31.03.2017 Views

CamSep 1

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.

POSTĘPY CHROMATOGRAFII<br />

Praca zbiorowa pod redakcją<br />

Bronisława K. Głoda<br />

Monografie nr 111<br />

WYDAWNICTWO<br />

AKADEMII PODLASKIEJ<br />

SIEDLCE 2009


Komitet Wydawniczy:<br />

Zofia Chyra-Rolicz (przewodnicząca), Stanisław Jaczyński, Mirosław<br />

Jakubiak, Iwona Kiersztyn, Marek Kucharski, Ryszard Mojak, Ryszard<br />

Rosa, Janina Skrzyczyńska, Stanisław Socha, Janusz Toruński,<br />

Izabela Trzpil, Janusz Uchmański, Hanna Wadas-Woźny, Andrzej<br />

Wiśniewski, Krystyna Wojtczuk, Kazimierz Żegnałek<br />

Komitet Redakcyjny (recenzenci):<br />

Tadeusz Dzido – Lublin, Bronisław K. Głód – Siedlce, Marian Kamiński<br />

– Gdańsk, Teresa Kowalska – Katowice, Mieczysław Sajewicz – Katowice,<br />

Andrzej Stołyhwo – Warszawa, Monika E. Waksmundzka-Hajnos<br />

– Lublin, Zygfryd Witkiewicz – Kielce, Paweł Zarzycki – Koszalin<br />

Żaden fragment tej publikacji nie może być reprodukowany, umieszczany w systemach przechowywania<br />

informacji lub przekazywany w jakiejkolwiek formie – elektronicznej, mechanicznej,<br />

fotokopii czy innych reprodukcji – bez zgody posiadacza praw autorskich.<br />

© Copyright by Wydawnictwo Akademii Podlaskiej, Siedlce 2009<br />

Monografie nr 111<br />

PL ISSN 0860-2719<br />

Wydawnictwo Akademii Podlaskiej<br />

08-110 Siedlce, ul. Bema 1, tel. (025) 643 15 20<br />

e-mail: wydawnictwo@ap.siedlce.pl<br />

www.wydawnictwo.ap.siedlce.pl<br />

Wyd. I. Format B-5.<br />

Ark. wyd. 7,2. Ark. druk. 8,6.<br />

Łamanie: Zofia Chudek (Wydawnictwo AP)<br />

2


SPIS TREŚCI<br />

Przedmowa.................................................................................................... 5<br />

Piotr M. Słomkiewicz, Zygfryd Witkiewicz<br />

Dozownik laserowy do dozowania próbek ciekłych do kolumn<br />

pakowanych w chromatografii gazowej.......................................................... 7<br />

Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Tomasz Zieliński, Paweł Zarzycki<br />

Zastosowanie HPLC w badaniach choroby Parkinsona .............................. 15<br />

Monika Asztemborska<br />

Zastosowanie metod separacyjnych w badaniu enancjomeryzacji.............. 33<br />

Bronisław K. Głód, Paweł Piszcz, Iwona Kiersztyn,<br />

Anna Lamert, Paweł Zarzycki<br />

Zastosowanie HPLC do oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów<br />

oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego.......................................... 41<br />

Józef Rzepa<br />

Oznaczanie leków i pestycydów w wodach powierzchniowych ................... 67<br />

Marian Kamiński<br />

Preparatywna i procesowa chromatografia cieczowa .................................. 79<br />

Daniel Jastrzębski, Grażyna Romanik, Marcin M. Kamiński, Maciej<br />

Trznadel, Anita Skrzypczak, Aleksandra Królicka, Marian Kamiński<br />

Kolumnowa chromatografia cieczowa w rozdzielaniu i analizie peptydów<br />

i białek......................................................................................................... 113<br />

3


4


PRZEDMOWA<br />

Postępy Chromatografii to pierwsza z cyklu monografia poświęcona<br />

najnowszym trendom w chromatografii, wydana przy okazji organizowanych<br />

Podlaskich Spotkań Chromatograficznych. Adresowana jest przede wszystkim<br />

do pracowników nauki, studentów oraz wszystkich, którzy na co dzień<br />

zajmują się chromatografią. Autorzy zawarli w tej pozycji praktyczne przykłady<br />

zastosowań z zakresu różnych dziedzin chromatografii.<br />

Pragniemy podziękować wszystkim, którzy przyczynili się do powstania<br />

tej książki oraz chcemy zachęcić innych, aby w przyszłości stali się<br />

współautorami kolejnych wydań.<br />

KOMITET REDAKCYJNY


6


Piotr M. SŁOMKIEWICZ 1 , Zygfryd WITKIEWICZ 1,2,3<br />

1)<br />

Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego, Kielce,<br />

2)<br />

COBRABiD, Warszawa,<br />

3)<br />

Instytut Chemii, Wojskowa Akademia Techniczna, Warszawa<br />

DOZOWNIK LASEROWY DO DOZOWANIA<br />

PRÓBEK CIEKŁYCH DO KOLUMN PAKOWANYCH<br />

W CHROMATOGRAFII GAZOWEJ<br />

Opisano dozownik umożliwiający dozowanie próbek ciekłych do kolumn pakowanych<br />

w chromatografii gazowej. Dozowane próbki są bardzo szybko odparowywane za<br />

pomocą promienia laserowego w kontrolowanych warunkach.<br />

WPROWADZENIE<br />

Dozowanie ciekłych próbek do chromatografów gazowych polega na<br />

wstrzykiwaniu cieczy za pomocą mikrostrzykawki do ogrzewanej komory dozownika,<br />

który znajduje się bezpośrednio przed kolumną chromatograficzną.<br />

W wyniku tego próbka ulega odparowaniu w przepływającym przez komorę<br />

gazie nośnym i jej pary wraz z tym gazem są wprowadzane do kolumny.<br />

Konstrukcje komór dozowników, służących do odparowywania ciekłych<br />

próbek, powinny spełniać dwa podstawowe warunki. Powinny charakteryzować<br />

się krótkim czasem odparowania, czyli bardzo szybko dostarczać<br />

ciepło potrzebne do odparowania próbki oraz mieć taką budowę, żeby rozcieńczanie<br />

par próbki gazem nośnym było możliwie najmniejsze. Warunki te<br />

są konieczne, albowiem początkowa szerokość pasma próbki w gazie nośnym<br />

mierzona w jednostkach czasu ma wpływ na rozdzielanie i rozmywanie<br />

pików chromatograficznych rejestrowanych u wylotu kolumny. Oprócz<br />

spełnienia tych podstawowych warunków minimalizacji początkowej szerokości<br />

pasma sprzyja minimalizacja wielkości dozowanej próbki.<br />

Dozowanie cieczy o wysokiej temperaturze wrzenia powoduje chwilowe<br />

obniżenie temperatury strumienia gazu nośnego i komory dozownika.<br />

W wyniku tego zmniejsza się prędkość odparowywania próbki i w rezultacie<br />

prowadzi to do znacznego rozcieńczenia gazem nośnym par cieczy dopływających<br />

do kolumny. Próbka dopływa do kolumny w postaci szerokiego,<br />

rozmytego gazem nośnym pasma i rozdzielenie pików chromatograficznych<br />

może nie być zadowalające. Efekt ten jest szczególnie wyraźny, gdy jest dozowana<br />

mieszanina dwóch cieczy znacznie różniących się temperaturą<br />

wrzenia. Wówczas pik składnika o wysokiej temperaturze wrzenia jest<br />

znacznie bardziej rozmyty w porównaniu z pikiem składnika o niższej temperaturze<br />

wrzenia.<br />

7


W niniejszym artykule opisano dozownik do chromatografii, w którym<br />

do odparowania ciekłej próbki wykorzystuje się energię światła laserowego.<br />

Zaletą tego rozwiązania jest natychmiastowe, krótkotrwałe odparowywanie<br />

próbki. Możliwa jest przy tym regulacja mocy światła laserowego i czasu nagrzewania<br />

próbki w trakcie odparowywania, tak, aby uzyskać wąski prostokątny<br />

kształt impulsu odparowywanej próbki. Dozownik ten przeznaczony<br />

głownie do dozowania próbek o wysokich temperaturach wrzenia do kolumn<br />

pakowanych [1,2].<br />

DOZOWNIK PRÓBEK O WYSOKIEJ TEMPERATURZE WRZENIA<br />

DO KOLUMN PAKOWANYCH<br />

Dozownik ma kształt walca (rys. 1), jego korpus 1 jest wykonany ze<br />

stali kwasoodpornej. Wewnątrz korpusu znajduje się cylindryczna ogrzewana<br />

komora 2. Komorę 2 od góry zamyka pokrywa 3, w której umieszczono<br />

kwarcową szybkę 4, przez którą do jej wnętrza przechodzi promień światła<br />

laserowego 5. Do komory 2 jest doprowadzany gaz nośny przez wlot górny<br />

6 lub wlot dolny 7. Gaz nośny przez przyłącze 8 wpływa do kolumny chromatograficznej.<br />

Wlot dolny 7 służy do zasilania kolumny chromatograficznej<br />

gazem nośnym z pominięciem komory 2 dozownika. Wlot górny 6 służy do<br />

zasilania gazem nośnym komory 2 poprzez dysze 9 umieszczone w pierścieniu,<br />

który znajduje się w górnej części komory 2. Dysze rozdzielają<br />

strumień gazu nośnego na kilka strumieni, co ułatwia tworzenie się laminarnego<br />

przepływu gazu nośnego w całym przekroju komory 2 niezależnie od<br />

szybkości przepływu i ciśnienia gazu nośnego. Dzięki temu unika się zawirowań<br />

i „martwych stref”, co mogłoby niekorzystnie wpływać na kształt pasma<br />

początkowego wprowadzanej próbki.<br />

9<br />

4<br />

5<br />

2<br />

3<br />

12<br />

6<br />

10<br />

11<br />

14<br />

13<br />

7<br />

8<br />

15<br />

1<br />

Rys. 1. Dozownik próbek o wysokiej temperaturze<br />

wrzenia do kolumn pakowanych:<br />

1 – korpus, 2 – komora, 3 – pokrywa,<br />

4 – szybka kwarcowa, 5 – promień światła<br />

laserowego, 6 – wlot górny, 7 – wlot dolny,<br />

8 - przyłącze kolumny chromatograficznej,<br />

9 – dysze w pierścieniu, 10 – pojemnik<br />

próbki, 11 – śruba regulacyjna, 12 – membrana,<br />

13 – oprawa, 14 – nakrętka,<br />

15 – grzałka elektryczna<br />

8


W komorze 2 znajduje się pojemnik próbki 10, który jest umieszczony<br />

na osi promienia światła laserowego. Regulacji położenia pojemnika próbki<br />

10 na osi promienia światła laserowego dokonuje się za pomocą mikrometrycznej<br />

śruby regulacyjnej 11. Przekłuwając igłą mikrostrzykawki membranę<br />

12 z gumy silikonowej umieszczonej w oprawie 13 z nakrętką 14 wprowadza<br />

się próbkę cieczy do pojemnika próbki 10. Oprawa 13 i nakrętka 14 mają radiatory,<br />

aby chronić membranę 12 przed nadmierną temperaturą. Korpus<br />

dozownika 1 jest ogrzewany i termostatowany grzałką elektryczną 15. Pojemnik<br />

próbki 10 znajduje się na osi wylotu kanalika, przez który przechodzi<br />

igła mikrostrzykawki po przekłuciu membrany dozownika. Wprowadzana igła<br />

przechodzi przez boczny otwór 16 (rys. 2) w pojemniku próbki 10 i opiera się<br />

o przeciwległą ściankę. Wówczas można wstrzyknąć próbkę cieczy do zagłębienia<br />

17 w pojemniku próbki 10. Takie rozwiązanie zapewnia prawidłowe<br />

napełnianie pojemnika próbki 10 i chroni wlot kolumny chromatograficznej<br />

przed przypadkowym skapnięciem ciekłej próbki. Zastosowanie otworu 16<br />

na igłę mikrostrzykawki z boku pojemnika próbki 10 ułatwia odtwarzalność<br />

wprowadzania próbki do pojemnika w trakcie wykonywania wielokrotnych<br />

dozowań podczas rutynowych analiz.<br />

16 17<br />

11<br />

10<br />

18<br />

Rys. 2. Układ pojemnika próbki:10 – pojemnik próbki, 11 – śruba regulacyjna, 16 – otwór doprowadzenia<br />

igły mikrostrzykawki, 17 – zagłębienie, 18 – złącze termopary<br />

Na dnie zagłębienia 17 znajduje się złącze termopary 18. Termopara<br />

służy do kontroli temperatury próbki w trakcie jej odparowywania promieniem<br />

światła laserowego. Możliwe jest wykonanie wstępnej charakterystyki zależności<br />

temperatury nagrzewania pojemnika próbki 10 od mocy wiązki laserowej<br />

i czasu naświetlania. Umieszczenie termopary 18 na dnie pojemnika<br />

próbki 10 pozwala precyzyjnie mierzyć temperaturę w punkcie odparowywania<br />

próbki, dzięki czemu można uniknąć silnego przegrzania, które może<br />

doprowadzić do rozkładu termicznego jej składników.<br />

Na rys. 3 przedstawiono schemat podłączenia dozownika z chromatografem<br />

gazowym. W trakcie wprowadzania mikrostrzykawką próbki cieczy<br />

do dozownika gaz nośny, którego wielkość strumienia reguluje się za pomocą<br />

zaworu iglicowego 19, przepływa przez otwarty zawór elektromagnetyczny<br />

20 do wlotu 7 dozownika i wypływa przez przyłącze 8 do kolumny chromatograficznej.<br />

Równocześnie jest zamknięty zawór elektromagnetyczny 21<br />

i gaz nośny omija komorę 2. Zastosowanie dwóch torów gazowych pozwala<br />

na wstrzymanie przepływu gazu przez komorę 2 dozownika w trakcie wprowadzania<br />

próbki do pojemnika 10. Dzięki temu unika się porywania niewiel-<br />

9


kich ilości par (szczególnie składników analizowanej mieszaniny o niższych<br />

temperaturach wrzenia) przez gaz nośny przed rozpoczęciem właściwego<br />

procesu odparowywania. Po wprowadzeniu próbki do pojemnika 10, zamyka<br />

się zawór elektromagnetyczny 20 i otwiera się zawór elektromagnetyczny<br />

21. Wówczas gaz nośny zaczyna przypływać przez komorę 2. W tym momencie<br />

włącza się laser 23 i promień światła laserowego pada na zagłębienie<br />

17 w pojemniku próbki 10 i znajdująca się w zagłębieniu 17 ciecz zostaje<br />

gwałtownie odparowana.<br />

Temperaturę procesu odparowywania można odczytać na mierniku<br />

temperatury 24, który jest podłączony do termopary 18. Regulując moc promienia<br />

laserowego, można kontrolować temperaturę, w jakiej odbywa się<br />

odparowywanie próbki cieczy. W ten sposób można uzyskać dużą szybkość<br />

odparowywania próbki, a jednocześnie uniknąć jej silnego przegrzania, które<br />

mogłoby być przyczyną termicznego rozkładu składników próbki. Pary próbki<br />

wraz z gazem nośnym przepływają do kolumny chromatograficznej.<br />

22<br />

23<br />

21<br />

6<br />

2<br />

10<br />

18<br />

17<br />

24<br />

20<br />

7<br />

19<br />

8<br />

Rys. 3. Schemat połączeń gazowych dozownika do kolumn pakowanych: 2 – komora, 6 – wlot<br />

górny, 7 – wlot dolny, 8 – przyłącze kolumny chromatograficznej, 10 – pojemnik próbki,<br />

17 – zagłębienie, 18 – czujnik temperatury, 19 – zawór iglicowy, 20, 21, 22 – zawór elektromagnetyczny,<br />

23 – laser, 24 – miernik temperatury<br />

Możliwe jest także usuwanie rozpuszczalnika z wprowadzonej próbki<br />

do pojemnika 10 przez zamknięcie zaworu elektromagnetycznego 21<br />

i otwarcie zaworów elektromagnetycznych 20 i 22. Wówczas gaz nośny za-<br />

10


czyna przypływać przez komorę 2 i wypływa z parami rozpuszczalnika przez<br />

zawór elektromagnetyczny 22 na zewnątrz dozownika.<br />

DOZOWNIK LASEROWY A DOZOWNIK KLASYCZNY<br />

W opisywanym dozowniku laserowym zastosowano laser argonowy<br />

firmy Spectra Physics o ciągłej lub impulsowej oraz o regulowanej długości<br />

i mocy wiązki światła. Działanie tego dozownika porównano ze zwykłym dozownikiem<br />

chromatografu gazowego Chrom 5.<br />

2<br />

napięcie [mV]<br />

1<br />

0 2 4 6 8 10<br />

czas [min]<br />

Rys. 4. Porównanie kształtu piku. Kolumna 0,5 m, średnica wewnętrzna 2 mm wypełniona granulkami<br />

szklanymi 60/80 mesh, temperatura kolumny 280 0 C, detektor (FID) 280 0 C, 0,3 μl oleju<br />

parafinowego. 1 – pik otrzymany za pomocą dozownika klasycznego, temperatura dozownika<br />

280 0 C, 2 – pik otrzymany za pomocą dozownika - laser argonowy λ=514,5 nm, 5W<br />

Na rysunku 4 przedstawiono przykładowe kształty pików chromatograficznych<br />

otrzymanych po dozowaniu próbki oleju parafinowego do dozownika<br />

klasycznego i laserowego w tych samych warunkach. Pik otrzymany z dozownika<br />

laserowego jest mniej rozmyty w porównaniu z pikiem otrzymanym<br />

przy użyciu dozownika klasycznego. Obliczony za pomocą programu Origin<br />

[3] narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika laserowego wynosi<br />

0,07 mV/s, a narost piku otrzymanego przy użyciu dozownika klasycznego<br />

0,3 mV/s.<br />

11


1<br />

2<br />

3<br />

A<br />

2<br />

3<br />

B<br />

napięcie [mV]<br />

napięcie [mV]<br />

0 1 2 3 4 5 6<br />

czas [min]<br />

0 1 2 3 4 5 6<br />

czas [min]<br />

Rys. 5. Chromatogram fenantrenu (2) i antracenu (3) w toluenie (1). Kolumna 1,6% SP-301 na<br />

Supelcoporcie 100/200 o długości 2,5 m i średnicy wewnętrznej 3 mm. Temperatura kolumny<br />

i detektora (FID) 275 o C, gaz nośny azot 20 cm 3 /min. A – dozownik klasyczny temperatura<br />

260 o C, B – dozownik - laser argonowy 514,5 nm, 10W<br />

Rysunek 5 przedstawia dwa chromatogramy fenantrenu i antracenu<br />

w toluenie. Chromatogram otrzymany przy użyciu dozownika klasycznego<br />

(rys. 5A) przedstawia nakładanie się piku rozpuszczalnika na piki fenantrenu<br />

i antracenu. Natomiast dozownik laserowy umożliwia wstępne odparowanie<br />

toluenu z dozownika a następnie szybkie odparowanie fenantrenu i antracenu<br />

za pomocą wiązki laserowej do kolumny chromatograficznej. W wyniku<br />

tego otrzymane WWA są lepiej rozdzielone.<br />

A<br />

B<br />

1<br />

2<br />

napięcie [mV]<br />

napięcie [mV]<br />

3<br />

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />

czas [min]<br />

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />

czas [min]<br />

12


4<br />

C<br />

napięcie [mV]<br />

3<br />

Rys. 6. Chromatogramy metanolu z zastosowaniem dozownika laserowego o różnych długościach<br />

fali i mocy wiązki. A – laser argonowy λ=514,5 nm, 5W, B - laser argonowy λ=351,5 nm,<br />

3W, C - laser argonowy λ=351,5 impuls 50 W. Kolumna chromatograficzna o długości 2,5 m<br />

i średnicy wewnętrznej 3 mm z Porapakiem Q 80/100 mesh, temperatura kolumny 160 o C,<br />

przepływ gazu nośnego (azot) 50 cm 3 /min, temperatura detektora (TCD) 160 o C. 1 – metanol,<br />

2 – metan, 3 – woda, 4 – wodór<br />

W zależności od użytej do odparowywania energii wiązki laserowej<br />

jest możliwa zmiana chemicznej postaci wprowadzanej próbki. Przedstawiono<br />

to na przykładzie chromatografowania metanolu. Dozowanie z użyciem<br />

niewielkiej energii wiązki laserowej metanolu do kolumny wypełnionej Porapakiem<br />

