następnie jest metabolizowana do kwasu<br />
3,4-dihydroksybenzoesowego (3,4-DHBA) (rys. 13), jak wynika z badań silnego<br />
zmiatacza rodników peroksylowych.<br />
OH<br />
H<br />
HO<br />
O +<br />
HO<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
OH<br />
HO<br />
Rys. 13. Przypuszczalny schemat metabolizmu cyjanidyny<br />
Według tradycji w roku 2737 p.n.e. cesarzowi Chen Nung wpadł do<br />
wody listek herbaty. Odtąd datują się początki znajomości zdrowotnego<br />
działania różnych herbat, które około XVI wieku przybyły do Europy. Spośród<br />
przebadanych i przedstawionych na rys. 14 [120] fotometrycznych wartości<br />
CPA wynika, że najsilniej wolne rodniki są zmiatane przez ekstrakt<br />
z herbaty zielonej. Na uwagę zasługuje też fakt zupełnego braku zmiatania<br />
wolnych rodników przez napój herbaciany Green Tea & Lychee. Sugeruje<br />
się, że tymi aktywnymi antyoksydantami występującymi w herbacie są<br />
związki z grupy flawonoidów. Podobne wyniki uzyskane zostały z zastosowaniem<br />
metody analogicznej do opisanej powyżej chromatograficznej<br />
(rys. 15). Różnica polegała na detekcji z zastosowaniem spektroskopii ma-<br />
61
sowej. Warto zwrócić w tym przypadku uwagę na silne własności zmiatające<br />
melatoniny, zupełnie nieaktywnej w stosunku do rodników peroksylowych.<br />
Rys. 14. Całkowity potencjał antyoksydacyjny, odniesiony do rodników peroksylowych,<br />
niektórych ekstraktów ziołowych o stężeniu początkowym 1 mg/ml: ekstraktu z herbaty zielonej,<br />
aronii, pycnogenol, ekstraktu z herbaty czerwonej, imbiru oraz napoju herbacianego<br />
Green Tea & Lychee<br />
Rys. 15. Całkowity potencjał antyoksydacyjny ekstraktów ziołowych, melatoniny oraz<br />
β-amyloidu. Rodnik generowany – hydroksylowy, metoda pomiaru – MS<br />
LITERATURA<br />
1. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,<br />
19(2000)492.<br />
2. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.<br />
3. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.<br />
4. W. Droge, Physiol. Rev., 82(2002)47.<br />
5. T. Kulawik, R. Gil, P. Grieb, B.K. Głód, Probl. Lekar., 41(2002)393.<br />
6. G. Benzi, A. Noretti, Neurobiol. Aging, 16(1995)661.<br />
62
7. B.K. Głód, J.C. Kowalski, J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol.,<br />
27(2004)2733-2742.<br />
8. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.<br />
8a. S. Dzeletovic, O. Breuer, E. Lund, U. Diczfalusy, Anal. Biochem.,<br />
225(1995)73-80.<br />
9. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.<br />
10. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)664.<br />
11. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warsaw), 47(2002)399.<br />
12. H.C. Ha, J.D. Yager, P.A. Woster, R.A Casero, Biochem. Biophys. Res.<br />
Commun., 244(1998)298.<br />
13. E. Lövaas, Medical Hyphoteses, 45(1995)59.<br />
14. T. Tsuda, F. Horio, T. Osawa, BioFactors, 13(2000)133.<br />
15. R. Salvayre, P. Braquet, T.H. Perruchot, L. Douste-Blazy, Proc. Internat.<br />
Bioflavan. Symp., Munch 1981, str. 437-442.<br />
16. Y.L. Hong, S.L. Yeh, C.Y. Chang, M.L. Hu, Clin. Biochem.,<br />
33(2000)619-625.<br />
17. J. Pilz, I. Meineke, C.H. Gleiter, J. Chromatogr. B, 742(200)315-325.<br />
18. R. Bakalova, M. Mileva, C. Kotsev, V. Bardarov, S. Ribarov, Method<br />
Find. Exp. Clin., 22(2001)267-269.<br />
19. F. Fenaille, P. Mottier, R.J. Turesky, S. Ali, P.A. Guy, J. Chromatogr. A,<br />
921(2001)237-245.<br />
20. P.J. Steghens, A.L. van Kappel, I. Denis, C. Collombel, Free Radic.<br />
Biol. Med., 31(2001)242-249.<br />
21. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,<br />
200(1995)69-72.<br />
22. A.W. Bull, L.J. Marnet, Analyt. Biochem., 149(1985)284-290.<br />
23. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237-1248.<br />
24. T. Obata, H. Hosokawa, Y. Yamanaka, Comp. Biochem. Physiol.,<br />
106(1997)629-634.<br />
25. B.K. Głód, G.A. Czapski, Zastosowanie HPLC do Badania Reakcji Wolnorodnikowych<br />
w Układach Biologicznych [w] Chromatographic Methods<br />
in the Analysis of Food and Ecotoxicology, Wyd. UMCS, Lublin<br />
1999, 11-15.<br />
26. Ste-Marie L., Boismenu D., Vachon L. and Montgomery J., Anal. Biochem.,<br />
241(1996)67.<br />
27. A.P. Diplock, Med. Biol., 62(1984)78-80.<br />
28. B.K. Głód, R. Greib, Chem. Anal., 47(2002)399-407.<br />
29. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Methods,<br />
10(1984)221.<br />
30. J.W. Phillis, A.Y. Estevez, M.H. O'Regan, Neurosci. Lett.,<br />
244(1998)109-111.<br />
31. A. Bishayee, H.Z. Hill, D. Stein, D.V. Rao, R.W. Howell, Radiation Res.,<br />
155(2001)335-344.<br />
32. B. Kamińska, M. Stańczyk, Post. Biol. Kom., 25 sup.11(1998)15.<br />
33. A. Friedman, Acta. Neurol. Scand., 89(1994)258.<br />
34. S. Ball, Chemia szarych komórek, Medyk, Warszawa 2003.<br />
63
35. W. Pakszys, B.K. Głód, P.P. Liberski, A. Klimek, red., Postępy w rozpoznawaniu<br />
i monitorowanym klinimetrycznie leczeniu choroby Parkinsona<br />
i parkinsonizmu, Medical Communications, Warszawa 2004.<br />
36. A. Szczudlik, Choroba Parkinsona, XVI Zimowa Szkoła Instytutu Farmakologii<br />
PAN, Mogilany 1999.<br />
37. H. Ehringer, O. Hornykiewicz, Klin. Wochenschr., 38(1960)1236.<br />
38. E.S. Tolosa, Clin. Neuropharm., 21 sup.1(1998)S1-S4.<br />
39. J. Cederbaum, Clin. Pharmacokinet., 13(1987)141.<br />
40. G.C. Cotzias, M.H. Van Woert, L.M. Schiffer, N. Engl. J. Med.,<br />
276(1967)374.<br />
41. Y. Agid, T.Chasa, D.Marschen, Lancet, 351(1998)851.<br />
42. C.W. Olanow, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)13.<br />
43. P.G. Jenner, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)3.<br />
44. H.S. Markus, M. Cox, A.M. Tomkins, Clinical Science, 83(1992)199.<br />
45. W. Pakszys, Neurol. Neurochir. Pol., 6(1971)837.<br />
46. M.D. Yahr, Autonomic Dysfuncion in Parkinson Dis. Rev., 1, 2(1989).<br />
47. D.J. Lanska, Ch.G. Goetz, T.A. Chmura, Movement Disorders,<br />
16(2001)736.<br />
48. K. Kwiatos, Pomiar i analiza drżeń kończyn człowieka, rozprawa doktorska<br />
na Wydziale Elektroniki WAT 2000.<br />
49. P. Jenner, C.W. Olanow, Neurology., 47(1996)161.<br />
50. D.T. Dexter, C.J. Carter, F.R. Wells, F. Javoy-Agid, J. Neurochem.,<br />
52(1989)381.<br />
51. J. Garthwaite, Tren. Neurosci., 14(1991)60.<br />
52. U. Pinkernell, S. Effekemann, U. Karst, Anal. Chem., 69(1997)3623.<br />
53. M. Gu, M.T. Gash, J.M. Cooper, G.K. Wenning, S.E. Daniel, N.P. Quinn,<br />
C.D. Marsden, A.H.V. Schapira, Ann. Neurol., 44(1997)418.<br />
54. T. Obata, Toxicol. Lett., 132(2002)83.<br />
55. T. Singer, A.J. Trevor, N. Castagnoli, Trend Biochem. Sci.,<br />
12(1987)266.<br />
56. J.W. Langston, Life Sci., 36(1985)201.<br />
57. E. Sofic, P. Riederer, H. Heinsen, H. Beckmann, G.P. Reynolds, G. Hebenstreit,<br />
J. Neural. Trans., 74(1988)199.<br />
58. E. Sofic, W. Paulus, K. Jellinger, P. Riederer, J. Neurochem.,<br />
56(1991)978.<br />
59. C. Buhmann, S. Arlt, A. Kontush, T. Moller-Bertram, S. Sperber,<br />
M. Oechsner, M. Stuerenburg, U. Beisiegel, Neurobiol. Disease,<br />
15(2004)160.<br />
60. A.N. Basma, E.J. Morris, W.J. Nicklas, H.M. Geller, J. Neurochem.,<br />
64(1995)825.<br />
61. D.G. Graham, Mol. Pharmacol., 14(1978)633.<br />
62. S.T. Spencer, T. Parker, W.D. Bennet, Neuroreport, 5(1994)1009.<br />
63. E. Martignoni, F. Blandini, L. Godi, S. Desideri, C. Pacchetti, F. Mancini,<br />
G. Nappi, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)428.<br />
64. J.W. Miller, J. Selhub, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 21(1996)241.<br />
64
65. M. Tanaka, A. Sotomatsu, H. Kanai, S. Hirai, J. Neurol. Sci.,<br />
101(1991)198.<br />
66. Y. Agid, Neurology, 43(1998)145.<br />
67. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.RF. Haddad, TrAC, Trends Anal. Chem.,<br />
19(2000)492.<br />
68. E. Miętkiewski, Kurs wykładów fizjologii człowieka, wyd. 2, PZWL, Warszawa,<br />
1969.<br />
69. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.<br />
70. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.<br />
71. B. Halliwell, Lancet, 355(2000)1179.<br />
72. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.<br />
73. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.<br />
74. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)1.<br />
75. B.K. Głód, J. Strosznajder, Wolne rodniki w starzeniu się mózgu<br />
i innych procesach biologicznych, w Mózg a starzenie (M.J. Mossakowski,<br />
J. Strosznajder, red.), Oświata UN-O, Warszawa 2001.<br />
76. P.G. Osborne, K. Yamamoto, J. Chromatogr. B, 707(1998)3.<br />
77. B. Halliwell, H. Kaur, M. Ingelman-Sundeberg, Free Radical Biol. Med.,<br />
10(1991)439.<br />
78. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237.<br />
79. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,<br />
19(2000)492.<br />
80. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal., (Warsaw), 47(2002)399.<br />
81. A. Rehman, M. Whiteman, B. Halliwell, British J. Pharmacol.,<br />
122(1997)1702.<br />
82. G. Ellis, I. Adatia, M. Yazdanpanah, S.K. Makela, Clin. Biochem.,<br />
31(1998)195.<br />
83. T-K. Lin and C-C. Lai, J. Chromatogr., 227(1982)369.<br />
84. B.K. Głód, W. Hilgier, J. Strosznajder, J. Albrecht, Chem. Anal.,<br />
(Warsaw), 45(2000)27.<br />
85. P.M. Abuja, R. Albertini, Clin. Chim. Acta, 306(2001)1.<br />
86. A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi, Free Rad.<br />
Biol. Med., 18(1995)29.<br />
87. M. Carlberg, J. Neurosci. Meth., 52(1994)165.<br />
88. K. Kostner, S. Bayai, M. Jansen, G. Khoschsorur, W.H. Horl, G. Maurer,<br />
B. Winklhofer-Roob, K. Derfler, Clin. Chim. Acta, 288(1999)21.<br />
89. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,<br />
200(1995)69.<br />
90. I.N. Acworth, B. Bailey, The Handbook of Oxidative Metabolism, ESA<br />
Inc. 1995.<br />
91. C.A. Rice-Evans, Free Rad. Res., 33(2000)59.<br />
92. M. Valkonen, T. Kuusi, J. Lipid Res., 38(1997)823.<br />
93. N. J. Miller, C. Rice-Evans, M.J. Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Clin.<br />
Scie., 84(1993)407.<br />
94. E. Lissi, M. Salim-Hanna, C. Pascual, M.D. del Castillo, Free Rad. Biol.<br />
Med., 18(1995)153.<br />
65
95. A. Ghiselli, M. Serafini, F. Natella, C. Saccini, Free Rad. Biol. Med.,<br />
29(2000)1106.<br />
96. F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini, Free Rad.<br />
Biol. Med., 24(1998)1228.<br />
97. A. Krasowska, D. Rosiak, K. Szkapiak, M. Łukasiewicz, Curr. Topics<br />
Biophys., 24(2000)89.<br />
98. H. Wang. J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.<br />
99. D. Genser, M-H. Kang, H. Vogelsang, I. Elmadta, Europ. J. Clin. Nutrit.,<br />
53(1999)675.<br />
100. E.C. Tsai, I.B. Hirsh, J.D. Brunzell, A. Chait, Diabetes, 43(1994)1010.<br />
101. E. Ali, Zesz. Nauk. Uniw. Jag., Prace Biol. Molek., 11(1985)139.<br />
102. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.<br />
103. L. Ste-Marie, D. Boismenu, L. Vachon, J. Montgomery, Anal. Biochem.,<br />
241(1996)67.<br />
104. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Meth.,<br />
10(1984)221.<br />
105. B.J. Tabner, S. Turnbull, O.M.A. El-Agnaf, D. Allsop, Free Rad. Biol.<br />
Med., 32(2002)1076.<br />
106. B.K. Głód, K.I. Stańczak, A. Woźniak, A. Walendzik, W. Pakszys, CPS:<br />
analchem/0306002.<br />
107. M.M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res., 89(2001)224.<br />
108. S. Chevion, E.M. Berry, N. Kitrossky, R. Kohen, Free Rad. Biol. Med.,<br />
22(1997)411.<br />
109. R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gati, O. Tirosh, R. Kohen, Free<br />
Rad. Biol. Med., 28(2000)547.<br />
110. G.L. Ellman, Arch. Biochem, Biophys., 82(1959)70.<br />
111. E. Bald, w The XXVI th Sci. Symp. “Chromatogr. Met. Invest. Org.<br />
Comp.”, Katowice-Szczyrk 5-6.06.2002.<br />
112. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.<br />
113. M. Asensi, J. Sastre, F.V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehnor, J.G. Asuction,<br />
Met. Enzymol., 295(1999)267.<br />
114. K.P. Miltor, T. Dzialosynski, S.E. Sanford, J.R. Trevithicle, Curr. Eye<br />
Res., 16(1997)564.<br />
115. A.T. Diplock, Free Rad. Res., 33(2000)521.<br />
116. W.A. Pryor, T. Strickland, D.F. Church, J. Am. Chem. Soc.,<br />
110(1988)2224.<br />
117. T. Doba, G.W. Burton, K.U. Ingold, Biochim. Biophys. Acta,<br />
835(1985)298.<br />
118. G. Cao, H.M. Alessioo, R.G. Cutler, Free Radic. Biol. Med.,<br />
14(1993)303.<br />
119. G. Cao, R.G. Cutler, Arch. Biochem. Biophys., 320(1995)106.<br />
120. K. Głód, K. Stańczak, A. Woźniak, W. Pakszys, Farmac. Pol.,<br />
49(2003)S26-S30.<br />
66
Józef RZEPA<br />
Instytut Chemii, Zakład Chemii Ogólnej i Chromatografii<br />
Uniwersytet Śląski w Katowicach<br />
OZNACZANIE LEKÓW I PESTYCYDÓW<br />
W WODACH POWIERZCHNIOWYCH<br />
WSTĘP<br />
Każdego roku tysiące ton leków są produkowane i następnie zużywane<br />
w medycynie i weterynarii. Znaczna ich część przedostaje się do wód<br />
powierzchniowych w formie niezmienionej. Badania nad obecnością leków<br />
i ich metabolitów prowadzone są od lat 90. XX wieku między innymi w Europie<br />
Zachodniej (Niemcy [2], Grecja, Szwajcaria [3]) oraz Ameryce Południowej<br />
(Brazylia [4]), dotyczyły leków stosowanych w medycynie i weterynarii. [5]<br />
Głównym źródłem zanieczyszczeń środowiska wodnego farmaceutykami są<br />
gospodarstwa domowe oraz szpitale. [6] Leki zażywane przez chorych nie<br />
ulegają całkowicie metabolizmowi w ich organizmach i wraz z moczem lub<br />
kałem trafiają do systemu kanalizacji, a stamtąd kierowane są do oczyszczalni<br />
ścieków. Oprócz gospodarstw i szpitali źródłami zanieczyszczeń są<br />
również zakłady farmaceutyczne, a także farmy zwierząt hodowlanych,<br />
gdzie profilaktycznie podaje się w paszy antybiotyki i bakteriostatyki (sulfonamidy),<br />
aby uchronić zwierzęta hodowlane przed ewentualnymi infekcjami.<br />
[3] Farmaceutyki, które wraz ze ściekami przedostają się do miejskich<br />
oczyszczalni ścieków, nie są całkowicie usuwane w procesach biologicznego<br />
oczyszczania. [2], [4]<br />
Ze względu na swoje właściwości farmaceutyki nie są eliminowane<br />
z wód w procesach samooczyszczania, a dodatkowo mają zdolności do kumulacji<br />
w tkankach organizmów wyższych, przez co stanowić mogą bezpośrednie<br />
zagrożenie dla ich zdrowia lub życia. Szerokie, wręcz nadmierne<br />
stosowanie leków przeciwbólowych z grupy fenoksykwasów np. ibuprofenu,<br />
potęgowane jeszcze nachalną reklamą w mediach prowadzi do wzrostu ich<br />
stężenia we wszystkich elementach środowiska.<br />
MIGRACJA LEKÓW W ŚRODOWISKU<br />
Leki odznaczają się dużą polarnością i niską adsorpcją w mule i glebie,<br />
co jest przyczyną coraz większego zanieczyszczenia wód powierzchniowych<br />
i gruntowych. Oczyszczalnie ścieków nie dysponują technologią<br />
umożliwiającą wyeliminowanie zanieczyszczeń tego typu. Każdy środek zanieczyszczający<br />
środowisko musi być sklasyfikowany i umieszczony w normach.<br />
Jest to jeden z powodów rozwoju coraz to czulszych metod analitycz-<br />
67
nych umożliwiających oznaczanie farmaceutyków w wodnych matrycach [8].<br />
Drogi migracji leków w środowisku przedstawia rysunek 1.<br />
Rys. 1. Drogi migracji leków w środowisku [7]<br />
Przedmiotem badań było oznaczanie leków kwaśnych i neutralnych w wodach<br />
powierzchniowych w rzekach zlewni górnej Wisły i górnej Odry, płynących<br />
na obszarze Górnego Śląska.<br />
Ibuprofen<br />
CH 3<br />
OH<br />
CH 3<br />
O<br />
H 3<br />
C<br />
68
Ketoprofen<br />
O<br />
O<br />
OH<br />
CH 3<br />
Naproksen<br />
CH 3<br />
H 3<br />
C<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
Karbamazepina i metabolit imminostilben<br />
N H 2<br />
N<br />
O<br />
H<br />
N<br />
Diklofenaki jego metabolit 1,3-dihydro-1-(2,6 dichlorofenylo)indol-2-on<br />
OH<br />
Cl<br />
H<br />
N<br />
Cl<br />
O<br />
Cl<br />
N<br />
O<br />
Cl<br />
W trakcie prowadzonych badań oznaczano także niektóre pestycydy,<br />
które izolowano wraz z oznaczanymi lekami. Były to: triazyny: atrazyna i symazyna,<br />
chlorofenoksykwasy: 2,4-D, MCPA i mekoprop oraz pyretroidy: cypermetryna<br />
i lambdacyhalotryna.<br />
69
W monitoringu wód powierzchniowych, których poziom w punktach poboru<br />
próbek jest zmienny często w szerokim zakresie, konieczna jest znajomość<br />
ilości przepływającej wody lub posiadanie innego punktu odniesienia.<br />
W czasie monitoringu oczyszczalni ścieków stwierdzono, że w wodach zrzutowych<br />
z tych instalacji najbardziej stabilnym zanieczyszczeniem i możliwym<br />
do oznaczania w tej samej procedurze analitycznej, jest kofeina.<br />
RUDA Śl. SIEMIANOWICE PANEWNIKI ŻORY GLIWICE<br />
10000<br />
9000<br />
8000<br />
7000<br />
6000<br />
ng/l<br />
5000<br />
4000<br />
3000<br />
2000<br />
1000<br />
0<br />
I/02<br />
V/02<br />
IX/02<br />
XI/02<br />
I/03<br />
III/03<br />
V/03<br />
VII/03<br />
IX/03<br />
XI/03<br />
I/04<br />
III/04<br />
V/04<br />
VII/04<br />
IX/04<br />
XI/04<br />
I/05<br />
III/05<br />
V/05<br />
VII/05<br />
IX/05<br />
Date<br />
Rys. 2. Zawartość kofeiny w wodach zrzutowych (oczyszczonych) wybranych oczyszczalni<br />
ścieków w latach 2002-2005<br />
Śląsk jest regionem silnie zurbanizowanym i większość ścieków komunalnych<br />
jest oczyszczana. Można więc przyjąć, że ilość kofeiny wprowadzanej<br />
do wód powierzchniowych jest w przybliżeniu stała. Jako wartość odnośnikową<br />
zawartości kofeiny w punkcie poboru przyjęto średnią z 12 oznaczeń<br />
z próbek pobieranych co miesiąc. Wartość ta jest na pewno obarczona<br />
znacznym błędem, ale pozwala na porównanie zawartości leków w wodzie<br />
w wybranych przedziałach czasowych.<br />
PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY<br />
Próbki wody pobierano co miesiąc do butelek z ciemnego szkła. Do<br />
próbek dodawano 15 izopropanolu. Następnie próbki sączono i przy użyciu<br />
HCl wyrównywano pH do wartości pH = 4. Wprawdzie najlepsza efektywność<br />
ekstrakcji leków do fazy stałej jest przy pH = 2 (około 88-94%), ale ilość<br />
ekstrahowanej kofeiny jest rzędu zaledwie kilku procent. Przy pH = 4 efektywność<br />
ekstrakcji kofeiny jest 33-35%.<br />
Do ekstrakcji do fazy stałej używano kolumienek 6 ml/100 mg BakerBond<br />
spe C18 Polar Plus (J.T. Baker) kondycjonowanych heksanem 3x3 ml, acetonem<br />
1x3 ml, metanolem 2x3 ml i dejonizowaną wodą 2x3 ml. Ekstrakcję<br />
próbek wody (500-1000 ml) prowadzono pod próżnią z prędkością<br />
8-10 ml/min. Następnie kolumienki przemywano wodą (2x1 ml) i suszono<br />
70
w strumieniu azotu. Anality eluowano mieszaniną metanolu i acetonu (1:1)<br />
– 4x0,5 ml.<br />
Uzyskany ekstrakt odparowywano azotem do sucha i substancje kwaśne estryfikowano<br />
metanolowym roztworem HCl (temp. 60 0 C). W późniejszych badaniach<br />
stosowano silylowanie tych związków odczynnikiem sililującym<br />
BESTFA + TMCS w pirydynie (temp. 60 0 C).<br />
Po przereagowaniu uzupełniano objętość próbki do 0,5 ml i analizowano<br />
chromatograficznie.<br />
WARUNKI ANALIZY CHROMATOGRAFICZNEJ<br />
Analizy prowadzono w chromatografie GC Trace z detektorem masowym<br />
MS Trace Finnigan (ThermoQuest) and autosamplerem CombiPAL (CTC).<br />
Kolumny kapilarne: MDN – 5S 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (Supelco)<br />
DB – 5ms 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (J&W)<br />
Prekolumna: 3 m x 0.32 mm,Injector: 280 0 C splitless,<br />
Objętość dozowanej próbki: 1 µl. Gaz nośny: hel p = 100 kPa.<br />
Termostat: izotermicznie – 100 0 C (3 min), program: 100 0 C – 280 0 C<br />
(15 0 /min), 280 0 C – 15 min.<br />
Detektor MS: Interface – 280 0 C. Źródło jonów EI: 250 0 C. Energia jonizacji:<br />
70eV,<br />
Analizę ilościową prowadzono z wykorzystaniem techniki pojedynczego jonu<br />
(SIM) charakterystycznego dla oznaczanego związku, pozwalającej na<br />
oznaczenie ich stężenia rzędu kilku ng/l.<br />
WYNIKI BADAŃ<br />
W wynikach przedstawiono jedynie część wyników ilustrujących podstawowe<br />