Q daje pojedynczy pik (rys. 6A). Zwiększenie energii wiązki sprawia,<br />

że następuje rozkład cząsteczki metanolu na metan i wodę i na chromatografie<br />

obserwuje się dwa piki (rys. 6B). Przy znacznym zwiększeniu energii<br />

wiązki, możliwy jest także rozkład metanu, na węgiel i wodór, i wówczas obserwuje<br />

się dwa piki wodoru i wody (rys. 6C). Węgiel pozostaje w dozowniku.<br />

WNIOSKI<br />

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20<br />

czas [min]<br />

1. Zastosowanie dozownika laserowego do kolumn pakowanych w chromatografii<br />

gazowej umożliwia zmniejszenie rozmycia pasma początkowego<br />

i pików składników dozowanej próbki.<br />

2. Dozownik laserowy pozwala wstępnie odparować rozpuszczalnik i następnie<br />

za pomocą wiązki laserowej odparować wysokowrzące składniki<br />

próbki.<br />

3. Stosowanie wiązki laserowej o zróżnicowanej energii pozwala nie tylko<br />

odparować próbkę, ale także rozkładać anality na części składowe. Takie<br />

postępowanie może być przydatne w chromatografii gazowej z detektorem<br />

masowym.<br />

13


LITERATURA<br />

1. P.M. Słomkiewicz, Dozownik do chromatografu gazowego, zwłaszcza<br />

do próbek o wysokiej temperaturze wrzenia, PL - 192882, (5 stycznia<br />

2007).<br />

2. P.M. Słomkiewicz, Z. Witkiewicz, Dozowniki laserowe w chromatografii<br />

gazowej, Aparatura Badawcza i Dydaktyczna, 11/4(2006)264 – 272.<br />

3. Origin User`s Manual, Microcal Software. Inc., Northampton MA, USA.<br />

14


Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Tomasz ZIELIŃSKI 1 ,<br />

Paweł ZARZYCKI 2<br />

1)<br />

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska<br />

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce<br />

e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl<br />

2)<br />

Zakład Toksykologiii Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,<br />

Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 Koszalin<br />

ZASTOSOWANIE HPLC W BADANIACH<br />

CHOROBY PARKINSONA<br />

W pracy przedstawiono podstawowe informacje o chorobie Parkinsona. Omówiono<br />

zastosowanie HPLC w oznaczaniu profilu dziennego leków stosowanych w jej leczeniu,<br />

oznaczaniu całkowitego potencjału antyoksydacyjnego oraz ich korelacje z testem<br />

Webstera i natężeniem tremoru.<br />

PODSTAWOWE INFORMACJE O CHOROBIE PARKINSONA<br />

Pierwszy opis klinicznych objawów choroby Parkinsona (ChP) pochodzi<br />

z egipskich papirusów z XIII wieku p.n.e. W czasach nowożytnych chorobę<br />

ponownie opisał w 1817 roku brytyjski lekarza Johna Parkinsona w artykule<br />

An Essay on the Shaking Palsy.<br />

ChP spowodowana jest niewydolnością pozapiramidowego układu ruchowego.<br />

Głównym procesem patologicznym jest postępujące zwyrodnienie<br />

neuronów dopaminergicznych w warstwie zbitej istoty czarnej [1]. Podobnie<br />

do choroby Alzheimera należy do grupy chorób zwyrodnieniowych układu<br />

nerwowego. Ma charakter przewlekły, a jej objawy pogłębiają się wraz<br />

z rozwojem choroby. Na ChP choruje prawie 1,5% populacji powyżej 65 roku<br />

życia. Jest więc bardzo ważnym problemem nie tylko medycznym, ale<br />

i społecznym [1]. Dotyka ona w podobnym stopniu różnych ludzi, bez względu<br />

na ich płeć, zamożność, pochodzenie społeczne i geograficzne. Klinicznie<br />

objawia się ona spowolnieniem ruchowym, sztywnością mięśni i drżeniem<br />

spoczynkowym.<br />

Udział wolnych rodników w ChP nie jest całkowicie wyjaśniony. Istota<br />

czarna ma duże tempo metabolizmu, dlatego też charakteryzuje się wysoką<br />

zawartością utleniaczy przy jednoczesnym niskim stężeniem antyoksydantów.<br />

Nawet niewielki stres oksydacyjny może z łatwością zniszczyć jej naturalną<br />

obronę powodując powstanie wolnych rodników tlenowych, które ze<br />

względu na przeważające stężenie utleniaczy utrzymują powstający stres,<br />

a także zapoczątkowują apoptozę neuronów dopaminergicznych przejawiającą<br />

się obniżoną zawartością cytochromu c w mitochondriach komórek nerwowych<br />

zaatakowanych chorobą. Zmniejsza to aktywność mitochondrialne-<br />

15


go kompleksu I. Powoduje to zmniejszenie ilości wytwarzanej energii, obniżenie<br />

ilości stężenia antyutleniaczy oraz wzrost tempa powstawania wolnych<br />

rodników i nasilenie procesów utlenienia. O tym, że w istocie czarnej w ogóle<br />

dochodzi do stresu oksydacyjnego świadczą zwiększone ilości dialdehydu<br />

malonowego będącego końcowym produktem peroksydacji lipidów, a także<br />

zmniejszenie ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych [2].<br />

Osobnym zagadnieniem są zmiany stężenia zarówno rodników jak<br />

i antyoksydantów we krwi chorego. Spowodowane są one z jednej strony<br />

zwiększonym metabolizmem, spowodowanym m.in. charakterystycznym<br />

drżeniem kończyn, przyczyniającym się do produkcji rodników. Z drugiej zaś<br />

podawane pacjentom jako leki aminy katecholowe są antyoksydantami.<br />

Zniszczenie komórek nerwowych istoty czarnej zmniejsza wydzielanie<br />

dopaminy, neuroprzekaźnika chemicznego odpowiedzialnego za transmisję<br />

sygnałów pomiędzy istotą czarną, a ciałem prążkowanym w kresomózgowiu.<br />

Sygnały przekazywane z istoty czarnej są odpowiedzialne za zależne od naszej<br />

woli ruchy, które dzięki prawidłowemu przekaźnictwu są płynne i przebiegają<br />

bez zakłóceń. Jeśli zniszczeniu ulegnie ponad 80% komórek produkujących<br />

dopaminę, zostaje utracona zdolność kontroli nad takim typem<br />

ruchów. Przyczyna zwyrodnienia komórek istoty czarnej nie jest dokładnie<br />

znana. Jedną z hipotez jest mechanizm wolnorodnikowy. Inne mówią o toksynach,<br />

czynnikach genetycznych (szczególnie mitochondrialnych) czy ekscytotoksyczności<br />

(nadprodukcji dopaminy).<br />

Dominującym, chociaż nie jedynym zaburzeniem w chorobie Parkinsona<br />

jest przedwczesne, postępujące zwyrodnienie neuronów dopaminoergicznych.<br />

Wynikiem tego jest obniżenie stężenia dopaminy i jej metabolitów,<br />

a także spadek aktywności enzymów związanych z jej syntezą. Opracowane<br />

zostały trzy główne strategie w walce z tą chorobą (i) uzupełnić niedobór dopaminy,<br />

(ii) zahamować proces jej rozkładu w mózgu oraz (iii) dostarczyć organizmowi<br />

substancje, które działają podobnie do dopaminy.<br />

Najprostszym sposobem leczenia tego schorzenia byłoby zastosowanie<br />

pierwszej z wymienionych strategii, czyli podanie dopaminy. Dopamina<br />

jednakże nie przekracza bariery krew – mózg. Z tego względu najprostszym<br />

obecnie sposobem leczenia tej choroby jest podawanie bezpośredniego jej<br />

prekursora – L-dopy (lewodopy), zdolnej przechodzić przez barierę krew –<br />

mózg.<br />

Wprawdzie wprowadzenie L-dopy było przełomem w walce z chorobą<br />

Parkinsona jednakże, niestety nie zapobiega ona obumieraniu komórek produkujących<br />

dopaminę. Z tego względu próbuje się zastosować drugą z wymienionych<br />

wcześniej strategii – zahamować procesy przemiany dopaminy<br />

w inne substancje, stosując np. inhibitor enzymu MAO-B (monoaminooksydazy<br />

B) odpowiedzialnego za rozkład dopaminy (rys. 1). Stymulację układu<br />

dopaminoergicznego można uzyskać poprzez zwiększenie produkcji endogennej<br />

dopaminy w układzie nigro-strialnym przez zablokowanie jej metabolizmu<br />

lub przez bezpośrednią stymulację receptora dopaminoergicznego [3].<br />

16


Rys. 1. Metabolizm dopaminy<br />

L-dopa po raz pierwszy została zastosowana w leczeniu choroby Parkinsona<br />

na początku lat 60. Dziś L-dopa jest uznawana jako „złoty standard”<br />

leczenia [4]. Jest najsilniejszym lekiem przeciwparkinsonowskim, jedynym,<br />

który jest skuteczny w każdym stadium zaawansowania choroby. Pod<br />

względem chemicznym jest to lewoskrętna 3,4-dihydroksy-L-fenyloalanina,<br />

bezpośredni prekursor dopaminy przechodzący przez barierę krew-mózg.<br />

Powstaje ona w ustroju z egzogennej tyrozyny (przy udziale hydroksylazy tyrozynowej)<br />

i ulega przemianie do dopaminy przy pomocy dekarboksylazy<br />

aromatycznych aminokwasów (rys. 1).<br />

Pod wpływem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) L-dopa metabolizowana<br />

jest do 3-metoksy-DOPA (3-OMD) (na rys. 1 etap ten został pominięty).<br />

Dopamina natomiast może być metabolizowana zgodnie z trzema<br />

szlakami (rys. 1). Pierwszy przebiega przez kwas dihydroksyfenylooctowy<br />

(DOPAC), katalizowany przez monoaminooksydazę (MAO), do kwasu homowanilinowego<br />

(HVA) katalizowanego przez COMT. W drugim natomiast<br />

pod wpływem COMT dopamina jest metabolizowana do 3-metoksytyraminy<br />

(3-MT), a następnie również do HVA pod wpływem MAO. Z wyjątkiem<br />

dopaminy, pozostałe metabolity L-dopy są farmakologicznie nieaktywne.<br />

Oba szlaki metabolizmu występują zarówno w narządach obwodowych,<br />

jak i w mózgu. Trzeci szlak prowadzi do powstania hormonów i dlatego nie<br />

będzie szerzej omawiany.<br />

Mimo wieloletniego już stosowania L-dopy mechanizm jej działania<br />

budzi wiele niejasności. Według klasycznej hipotezy egzogenna L-dopa<br />

podana doustnie zostaje wchłonięta w jelicie cienkim i poprzez system<br />

transportu dużych aminokwasów (LNAA) szybko trafia do innych tkanek<br />

i przekracza barierę krew – mózg, gdzie jest wychwytywana przez neurony<br />

17


dopaminoergiczne i tam poddawana działaniu dekarboksylazy aromatycznych<br />

aminokwasów i dopiero jako dopamina uwalniana do synapsy. Na obwodzie,<br />

a także w śluzówce przewodu pokarmowego L-dopa ulega także<br />

szybkiej dekarboksylacji. Dlatego też w narządach obwodowych powstają<br />

duże ilości dopaminy nieprzechodzącej do mózgu, a tylko niewielka ilość<br />

L-dopy (ok. 1-3%) przedostaje się przez barierę wykazując działanie terapeutyczne.<br />

Zależy to od wielu czynników m.in. od zawartości białka w diecie<br />

i czasu przejścia przez żołądek. Aby wyeliminować szybką zmianę L-dopa<br />

w dopaminę już w błonie śluzowej żołądka, a tym samym zwiększyć jej możliwość<br />

dotarcia do mózgu, doustne preparaty zawierają inhibitory obwodowej<br />

dekarboksylazy, karbidopę lub benserazyd. Pośrednio zwiększa to przenikanie<br />

L-dopy do mózgu i pozwala na znaczną redukcję dawki leku i jego<br />

obwodowe działanie niepożądane takie jak nudności, wymioty i spadki ciśnienia<br />

[3].<br />

Wprowadzenie L-dopy do lecznictwa spowodowało wyraźny spadek<br />

śmiertelności chorych. Dane epidemiologiczne sugerują, że chorzy z dobrze<br />

leczoną chorobą Parkinsona mają szansę żyć równie długo jak ich zdrowi<br />

rówieśnicy. Tłumaczy się ono zarówno zmniejszeniem śmiertelnych powikłań<br />

z unieruchomienia, jak i neuroprotekcyjnym działaniem L-dopy [5]. W ostatnich<br />

latach badania eksperymentalne zaczęły dostarczać jednak coraz więcej<br />

danych na to, że L-dopa może być toksyczna dla neuronów dopaminoergicznych.<br />

W skojarzeniu z wolnorodnikową hipotezą etiopatogenezy choroby<br />

Parkinsona oraz z faktem występowania ruchowych objawów niepożądanych<br />

po długotrwałym podaniu L-dopa problem jej toksycznego działania<br />

wzbudza duży niepokój. Mimo intensywnie prowadzonych badań nadal nie<br />

udało się ostatecznie ustalić ani uzyskać jednoznacznych dowodów na to,<br />

że L-dopa w dawkach terapeutycznych powoduje śmierć komórek nerwowych.<br />

U chorych słabo reagujących na leczenie farmakologiczne stosuje się<br />

leczenie chirurgiczne. Czynione są także próby wszczepienia stymulatorów,<br />

które pozwolą modelować aktywność upośledzonych struktur mózgu.<br />

FARMAKOKINETYKA AMIN KATECHOLOWYCH<br />

0,8<br />

*<br />

c [μM]<br />

0,4<br />

#<br />

0<br />

0 1 2 3 4<br />

czas [h]<br />

Rys. 2. Zmiany stężenia L-dopy w surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona przed podaniem<br />

leku, po godzinie, dwóch, trzech i pięciu po podaniu preparatu.* p


Dopamina, której niedobór w części zbitej istoty czarnej jest czynnikiem<br />

wyzwalającym objawy choroby Parkinsona, należy do amin katecholowych.<br />

Ponieważ jednak nie przedostaje się przez barierę krew-mózg, dlatego<br />

też wprowadzona do krążenia obwodowego nie daje efektu<br />

terapeutycznego. Uzyskuje się go jednak poprzez podanie bezpośredniego<br />

prekursora dopaminy – L-dopy, która należy także do amin katecholowych.<br />

Przedostający się do mózgu tylko niewielki procent (1-3%) jest często niewystarczającą<br />

dawką do uzyskania efektów terapeutycznych. Z kolei zwiększenie<br />

podawanej dawki powoduje szereg niepożądanych objawów. Okazało<br />

się, że równoczesne podawanie L-dopy z inhibitorami dekarboksylazy<br />

aromatycznych aminokwasów, zwiększa jej biodostępność poprzez zmniejszenie<br />

jej obwodowego metabolizmu. L-dopę, jak i inne aminy katecholowe,<br />

można w surowicy oznaczać stosując HPLC z detekcją amperometryczną.<br />

Maksymalne stężenie L-dopy w surowicy występuje po ok. godzinie od chwili<br />

zażycia leku (rys. 2 [6]) [6-8]. Po 90 min. stężenie L-dopy w surowicy jest<br />

śladowe. W leczeniu niezwykle istotna jest więc optymalizacja dawki. Zarówno<br />

zbyt niskie jak i zbyt wysokie stężenia leku skazują pacjenta na niepowodzenie<br />

w trakcie terapii. Niskie stężenia mogą być następstwem zaburzeń<br />

wchłaniania L-dopy z przewodu pokarmowego, wysokie natomiast<br />

mogą osiągać wartości dawki toksycznej. Przeprowadzone badania potwierdzają,<br />

że maksymalne L-dopy stężenie występuje po około godziny od zażycia<br />

preparatu. Zmiany stężenia L-dopy po godzinie, dwóch, trzech i pięciu<br />

w stosunku do godziny zerowej są statystycznie znamienne. Zmiany stężenia<br />

L-dopy powinny mieć odzwierciedlenie w zmniejszeniu drżenia, głównego<br />

objawu parkinsonizmu, a także na poprawę parametrów fizjologicznych<br />

określanych za pomocą testu Webstera. Maksymalne stężenie karbidopy<br />

(rys. 3 [6]) występuje także po godzinie od podania preparatu, po czym<br />

zmniejsza się, ale po trzeciej godzinie ponownie wzrasta. Pomimo podobnej<br />

dynamiki współczynnik korelacji pomiędzy karbidopą, a grupą nierozdzielonych<br />

reduktorów jest bardzo niski.<br />

9<br />

8<br />

c [μM] 7<br />

6<br />

5<br />

0 1 2 3 5<br />

t [h]<br />

Rys. 3. Farmakodynamika karbidopy. Zmiany stężenia karbidopy w surowicy pacjentów z chorobą<br />

Parkinsona. Pozostałe warunki jak na rys. 2. * p


WŁASNOŚCI ANTYOKSYDACYJNE AMIN KATECHOLOWYCH<br />

W literaturze można znaleźć sprzeczne informacje na temat dopaminy.<br />

Z jednej strony dopamina przyczynia się do stresu oksydacyjnego,<br />

z drugiej zaś ma właściwości antyoksydacyjne. Zarówno enzymatyczne utlenianie<br />

dopaminy przy udziale MAO B jak i jej samoutlenianie prowadzą do<br />

powstania nadtlenku wodoru, będącego źródłem najbardziej reaktywnego<br />

wolnego rodnika – hydroksylowego. Tak więc, metabolizm dopaminy prowadzi<br />

do powstania uszkodzeń w komórkach nerwowych oraz ich śmierci<br />

w procesie apoptozy. System dopaminowy broni się przed skutkami deficytu<br />

neuromediatora zwiększając jego metabolizm. Przeprowadzone pośmiertnie<br />

badania w mózgach parkinsoników wykazały specyficzne, wielokrotne nasilenie<br />

metabolizmu w strukturach układu pozapiramidowego. Zwiększony metabolizm<br />

dopaminy, powoduje zwiększoną produkcję nadtlenku wodoru<br />

i rodnika hydoksylowego. Zwiększone uwalnianie, wychwyt i presynaptyczny<br />

metabolizm dopaminy może przyczyniać się do postępującej destrukcji neuronów<br />

obserwowanej w chorobie Parkinsona. Powstający nadmiar rodników<br />

jest przyczyną wzmożonej peroksydacji lipidów, co w konsekwencji prowadzi<br />

do indukcji procesu apoptozy. Podobną rolę pełnią produkty metabolizmu<br />

dopaminy (np.: 6-hydroksydopamina).<br />

Rys. 4. Anty- i prooksydacyjne właściwości dopaminy w stosunku do rodników hydroksylowych<br />

Istnieje kilka mechanizmów, które z jednej strony nadają dopaminie<br />

właściwości prooksydacyjne: zdolność redukcji żelaza (III) do żelaza (II)<br />

i samoutlenianie dopaminy do pochodnej chinonowej. Z drugiej zaś strony<br />

dopamina wykazuje właściwości antyoksydacyjne dzięki obecności grupy<br />

20


katecholowej oraz kompleksowaniu żelaza (II), uniemożliwiającemu zajście<br />

reakcji Fentona.<br />

Stosując chromatograficzną metodę oznaczania całkowitego potencjału<br />

antyoksydacyjnego (CPA) przebadano własności dopaminy w stosunku<br />

do rodników hydroksylowych [6]. Rodniki hydroksylowe, które generowano<br />

w reakcji analogicznej do Fentona, pułapkowano kwasem p-hydroksybenzoesowym.<br />

Gdy do układu, zawierającego dopaminę, dodawano ADP<br />

(rys. 4B), który katalizuje reakcję redukując żelazo z +3 stopnia utlenienia na<br />

+2 pik kwasu 3,4-DHBA (którego wysokość świadczyła o właściwościach<br />

prooksydacyjnych dopaminy) był niższy w stosunku do kontroli (rys. 4A), która<br />

zawierała wodę zamiast dopaminy. Wynik ten był spowodowany tym, że<br />

gdy w układzie reakcyjnym znajdowała się, dopamina wygenerowane rodniki<br />

hydroksylowe reagowały zarówno z pHBA jak i dopaminą. Otrzymane wyniki<br />

sugerują, że dopamina jest słabym zmiataczem rodników hydroksylowych.<br />

Brak ADP w układzie powodował, że pik chromatograficzny pochodzący od<br />

3,4-DHBA był znacznie niższy niż w obecności ADP (rys. 4C). Oznacza to,<br />

że reduktor w mieszaninie jest niezbędny, aby stale zapewniona była obecność<br />

żelaza (II). W końcu, gdy do układu zawierającego dopaminę nie dodano<br />

ADP wielkość piku 3,4-DHBA była większa niż w układzie bez ADP<br />

i bez dopaminy (rys. 4D). Oznacza to, że dopamina przejęła rolę reduktora<br />

Fe 3+ do Fe 2+ . Doświadczenie to potwierdziło sugestie, że w zależności od<br />

warunków dopamina może z antyoksydanta stać się oksydantem (rys. 5).<br />

Ponadto metoda ta pozwoliła ustalić jeden z prawdopodobnie kilku istniejących<br />

mechanizmów prooksydacyjnego działania dopaminy.<br />

40<br />

30<br />

((–) ADP<br />

(+) ADP<br />

h [nA] 20<br />

10<br />

0<br />

0 50 100 150 200<br />

C [μM]<br />

Rys. 5. Wpływ stężenia dopaminy na<br />

zmiany wysokości pików chromatograficznych<br />

3,4-DHBA. Zmniejszenie wysokości<br />

oznacza antyoksydacyjne działanie<br />

badanego związku<br />

21


Autooksydacja amin katecholowych może zachodzić nie tylko pod<br />

wpływem enzymów czy jonów metali, ale także pod wpływem tlenu w powietrzu.<br />

Okazało się, że z amin katecholowych obecnych w lekach antyparkinsonowskich<br />

najszybciej samoutlenianiu ulegał benserazyd, najwolniej zaś<br />

L-dopa (rys. 6). Oznacza to, że za zmianę barwy rozpuszczonego w wodzie<br />

leku odpowiada samoutlenianie benserazydu (inhibitora), zaś spadek stężenia<br />

substancji czynnej w postaci L-dopy jest nieznaczny.<br />

Rys. 6. Zmiany stężenia amin katecholowych w zależności od czasu ich przechowywania<br />

w temp. 25ºC<br />

HIPERMETABOLIZM W CHOROBIE PARKINSONA, TREMOR<br />

I JEGO POMIAR<br />

Drżenia są najbardziej istotnym elementem symptomatologii i diagnostyki<br />

wielu chorób układu pozapiramidowego (w tym również parkinsonizmu<br />

i choroby Parkinsona). Wykorzystywane są zarówno w rozpoznawaniu wielu<br />

chorób, dla których drżenie jest objawem typowym, jak i w diagnostyce różnicowej,<br />

w której badane są charakterystyki różnych rodzajów drgań. Warunkiem<br />

szerszego ich wykorzystania jest udoskonalenie metod pomiaru odpowiednich<br />

charakterystyk, powiązanie wyników ich pomiaru z konkretnymi<br />

jednostkami chorobowymi, na podstawie uzyskanych rozkładów prawdopodobieństwa,<br />

a następnie przypisanie im odpowiednich procedur terapeutycznych.<br />

Ze względu na coraz częstsze występowania schorzeń układu pozapiramidowego<br />

wydaje się to bardzo istotne. Oryginalne urządzenie tego<br />

22


typu skonstruowano w Instytucie Elektroniki WAT we współpracy z Kliniką<br />

Neurologii CSK WAM. Pozwala ono na podniesienie efektywności diagnozy<br />

schorzenia, przyspieszenie rozpoznania, a więc i wcześniejsze rozpoczęcie<br />

leczenia. Podnosi to standard życia jednostek i zmniejsza całościowe koszty<br />

leczenia populacji.<br />

Przy nadmiernych wydatkach energetycznych w organizmie następuje<br />

szereg zmian metabolicznych, wśród nich niedostateczna podaż glukozy<br />

w mięśniach i konieczność glukoneogenezy. Zjawiska te prowadzą do utleniania<br />

aminokwasów i nasilenia zużycia tlenu [9]. Objawy wyniszczenia i wychudzenia<br />

ciała – typowe dla parkinsoników, są bezpośrednimi dowodami<br />

długotrwałego występowania u chorych hipermetabolizmu prowadzącego do<br />

ujemnego bilansu energetycznego. Wartość energetyczna spożywanej diety<br />

nie pokrywa wówczas w pełni wydatków energetycznych, w wyniku, czego<br />

początkowo spalany jest tłuszcz zapasowy, a następnie białka mięśniowe.<br />

Zwiększony wydatek energetyczny powoduje również uszkodzenie układu<br />

dopaminoergicznego w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) powodujące<br />

uogólnione zaburzenia metabolizmu energetycznego ustroju. Parkinsonicy<br />

często wykazują hypertermię i znaczną potliwość. Przyczyną tego może być<br />

zablokowanie ośrodkowych receptorów dopaminoergicznych, a konsekwencją<br />

dodatkowy wydatek energetyczny [10]. Drżenie (tremor) może mieć charakter<br />

fizjologiczny, stanowiąc przejaw działania układu pozapiramidowego,<br />

który jest najlepiej wykształconym układem generowania ruchów mimowolnych<br />

w okresie noworodkowym i niemowlęcym, a także odruchów bardziej<br />

złożonych. Mogą być także przejawem patologicznym i być skutkiem nieprawidłowych<br />

impulsów z jądra czerwiennego i wzgórzomózgowia, jak<br />

w chorobie Parkinsona [11-13].<br />

Drżenia możemy charakteryzować za pomocą rozmaitych parametrów:<br />

lokalizacji, regularności występowania, stopnia nasilenia, wpływu<br />

czynników wewnętrznych, wpływu czynników środowiskowych, częstotliwości,<br />

amplitudy, energii całkowitej czy widma. Ostatnie cztery parametry są<br />

mierzalne w sposób obiektywny. Ich wartości są powiązane z wymienionymi<br />

wcześniej czynnikami. Lokalizacja drżenia ma oczywisty wpływ na amplitudę.<br />

Części ciała odleglejsze od jego osi mają większą amplitudę niż części<br />

ciała bliskie osi. Z kolei podparcie (a więc, fizycznie rzecz biorąc, przesunięcie<br />

osi ruchu w kierunku obwodowym) zmniejsza amplitudę drżenia, o ile nie<br />

wiąże się z powstaniem dodatkowych napięć spowodowanych wymuszonym<br />

(czyli nie fizjologicznym) ułożeniem. Regularność i częstość występowania<br />

wiążą się z amplitudą i energią drżenia. Włókno mięśniowe po wykonaniu<br />

ok. 80 drgań traci większość lub nawet całość ATP i wskutek tego nie może<br />

przez pewien czas wykonywać ruchów. Tak więc regularność i duża częstotliwość<br />

drżeń powoduje, przynajmniej okresowo, spadek amplitudy i energii<br />

sygnału. Nasilenie drżenia jest niespecyficznym wskaźnikiem obejmującym<br />

takie jego składowe jak lokalizacja, regularność, częstotliwość i charakterystyka<br />

widmowa. Jego stosowanie jest związane z brakiem możliwości dokładnego<br />

pomiary pewnych charakterystyk obiektywnych; wydaje się, że<br />

średnia energia na ustaloną jednostkę czasu (być może wraz z charaktery-<br />

23


styką amplitudową) byłaby rzetelnym i wystarczającym miernikiem tego<br />

wskaźnika. Czynniki wewnętrzne i zewnętrzne mogą w rozmaity sposób<br />

wpływać na mierzalne parametry drżenia. Mogą je także wywoływać (drżenie<br />

spowodowane chłodem, tzw. dreszcze) lub znosić (ustępowanie u alkoholika<br />

drżenia po wypisu alkoholu). Mogą także modyfikować jego charakterystyki.<br />

Z kolei oczywisty jest wpływ czynników wewnętrznych na<br />

występowanie i intensywność drżeń. Łączny wpływ tych czynników na obraz<br />

drżeń jest złożony i niejednoznaczny. W zakresie mierzalnych charakterystyk<br />

drżenia najczęściej stosowaną jest częstotliwość. W zależności od niej<br />

dzielimy je na następujące pasma:<br />

- 1,5 – 3 Hz: pasmo drżeń ataktycznych, dotyczących głównie<br />

głowy i tułowia, spotykanych w chorobach demielizacyjnych;<br />

- 4 – 5 Hz: pasmo najbardziej nieokreślone, drżenia postawne<br />

o częstotliwości 4 Hz występują w przypadkach uszkodzenia<br />

móżdżku lub jądra czerwiennego, w przypadku drżenia spoczynkowego<br />

jest identyfikowane jako symptom choroby Parkinsona<br />

(drżenie postawne i spoczynkowe różni się amplitudą);<br />

- 6 Hz: pasmo drżeń głównie kończyn; a także drżeń zamiarowych<br />

i klonicznych (np. klonus typowy dla uszkodzeń drogi pozapiramidowej<br />

ma częstotliwość 6 Hz);<br />

- 8 – 12 Hz: pasmo drżeń o rozmaitej etiologii, tak fizjologicznej<br />

jak i patologicznej, np. z powodu udarów mózgu, zwyrodnienia<br />

oraz neuropatii obwodowych.<br />

Inną mierzalną charakterystyką drżenia jest amplituda. Jej pomiar, ze<br />

względu na jej niewielką wartość, zazwyczaj wymaga specjalnej aparatury<br />

pomiarowej i wobec tego nie jest ona dokładnie opisana w funkcji rodzaju<br />

schorzenia. Wykazuje się wyraźną zmiennością w zależności od pory dnia,<br />

wpływu stosowanych leków, pozycji ciała badanego, a także rozmaitych<br />

czynników wewnętrznych i zewnętrznych, w związku z czym jej opisowe<br />

określenie jest trudne.<br />

Drżenia samoistne (ET) są uważane za łagodną, skąpo-objawową<br />

chorobę układu nerwowego. Charakteryzują się częstotliwością 6 – 11 Hz<br />

i amplitudą 25 – 600 μV. Najczęściej spotykanym wyrazem tej choroby jest<br />

drżenie głosu. Mogą także występować równolegle inne objawy, jak drżenie<br />

rąk czy głowy, sporadycznie także innych części ciała. W zakresie drżeń patologicznych<br />

dzieli się je przede wszystkim w zależności od funkcji piramidowego<br />

układu ruchowego, odpowiedzialnego za ruchy dowolne. Funkcje te<br />

to spoczynek, pozycja wyjściowa do ruchu zamierzonego oraz ruch zamierzony<br />

(dowolny) odpowiednio do tego wyróżnia się (i) drżenie spoczynkowe,<br />

(ii) drżenie pozycyjne i (iii) drżenie zamiarowe. Drżenie spoczynkowe stało<br />

się podstawą definicji przez Jamesa Parkinsona choroby, nazywanej dzisiaj<br />

jego nazwiskiem. Polega na występowaniu w pozycji spoczynku drżeń,<br />

ustępujących po rozpoczęciu ruchów czynnych. Drżenia te występują wyłączne<br />

w trakcie czuwania i pojawiają się po przebudzeniu przy próbie wykonania<br />

pierwszych ruchów dowolnych. Ich amplituda zależy od stopnia zaawansowania<br />

choroby, a także od czynników zewnętrznych i wewnętrznych<br />

24


takich jak zmęczenie czy stres. Drżenie pozycyjne jest wywoływane ustawieniem<br />

kończyn, powodującym napinanie się pewnych grup mięśniowych.<br />

Może mieć charakter fizjologiczny, zwłaszcza u ludzi starszych lub w przypadku<br />

niewygodnej pozycji – głównie kończyn – występować jako tzw. drżenie<br />

pozycyjne fizjologiczne (u sportowców bywa obiektem odrębnych badań).<br />

Jest także typowe dla choroby Parkinsona i innych chorób<br />

zwyrodnieniowych. Występuje jednak również w przypadku zaburzeń o zupełnie<br />

odmiennej etiologii, jak alkoholowe zaburzenie pracy wątroby czy<br />

nadczynność tarczycy. Drżenie zamiarowe jest związane z wykonywaniem<br />

ruchów dowolnych. Odznacza się niską częstotliwością (3 – 5 Hz) oraz narastającą<br />

w czasie amplitudą. Jest wyraźniejsze w bliskości osi ciała. Oprócz<br />

choroby Parkinsona może wskazywać na wrodzone procesy zwyrodnieniowe,<br />

zatrucia metaboliczne, zaburzenia funkcji wątroby i nerek, stwardnienie<br />

rozsiane.<br />

Rys. 7. Sfygmograf Petersena oraz tambur Eschnera<br />

Ze względu na obiektywny, tj. mierzalny, charakter drżeń próby ich<br />

pomiaru miały miejsce już w XIX wieku [15]. Mimo niezbyt wyszukanej techniki<br />

prace takich uczonych jak Charcot i Vulpian we Francji czy Petersen,<br />

Dana i Eschner w Stanach Zjednoczonych pozwoliły na realizację pierwszych<br />

badań mierzalnych charakterystyk drżeń. Aparatami, stosowanymi<br />

pierwotnie w innych badaniach, a następnie do celu pomiarów drżeń były<br />

sfygmograf oraz tambur (rys. 7). Pierwszy z nich działał na zasadzie mechanicznej,<br />

drugi – pneumatycznej. Rozwój techniki spowodował, że obecnie<br />

zostały one zastąpione przez nowocześniejsze systemy elektroniczne,<br />

w pełni skomputeryzowane.<br />

Równolegle z pomiarami drżenia przeprowadza się także badania fizjologiczne<br />

chorych za pomocą testu Webstera. Składa się on z oceny<br />

10 parametrów fizjologicznych, np. trudności z poruszaniem się czy z mówieniem.<br />

Stosuje się przy tym czterostopniową całkowitoliczbową skalę porządkową,<br />

od 0 (brak objawów negatywnych) do 3 (bardzo duże ich nasilenie).<br />

Wynik testu jest sumą tych dziesięciu ocen. Ponieważ drżenie<br />

powiązane jest z wynikiem testu Webstera (im większe drżenia tym gorsze<br />

25


samopoczucie badanego, a więc wyższy wynik testu), dlatego też test ten<br />

wykonuje się kilka minut po pomiarze drżenia [16].<br />

Poprawa stanu pacjentów powinna się zatem wyrażać zarówno w poprawie<br />

parametrów fizjologicznych mierzonych testem Webstera jak<br />

i zmniejszoną mocą drżenia. W trakcie badań, prowadzonych w ramach wieloośrodkowego<br />

zespołu badawczego podjęliśmy próbę powiązania wymienionych<br />

wyżej płaszczyzn. Wykonywano równocześnie ilościowe badania<br />

stanu fizycznego pacjenta: klinicznie oceny drżenia, parametrów chemicznych:<br />

stężenie L-dopy w surowicy i pomiaru CPA oraz parametrów fizjologicznych<br />

(trudności w wykonywaniu podstawowych czynności, objawy patologiczne<br />

funkcjonowania organizmu itp.). Pomiary w zakresie wymienionych<br />

wskaźników były wykonywane równolegle (rys. 8). Pozwoliło to określić korelacje<br />

miedzy nimi. Wyniki eksperymentalnych badań dowodzą, że występuje<br />

efekt przesunięcia w czasie maksymalnego zmniejszenia mocy drżenia<br />

w odniesieniu do czasu uzyskania maksymalnego stężenia L-dopy w surowicy.<br />

Przesunięcie to wynika z faktu metabolizmu (absorbcji w układzie trawiennym,<br />

przekraczanie bariery krew- mózg i jej konwersji do dopaminy)<br />

L-dopy i upływu czasu, po którym L-dopa wywiera swój terapeutyczny efekt<br />

(rys. 2). W przypadku korelacji między testem Webstera, mocą drżenia<br />

i CPA badania wykazały, że podobnie jak w przypadku L-dopy występuje<br />

efekt przesunięcia między osiąganym maksymalnym CPA a poprawą parametrów<br />

fizjologicznych i mocą drżenia. Przesunięcie to spowodowane jest<br />

także metabolizmem L-dopy. Uzyskanie efektu terapeutycznego w postaci<br />

uzupełnienia deficytu dopaminy, poprawy samopoczucia pacjentów i zmniejszenie<br />

mocy drżenia jest wynikiem działania farmakologicznego L-dopy<br />

i wymaga upływu czasu. Nie stwierdzono natomiast korelacji pomiędzy CPA,<br />

a pozostałymi parametrami. Brak korelacji wynika z braku zależności pomiędzy<br />

zmianami CPA, a stężeniem L-dopy w surowicy.<br />

c L-dopy [μM]<br />

0,6<br />

0,5<br />

0,4<br />

0,3<br />

0,2<br />

0,1<br />

0<br />

0 1 2 3 4 5<br />

czas od podania L-dopy [h]<br />

0,0004<br />

0,0003<br />

0,0002<br />

0,0001<br />

0<br />

moc drżenia [W]<br />

Rys. 8. Dynamika zmian stężenia L-dopy i mocy drżenia u pacjentów z chorobą Parkinsona<br />

26


CPA SUROWICY KRWI PACJENTÓW Z CHOROBĄ PARKINSONA<br />

Całkowity Potencjał Antyoksydacyjny (CPA) jest miarą zdolności antyoksydacyjnych<br />

próbek biologicznych, w szczególności krwi. W literaturze<br />

[17] można znaleźć opisy oznaczania rodników hydroksylowych metodą pułapki<br />

spinowej polegającej na wprowadzeniu do materiału biologicznego<br />

względnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczania produktów<br />

ich reakcji z rodnikiem. Wygenerowane, w reakcji Fentona, rodniki hydroksylowe<br />

reagują zarówno ze związkami obecnymi we krwi jak i detektorem. Wysokość<br />

piku chromatograficznego produktu reakcji detektora z rodnikiem zależy<br />

od ilości antyoksydantów obecnych w badanym materiale i ich<br />

reaktywności. Miarą CPA jest zmniejszenie się wysokości tego piku pod<br />

wpływem próbki. W przypadku surowicy krwi parkinsoników obserwowano<br />

efekt odwrotny, wzrost wysokości tego piku (rys. 9). Uzyskane wyniki sugerują,<br />

że surowica posiada właściwości prooksydacyjne w stosunku do rodników<br />

hydroksylowych, czyli generuje rodniki. Największym CPP (Całkowity<br />

Potencjał Prooksydacyjny) cechowała się surowica pobrana od pacjentów<br />

po godzinie od podania L-dopy czyli w czasie gdy stężenie L-dopy w surowicy<br />

u pacjentów było największe (rys. 2). Prawdopodobnie istnieje kilka mechanizmów<br />

w wyniku których powstaje zwiększona ilość wolnych rodników.<br />

W surowicy występuje szereg niskocząsteczkowych antyoksydantów (np.<br />

kwas askorbinowy), które z jednej strony zmiatają wolne rodniki, z drugiej<br />

zaś mogą redukować żelazo z +3 na +2 stopień utlenienia, dzięki czemu zapewniony<br />

jest stały dopływ żelaza(II) (reakcja Fentona) i wzrost stężenia<br />

rodników. Powstałe w reakcji Fentona Fe(III) jest utleniaczem, mogącym<br />

zwiększać CPP. Podobnie zachowują się obecne w surowicy aminy katecholowe.<br />

Utlenianie ich prowadzi do powstania semichinonów, rodników<br />

peroksylowych i anionorodnika ponadtlenkowego.<br />

-0,1<br />

czas [h]<br />

0 1 2 3 5<br />

CPA[min]<br />

-0,3<br />

-0,5<br />

-0,7<br />

*<br />

Rys. 9. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodników<br />

hydroksylowych. Wykres przedstawia wartości średnie z pięciu pomiarów w trzech powtórzeniach<br />

± błąd standardowy (SEM), * p


W warunkach fizjologicznych żelazo i miedź występujące w surowicy<br />

związane są z białkami takimi jak celuroplazmina czy transferryna. W wyniku<br />

przebiegu procesów patologicznych jony tych metali zostają oddzielone od<br />

białek [17] i tym samym w wyniku reakcji Fentona i Habera – Weissa generować<br />

rodniki hydroksylowe. Istnieją sugestie, że stężnie rodników hydroksylowych<br />

w surowicy pacjentów z chorobą Parkinsona jest znacznie wyższy<br />

niż u zdrowych ludzi. Prooksydacyjne właściwości surowicy pacjentów z choroba<br />

Parkinsona mogą mieć także inne podłoże. Sugeruje się [18], że obniżone<br />

stężenia ubichinonu, α-tokoferolu, askorbinianu i glutationu przyczynia<br />

się do pogłębienia istniejącego już stresu oksydacyjnego u chorych w wyniku<br />

zaburzeń równowagi pro- i antyoksydacyjnej. Dodatkowo sam metabolizm<br />

L-dopy przez enzym MAO-B prowadzi także do zwiększonej generacji<br />

reaktywnych form tlenu. Zwiększoną jej autooksydację w surowicy zaobserwowano<br />

u pacjentów u których stosowano monoterapię L-dopą, w stosunku<br />

do zdrowych ludzi i pacjentów u których L-dopa nie była zastosowana.<br />

Prawdopodobnie zwiększone stężenie L-dopy w surowicy było przyczyną<br />

wzmożonej jej autooksydacji, podczas której generowane są wolne rodniki.<br />

Prooksydacyjne właściwości mogą wynikać także z obecności w surowicy<br />

niezidentyfikowanych jeszcze prooksydantów generujących w pośredni sposób<br />

rodniki hydroksylowe [18-20]. Rolę nadmienionego, niezidentyfikowanego<br />

oksydanta może pełnić żelazo lub miedź.<br />

CPA[μMTroloks]<br />

400<br />

300<br />

200<br />

100<br />

* *<br />

#<br />

0<br />

1 2 3 4 5<br />

czas [h]<br />

Rys. 10. CPA surowicy parkinsoników, leczonych substytucyjnie L-dopą, w stosunku do rodników<br />

peroksylowych. .* p


mo wyższych stężeń w surowicy enzymów antyoksydacyjnych (SOD, katalaza)<br />

zaobserwowano wzrost stężenia produktów reakcji wolnorodnikowych,<br />

MDA/TBARS, i spadek wartości CPA. Potwierdza to hipotezę, że u pacjentów<br />

z chorobami neurodegeneracyjnymi deficyt enzymów zmiatających wolne<br />

rodniki w mózgu jest kompensowany zwiększonymi ich stężeniami w surowicy.<br />

Oznacza to, że u chorych system antyoksydacyjny nie działa tak<br />

sprawnie jak u zdrowych ludzi, a zwiększone stężenia enzymów w surowicy<br />

są jednym z etapów obrony organizmu przed powstającym stresem oksydacyjnym<br />

w mózgu. W wyniku wzmożonego stresu oksydacyjnego u chorych<br />

po pewnym czasie powstają mechanizmy adaptacyjne przeciwdziałające<br />

nadmiernemu powstawaniu rodników.<br />

Reasumując, CPA, odniesione do rodników peroksylowych (wyznaczony<br />

tradycyjną metodą fotometryczną), pacjentów z chorobą Parkinsona<br />

jest mniejszy niż u osób zdrowych. Z drugiej strony wyznaczony chromatograficznie<br />