zaobserwowane prawidłowości. Analizę ilościową prowadzono<br />
w oparciu o kalibrację wykonaną dla wybranych jonów (SIM), charakterystycznych<br />
dla oznaczanego leku czy pestycydu. Na rysunku 3 przedstawiono<br />
chromatogram (TIC) ekstraktu próbki wody i chromatogramy SIM wybranych<br />
jonów ibuprofenu.<br />
71
RT: 4.01 - 19.97<br />
Intensity<br />
Intensity<br />
100<br />
50<br />
0<br />
80000<br />
60000<br />
40000<br />
20000<br />
0<br />
30000<br />
20000<br />
10000<br />
0<br />
4.26 5.25 6.65 7.52<br />
4.26 5.95<br />
4.54 5.83<br />
8.37<br />
8.37<br />
11.59<br />
12.79 16.14 16.55<br />
9.83 11.18<br />
16.75<br />
13.54 15.55<br />
17.87<br />
10.72<br />
8.94<br />
7.52<br />
14.61<br />
6.66 8.84 9.86 11.59 13.36 16.65 17.31 18.37<br />
8.37<br />
7.14<br />
8.73 9.05 11.59 12.41 14.84 15.56 16.67 16.97 19.35<br />
6 8 10 12 14 16 18<br />
Time (min)<br />
NL:<br />
1.05E6<br />
TIC MS<br />
GCZAG02<br />
NL:<br />
8.56E4<br />
m/z=<br />
160.5-161.5<br />
MS GCZAG02<br />
NL:<br />
3.52E4<br />
m/z=<br />
205.5-206.5<br />
MS GCZAG02<br />
Rys. 3. Chromatogram (TIC) próbki wody pobranej z Wisły na wlocie do jeziora Goczałkowickiego<br />
(styczeń 2005), oraz chromatogramy pojedynczych jonów (SIM) m/z=161 i m/z=206,<br />
charakterystycznych dla ibuprofenu<br />
Na wykresach (rysunek 4) przedstawiono wyniki uzyskane w przeciągu czterech<br />
lat dla ibuprofenu, ketoprofenu, diklofenaku i karbamazepiny w wybranych<br />
punktach poboru próbek na Wiśle i jej dopływach. W Największych<br />
ilościach w wodach powierzchniowych występuje ibuprofen – lek przeciwbólowy<br />
dostępny bez recepty i szeroko stosowany. Najistotniejszy jest jednak<br />
fakt, że jego ilość w wodach powierzchniowych wykazuje ciągły wzrost. Największe<br />
przyrosty procentowe obserwowano jednak w przypadku ketoprofenu.<br />
Podobną prawidłowość wykazuje też diklofenak. Karbamazepina jest lekiem<br />
stosowanym pomocniczo w wielu chorobach i jego ilości – najniższe,<br />
nie wykazuje tendencji wzrostu.<br />
72
73
Rys. 4. Maksymalne stężenia wybranych leków w latach 2002-2005 w wybranych punktach poboru<br />
w zlewni rzeki Wisły. Punkty poboru: 1 - Rzeka WISŁA (Strumień), 2 - Rzeka WISŁA<br />
(Goczałkowice), 3 - Rzeka PSZCZYNKA, 4 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Siewierz), 5 - Rzeka<br />
CZ. PRZEMSZA (Przeczyce), 6 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Sosnowiec), 7 - Rzeka RAWA<br />
(ujście), 8 - Rzeka BRYNICA (ujście), 9 - Rzeka B. Przemsza (ujście), 10 - Rzeka<br />
CZ. PRZEMSZA (ujście), 11 - Rzeka WISŁA (Babice)<br />
74
Ciekawą rolę pełnią zbiorniki wodne na rzekach. Stężenie leków na wlocie<br />
rzeki do jeziora jest zdecydowanie wyższe niż na wylocie z jeziora. Następuje<br />
więc istotny spadek stężenia leków w zbiornikach wodnych, choć nie jest<br />
pewne, że ulegają one w nich przemianom chemicznym, czy też jest to efekt<br />
sorpcji na osadach dennych. Na rysunku 5 przedstawiono ten efekt dla ibuprofenu.<br />
Rys. 5. Zawartość ibuprofenu na wlocie i wylocie do jeziora Goczałkowickiego i jeziora<br />
w Przeczycach<br />
Oznaczane pestycydy występują w wodach powierzchniowych okresowo, co<br />
wiąże się z cyklem prac polowych i intensywnością opadów. Na rysunku 6<br />
przedstawiono wyniki monitoringu triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboru<br />
w zlewni Odry. Są to wyniki maksymalne pojawiające się zwykle na<br />
przełomie lata i jesieni. W punktach poboru 7 i 8 widoczny jest efekt znacznego<br />
spadku stężenia oznaczanych pestycydów w wodzie na wylocie z jeziora<br />
Dzierżno. Efekt ten opisano wcześniej także w przypadku oznaczanych<br />
leków. Co charakterystyczne, atrazyna i inne triazyny od wielu lat są wycofane<br />
z użycia w rolnictwie. Ich ciągłą obecność w wodach powierzchniowych<br />
można tłumaczyć trwałością triazyn w środowisku lub, co nie wykluczone,<br />
wykorzystywaniem starych zapasów.<br />
75
Rys. 6. Maksymalne stężenia pestycydów – sumy triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboru<br />
zlewni rzeki Odry. Punkt poboru próbki: 1 - ODRA(granica), 2 - Rzeka RUDA (Żory), 3 - Rzeka<br />
RUDA (ujście do Odry), 4 - Rzeka BIERAWKA (ujście), 5 - Rzeka KLODNICA (Ligota),<br />
6 - Rzeka KŁODNICA (Bielszowice), 7 - Jezioro DZIERZNO (wlot), 8 - Jezioro DZIERZNO<br />
(wylot), 9 - ODRA (Kanał Gliwicki)<br />
76
Stosowana w badaniach procedura analityczna jest pracochłonna, ale pozwoliła<br />
na uzyskanie wiarygodnych wyników. Nie sprawdziły się w badaniach<br />
ekstrakcji do fazy stałej SPE tzw. speediski, pozwalające wprawdzie<br />
na duże skrócenie czasu ekstrakcji spe, ale powodujące duży rozrzut wyników.<br />
Uzyskiwane chromatogramy ekstraktów były często bardzo bogate<br />
i nastręczały kłopoty z pełnym rozdziałem oznaczanych analitów od obecnych<br />
w ekstrakcie zanieczyszczeń. Dlatego zastosowanie detektora masowego<br />
i analiza z wykorzystaniem monitorowania pojedynczego jonu (SIM)<br />
pozwoliła na ominięcie problemów z niecałkowitym rozdziałem składników<br />
próbki.<br />
LITERATURA<br />
1. Rodriguez I., Quintana J.B., Carpinteiro J., Carro A.M., Lorenzo R.A., Cela<br />
R.: „Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-mass<br />
spectrometry as tert.-butyldimethylsilyl derivatives”, 2002,<br />
265-274.<br />
2. F. Sacher, F.T. Lange, H.-J. Brauch, J. Blankenhorn, 2001; “Pharmaceuticals<br />
in groundwaters. Analitical methods and results of a monitoring<br />
program in Boden – Württemberg, Germany”; Journal of Chromatography<br />
A, Vol. 938, pp. 199-210.<br />
3. V.Koutsouba, Th. Heberer, B. Fuhrmann, K. Schmidt-Baumler, D. Tsipi,<br />
A. Hiskia, 2003; “Determination of polar pharmaceuticals in sewage water<br />
of Greece by gas – chromatography – mass spectrometry”; Chemosphere,<br />
Vol. 51, pp. 69-75.<br />
4. M. Stumpf, T. Ternes, R.-D. Wilken, S.V. Rodrigues, W. Bauman, 1999;<br />
“Polar drug residues in sewage I natural waters in the state of Rio dr Janerio,<br />
Brazil”; Science of Total Environment, Vol. 225, pp. 135-141.<br />
5. M.A. Soliman, J.A. Pedersen, J.H. Suffet, 2004; “Rapid gas chromatography<br />
– mass spectrometry screening method for human pharmaceuticals,<br />
hormones, antioxidants and plasticizers in water”; Journal of Chromatography<br />
A, Vol. 1029, pp. 223-237.<br />
6. S. Weigel, U. Berger, E. Jensen, R. Kallenborn, H. Thoresen, H. Hühnerfuss,<br />
2004; “Determination of selected pharmaceuticals and caffeine in<br />
sewage and seawater from Tromsø/Norway with emphasis on ibuprofen<br />
and its metabolites”; Chemosphere, Vol. 56, pp 583-592.<br />
7. Ternes Th.A., Occurrence of drugs in German sewage treatment plants<br />
and rivers. Water research. 1998, 32, 3245-3260.<br />
77
78
Marian KAMIŃSKI<br />
Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, 80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,<br />
e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl.; tel: 601-40-18-24, (058) 347-17-29<br />
PREPARATYWNA I PROCESOWA<br />
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA<br />
WPROWADZENIE<br />
Niniejszy artykuł monograficzny został pomyślany jako swego rodzaju<br />
podręcznik i przewodnik optymalnego stosowania kolumnowej elucyjnej<br />
chromatografii cieczowej w skali preparatywnej lub procesowej do rozdzielania<br />
mieszanin substancji, lub grup substancji. Może też być pomocny w pracach<br />
nad optymalizacją warunków preparatywnego stosowania kolumnowej<br />
elucyjnej chromatografii gazowej oraz z eluentem nadkrytycznym, ponieważ<br />
wiele ogólnych reguł jest wspólnych dla optymalnego stosowania wszystkich<br />
technik chromatografii w skali preparatywnej. Oczywiście, chromatografia<br />
gazowa, lub z eluentem nadkrytycznym, tak w skali analitycznej, jak i preparatywnej<br />
posiada wiele specyficznych cech i właściwości. Stąd tylko niektóre<br />
z opisanych dalej zasad optymalnego stosowania preparatywnej i procesowej<br />
chromatografii cieczowej jest wspólnych dla innych technik preparatywnego<br />
stosowania chromatografii.<br />
Chromatografia w sprzężeniu z detekcją to niezastąpione techniki<br />
analityczne o ogromnym i ciągle rosnącym zakresie zastosowań. Przede<br />
wszystkim, jednak, jest to ważna grupa technik rozdzielania, które mogą służyć<br />
do otrzymywania użytkowych ilości czystych substancji ze złożonych<br />
mieszanin. Istnieją takie problemy separacyjne, których rozwiązanie jest dotychczas<br />
możliwe tylko z wykorzystaniem chromatografii. Wówczas chromatografia<br />
jest niezastąpiona. Istnieje wiele innych problemów rozdzielczych,<br />
które można „rozwiązać” innymi technikami rozdzielania, takimi jak, ekstrakcja<br />
przeciwprądowa, metody strącania, membranowe i inne oraz ich kombinacje.<br />
Często okazuje się, że chromatografia jest bardziej efektywną od innych,<br />
techniką uzyskania użytkowych ilości substancji. Jest tak nie tylko<br />
wtedy, gdy można zastosować warunki symulacji przemieszczania złoża<br />
(Simulated Moving Bed) i otrzymywać produkt w sposób ciągły, ale także,<br />
w przypadku periodycznego wykorzystywania tej techniki rozdzielania.<br />
Należy na wstępie podkreślić, że proces rozdzielania i otrzymywania<br />
substancji czystych, z wykorzystaniem chromatografii, jest tym bardziej efektywny,<br />
im wyższa jest selektywność zastosowanego układu rozdzielczego,<br />
a w przypadku chromatografii cieczowej, im mniejsze zapewni się straty eluentu,<br />
tzn., im większy będzie stopień zawracanie eluentu do ponownego<br />
rozdzielania. Stąd, m.in., należy unikać stosowania warunków elucji gradientowej<br />
w przypadku wykorzystywania chromatografii cieczowej do otrzymy-<br />
79
wania substancji, zwłaszcza, w skali procesowej, ponieważ to zawsze podraża<br />
łączne koszty.<br />
Warto też zwrócić uwagę, że doświadczenia ostatnich lat wykazały, iż<br />
szczególnie efektywną ekonomicznie techniką rozdzielania i otrzymywania<br />
substancji w skali preparatywnej i procesowej jest chromatografia z eluentem<br />
nadkrytycznym (P-SFC). Jednakże, można tą techniką rozdzielać tylko<br />
substancje trwałe termicznie oraz nisko i średnio polarne. Rozdzielanie substancji<br />
wysoko polarnych napotyka na trudności związane z koniecznością<br />
stosowania polarnego modyfikatora cieczy nadkrytycznej.<br />
W konsekwencji chromatografia cieczowa w skali preparatywnej lub<br />
procesowej (P-LC, albo P-HPLC) jest obecnie powszechnie i szeroko stosowaną<br />
techniką rozdzielania i otrzymywania czystych substancji i to nie tylko<br />
w laboratoriach, do uzyskiwania wzorców i niewielkich ilości określonych<br />
związków chemicznych dla mikrosyntez, czy zbadania właściwości nowo odkrytych<br />
lub zsyntetyzowanych indywiduów chemicznych, ale także w skali<br />
procesowej, do produkcji, np., insuliny, antybiotyków peptydowych, hormonów,<br />
glikozydów i innych substancji aktywnych biologicznie, w tym, leków itp.<br />
GŁÓWNE OBSZARY ZASTOSOWAŃ CHROMATOGRAFII W SKALI<br />
PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />
Chromatografia w zastosowaniu do otrzymywania czystych substancji<br />
ma dwie nazwy:<br />
- chromatografia preparatywna, gdy ilości otrzymywanych substancji są<br />
niewielkie i otrzymywanie ma charakter sporadyczny;<br />
- chromatografia procesowa (produkcyjna, przemysłowa), gdy proces prowadzony<br />
jest systematycznie, w sposób cykliczny lub ciągły, a ilość produktu<br />
jest znacznie większa (np. otrzymywanie leku, produktu handlowego itp.).<br />
Od początku stosowania chromatografii technika ta była wykorzystywana<br />
dwukierunkowo: jako technika analityczna i jako sposób na wydzielenie<br />
z mieszaniny interesującego składnika (lub składników) mieszaniny.<br />
Przez wiele lat, w okresie poprzedzającym automatyzację i mikroprocesory,<br />
detekcja, analityka ilościowa, a także preparatyka, z zastosowaniem chromatografii<br />
cieczowej, opierała się na stosowaniu szklanej kolumny, wypełnionej<br />
sorbentem i zbieraniu kolejnych frakcji eluatu, ich analizie typowymi<br />
technikami analitycznymi, np. spektrofotometrycznie, czy refraktometrią.<br />
Analityk musiał często użyć do analizy całą ilość wydzielonej substancji,<br />
szczególnie, w przypadku wykonywania analizy śladowej, albo wydzielania<br />
składników występujących w bardzo niskich zawartościach. Im lepsze uzyskiwał<br />
rozdzielenie od składników towarzyszących, tym wynik był bardziej<br />
rzetelny. Na tym etapie rozwoju chromatografii granica pomiędzy chromatografią,<br />
jako techniką analityczną, czy służącą do otrzymywania czystych<br />
substancji nie była wyraźna. Wprowadzenie detektorów przepływowych i rejestratorów,<br />
a później komputerów, wyraźnie rozdzieliło te dwa obszary zastosowań<br />
chromatografii.<br />
80
W chromatografii analitycznej celem jest uzyskanie rozdzielenia interesujących<br />
(czasem wszystkich) substancji w jak najkrótszym czasie, z rozdzielczością<br />
R = ok. 1. Dąży się do zmniejszenia skali procesu i oszczędności<br />
drogich składników eluentu przez zmniejszenie wymiarów kolumny,<br />
zwłaszcza średnicy, dbając równocześnie o jak najwyższą sprawność rozdzielania.<br />
Stosuje się niewielkie objętości roztworu dozowanej mieszaniny,<br />
by obniżyć do minimum tzw. rozmycie poza-kolumnowe. Ze względu na wysoką<br />
czułość współczesnych detektorów ilość dozowanej próbki może być<br />
bardzo mała (poza przypadkami analityki śladowej) i eluat traktowany jest<br />
jako ściek, który zostaje poddany utylizacji.<br />
W skali preparatywnej, lub procesowej stosuje się, natomiast, kolumny<br />
o dużych średnicach i wysokie natężenia przepływu eluentu.<br />
Chromatografia w zastosowaniu preparatywnym jest powszechnie<br />
uważana za szczególnie efektywną technikę rozdzielania wieloskładnikowych<br />
mieszanin w celu otrzymywanie czystych substancji do zastosowań<br />
badawczych lub mikrosyntez, gdy problem rozdzielczy należy do trudnych,<br />
lub bardzo trudnych, gdy możliwy do osiągnięcia współczynnik rozdzielenia<br />
interesującej nas substancji i pasm towarzyszących jest niższy od 1.05.<br />
Również, w skali procesowej znajduje coraz więcej zastosowań do otrzymywania<br />
substancji w ilości nawet do kilkudziesięciu kilogramów na dobę.<br />
Szczególnie, w nowoczesnym przemyśle farmaceutycznym można dzisiaj<br />
spotkać hale produkcyjne, gdzie znajdują się, wyłącznie, kolumny chromatograficzne<br />
i ich oprzyrządowanie w postaci pomp eluentu, pomp dozujących<br />
wsad, zbiorników, kolektorów frakcji, urządzeń do wzbogacania frakcji eluatu<br />
w postaci odparowywaczy próżniowych, lub membranowych wymienników<br />
masy oraz urządzeń do izolacji substancji w postaci krystalicznej z frakcji<br />
eluatu.<br />
Najważniejsze dziedziny preparatywnych i procesowych zastosowań<br />
chromatografii to:<br />
- izolacja produktów biotechnologii, szczególnie białek i enzymów, polisacharydów,<br />
fosfolipidów, określonych fragmentów DNA, lub RNA itp.;<br />
- izolacja produktów naturalnych pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego,<br />
- izolacja produktów oraz zanieczyszczeń powstałych podczas syntezy leków<br />
(farmaceutyków, składników kosmetyków itp.),<br />
- izolacja lantanowców i transuranowców,<br />
- izolacja użytkowych ilości substancji do badań i mikrosyntez w zakresie<br />
chemii organicznej, biochemii, mikrobiologii itp.,<br />
- izolacja izomerów optycznych.<br />
TECHNIKI I MECHANIZMY CHROMATOGRAFII UŻYWANE<br />
W ZASTOSOWANIACH PREPARATYWNYCH ORAZ NAJWAŻNIEJSZE<br />
ZASADY POWIĘKSZANIA SKALI ROZDZIELANIA<br />
Techniki chromatograficzne stosowane w skali preparatywnej i procesowej to:<br />
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia cieczowa (P-LC, lub P-HPLC) – największy<br />
zakres preparatywnych i procesowych zastosowań chromatografii,<br />
81
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia gazowa (P-GC) – zastosowania<br />
głównie do izolacji substancji zapachowych i składników olejków eterycznych,<br />
- Kolumnowa, elucyjna chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym<br />
(P-SFC), najbardziej efektywna ekonomicznie domena zastosowań<br />
chromatografii preparatywnej i procesowej, ale wiąże sie z wieloma<br />
trudnościami metodycznymi i technicznymi,<br />
- „Flush Chromatography” (F-LC) – technika podobna do cienkowarstwowej,<br />
ale realizowana w kolumnie, wypełnionej niezwilżonym sorbentem,<br />
z wykorzystaniem wymuszonego, albo niewymuszonego przepływu eluentu,<br />
- Planarna (cienkowarstwowa) preparatywna chromatografia cieczowa<br />
(P-TLC), przydatna do otrzymywania bardzo niewielkich ilości substancji.<br />
Do celów preparatywnych wykorzystywane są wszystkie poznane<br />
chromatograficzne mechanizmy rozdzielcze i wszystkie znane układy chromatograficzne.<br />
Wykorzystuje się chromatografię adsorpcyjną w układzie faz<br />
normalnych (NP) i odwróconych (RP), chromatografię oddziaływań hydrofilowych<br />
(HILIC), chromatografię jonowymienną (IEC), mechanizmy sita molekularnego<br />
i sączenia molekularnego (GPC/SEC), chromatografię powinowactwa<br />
(AC), mechanizm oddziaływań hydrofobowych (HIC) itd.<br />
Wykorzystuje się te same rodzaje wypełnienia kolumny, jak w chromatografii<br />
analitycznej, ale najczęściej o nieco większych ziarnach oraz jednorazowo<br />
dozuje możliwie jak największą ilość mieszaniny komponentów do<br />
kolumny, w przeliczeniu na masę wypełnienia, tzn., dąży się do uzyskiwania<br />
maksymalnego, możliwy do zastosowania stopnia przeładowania kolumny<br />
(sorbentu). To warunkuje jak najwyższą wydajność otrzymywania substancji.<br />
Na rys. 1 zamieszczono przykłady chromatogramów, uzyskanych<br />
z zastosowaniem kolumn analitycznych, pełniących w tym przypadku funkcję<br />
kolumn modelowych, otrzymane, w warunkach braku przeładowania kolumny<br />
oraz w warunkach różnego stopnia przeładowania stężeniowego, albo<br />
objętościowego, w układach faz odwróconych i normalnych. Warunki rozdzielania<br />
oraz masy substancji w roztworach dozowanych do kolumny<br />
podano w opisie rysunku.<br />
W komentarzu do tego rysunku warto dodać, że szczególne korzyści w zastosowaniach<br />
preparatywnych, daje stosowanie warunków dynamicznie generowanej<br />
fazy stacjonarnej w układach faz normalnych, tzn., z zastosowanie<br />
np. porowatego żelu krzemionkowego, jako sorbentu i mieszaniny<br />
nierozpuszczalnego w wodzie nisko polarnego rozpuszczalnika organicznego<br />
(chlorku metylenu, etylenu, chloroformu, eteru di-etylowego, MTBE, octanu<br />
metylu, etylu itp.), w mieszaninie z niewielką ilością rozpuszczalnika polarnego,<br />
rozpuszczalnego w wodzie (metanolu, etanolu, acetonitrylu,<br />
dioksanu itp.) oraz z niewielkim dodatkiem wody do eluentu - o stężeniu bliskim<br />
stężeniu nasycenia, ale nieco niższym. Takie warunki są bardzo przydatne<br />
do rozdzielania glikozydów, alkaloidów itp. substancji (patrz chromatogramy<br />
na rys. 1 a i a’) i są szczególnie korzystne, pod względem<br />
maksymalizacji produktywności kolumny.<br />
82
Rys. 1. Zestawienie typowych chromatogramów, ilustrujących różne warunki rozdzielania mieszanin tych samych substancji bez i w warunkach<br />
przeładowania kolumny, otrzymane z zastosowaniem kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej w skali modelowej oraz<br />
w warunkach liniowej odpowiedzi detektora – praca nad doborem optymalnych warunków rozdzielania. Szczegółowy opis rysunku na kolejnej<br />
stronie<br />
83
Przykłady a, a’, b, b’, c, c’ dotyczą optymalnych warunków rozdzielania z przeładowaniem stężeniowym,<br />
natomiast, przykłady d – f dotyczą rozdzielania substancji w niekorzystnych układach<br />
chromatograficznych lub w warunkach znikomej rozpuszczalności w eluencie (konieczne<br />
stosowanie przeładowania objętościowego).<br />
a, a’ – rozdzielanie lanatozydów A (LA), B (LB), C (LC) z odpadu poprodukcyjnego, powstałego<br />