CPA odniesiony do rodników hydroksylowych jest większy od grupy<br />

kontrolnej (podobny efekt zaobserwowano w stosunku do tlenku azotu).<br />

Oznacza to, że pomiary chromatograficzne dostarczają dodatkowych, istotnych<br />

informacji, pozwalających lepiej zrozumieć stres oksydacyjny, tym bardziej,<br />

że odnoszą się one do najbardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego.<br />

CPA odniesione do rodników peroksylowych zmieniało się (rys. 10)<br />

wprost proporcjonalnie do zmian karbidopy w surowicy (rys. 3). CPA odniesione<br />

do rodników hydroksylowych zmieniało się (rys. 9) odwrotnie proporcjonalnie<br />

do zmian L-dopy w surowicy (rys. 2).<br />

L-dopa<br />

karbidopa<br />

karbidowa<br />

białka<br />

antyoksydanty<br />

ty<br />

całkowity CPA<br />

CPA<br />

czas[h]<br />

400<br />

350<br />

300<br />

250<br />

200<br />

150<br />

100<br />

50<br />

0<br />

Rys. 11. CPA surowicy, obrazujące wpływ poszczególnych składników<br />

Pomiary chromatograficzne przydatne były również w interpretacji<br />

zmian wyznaczanego fotometrycznie CPA odniesionego do rodników peroksylowych<br />

(rys. 11). Pozwoliły one na wyznaczenie stężeń leków we krwi pacjentów.<br />

Po przemnożeniu tych stężeń przez odpowiadające im CPA można<br />

29


yło wyznaczyć udział składników surowicy w jej CPA (rys. 11). Okazało się,<br />

że maksymalne stężenie L-dopy w surowicy było zbyt niskie, aby mogło<br />

znacząco wpływać na zmiany CPA. Prawdopodobnie L-dopa wykazuje tylko<br />

efekt farmakologiczny, natomiast wpływ jej na zmiany CPA jest nieznaczny.<br />

Największy udział w CPA mają antyoksydanty niskocząsteczkowe (w tym<br />

kwas moczowy). CPA chorych był niższy od ludzi zdrowych głównie z powodu<br />

niższego CPA białek (rys. 12). Zmiany CPA skorelowane są ze zmianami<br />

stężeń L-dopy i tremoru (rys. 13).<br />

CPA [μ MTroloks]<br />

600<br />

400<br />

200<br />

0<br />

CPA całkowity<br />

antyoksydanty<br />

białka<br />

chorzy<br />

zdrowi<br />

CPA<br />

Rys. 12. Porównanie udziału antyoksydantów i białek w całkowitym CPA, odniesionym do rodników<br />

peroksylowych, u ludzi zdrowych i parkinsoników leczonych substytucyjnie L-dopą, przed<br />

podaniem leku<br />

pacjenci<br />

380<br />

15<br />

CPA [μM<br />

[ MTroloks]<br />

]<br />

moc drżenia [μM]<br />

moc drżenia [ W]<br />

350<br />

320<br />

290<br />

260<br />

14<br />

13<br />

12<br />

Nw<br />

230<br />

0 1 2 3 4 5<br />

czas od podania L-dopy [h]<br />

11<br />

Rys. 13. Dynamika zmian CPA (•), wartości punktów w skali Webstera (•), mocy drżenia (▲)<br />

30


LITERATURA<br />

1. C. Courderot-masuyer, F. Dallozo, V. Maupoil, L. Rochette, Fundam.<br />

Clin. Pharmacol., 13(1999)535.<br />

2. F. Visioli, C. Galli, Anal. Biochem., 249(1997)244.<br />

3. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warszawa), 47(2002)399.<br />

4. D.R. Dufield, G.S. Wilson, R.S. Glass, C. Schoneich, J. Pharm. Sci.,<br />

93(2004)1122.<br />

5. T.W. Yu, C.N. Ong, Anal. Biochem., 275(1999)217.<br />

6. B.K. Głód, K. Stańczyk, Acta Chromatogr., 15(2005)276.<br />

7. T. Yakabe, H. Yoshida, H. Nohta, M. Yamaguchi, Anal. Sci.,<br />

18(2002)1375.<br />

8. K. Stańczyk, praca mag., SGGW 2004.<br />

9. G. Bartosz, M. Bartosz, Acta Biochim. Pol., 46(1999)23.<br />

10. I.N. Popov, G. Lewin, Free Radic. Biol. Med., 17(1991)267.<br />

11. B.A. Collingham, M.A. Barrand, J. Pharm. Pharmacol., 28(1976)356.<br />

12. U.S von Euler, Pharmacol. Rev., 6(1954)15.<br />

13. G.R. Kelman Applied Cardivascular Physiology, Butterworths, London<br />

1971.<br />

14. M. Jouvet, Science, 163(1969)32.<br />

15. A.M. Krustulovic, The current state of the art. in the analysis of catecholamines,<br />

Chemistry Deparment Manhattanville College Purchase, New<br />

York 1999.<br />

16. Y. Kondo, M. Ohnishi, M. Kawaguchi, J. Agr. Ford. Chem., 47(1999)1781.<br />

17. M.A. Raggi, V. Pucci, C. Sabbioni, S. Furlanetto, G. Gerra, J. Sep. Sci.,<br />

24(2001)275.<br />

18. B.K. Głód, P.R. Haddad, Czapski G.A., Trends Anal. Chem., 19(2000)492-<br />

-497.<br />

19. P. Kumarathasan, R. Vincent, J. Chromatogr. A, 987(2003)349.<br />

20. P.T. Kissinger, C.S. Bruntlett, R.E. Shoup, Life Sci., 28(1981)455.<br />

21. H. Wang, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.<br />

31


32


Monika ASZTEMBORSKA<br />

Instytut Chemii Fizycznej PAN<br />

ul. Kasprzaka 44/52, 01-224 Warszawa<br />

ZASTOSOWANIE METOD SEPARACYJNYCH<br />

W BADANIU ENANCJOMERYZACJI<br />

WPROWADZENIE<br />

Związki chiralne są w naturze bardzo powszechne. Najbardziej istotne<br />

dla życia biopolimery tj. białka i DNA są zbudowane z chiralnych aminokwasów<br />

i cukrów.<br />

Wiele innych substancji należących do grupy flawonoidów, alkaloidów,<br />

terpenoidów i steroidów jest związkami optycznie czynnymi. Co ciekawsze<br />

większość z tych naturalnych substancji jest biosyntezowana tylko w postaci<br />

jednej z dwu możliwych form. O takich związkach mówi się, że są homochiralne.<br />

Homochiralne są peptydy i DNA zbudowane z L-aminokwasów<br />

i D-cukrów. Flawanony syntezowane w świecie roślinnym są lewoskrętne.<br />

Taki wysoki stopień homochiralności w żywych organizmach jest entropowo<br />

niekorzystny. Proces racemizacji homochiralnej substancji prowadzi<br />

do wzrostu entropii systemu. Tak więc wraz ze śmiercią organizmu homochiralne<br />

substancje powinny racemizować powodując wzrost nieuporządkowania<br />

systemu.<br />

W zależności od struktury chiralnej biomolekuły proces racemizacji<br />

może być bardzo szybki jak w przypadku atropiny [1] lub wystarczająco powolny<br />

jak w przypadku kwasu aspartamowego [2] aby być użytecznym<br />

w wyznaczaniu wieku organizmów. Czasami jest też tak, że cząsteczka zostaje<br />

rozłożona lub zdegradowana zanim ulegnie racemizacji.<br />

Innym istotnym problemem związanym ze związkami chiralnymi jest<br />

fakt, że dwa enancjomery chiralnej substancji chociaż tak podobne pod<br />

względem budowy chemicznej mogą mieć drastycznie różną aktywność biologiczną.<br />

Nie jest to szczególnie dziwne gdy uświadomimy sobie, że organizmy<br />

żywe zbudowane z chiralnych białek i cukrów stanowią chiralne środowisko<br />

rozróżniające dwa enancjomery tej samej substancji. Szczególnie istotne jest<br />

to w przypadku leków. Znanych jest wiele chiralnych substancji farmakologicznych<br />

z których tylko jeden z enancjomerów ma właściwości lecznicze,<br />

drugi w najlepszym przypadku może być nieaktywny a w najgorszym może się<br />

okazać toksyczny. Np. atropina jest komercyjnie dostępna jako mieszanina<br />

racemiczna (DL-hioscyamina) jednakże tylko L-hioscyamina ma aktywność<br />

farmakologiczną. D-hioscyamina jest nieefektywna i powstaje jako produkt racemizacji<br />

podczas ekstrakcji L-hioscyaminy z surowców roślinnych.<br />

Znajomość stabilności konfiguracyjnej substancji staje się więc koniecznością<br />

gdy chodzi o rejestrację chiralnych leków. Instytucje rządowe<br />

33


dopuszczające leki jak np. FDA nie tylko kontrolują sprzedaż leków racemicznych<br />

ale wymagają jednoznacznych danych na temat konfiguracyjnej<br />

stabilności czystych enancjomerów. W konsekwencji producenci leków są<br />

zobowiązani do oszacowania stereochemicznej trwałości enancjomerów<br />

i zbadania ich potencjalnej podatności na konwersję.<br />

Z drugiej strony znajomość szybkości reakcji enancjomeryzacji substancji<br />

występujących naturalnie może być wykorzystana praktycznie do sprawdzania<br />

jakości, stopnia świeżości i zafałszowań produktów spożywczych.<br />

Stopień racemizacji aminokwasów w białkach zębów (głównie jest to<br />

kwas aspartamowy) jest np. wykorzystywany do oznaczenia wieku denata<br />

w naukach sądowych [3, 4]. Jest on również wykorzystywany w oznaczaniu<br />

wieku próbek archeologicznych i geochemicznych [5, 6]. Ma również zastosowanie<br />

w paleotermometrii [7].<br />

Znajomość barier racemizacji substancji chiralnych może więc być<br />

istotna z punktu widzenia zastosowań praktycznych.<br />

DEFINICJE<br />

Przez enancjomeryzację rozumiemy mikroskopowy proces odwracalnej<br />

interkonwersji enancjomerów.<br />

R<br />

k enant<br />

k enant<br />

Racemizacja to z kolei makroskopowy proces nieodwracalnej transformacji<br />

enancjomerycznie wzbogaconej lub czystej próbki do mieszaniny racemicznej.<br />

S<br />

R<br />

k rac<br />

rac<br />

k rac<br />

S<br />

Przy czym stała szybkości racemizacji jest dwukrotnie większa od stałej<br />

szybkości enancjomeryzacji (k enant =2k rac ). Można to wytłumaczyć w ten sposób,<br />

że na każdą cząsteczkę (-) utworzoną z cząsteczki (+) dwie molekuły<br />

ulegają racemizacji, jako, że utworzona w ten sposób cząsteczka (-) równoważy<br />

skręcalność optyczną innej nie przekształconej cząsteczki (+).<br />

Diastereomeryzacja to z kolei molekularny proces transformacji jednego diastereomeru<br />

w drugi, przy czym stałe szybkości diastereomeryzacji nie są<br />

sobie równe (k diastAB ≠k diastBA )<br />

Diast A<br />

k diastAB<br />

k diastBA<br />

Diast B<br />

Do badania kinetyki enancjomeryzacji i diastereomeryzacji substancji<br />

można stosować wiele różnych metod m.in. polarymetria, dichroizm kołowy<br />

34


(CD), dyspersja zdolności skręcającej (ORD), protonowy rezonans magnetyczny<br />

1 H-NMR [8].<br />

Wśród tych metod istotne miejsce zajmują metody chromatograficzne<br />

(wysokosprawna chromatografia cieczowa, chromatografia gazowa) oraz metody<br />

elektroforezy kapilarnej, które ogólnie można nazwać analitycznymi metodami<br />

separacyjnymi. Ze względu na pewne uproszczenia czasami obie<br />

techniki będą określane jako techniki chromatograficzne, chociaż metoda<br />

elektroforezy kapilarnej zasadniczo zalicza się do technik elektromigracyjnych.<br />

Metody separacyjne służące do badania barier enancjomeryzcji można<br />

w zasadzie podzielić na dynamiczne metody separacyjne [9-13] i metody<br />

separacyjne z zatrzymanym przepływem (stopped-flow) [14-16].<br />

Wykorzystanie metod separacyjnych do wyznaczania barier enancjomeryzacji<br />

labilnych enancjomerów zapoczątkowano w latach 80-tych ubiegłego<br />

wieku wraz z rozwojem enancjoselektywnych metod separacyjnych.<br />

Oba rodzaje metod zostały opisane w pracach przeglądowych [17, 18].<br />

Przy pomocy DHPLC można mierzyć bariery enancjomeryzacji w granicach<br />

65-105 kJ/mol, DGC 70-130 kJ/mol, natomiast przy pomocy<br />

SFMDGC 70-180 kJ/mol a SFMDCE 100-130 kJ/mol.<br />

DYNAMICZNE METODY SEPARACYJNE<br />

Chromatografia dynamiczna jest definiowana jako metoda służąca do<br />

badania procesów odwracalnej interkonwersji zachodzących w czasie chromatografowania.<br />

Została ona wykorzystana do wyznaczania barier enancjomeryzacji.<br />

W chromatografii enancjoselektywnej szybka interkonwersja enancjomerów<br />

powoduje tworzenie się plateau pomiędzy rozdzielonymi pikami.<br />

Przy dostatecznie szybkiej reakcji obserwuje się nakładanie się pików.<br />

20.0 20.5 21.0 21.5 22.0 22.5 23.0 23.5 24.0 24.5 25.0 25.5 26.0 26.5 27.0 27.5 28.0 28.5 29.0<br />

Minutes<br />

Rys. 1. Przykładowy chromatogram z widocznym plateau tworzącym się pomiędzy rozdzielanymi<br />

enancjomerami<br />

35


W przypadku przeprowadzania analizy enancjoselektywnej zjawiska<br />

te są niepożądane i stanowią komplikacje, które likwiduje się poprzez dodatek<br />

modyfikatora organicznego bądź zmianę chiralnej fazy stacjonarnej.<br />

W dynamicznej chromatografii natomiast charakterystyczny profil piku nie<br />

tylko stanowi źródło diagnostyczne zachodzącego w kolumnie procesu interkonwersji<br />

enancjomerów ale jest warunkiem do ilościowego wyznaczenia<br />

bariery enancjomeryzacji.<br />

Stałe szybkości oraz bariery enancjomeryzacji wyznacza się poprzez<br />

porównanie symulowanych komputerowo profilów elucji z uzyskanymi eksperymentalnie<br />

chromatogramami [19, 20].<br />

Rys. 2. Schemat równowag zachodzących w kolumnie w czasie procesu chromatograficznego<br />

Odwracalna pseudo-pierwszorzędowa reakcja enancjomeryzacji na<br />

kolumnie przebiega z różnymi stałymi szybkości k s w fazie stacjonarnej i k m<br />

w fazie ruchomej. Dla enancjomerów stałe szybkości reakcji enancjomeryzacji<br />

w achiralnej fazie ruchomej są jednakowe dla obu enancjomerów.<br />

W chiralnej fazie stacjonarnej sytuacja się zmienia stałe szybkości enancjomeryzacji<br />

są różne dla obu enancjomerów z uwagi na tworzenie się diasteromerycznych<br />

kompleksów pomiędzy rozdzielanymi enancjomerami i chiralnym<br />

selektorem. Nie obserwujemy jednak w rezultacie enancjomerycznego<br />

wzbogacenia próbki gdyż enancjomer który reaguje wolniej przebywa dłużej<br />

w fazie stacjonarnej.<br />

K S i K R są współczynnikami podziału enancjomerów R i S pomiędzy<br />

fazę ruchomą i stacjonarną.<br />

Z danych chromatograficznych możemy wyliczyć pozorne stałe szybkości<br />

enancjomeryzacji, które są średnimi ważonymi stałych szybkości w fazie<br />

stacjonarnej i ruchomej. Stałe szybkości w fazie ruchomej można wyznaczyć<br />

niezależnie za pomocą innych metod.<br />

Dynamiczna chromatografia gazowa [21-23], dynamiczna chromatografia<br />

cieczowa [24-27], dynamiczna elektroforeza kapilarna oraz micelarna<br />

elektrokinetyczna chromatografia cieczowa [28, 29] jak również dynamiczna<br />

chromatografia w stanie nadkrytycznym [30] zostały wykorzystane do wyznaczania<br />

barier enancjomeryzacji wielu stereolabilnych związków.<br />

36


METODY SEPARACYJNE Z ZATRZYMANYM PRZEPŁYWEM<br />

W metodach chromatograficznych z zatrzymanym przepływem racemiczna<br />

mieszanina jest wstępnie rozdzielana na kolumnie z fazą chiralną<br />

w temperaturze, w której nie obserwuje się procesu enancjomeryzacji.<br />

W momencie gdy wiadomo, że enancjomery zostały rozdzielone zostaje zatrzymany<br />

przepływ fazy ruchomej i kolumna jest ogrzewana w określonej<br />

temperaturze przez określony czas. Następuje wtedy enancjomeryzacja<br />

rozdzielonych pików w środowisku chiralnym. Następnie schładza się kolumnę<br />

do temperatury analizy, przywraca się przepływ fazy ruchomej i kontynuuje<br />

się analizę. Na uzyskanym chromatogramie oprócz rozdzielonych<br />

enancjomerów pojawiają się dodatkowe piki pochodzące z ulegających<br />

enancjomeryzacji rozdzielonych związków.<br />

35<br />

30<br />

25<br />

R<br />

S<br />

[mV]<br />

20<br />

15<br />

10<br />

5<br />

S<br />

R<br />

0<br />

0 10 20 30 40 50<br />

[min]<br />

Rys. 3. Przykładowy chromatogram rozdzielania enancjomerów otrzymany za pomocą chromatografii<br />

z zatrzymanym przepływem<br />

W metodach chromatografii wielowymiarowej z zatrzymanym przepływem,<br />

racemiczna mieszanina jest wstępnie rozdzielana na chiralnej fazie<br />

stacjonarnej, następnie jeden z enancjomerów jest kierowany do achiralnej<br />

kolumny reakcyjnej gdzie podczas podgrzewania następuje enancjomeryzacja<br />

w achiralnym środowisku. Potem zenancjomeryzowana próbka jest kierowana<br />

na drugą chiralną kolumnę w celu rozdzielana jej na enancjomery.<br />

Zaletą tej metody jest to, że enancjomeryzacja zachodzi w warunkach achiralnego<br />

otoczenia a nie w środowisku chiralnym.<br />

37


pompa<br />

HPLC<br />

kolumna chiralna<br />

kolumna<br />

reakcyjna<br />

detektor<br />

80.00<br />

60.00<br />

[mV]<br />

40.00<br />

pompa<br />

HPLC<br />

20.00<br />

0.00<br />

kolumna<br />

reakcyjna<br />

[mV]<br />

10<br />

8<br />

6<br />

4<br />

2<br />

0<br />

-2<br />

0.00 5.00 10.00 15.00<br />

[m in]<br />

kolumna chiralna<br />

0 5 10 15 20 25<br />

[m in ]<br />

detektor<br />

Rys. 4. Schemat wielowymiarowej chromatografii cieczowej z zatrzymanym przepływem<br />

Parametry kinetyczne reakcji enancjomeryzacji i diastereomeryzacji<br />

niestabilnych stereoizomerów zostały również wyznaczone za pomocą metod<br />

separacyjnych z zatrzymanym przepływem, m. in. chromatografii cieczowej<br />

z zatrzymanym przepływem [31] oraz dwuwymiarowej chromatografii<br />

gazowej z zatrzymanym przepływem [32].<br />

PODSUMOWANIE<br />

Podsumowując można powiedzieć, że obydwie metody znajdują zastosowanie<br />

do wyznaczania barier enancjomeryzacji. Pierwsza z nich to<br />

znaczy chromatografia dynamiczna wymaga bardziej skomplikowanych obróbki<br />

matematycznej i symulacji komputerowej za to nie wymaga dodatkowego<br />

sprzętu chromatograficznego. W przypadku metody z zatrzymanym<br />

przepływem wymagana jest bardziej skomplikowana aparatura za to same<br />

obliczenia są proste.<br />

Obie metody posiadają wiele zalet:<br />

• nie wymagają substancji optycznie czystych lub wzbogaconych, racemat<br />

wystarcza do badań,<br />

• wymagana jest bardzo mała ilość próbki ok. 10 -8 g,<br />

• zanieczyszczenia są na ogół oddzielone od próbki na kolumnie<br />

w związku z tym nie przeszkadzają,<br />

• w przypadku GC mogą być badane próbki gazowe lub też bardzo<br />

lotne,<br />

38


• pomiary mogą być prowadzone w szerokim zakresie dobrze kontrolowanej<br />

temperatury,<br />

• metody są szybkie, proste a wyniki są powtarzalne.<br />

Jednak metody chromatograficzne nie składają się z samych zalet.<br />

Podstawową wadą tych metod jest to, że konieczne jest do ich zastosowania<br />

uzyskanie bardzo dobrego rozdzielenia enancjomerów co oczywiście w wielu<br />

przypadkach jest sprawą trudną. Tam gdzie rozdzielenie enancjomerów<br />

jest wystarczające do określenia czystości optycznej niekoniecznie jest wystarczające<br />

do wyznaczenia bariery enancjomeryzacji.<br />

LITERATURA<br />

1. A. Huhtikangas, T. Lehtola, R. Virtanen, P. Peura, Finn. Chem. Lett.,<br />

5(1982)63.<br />

2. S. Ritz, H. Schütz, J. Forensic Sci., 38(1993)633.<br />

3. S. Ohtani, K. Yamamoto, J. Forensic Sci., 36(1991)792.<br />

4. E. Waite, M. Collins, S. Ritz-Time, H. Schutz, C. Cattaneo, H. Borrman,<br />

Forensic Sci. Int., 103(1999)113.<br />

5. G. Goodfriend, M. Kashgarian, M. Harasevych, Cosmochim. Acta,<br />

59(1995)1125.<br />

6. M. Collins, E. Waite, A. van Duin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B,<br />

354(1999)51.<br />

7. G. Miller, J. Magee, A. Jull, Nature, 385(1997)241.<br />

8. M. Reist, B. Testa, P.-A. Carrupt, Enantiomer, 2(1997)147.<br />

9. J. Veciana, M. Crespo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 30(1991)74.<br />

10. F. Gasparrini, D. Misiti, M. Pierini, C. Villani, Tetrahedron Assym.,<br />

8(1997)2069.<br />

11. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Org. Chem., 64(1999)1483.<br />

12. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Anal. Chem., 72(2000)2758.<br />

13. F. Gasparrini, M. Pierini, C. Villani, J. Org. Chem., 68(2003)3173.<br />

14. K. Rossen, J. Sager, Y. Sun, Chem. Commun., 1(1998)115.<br />

15. S. Reich, O. Trapp, V. Schurig, J. Chromatogr. A, 892(2000)487.<br />

16. O. Trapp, G. Schoetz, V. Schurig, J. Pharm. Biomed. Anal.,<br />

27(2002)497.<br />

17. J. Krupcik, P. Oswald, P. Majek, P. Sandra, D.W. Armstrong, J. Chromatogr.<br />

A, 1000(2003)779.<br />

18. Ch. Wolf, Chem. Soc. Rev., 34(2005)595.<br />

19. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.<br />

20. O. Trapp, V. Schurig, Chirality, 14(2002)465.<br />

21. W. Bürkle, H. Karfunkel, V. Schurig, J. Chromatogr., 288(1984)1.<br />

22. M. Jung, V. Schurig, J. Am. Chem. Soc., 114(1992)529.<br />

23. D. Hochmuth, W. König, Tetrahedron Asymmetry, 10(1999)1089.<br />

24. T. Nishikawa, Y. Hayashi, S. Suzuki, H, Kubo, H. Ohtani, J. Chromatogr.<br />

A, 767(1997)93.<br />

39


25. K. Lorenz, E. Yashima, Y. Okamoto, Angew. Chem. Int. Ed.,<br />

37(1998)1922.<br />

26. J. Oxelbark, S. Allenmark, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 2(1999)1587.<br />

27. J. Oxelbark, S. Claeson, S. Allenmark, Enantiomer, 5(2000)413.<br />

28. D. Wistuba, O Trapp, N. Gel-Moreto, R. Galensa, V. Schurig, Anal.<br />

Chem., 78(2006)3424.<br />

29. G. Schoetz, O. Trapp, V. Schurig, Enantiomer, 5(2000)391.<br />

30. Ch. Wolf, W. Pirkle, Ch. Welch, D. Hochmuth, W.A. König, G.-L. Chee,<br />

J. Charlton, J. Org. Chem., 62(1997)5208.<br />

31. M. Asztemborska, J. Żukowski, J. Chromatogr. A, 1134(2006)95.<br />

32. Ph. Marriott, K. Aryusuk, R. Shellie, D. Ryan, K. Krisnangkura, V. Schurig,<br />

O. Trapp, J. Chromatogr. A, 1033(2004)135.<br />

40


Bronisław K. GŁÓD 1 , Paweł PISZCZ 1 , Iwona KIERSZTYN 1 ,<br />

Anna LAMERT 1 , Paweł ZARZYCKI 2<br />

1)<br />

Zakład Chemii Analitycznej, Instytut Chemii, Akademia Podlaska<br />

ul. 3 Maja 54, 08-110 Siedlce<br />

e-mail: bkg@onet.eu; URL: http://dach.ich.ap.siedlce.pl<br />

2)<br />

Zakład Toksykologii i Bioanalityki, Wydział Budownictwa i Inżynierii Środowiska,<br />

Politechnika Koszalińska, ul. Śniadeckich 2, 75-453 Koszalin<br />

ZASTOSOWANIE HPLC DO OZNACZANIA<br />

WOLNYCH RODNIKÓW, ANTYOKSYDANTÓW<br />

ORAZ CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU<br />

ANTYOKSYDACYJNEGO<br />

W pracy przedstawiono podstawowe informacje o wolnych rodnikach, ich wytwarzanie,<br />

oddziaływanie z podstawowymi składnikami organizmów żywych, udział w wielu<br />

stanach chorobowych, a także starzeniu organizmu. Ponadto omówiono metody<br />

oznaczania wolnych rodników, antyoksydantów oraz całkowitego potencjału antyoksydacyjnego<br />

za pomocą HPLC.<br />

INFORMACJE PODSTAWOWE<br />

Tlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. Odpowiada<br />

za mniej więcej jedną czwartą jej masy. W dolnych warstwach atmosfery<br />

objętościowa zawartość tlenu wynosi 21%. Pierwotna atmosfera ziemska<br />

była mieszaniną gazów o właściwościach redukujących. Wolny tlen<br />

w postaci cząsteczkowej pojawił się w niej wraz z rozwojem pierwszych organizmów<br />

fotosyntezujących, ok. 2 miliardów lat temu. Rozpuszczając się<br />

w wodzie był on niezbędnym czynnikiem powstania i rozwoju organizmów<br />

wyższych. Znacznie wyższa niż w wodzie jest jego rozpuszczalność w rozpuszczalnikach<br />

organicznych, co wpływa na lokalizację rodników tlenowych<br />

w hydrofobowych częściach błon biologicznych. W organizmach aerobowych<br />

znaczna część pobieranego tlenu wykorzystywana jest jako akceptor<br />

elektronów. Takie enzymy jak dioksygenaza tryptofanowa i oksydaza ksantynowa<br />

katalizują reakcje utleniania polegające na przenoszeniu pojedynczych<br />

elektronów z substratów na cząsteczkę tlenu. W trakcie redukcji tlenu<br />

wytwarzane są tzw. reaktywne formy tlenu (ang. ROS - reactive oxygen species).<br />

Jest to pojecie szersze, gdyż oprócz wolnych rodników zalicza się do<br />

nich m.in. wzbudzony tlen singletowy i nadtlenek wodoru. Wolne rodniki zaś<br />

są to atomy, cząsteczki (lub ich fragmenty) bądź też jony posiadające niesparowane<br />

elektrony, nadające im własności paramagnetyczne.<br />

41


Tlen, chociaż jest konieczny do życia, paradoksalnie ma on jednocześnie<br />

działanie toksyczne dla organizmów żywych [1, 2]. Przykładowo, oddychanie<br />

czystym tlenem przez dłużej niż 48 godzin prowadzi do śmierci.<br />

Olbrzymia jego większość wykorzystywana jest jako akceptor elektronów<br />

w komórkowych procesach energetycznych. Tym niemniej, w trakcie redukcji,<br />

niewielka część tlenu przekształcana jest w reaktywne formy tlenu, do<br />

których zalicza się również rodniki tlenowe. Ocenia się, że do ROS przekształcane<br />

jest 1÷4% tlenu zużywanego przez organizm człowieka [3]. Przy<br />

dziennym jego zużyciu wynoszącym ok. 10 l oznacza to wytworzenie ok.<br />

4,5÷18 mmoli rodników. Jest to ilość znaczna, zwłaszcza, jeśli uwzględni się<br />

fakt, że wiele uszkodzeń wolnorodnikowych ma tendencję do gromadzenia<br />

się w organizmach żywych. W żywym organizmie wolne rodniki są wytwarzane<br />

w warunkach zarówno fizjologicznych jak i patologicznych. W warunkach<br />

fizjologicznych nie gromadzą się w tkankach gdyż są stale unieczynniane,<br />

„zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.<br />

W patologicznych mogą prowadzić do degeneracji i obumierania komórek [1].<br />

Kolejnym paradoksem tlenowym jest fakt, że chociaż obecnie powszechnie<br />

wiadomo, że tlen w nadmiarze jest szkodliwy to jednakże nie ma<br />

spójnej teorii tłumaczącej, który z rodników jest za tę toksyczność odpowiedzialny<br />

[2]. Wspomniany, paradoks tlenowy na tym się nie kończy. Okazało<br />

się, że niektóre wolne rodniki pełnią istotne funkcje fizjologiczne, np. inhibitorów<br />

niektórych enzymów [4]. Do tego można dodać dalsze paradoksy. Niejasny<br />

jest wpływ rodników na przebieg niektórych zmian patologicznych, jak<br />

miażdżycy [5] czy choroby Alzheimera [6]. Często występują nawet kłopoty<br />

z odpowiedzią na pytanie czy rodniki są przyczyną czy skutkiem owych<br />

zmian. Jeszcze większe problemy sprawia odpowiedź na pytanie czy podawanie<br />

antyoksydantów zapobiega tym zmianom [7, 8]. Wynika z tego, że<br />

choć jest to tematyka bardzo szeroko ostatnio dyskutowana to jej podstawowe<br />

problemy są wciąż nierozwiązane.<br />

WYTWARZANIE RODNIKÓW<br />

Występowanie reaktywnych form tlenu jest charakterystyczne nie tylko<br />

dla organizmów żywych. W warstwach przypowierzchniowych naturalnych<br />

zbiorników wodnych ich stężenie jest znacznie większe niż we wnętrzu organizmów<br />

żywych, gdzie mogą się przedostawać. Najprostszym zaś rodnikiem<br />

(dokładnie – birodnikiem w stanie trypletowym) jest tlen atmosferyczny<br />

którym oddychamy.<br />

Wolne rodniki mogą być indukowane in vitro i in vivo przez różne<br />

czynniki: promieniowanie jonizujące, ultrafioletowe, widzialne i podczerwone<br />

oraz wszelkie reakcje utleniania i redukcji. Do reakcji tych zaliczyć można<br />

autooksydację tioli, katecholamin, flawin i hydrochinonów oraz niektóre reakcje<br />

enzymatyczne, np. oksydazy ksantynowej, dysmutazy ponadtlenkowej<br />

stymulującej mitochondrialny system transportu elektronów, oksydazy cytochromowej<br />

P-450 i b-5 systemu mikrosomalnego.<br />

42


Rys. 1. Schemat transportu elektronów, tworzenia ATP oraz utlenianie zredukowanego<br />

koenzymu Q wraz z towarzyszącą mu redukcją cytochromu b<br />

Rodniki mogą również generować pobudzone komórki fagocytujące<br />

(makrofagi, monocyty i granulocyty) podczas tzw. wybuchu oddechowego.<br />

W tym przypadku odgrywają one pozytywną rolę. Jednakże długotrwałe ich<br />

wytwarzanie (np. w przewlekłych stanach zapalnych) ma działanie kancerogenne.<br />

W błonach komórkowych tworzą się one głównie w wyniku metabolizmu<br />

kwasu arachidonowego przy udziale cyklooksygenazy i lipooksygenazy.<br />

Z czynników zewnętrznych wymienić można przykładowo fenacytynę czy też<br />

parakwat oraz cały szereg leków (haloperidol, salsolinol, cytostatyki itp.).<br />

Najważniejszym generatorem wolnych rodników wydaje się być mitochondrialny<br />

łańcuch oddechowy (rys. 1). Należy sobie również zdać sprawę z tego,<br />

że w komórkach żywych zwierząt i roślin wolne rodniki są stale obecne<br />

jako konieczny etap przejściowy przebiegu szeregu reakcji.<br />

TLEN I PRODUKTY JEGO REDUKCJI<br />

Cząsteczki o spinach połówkowych opisuje statystyka Fermiego-Diraca.<br />

Zgodnie z funkcją rozkładu prawdopodobieństwo występowania elektronu<br />

(fermionu) wzrasta ze spadkiem energii nie przekraczając 1. To znaczy, że<br />

w danym stanie energetycznym określonym energią, pędem oraz spinem może<br />

znajdować się tylko jeden elektron. Rozkład elektronów w cząsteczce tlenu<br />

i produktach jego redukcji przedstawiono na rys. 2. W stanie podstawowym<br />

tlen występuje jako dwurodnik trypletowy, co tłumaczy jego względnie dużą<br />

reaktywność ale jednocześnie stosunkowo małą, jak na rodnik.<br />

43


σ2<br />

∗<br />

p<br />

π * 2p<br />

π 2p<br />

σ 2p<br />

singletowy O2<br />

1<br />

Δ g O<br />

2<br />

singletowy O2<br />

1 +<br />

ΣgO<br />

2<br />

anionorodnik<br />

.-<br />

ponadtlenkowy O 2<br />

jon<br />

nadtlenkowy O 2<br />

2-<br />

tlen atomowy<br />

σ2<br />

∗<br />

s<br />

σ 2s<br />

σ1<br />

∗<br />

s<br />

σ 1s<br />

stan podstawowy<br />

3<br />

O ΣgO (tryplet)<br />

2 2<br />

ΔgΟ Σg<br />

Ο<br />

1 1 +<br />

2 2<br />

92 kJ 155 kJ<br />

3 e .−<br />

g<br />

_ e _ e _<br />

e _<br />

2 2 2 2 2<br />

Σ Ο Ο Η Ο ΟΗ Η Ο<br />

H +<br />

ΗΟ<br />

.<br />

2<br />

Rys. 2. Rozkład elektronów na orbitalach tlenu i produktach jego redukcji.<br />

- orbital molekularny, * - orbitale antywiążące, ↑↓ - spiny elektronowe<br />

W stanie wzbudzonym tlen występuje w postaci singletu. Jego stężenie<br />

w cytoplazmie jest na poziomie 10 -15 M, podczas gdy tlenu trypletowego<br />

10 -5 M. Wyróżniamy dwa stany singletowe - delta i sigma. Czas życia tlenu<br />

w stanie 1 Σg + O 2 (antyrównoległe spiny na różnych orbitalach) w roztworach<br />

wodnych wynosi 10 -11 s, zaś tlenu delta 1 ΔgO 2 – 10 -6 s. W gazach czasy te<br />

wynoszą odpowiednio 12 s i 45 min.<br />

Pierwszym produktem redukcji tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy<br />

(O 2 •- ) i jego zprotonowana forma – rodnik nadhydroksylowy (HO 2<br />

•<br />

). W roku<br />

1954 Gershman, Gilbert i Fridovich wysunęli hipotezę, że za toksyczność<br />

tlenu odpowiedzialny jest właśnie anionorodnik ponadtlenkowy. Niestety,<br />

okazało się, że jest on wprawdzie bardzo reaktywny ale jednocześnie krótko-żyjący<br />

oraz mało reaktywny w środowisku aprotycznym i w stosunku do<br />

aminokwasów i kwasów tłuszczowych. Rodnik nadhydroksylowy jest znacznie<br />

silniejszym utleniaczem niż anionorodnik ponadtlenkowy. Sugeruje się<br />

nawet [9], że za szkodliwe działanie tlenu i uszkadzanie błon komórkowych<br />

odpowiedzialny jest układ rodników O 2·- /HO 2·, a nie rodnik hydroksylowy.<br />

HO 2· charakteryzuje się długim czasem życia przez co może dyfundować on<br />

do sąsiednich struktur komórkowych. Przy pH fizjologicznym 7,4 ok. 1%<br />

anionorodnika występuje w postaci zhydratowanej (pK a = 4,88). W wyniku<br />

przebiegu reakcji dysmutacji oba te rodniki wytwarzają nadtlenek wodoru.<br />

W obecności jonów metali grup przejściowych (żelaza i miedzi) nadtlenek<br />

wodoru ulega rozpadowi z wytworzeniem reaktywnego rodnika hydroksylowego,<br />

zgodnie z reakcją opisaną po raz pierwszy w roku 1884 przez<br />

Fentona:<br />

+<br />

2 + n<br />

3+<br />

(n+<br />

1) +<br />

- •<br />

(1) Fe (M ) + H O = Fe (M ) + OH + OH<br />

.<br />

2<br />

2<br />

Utleniony metal może zostać następnie zredukowany, co oznacza, że pełni<br />

on rolę katalizatora:<br />

44


•−<br />

3+<br />

2+<br />

(2) Fe + O2<br />

= Fe + O2<br />

.<br />

W sumie obie reakcje przedstawia się jako reakcję Habera-Weissa (1934 r.):<br />

(3)<br />

O<br />

•-<br />

- •<br />

2<br />

+ H<br />

2O2<br />

= O2<br />

+ OH + OH .<br />

Bez katalizatora (jonów metali) reakcja (3) przebiega bardzo wolno. Znacznie<br />

przyśpiesza ją niewielka nawet obecność żelaza na plus drugim stopniu<br />

utlenienia. Żelazo trójwartościowe również może ją katalizować gdyż jest<br />

ono łatwo redukowalne w organizmie, np. w obecności kwasu askorbinowego,<br />

cysteiny lub glutationu. Przyśpieszają ją również niektóre kompleksy<br />

(EDTA, cytrynian). Kompleksy te mogą przyśpieszać jego utlenianie gdyż<br />

eliminują konieczność zmiany jego powłoki hydratacyjnej. W świetle powyższego<br />

problematyczne jest podawanie żelaza w postaci kompleksu z askorbinianem<br />

i EDTA, stosowane przez niektóre firmy farmaceutyczne.<br />

Powstały w reakcjach (1 - 3) rodnik hydroksylowy jest wyjątkowo reaktywny.<br />

Wchodzi on w reakcje z wieloma związkami organicznymi (addycja,<br />

substytucja wolnorodnikowa, przenoszenie elektronów). Rodnik ten jest bardzo<br />

słabym kwasem, uwalniając alkaliczny jon nadtlenkowy O - . Jego stała<br />

dysocjacji porównywalna jest ze stałą nadtlenku wodoru i wynosi 11,85. Nie<br />

penetruje on jednak komórki. Reaguje tylko z cząsteczkami obecnymi<br />

w bezpośrednim ich sąsiedztwie, np. z jonem węglanowym tworząc rodnik<br />

węglanowy będący silnym reduktorem.<br />

Bardzo intensywnie badanym ostatnio rodnikiem jest tlenek azotu.<br />

Jest to związek wyjątkowo ciekawy gdyż, z jednej strony, jest on poszukiwanym<br />

od dawna śródbłonkowym czynnikiem rozluźniającym (ang. EDRF - endothelial<br />

derived relaxing factor), neurotransmiterem i zmiataczem wolnych<br />

rodników (przez to związkiem antykancerogennym). Z drugiej strony, będąc<br />

sam wolnym rodnikiem, jest on również neurotoksyczny, kancerogenny<br />

i może wytwarzać inne wolne rodniki.<br />

Tlenek azotu jest zmiataczem anionorodnika ponadtlenkowego,<br />

a w szczególności skutecznym (silniejszym niż witamina E) przeciw utleniaczem<br />

lipidów. Co ciekawe, po przejściu do nadtlenoazotynu z przeciwutleniacza<br />

staje się on silnym utleniaczem. Nadtlenoazotyn utlenia grupy tiolowe<br />

reszt tryptofanowych i metionylowych w białkach (powoduje to ich fragmentacje),<br />

indukuje powstawanie grup karbonylowych, nitruje reszty tyrozylowe,<br />

utlenia kwasy nukleinowe i lipidy. Te oddziaływania z biologicznie czynnymi<br />

związkami mają aspekt pozytywny, mianowicie – antykancerogenny, chociaż<br />

mechanizm jego działania jest nieznany. Związany jest on m.in. z blokadą<br />

reduktazy rybonukleinowej, co uniemożliwia wytwarzanie DNA i podział komórek<br />

nowotworowych. Z drugiej strony nitrozuje on aminy drugorzędowe<br />

do toksycznych, rakotwórczych N-nitrozoamin. Tlenek azotu oddziaływuje<br />

również z centrami Fe-S różnych białek tworząc klastery nitrozylowe. Jest on<br />

inhibitorem enzymów mitochondrialnych, akonitazy i kompleksu I (NADPH -<br />

oksydorektuza ubichinowa).<br />

45


Rozpuszczalność tlenku azotu w wodzie wynosi 1,8⋅10 -3 M, a stężenie<br />

w komórce jest rzędu 3⋅10 -6 M, okres półtrwania w wodzie od 4 min do<br />

3 godzin, we krwi 0,1 sek., a w tkankach 3 - 30 sek. W komórce wytwarzany<br />

jest podczas utleniania (w obecności NADPH jako donora elektronów) przez<br />

syntazę tlenku azotu (NOS), zależną od cytochromu P-450, argininy do cytruliny<br />

i NO. Jest on następnie szybko degradowany z powodu reakcji z tlenem,<br />

dwutlenkiem azotu i anionorodnikiem ponadtlenkowym. Zmiatając<br />

anionorodnik wytwarza anion peroksyazotawy, będący silnym utleniaczem<br />

i rozpadającym się na dwa rodniki, hydroksylowy i dwutlenek azotu. Wytwarzają<br />

one z małą szybkością azotany i azotyny.<br />

Cytotoksyczność tlenku azotu wywołują anion peroksyazotawy i powstający<br />

z jego rozpadu rodnik hydroksylowy. Oddziaływają one m.in. z lipidami,<br />

DNA i wpływają na mitochondrialne kanały wapniowe (oddziaływanie<br />

na kompleksy żelaza w błonie mitochondrialnej). Uszkodzenia DNA aktywują<br />

poli(ADP-rybozo)polimerazę, PARP. Enzym ten odpowiedzialny jest za<br />

energetyczną śmierć komórki poprzez zużywanie ATP podczas naprawy<br />

uszkodzonego DNA. Jego nadprodukcja jest przyczyną śmierci neuronów<br />

podczas zawałów naczyniowych, w chorobie Huntingtona i Alzheimera.<br />

NO jest też neurotransmiterem w obwodowym układzie nerwowym<br />

(sercowo-naczyniowym, płciowo-moczowym, oddechowym i trawiennym).<br />

Przykładowo, kontroluje on rozkurcz mięśni jelit podczas ruchów perystaltycznych<br />

i rozkurcz mięśni ciał jamistych ułatwiających napływ krwi do prącia<br />

podczas erekcji oraz rozkurcz mięśni naczyń krwionośnych. To ostatnie powoduje<br />

spadek ciśnienia krwi. Dlatego chorym na serce podawana jest nitrogliceryna,<br />

metabolizowana w organizmie do NO. eNOS z komórek śródbłonka<br />

aktywowany jest przez kompleks Ca 2+ -kalmodulina, tworzący się po wniknięciu<br />

jonów wapnia do wnętrza komórki. Otwarcie kanałów jonowych następuje<br />

po związaniu przez receptory powierzchniowe np. acetylocholiny. NO dyfunduje<br />

do wnętrza naczynia krwionośnego i jako czynnik EDRF do komórek<br />

mięśni gładkich. Uaktywnia cyklazę guanylową, cGMP, fosforylację protein<br />

transportujących jony wapnia (spadek ich stężenia) przez kinazę białkową, co<br />

prowadzi do rozkurczu. Podobny efekt dają S-nitrozole, [Fe(CN) 5 (NO)] 2- ,<br />

[Fe 4 S 4 (NO) 7 ] - , organiczne azotyny i azotany, np. nitrogliceryna.<br />

WPŁYW WOLNYCH RODNIKÓW NA PODSTAWOWE SKŁADNIKI<br />

KOMÓREK<br />

Wolne rodniki reagują w zasadzie ze wszystkimi składnikami komórek.<br />

Największe uszkodzenia powodują w lipidach, białkach i DNA. Z organelli<br />

komórkowych najbardziej narażone na atak wolnych rodników są mitochondria.<br />

Ich uszkodzenie prowadzić może nawet do śmierci komórek.<br />

Należy w tym miejscu zaznaczyć, że mimo ich negatywnego wpływu<br />

na organizmy żywe, wolne rodniki są koniecznymi etapami przejściowymi<br />

przebiegu szeregu reakcji biochemicznych, jak też mają szereg działań pozytywnych.<br />

Przykładowo wspomnieć tu można o tym, że szereg enzymów<br />

46


eperujących DNA (polimerazy) aktywowanych jest wolnymi rodnikami, często<br />

indukowanych światłem. Rodniki umożliwiają również spełnianie funkcji<br />

biologicznych cyklazie guanylynowej (receptor NO aktywujący cGMP, PKG<br />

i fosforylujący NOS), oksydazie glukozy, S-transferazie glutationu. Wolne<br />

rodniki są również stosowane w terapii nowotworów – tlenek azotu oraz wytwarzane<br />

przez promieniowanie rodniki hydroksylowe. Duże ilości wolnych<br />

rodników wytwarzają również pobudzone komórki fagocytujące (granulocyty,<br />

monocyty i makrofagi) w trakcie tzw. – wybuchu oddechowego.<br />

Wyjątkowo aktywnym organem, zużywającym ponad 20% dostarczanego<br />

organizmowi tlenu, jest mózg. Jest on również szczególnie narażony<br />

na uszkodzenia wolnorodnikowe gdyż w dużym stężeniu występują w nim<br />

wielonienasycone kwasy (PUFA) i żelazo, a w małym - antyutleniacze. Ma<br />

on ponadto małe możliwości wiązania metali i nie posiada możliwości regeneracji<br />

neuronów. Ich nadmierne stężenie wpływa na starzenie się mózgu,<br />

jest przejawem choroby Alzheimer’a i syndromu Downa.<br />

Wolne rodniki odgrywają też ważną rolę w wielu teoriach procesu starzenia.<br />

Sam proces starzenia nie jest obecnie dokładnie poznany. Prawdopodobnie<br />

starzenie się związane jest w jakiś sposób ze zmianami genetycznymi.<br />

Nawet nieśmiertelne organizmy musiały umierać z przyczyn losowych.<br />

Dlatego nie przekazywały one swojemu potomstwu cech umożliwiających<br />

zwalczanie chorób starczych. 2 000 lat temu przewidywana długość życia<br />

człowieka wynosiła 19 lat. Oznacza to, że geny które byłyby korzystne<br />

w wieku 50 lat nie były wówczas przekazywane. Chociaż więc starzenie nie<br />

jest korzystne z punktu widzenia poszczególnej jednostki to nie było ewolucyjnego<br />

nacisku jeżeli tylko nieliczne jednostki dożywały wieku sędziwego.<br />

Jak wiadomo wolne rodniki rodniki oddziaływają z DNA. Trudno jest jednakże<br />

jednoznacznie stwierdzić ich wpływ na rozwój ewolucjny. Wraz z rozwojem,<br />

„program” genetyczny coraz to bardziej komplikował się, a przez to był<br />

bardziej narażony na uszkodzenia. Tym można wytłumaczyć dlaczego znane<br />

są nieśmiertelne organizmy jednokomórkowe, a nie np. ludzie. W latach<br />

pięćdziesiątych L. Hayflick i P. Moorhead wysunęli koncepcję o ograniczonej<br />

liczbie podziałów komórki diploidalnej i występowaniu tzw. limitu Hayflicka.<br />

Zauważono w tym przypadku ścisłą korelację między oczekiwaną długością<br />

życia różnych organizmów, a ich limitem Hayflicka. Tę teorię jest wyjątkowo<br />

trudno połączyć z wolno-rodnikową teorią starzenia. Ostatnio sugeruje się<br />

jednakże, że limit Hayflicka zależy również od środowiska w którym przebywa<br />

komórka. Mogłoby to oznaczać udział wolnych rodników w starzeniu, tym<br />

bardziej, że zaobserwowano, że komórki pochodzące od organizmów długożyjących<br />

są bardziej odporne na ich ataki. Faktycznie udało się wydłużyć<br />

długość życia nicieni poprzez zamianę jednego z genów zwiększającą jego<br />

funkcje anty-oksydacyjne.<br />

ZMIATACZE WOLNYCH RODNIKÓW I ANTYUTLENIACZE<br />

Organizmy żywe w trakcie ewolucji wytworzyły szereg mechanizmów<br />

zapobiegających lub naprawiających uszkodzenia powstałe wskutek działa-<br />

47


nia wolnych rodników. Dlatego nie gromadzą się one w tkankach gdyż są<br />

stale unieczynniane, „zmiatane” przez miejscowe mechanizmy antyoksydacyjne.<br />

Bardzo często stanowią one niedostateczną ochronę i co więcej, ich<br />

efektywność maleje z wiekiem. Generalnie można je podzielić na systemy<br />

naprawcze białek, lipidów i DNA oraz antyutleniacze enzymatyczne lub nieenzymatyczne,<br />

jak to zostało zestawione poniżej.<br />

Rys. 3. Równowaga oksydacyjna<br />

1. Systemy naprawcze<br />

1.1. Naprawa białek - proteinazy (odcinają utlenione białka), proteazy<br />

(tną produkty aktywności proteinaz), peptazy (tną produkty aktywności<br />

proteaz na aminokwasy).<br />

1.2. Naprawa lipidów - fosfolipazy (usuwają utleniane fragmenty lipidów<br />

z błon), acetylotransferazy (wymieniają kwasy tłuszczowe oddzielone<br />

od lipidów), peroksydaza glutationowa i transferaza (wspomagają<br />

naprawę utlenionych kwasów tłuszczowych).<br />

1.3. Naprawa DNA - egzo- i endonukleazy (usuwają zniszczone fragmenty<br />

DNA), glikozylazy i polimerazy (wypełniają ubytki powstałe po<br />

działaniu nukleaz), ligazy (łączą naprawione fragmenty).<br />

2. Antyutleniacze (zmiatacze wolnych rodników)<br />

2.1. Enzymatyczne<br />

48


2.1.1. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) – składa się ona z dwóch<br />

dimerów o M = 32000, każdy zawiera Cu(II) i Zn(II), przy czym<br />

miedź znajduje się w centrum katalicznym, a cynk pełni rolę<br />

strukturalną. Występuje w cytozolu i mitochongriach (magnezo-zależna).<br />

Katalizuje dysmutację anionorodnika ponadtlenkowego<br />

w nadtlenek wodoru, powodując obniżenie jego stężenia<br />

do poziomu poniżej 10 -11 M. Wstrzyknięta do chorej<br />

tkanki z przewlekłym stanem zapalnym powoduje szybkie jej<br />

wyleczenie. Daje to lepsze wyniki leczenia reumatyzmu niż<br />

dotychczasowa terapia polegająca na naświetlaniu, powodująca<br />

wzrost stężenia rodników i tylko przejściową ulgę.<br />

2.1.2. Katalaza (M = 240 000) - składa się z 4 podjednostek, każda<br />

zawiera grupę hemową z wysokospinowym żelazem Fe(III).<br />

Jest reaktywna w peroksyzomach, obniża stężenie nadtlenku<br />

wodoru. Osłabienie funkcji SOD i katalazy jest przyczyną<br />

szybkiego starzenia się. Przy ich prawidłowym rozwoju człowiek<br />

mógłby, prawdopodobnie, żyć znacznie dłużej.<br />

2.1.3. Peroksydaza glutationowa (M = 90 000) zawiera atom selenu,<br />

stąd niektórzy mylnie zaliczają selen do antyutleniaczy. Występuje<br />

w mitochondriach i cytozolu, redukuje hydronadtenki organiczne<br />

i nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego.<br />

2.1.4. Ceruloplazmina - niebieska miedzioproteina występująca<br />

w surowicy krwi (M = 132000; 7,8 jonów Cu(II)). Katalizuje<br />

ona utlenianie jonów żelaza, przez co zapobiega tworzeniu się<br />

rodników hydroksylowych, likwiduje anionorodnik ponadtlenkowy.<br />

Mniej reaktywna od SOD, nie wytwarza nadtlenku wodoru.<br />

W przeciwieństwie do SOD jest zewnątrzkomórkowa<br />

w układzie krążenia.<br />

2.2. Nieenzymatyczne<br />

2.2.1. Witamina E i beta-karoten – reagując z wolnymi rodnikami wytwarzają<br />

trwałe rodniki oddziaływujące następnie z witaminą<br />

C. Jako rozpuszczalne w tłuszczach chronią głownie błony<br />

plazmatyczne. Usuwają NO 2 . chroniąc płuca przed dymem tytoniowym.<br />

2.2.2. Witamina C – reduktor zaangażowany w reakcje hydroksylacji<br />

(tworzenie hydroksyproliny w kolagenie). Chelatuje metale,<br />

w tym żelazo. Chroni witaminy A i E przed utlenianiem. Reaguje<br />

z wolnymi rodnikami w cytoplaźmie. Działa antyutleniająco<br />

wspólnie z witaminą E.<br />

2.2.3. Kwas moczowy – likwiduje rodniki w cytoplaźmie. Jest on<br />

końcowym produktem metabolizmu puryny u człowieka i naczelnych.<br />

Jego duże stężenie (> 0,5 mM) u naczelnych tłumaczy<br />

ich dużą żywotność.<br />

2.2.4. Chelatory metali (transferyna, laktoferyna, w tym białkowe:<br />

hemoglobina, mioglobina, ferrodyksyna) – zapobiegają katalizowaniu<br />

reakcji utleniania przez żelazo i miedź Zaliczyć moż-<br />

49


na do nich również poliaminy biogenne (spermina) – produkty<br />

metabolizmu (podobnie do NO) argininy.<br />

2.2.5. Związki zawierające grupy sulfhydrylowe -SH (cysteina, cysteamina,<br />

glutation).<br />

2.2.6. Kwas liponowy (tiooktanowy) – lek podawany diabetykom<br />

(normalizuje poziom cukru we krwi). Usuwa z organizmu metale<br />

ciężkie (Fe, Cu) i toksyczne (Cd, Pb, Hg). Ostatnio okazało<br />

się, że regeneruje on system nerwowy i wątrobę oraz spowalnia<br />

rozwój wirusa HIV, choroby Parkinsona i Alzheimera.<br />

Wiąże się to z jego silnym działaniem antyutleniającym (zarówno<br />

w wodzie jak i w tłuszczach) oraz z ochroną przed rozkładem<br />

witamin C i E.<br />

2.2.7. Melatonina – hormon wytwarzany w szyszynce. Ponieważ zanika<br />

ona z wiekiem stąd wysunięto koncepcję, że podawanie<br />

melatoniny może zapobiec, a nawet odwrócić procesy starzenia.<br />

Faktycznie, w roku 1994r. Pierpaoli i Regalson przedłużyli<br />

maksymalną długość życia myszy (z 23 do 28 miesięcy) poprzez<br />

podawanie im melatoniny w pożywieniu lub przeszczep<br />

szyszynki. Działanie melatoniny nie jest dokładnie poznane.<br />

Wiadomo, że jest ona 15 razy silniejszym antyutleniaczem niż<br />

witamina E. Jest stężenie (10 -9 M) jest jednakże za małe, aby<br />

mogła ona skutecznie usuwać wolne rodniki. Problematyczna<br />

wydaje się również możliwość „bezkarnej” kuracji hormonalnej.<br />

Wiąże się to z wysuniętą jeszcze w latach dwudziestych,<br />

przez Steinacha, koncepcją, według której główną przyczyną<br />

starzenia jest niedobór hormonów. Spektakularne wyniki okazały<br />

się bardzo niekorzystne w dłuższym okresie czasu.<br />

2.2.8. Koenzym Q 10 (ubichinon) – występuje w komórkowym układzie<br />

oddychania, na wewnętrznej membranie mitochondriów<br />

oraz w cytoplaźmie w połączeniu z lipoproteinami. Chroni<br />

przed utlenianiem lipidów.<br />

2.2.9. Fito-związki – zmiatacze rodników pochodzenia roślinnego<br />

(polifenole, flawonoidy, antocyjany, proantocyjanidy, pytoestrogeny).<br />

CAŁKOWITY POTENCJAŁ ANTYOKSYDACYJNY<br />

W literaturze można znaleźć opisy wielu metod oznaczania zarówno<br />

poszczególnych wolnych rodników [32-54] jak też antyoksydantów [32,<br />

54-57]. Wolne rodniki wytwarzane są w trakcie przebiegu całego łańcucha<br />

przemian. W rezultacie dochodzi do wytworzenia wielu rodników o różnej<br />

trwałości i reaktywności. Istnieje, więc potrzeba oznaczania sumarycznej ilości<br />

wolnych rodników lub stresu oksydacyjnego spowodowanego przez nie<br />

[41, 42, 51-53]. Z drugiej strony w trakcie przebiegu zmian patologicznych<br />

zmieniają się stężenia różnych antyoksydantów. Spowodowane jest to<br />

50


z jednej strony ich zużywaniem się w czasie reakcji z wolnymi rodnikami,<br />

z drugiej zaś akcją obronną organizmu. Okazało się, że oznaczanie sumarycznego<br />

stężenia wszystkich antyoksydantów często lepiej pozwala ocenić<br />

poziom mocy antyoksydacyjnej badanego układu biologicznego niż oznaczanie<br />

stężenia poszczególnych antyoksydantów osobno [58-67]. Obie te<br />

wielkości, tzn. stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny, są ze<br />

sobą ściśle powiązane, a nawet czasami, utożsamiane [67]. M.in. zmiana<br />

stężenia antyoksydantów w surowicy krwi pozwala badać wpływ wolnych<br />

rodników na przebieg szeregu stanów patologicznych [68-70]. Okazało się,<br />

że współdziałanie między różnymi antyoksydantami daje większą protekcję<br />

niż związki te osobno. Przykładowo, wymienić tu można synergizm glutationu<br />

regenerującego askorbinian [71], czy askorbinianu regenerujacego<br />

α-tokoferol [27, 72]. Te zdolności zmiatania rodników w literaturze definiowane<br />

i nazywane są bardzo różnorodnie (ang. TAC – total antioxidant capacity,<br />

FRAP – ferric reducing ability of plasma, TRAP – total peroxyl radical<br />

trapping antioxidant parameter, TRAP – total redox antioxidant potential,<br />

ORAC – oxygen radical absorbance capacity, TEAC – Trolox-equivalent antioxidant<br />

capacity czy TAR – total antioxidant reactivity) [59, 64, 73]. W opracowaniu<br />

stosujemy skrót CPA pochodzący od terminu - całkowity potencjał<br />

antyoksydacyjny.<br />

Za przybliżoną miarą stresu oksydacyjnego jest stężenie najbardziej<br />

reaktywnych rodników - hydroksylowych. Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałe<br />

dlatego do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Metoda<br />

ta polega na wprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznych<br />

związków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji<br />

(substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym.<br />

Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującą fenyloalaninę,<br />

kwas tereftalowy [74] lub egzogenne pochodne aspiryny. Produkty ich<br />

reakcji z rodnikiem hydroksylowym oznaczane są chromatograficznie.<br />

Chromatografia może być również zastosowana do pomiaru CPA.<br />

Wówczas układ pomiarowy zawiera badany związek lub próbkę biologiczną<br />

oraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwas p-hydroksybenzoesowy)<br />

[75]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostają w reakcji analogicznej do<br />

Fentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodoru i ADP [76, 77]. Rodniki te<br />

są zmiatane zarówno przez detektor jak i badaną próbkę. Jeśli próbka charakteryzuje<br />

się większą reaktywnością z rodnikami wówczas spowoduje to<br />

zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego produktu reakcji detektora<br />

z rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiatania rodników hydroksylowych<br />

przez różne próbki.<br />

Rodniki są wytwarzane m.in. pod wpływem działania promieniowania<br />

elektromagnetycznego na niektóre związki. Podczas reakcji odwrotnej, np.<br />

rekombinacji rodników lipidowych dochodzi do wydzielenia kwantu promieniowania<br />

elektromagnetycznego (chemiluminescencji). Dzięki temu metodą<br />

chemiluminescencji można badać niestabilne rodniki lipidowe, niemożliwe<br />

do bezpośredniej ich analizy, nawet w żywym materiale biologicznym [78].<br />

Inna metoda polega na dodaniu do badanego układu związku tworzącego<br />

51


trwały rodnik, możliwy do oznaczenia fotometrycznego [62, 64] lub za pomocą<br />

elektronowego rezonansu paramagnetycznego [79, 80]. Olbrzymia większość<br />

rodników mających istotne znaczenie biologiczne jest utleniaczami.<br />

Dlatego też sumaryczne stężenie rodników niskocząsteczkowych można<br />

oznaczać metodami elektrochemicznymi [81, 82].<br />

Oddzielną grupę technik oznaczania stresu oksydacyjnego jest analiza<br />

niektórych związków naturalnie występujących w układach biologicznych.<br />

Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznego stężenia tioli [99, 100],<br />

stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaci [101, 102] czy kwasu<br />

askorbinowego do dehydroaskorbinowego [103]. Wolne rodniki reagują<br />

praktycznie z wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi. Najbardziej<br />

istotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami. Produkty tych reakcji<br />

służą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków [104]. Uszkodzenie<br />

wolnorodnikowe białek mierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny<br />

w bityrozynę lub stężeniem grup karbonylowych [105]. Znanych jest ponad<br />

20 wolnorodnikowych uszkodzeń zasad purynowych i pirymidynowych.<br />

Wśród istotnych wskaźników uszkodzenia kwasów nukleinowych wyróżnić<br />

należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninę i 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę<br />