podczas otrzymywania lanatozydu C z zastosowaniem ekstrakcji p-prądowej. Przykład wykorzystywania<br />
chromatografii podziałowej z dynamicznie generowaną fazą stacjonarną dla rutynowego<br />
otrzymywania substancji. a: ⎯⎯ warunki przeładowania (2·10 -3 g mix /g morb ); - - - warunki<br />
braku przeładowania („analityczne”); a’: warunki dolnej granicy przeładowania stężeniowego<br />
(2·10 -3 g mix /g morb );<br />
Warunki chromatogr.: kolumna 800x6 mm i.d., Kieselgel SI 60 40-63 um (Merck), eluent:<br />
CH 2 Cl 2 :CH 3 OH:H 2 O 92:8:0,2 V/V, w = 5 ml/min, detektor UV-254 (KABiD), czułość –<br />
1,28 AU/FS (oprócz - - -: 0,08 AU/FS).<br />
b, b’ – rozdzielanie „modelowej” mieszaniny o (oNA), m (mNA), p (pNA)-nitroaniliny w warunkach<br />
chromatografii adsorpcyjnej; b: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego<br />
(6·10 -3 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (6·10 -3 g mix /g morb ), b’: warunki dolnej granicy przeładowania<br />
(2·10 -3 g mix /g morb );<br />
Warunki chromatograficzne: kolumna 100x4 mm i.d., Lichrosorb SI 60 5 um, eluent: n-heptan –<br />
dioksan 8:2 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm (Knauer), długość drogi optycznej 0,4 mm, czułość<br />
– b: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, b’: 0,16 AU/FS.<br />
c, c’: rozdzielanie modelowej mieszaniny estrów CH 3 -, C 2 H 5 -, C 3 H 7 -kwasu 40H benzoesowego<br />
w układzie faz odwróconych (RP18); c: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego<br />
(10 -2 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (10 -5 g mix /g morb ); c’: warunki dolnej granicy przeładowania<br />
stężeniowego (2x10 -4<br />
g mix /g morb ); Warunki chromatograficzne: kolumna 120x4 mm i.d.,<br />
Nucleosil RP18 7 um, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm, długość<br />
drogi opt. 0,4 mm (Knauer), czułość - c: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, c’: 0,32 AU/FS.<br />
d – rozdzielanie estrów kwasu 4-OH benzoesowego: C 3 H 7 - (1), C 2 H 5 - (2), CH 3 - (3) w układzie<br />
faz normalnych na żelu krzemionkowym Lichrosorb SI 60 5 um – kolumna 250x4 mm i.d., eluent:<br />
heptan – dioksan 8:2 V/V, 2 ml/min, 256 nm; ⎯⎯ warunki granicy przeładowania stężeniowego,<br />
- - - warunki „analityczne”;<br />
e, f – rozdzielanie o, m, p – nitroaniliny (patrz rys. 1b, b’) w układzie faz odwróconych: Nucleosil<br />
C18 7 μm, kolumna 120x4 mm, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 2 ml/min, e – warunki granicy<br />
przeładowania stężeniowego, f – warunki „analityczne”;<br />
g – rozdzielanie benzenu (c i = 2 mg/ml, pik 1) i naftalenu (c i = 0,2 mg/ml, pik 2) w warunkach<br />
znikomej rozpuszczalności substancji w eluencie: ⎯⎯ obj. dozowania 2 ml, warunki typowego<br />
przeładowania objętościowego, - - - obj. dozow. 20 μm warunki „analityczne”; kolumna: Nucleosil<br />
C18 7 μm, 250x4 mm i.d., 1 ml/min; W przypadku chromatogramów d-f detektor UV<br />
254 nm, droga opt. 0,4 mm.<br />
Najczęściej optymalne warunki rozdzielania w skali preparatywnej,<br />
a szczególnie w skali procesowej dobiera się z zastosowaniem kolumny<br />
modelowej. Dotyczy to doboru selektywności układu chromatograficznego,<br />
sprawności rozdzielania - wielkość ziaren wypełnienia, długości kolumny,<br />
prędkości przepływu eluentu, możliwego do osiągnięcia stopnia przeładowania<br />
sorbentu oraz położenia na chromatogramie punktów zbierania frakcji<br />
itp. parametrów decydujących o efektywności rozdzielania i zbierania frakcji<br />
eluatu oraz o czystości otrzymywanego produktu. Funkcję kolumny modelowej<br />
pełni często kolumna analityczna, albo semi-preparatywna o średnicy<br />
dc = 4 - 8 mm, jednak, nie jest to optymalne, ponieważ kolumna modelowa<br />
powinna być wypełniona nie tylko tego samego typu sorbentem, jak preparatywna,<br />
ale tym samym sorbentem, także w zakresie wielkości ziaren oraz<br />
powinna być tej samej długości, jak kolumna preparatywna, albo procesowa.<br />
Następnie można w sposób bardzo prosty dokonać powiększenia skali roz-<br />
84
dzielania, przechodząc do stosowania kolumny o odpowiednio większej<br />
średnicy, nie zmieniając ani sorbentu, ani długości kolumny. Średnicę kolumny<br />
preparatywnej, konieczną do uzyskania potrzebnej wydajności rozdzielania,<br />
oblicza się wówczas, zakładając odpowiednie zwiększenie objętości<br />
dozowanej mieszaniny substancji rozdzielanych oraz natężenia<br />
przepływu eluentu, proporcjonalnie do stopnia zwiększenia pola przekroju<br />
poprzecznego wypełnienia kolumny preparatywnej lub procesowej i modelowej.<br />
Na rys. 2 naszkicowano schematycznie opisaną powyżej zasadę postępowania<br />
w związku z doborem optymalnych warunków rozdzielania substancji<br />
w skali preparatywnej, albo procesowej.<br />
Rys. 2. Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania<br />
w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej.<br />
M – skala modelowa rozdzielania, P – skala preparatywna i procesowa rozdzielania<br />
Warto też zwrócić uwagę, że w prawie wszystkich w/w domenach zastosowań<br />
chromatografii - szczególnie, gdy trzeba rozdzielać tylko dwie<br />
substancje i gdy nie jest konieczne stosowanie elucji gradientowej - jest<br />
możliwe wykonywanie rozdzielania w warunkach procesu ciągłego (SMB).<br />
Polega on na równoczesnej pracy ośmiu do kilkunastu kolumn, z odpowiednim<br />
przesunięciem fazy rozdzielania w każdej z nich. Roztwór rozdzielanych<br />
substancji („wsad”) i eluent („ekstrahent”), wprowadza się w sposób ciągły<br />
oraz w sposób ciągły odbiera się składnik A (o niższej retencji – „ekstrakt)<br />
i składnik B (o wyższej retencji – „rafinat”). Odpowiednie miejsca doprowadzania<br />
/ odbioru w/w strumieni są okresowo zmieniane przez odpowiedni<br />
system sterowania komputerowego. W konsekwencji frakcje eluentu, zawierające<br />
poszczególne rozdzielane substancje są zbierane bez przerwy. W takich<br />
przypadkach okazuje się, że chromatografia może być najbardziej opłacalna<br />
ekonomicznie ze wszystkich technik rozdzielania, możliwych<br />
potencjalnie do stosowania.<br />
85
ZJAWISKA PRZEŁADOWANIA KOLUMNY (POWIERZCHNI<br />
SORPCYJNEJ) I ICH EFEKTYWNE WYKORZYSTANIE W WARUNKACH<br />
CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />
Różnica warunków preparatywnych, w porównaniu do warunków<br />
chromatografii analitycznej, polega na konieczności wykorzystania w maksymalnym<br />
stopniu powierzchni sorpcyjnej, lub fazy stacjonarnej. Im wyższy<br />
udaje się osiągnąć stopień przeładowania kolumny, tym bardziej efektywny<br />
ekonomicznie jest proces rozdzielczy. Przy czym, rozdzielanie jest szczególnie<br />
efektywne, gdy można uzyskać warunki silnego przeładowania stężeniowego<br />
kolumny. Istnieje wówczas możliwość rozdzielania jednorazowo do<br />
ok. 10 -2 g mieszaniny rozdzielanych substancji / g sorbentu typu żel krzemionkowy<br />
lub chemicznie modyfikowany żel krzemionkowy i uzyskiwanie<br />
produktu o czystości powyżej 99.99 %. Może to, jednak, mieć miejsce tylko<br />
wtedy, gdy rozpuszczalność rozdzielanych substancji w eluencie jest dostatecznie<br />
wysoka oraz, gdy kolumna o wysokiej sprawności (wysokiej liczbie<br />
półek teoretycznych), wypełniona techniką zawiesinową na mokro, albo na<br />
mokro - techniką dynamicznej kompresji aksjalnej (DAC), jest wykorzystywana<br />
w warunkach „niekończonej średnicy). Wówczas piki chromatograficzne<br />
są kształtu zbliżonego do trójkąta prostokątnego, którego prawy dolny<br />
wierzchołek leży w punkcie retencji, jaka by została uzyskana w warunkach<br />
braku przeładowania (analitycznych - patrz rys. 1 a, b, c).<br />
W przypadku niskiej rozpuszczalności rozdzielanych substancji w eluencie<br />
możliwe jest uzyskanie jedynie przeładowania objętościowego. Nie<br />
można wówczas osiągnąć tak wysokiej efektywności ekonomicznej rozdzielania<br />
– teoretycznie, nawet 50 razy mniejszą, niż w warunkach przeładowania<br />
stężeniowego. Piki chromatograficzne mają, wówczas, kształt zbliżony<br />
do prostokąta, co jest spowodowane koniecznością dozowania dużych objętości<br />
roztworu substancji rozdzielanych o stosunkowo niskim stężeniu (patrz<br />
rys. 1g).<br />
W przypadku trudnych, lub bardzo trudnych problemów separacyjnych<br />
(współczynnik selektywności α zbliżony do 1.01), Dąży się również do prowadzenia<br />
rozdzielania w warunkach przeładowania kolumny, lecz w praktyce<br />
konieczne jest poprzestanie na dozowaniu jednorazowo do kolumny tylko<br />
takiej ilości mieszaniny substancji rozdzielanych, aby nie przekraczać granicy<br />
liniowości odpowiedniej izotermy sorpcji (w praktyce do ok. 5.10 -4 g/g sorbentu<br />
typu żel krzemionkowy i fazy stacjonarne związane do powierzchni żelu<br />
krzemionkowego). W przeciwnym razie strefy rozdzielanych substancji<br />
nakładają się na siebie wzajemnie i czystość rozdzielanych substancji będzie<br />
niewielka. Wówczas efektywność ekonomiczna separacji też pozostaje<br />
niewielka (patrz rys. 1 d, e).<br />
Opisane powyżej reguły mają bezpośredni związek ze zjawiskami<br />
sorpcji substancji rozdzielanych na powierzchni wypełnienia kolumny i z rodzajem<br />
izotermy sorpcji. Najczęściej izoterma sorpcji ma w warunkach<br />
chromatografii, w tym, cieczowej - charakter izotermy Langmuira, Zdarzają<br />
się też bardzo korzystne dla wydajności rozdzielania, przypadki, sorpcji wie-<br />
86
lowarstwowej, gdy charakter izotermy sorpcji jest wklęsły (typu „S”). Na<br />
rys. 3. zamieszczono zestawienie różnych warunków rozdzielania, wykorzystywanych<br />
w chromatografii preparatywnej przy niewielkim i znacznym stopniu<br />
przeładowania kolumny oraz rodzaje spotykanych izoterm sorpcji i związek<br />
zakresu stężenia w roztworze dozowanym do kolumny z zakresem<br />
izotermy sorpcji oraz kształtem pików i zmianą retencji substancji w porównaniu<br />
do warunków braku przeładowania (warunków „analitycznych”).<br />
W podpisie pod rysunkiem zamieszczono dodatkowe wyjaśnienia.<br />
Rys. 3.<br />
Część I: Zestawienie form pików chromatograficznych dla pojedynczej substancji eluowanej<br />
w kolumnie chromatograficznej, w zależności od typu przeładowania kolumny (po lewej stronie<br />
cyfr odniesienia naszkicowano profile stężenia w chwili dozowania roztworu substancji eluowanej<br />
do kolumny).<br />
Oznaczenia: 1 – brak przeładowania kolumny, 2 – dolna granica przeładowania danego typu,<br />
3 – typowy przykład przeładowania danego typu;<br />
Część II: Kształty i zakresy izoterm sorpcji odpowiednie dla pików chromatograficznych zamieszczonych<br />
powyżej (linią pogrubioną zaznaczono zakresy izoterm sorpcji charakterystyczne<br />
dla danego typu przeładowania kolumny);<br />
Część III: Zestawienie charakteru typowych chromatogramów otrzymanych w przypadku rozdzielania<br />
dwóch substancji w warunkach danego typu przeładowania kolumny, odpowiednio:<br />
z zachowaniem warunku Rs=1 (środka części fragmentu III – piki rozdzielane praktycznie do<br />
poziomu linii bazowej) i po zwiększeniu ilości substancji wprowadzonej do kolumny (piki częściowo<br />
„nałożone” wzajemnie). W górnym fragmencie cz.III naszkicowano odpowiednie chromatogramy<br />
otrzymane w warunkach braku przeładowania (tzw. „warunkach analitycznych”);<br />
87
ZASADY OPTYMALNEGO STOSOWANIA PREPARATYWNEJ<br />
I PROCESOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ<br />
Parametry opisujące wydajność i produktywność kolumny<br />
Wydajność kolumny definiuje się jako masę interesującej nas substancji,<br />
otrzymywaną w jednostce czasu (1):<br />
R h = Q r / t c (1)<br />
Produktywność kolumny w chromatografii preparatywnej i procesowej<br />
jest definiowana najogólniej w ten sposób, że jest obliczana da jednostki<br />
przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny (2). To pozwala porównywać<br />
efektywność rozdzielania tych samych substancji z zastosowaniem kolumn<br />
o różnych wymiarach, a wartość maksymalna oznacza optimum generalne.<br />
W każdym przypadku obliczenia oraz porównywanie wyników jest wykonywane<br />
dla warunków otrzymywania produktu o takiej samej czystości:<br />
P t<br />
Q<br />
Q<br />
r<br />
*<br />
i<br />
Qi<br />
t A<br />
= [<br />
c<br />
kg<br />
2<br />
h * m<br />
] (2)<br />
P t - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostki<br />
czasu i dla<br />
jednostki powierzchni przekroju kolumny;<br />
Q i - masa substancji wprowadzona do kolumny;<br />
Q r - masa substancji o czystości (p) , otrzymana z kolumny;<br />
t c - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania<br />
– czas trwania jednego etapu rozdzielania);<br />
A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πd c 2 /4 ;<br />
Wyrażenie<br />
Q<br />
Q<br />
r<br />
i<br />
nazwane jest stopniem odzysku.<br />
Przedstawione wyrażenia uwzględnia stronę „korzyści”. Do strony<br />
„koszty”, należą koszty związane ze bezpowrotnym zużyciem składników<br />
eluentu (jeśli ma miejsce), usuwaniem składników eluentu z frakcji eluatu<br />
i odzyskiem eluentu, cena kolumny i urządzeń pomocniczych, koszty robocizny<br />
itd.<br />
Optymalne przeładowanie kolumny w warunkach pracy preparatywnej<br />
jest najczęściej takie, aby wartość R między izolowaną substancją, a najbliższymi<br />
„zanieczyszczeniami”, widocznymi na chromatogramie wynosiła ok. 1.<br />
W warunkach rozdzielania procesowego korzystne jest stosowanie wyższego<br />
stopnia przeładowania, utrzymując R na optymalnym poziomie (często<br />
ok. 0.75) i „wycinając” oraz zawracając do ponownego rozdzielania, odpo-<br />
88
wiednie między-frakcje. Trzeba dodać, że eksperymentalne określenie<br />
optymalnej wartości R oraz punktów zbierania frakcji, zapewniających<br />
otrzymanie maksymalnej produktywności kolumny i wymaganej czystości<br />
produktu jest bardzo pracochłonne. Jeżeli nie dysponujemy odpowiednim<br />
poprawnym komputerowym modelem rozdzielania, warto to wykonać doświadczalne<br />
tylko wtedy, gdy optymalizuje się przeładowanie kolumny i zbieranie<br />
frakcji dla warunków procesowego rozdzielania i dla produkcji substancji.<br />
Dla sporadycznego wykonywania rozdzielania preparatywnego,<br />
znacznie bardziej celowe jest jednorazowe dozowanie takiej objętości możliwie<br />
stężonej mieszaniny substancji, by otrzymywać R ok. 1 i zbierać cały<br />
zakres pików interesujących nas substancji widocznych na chromatogramie.<br />
Zasadę doboru optymalnej ilości jednorazowo dozowanej do kolumny<br />
mieszaniny substancji w warunkach chromatografii preparatywnej, albo procesowej<br />
zilustrowano na rys. 4.<br />
Do parametrów, które mają istotny wpływ na wydajność preparatywnego,<br />
albo procesowego rozdzielania należą: ilość dozowanej substancji<br />
(Vi * Ci), średnica kolumny (dc), długość wypełnienia kolumny (Lc), natężenie<br />
przepływu eluentu (w), powierzchnia właściwa materiału stanowiącego<br />
wypełnienie kolumny (F), wielkość ziaren wypełnienia (dp), wartość współczynnika<br />
retencji substancji izolowanej (ki) i współczynnika retencji ostatniego<br />
piku (kn). Wpływ każdego z tych parametrów na wydajność rozdzielania<br />
wymaga oddzielnego omówienia.<br />
Ilość dozowanej substancji<br />
Ilość dozowanej substancji (m i ) określona jest iloczynem objętości (V i )<br />
i stężenia izolowanej substancji (c i ):<br />
m i = V i * c i (3)<br />
Rys. 4. Ilustracja zasady określania ilości substancji dozowanych jednorazowo do kolumny oraz<br />
wyznaczania punktów zbierania frakcji w warunkach chromatografii procesowej<br />
89
- przeładowanie objętościowe<br />
W chromatografii analitycznej próbka jest dozowana w taki sposób,<br />
aby ze wzrostem dozowanej ilości m i rosła tylko wysokość piku. Aby spełnić<br />
ten warunek objętość próbki nie powinna przekroczyć około ¼ szerokości<br />
piku (wyrażonej w jednostkach objętości), mierzonej przy podstawie piku,<br />
a stężenie nie powinno być większe niż 10 -4 g substancji na g wypełnienia<br />
kolumny.<br />
Zwiększenie objętości dozowania (bez wzrostu stężenia – warunki<br />
przeładowania objętościowego), powoduje wzrost wysokości i szerokości piku.<br />
Jeżeli objętość przekroczy graniczną wartość, dalszy wzrost powoduje<br />
wyłącznie poszerzenia pasm. W takim przypadku stężenie substancji w eluacie<br />
obserwowane jako wysokość piku nie zmienia się (pojawi się „odcinek”<br />
piku o stałej wysokości). Objętość, od której obserwuje się pik z plateau wynosi<br />
około 6 odchyleń standardowych piku otrzymanego po dozowaniu<br />
próbki analitycznej, tj. o znikomej objętości i niskim stężeniu.<br />
Wzrost szerokości piku będący wynikiem dużej objętości dozowania<br />
odbywa się poprzez wzrost objętości elucji opadającej części piku, podczas<br />
gdy położenie frontu piku nie ulega zmianie i odpowiada położeniu piku<br />
w warunkach chromatografii analitycznej i nie zależy od retencji substancji<br />
ani jej rodzaju. Maksymalną objętość, którą można dozować w celu zwiększenia<br />
wydajności procesu można oszacować z chromatogramu, otrzymanego<br />
dla próbki analitycznej. Jest to, zmierzona na poziomie linii podstawowej<br />
i wyrażona w jednostkach objętości - odległość pomiędzy pikami<br />
substancji, które są celem rozdzielania.<br />
- przeładowanie stężeniowe<br />
Wzrost stężenia substancji w próbce dozowanej do kolumny (przy zachowaniu<br />
małej objętości dozowania (V i )), powoduje poszerzenie pasma,<br />
a kształt pików zależy od rodzaju izotermy sorpcji (patrz rys. 3 oraz 1 i 4), ale<br />
także od stopnia nieliniowości odpowiedzi detektora. Zależności retencji od<br />
kształtu izotermy sorpcji przedstawiono schematycznie na rys 3, a dla pików<br />
otrzymywanych w praktyce, na rys. 1.<br />
Adsorpcja substancji z roztworów w układach ciecz - ciało stałe najczęściej<br />
przebiega wg izotermy Langmuira. W nieliniowym zakresie tej izotermy,<br />
dla wysokiego stężenia substancji, wartość współczynnika retencji (k)<br />
maleje ze wzrostem stężenia, tzn., że ta część pasma, gdzie jest wyższe<br />
stężenie wędruje szybciej. Pasmo staje się niesymetryczne, w kształcie trójkąta,<br />
ze stromym frontem. Wzrost stężenia próbki powoduje wzrost wysokości<br />
maksimum piku i poszerzenie pasma przez zmniejszenie objętość elucji<br />
frontu. Tył piku pozostaje w przybliżeniu w tym samym miejscu, jak dla piku<br />
analitycznego.<br />
Zwiększanie wydajności procesu rozdzielania preparatywnego poprzez<br />
wzrost stężenia roztworu dozowanego jest bardziej korzystne, niż zachowywanie<br />
przeładowania objętościowego (ze względu na większe stęże-<br />
90
nie substancji w eluacie, można uzyskać ponad 50-cio krotny wzrost wydajności<br />
kolumny). Ograniczeniem jest rozpuszczalność składników<br />
rozdzielanej mieszaniny w eluencie, która z reguły maleje ze wzrostem retencji<br />
rozdzielanego składnika.<br />
Powyższe stwierdzenia są poprawne, przy założeniu, że rozpuszczalnikiem<br />
roztworu dozowanego do kolumny jest eluent (albo ciecz o początkowym<br />
składzie, w przypadku elucji gradientowej) oraz gdy lepkość roztworu<br />
dozowanego jest niewiele wyższa od lepkości eluentu. Gdy rozpuszczalnikiem<br />
jest ciecz o wyższej sile elucyjnej niż eluent i/albo roztwór dozowany<br />
jest bardzo lepki, to ze wzrostem stężenia roztworu dozowanego do kolumny<br />
chromatograficznej mogą być związane dodatkowe problemy, powodujące<br />
w konsekwencji różnego typu zniekształcenia pików chromatograficznych.<br />
Efekty te zilustrowano na rys. 5.<br />
Rys. 5. Zestawienie zaobserwowanych w praktyce rodzajów zniekształceń pików<br />
chromatograficznych w warunkach chromatografii preparatywnej z uwzględnieniem warunków,<br />
gdy inna ciecz niż faza ruchoma pełni rolę rozpuszczalnika dla sporządzenia roztworu<br />
dozowanego do kolumny<br />
Oznaczenia:<br />
a – kształt piku w warunkach górnej granicy braku przeładowania<br />
a 1 – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania objętościowego<br />
b – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania stężeniowego<br />
b 1 – zniekształcenie piku spowodowane zbyt wysoką różnicą lepkości i napięć powierzchniowych<br />
między roztworem dozowanym do kolumn i eluentem<br />
b 2 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonej<br />
w eluencie – przypadek „wypadania oleju” podczas dozowania<br />
b 3 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonej<br />
w eluencie – przypadek „wypadania kryształów” podczas dozowania<br />
- kształt piku bez przeładowania, lub w warunkach górnej granicy braku przeładowania oraz<br />
usytuowanie piku w tych warunkach<br />
c – naturalny kształt piku w warunkach izotermy sorpcji typu „s” (dość rzadki, lecz korzystny<br />
przypadek w praktyce)<br />
c s , c m – stężenia substancji rozdzielanej odpowiednio: w fazie stacjonarnej (s) i ruchomej (m) jako<br />
oznaczenia osi odpowiednich izoterm sorpcji naszkicowanych w pobliżu odpowiadającym im<br />
pikom chromatograficznym<br />
91
Średnica kolumny<br />
Najbardziej celowe jest powiększanie skali rozdzielania substancji z zastosowaniem<br />
kolumn tej samej długości, wypełnionych tym samym sorbentem,<br />
z zachowaniem tego samego układu chromatograficznego i warunków pełnego<br />
podobieństwa fizycznego. Zwiększeniu powinna, więc, ulec tylko średnica<br />
kolumny. Wydajność otrzymywania produktu wzrośnie proporcjonalnie<br />
do zmiany powierzchni przekroju poprzecznego kolumny, a więc proporcjonalnie<br />
do drugiej potęgi zmiany średnicy kolumny z modelowej do preparatywnej.<br />
d<br />
m<br />
2<br />
= m1<br />
*<br />
(4)<br />
d<br />
2<br />
c2<br />
2<br />
c1<br />
m<br />
2<br />
, m<br />
1<br />
- masy substancji, dozowanych, odpowiednio, do kolumny o średnicy<br />
d<br />
c2<br />
i d<br />
c1<br />
;<br />
Według tej samej proporcji należy również zwiększyć natężenie przepływu<br />
eluentu, a więc, odpowiednio wzrośnie zużycie eluentu. Natomiast, liniowa<br />
prędkość przepływu eluentu powinna być zachowana bez zmiany. Nie powinien<br />
też zmienić się czas rozdzielania, położenie punktów zbierania frakcji<br />
na chromatogramie, sprawność kolumny, ani ciśnienie pompowania eluentu.<br />
Pod warunkiem, jednak, opanowania umiejętności uzyskiwania takiej samej<br />
sprawności kolumny modelowej i preparatywnej lub procesowej, co nie zawsze<br />
jest łatwe do osiągnięcia, choć z pewnością możliwe. Zależność wydajności<br />
i niektórych innych parametrów procesu rozdzielania w funkcji średnicy<br />
kolumny, pozostają wtedy zgodne z wyrażeniem (4). Zależność (4) dotyczy<br />
także zmiany wydajności otrzymywania substancji (R i ), objętości dozowania<br />
(Vi) i natężenia przepływu eluentu (w).<br />
Długość kolumny<br />
Wraz z długością kolumny (L c ) proporcjonalnie rośnie masa wypełnienia,<br />
lecz liczba półek teoretycznych jest proporcjonalna do L<br />
c<br />
, stąd<br />
w dłuższej kolumnie pasma substancji są bezwzględnie bardziej rozmyte,<br />
ale względnie - mniej. Wzrost długości kolumny powoduje też zwiększenie<br />
oporów przepływu (ΔP), co, w przypadku ograniczenia maksymalnego ciśnienia<br />
pracy aparatury preparatywnej lub procesowej może uniemożliwić<br />
uzyskanie optymalnego natężenia przepływu eluentu.<br />
Istnieje najmniejsza, krytyczna długość kolumny (Lc min ), wypełnionej<br />
określonym sorbentem, a w istocie najmniejsza liczba tzw. półek teoretycznych<br />
kolumny (N min ), która warunkuje minimalny konieczny stopień rozdzielenia<br />
interesujących nas substancji, wzajemnie od siebie, albo od niepożą-<br />
92
danych składników. Zwiększenie długości kolumny, powyżej tej krytycznej,<br />
minimalnej długości, jest bardzo korzystne i celowe, zwłaszcza, gdy jednocześnie<br />
można zwiększać wartość liniowej prędkości przepływu eluentu (u).<br />
Umożliwia to znaczne zwiększenie wydajności rozdzielania. Zależność produktywności<br />
kolumny (P t ) od jej długości (Lc), otrzymana w warunkach stałej<br />
prędkości liniowej eluentu (u) jest, jednak, nieliniowa. Osiąga się optymalną<br />
długość kolumny - znacznie większą, niż potrzebna do rozdzielania analitycznego,<br />
w warunkach bez przeładowania, jednak dalsze zwiększanie długości<br />
kolumny jest już niecelowe. Dla warunków zachowania stałej wartości<br />
prędkości przepływu eluentu zilustrowano to na rys. 6, pokazującym u góry<br />
wykresy zależności produktywności kolumny od długości wypełnienia,<br />
otrzymane na podstawie równań uzyskanych teoretycznie przez Hupe i Lauera,<br />
oraz poniżej, wykresy uzyskane doświadczalne, podczas pracy nad<br />
optymalizacją warunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszu<br />
z brunatnicy wełnistej.<br />
Rys. 6. Zależność produktywności czasowej (P t ) kolumny chromatograficznej od długości (Lc)<br />
kolumny w warunkach stałej prędkości przepływu eluentu. Krzywe a, b, c, d, zostały uzyskane<br />
w wyniku obliczeń teoretycznych przez Hupe i Lauera, odpowiednio, dla wypełnień o wielkości<br />
ziaren dp = 5, 7, 10, 32.5 μm, a krzywe 1, 2, 3, podczas badań nad optymalizacją warunków<br />
otrzymywania lanatozydu C z ekstraktu suszu z brunatnicy wełnistej dla kolumn wypełnionych<br />
żelem krzemionkowym o średnich wielkościach ziaren, odpowiednio: 10, 45, i 102 μm<br />
93
Średnica ziaren wypełnienia kolumny<br />
Średnica ziaren wypełnienia ma zasadniczy wpływ na sprawność kolumny.<br />
Krytyczną, minimalną liczbę półek teoretycznych, niezbędną do preparatywnego<br />
rozdzielenia mieszaniny substancji można osiągnąć zmieniając<br />
długość kolumny, albo / i średnicę ziaren wypełnienia kolumny. Przy zmianie<br />
skali procesu rozdzielania w warunkach przeładowania objętościowego,<br />
L c<br />
ważna jest nie tyle sama długość kolumny L c , lecz stosunek<br />
d 2p , tj. proporcja<br />
długości kolumny do kwadratu średnicy ziaren wypełnienia. W warunkach<br />
przeładowania stężeniowego korzystne jest jednoczesne zmniejszanie wielkości<br />
ziaren wypełnienia oraz długości kolumny, jednak, zachowanie stałej<br />
Lc<br />
wartości proporcji nie jest wówczas optymalną regułą. Bardziej korzystne<br />
jest zastosowanie o ok. 30% dłuższej kolumny, niż to wynika z obliczenia<br />
2<br />
dp<br />
otrzymanego na podstawie tej reguły. Zachowując te proporcje oraz zwiększając<br />
jednocześnie prędkość przepływu eluentu, można uzyskać znaczący<br />
wzrost wydajności rozdzielania preparatywnego lub procesowego, z zachowaniem<br />
stałej czystości produktu.<br />
Można generalnie stwierdzić, że zmniejszanie wielkości ziaren wypełnienia<br />
kolumny preparatywnej (dp) jest zawsze bardzo korzystne dla uzyskiwania<br />
wzrostu wydajności procesu rozdzielania oraz czystości otrzymywanych<br />
substancji i jest tym bardziej celowe, im trudniejszy jest problem<br />
rozdzielczy (im mniejsze wartości α). Ograniczeniem może być, jednak,<br />
maksymalna wartość ciśnienia (ΔP max ), jakie można zastosować do rozdzielania.<br />
Optymalną wielkość ziaren wypełnienia kolumny preparatywnej lub<br />
procesowej można określić jako wartość w zakresie 10-25 mikrometrów i jest<br />
ona tym niższa, im trudniejszy jest problem rozdzielczy (im niższa wartość α<br />
w warunkach bez przeładowania kolumny).<br />
W przypadku rozdzielania substancji makromolekularnych, ich bardzo<br />
niekorzystna kinetyka dyfuzji (niskie wartości współczynników dyfuzji) powodują,<br />
że zwiększanie liniowej prędkości przepływu jest niekorzystne i prowadzi<br />
do znacznego względnego poszerzenia pików. Wówczas zmniejszanie<br />
wielkości ziaren wypełnienia i, jeśli to możliwe z jednoczesnym zwiększaniem<br />
temperatury pracy kolumny, w zasadniczym stopniu poprawia rozdzielczość<br />
R i umożliwia zwiększanie przeładowania, a stąd i wydajności oraz<br />
produktywności kolumny.<br />
Prędkość przepływu fazy ruchomej<br />
Wzrost prędkości przepływu fazy ruchomej powyżej prędkości optymalnej<br />
dla zależności H=f(u), powoduje zmniejszenie czasu trwania rozdzielania<br />
i tym samym wzrost wydajności kolumny. Wpływa, jednak, ujemnie na<br />
sprawność rozdzielania, powodując poszerzenie pasm. To, przy założonej<br />
czystości wydzielanej substancji, wymusza konieczność zmniejszenia masy<br />
94
dozowanej próbki albo zmniejszenie objętości zbieranych frakcji. Spadek<br />
sprawności kolumny powoduje też zmniejszenie stężenia substancji w eluacie<br />
wypływającym z kolumny. Należy, jednocześnie, brać pod uwagę ograniczenia,<br />
wynikające z możliwości uzyskana odpowiednio wysokiego ciśnienia<br />
pompowania eluentu na wlocie do kolumny oraz ograniczoną<br />
wytrzymałość mechaniczną kolumny i jej wypełnienia.<br />
Bez uwzględniania ograniczeń wytrzymałościowych, zależność produktywności<br />
kolumny (P t ) od szybkości przepływu eluentu (u) nie jest liniowa<br />
i posiada maksimum, którego wartość jest tym wyższa im mniejsze są ziarna<br />
wypełnienia kolumny (dp). Dalsze zwiększanie prędkości eluentu jest nieopłacalne<br />
i z wielu powodów niekorzystne. Zilustrowano to na rys. 7 pokazującym<br />
u góry wykresy zależności, otrzymanych na podstawie równań otrzymanych<br />
teoretycznie przez Hupe i Lauera oraz poniżej - krzywe, otrzymane<br />
na podstawie wyników uzyskanych doświadczalne podczas pracy nad optymalizacją<br />
warunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszu brunatnicy<br />
wełnistej.<br />
Rys. 7. Zależność produktywności czasowej kolumn chromatograficznych wypełnionych<br />
sorbentem o różnych wielkościach ziaren od prędkości przepływu eluentu. Krzywe teoretyczne<br />
wzięto z pracy Hupe i Lauera Krzywe eksperymentalne otrzymano podczas badań<br />
nad doborem optymalnych warunków procesu otrzymywania lanatozydu C.<br />
Oznaczenia: a, b – dp = 102 μm, Lc odpowiednio: 800 mm (a) i 1600 mm (b);<br />
c, d, e – dp = 50 μm, Lc odpowiednio: 400, 800 i 1200 mm; f – dp = 10 μm, Lc = 250 mm<br />
95
Retencja<br />
Silna retencja składników mieszaniny jest niekorzystna ze względu na<br />
nadmierne zużycie eluentu, a przede wszystkim wzrost czasu rozdzielania.<br />
Jednakże, dla dwóch substancji o różnej retencji, względnie wolniej rośnie<br />
szerokość pasma wraz z ilością dozowanej substancji dla pików o większej<br />
retencji, niż dla substancji o niższej wartości k. Optymalna wartość współczynnika<br />
retencji (k) dla pierwszego rozdzielanego składnika mieszaniny<br />
dwóch substancji nie powinna przekraczać 2-3, a dla ostatniego powinna<br />
być większa od 2-3, ale nie wyższa niż ok. 12 [3].<br />
Maksymalizacja selektywności, czyli wartości α, ma najważniejsze<br />
znaczenie dla maksymalizacji wydajności rozdzielnia substancji w chromatografii<br />
preparatywnej lub procesowej, niezależnie od stosowanej techniki<br />
chromatograficznej.<br />
Korzystne jest stosowanie sorbentów o dużej powierzchni właściwej<br />
(o ziarnach wypełnienia całkowicie porowatych, albo posiadających nieporowate<br />
„jądro”, o bardzo niewielkiej średnicy.<br />
Odkrycie ostatnio technologii otrzymywania, tzw., monolitycznych wypełnień<br />
kolumn HPLC o bardzo niskiej wartości impedancji rozdzielania jest<br />
szczególnie ważne dla rozwoju wykorzystania chromatografii cieczowej<br />
w skali preparatywnej i procesowej. Tego typu kolumny umożliwiają otrzymywanie<br />
zasadniczo wyższych wydajności preparatywnego rozdzielania<br />
substancji o niewysokich masach cząsteczkowych, niż kolumny „klasyczne”,<br />
wypełnione ziarnistym sorbentem.<br />
Optymalne warunki preparatywnego albo procesowego otrzymywania<br />
substancji<br />
Podsumowując przedstawione powyżej reguły optymalizacji warunków<br />
preparatywnego lub procesowego rozdzielania substancji z wykorzystaniem<br />
chromatografii cieczowej, można podać następujące ogólne zasady<br />
maksymalizacji wydajności:<br />
- W przypadku rozdzielania substancji o niskich masach cząsteczkowych,<br />
w układach chromatograficznych, charakteryzujących się dobrą kinetyką zjawisk<br />
sorpcji – desorpcji oraz, gdy ograniczeniem nie jest dopuszczalne ciśnienie<br />
pompowania eluentu, najbardziej korzystne jest stosowanie stosunkowo<br />
wysokosprawnych kolumn preparatywnych o optymalnej długości, tym<br />
wyższej im większa jest wielkość ziaren wypełnienia kolumny oraz zasadniczo<br />
dłuższych, niż wynosiłaby konieczna długość kolumny analitycznej, wypełnionych<br />
sorbentem typu HPLC, o małych ziarnach wypełnienia. Jeśli to<br />
możliwe, należy stosować wysokosprawne kolumny monolityczne. Jednocześnie<br />
należy stosować stosunkowo wysoką, prędkość przepływu eluentu,<br />
której optymalna wartość zależy od wielkości ziaren wypełnienia kolumny<br />
(dp), znacznie wyższą od prędkości optymalnej dla zależności H=f(u).<br />
96
- W przypadku rozdzielania substancji o wysokich masach molekularnych,<br />
albo w przypadku bardzo trudnych problemów rozdzielczych, należy stosować<br />
kolumny o maksymalnej możliwej do osiągnięcia sprawności, jednak liniowa<br />
prędkość przepływu eluentu, szczególnie dla rozdzielania substancji<br />
makromolekularnych powinna być zbliżona do optymalnej dla zależności<br />
H=f(u), a więc stosunkowo bardzo niska i w tych warunkach produktywność<br />
kolumny jest też względnie niska.<br />
- Gdy kinetyka zjawisk sorpcji – desorpcji jest niekorzystna, np. w warunkach<br />
chromatografii jonowymiennej, celowe jest stosowanie kolumn, wypełnionych<br />
sorbentem o większych ziarnach (25-40 mikrometrów). Konieczne jest<br />
wówczas również stosowanie stosunkowo niskich, optymalnych, prędkości<br />
przepływu eluentu, jednak wyższych od prędkości optymalnych wg zależności<br />
H=f(u). Wówczas nie jest możliwe otrzymanie tak wysokiej produktywności<br />
kolumny, jak w warunkach opisanych na początku.<br />
- W każdym przypadku, korzystne jest stosowanie dla celów preparatywnych<br />
sorbentów o wysokiej powierzchni właściwej oraz zachowanie niezbyt wysokich<br />
wartości k, pierwszej z rozdzielanych substancji i wartości k poniżej<br />
ok. 12 dla ostatniej substancji eluowanej z kolumny.<br />
- Stosowanie elucji stopniowej, w celu skrócenia ogólnego czasu elucji (czasu<br />
jednego etapu rozdzielania), bywa niezbędne. Należy, jednak, wówczas<br />
wykonywać reaktywację powierzchni wypełnienia kolumny, co najczęściej<br />
wymaga zastosowania eluentu o początkowym składzie w ilości co najmniej<br />
7 objętości martwych kolumny. Bardziej korzystne, niż elucja skokowa, jest<br />
stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie preparatywnej, albo<br />
procesowej. Zapewnia to długotrwałe utrzymywanie stałej aktywności powierzchni<br />
sorpcyjnej oraz produktywności kolumny, przy minimalnym zużyciu<br />
eluentu.<br />
- Stosowanie elucji gradientowej nie jest korzystne. W przypadku rozdzielania<br />
peptydów i białek, albo w warunkach chromatografii oddziaływań hydrofobowych,<br />
jest jednak, konieczne. Powoduje, w porównaniu do warunków<br />
elucji izokratycznej, obniżenie efektywności procesu otrzymywania substancji<br />
z powodu zwiększenia czasu trwania jednego etapu rozdzielania o czas<br />
reaktywacji kolumny/ Powoduje istotny wzrost kosztów repetycyjnego otrzymywania<br />
substancji, tym większy im wyższa jest cena eluentu, wyższy koszt<br />
odzysku eluentu i im większa część eluentu ulega utracie (nie może zostać<br />
zawrócona do procesu).<br />
97
OPERACJE JEDNOSTKOWE I TECHNOLOGIA ROZDZIELANIA<br />
I OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI Z ZASTOSOWANIEM<br />
PREPARATYWNEJ LUB PROCESOWEJ CHROMATOGRAFII<br />
CIECZOWEJ<br />
Na rys. 8 przedstawiono operacje jednostkowe, z których składa się technologia<br />
otrzymywania substancji z zastosowaniem chromatografii cieczowej.<br />
Rys. 8. Schemat technologiczny procesu otrzymywania substancji z wykorzystaniem<br />
chromatografii cieczowej procesowej lub preparatywnej<br />
98
Na rys. 9 i 10 pokazano przykłady schematów ideowych układu aparatów,<br />
odpowiednio: do chromatografii preparatywnej (rys. 9) i do chromatografii<br />
w skali procesowej (rys. 10).<br />
Rys. 9. Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego – sterowanego komputerem<br />
– gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z 1 ... Z 24 ), z możliwością<br />
recyrkulacji części eluentu oraz z podwójnym systemem automatycznie kontrolowanego<br />
dozowania roztworu substancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym<br />
napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lub dozowanie dużych objętości<br />
poprzez zawory Z 2 i Z 3 ), oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przecieków<br />
eluentu. Znaczenie symboli (które nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej):<br />
P – pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej, Z – zawory (A – D: programowanie składu<br />
eluenta, 1 – 10: sterowania przebiegiem procesu separacji, 11 – 24: kolekcji frakcji);<br />
MSP – moduł sterowania pompą, MSWE – moduł sterowania „niskociśnieniowym” systemem<br />
gradientowym, MSZ – moduł sterowania zaworami, MK – moduł komunikacji z użytkownikiem<br />
i wzajemnej koordynacji programów, obsługi awarii oraz kontroli warunków pracy kolumn (moduł<br />
o nadrzędnych priorytetach, może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań<br />
w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu, a w przyszłości ewentualne wyeliminowanie konieczności<br />
stosowania komputera) – obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu<br />
komputerowi<br />
99
Rys. 10. Schemat ideowy chromatografu preparatywnego w dużej skali separacji lub chromatografu<br />
procesowego. Oznaczenia: A, B, C – składniki eluentu i odpowiednie zbiorniki;<br />
SR – roztwór rozdzielonych i odpowiedni zbiornik; P1 – pompa główna z programowaniem<br />
składu eluentu; P2 – pompa dozująca roztwór substancji rozdzielonych (P1 i P2 włączona<br />
alternatywa); Gr – programator i sterownik programu elucji, K – kolumna PLC, D – detektor;<br />
R – „restryktor”, K.Fr – sterownik kolektora frakcji, ZA, ZB, ZC – zawory proporcjonujące,<br />
1, 2, 3, 4 – zawory kolektora frakcji, F – filtry ssawne, Śc – ściek<br />
100
Rys. 11. Schematy ideowe różnych rozwiązań technicznych dozowania wsadu w chromatografii<br />
preparatywnej lub procesowej<br />
Na rys. 12 zamieszczono przykład chromatogramu otrzymanego w czasie<br />
jednego etapu repetycyjnego rozdzielania zanieczyszczonej mieszaniny lanatozydów<br />
A, B, i C w warunkach chromatografii procesowej – produkcja lanatozydu<br />
C (LC) z metanolowego ekstraktu z suszu zioła - brunatnica wełnista<br />
(digitalis lanata), z wykorzystaniem kolumny chromatograficznej<br />
o średnicy wypełnienia: 150 mm.<br />
Z<br />
LA<br />
LB<br />
LC<br />
∼<br />
0 10 20 30<br />
5 1 2 3 4 5 1<br />
[min]<br />
Rys. 12. Przykład chromatogramu uzyskanego w czasie trwania jednego etapu cyklicznej izolacji<br />
lanatozydu C z odpadu produkcyjnego z wykorzystaniem kolumny 800x150 mm, wypełnionej<br />
żelem krzemionkowym 60A d p =50μm (N o =1600); Warunki: Eluent – CH 2 Cl 2 / CH 3 OH / H 2 O<br />
92:8:0,2 v/v, natężenie przepływu 2200 ml/min, ciśn. 26 bar, temperatura pokojowa, detektor<br />
UV 254nm. Poniżej osi czasu podano numery zbiorników, gdzie zostają kierowane frakcje<br />
101
Na rys. 13 pokazano kilka chromatogramów otrzymanych bez przeładowania<br />
kolumny (w warunkach „analitycznych – piki gaussowskie) i w warunkach<br />
przeładowania stężeniowego (piki pozostałe), otrzymane z przekroczeniem<br />
liniowości zakresu odpowiedzi detektora UV, jak i zastosowaniem<br />
kilku sposobów postępowania dla uniknięcia przekroczenia liniowego zakresu<br />
wskazań detektora - bardzo mała droga optyczna – 2 mm, a nawet<br />
0.5 mm, i / albo wybór długości fali o niskich wartościach absorbancji molowej<br />
rozdzielanych substancji – 220 nm, albo 290 nm, zamiast 250 nm.<br />
Rys. 13 Przykłady kilku chromatogramów uzyskanych dla tych samych ilości estrów kwasu<br />