[106]. Inne podejście polega na określeniu aktywności enzymu reperującego<br />

nici DNA, Poli-ADP-rybozy [107]. Najwięcej prac poświęconych jest jednak<br />

określeniu stopnia peroksydacji lipidów [60, 108]. W tym przypadku oznacza<br />

się dialdehyd malonowy (MDA) [108, 109], 4-hydroksy-2-nonenal [110],<br />

oksysterole [111], hydroksynadtlenki [112] czy też sprzężone dieny [113].<br />

Ostatnio stwierdzono, że izomery prostaglandyny F 2 są również wskaźnikami<br />

generacji wolnych rodników i peroksydacji lipidów. F 2 -izoprostany<br />

(w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstają przede wszystkim w procesie peroksydacji<br />

kwasu arachidonowego i eikozanoidów (prostoglandyny, leukotrieny<br />

i tromboksany) [114-117].<br />

Jednym z pierwszych oznaczeń aktywności antyoksydacyjnej była<br />

wprowadzona w Instytucie Fizyki Chemicznej byłego ZSRR w Moskwie metoda<br />

polegająca na ocenie wpływu ekstraktów tkanek otrzymanych w wyniku<br />

działania rozpuszczalników organicznych na utlenianie nienasyconego kwasu<br />

tłuszczowego w standardowych warunkach (przedmuchiwanie tlenem,<br />

stała temperatura 37°C). Jeśli w ekstrakcie znajdowały się antyoksydanty,<br />

utlenianie kwasu tłuszczowego (monitorowane przez jodometryczny pomiar<br />

zawartości nadtlenków) rozpoczynało się z opóźnieniem, po czasie indukcji,<br />

który był zależny od sumarycznego stężenia antyoksydantów. Metoda ta pozwalała<br />

na oznaczenie zawartości antyoksydantów hydrofobowych i zdolnych<br />

do oddziaływania z hydrofobowym kwasem tłuszczowym. Wraz z rozwojem<br />

nauki powstały coraz to nowocześniejsze i bardziej czułe metody<br />

oznaczania CPA. Większość tych metod opiera się na tej samej zasadzie.<br />

Utleniacz inicjuje reakcję której przebieg można łatwo śledzić, np. fotometrycznie.<br />

Obecność antyoksydantów w próbce spowalnia reakcję utleniania,<br />

a mierzony parametr (np. czas indukcji) charakteryzujący to spowolnienie<br />

jest miarą zawartości antyoksydantów w próbce [118].<br />

52


Jednym z najpowszechniejszych oznaczeń jest TAS (Total Antioxidant<br />

Status), zaproponowane przez Rice-Evans [118]. Opiera się ono na następującej<br />

zasadzie. W środowisku reakcji znajduje się 2,2’-azynobis-<br />

-(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonian) (ABTS), nadtlenek wodoru i peroksydaza<br />

lub mioglobina działająca jako pseudoenzym. Peroksydaza katalizuje<br />

reakcje jednoelektronowego utleniania ABST przez nadtlenek wodoru.<br />

W wyniku reakcji powstaje kationorodnik ABTS .+ charakteryzujący się zielononiebieską<br />

barwą. Im więcej antyoksydantów znajduje się w środowisku<br />

reakcji tym wolniej powstaje zielone zabarwienie i tym jest ono słabsze. Zahamowanie<br />

zielenienia próbki mierzonego spektrofotometrycznie po określonym<br />

czasie inkubacji jest miarą zawartości przeciwutleniaczy w próbce.<br />

Metoda ta ma wiele wad, jednak jej ogromną zaletą jest wykonanie oznaczeń<br />

w ściśle określonych warunkach, gdyż zestaw odczynników do przeprowadzenia<br />

testu jest powszechnie dostępny [118].<br />

Rys. 4. Schemat pomiaru całkowitego potencjału antyoksydacyjnego metodą fotometryczną.<br />

1 – hipotetyczna zmiana sygnału przy braku próbki w mieszaninie reakcyjnej, 2 – przebieg<br />

rzeczywistej zmiany sygnału w obecności próbki charakteryzującej się dużo większą stałą<br />

szybkości reakcji z rodnikiem niż „detektor” i 3 – stałą szybkości reakcji porównywalną z nim<br />

Pomiar CPA jest szczególnie często stosowany do badań skomplikowanych<br />

próbek biologicznych, głównie surowicy lub osocza krwi [59-67].<br />

Oparty on jest na fotometrycznym pomiarze wytworzonych trwałych rodników<br />

[62, 99] lub redukcji żelaza przez składniki surowicy [60]. Najczęściej<br />

jednak wykorzystuje się metodę opartą o generację rodników wskutek termicznego<br />

rozpadu związków dwuazowych, najczęściej AAPH (2,2-diazobis-<br />

(2-amidinopropano)-dihydrochlorek). Początkowo AAPH rozpada się samorzutnie<br />

na dwa rodniki alkilowe, które następnie reagując z tlenem wytwarzają<br />

rodniki ponadtlenkowe. Powstałe rodniki monitoruje się za pomocą tzw.<br />

detektora, tzn. związku, który po przereagowaniu z rodnikami zmienia sygnał<br />

luminescencyjny [63], fluorometryczny [59, 119] lub fotometryczny [61, 65].<br />

Miarą potencjału antyoksydacyjnego jest czas opóźnienia krzywej obrazują-<br />

53


cej zmiany stężenia detektora lub produktu jego reakcji w czasie (rys. 4). To<br />

przesunięcie spowodowane jest tym, że antyoksydanty zawarte w próbce<br />

nie dopuszczają do reakcji rodnika z detektorem. Stąd podstawowym wymogiem<br />

tej metody jest, aby reakcja próbki z rodnikiem była znacznie szybsza<br />

od analogicznej reakcji detektora.<br />

Duża ilość metod pomiaru CPA powoduje, że ten sam materiał mierzony<br />

za pomocą różnych metod może dawać odmienne wyniki. W celu<br />

ujednolicenia wyników w większości przypadków stosuje się przeliczanie ich<br />

na jeden ze standardów, przeważnie stężenie Troloksu, syntetycznego, rozpuszczalnego<br />

w wodzie analogu witaminy E.<br />

CHROMATOGRAFICZNY POMIAR STRESU OKSYDACYJNEGO<br />

CPA jest odwrotnie skorelowany z inną sumaryczną wielkością, mianowicie<br />

ze stresem oksydacyjnym. Pośrednią grupę technik oznaczania<br />

stresu oksydacyjnego jest analiza niektórych związków naturalnie występujących<br />

w układach biologicznych. Zaliczyć do tego można oznaczanie sumarycznego<br />

stężenia tioli, stosunku stężeń glutationu do jego utlenionej postaci<br />

czy kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego. Wolne rodniki reagują<br />

z praktycznie wszystkimi związkami biologicznie aktywnymi (najbardziej<br />

istotne są ich oddziaływania z DNA, białkami i lipidami). Produkty tych reakcji<br />

służą do wyznaczenia stopnia uszkodzenia tych związków. Ponieważ są<br />

one nietrwałe ich bezpośrednie oznaczanie w próbkach materiału biologicznego<br />

(np. w osoczu, czy w homogenatach tkankowych) nie jest zazwyczaj<br />

możliwe, dlatego też pośrednią metodą oznaczania stresu oksydacyjnego<br />

jest analiza produktów tych reakcji. Uszkodzenie wolnorodnikowe białek<br />

mierzone jest stopniem przereagowania tyrozyny w bityrozynę lub stężeniem<br />

grup karbonylowych. Znanych jest ponad 20 wolnorodnikowych uszkodzeń<br />

zasad purynowych i pirymidynowych. Wśród istotnych wskaźników uszkodzenia<br />

kwasów nukleinowych wyróżnić należy 8-okyguaninę i 8-oksyadeninę<br />

i 8-hydroksy-2-deoksyguanozynę. Inne podejście polega na określeniu aktywności<br />

enzymu reperującego nici DNA, poli-ADP-rybozy. Wydaje się, że<br />

w chwili obecnej największe zainteresowanie wzbudza określenie stopnia<br />

peroksydacji lipidów. Oznaczanymi produktami ich peroksydacji jest dialdehyd<br />

malonowy (MDA) [7], 4-hydroksy-2-nonenal (HNO), oksysterole (7α-,<br />

7β-, 24, 25- i 27-hydroksycholesterol oraz epoksycholesterol [8a]), hydroksynadtlenki,<br />

sprzężone dieny czy też ostatnio intensywnie badane izomery<br />

prostaglandyny F 2 . F 2 -izoprostany (w szczególności 8-epiPGF 2α ) powstają<br />

przede wszystkim w procesie peroksydacji kwasu arachidonowego i eikozanoidów<br />

(prostoglandyny, leukotrieny i tromboksany).<br />

Produktami peroksydacji, głównie wielonienasyconych kwasów tłuszczowych<br />

(PUFA), są aldehydy, hydroksynadtlenki i ketony, a ich produktem<br />

końcowym jest dialdehyd malonowy (MDA). Pomiar jego stężenia jest powszechnie<br />

uznawany za miarę wolnorodnikowego uszkodzenia lipidów [7].<br />

Najczęściej stosuje się do tego, ze względu na prostotę obsługi i wysoką<br />

54


czułość, test kwasu tiobarbiturowego, TBA [7]. Niestety test TBA jest wysoce<br />

niespecyficzny i trudny do zastosowania w próbkach biologicznych. Dodatni<br />

wynik otrzymuje się także z cukrami, niektórymi aminokwasami, kwasami<br />

żółciowymi, alkenami, alkadienami, itp. Pewne udoskonalenie uzyskano stosując<br />

chromatografię w układzie faz odwróconych z detekcją fluorometryczną<br />

[10, 11] lub fotometryczną przy długości fali 535 nm [13-16]. W tym przypadku<br />

derywatyzacja (kwasem tiobarbiturowym) wpływa zarówno na<br />

rozdział, jak i na detekcję. Ciągle jednak etap derywatyzacji związany z opisaną<br />

niejednoznacznością, jest wymagany. Metodę tę próbowano zmodyfikować<br />

stosując derywatyzację 2,4-dinitrofenylohydrazyną [17-19] lub diaminonaftalenem<br />

[20] z detekcją fotometryczną przy 310 nm. Etap<br />

derywatyzacji usunięto stosując tzw. chromatografię par jonowych [21, 22]<br />

(dialdehyd jest kwasem i dlatego jest on słabo zatrzymywany na fazie<br />

RP-18). Detekcja fotometryczna przy 267 nm pozwala na jednoczesną analizę<br />

MDA z dwoma powszechnie występującymi w surowicy krwi antyoksydantami,<br />

tzn. kwasem askorbinowym i moczowym. Na rysunku 5 przedstawiono<br />

analogiczny chromatogram uzyskany metodą chromatografii<br />

wykluczania jonowego (jest to technika predysponowana do rozdziału słabych<br />

kwasów), takich jak MDA (pK a ~4.5) [23]. Porównany on został<br />

z chromatogramem uzyskanym po derywatyzacji MDA.<br />

A<br />

AA<br />

UA<br />

267nm<br />

MDA<br />

B<br />

535nm<br />

20 min<br />

Rys. 5. Chromatogram jonowo-wykluczający 100 μM kwasu (AA) – askorbinowego,<br />

(UA) – moczowego, (MDA) – dialdehydumalonylowego i - 25 μM MDA . TBA (dolny wykres).<br />

Warunki: kolumna – 300x7.8 mm I.D. TSK-GEL SCH(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma:<br />

(A) - 3 mM H 2 SO 4 , 3 mM TBABr, 5% ACN, temp. – 40°C; (B) – 1 mM H 2 SO 4 , 15% ACN,<br />

temp. – 20°C; detektor UV-267/535 nm<br />

55


Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo reaktywne. Dlatego też są stosunkowo<br />

często oznaczane i pośrednio świadczą o całkowitym stresie oksydacyjnym.<br />

Ponieważ są one wyjątkowo nietrwałe, do ich oznaczania stosuje<br />

się metodę pułapki spinowej. Polega ona na wprowadzeniu do materiału biologicznego<br />

względnie nietoksycznych związków aromatycznych i oznaczaniu<br />

produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa lub nukleofilowa) z rodnikiem<br />

hydroksylowym. Jako pułapkę spinową wykorzystuje się naturalnie występującą<br />

fenyloalaninę, kwas tereftalowy lub egzogenne pochodne aspiryny.<br />

W przypadku fenyloalaniny (D-izomer) jej produktami reakcji z rodnikami<br />

hydroksylowymi są tyrozyny [24]. Produkty ich reakcji z rodnikiem hydroksylowym<br />

oznaczane są chromatograficznie.<br />

Aspiryna (kwas o-acetylosalicylowy) jest lekiem powszechnie stosowanym<br />

m.in. przy leczeniu stanów zapalnych i złogów naczyń krwionośnych.<br />

W organizmach jest ona bardzo szybko hydrolizowana do kwasu salicylowego<br />

(rys. 9). Kwas ten w warunkach fizjologicznego pH = 7,4 reaguje<br />

z rodnikami hydroksylowymi dając trzy produkty reakcji: kwasy 2,3- (49%)<br />

i 2,5-dihydroksybenzoesowe (40%) (DHBA) oraz o-katechol (11%). Pułapkowanie<br />

rodników hydroksylowych kwasem salicylowym zostało wielokrotnie<br />

opisane w literaturze [24]. Kwas ten (ok. 5 mM) wprowadzany jest dootrzewnowo<br />

lub stereotaktycznie dokomorowo do komory mózgowej. Stężenie<br />

2,5-DHBA może być powiązane ze stężeniem cytochromu P-450. Zmiany<br />

stężenia 2,3-DHBA są zaś bezpośrednio powiązane ze zmianami stężenia<br />

rodników hydroksylowych. Kwasy te oznaczane są zwykle chromatograficznie<br />

w układzie faz odwróconych [25], jak przedstawiono to na rys. 6.<br />

Rys. 6. HPLC chromatogram 1 mM standardów kwasów (1) - 2,5-,<br />

(2) - 2,3-dihydroksybenzoesowych oraz (3) - kwasu salicylowego. Warunki chromatograficzne:<br />

kolumna - 250x4 mm śr. wew. Zorbax ODS 5 μm (Knauer); faza ruchoma - bufor octanowocytrynianowy<br />

pH = 4,3, 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA, 5% MeOH, 3 mM TBAP; temp. - 20ºC;<br />

szybkość przepływu - 0,9 ml/min; detektor - UV-205 nm<br />

56


Pułapka salicylanowa posiada szereg wad [26]:<br />

a) problematyczne jest oznaczanie kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego<br />

gdyż może on występować endogennie, np. wskutek działania<br />

cytochromu P-450,<br />

b) czułość układu jest zmniejszona na skutek tworzenia się dwóch produktów<br />

reakcji,<br />

c) pochodne aspiryny mogą występować w pożywieniu, a jej nieuzasadnione<br />

podawanie wpływa na stany zapalne.<br />

Aby uniknąć tych trudności SteMarie i wsp. zaproponowali zastąpienie salicylanów<br />

kwasem p-hydroksybenzoesowym [26]. Chociaż kwasy te oznaczać<br />

można fotometrycznie to zwykle stosuje się znacznie bardziej czułą (1 pg dla<br />

DHBA, 100 pg dla kwasu salicylowego) detekcję elektrochemiczną (elektroda<br />

pracująca: węgiel szklisty; 0,8 V vs Ag/AgCl) [25].<br />

Rys. 7. Chromatogram jonowo-wykluczający kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego oraz kwasu<br />

p-hydroksybenzoesowego. Warunki chromatograficzne: kolumna - 300x7,8 mm śr. wew.<br />

TSK-GEL SCX(H + ) (TosoHaas); faza ruchoma - 1 mM H 2 SO 4 , 1 mM KCl, 0,25 mM EDTA,<br />

13% ACN; detektor elektrochemiczny<br />

Rys. 8. Hydrodynamiczne woltamogramy 1 mM kwasów 3,4-dihydroksybenzoesowego<br />

i p-hydrosybenzoesowego. Warunki chromatograficzne jak na rysunku powyżej<br />

57


COOH<br />

OCOCH3<br />

aspiryna<br />

hydroliza<br />

COOH<br />

COC 6H 9O6<br />

OH<br />

COOH<br />

OH<br />

kwas salicylowy<br />

OH<br />

OH<br />

salicyloacyloglukoronid<br />

OH<br />

2,3-DHBA<br />

COOH<br />

CO 2<br />

OC 6H 9O6<br />

COOH<br />

OH<br />

salicylofenyloglukoronid<br />

CONHCH 2CO 2H<br />

OH<br />

OH<br />

OH<br />

HO<br />

2,5-DHBA<br />

kwas salicylurowy<br />

Rys. 9. Metabolity i produkty reakcji ataku rodnika hydroksylowego na kwas salicylowy<br />

CHROMATOGRAFICZNY POMIAR CAŁKOWITEGO POTENCJAŁU<br />

ANTYOKSYDACYJNEGO<br />

COOH<br />

COOH<br />

OH<br />

OH<br />

OH<br />

OH<br />

Rys. 10. Reakcja pułapkowania rodnika hydroksylowego kwasem p-hydroksybenzoesowym,<br />

w wyniku której powstaje kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy<br />

Ponieważ rodnik hydroksylowy jest najbardziej reaktywny z całej kaskady<br />

rodników jego oznaczanie pozwala uzyskać informacje o całkowitym<br />

stresie oksydacyjnym. Rodniki hydroksylowe są wyjątkowo nietrwałe dlatego<br />

do ich oznaczania stosuje się metodę pułapki spinowej. Polega ona na<br />

wprowadzeniu do materiału biologicznego względnie nietoksycznych związ-<br />

58


ków aromatycznych i oznaczaniu produktów ich reakcji (substytucja wolnorodnikowa<br />

lub nukleofilowa) z rodnikiem hydroksylowym. Jako pułapkę spinową<br />

wykorzystuje się m.in. naturalnie występującą fenyloalaninę, kwas tereftalowy,<br />

egzogenne pochodne aspiryny oraz, przedstawiony na rys. 10,<br />

kwas p-hydroksybenzoesowy (p-HBA) [25]. Kwasy hydroksybenzoesowe<br />

mogą być oznaczane metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej<br />

w układzie faz odwróconych z detekcja elektrochemiczną (węgiel szklisty;<br />

0,8 V vs Ag/AgCl).<br />

W tym miejscu warto zauważyć, że salicylany, czy szerzej hydroksybenzoesany,<br />

(np.: aspiryna - kwas o-acetylosalicylowy) występują w wielu<br />

roślinach. Wykorzystanie, z powodzeniem, tej grupy związków jako pułapki<br />

rodnika hydroksylowego udowadnia, że oprócz własności przeciwzapalnych<br />

związki te w organizmie mogą pełnić również rolę antyoksydantów.<br />

Rys. 11. Porównanie potencjał antyoksydacyjny metanolu, etanolu i dimetyosulfotlenku. Rodniki<br />

hydroksylowe zostały wygenerowane w układzie (ADP/Fe(II)/H 2 O 2, ) i pułapkowane kwasem<br />

p-hydroksybenzoesowym w obecności badanych rozpuszczalników o stężeniu 0.1%. Produkt<br />

reakcji (kwas 3,4-dihydroksybenzoesowy) był oznaczany z zastosowaniem chromatografii<br />

wykluczania jonowego. Próbka kontrolna nie zawierała antyoksydantów, dlatego wysokość<br />

jej piku chromatograficznego przyjęto za 100%<br />

Rys. 12. Prównanie potencjału antyoksydacyjny poliamin biogennych (AGM – agmatyny,<br />

PUT – putrescyny, SPD – spermidyny i SPE – sperminy). Warunki jak na rys. 11<br />

59


W statycznej, chromatograficznej metodzie pomiaru całkowitego potencjału<br />

antyoksydacyjnego układ pomiarowy zawiera badany związek lub<br />

próbkę biologiczną oraz będący pułapką spinową „detektor” (np. kwas<br />

p-hydroksybenzoesowy) [28]. Rodniki hydroksylowe wygenerowane zostają<br />

w reakcji analogicznej do Fentona, w układzie żelazo (II), nadtlenek wodoru<br />

i ADP [29]. Rodniki te są zmiatane zarówno przez detektor jak i badaną<br />

próbkę. Jeśli próbka charakteryzuje się większą reaktywnością z rodnikami<br />

wówczas spowoduje to zmniejszenie wysokości piku chromatograficznego<br />

produktu reakcji detektora z rodnikiem. Umożliwia to porównanie mocy zmiatania<br />

rodników hydroksylowych przez różne próbki. Okazało się, że tak wyznaczony<br />

potencjał antyoksydacyjny skorelowany jest ze stałymi szybkości<br />

reakcji rodnika hydroksylowego z badanymi związkami.<br />

Na rys. 11 pokazano wysokości pików chromatograficznych uzyskanych<br />

w obecności niektórych rozpuszczalników organicznych (metanolu,<br />

etanolu i dimetylosulfotlenku – DMSO) w odniesieniu do próbki kontrolnej<br />

(wytworzony rodnik+detektor) [28]. Zmniejszenie wysokości pików wskazuje<br />

na to, że rozpuszczalniki te zmiatają rodniki hydroksylowe. Może to tłumaczyć<br />

protekcyjne własności DMSO obserwowane w czasie stresu oksydacyjnego<br />

mózgu [30, 31]. Obserwowane zmniejszenie wysokości pików<br />

chromatograficznych dihydroksybenzoesanów jest proporcjonalne do stężenia<br />

próbki, ale także i jej własności. Ta ostatnia jest prawdopodobnie zależna<br />

od wartości stałej szybkości reakcji próbki z rodnikiem hydroksylowym.<br />

Stałe szybkości wynoszą 8.3 x 10 8 , 2.2 x 10 9 i 7.0 x 10 9 mol L -1 s -1 odpowiednio<br />

dla metanolu, etanolu i DMSO.<br />

Podobne zależności uzyskane dla poliamin biogennych, putrescyny,<br />

spermidyny, sperminy i agmatyny przedstawiono na rys. 12 [11]. Związki te<br />

pełnią istotną rolę we wszystkich żywych organizmach, m.in. we wzroście<br />

i replikacji komórek. Poza tym pełnią rolę antagonistów niektórych kationów<br />