4OH benzoesowego rozdzielanych w warunkach typowego przeładowania stężenia kolumny,<br />
z wyjątkiem gaussowskich pików narysowanych linią cienką ciągłą, które dotyczą braku przeładowania;<br />
W warunkach przeładowania stężenia zastosowano następujące warunki detekcji:<br />
280 nm, 2,56 AU/FS, kuweta 10 mm<br />
280 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mm<br />
254 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mm<br />
Zamieszczone ilustracje i podpisy pod nimi, umożliwiają uzyskanie<br />
ogólnej orientacji w zakresie stosowanych operacji jednostkowych i alternatywnych<br />
sposobów ich realizacji w praktyce w chromatografii cieczowej<br />
w skali preparatywnej lub procesowej. Opis bardziej szczegółowy przekracza<br />
ramy tego opracowania. Zainteresowany czytelnik powinien skorzystać ze<br />
specjalistycznej literatury, albo z bardziej obszernego podręcznika na temat<br />
preparatywnej i procesowej chromatografii cieczowej.<br />
KOLUMNY DO CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />
– WYMAGANIA I ZASADY ICH SPEŁNIENIA W PRAKTYCE<br />
Kolumny do chromatografii preparatywnej są zawsze bardziej skomplikowanej<br />
konstrukcji, niż do kolumny do chromatografii analitycznej. Jed-<br />
102
nakże, w kolumnach preparatywnych zachodzą takie same zjawiska fizykochemiczne<br />
i hydrodynamiczne jak w kolumnach analitycznych. Dotyczy to<br />
zasad opisu retencji i selektywności układu chromatograficznego, a także<br />
zjawisk decydujących o sprawności rozdzielania i wpływających na liczbę<br />
półek teoretycznych kolumny, z zastrzeżeniem, konieczności rozpatrywania,<br />
w obu wypadkach, warunków przekroczenia zakresu liniowości izotermy<br />
sorpcji, tzn. rozpatrywania warunków przeładowania kolumny.<br />
W związku z wykorzystywaniem do celów preparatywnych i procesowych<br />
kolumn o znacznie większej średnicy niż kolumny analityczne pojawiają<br />
się dodatkowe trudności oraz problemy. Jednym z nich jest konieczność<br />
zapewnienia równomiernego rozprowadzenia roztworu rozdzielanych substancji<br />
oraz eluentu na całym przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny<br />
i takiego samego odbierania eluatu opuszczającego kolumnę. Musi to zapewnić<br />
optymalna konstrukcja głowic - rozprowadzających eluent na powierzchni<br />
warstwy wypełnienia kolumny i zbierających eluat z powierzchni<br />
złoża kolumny.<br />
Istnieje wiele konstrukcji preparatywnych kolumn chromatograficznych,<br />
w których powyższe wymagania zostały w różny sposób - najczęściej<br />
poprawnie - rozwiązane. Na rys. 14 zamieszczono kilka przykładów schematów<br />
budowy kolumn chromatograficznych, stosowanych do preparatywnego,<br />
albo procesowego rozdzielania substancji, a w opisie rysunku zamieszczono<br />
potrzebne wyjaśnienia.<br />
Ważny problem, to zapewnienie długookresowej stabilności wypełnienia<br />
kolumny, gdy stosunek średnicy kolumny i średnicy ziarna wypełnienia<br />
często jest większy od 1000, a nawet 10000, a ziarna wypełnienia są wyjątkowo<br />
małych rozmiarów. W tych warunkach oddziaływania ścian - stabilizujące<br />
strukturę złoża w kolumnie, tak ważne w reaktorach chemicznych z wypełnieniem,<br />
albo także w kolumnach analitycznych - w kolumnach<br />
procesowych i preparatywnych praktycznie nie ma miejsca. W tej sytuacji<br />
szczególne znaczenie ma poprawne, równomierne i zwarte (ale nie nadmiernie<br />
zwarte) upakowanie kolumny. Wykorzystywane są też dodatkowo,<br />
specjalne sposoby stabilizacji struktury złoża w czasie rozdzielania, takie jak<br />
tzw. „dynamiczna kompresja aksjalna” (DAC), lub kompresja „aksjalno-<br />
-radialna”, lub ma miejsce kompresja złoża w kolumnie za pomocą mechanizmu<br />
śrubowego, niekiedy z zastosowaniem sprężyn regulujących siłę docisku<br />
przesuwnej głowicy (patrz rys. 14).<br />
Poprawne działanie głowicy wlotowej - wprowadzającej ciecz do kolumny<br />
i wylotowej, wyprowadzającej eluat z kolumny oraz charakter profilu<br />
przepływu cieczy w warstwie wypełnienia kolumny preparatywnej, lub procesowej,<br />
zależny od właściwości złoża (promieniowego rozkładu porowatości<br />
między-ziarnowej i promieniowego rozkładu ziaren pod względem wielkości,<br />
i ma decydujący wpływ na szerokość i kształt pików chromatograficznych<br />
otrzymywanych z zastosowaniem kolumny preparatywnej, bądź procesowej,<br />
niezależnie od stopnia przeładowania kolumny. Sprawność kolumny mierzona<br />
liczbą półek teoretycznych (N), nie powinna zależeć od średnicy kolumny.<br />
Tylko wówczas może mieć miejsce całkowite podobieństwo warunków<br />
103
fizycznych i hydrodynamicznych w kolumnie modelowej i preparatywnej lub<br />
procesowej. Na wlocie do obu kolumn i na wylocie i na wylocie z nich, powinno<br />
mieć miejsce, odpowiednio, równomierne rozprowadzanie cieczy na<br />
cały przekrój poprzeczny wypełnienia / równomierne zbieranie z całego<br />
przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny. Zasadnicze znaczenie ma taki<br />
sposób wypełniania kolumny, aby profil prędkości przepływu cieczy w całym<br />
przekroju poprzecznym kolumny i wzdłuż całej długości wypełnienia, był<br />
płaski, tzn. „tłokowy”, a także taki sposób wprowadzania strefy dozowanej do<br />
kolumny, aby już na początku nie było zniekształcenia, którego nie można<br />
zmienić w czasie trwania elucji.<br />
A. B. C.<br />
D.<br />
E. F.<br />
Rys. 14. Zasady budowy i działania ważniejszych typów kolumn i głowic dystrybucyjnych<br />
do preparatywnej i procesowej chromatografii cieczowej<br />
Typy kolumn (ciąg dalszy opisu rys. 14.): A – kolumna z nieruchomymi głowicami; B – kolumna<br />
z co najmniej jedną głowicą przesuwną, dociskaną śrubami lub poprzez połączenie gwintowe<br />
nakrętki (10) z korpusem (7); C – kolumna z co najmniej jedną głowicą dociskaną do złoża<br />
z wykorzystaniem siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, tzn. kolumna wyposażona<br />
w tzw. „system dynamicznej kompresji aksjalnej złoża (DAC)”; D – kolumna o elastycznych ścianach<br />
wyposażona w system promieniowej kompresji złoża (patent f-my Waters); F – kolumna<br />
o radialno-aksjalnej kompresji złoża,<br />
Typy głowic dystrybucyjnych: A, B, C – głowice z wolną przestrzenią dystrybucyjną w formie<br />
stożka o kącie wierzchołkowym 140-165 o (patent f-my Amicon); E – jedna z uproszczonych<br />
form typoszeregu głowic dystrybucyjnych opracowanych w Politechnice Gdańskiej,<br />
Oznaczenia: 1 – przewód doprowadzający eluent lub roztwór dozowany, 2 – korpus głowicy,<br />
3- uszczelka główna, 4 – przestrzeń dystrybucyjna, 4’ – wkładka dystrybucyjna z systemem<br />
rowków poziomych i poprzecznych otworków, 5 – spiek porowaty lub „tkanina” z drutu kwasoodpornego,<br />
6 – materiał wypełnienia kolumny, 7, 7’ – korpus kolumny, odpowiednio: rura kwasoodporna<br />
lub z elastycznego chemoodpornego tworzywa sztucznego, 8 – siatka tkana ze stosunkowo<br />
grubego drutu (0,3-1,0 mm) lub wkładka z rowkami zapewniającymi promieniowy<br />
rozpływ cieczy w głowicy, 9 – tuleja dystansowa, 10 – nakrętka lub pokrywa dociskana śrubami,<br />
11 – korpus siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, 12 – trzpień tłoczyska, 13 – tłoczysko,<br />
14 – płyn tłoczący<br />
104
Można stwierdzić, że w praktyce, większość niepowodzeń preparatywnego<br />
stosowania chromatografii cieczowej jest spowodowane nieumiejętnością<br />
zapewnienia tłokowego profilu przepływu eluentu w kolumnie oraz<br />
wystarczającej stabilności mechanicznej wypełnienia kolumny. Na rysunku<br />
15 pokazano związek kształtu pików chromatograficznych z profilem przepływu<br />
eluentu w kolumnie. Strefy substancji są w każdym przypadku rozdzielne<br />
w przestrzeni wypełnienia kolumny. Jednakże na wylocie z kolumny<br />
tylko tłokowy profil przepływu zapewnia całkowite rozdzielenie. W przypadku<br />
profilu nie tłokowego, dowolnego typu, na wylocie z kolumny następuje<br />
„wtórne” wymieszanie stref rozdzielonych w kolumnie.<br />
Rys. 15. Ilustracja uzasadniająca konieczność istnienia tłokowego (płaskiego) profilu przepływu<br />
cieczy w przestrzeni wypełnienia kolumny preparatywnej oraz pokazująca niekorzystny wpływ<br />
zniekształcenia stref w kolumnie z p-tu widzenia wymagań, co do czystości substancji:<br />
a) Kolumna charakteryzująca się tłokowym profilem przepływu eluentu;<br />
b) Kolumna o niższej przepuszczalności w rejonie przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrój;<br />
c) Kolumna o wyższej przepuszczalności w rejonie w przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrój<br />
Rys. 16. Zestawienie odpowiadających sobie chromatogramów otrzymanych w warunkach braku<br />
przeładowania – a, b, c oraz w warunkach typowego przeładowania stężeniowego – a’, b’, c’<br />
z wykorzystaniem kolumny analitycznej (120x4 mm i.d.) – a, a’ oraz preparatywnej<br />
(120x32 mm i.d.) – b, b’; c, c’<br />
105
Nie opanowany do końca problem stanowi też występowanie nie wyjaśnionego<br />
dotychczas w pełni, efektu tzw. „ogonowania” pików przy linii bazowej<br />
- przy „podstawie” pików po stronie zstępującej - w przypadku większości<br />
komercyjnych kolumn preparatywnych HPLC, wypełnionych<br />
metodami „na mokro”. Tego typu zniekształcenie pików skutkuje otrzymywaniem<br />
mniej czystych substancji, jak by to było możliwe, gdyby efektu tego<br />
nie było. Na rys. 16 i 17 zilustrowano ten problem oraz pokazano, że najbardziej<br />
efektywnym sposobem uniknięcia jego skutków, jest stosowanie kolumny<br />
preparatywnej HPLC, w warunkach tzw. nieskończonej średnicy. Takie<br />
rozwiązanie zaproponowanych przed laty Knox dla kolumn analitycznych<br />
i semi-preparatywnych, charakteryzujących się niekorzystnym profilem przepływu<br />
eluentu w rejonie przyściennym wypełnienia kolumny. Stosowanie warunków<br />
nieskończonej średnicy wiąże się ze zmniejszeniem wydajności kolumny,<br />
ale jest ono, tym mniejsze, im większa jest średnica kolumny i im<br />
mniejsza jest wielkość ziaren wypełnienia.<br />
Eluent<br />
w<br />
Eluent<br />
lub próbka<br />
w<br />
2 1<br />
d l<br />
i<br />
w = w 1 + w2<br />
w 1<br />
w 2<br />
= const.<br />
[ ]<br />
ml<br />
min<br />
S =<br />
2<br />
w<br />
1<br />
d<br />
1<br />
≅ 2<br />
w + w d<br />
1 2 c<br />
d c<br />
w<br />
d-2i<br />
c<br />
Rys. 17. Model optymalnego wykorzystania kolumny preparatywnej w warunkach nieskończonej<br />
średnicy z ograniczeniem penetracji przez substancje eluowane strefy przyściennej<br />
w kolumnie o grubości „i”<br />
Wypełnienie kolumn: Nucleosil C18 7 μm; Kolumny wypełnianie na mokro<br />
sposobami stosowanymi dla kolumn komercyjnych; b, b’ - kolumna preparatywna<br />
była eksploatowana w sposób „klasyczny”, tzn. z wykorzystaniem całej<br />
powierzchni przekroju poprzecznego dla rozdzielania; c, c’ – ta sama kolumna<br />
stosowana w optymalnym wykorzystaniem warunków nieskończonej<br />
106
średnicy (s=76%). Na chromatogramach b’ i c’ oznaczono zakresy zbierania<br />
frakcji eluentu, poddanych następnie analizie. Substancje rozdzielane: estry<br />
kwasu 4 OH benzoesowego, masa substancji dozowanych do kolumny<br />
w warunkach przeładowania stężeniowego: ester etylowy – 95 mg, ester etylowy<br />
120 mg, ester propylowy 137 mg, masa substancji dozowanych do kolumny<br />
analitycznej ok. 60 razy mniejsza niż do kolumny preparatywnej; eluent:<br />
CH 3 OH – H 2 O 1:1 V/V, w=0,97 ml/min (d c =4 mm) oraz w=58 ml/min<br />
(d c =32 mm) (74 bar), detektor UV 280 nm, czułość 1,28 AU/FS, kuweta<br />
o drodze optycznej 0,5 mm.<br />
W przypadku wypełnień o wielkości ziaren ponad ok. 25 mikrometrów,<br />
kolumny można napełniać na sucho, stosując, np. metodę udarową (udarowanie<br />
kolumny w pionie, przy bardzo niewielkiej intensywności, jest bardziej<br />
korzystne od udarów intensywnych). W przypadku stosowania wypełnień<br />
o ziarnach poniżej ok. 25 mikrometrów, nie można w sposób zadowalający<br />
wypełnić kolumn chromatograficznych metodami „na sucho” i konieczne jest<br />
stosowanie metod „na mokro” z wykorzystaniem zawiesiny wypełnienia<br />
w odpowiednio dobranej cieczy. Często stosuje się pompowanie cieczy, albo<br />
jej wytłaczanie za pomocą tłoka, tworząc wypełnienie kolumny w czasie filtracji<br />
złoża, narastającego na powierzchni głowicy odbiorczej kolumny, albo<br />
pompując zawiesinę z zastosowaniem jednej z głowic umieszczonych w kolumnie.<br />
Na rys. 18 przedstawiono przykłady wyników badania związku między<br />
profilem przepływu cieczy w preparatywnej kolumnie do chromatografii cieczowej,<br />
warunkami wypełniania kolumny i występowaniem tzw. efektu autosegregacji<br />
ziaren wypełnienia kolumny pod względem wielkości. Widać, że<br />
także wówczas, gdy nie występuje auto-segregacja ziaren pod względem<br />
wielkości, może mieć miejsce nie-tłokowy profil przepływu cieczy w kolumnie<br />
i zniekształcenie pików chromatograficznych, a w konsekwencji zmniejszenie<br />
wydajności kolumny i czystości otrzymywanych substancji. Widać też, że<br />
przyczyną efektu „ogonowania” pików w przypadku kolumn preparatywnych<br />
HPLC, wypełnionych „na mokro” nie jest zjawisko „auto-segregacji” ziaren<br />
wypełnienia w kolumnie. Widać również, że stosowanie warunków nieskończonej<br />
średnicy może skutkować otrzymywaniem czystych substancji tylko<br />
wtedy, gdy przyczyną problemu jest „ogonowanie” pików.<br />
107
Rys. 18. Przykłady reprezentowanych rezultatów uzyskanych podczas doboru optymalnych warunków<br />
wypełnienia kolumn preparatywnych o średnicy 32-52 mm, wykonanych z zastosowaniem<br />
mieszaniny dwóch różnobarwnych frakcji żelu krzemionkowego o zakresie wielkości ziaren<br />
22 do 45 μm (frakcja bezbarwna: 22 do 35 μm i frakcja zabarwiona: 30 do 45 μm)<br />
z uwzględnieniem kształtów stref barwnika Sudan I „zatrzymanego” w przekroju poprzecznym<br />
wypełnienia kolumny oraz odpowiadające tym kolumnom kształty pików chromatograficznych<br />
na chromatogramach testowych.<br />
Warunki wypełniania kolumn: A, B, C – wypełnianie na sucho metodą udarową z równomiernym<br />
doprowadzeniem sorbentu do kolumny podczas wypełniania w warunkach, odpowiednio:<br />
A – optymalnych (prędkość narostu złoża podczas wypełniania (u ι - ok. 1 cm/min) – cyfrą „1”<br />
oznaczono wygląd przekroju wypełnienia obserwowany również niekiedy w optymalnie wypełnionej<br />
kolumnie),<br />
B – przy zbyt szybkim doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 3 cm/min),<br />
C – przy zbyt powolnym doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 0,22 cm/min),<br />
D, D’, E – wypełnianie kolumny na mokro, odpowiednio: metodą filtracyjną lub tłokową w warunkach<br />
optymalnych (przykłady D, D’) i sedymentacyjno-wibracyjną (przykład E), (w przypadku<br />
D’ zastosowano głowicę dystrybucyjną zapewniającą realizację warunków nieskończonej średnicy<br />
w kolumnie (S=50%) wypełnionej w tych samych warunkach jak w przykładzie D). Długości<br />
warstwy wypełnienia w kolumnach: 15-25 cm<br />
Na rys. 19 pokazano schematycznie kilka alternatywnych sposobów<br />
wypełniania „na mokro” kolumn preparatywnych HPLC. Warto zwrócić uwagę<br />
na metodę pokazaną na rys. 19b, nie tyle dlatego, że jest oryginalna i autor<br />
nie spotkał w literaturze propozycji jej stosowania, ale przede wszystkim<br />
dlatego, że jest prosta w realizacji, bardzo skuteczna w praktyce i może zostać<br />
zastosowana w każdym laboratorium, które ma możliwość wykonania<br />
w warsztacie mechanicznym kilku prostych metalowych elementów oraz po-<br />
108
siada jakąkolwiek pompę, mającą ograniczenie maksymalnego ciśnienia<br />
pompowania. Schemat a dotyczy procedur postępowania realizowanych<br />
najczęściej przez producentów kolumn. Schemat b, to stosowanie „tłoka”<br />
uszczelnionego względem ściany kolumny, oddzielającego zawiesinę wypełnienia<br />
od medium tłoczącego, którym może być sprężone powietrze<br />
(w istocie pompa stało-ciśnieniowa). Schemat c dotyczy metodyki zalecanej<br />
do wypełniania na mokro kolumn preparatywnych sorbentami o wielkości<br />
ziaren powyżej 20 mikrometrów, z zastosowaniem zasysania cieczy tworzącej<br />
zawiesinę.<br />
Rys. 19. Zestawienie schematów instalacji do badań „kombinowanych” metod wypełnienia kolumn<br />
preparatywnych HPLC i MPLC na mokro,<br />
a) Kombinacja metody zawiesinowej z wibracjami lub udarowaniem zespołu kolumna – zbiornik<br />
z zawiesiną<br />
b) Kombinacja metody dynamicznej kompresji aksjalnej z zastosowaniem „pływającego” tłoka<br />
z wibracjami lub udarowaniem<br />
c) Udarowanie albo wibrowanie zespołu kolumn – zbiornik z zawiesiną, albo wykorzystanie wibratora<br />
pogrążalnego – z jednoczesnym zasysaniem cieczy tworzącej zawiesinę<br />
Elementy 1-13 powtarzają się na rysunku b w całości, natomiast na rysunku c nie stosowano<br />
elementów 1-4 oraz 10 i głowicy górnej 11.<br />
Oznaczenia:<br />
1 – zbiornik z cieczą konsolidującą „L”, 2 – pompa wodna tłokowa, (w=const = 0-1 l/min lub<br />
P=const: 0-300 bar), 3 – zawiesina „s”, 6 – kolumna, 7- uchwyt suwliwy, 8 – łącznik i uszczelnienie,<br />
9 – kabel uziemiający, 10 – post-kolumna wstępnie częściowo wypełniona na sucho<br />
(dp=60 μm), 11, 11’ – głowice wylotowa i wlotowa, 12 – przewód wlotowy (rurka), 13, 13’ – cylinder<br />
miarowy lub zbiornik próżniowy, 14 – „pływający tłok”<br />
W – wzbudnik wibracji wraz z czujnikiem wibracji i oscyloskopem, T - urządzenie udarowania<br />
kolumn [31], B – łaźnia ultradźwiękowa, WP – pogrążalny wzbudnik ultradźwiękowy<br />
109
LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA (pozycje w posiadaniu Biblioteki Wydziału<br />
Chemicznego PG, w przypadku niektórych pozycji - istnieją na rynku nowsze<br />
wydania)<br />
w języku angielskim<br />
1. L.R Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, “Practical HPLC Method Development”,<br />
Willey, New York, NY, 1998.,<br />
2. J. Cazes (ed), “Encyclopedia of Chromatography”, Marcel Dekker, New,<br />
York, 2001.,<br />
3. P. Jandera, J. Churacek, “Gradient Elution in Column Liquid Chromatography”,<br />
Elsevier, Amsterdam, 1985.,<br />
4. O. Mikes, “HPLC, of Biopolimers and Biooligomers”, Elsevier, Amsterdam,<br />
1988.,<br />
5. J.W. Dolan, L.R. Snyder, “Troubleshooting LC Systems”, Humana<br />
Press, Clifton, New York, 1989.,<br />
6. K. Hostettman, A. Morston, “Preparative Chromatography – Techniques,<br />
Applications“, Springer Verlag, 1998.,<br />
7. H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, “Thin-Layer Chromatography<br />
– Reagents and Detection Methods”, vol. 1a – Physical and Chemical<br />
Detection Methods: Fundamentals, Reagents, VCH Publishers, Weinheim,<br />
1990.,<br />
8. D. M. Ruthven, “Encyclopedia of Separation Technology”, vol. 1-2,<br />
J. Willey. 1997.,<br />
9. A.S. Grandisson (ed), M.J. Lewis (ed), “Separation Processes in the<br />
Food and Biotechnology Industries – Principles and Applications”,<br />
Woodhoed Publ. Ltd., Camridge, England, 1998,<br />
10. V. R. Mayer, “Practical High-Performace Liquid Chromatography”, John<br />
Wiley and Sons, Chichester, 1994<br />
w języku polskim<br />
1. Z. Witkiewicz, „Podstawy chromatografii”, wyd. II, a szczególnie III,<br />
WNT, Warszawa, odpowiednio: 1992, 2000, 2005.<br />
2. D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka. „Chromatografia żelowa”,<br />
PWN, Warszawa, 1989.<br />
3. R. Rosset, H. Kołodziejczyk, “Współczesna chromatografia cieczowa -<br />
ćwiczenia i zadania”, PWN, Warszawa 2001.<br />
4. B. Walczak, J, Śliwiok, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa<br />
(HPLC)”, Skrypty Uniwersytetu Śląskiego, skrypt nr 429, Uniwersytet<br />
Śląski, Katowice 1989.<br />
5. Z. Witkiewicz, „Nowe kierunki w chromatografii”, WNT, Warszawa 1988.<br />
6. M. Kamiński, „Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowej,<br />
jako metody otrzymywania substancji”, rozprawa habilitacyjna, Politechnika<br />
Gdańska, Gdańsk, 1992.<br />
110
Pozycje o znaczeniu historycznym, ale opisane zasady teoretyczne są nadal<br />
aktualne i przydatne dla zrozumienia zjawisk:<br />
7. R.J. Hamilton, P.A. Sewell, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa”,<br />
PWN, 1982.<br />
8. J.S. Kowalczyk (ed.), „Podstawy podziałowej i adsorpcyjnej chromatografii<br />
cieczowej”, Wrocław, Warszawa, Kraków, Gdańsk, Zakład Narodowy<br />
im. Ossolińskich, Wydawnictwo Polskiej Akademii Nauk, Ossolineum,<br />
1973.<br />
9. A. Zlatkis (ed), V. Pretorius, (ed), „Preparatywna chromatografia gazowa”,<br />
WNT, Warszawa 1975.<br />
10. L. R. Snyder, “Prioncipless of Adsorpition Chromatography”, Mercel<br />
Dekker, Nowy York, 1968<br />
11. E. Stahl, “Thin-Layer Chromatography – A Laboratory Handbook”,<br />
Springer, Berlin, wydanie drugie 1969.<br />
12. J.J. Kirkland (praca zbiorowa), „Współczesna chromatografia cieczowa”,<br />
PWN, Warszawa, 1976<br />
LITERATURA ŹRÓDŁOWA<br />
1. Bildingmayer B.A., Preparative Liquid Cromatography , (P.D. McDonald<br />
Ed), Elsevier, Amsterdam, 1987.<br />
2. Hostettman K., Preparative Chromatographic Technics: Applications in<br />
Natural Product Isolation, Springer - Verlag, 1986.<br />
3. Scaven M.D. and Hammond P.M., J.Chem. Tech. Biotechnol. 46, 85<br />
(1989).<br />
4. Jones K., Chromatographia, 25, 437, 443, 547, 577 (1988).<br />
5. Kamiński M., Rozprawa habilitacyjna, Politechnika Gdańska, Wydział<br />
Chemiczny,Gdańsk 1992.<br />
6. Knox J.H., Pyper H. M., J. Chromatogr. 363 , 1 (1986).<br />
7. Cox G.B., Snyder L.R. and Dolan L.W., J. Chromatogr., 484, 409, 425,<br />
483, (1989).<br />
8. Wawrzynowicz T., Soczewiński E. and Czapińska K., Chromatographia,<br />
20, 223 (1985).<br />
9. Soczewiński E, Czapińska K. and Wawrzynowicz T., Separ. Sci., 22,<br />
210 (1987),<br />
10. Verzele M., de Conink M., Vinderogel J. and Develee C., J. Chromatogr.,<br />
450, 47 (1988).<br />
11. Katti A. and Guiochon G., Anal. Chem. 61, 982 (1989).<br />
12. Proceedings of the 9th International Symposium “Preparative and Industrial<br />
Chromatography” PREP-92, 6-8 April, 1992 Nancy, France.,<br />
13. Kamiński M., Śledzińska B. and J. Klawiter., J. Chromatogr., 367, 45<br />
(1986).<br />
111
14. Hupe K.P. and Lauer H.H., J. Chromatogr., 203, 41 (1981).<br />
15. Guiochon G., J.Chromatogr., 185, 3 (1979).<br />
16. Klawiter J., Kamiński M. and Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 207<br />
(1982).<br />
17. Leutert Th. von Arx E., J. Chromatogr., 292, 33 (1984).<br />
18. Kamiński M., Reusch J.F., Preparative Chromatography, 1(4), 367<br />
(1992).<br />
19. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 356, 47 (1986).<br />
20. Coq B., Cretier G., Rocca J.L. and Portlhault M., J. Chromatogr. Sci.,<br />
19, 1 (1981).<br />
21. Martin C.W., Shalon Y., LC-GC 5, 23 (1985).<br />
22. M. Kamiński, Proceedengs of the 17 th International Symposium on<br />
“Column Liquid Chromatography - HPLC’93”, GDCh, Hamburg, May<br />
9-14, 1993, vol. 1,2.<br />
23. Snyder L.R., Cox G.B and Antle P.E., Chromatographia, 24, 82 (1987).<br />
24. Kamiński M., J. Chromatogr., 589, 61 (1991).<br />
25. Goddings J.C., Dynamics of Chromatography, Marcel Dekker, New<br />
York, 1965.<br />
26. Wroński S., Molga E., Chem. Eng. Process, 22, 123 (1987).<br />
27. Knox J.H., J. Chromatogr. Sci., 15, 352 (1977).<br />
28. Carbonell R.D. and Mc Coy B.L., Chem. Eng. J., 9, 115 (1975).<br />
29. Francotte E., Junker-Buchheit A., J. Chromatogr., 576, 1 (1992).<br />
30. Unger K.K., Proceedings of “HPLC’93”, Hamburg May 1993,<br />
31. Godbille E., Devaux P., J. Chromatogr., 122, 317 (1976).<br />
32. Collin H., Hilaireau P., de Tounemire J., LC-GC, 3, 40 (1990).<br />
33. Kamiński M. , Klawiter J., Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 225<br />
(1982).,<br />
34. Kozak M.W., Davis E.J., Jour. Coll Interface Sci., 127, 497 (1989), 129,<br />
166 (1989).<br />
35. Głód B., Thesis, IChF Wa-wa 1985.<br />
36. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 436, 367 (1988).<br />
112
Daniel JASTRZĘBSKI 1,2 , Grażyna ROMANIK 1 , Marcin M. KAMIŃSKI 3 ,<br />
Maciej TRZNADEL 1 , Anita SKRZYPCZAK 1 , Aleksandra KRÓLICKA 4 ,<br />
Marian KAMIŃSKI 1<br />
1)<br />
Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Katedra Chemii Analitycznej, 80-954 Gdańsk<br />
2)<br />
Zakłady Farmaceutyczne „POLPHARMA” S.A., Kontrola Jakości JB Pharma,<br />
83-200 Starogard Gdański<br />
3)<br />
Tumor Immunology Program, German Cancer Research Center (DKFZ), Immunogenetics<br />
Division (D030), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany<br />
4)<br />
Intercollegiate Faculty of Biotechnology, University of Gdańsk and Medical University<br />
of Gdańsk, Kładki 24, 80-822 Gdańsk, Poland<br />
KOLUMNOWA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA<br />
W ROZDZIELANIU I ANALIZIE PEPTYDÓW<br />
I BIAŁEK<br />
Szybka ekspansja zastosowań peptydów i białek w biochemii i w medycynie,<br />
stymuluje ogromny wzrost zainteresowania metodami rozdzielania peptydów. Elektroforeza<br />
żelowa i kapilarna to najczęściej dotychczas wykorzystywane metody rozdzielania<br />
peptydów i białek, w celach identyfikacyjnych i analitycznych. Metody te nie<br />
są jednak przydatne do otrzymywania użytkowych ilości tych substancji. Obecnie<br />
HPLC jest najistotniejszą metodą oczyszczania i otrzymywania peptydów i białek.<br />
Ponadto techniki HPLC znajdują coraz większe zastosowanie w rozwijającej się proteomice.<br />
W pracy dokonano przeglądu najważniejszych technik chromatografii cieczowej,<br />
metod oraz procedur stosowanych do rozdzielania peptydów i białek jak<br />
również obecnych trendów w tym obszarze<br />
Słowa kluczowe<br />
Peptydy, białka, proteomika, chromatografia cieczowa, rozdzielanie<br />
WPROWADZENIE<br />
Peptydy i białka mają ogromne znaczenie w organizmach żywych jako<br />
enzymy, hormony, przeciwciała i inne składniki komórek, tkanek i płynów fizjologicznych.<br />
Niektóre peptydy wykazują także aktywność antybiotyczną<br />
oraz jako źródło antybiotyków peptydowych znajdują się w obszarze zainteresowań<br />
badaczy w ostatnich latach [1-4].<br />
Potrzeba uzupełniania braków określonych peptydów i białek w organizmie,<br />
albo stosowania antybiotyków lub innych leków peptydowych, pociąga<br />
za sobą konieczność otrzymywania tych substancji w formie biologicznie<br />
aktywnej. Najczęściej, wymagana jest równocześnie, bardzo wysoka czy-<br />
113
stość izolowanych substancji. Peptydy i białka można otrzymać w sposób<br />
tradycyjny, wyodrębniając je z tkanek zwierzęcych (w tym ludzkich), a niekiedy<br />
z roślin. W ostatnich latach rośnie znaczenie chemicznych, a szczególnie<br />
biotechnologicznych metod syntezy peptydów i białek.<br />
Dobór metody rozdzielania peptydów i białek od zanieczyszczeń,<br />
a następnie takich warunków wyodrębniania, które zapewniają otrzymanie<br />
produktu o najwyższej aktywności biologicznej, stanowi z reguły trudny problem<br />
rozdzielczy i technologiczny. Najczęściej łatwiejsze jest opracowanie<br />
metodyki oznaczania zawartości izolowanych substancji w poszczególnych<br />
etapach syntezy, czy biosyntezy. Jednak, rozwiązanie każdego z tych problemów<br />
wymaga z reguły znacznego nakładu pracy eksperymentalnej.<br />
Wśród różnych metod rozdzielania peptydów i białek, dominujące<br />
znaczenie identyfikacyjne oraz analityczne posiadają metody elektroforetyczne<br />
[5]. Ważne i rosnące znaczenie posiada też wysokosprawna chromatografia<br />
cieczowa (HPLC). Dla przykładu kolumnowa chromatografia cieczowa<br />
bardzo często stosowana jest w przemyśle farmaceutycznym do<br />
izolowania peptydów i białek na dużą skale.<br />
Obecnie, do rozdzielania białek i peptydów metodami chromatografii<br />
cieczowej wykorzystywane są praktycznie wszystkie układy chromatograficzne.<br />
Stosowana jest chromatografia żelowa (GPC - gel permeation chromatography,<br />
albo SEC – size exclusion chromatography) [6,7], chromatografia<br />
jonowymienna (IEC – ion exchange chromatography) [8,9], z chromatografią<br />
wykluczania jonowego (ion exclusion chromatography), włącznie.<br />
Chromatografia w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) jak i chromatografia<br />
oddziaływań hydrofobowych (HIC) są bardzo często stosowane do rozdzielania<br />
białek o wysokiej masie molekularnej. Nawet chromatografia adsorpcyjna<br />
w układzie faz normalnych (NP-HPLC – normal phase high performance<br />
chromatography), szczególnie, z chemicznie związaną fazą<br />
stacjonarną w układzie oddziaływań hydrofilowych (HILIC). W dodatku, szerokie<br />
zastosowanie znajdują metody chromatografii powinowactwa (Affinity<br />
Chromatography – AC), jako odrębna grupa metod separacyjnych o szczególnie<br />
wysokiej selektywności i specyficzności [10,11].<br />
W literaturze można znaleźć wiele procedur dotyczących rozdzielania<br />
konkretnych peptydów, białek i innych substancji, stanowiących zanieczyszczenia.<br />
Nie opracowano, jednak, dotąd takich uogólnionych reguł, które<br />
umożliwiałyby dobór optymalnych warunków rozdzielania zależnie od pierwszo-<br />
i wyżej - rzędowej struktury peptydów i białek. Analiza literatury, prezentującej<br />
procedury rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem chromatografii<br />
cieczowej, pozwala zauważyć pewne dominujące kierunki<br />
postępowania i uogólnione zasady doboru najkorzystniejszych warunków<br />
rozdzielania tych substancji.<br />
W pracy przedstawiono najczęściej stosowane sposoby wpływania na<br />
selektywność i sprawność układu w przypadku najważniejszych metod rozdzielania<br />
peptydów i białek z wykorzystaniem elucyjnej chromatografii cieczowej.<br />
114
Publikacja opisuje zjawiska, efekty oraz oddziaływania towarzyszące procesom<br />
chromatografii cieczowej oraz możliwości wpływania na retencje peptydów<br />
i białek, jak również na selektywność rozdzielania. Przedstawiono również<br />
odpowiednie przykłady procedur rozdzielania.<br />
Peptydy i białka są, jak wiadomo, kwasami i zasadami. W strukturze<br />
cząsteczki złożonej z ‘n’ aminokwasów występuje n-1 wiązań peptydowych.<br />
Często w cząsteczkach tych substancji występują też często tzw. mostki disiarczkowe<br />
oraz wewnętrzne wiązania wodorowe, determinujących drugoi<br />
trzecio- rzędową strukturę molekuły. Obecność aminokwasów zawierających<br />
hydrofobowe fragmenty wpływa na wzrost ogólnej hydrofobowości cząsteczki<br />
peptydu lub białka. W zależności od pH rozpuszczalnika cząsteczki<br />
peptydów i białek mogą ulegać kilku ważnym procesom. W pH wyższym od<br />
punktu izoelektrycznego może mieć miejsce dysocjacja protonu od zewnętrznej<br />
grupy karboksylowej. Co więcej, w pH poniżej punktu izoelektrycznego<br />
może mieć miejsce protonowanie n-terminalnej grupy aminowej.<br />
Przy pH bliskim punktowi izoelektrycznemu następuje szczególnie silne obniżenie<br />
rozpuszczalności peptydu.<br />
W zależności od pH eluentu i jego kompozycji (np. modyfikatory eluentu<br />
powodujące powstanie par jonowych, sole, modyfikatory) peptydy<br />
i białka podlegać następującym procesom:<br />
- dysocjacji elektrolitycznej,<br />
- tworzeniu par jonowych z innymi peptydami oraz z jonowymi<br />
dodatkami do eluentu,<br />
- pozornemu spadkowi hydrofobowości peptydów i białek na części<br />
powierzchni przy stężeniu soli bliskiemu „punktu wysolenia”,<br />
- solwatacji przez akceptory protonów lub kwasy,<br />
- formowaniu się agregatów białek (dimerów i trimerów).<br />
Wszystkie te zjawiska mają wpływ na zachowanie się cząsteczek peptydów<br />
i białek w roztworach oraz na ich oddziaływania z fazą stacjonarną<br />
w różnych układach chromatograficznych.<br />
Na retencję i stopień rozdzielenia peptydów i białek ma wpływ szereg<br />
parametrów układu chromatograficznego, takich, jak: typ powierzchni sorpcyjnej<br />
i uboczne oddziaływania na powierzchni sorbentu, rodzaj ligandu<br />
związanego z sorbentem, powierzchnia właściwa fazy stacjonarnej, wielkość<br />
i porowatość ziaren wypełnienia kolumny, a także, skład, pH, temperatura,<br />
prędkość przepływu eluentu, oddziaływania dodatkowych składników eluentu<br />
np. stężenie soli w eluencie, przebieg programu elucji i inne parametry,<br />
w tym nawet ciśnienie podczas rozdzielania [12].<br />
W tabeli 1 przedstawiono przykłady często wykorzystywanych warunków<br />
stosowania chromatografii cieczowej do rozdzielania peptydów / białek<br />
w różnych układach chromatograficznych. Dane te mogą być przydatne dla<br />
wstępnego doboru warunków przy rozwiązywaniu problemów rozdzielczych,<br />
dotyczących peptydów i białek.<br />
Najczęściej stosowane są układy faz odwróconych oraz chromatografia<br />
jonowymienna. Jednakże, wstępna separacja wykonywana jest z wykorzystaniem<br />
chromatografii żelowej (GPC) lub chromatografia wykluczania<br />
115
(SEC). Ostatnio, do tego celu wykorzystuje się „twarde” sorbenty typu DIOL,<br />
szczególnie te, których struktura porowata bazuje ma „matrycy” z porowatego<br />
di-tlenku cyrkonu, albo di-tlenku tytanu. Ponadto, HIC a w szczególności<br />
AC stosowane są do rozdzielania i izolowania peptydów i białek.<br />
Dodatkowo, w przypadku rozdzielania białek o dużej masie molekularnej<br />
Janzen et al. [13] wprowadzili do użytku sorbenty typu tentacle. Takie sorbenty<br />
chronią przed zbytnim zaburzeniem struktury rozdzielanych białek<br />
i obniżeniem aktywności (trwała, nieodwracalna denaturacja)<br />
Tabela 1. Przykłady praktycznego zastosowania HPLC do rozdzielania peptydów<br />
i białek wraz z warunkami chromatograficznymi<br />
116
ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK W UKŁADACH<br />
FAZ ODWRÓCONYCH<br />
Metody RP-HPLC są powszechnie stosowane do rozdzielania peptydów<br />
i białek w szczególności do celów analitycznych, a także w proteomice.<br />
Rozdzielanie peptydów i białek w układach faz odwróconych odbywa się na<br />
powierzchni fazy stacjonarnej o określonym stopniu hydrofobowości [18],<br />
z zastosowaniem sorbentów typu C18, C8, C4 (C5, C6), C2, fenyl, alkilofenyl,<br />
alkilonitryl i inne. Z reguły rozdzielanie peptydów i białek przeprowadza<br />
się w warunkach elucji gradientowej. Faza ruchoma bardzo często zawiera<br />
wodę i acetonitryl z dodatekiem kwasu trifluorooctowego (TFA), zarówno<br />
w eluencie A (niższe stężenie acetonitrylu 5 – 25%) jak i w eluencie B (wyższe<br />
stężenie acetonitrylu 75 – 95%).<br />
Rozdzielane cząsteczki peptydów i białek są złożone z różnych aminokwasów<br />
(hydrofobowych lub hydrofilowych), ułożonych w zróżnicowanej<br />
kombinacji. Retencja zależy od wynikowej hydrofobowości rozdzielanych<br />
cząsteczek, albo ich solwatów, tzn. zarówno od struktury i rozkładu hydrofobowości<br />
w cząsteczkach, jak i od hydrofobowości solwatów istniejących<br />
w równowadze ze składnikami eluentu.<br />
Podczas rozdzielania dużych cząsteczek polipeptydów i białek<br />
w układach faz odwróconych dość często obserwowane są niekorzystne<br />
przypadki zmian konformacyjnych łańcucha aminokwasowego [24] i w konsekwencji<br />
denaturacja produktu [25]. Nie polarna faza stacjonarna, organiczna<br />
faza ruchoma i kwaśne, albo alkaliczne dodatki do fazy ruchomej<br />
(kwas trifluorooctowy (TFA) lub inny, albo amina) – to czynniki mające potencjalne<br />
działanie denaturujące, a nawet hydrolityczne. Denaturacja objawia<br />
się najczęściej zmianą, retencji substancji, a hydroliza - zwiększeniem<br />
ilości pików. Aby uniknąć hydrolizy trzeba kontrolować pH i temperaturę rozdzielania<br />
[26]. Denaturacji można, także uniknąć przez dodatek do eluentu<br />
soli stabilizujących strukturę białka (np. NaCl, AcNa, (NH 4 ) 2 SO 4 ). Trzeba się,<br />
jednak, liczyć się z tym, że taki dodatek często modyfikuje retencję substancji<br />
[15].<br />
Najczęściej do rozdzielania peptydów i białek w układach faz odwróconych<br />
są stosowane sorbenty siloksanowe modyfikowane grupami alkilowymi,<br />
fenylowymi i difenylowymi Wśród grup alkilowych najczęściej wykorzystuje<br />
się grupę butylową (C4), kolejno pentylową (C5) i oktylową (C8).<br />
Wiele jest też zastosowań oktadecylowych (C18) faz stacjonarnych. Rys. 1<br />
przedstawia przykład rozdzielania 9 białek w kolumnie wypełnionej sorbentem<br />
typu C5, [27], a chromatogram na rys. 2 to przykład rozdzielania 8 peptydów<br />
i białek z wykorzystaniem kolumny C8.<br />
117
5<br />
1<br />
2<br />
4<br />
3<br />
6<br />
7<br />
8 9<br />
0 2 4 6 8 10 12 14 16<br />
Rys. 1. Rezultat rozdzielania mieszaniny peptydów z zastosowaniem kolumny C5 Discovery ®<br />
BIO Wide Pore, 150x4,6 mm(5μm). Eluenty: A-H 2 O :AcCN :PFPA (kwas penta fluoropropionowy)<br />
81 :19 :0,1, B-H 2 O :AcCN :PFPA 62 :38 :0,1. Program elucji: 0-19 min 0-100% B,<br />
v=1,0 ml/min, T=30 0 C. Detekcja UV 215 nm; 1 - Arg8-Vassopressin, 2 - Bradykinin fragment 1-5,<br />
3 - Oxytocin, 4 - Met-Enkephalin, 5 - Luteinizing Hormone, 6 - Leu-Enkephalin, 7 - Bradykinin,<br />
8 - Bombesin, 9 - Substancja P [34]<br />
Rys. 2. Przykład rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem kolumny C8. Kolumna: YMC8<br />
Octyl S-5 120A column, 250x4,6 mm (5μm); Eluent: A-0,1% TFA, B-AcCN; Program elucji:<br />
0-30 min 20-50% B, v=1,0 ml/min; Detekcja UV 200 nm; Rozdzielane substancje: 1 - Bradykinin,<br />
2 - Met-Enkephalin, 3 - Angiotensin I, 4 - Leu-Enkephalin, 5 - Substance P, 6 - Insulin,<br />
7 - Lysozome, 8 - Myoglobin [35]<br />
118
Głównym ograniczeniem stosowania kolumn z chemicznie modyfikowanym<br />
wypełnieniem siloksanowym jest ograniczone pH fazy ruchomej.<br />
Stosowane pH powinno być bezpieczne dla wiązań grup funkcyjnych z żelem<br />
krzemionkowym i nie powodać ich hydrolizy (typowo 2 - 8.5, a skrajnie<br />
1,5-10, w przypadku specjalnie opracowanych faz stacjonarnych [28]).<br />
Okazjonalnie stosowane są wypełnienia polimerowe oparte o kopolimer<br />
styrenu-diwinylobenzenu, albo poli-metakrylan alkilu. Do powierzchni<br />
sorpcyjnej najczęściej dodatkowo związane są cząsteczki oktadekanu (C18)<br />
[29, 30]. Ostatnio, mimo wysokiej ceny, rośnie znaczenie polimerowych sorbentów.<br />
Powodem jest ich trwałość w szerokim zakresie pH od 0,8 – 13,5.<br />
Brak wolnych grup siloksanowych poprawia symetrię pików i w konsekwencji<br />
sprawność rozdzielania [29, 30]. Wadą kolumn wypełnionych polimerowymi<br />
sorbentami są niskie prędkości przepływu, jakie powinno się stosować podczas<br />
rozdzielania substancji o wysokich masach cząsteczkowych. Zbyt duże<br />
prędkości przepływu prowadzą do otrzymywania nadmiernie poszerzonych<br />
pików, szczególnie, pików substancji silnie hydrofobowych i w szczególności<br />
o wysokiej masie molekularnej. Jest to wynikiem niekorzystnej kinetyki procesów<br />
sorpcji / desorpcji spowodowanej tendencją do rozpuszczania się<br />
cząsteczek rozdzielanych substancji w powierzchniowej warstwie niepolarnego<br />
sorbentu i bardzo małej dyfuzji dużych molekuł.<br />
Sporadycznie stosowane są inne wypełnienia, np. sorbenty siloksanowe<br />
modyfikowane równocześnie grupami C8 i hydrofilowymi grupami –<br />
COOH, pochodzącymi z nienasyconych kwasów karboksylowych, albo specyficznie<br />
modyfikowane sorbenty siloksanowe o podwyższonej stabilności<br />
mechanicznej i chemicznej [31].<br />
Długość łańcucha alkilowego ma istotny wpływ na selektywność rozdzielania<br />
peptydów i białek. Z jednej strony River i współpracownicy [32]<br />
stwierdzili, że krótkie kolumny wypełnione polisiloksanem modyfikowanym<br />
C4 sprawdzają się najlepiej w rozdzielaniu dużych peptydów i białek. Natomiast<br />
Hartman i współpracownicy [33] udowodnili przydatność kolumn siloksanowych<br />
modyfikowanych C8 do rozdzielania naturalnych i syntetycznych<br />
peptydów oraz niewielkich białek posiadających charakter hydrofilowy.<br />
W przypadku polipeptydów, szczególnie, jeśli zawierają w łańcuchu pierścienie<br />
aromatyczne, skuteczne okazują się kolumny siloksanowe modyfikowane<br />
grupami difenylowymi [32].<br />
Kolumny siloksanowe modyfikowane grupami oktadecylowymi (C18),<br />
o małych średnicach porów, są najskuteczniejsze do rozdzielania małych,<br />
hydrofilowych peptydów i fragmentów białek złożonych z 2-10 aminokwasów<br />
[32]. Przy czym do rozdzielania peptydów w zastosowaniu do proteomiki<br />
stosuje się, coraz częściej, tzw. kolumny mikropakowane (o średnicy<br />
1-1,5 mm) lub sorbent typu CSP (Core Surface Particles) jak również często<br />
stosowane są kolumny monolityczne. Kolumny te zapewniają bardzo wysoką<br />
sprawność i szybkość rozdzielania (do 350 tys. półek teoretycznych na<br />
metr długości wypełnienia kolumny).<br />
Fazy stacjonarne, zawierające krótkie alifatyczne łańcuchy, umożliwiają<br />
skuteczne rozdzielanie silnie hydrofobowych peptydów i białek, a posiada-<br />
119
jące długie łańcuchy alkilowe, są odpowiedniejsze do rozdzielania cząstek<br />
o charakterze mniej hydrofobowym [34].<br />
Wskazane jest, aby sorbenty o modyfikowanej chemicznie powierzchni<br />
sorpcyjnej były zabezpieczone przed oddziaływaniem resztkowych grup<br />
hydroksylowych z fazą ruchomą, tzn. aby miały tzw. „end-capping” - zastąpienie<br />
wolnych grup OH grupami OCH 3 , albo poprzez silanizację. Polepsza<br />
to symetrię pików, a stąd stopień rozdzielenia w przypadku mniejszych peptydów<br />
i umożliwia wysoki stopień odzysku w przypadku białek [35].<br />
Szeroko badany był wpływ rozkładu wielkości ziaren i porowatości<br />
wypełnienia kolumny na rozdzielanie peptydów i białek [36]. Stwierdzono<br />
wpływ takich parametrów jak rozmiar i kształt ziaren, średnica i kształt porów<br />
oraz powierzchnia wymiany masy. W zależności od wielkości rozdzielanych<br />
peptydów i białek, dobiera się złoże o odpowiednich średnicach porów. I tak,<br />
dla małych peptydów (do 10 aminokwasów) Krstulovic i Brown [37] zalecają<br />
kolumny z wypełnieniem o średnicy porów do 60Å. Dla średnich peptydów<br />
(10-30 aminokwasów) i małych białek najskuteczniejsze są kolumny o średnicy<br />
porów 100Å, 120Å i 150Å. Natomiast dla większych peptydów (ponad<br />
30 aminokwasów) i dla białek polecają sorbenty o porach 300Å i większych.<br />
Tweeten i Tweeten [29] stwierdzili w przypadku kolumn wypełnionych<br />
makroporowatym poli -styrenem-diwinylobenzenem, że dalszy wzrost wielkości<br />
porów (do 1000Å) nie wpływa na polepszenie retencji białek o dużej<br />
masie cząsteczkowej (do 335 kD). W celu maksymalizacji sprawności kolumny<br />
do zastosowań analitycznych wykorzystuje się sorbenty o małych<br />
ziarnach (o średnicy 5 i 3 μm), a nawet coraz częściej, wspomniane wyżej,<br />
nieporowate sorbenty o średnicy ziarna 1 μm. Wtedy stosowane kolumny<br />
mogą mieć nawet tylko 10 mm długości [21]. Jednakże, najczęściej stosuje<br />
się kolumny o długościach 125, 150 i 250 mm. Przy czym, im mniejsza wielkość<br />
ziaren sorbentu, tym krótsza może być kolumna. Obecnie duże zainteresowanie<br />
budzą tzw. monolityczne kolumny o porowatym wypełnieniu zajmujących<br />
całą objętość kolumny. Charakteryzują się one szczególnie niskimi<br />
wartościami tzw. impedancji rozdzielania [38]. Bez wątpienia w najbliższym<br />
czasie kolumny monolityczne będą powszechnie stosowane.<br />
ELUENTY, MODYFIKATORY ELUENTU I PROGRAMY ELUCJI<br />
STOSOWANE W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH<br />
W układach faz odwróconych głównym czynnikiem wpływającym na<br />
retencję jest zawartość organicznych składników w eluencie, takich jak acetonitryl<br />
(AcCN), metanol (MeOH), etanol (EtOH), izopropanol (iPrOH), tetrahydrofuran<br />
(THF), czy dioxan (DX) [39]. Dodatkowo, w celu optymalizacji<br />
warunków rozdzielania należy wpływać na retencję substancji o charakterze<br />
zarówno kwaśnym jak i zasadowym, do których należą peptydy i białka, poprzez<br />
dodatek kwaśnego lub zasadowego modyfikatora do eluentu.<br />
Rozdzielanie peptydów i białek najczęściej przeprowadza się w warunkach<br />
elucji gradientowej. Program zmian stężenia organicznego składni-<br />
120
ka eluentu (AcCN, MeOH) ustala się w zakresie od 10-25% v/v do 75-90% v/v,<br />
dodając do eluentu A i B modyfikatora zmieniającego pH eluentu i cofającego<br />
dysocjację kwasowo-zasadową, w konsekwencji modyfikującego hydrofobowość<br />
i polarność cząsteczek peptydów / białek.<br />
Najczęściej wykorzystywanym organicznym składnikiem eluentu jest<br />
acetonitryl. Powodem tego jest jego wysoka transparentność przy niskich<br />
długościach fali w zakresie UV. Ponadto jego niska lepkość oraz wysoka lotność,<br />
która ułatwia dalszą izolację produktu [40]. Rozpuszczalność peptydów<br />
i białek jest, także lepsza w acetonitrylu niż w innych organicznych<br />
składnikach eluentu, stosowanych w RP-HPLC.<br />
Znacznie rzadziej wykorzystywane są alkohole. Niekiedy stosuje się<br />
izopropanol, aby zwiększyć rozpuszczalność w fazie ruchomej solwatów dużych<br />
peptydów i białek [41]. Użycie izopropanolu lub jego mieszaniny z acetonitrylem<br />
(w proporcji od 1:2 do 2:1) jest uzasadnione w przypadku rozdzielania<br />
peptydów i białek stosunkowo bardzo hydrofobowych. Izopropanol,<br />
jako rozpuszczalnik o wyższej sile elucyjnej w układach faz odwróconych od<br />
AcCN, silniej oddziałuje z centrami alkilo - siloksanowymi sorbentu [42] niż<br />
np. metanol.<br />
Najczęściej stosowaną szybkością narostu objętościowego udziału<br />
składnika organicznego do rozdzielania peptydów i białek jest 2-5%/min.<br />
Zbyt wolny narost stężenia hydrofobowego składnika eluentu może powodować<br />
zbytnie rozcieńczenie otrzymywanych frakcji eluatu [43]. Końcowe<br />
stężenie rozpuszczalnika organicznego w programie elucji nie powinno prowadzić<br />
do całkowitego usunięcia wody z kolumny. Utrudniałoby to doprowadzanie<br />
fazy stacjonarnej do równowagi z początkowym eluentem. To może<br />
prowadzić do braku powtarzalności retencji peptydów i białek, szczególnie<br />
wcześnie eluowanych substancji. Najczęściej nie przekracza się 95% substancji<br />
organicznej w eluencie.<br />
Natężenie przepływu fazy ruchomej przez kolumnę klasycznie pakowaną<br />
o średnicy 4-4,6 mm jest rzędu 0,8-2,0 ml/min oraz dla kolumny monolitycznej<br />
aż do 5 ml/min. Od natężenia przepływu zależy sprawność rozdzielania<br />
oraz ciśnienie na wlocie do kolumny. Bylina i współpracownicy<br />
zauważyli wpływ ciśnienia panującego w kolumnie na retencję podczas rozdzielania<br />
insuliny w warunkach izokratycznych [12]. Wzrost ciśnienia w kolumnie<br />
o 1 bar powodował wzrost czasu retencji białka o 1-5 s. Ostatnio Guiochon<br />
i współpracownicy [44] potwierdzili występowanie tych efektów<br />
i podjęli próby ich wyjaśnienia. Najważniejsze modyfikatory fazy ruchomej,<br />
stosowane w układach faz odwróconych, zestawiono w tabeli 2.<br />
121
Tabela 2. Modyfikatory fazy ruchomej najczęściej stosowane w układach faz<br />
odwróconych<br />
H 3 PO 4 i jego sole<br />
(np.<br />
(NH 4 ) 3 PO 4 )<br />
HFBA (kwas<br />
heksa fluoro butyrowy)<br />
HCOOH,<br />
CH 3 COOH,<br />
HCl<br />
Modyfikator Działanie (korzystne i niekorzystne) Literatura<br />
Kwaśne<br />
Kwas trójchlorooctowy<br />
(TFA)<br />
- Eliminuje jonizację ewentualnych wolnych grup siloksanowych;<br />
- Cofa dysocjację grupy karboksylowej na „C-końcu” aminokwasu,<br />
co zwiększa hydrofobowość tej części peptydu;<br />
- Powoduje wzrost polarności cząsteczki przez tworzenie<br />
kationu R-NH + 3 na „N-końcu” peptydu [52];<br />
- Dostarcza anionów CF 3 COO - , które stanowią przeciwjon<br />
dla „N-końcowego” kationu amoniowego tworząc z nim parę<br />
jonową;<br />
- Powoduje solwatację wiązań peptydowych, co ma znaczenie<br />
szczególnie przy dużych peptydach i białkach;<br />
- Podwyższa absorpcję światła przez eluent przy niskich<br />
długościach fali światła w przypadku detekcji UV [53] - pogarsza<br />
granicę oznaczalności związku;<br />
- Najczęściej stosowane stężenie 0,05 - 0,13% (v/v), stężenie<br />
poniżej 0,075% może prowadzić do poszerzenia pików i<br />
obniżonej retencji peptydów, a powyżej 0,1% do hydrolizy<br />
wiązań fazy stacjonarnej z powierzchnią żelu krzemionko-<br />
[44-46]<br />
wego;<br />
- Obniżenie retencji peptydów (w porównaniu do dodatku<br />
TFA, czy do braku H 3 PO 4 lub jego soli);<br />
[40]<br />
- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne; [41], [47]<br />
- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne;<br />
- Kwas solny powoduje jedynie protonowanie grupy karboksylowej<br />
„C-końca” peptydu bez tworzenia pary jonowej na<br />
„N-końcu” związku;<br />
- Pewne podwyższenie retencji, ale wpływ na retencję<br />
mniejszy niż H 3 PO 4 ;<br />
Zasadowe<br />
NH 4 HCO 3 - Podwyższa pH i zmienia nieco hydrofobowość peptydu /<br />
białka;<br />
CH 3 COONH 4 - Działanie podobne do NH 4 HCO 3 [50, 51]<br />
Trójetyloamina<br />
(TEA)<br />
- Dodawana jednocześnie z H 3 PO 4 lub HCOOH w celu [52, 53]<br />
zmiany pH;<br />
- Blokuje wolne grupy hydroksylowe sorbentu, co może<br />
przyczynić się do polepszenia kształtu pików;<br />
[46]<br />
[41]<br />
Wszystkie modyfikatory wymienione w tabeli 2 zmieniają pH eluentu<br />
i hydrofobowość cząsteczek rozdzielanych substancji przez solwatacje i tworzenie<br />
par jonowych. Modyfikatory kwaśne mają na celu zmniejszenie stopnia<br />
kwaśnej dysocjacji peptydu, a dodatki zasadowe eliminują protonowanie<br />
terminalnych grup NH 2 i powodują dysocjację grupy karboksylowej.<br />
122
ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK<br />
W UKŁADACH JONOWYMIENNYCH<br />
W chromatografii jonowymiennej jest zasadą, że substancje posiadające<br />
ładunek elektryczny są rozdzielane na kolumnie, która ma na powierzchni<br />
sorpcyjnej odwrotny ładunek elektryczny do substancji rozdzielanych.<br />
Grupy jonowe wymieniacza jonowego są kowalencyjnie wiązane<br />
z powierzchnią sorbentu i ich ładunki elektryczne są kompensowane przez<br />
jony obecne w eluencie (buforze). Po wprowadzeniu próbki do kolumny centra<br />
jonowe słabo związane z eluentem, ulegają wymianie na jony substancji<br />
rozdzielanych. Wykorzystuje się okoliczność, że peptydy i białka mogą posiadać<br />
zarówno ładunek dodatni, jak ujemny w zależności od pH buforu.<br />
Podczas stosowania buforów o charakterze kwaśnym, peptydy występują<br />
w postaci kationów (zahamowanie dysocjacji grup karboksylowych i sprotonowanie<br />
grup aminowych oraz najbardziej polarnych grup NH 2 w połączeniach<br />
peptydowych). W przypadku stosowania buforów zasadowych, peptydy<br />
i białka występują w postaci anionów (sprotonowane grupy aminowe są<br />
zasadami wiążącymi grupy hydroksylowe, a grupy karboksylowe są zdysocjowane,<br />
albo tworzą pary jonowe ze sprotonowanymi kationami zasadowych<br />
dodatków). Netto dodatni lub ujemny elektryczny ładunek peptydu /<br />
białka umożliwia jego związanie z odpowiednimi centrami fazy stacjonarnej.<br />
Z zastosowaniem gradientu soli lub niekiedy, dodatkowo zmiany pH buforu,<br />
powoduje się stopniową elucję substancji związanych z powierzchnią wymieniacza<br />
jonowego.<br />
Na retencję peptydów i białek w warunkach chromatografii jonowymiennej<br />
wpływają głównie cztery czynniki: siła jonowa eluentu, jego pH i powierzchnia<br />
właściwa wymieniacza jonowego (gęstość obsadzenia molekułami<br />
wymieniacza jonowego), a także rozkład wielkości porów adsorbentu.<br />
Zwiększając siłę jonową eluentu obniżamy retencję peptydów i białek<br />
w przypadku obu wymieniaczy, kationowych i anionowych. Zwiększając pH<br />
buforu obniżamy retencję na kationitach, a podwyższamy na anionitach<br />
i odwrotnie - zmniejszając pH buforu podwyższamy retencje na kationitach,<br />
a obniżamy na anionitach. Poszerzenie zakresu średnic porów w stosunku<br />
do hydrodynamicznej średnicy cząsteczek rozdzielanych białek przyczynia<br />
się do podwyższenia retencji w przypadku stosowania kationitów [19]<br />
i prawdopodobnie także w przypadku anionitów.<br />
Wzrost stopnia obsadzenia powierzchni jonitu grupami jonowymiennymi<br />
wpływa, oczywiście, na wzrost retencji w konkretnych warunkach rozdzielania.<br />
Jednak, do rozdzielania peptydów i białek w warunkach chromatografii<br />
elucyjnej nie są zalecane wymieniacze jonowe o bardzo wysokim<br />
stopniu nasycenia powierzchni sorpcyjnej grupami jonowymiennymi, w przeciwieństwie<br />
do chromatografii jonowymiennej w warunkach selektywnej<br />
sorpcji – desorpcji jonowymiennej, gdy pojemność jonowa wymieniacza jonowego<br />
powinna być możliwie jak najwyższa.<br />
W zależności od właściwości rozdzielanych peptydów / białek, dobiera<br />
się odpowiedni wymieniacz jonowy. Stosuje się wiele rodzajów kolumn jo-<br />
123
nowymiennych, równorzędnie kationowymienne i anionowymienne. Oba<br />
wymieniacze jonowe mogą być stosowane w wariantach słabym i mocnym.<br />
W przypadku mocnych wymieniaczy jonowych wszystkie grupy funkcyjne są<br />
w szerokim zakresie pH w postaci zjonizowanej i powinowactwo jonowe kolumny<br />
jest mało zależne od pH eluentu, ale retencja peptydów od pH eluentu<br />
zależy silnie, ponieważ w zależności od pH ich cząsteczki są w różnym<br />
stopniu zjonizowane.<br />
Jako kationity stosowane są kolumny ze związanymi na powierzchni<br />
sorpcyjnej ligandami alkilo-, albo arylo- sulfonowymi: R-SO 3 - (mocne wymieniacze,<br />
np. Fractogel SO 3 , Cellufine sulfate, SP), karboksylowymi R-COO -<br />
(słabe wymieniacze, np. Fractogel COO, Toyopearl), a także inne polimery<br />
o słabo kwaśnych grupach funkcyjnych, takie, jak Sepharoza czy Spherodex<br />
[19,55,56]. Na rys. 3 przedstawiono przykład rozdzielania 6 peptydów z zastosowaniem<br />
kolumny kationowymiennej.<br />
Rys. 3. Przykład rozdzielania małych peptydów z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej.<br />
Kolumna: Vydac 400VHP5410, 100x4,6 mm (5 μm); Eluenty: A – 20 mM TEAP in 50%<br />
AcCN, pH 2; B - 100 mM NaClO 4 in A; Program elucji: 0 - 50 min, 0 - 100% B, v=1,0 ml/min,<br />
Detekcja: UV 220 nm; 1 - Oxytocin, 2 - Eledoisin related peptide, 3 - Neurotensin,<br />
4 - Angiotensin II, 5 - Bradykinin, 6 - Angiotensin I [56]<br />
Jako anionity stosowane są kolumny o ligandach w postaci grup alkilo-,<br />
albo arylo- amoniowych, np. mocny wymieniacz z grupami trimetyloaminoetylowymi<br />
(TMAE), średnio mocny wymieniacz z grupami dietyloaminoetylowymi<br />
(DEAE), oraz słaby wymieniacz z grupami dimetyloaminoetylowymi<br />
(DMAE) [55,57]. Ligandy jonowymienne najczęściej osadzone są na matrycy,<br />
którą może być kopolimer styrenu-divinylobenzenu, żywica syntetyczna,<br />
poliwęglowodany, poliamidy, a niekiedy polimery nieorganiczne. Na rys. 4<br />
zamieszczono przykład wyników rozdzielania czterech białek w kolumnie<br />
anionowymiennej.<br />
124
Rys. 4. Przykład rozdzielania białek za pomocą chromatografii anionowymiennej Kolumna:<br />
Vydac 300VHP575, 50x7,5 mm (5 μm); Eluenty: A- 10 mM kwas CHES-2-(-cykloheksyloamino)<br />
etanosulfonowy / TEA, pH 9,53; B- 0,5 M NaCl w A; Program elucji: 0 - 20 min, 0 - 100% B,<br />
1 - Bovine carbonic anhydrase (pl 7,3), 2 - Conalbumin (pl 6; 6,3; 6,6), 3 - Ovalbumin (pl 4,7),<br />
4 - Soybean trypsin inhibitor (pl 4,5) [56]<br />
W przypadku większości komercyjnie stosowanych kolumn jonowymiennych,<br />
stosunkowo małe grupy jonowymienne znajdują się na powierzchni<br />
sorbentu. W takim przypadku tylko pojedyncze, ewentualnie kilka<br />
jonowych grup peptydu / białka zostaje związane ze złożem, z powodu<br />
ograniczeń przestrzennych. W wymieniaczach jonowych o ruchomych ligandach<br />
(tzw. „tentacle”), łańcuchy cząsteczek wymieniacza jonowego są kowalencyjnie<br />
związane z matrycą. Są to liniowe łańcuchy polimerowe z rozłożonymi<br />
wzdłuż łańcucha grupami jonowymiennymi. Ilość grup jonowymiennych<br />
jest znacznie większa niż na powierzchni „klasycznego” wymieniacza<br />
i w konsekwencji znacząco wzrasta pojemność takich wymieniaczy wobec<br />
peptydów i białek. Elastyczność ruchomych ligandów wymieniacza powoduje<br />
dodatkowo, że mogą się one wiązać do cząsteczek białek bez odkształcenia<br />
cząsteczek tych ostatnich. Ma to szczególne znaczenie dla uniknięcia<br />
denaturacji w trakcie rozdzielania białek o dużych masach molekularnych.<br />
Podczas rozdzielania peptydów i białek z użyciem chromatografii jonowymiennej<br />
regułą jest stosowanie krótkich kolumn o dużych średnicach.<br />
Zalecane są kolumny o długościach od 5 cm (szczególnie w metodach sorpcyjno<br />
- desorpcyjnych) do 25 cm (dla warunków jonowymiennej chromatografii<br />
elucyjnej) i o średnicach 5-26 mm lub wyższych.<br />
125
UKŁADY ADSORPCYJNE I ADSORPCYJNO-JONOWYMIENNE<br />
FAZ NORMALNYCH<br />
Układy chromatograficzne faz normalnych nie znajdują tak szerokiego<br />
zastosowania do rozdzielania peptydów i białek jak układy faz odwróconych<br />
i jonowymienne. Yoshida i Okada [23] wykonali badania przydatności do<br />
rozdzielania peptydów kilku różnych wypełnień w układach faz normalnych.<br />
Stwierdzili przydatność kolumn wypełnionych związanym z żelem krzemionkowym<br />
sorbentem amidowym i diolem w warunkach elucji gradientowej<br />
AcCN – H 2 O, z rosnącym udziałem wody w trakcie programu elucji i z zastosowaniem<br />
kwaśnych modyfikatorów fazy ruchomej (TFA albo TFA+TEA),<br />
zwiększających retencję peptydów (rys. 5 – porównanie rozdzielania 10 peptydów<br />
na kolumnie amidowej i diolowej z różnymi dodatkami do eluentu)<br />
[23]. Odrzucili kolumny napełnione sorbentem aminowym (NH 2 ) i nitrylowym<br />
(CN) jako nieprzydatne do rozdzielania peptydów oraz kolumny z żelem<br />
krzemionkowym jako powodujące obniżenie stopnia odzysku peptydów [23].<br />
Jednakże, należy zaznaczyć, że zastosowane warunki rozdzielania<br />
w wyżej wymienionych badaniach uniemożliwiają przeważanie efektu adsorpcyjnego<br />
mechanizmu charakterystycznego dla NP-HPLC. Zastosowanie<br />
bardzo polarnego eluentu prowadzi do mechanizmu rozdzielania charakterystycznego<br />
dla Chromatografii Oddziaływań Hydrofilowych (HILIC).<br />
Do rozdzielania białek i peptydów zastosowano też z powodzeniem<br />
kolumny wypełnione hydroksyapatytem, wykorzystując jednocześnie adsorpcyjne<br />
i słabe jonowymienne oddziaływania.<br />
126
Rys. 5. Porównanie rozdzielania peptydów na kolumnie aminowej (I) i DIOL (II) z innymi dodatkami<br />
do eluentów [23] Kolumna I - TSK gel Amide-80 250x4.6 mm, Kolumna II – TSK gel OH-<br />
120 250x4,6 mm; Eluent: (A) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0,1% TFA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1%<br />
TFA (B) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.1% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1% TFA+TEA;<br />
(C) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.2% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.2% TFA+TEA; Program<br />
elucji: 70 min liniowo gradient H 2 O od 3 to 45% (0.6% H 2 O/min), T=40 0 C, v=1.0 ml/min.<br />
Detekcja UV 215 nm; 1 - FY, 2-FGGF, 3 - FLEEI, 4 - DYMGWMDP-NH 2 , 5 - NFTYGGF,<br />
6 - AGSE, 7 - WAGGDASGE, 8 - YGGFMTSQKSQTPLVT, 9 - ASTTTNYT,<br />
10 - VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILI-RLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEM *)<br />
( * )M-homoserine)<br />
127
CHROMATOGRAFIA ŻELOWA<br />
Chromatografia wykluczania (SEC), zwana również chromatografią<br />
żelową (GPC), znajduje ogromne zastosowanie w separacji peptydów<br />
i białek oraz do odsalania. Bazuje na wykorzystaniu różnicy wielkości<br />
i kształtu, a w konsekwencji różnic w wartości efektywnego promienia hydrodynamicznego<br />
rozdzielanych substancji. Molekuły o różnych rozmiarach<br />
w różnym stopniu penetrują pory sorbentu. Małe cząsteczki są w większym<br />
stopniu zatrzymywane w kolumnie, a duże są szybciej eluowane. SEC ma<br />
zastosowanie do rozdzielania peptydów i białek o masie molowej w zakresie<br />
2 do 1000 kDa. Technika ta może być stosowana do wyznaczania masy molowej<br />
białek. Jednak nie tylko masa cząsteczkowa, ale również kształt cząsteczki<br />
białka oraz oddziaływania sorpcyjne, trudne do całkowitego wyeliminowania<br />
mają wpływ na retencję, dlatego też konieczna jest staranna<br />
kalibracja przy użyciu odpowiednich białek kalibracyjnych.<br />
Dużego znaczenia nabierają, ostatnio, złoża SEC wykonane w technologii<br />
ruchomych ligandów, „tentacle” (podobnie jak w przypadku złóż jonowymiennych).<br />
Rozmiary porów i ich rozkład gwarantują rozdzielenie białek<br />
zgodnie z wielkością i kształtem cząsteczek. „Dynamiczne” ligandy uniemożliwiają<br />
małym cząsteczkom wniknięcie wewnątrz porów, a większe molekuły<br />
mają utrudnioną głębszą penetrację [57].<br />
SEC jest szczególnie użyteczna jako początkowy etap frakcjonowania,<br />
do izolacji dużych ilości zanieczyszczeń, lub jako końcowy etap rozdzielania<br />
oczyszczonych białek, tzw. „polishing step”.<br />
Należy też zwrócić uwagę na szczególną przydatność chromatografii<br />
żelowej do odsalania peptydów i białek. Do tego celu stosuje się często, ciągle<br />
jeszcze, tzw. miękkie sita molekularne. Coraz większe znaczenie mają<br />
„twarde” wypełnienia kolumn w tych zastosowaniach, takie jak DIOL [58],<br />
a także szkła porowate o zdezaktywowanej powierzchni (rys. 6 – przykład<br />
analizy mieszaniny białek z wykorzystaniem GPC-DIOL).<br />
128
Rys 6. A. Przykład rozdzielania białek na kolumnie DIOL. Kolumna: BioGPC - DIOL 250, 300x10 mm (5μm); Eluent: 10 mM<br />
NaH2PO4 + 300 mM NaCl, pH 7,2; w=0,5 ml/min, Detekcja UV 280 nm. B. Krzywa kalibracyjna białek na kolumnie GF450 [56]<br />
129
CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH<br />
(HIC – HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY)<br />
Należy zwrócić też uwagę na duże znaczenie chromatografii oddziaływań<br />
hydrofobowych (HIC), zarówno do wstępnego monitorowania składu<br />
białkowego badanego materiału biologicznego, jak i do zastosowań preparatywnych<br />
[59,60]. Proces rozdzielania opiera się na hydrofobowych oddziaływaniach<br />
pomiędzy hydrofobowym ligandem związanym z fazą stacjonarną<br />
a niepolarnym regionem na powierzchni biomolekuły. Te hydrofobowe oddziaływania<br />
są zwiększane przez obecność soli w eluencie, powoduje ona<br />
odsłonięcie hydrofobowej części białka przez zakłócenie ułożenia cząsteczek<br />
wody wokół białka [61].<br />
Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych<br />
to sorbenty typu C3-, C4-, C5-, albo C6- wiązane najczęściej z sieciowaną<br />
agarozą lub syntetycznym kopolimerem o odpowiednim zakresie<br />
wielkości porów (300 A, albo większe). Proces rozdzielania wykonuje się<br />
przy malejącym gradiencie stężenia soli podczas elucji (rys. 7). Rodzaj soli<br />
i jej stężenie znacząco wpływa na oddziaływania hydrofobowe pomiędzy<br />
białkiem a hydrofobowym adsorbentem.<br />
Jednakże, stężenie soli stosowane podczas rozdzielenia powinno być<br />
nieznacznie niższe od „punktu wysalania” cząsteczki białka. Co więcej szereg<br />
Hofmeistera zestawia sole według zdolności wysalania białka:<br />
(NH 4 ) 2 SO 4 > KH 2 PO 4 > Na 2 HPO 4 > Na 2 SO 4 > CH 3 COOK> CH 3 COONa> NaCl.<br />
Rys. 7. Rozdzielanie 1. Cytochromu c, 2. Mioglobiny, 3. β-Laktoglobuliny, 4. Rybonukleazy A,<br />
5. Lizozymu, 6. α-Chymotrypsyny, 7. Chymotrypsynogenu A; na kolumnie YMC-Pack HIC<br />
4,6x250 mm; Eluent: A – 2.0 M (NH 4 ) 2 SO 4 + 0.1 M KH 2 PO 4 pH 6,8; B – 0.1 M KH 2 PO 4<br />
pH 6,8; Program elucji: 0-100% B w 30 min; v=1.0 ml/min. Detekcja UV 254 nm; [60]<br />
Temperatura i pH buforu również wpływają na oddziaływania białek<br />
z fazą stacjonarną. Ze wzrostem temperatury wzrasta retencja białka [63],<br />
wpływ pH na białko jest bardziej złożony. Przypuszczalnie oddziaływania<br />
130
hydrofobowe są silniejsze, gdy pH buforu znajduje się blisko punktu izoelektrycznego<br />
białka [64]. Główną zaletą chromatografii oddziaływań hydrofobowych<br />
(HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie aktywności<br />
biologicznej cząsteczek przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niż<br />
w przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkie<br />
białka obecne w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem nie<br />
można metody HIC traktować jako „panaceum separacyjne”. Należy zawsze<br />
ją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie białek i peptydów o wysokich<br />
masach molekularnych (powyżej 50 tys. Daltonów).<br />
CHROMATOGRAFIA WIELOWYMIAROWA<br />
Obecnie, identyfikacja i oznaczanie białek w złożonych mieszaninach<br />
białkowych jak w przypadku analizy proteomu komórkowego jest często<br />
osiągana poprzez połączenie różnych metod separacyjnych takich jak SEC,<br />
IEC, RP-HLC lub innych technik chromatograficznych [65, 66]. Wykorzystanie<br />
jednego mechanizmu separacji jest bardzo często niewystarczające.<br />
Sprawność separacji może zostać polepszona poprzez połączenie różnych<br />
rodzajów kolumn chromatograficznych bądź poprzez wykorzystanie różnych<br />
konfiguracji analitycznych. Najczęściej wielowymiarowa separacja obejmuje<br />
dwie bądź więcej techniki rozdzielania podczas jednej analizy.<br />
Podstawowe wymagania zostały początkowo zasugerowane w pracy<br />
Giddings’a na temat wielowymiarowej separacji białek [67]. Dla dwuwymiarowej<br />
separacji można zastosować chromatografię jonowymienną (zazwyczaj<br />
kationowymienną) [68, 69], SEC lub chromatografię powinowactwa [70,<br />
71] w połączeniu z RP-HPLC. Opiteck i inni [72,73] połączyli chromatografię<br />
z silnym wymieniaczem kationowym lub SEC z RP-HPLC by frakcjonować<br />
całkowite lizaty bakterii Escherichia coli. W przybliżeniu wyizolowano 450<br />
białek. Identyfikacja 14 z nich była przeprowadzona przy użyciu spektrometrii<br />
mas (MS) i sekwencjonowania Edmana.<br />
PROTEOMIKA<br />
Proteomika jest nowo powstającą dziedziną naukową. Jej celem są<br />
badania w dużej skali nad składem białek, ich charakterystyką (na przykład<br />
modyfikacje posttranslacyjne) i oddziaływania pomiędzy białkami (również<br />
z innymi biomolekułami takimi jak lipidy bądź kwasy nukleinowe) w żywych<br />
komórkach bądź całych organizmach. W proteomice podczas badań złożona<br />
mieszanina białkowa musi zostać rozdzielona na pojedyncze białka (lub<br />
określone grupy białek) zanim zostanie strawiona do formy peptydów w celu<br />
umożliwienia identyfikacji MS (ryc. 8).<br />
W badaniach w proteomice często stosowana jest dwuwymiarowa<br />
elektroforeza żelowa jako wstępna technika do frakcjonowania, jak również<br />
do określania masy molekularnej i punktu izoelektrycznego rozdzielonych<br />
131
związków. Połączenie elektroforezy kapilarnej z chromatografią w układzie<br />
faz odwróconych jest również ważne. Chromatografia cieczowa jest używana<br />
głównie w celu identyfikacji i oznaczania peptydów o małej masie, które<br />
bardzo trudno rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej. Co więcej do rozdzielania<br />
peptydów i białek za pomocą HPLC często wykorzystuje się połączenie<br />
z spektrometrem mas (HPLC-MS) bądź z tandemowym spektrometrem<br />
mas (HPLC-MS/MS). Techniki te są wykorzystywane w proteomice do<br />
identyfikacji białek i oznaczania ich struktury. Określenie struktury bądź identyfikacja<br />
danego białka jest osiągana poprzez trawienie trypsyną w dokładnie<br />
kontrolowanych warunkach (tworzenie map peptydowych po trawieniu<br />
trypsyną), a następnie przez ustalanie rodzaju wygenerowanych w ten sposób<br />
peptydów i ich wzajemnych proporcji.<br />
Rys. 8. Ogólny schemat przedstawiający przebieg procesu analizy<br />
w proteomice materiału biologicznego<br />
132
Rozdzielanie chromatograficzne strawionych peptydów jest prowadzone<br />
z zastosowaniem kolumnowej chromatografii cieczowej w warunkach<br />
elucji gradientowej. Tak zwane wielowymiarowe układy chromatograficzne<br />
z systemem przełączania kolumn są często wykorzystywane. Na rysunku 9<br />
chromatogram obrazuje przykład rozdzielania peptydów uzyskanych z kazeiny<br />
po trawieniu trypsyną [74]. Produkty strawienia służą jako „odcisk palca”<br />
analizowanego białka.<br />
Poprzez połączenie stworzonych map peptydowych po trawieniu<br />
trypsyną z odpowiednimi bazami danych biolodzy i biotechnolodzy niedawno<br />
uzyskali bardzo skuteczne narzędzie identyfikacji oparte na technikach<br />
HPLC i MS.<br />
Rys. 9. Przykład rozdzielania peptydów powstałych po trawieniu trypsyną kazeiny na kolumnie<br />
Jupiter proteo 90 Å column [72]<br />
CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA<br />
(AFFINITY CHROMATOGRAPHY)<br />
Bardzo szerokie zastosowanie do rozdzielania białek znajdują szczególnie<br />
selektywne metody chromatografii powinowactwa (Affinity Chromatography).<br />
Ta technika jest przede wszystkim wykorzystywana do specyficznych<br />
zastosowań i do białek o konkretnych właściwościach. Jedynie tzw.<br />
chromatografia metalopowinowactwa [10,75] ma dość ogólne zastosowanie<br />
do rozdzielania białek i peptydów posiadających atomy siarki w cząsteczce.<br />
W innych zastosowaniach chromatografii powinowactwa metody postępowania<br />
są często zależne od enzymatycznych lub koenzymatycznych właściwości<br />
wyodrębnianych białek. Mimo stosowania nazwy „chromatografia powinowactwa”,<br />
metody powinowactwa winny być raczej zaliczane do grupy<br />
metod selektywnej chemisorpcji niż do metod chromatograficznych. Chromatografia<br />
powinowactwa zostanie szerzej omówiona w następnej pracy.<br />
133
METODY DETEKCJI W CHROMATOGRAFII PEPTYDÓW I BIAŁEK<br />
Do oznaczania obecności i stężenia peptydów i białek w eluacie wypływającym<br />
z kolumny chromatograficznej wykorzystywane są najczęściej<br />
detektory spektrofotometryczne w zakresie nadfioletu UV, albo w zakresie<br />
widzialnym VIS. Oznaczenie białek i peptydów może zostać ułatwione po<br />
zastosowaniu tzw. derywatyzacji postkolumnowej ninhydryną. Detektory UV<br />
stosuje się w zakresie 215 nm, gdy rozdzielane peptydy zawierają jedynie<br />
chromofory pochodzące od wiązań peptydowych. Gdy w cząsteczkach peptydów<br />
zwarte są struktury aromatyczne, albo mostki disiarczkowe, wykorzystuje<br />
się wyższe długości fali (260-280 nm).<br />
Gdy rozdzielane peptydy / białka występują w śladowych stężeniach<br />
wykorzystuje się fluorescencję stosując detektor fluoroescencyjny FLD. Zjawisko<br />
fluorescencji może zostać wykorzystane do oznaczania i identyfikacji<br />
peptydów i białek dzięki postkolumnowemu, albo prekolumnowemu zastosowaniu<br />
odczynnika derywatyzującego). Jako odczynniki derywatyzujące<br />
stosuje się różne związki lub mieszaniny związków, np. kwas jodooctowy<br />
z aldehydem o-ftalowym i 2-merkaptoetanolem [76], 6-aminoquinolyl-N-<br />
-hydroksysuccinimidyl carbamate, czy dialdehyd o-ftalowy [16]. Detektory<br />
fluorescencyjne są bardzo specyficzne wiele razy czulsze od detektorów<br />
spektrofotometrycznych.<br />
Coraz powszechniej wykorzystywane są spektrometry mas w połączeniu<br />
z kolumnową chromatografią cieczową (LC-MS lub przeważnie<br />
z tandemowym spektrometrem mas LC-MS-MS) szczególnie do detekcji<br />
i oznaczenia masy molekularnej małych peptydów i fragmentów białek o niskim<br />
stężeniu w badanej próbce [77], szczególnie w burzliwie rozwijającej<br />
się proteomice. Zastosowanie w analityce śladowych zawartości peptydów<br />
znajdują też detektory elektrochemiczne [78].<br />
PODSUMOWANIE<br />
Przez wiele lat wykorzystywania chromatografii cieczowej do rozdzielania<br />
peptydów i białek udało się opracować szereg metod rozdzielania tych<br />
substancji i różnych sposobów wpływania na ich retencję. Dotychczas nie<br />
sformułowano ogólnych reguł racjonalnego doboru warunków rozdzielania<br />
w zależności od struktury cząsteczek rozdzielanych peptydów i białek. Elektroforeza<br />
żelowa nie jest odpowiednią techniką do separacji peptydów o niskich<br />
masach molekularnych, a elektroforeza kapilarna nie jest do końca<br />
wdrożona do zastosowań dla peptydów i białek, a szczególnie nie jest przydatna<br />
do zastosowań preparatywnych.<br />
W konsekwencji metody chromatografii cieczowej pozostają jedyną<br />
uniwersalną metodą rozdzielania wszystkich mieszanin peptydów i białek.<br />
Metody chromatografii cieczowej są szczególnie przydatnymi narzędziami<br />
do rozdzielania i oznaczania peptydów i białek, a szczególnie peptydów<br />
o niskich masach cząsteczkowych, co więcej są nieocenione w procesie roz-<br />
134
dzielania tych substancji w skali preparatywnej i przy ich przemysłowej produkcji.<br />
Jednakże z powodu skomplikowanej budowy białek, ich zachowanie<br />
podczas procesu rozdzielania bywa często dalekie od reguł i poglądów.<br />
Próba opracowania ogólnych reguł zależności retencji tych substancji<br />
od warunków rozdzielania w wybranych układach chromatograficznych jest<br />
przedmiotem aktualnie prowadzonych badań autorów niniejszej pracy.<br />
LITERATURA<br />
[1] M. Zasloff, Nature, 415 (2002) 389.<br />
[2] T. Ganz, R.I. Lehrer, Curr Opin Hematol., 9 (2002) 18.<br />
[3] W. Kamysz, M. Okrój and J. Łukasiak, Acta Biochim. Pol., 50 (2003) 461.<br />
[4] K. Conceicao, K. Konno, M. Richardson, M.M. Antoniazzi, C. Jared,<br />
S. Daffre, A.C.M. Camargo, D.C. Pimenta, Peptides, 27 (2006) 3092.<br />
[5] T.V. Popa, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1111 (2006) 192.<br />
[6] J. Amiot, L. Germain, S. Turgeon, M. Lemay, C. Ory-Salam, F.A. Auger,<br />
Int. Dairy J., 14 (2004) 619.<br />
[7] G.B. Irvine, J. Biochem. Bioph. Meth., 56 (2003) 233.<br />
[8] W. Warren, N.E. Astephen, T.E. Wheat, J. Chromatogr. A, 512 (1990) 13.<br />
[9] X. Chen, L. Hu, X. Su, L. Kong, M. Ye, H. Zou, J. Pharmaceut. Biomed.,<br />
40 (2006) 559.<br />
[10] W.-C. Lee, K.H. Lee, Anal. Biochem., 324 (2004) 1.<br />
[11] A. Cecilia A. Roque, C. R. Lowe, Biotechnol. Adv., 24 (2006) 17.<br />
[12] A. Bylina, M. Ulanowicz, Chem. Anal.-Warsaw, 43 (1998) 955.<br />
[13] R. Janzen, K.K. Unger, W. Müller, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 522<br />
(1990) 77.<br />
[14] B. De Collongue-Poyet, C. Vidal-Madjar, B. Sebille, K.K. Unger,<br />
J. Chromatogr. B, 664 (1995) 155.<br />
[15] J.L.M. McNay, J.P. O’Connell, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng.,<br />
76 (3) (2001) 233.<br />
[16] A.B.P. Van Kuilenburg, A.E.M. Stroomer, G.J. Peters, A.H. Van Gennip,<br />
J. Chromatogr. B, 759 (2001) 51.<br />
[17] F. Moffat, P. Senkans, D. Ricketts, J. Chromatogr. A, 891 (2000) 235.<br />
[18] G. Bordin, F. Cordeiro Raposo, B. De la Calle, A.R. Rodriguez,<br />
J. Chromatogr. A, 928 (2001) 63.<br />
[19] P. DePhillips, A.M. Lenhoff, J. Chromatogr. A, 933 (2001) 57.<br />
[20] F. Lesignoli, A. Germini, R. Carradini, S. Sforza, G. Galaverna, A. Dossena,<br />
R. Marchelli, J. Chromatogr. A, 922 (2001) 177.<br />
[21] D. Josić, H. Horn, P. Schulz, H. Schwinn, L. Britsch, J. Chromatogr.<br />
A, 796 (1998) 289.<br />
[22] G. Iberer, H. Schwinn, D. Josić, A. Jungbauer, A. Buchacher, J. Chromatogr.<br />
A, 921 (2001) 15.<br />
[23] T. Yoshida, T. Okada, J. Chromatogr. A, 840 (1999) 1.<br />
[24] J.L.M. McNay, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng., 76 (3) (2001) 224.<br />
135
[25] S.U. Sane, S.M. Cramer, T.M. Przybycien, J. Chromatogr. A, 849<br />
(1999) 149.<br />
[26] V. Sanz-Nebot, I. Toro, J. Barbosa, J. Chromatogr. A, 870 (2000) 335;<br />
[27] the Reporter – Discovery BIO.<br />
[28] YMC INC. – “Liquid Chromatography Product Guide”.<br />
[29] K.A. Tweeten, T.N. Tweeten, J. Chromatogr., 359 (1986) 111.<br />
[30] J.K. Swadesh, J. Chromatogr., 512 (1990) 315.<br />
[31] Y. Shen, X. Shao, K. O’Neill, J.S. Bradshaw, M.L.Lee, J. Chromatogr.<br />
A, 866 (2000) 1.<br />
[32] J. River, R. McClintock, R. Galyean, H. Anderson, J. Chromatogr., 288<br />
(1984) 303.<br />
[33] P.A. Hartman, J.D. Stodola, G.C. Harbour, J.G. Hoodegheide, J. Chromatogr.,<br />
360 (1986) 385.<br />
[34] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,<br />
255 (1983) 115.<br />
[35] G.B. Cox, J. Chromatogr. A, 656 (1993) 353.<br />
[36] W.S. Hancock (Editor), “Handbook of HPLC for the Separation of Amino<br />
Acids, Peptides and Proteins”, Vol. II, CRC Press, Boca Raton, Florida,<br />
1986.<br />
[37] A.M. Krstulovic, P.R. Brown, “RP HPLC. Theory, Practice and Biomedical<br />
Applications”, John Wiley and Sons, New York, 1982.<br />
[38] N. Ishizuka, H. Kobayashi, H. Minakuchi, K. Nakanishi, K. Hirao, K. Hosoya,<br />
T. Ikegami, N. Tanaka, J. Chromatogr. A, 960 (2002) 85.<br />
[39] J.P. Boissel, H. Wajcman, H. Fabritius, R. Cabanes, D. Labie, Biochim.<br />
Biophys. Acta., 670 (1981) 203.<br />
[40] D. Corradini, LC-GC int., 9 (1996) 732.<br />
[41] J. Sugihara, T. Imamura, T. Imoto, T.H.J. Huisman, Biochim. Biophys.<br />
Acta., 669 (1981) 105.<br />
[42] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,<br />
255 (1983) 115.<br />
[43] C.A. Bishop, W.S. Hancock, S.O. Brennan, R.W. Carrel, M.T.W. Hearn,<br />
J. Liq. Chromatogr., 599 (1981) 4.<br />
[44] P. Szabelski, A. Cavazzani, K. Kaczmarski, X. Liu, J. Van Horn, G. Guiochon,<br />
J. Chromatogr. A, 950 (2002) 41.<br />
[45] C.L. Stevenson, M.M. Tan, J. Pept. Res., 55 (2000) 129.<br />
[46] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1043<br />
(2004) 9.<br />
[47] W.S. Hancock, C.A. Bishop, R.L. Prestidge, M.T. Hearn, Anal. Biochem.,<br />
89 (1978) 203.<br />
[48] D.M. Abercrombie, Anal. Biochem., 125 (1982) 395.<br />
[49] J.L. Glajch, J.J. Kirkland, J. Kohler, J. Chromatorgr., 384 (1987) 81.<br />
[50] B. Grego, F. Lambrou, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 266 (1983) 89.<br />
[51] H. Ishikawa, H. Tamaoki, J. Ferment. Bioeng., 82 (1996) 140.<br />
[52] K. Stachowiak, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 1758.<br />
[53] K. Larsson, W. Hermann, P. Moller, D. Sanchez, J. Chromatogr., 450<br />
(1988) 71.<br />
136
[54] W.S. Hancock, J.T. Sparrow, J. Chromatogr., 206 (1981) 71.<br />
[55] M.A. Stadalius, L.R. Snyder, J. Berus, LC-GC, 6(6) (1988) 494.<br />
[56] Vydac – “2000/2001 HPLC Columns and Bulk Media”.<br />
[57] S-I. Wu, J. Frenz, LC GC, 6 (11) (1993) 684.<br />
[58] Aglient – “ZORBAX BioSeries GF-450 column”.<br />
[59] M.E. Lienqueo, A. Mahn, J.C. Salgado, J.A. Asenjo, J. Chromatogr. B,<br />
849 (2007) 53.<br />
[60] J.A. Queiroz , C.T. Tomaz, J.M.S. Cabral, J. Biotechnol., 87 (2001) 143.<br />
[61] A. Mahn, J.A. Asenjo, Biotechnol. Adv., 23 (2005) 359.<br />
[62] YMC INC. – “Pack HIC Columns”.<br />
[63] J.Chen, Y. Sun, J. Chromatogr. A, 992 (2003) 29.<br />
[64] S. Hjerten, J. Rosengren, S. Pahlman, J. Chromatogr., 101 (1974) 281.<br />
[65] C.T. Tomaz, J.A. Queiroz, Biotechnol. Lett., 26 (2004) 223.<br />
[66] I. Neverova, J.E. Van Eyk, J. Chromatogr. B, 815 (2005) 51.<br />
[67] A.J. Link, Trends Biotechnol., 20 (2002) 12.<br />
[68] J.C. Giddings, Anal. Chem., 56 (1984) 1258A.<br />
[69] D. Wall, M. Kachman, S. Gong, R. Hinderer, S. Pavus, D. Misek,<br />
S. Hauash, D. Lubman, Anal. Chem., 72 (2000) 1099.<br />
[70] D. Wolter, M.P. Washburn, J.R. Yates III, Anal. Chem., 73 (2001) 5683.<br />
[71] L. Giggs, C. Sioma, F.E, Reginier, J. Chromatogr. A, 924 (2001) 359.<br />
[72] G.J. Opiteck, K.C. Lewis, J.W. Jorgenson, R.J. Anderegg, Anal. Chem.,<br />
69 (1997) 1518.<br />
[73] G.J. Opiteck, S.M. Ramirez, J.W. Jorgenson, M.A. Moseley III, Anal.<br />
Biochem., 258 (1998) 349.<br />
[74] Jupiter – “HPLC columns for the proteomic era”.<br />
[75] C. Roesli, G. Elia, D. Neri, Clin. Biochem., 37 (2004) 579.<br />
[76] N.E. Labrou, J. Chromatogr. B, 790 (2003) 67.<br />
[77] Y.V. Tcherkas, A.D. Denisenko, J. Chromatogr. A, 913 (2001) 309.<br />
[78] W.A. Kleinman, J.P. Richie Jr., Biochem. Pharmacol., 60 (2000) 19.<br />
137