(takich jak K + , Mg 2+ czy Ca 2+ ) i antyoksydantów [12]. Jako substancje smakowe<br />

i zapachowe występują m.in. w winie, herbacie, grzybach, jabłkach itd.<br />

Pełnią one rolę też antygenów w komórkach niektórych bakterii, nowotworów,<br />

pasożytów i grzybów chorobotwórczych. Dlatego sugeruje się, że picie<br />

herbaty ma działanie antykancerogenne gdyż pobudza to aktywność komórek<br />

układu odpornościowego i wzrost produkcji np. interferonu gamma.<br />

Zmiany ich stężenia obserwowano w czasie ischemii i reperfuzji. Kontrowersje<br />

wzbudza w dalszym ciągu czy ich wytwarzanie ma w tym przypadku<br />

działanie neurotoksyczne czy neuroprotekcyjne [13]. Z przedstawionego rysunku<br />

wynika, że poliaminy są zmiataczami wolnych rodników. Podobnie do<br />

opisanych wcześniej rozpuszczalników organicznych ich potencjał antyoksydacyjny<br />

proporcjonalny jest do stałych szybkości ich reakcji z rodnikiem<br />

hydroksylowym (wynoszą one odpowiednio 1.1 x 10 8 , 1.2 x 10 8 i 1.3 x 10 8<br />

mol L -1 s -1 ). Mechanizm zmiatania rodników w tym przypadku oparty jest<br />

głównie na kompleksowaniu jonów żelaza, co zapobiega przebiegowi reakcji<br />

Fentona, a nie na konkurencyjnej reakcji z jonami hydroksylowymi.<br />

Ostatnio dużym zainteresowaniem cieszą się naturalne antyoksydanty<br />

do których zalicza się występujące w roślinach barwniki – flawonoidy w tym<br />

60


antocyjany. Do tych ostatnich należy m.in. barwnik C3G (3-O-β-D glukozyd<br />

cyjnidyny) oraz jego aglikol – cyjanidyna. Są to związki powszechnie występujące<br />

w warzywach i owocach. Duże ilości antocyjanów zawierają owoce<br />

o niebieskim bądź fioletowym zabarwieniu. Wyizolowano je m.in. z czerwonej<br />

i czarnej fasoli. Uważane są one za potencjalne wymiatacze wolnych<br />

rodników tlenowych in vivo [14]. W szczególności dużo antocyjanów zawartych<br />

jest w aronii czarnej (Aronia melanocarpa) [14-16]. W literaturze można<br />

znaleźć liczne opisy ich neuro- i cytoprotekcyjnego działania, m.in. w chorobie<br />

Alzheimera, udarze mózgu, zawale serca itp. [14]. Ekstrakt z owoców<br />

aronii jak i zawarte w niej antocyjany charakteryzują się silnymi własnościami<br />

antyoksydacyjnymi. Okazało się jednakże, że nie zmieniał on potencjału<br />

antyoksydacyjnego osocza krwi, co oznacza, że związki te nie są wchłaniane<br />

z przewodu pokarmowego. Wyjaśnieniem tego paradoksu może okazać<br />

się sugestia Tsudy i wsp., że cyjanidyna zawarta w aronii ulega w organizmach<br />

żywych alglikolizacji, a następnie jest metabolizowana do kwasu<br />

3,4-dihydroksybenzoesowego (3,4-DHBA) (rys. 13), jak wynika z badań silnego<br />

zmiatacza rodników peroksylowych.<br />

OH<br />

H<br />

HO<br />

O +<br />

HO<br />

O<br />

O<br />

OH<br />

OH<br />

HO<br />

Rys. 13. Przypuszczalny schemat metabolizmu cyjanidyny<br />

Według tradycji w roku 2737 p.n.e. cesarzowi Chen Nung wpadł do<br />

wody listek herbaty. Odtąd datują się początki znajomości zdrowotnego<br />

działania różnych herbat, które około XVI wieku przybyły do Europy. Spośród<br />

przebadanych i przedstawionych na rys. 14 [120] fotometrycznych wartości<br />

CPA wynika, że najsilniej wolne rodniki są zmiatane przez ekstrakt<br />

z herbaty zielonej. Na uwagę zasługuje też fakt zupełnego braku zmiatania<br />

wolnych rodników przez napój herbaciany Green Tea & Lychee. Sugeruje<br />

się, że tymi aktywnymi antyoksydantami występującymi w herbacie są<br />

związki z grupy flawonoidów. Podobne wyniki uzyskane zostały z zastosowaniem<br />

metody analogicznej do opisanej powyżej chromatograficznej<br />

(rys. 15). Różnica polegała na detekcji z zastosowaniem spektroskopii ma-<br />

61


sowej. Warto zwrócić w tym przypadku uwagę na silne własności zmiatające<br />

melatoniny, zupełnie nieaktywnej w stosunku do rodników peroksylowych.<br />

Rys. 14. Całkowity potencjał antyoksydacyjny, odniesiony do rodników peroksylowych,<br />

niektórych ekstraktów ziołowych o stężeniu początkowym 1 mg/ml: ekstraktu z herbaty zielonej,<br />

aronii, pycnogenol, ekstraktu z herbaty czerwonej, imbiru oraz napoju herbacianego<br />

Green Tea & Lychee<br />

Rys. 15. Całkowity potencjał antyoksydacyjny ekstraktów ziołowych, melatoniny oraz<br />

β-amyloidu. Rodnik generowany – hydroksylowy, metoda pomiaru – MS<br />

LITERATURA<br />

1. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,<br />

19(2000)492.<br />

2. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.<br />

3. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.<br />

4. W. Droge, Physiol. Rev., 82(2002)47.<br />

5. T. Kulawik, R. Gil, P. Grieb, B.K. Głód, Probl. Lekar., 41(2002)393.<br />

6. G. Benzi, A. Noretti, Neurobiol. Aging, 16(1995)661.<br />

62


7. B.K. Głód, J.C. Kowalski, J. Liquid Chromatogr. & Rel. Technol.,<br />

27(2004)2733-2742.<br />

8. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.<br />

8a. S. Dzeletovic, O. Breuer, E. Lund, U. Diczfalusy, Anal. Biochem.,<br />

225(1995)73-80.<br />

9. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.<br />

10. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)664.<br />

11. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal. (Warsaw), 47(2002)399.<br />

12. H.C. Ha, J.D. Yager, P.A. Woster, R.A Casero, Biochem. Biophys. Res.<br />

Commun., 244(1998)298.<br />

13. E. Lövaas, Medical Hyphoteses, 45(1995)59.<br />

14. T. Tsuda, F. Horio, T. Osawa, BioFactors, 13(2000)133.<br />

15. R. Salvayre, P. Braquet, T.H. Perruchot, L. Douste-Blazy, Proc. Internat.<br />

Bioflavan. Symp., Munch 1981, str. 437-442.<br />

16. Y.L. Hong, S.L. Yeh, C.Y. Chang, M.L. Hu, Clin. Biochem.,<br />

33(2000)619-625.<br />

17. J. Pilz, I. Meineke, C.H. Gleiter, J. Chromatogr. B, 742(200)315-325.<br />

18. R. Bakalova, M. Mileva, C. Kotsev, V. Bardarov, S. Ribarov, Method<br />

Find. Exp. Clin., 22(2001)267-269.<br />

19. F. Fenaille, P. Mottier, R.J. Turesky, S. Ali, P.A. Guy, J. Chromatogr. A,<br />

921(2001)237-245.<br />

20. P.J. Steghens, A.L. van Kappel, I. Denis, C. Collombel, Free Radic.<br />

Biol. Med., 31(2001)242-249.<br />

21. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,<br />

200(1995)69-72.<br />

22. A.W. Bull, L.J. Marnet, Analyt. Biochem., 149(1985)284-290.<br />

23. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237-1248.<br />

24. T. Obata, H. Hosokawa, Y. Yamanaka, Comp. Biochem. Physiol.,<br />

106(1997)629-634.<br />

25. B.K. Głód, G.A. Czapski, Zastosowanie HPLC do Badania Reakcji Wolnorodnikowych<br />

w Układach Biologicznych [w] Chromatographic Methods<br />

in the Analysis of Food and Ecotoxicology, Wyd. UMCS, Lublin<br />

1999, 11-15.<br />

26. Ste-Marie L., Boismenu D., Vachon L. and Montgomery J., Anal. Biochem.,<br />

241(1996)67.<br />

27. A.P. Diplock, Med. Biol., 62(1984)78-80.<br />

28. B.K. Głód, R. Greib, Chem. Anal., 47(2002)399-407.<br />

29. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Methods,<br />

10(1984)221.<br />

30. J.W. Phillis, A.Y. Estevez, M.H. O'Regan, Neurosci. Lett.,<br />

244(1998)109-111.<br />

31. A. Bishayee, H.Z. Hill, D. Stein, D.V. Rao, R.W. Howell, Radiation Res.,<br />

155(2001)335-344.<br />

32. B. Kamińska, M. Stańczyk, Post. Biol. Kom., 25 sup.11(1998)15.<br />

33. A. Friedman, Acta. Neurol. Scand., 89(1994)258.<br />

34. S. Ball, Chemia szarych komórek, Medyk, Warszawa 2003.<br />

63


35. W. Pakszys, B.K. Głód, P.P. Liberski, A. Klimek, red., Postępy w rozpoznawaniu<br />

i monitorowanym klinimetrycznie leczeniu choroby Parkinsona<br />

i parkinsonizmu, Medical Communications, Warszawa 2004.<br />

36. A. Szczudlik, Choroba Parkinsona, XVI Zimowa Szkoła Instytutu Farmakologii<br />

PAN, Mogilany 1999.<br />

37. H. Ehringer, O. Hornykiewicz, Klin. Wochenschr., 38(1960)1236.<br />

38. E.S. Tolosa, Clin. Neuropharm., 21 sup.1(1998)S1-S4.<br />

39. J. Cederbaum, Clin. Pharmacokinet., 13(1987)141.<br />

40. G.C. Cotzias, M.H. Van Woert, L.M. Schiffer, N. Engl. J. Med.,<br />

276(1967)374.<br />

41. Y. Agid, T.Chasa, D.Marschen, Lancet, 351(1998)851.<br />

42. C.W. Olanow, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)13.<br />

43. P.G. Jenner, Eur. J. Neurol., 4 sup.3(1997)3.<br />

44. H.S. Markus, M. Cox, A.M. Tomkins, Clinical Science, 83(1992)199.<br />

45. W. Pakszys, Neurol. Neurochir. Pol., 6(1971)837.<br />

46. M.D. Yahr, Autonomic Dysfuncion in Parkinson Dis. Rev., 1, 2(1989).<br />

47. D.J. Lanska, Ch.G. Goetz, T.A. Chmura, Movement Disorders,<br />

16(2001)736.<br />

48. K. Kwiatos, Pomiar i analiza drżeń kończyn człowieka, rozprawa doktorska<br />

na Wydziale Elektroniki WAT 2000.<br />

49. P. Jenner, C.W. Olanow, Neurology., 47(1996)161.<br />

50. D.T. Dexter, C.J. Carter, F.R. Wells, F. Javoy-Agid, J. Neurochem.,<br />

52(1989)381.<br />

51. J. Garthwaite, Tren. Neurosci., 14(1991)60.<br />

52. U. Pinkernell, S. Effekemann, U. Karst, Anal. Chem., 69(1997)3623.<br />

53. M. Gu, M.T. Gash, J.M. Cooper, G.K. Wenning, S.E. Daniel, N.P. Quinn,<br />

C.D. Marsden, A.H.V. Schapira, Ann. Neurol., 44(1997)418.<br />

54. T. Obata, Toxicol. Lett., 132(2002)83.<br />

55. T. Singer, A.J. Trevor, N. Castagnoli, Trend Biochem. Sci.,<br />

12(1987)266.<br />

56. J.W. Langston, Life Sci., 36(1985)201.<br />

57. E. Sofic, P. Riederer, H. Heinsen, H. Beckmann, G.P. Reynolds, G. Hebenstreit,<br />

J. Neural. Trans., 74(1988)199.<br />

58. E. Sofic, W. Paulus, K. Jellinger, P. Riederer, J. Neurochem.,<br />

56(1991)978.<br />

59. C. Buhmann, S. Arlt, A. Kontush, T. Moller-Bertram, S. Sperber,<br />

M. Oechsner, M. Stuerenburg, U. Beisiegel, Neurobiol. Disease,<br />

15(2004)160.<br />

60. A.N. Basma, E.J. Morris, W.J. Nicklas, H.M. Geller, J. Neurochem.,<br />

64(1995)825.<br />

61. D.G. Graham, Mol. Pharmacol., 14(1978)633.<br />

62. S.T. Spencer, T. Parker, W.D. Bennet, Neuroreport, 5(1994)1009.<br />

63. E. Martignoni, F. Blandini, L. Godi, S. Desideri, C. Pacchetti, F. Mancini,<br />

G. Nappi, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)428.<br />

64. J.W. Miller, J. Selhub, J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 21(1996)241.<br />

64


65. M. Tanaka, A. Sotomatsu, H. Kanai, S. Hirai, J. Neurol. Sci.,<br />

101(1991)198.<br />

66. Y. Agid, Neurology, 43(1998)145.<br />

67. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.RF. Haddad, TrAC, Trends Anal. Chem.,<br />

19(2000)492.<br />

68. E. Miętkiewski, Kurs wykładów fizjologii człowieka, wyd. 2, PZWL, Warszawa,<br />

1969.<br />

69. R.A. Floyd, FASEB J., 4(1990)2587.<br />

70. A. Boveris, N. Oshinao, B. Chance, Biochem. J., 128(1972)617.<br />

71. B. Halliwell, Lancet, 355(2000)1179.<br />

72. B. Halliwell, Free Radic. Res, 25(1996)439.<br />

73. I. Fridovich, Arch. Biochem. Biophys., 247(1986)1.<br />

74. R.M.J. Palmer, D.S. Ashton, S. Moncada, Nature, 333(1988)1.<br />

75. B.K. Głód, J. Strosznajder, Wolne rodniki w starzeniu się mózgu<br />

i innych procesach biologicznych, w Mózg a starzenie (M.J. Mossakowski,<br />

J. Strosznajder, red.), Oświata UN-O, Warszawa 2001.<br />

76. P.G. Osborne, K. Yamamoto, J. Chromatogr. B, 707(1998)3.<br />

77. B. Halliwell, H. Kaur, M. Ingelman-Sundeberg, Free Radical Biol. Med.,<br />

10(1991)439.<br />

78. B.K. Głód, Neurochem. Res., 22(1997)1237.<br />

79. B.K. Głód, G.A. Czapski, P.R. Haddad, TRAC, Trends Anal. Chem.,<br />

19(2000)492.<br />

80. B.K. Głód, P. Grieb, Chem. Anal., (Warsaw), 47(2002)399.<br />

81. A. Rehman, M. Whiteman, B. Halliwell, British J. Pharmacol.,<br />

122(1997)1702.<br />

82. G. Ellis, I. Adatia, M. Yazdanpanah, S.K. Makela, Clin. Biochem.,<br />

31(1998)195.<br />

83. T-K. Lin and C-C. Lai, J. Chromatogr., 227(1982)369.<br />

84. B.K. Głód, W. Hilgier, J. Strosznajder, J. Albrecht, Chem. Anal.,<br />

(Warsaw), 45(2000)27.<br />

85. P.M. Abuja, R. Albertini, Clin. Chim. Acta, 306(2001)1.<br />

86. A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi, Free Rad.<br />

Biol. Med., 18(1995)29.<br />

87. M. Carlberg, J. Neurosci. Meth., 52(1994)165.<br />

88. K. Kostner, S. Bayai, M. Jansen, G. Khoschsorur, W.H. Horl, G. Maurer,<br />

B. Winklhofer-Roob, K. Derfler, Clin. Chim. Acta, 288(1999)21.<br />

89. A.H. Waterfall, G. Singh, J.R. Fry, C.A. Marsden, Neurosci. Lett.,<br />

200(1995)69.<br />

90. I.N. Acworth, B. Bailey, The Handbook of Oxidative Metabolism, ESA<br />

Inc. 1995.<br />

91. C.A. Rice-Evans, Free Rad. Res., 33(2000)59.<br />

92. M. Valkonen, T. Kuusi, J. Lipid Res., 38(1997)823.<br />

93. N. J. Miller, C. Rice-Evans, M.J. Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Clin.<br />

Scie., 84(1993)407.<br />

94. E. Lissi, M. Salim-Hanna, C. Pascual, M.D. del Castillo, Free Rad. Biol.<br />

Med., 18(1995)153.<br />

65


95. A. Ghiselli, M. Serafini, F. Natella, C. Saccini, Free Rad. Biol. Med.,<br />

29(2000)1106.<br />

96. F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini, Free Rad.<br />

Biol. Med., 24(1998)1228.<br />

97. A. Krasowska, D. Rosiak, K. Szkapiak, M. Łukasiewicz, Curr. Topics<br />

Biophys., 24(2000)89.<br />

98. H. Wang. J.A. Joseph, Free Rad. Biol. Med., 27(1999)612.<br />

99. D. Genser, M-H. Kang, H. Vogelsang, I. Elmadta, Europ. J. Clin. Nutrit.,<br />

53(1999)675.<br />

100. E.C. Tsai, I.B. Hirsh, J.D. Brunzell, A. Chait, Diabetes, 43(1994)1010.<br />

101. E. Ali, Zesz. Nauk. Uniw. Jag., Prace Biol. Molek., 11(1985)139.<br />

102. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.<br />

103. L. Ste-Marie, D. Boismenu, L. Vachon, J. Montgomery, Anal. Biochem.,<br />

241(1996)67.<br />

104. R.A. Floyd, J.J. Watson, P.K. Wong, J. Biochem. Biophys. Meth.,<br />

10(1984)221.<br />

105. B.J. Tabner, S. Turnbull, O.M.A. El-Agnaf, D. Allsop, Free Rad. Biol.<br />

Med., 32(2002)1076.<br />

106. B.K. Głód, K.I. Stańczak, A. Woźniak, A. Walendzik, W. Pakszys, CPS:<br />

analchem/0306002.<br />

107. M.M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res., 89(2001)224.<br />

108. S. Chevion, E.M. Berry, N. Kitrossky, R. Kohen, Free Rad. Biol. Med.,<br />

22(1997)411.<br />

109. R. Kohen, E. Vellaichamy, J. Hrbac, I. Gati, O. Tirosh, R. Kohen, Free<br />

Rad. Biol. Med., 28(2000)547.<br />

110. G.L. Ellman, Arch. Biochem, Biophys., 82(1959)70.<br />

111. E. Bald, w The XXVI th Sci. Symp. “Chromatogr. Met. Invest. Org.<br />

Comp.”, Katowice-Szczyrk 5-6.06.2002.<br />

112. C. O'Gara, K. Maddipati, L. Marnett, Chem. Res. Toxicol., 2(1989)295.<br />

113. M. Asensi, J. Sastre, F.V. Pallardo, A. Lloret, M. Lehnor, J.G. Asuction,<br />

Met. Enzymol., 295(1999)267.<br />

114. K.P. Miltor, T. Dzialosynski, S.E. Sanford, J.R. Trevithicle, Curr. Eye<br />

Res., 16(1997)564.<br />

115. A.T. Diplock, Free Rad. Res., 33(2000)521.<br />

116. W.A. Pryor, T. Strickland, D.F. Church, J. Am. Chem. Soc.,<br />

110(1988)2224.<br />

117. T. Doba, G.W. Burton, K.U. Ingold, Biochim. Biophys. Acta,<br />

835(1985)298.<br />

118. G. Cao, H.M. Alessioo, R.G. Cutler, Free Radic. Biol. Med.,<br />

14(1993)303.<br />

119. G. Cao, R.G. Cutler, Arch. Biochem. Biophys., 320(1995)106.<br />

120. K. Głód, K. Stańczak, A. Woźniak, W. Pakszys, Farmac. Pol.,<br />

49(2003)S26-S30.<br />

66


Józef RZEPA<br />

Instytut Chemii, Zakład Chemii Ogólnej i Chromatografii<br />

Uniwersytet Śląski w Katowicach<br />

OZNACZANIE LEKÓW I PESTYCYDÓW<br />

W WODACH POWIERZCHNIOWYCH<br />

WSTĘP<br />

Każdego roku tysiące ton leków są produkowane i następnie zużywane<br />

w medycynie i weterynarii. Znaczna ich część przedostaje się do wód<br />

powierzchniowych w formie niezmienionej. Badania nad obecnością leków<br />

i ich metabolitów prowadzone są od lat 90. XX wieku między innymi w Europie<br />

Zachodniej (Niemcy [2], Grecja, Szwajcaria [3]) oraz Ameryce Południowej<br />

(Brazylia [4]), dotyczyły leków stosowanych w medycynie i weterynarii. [5]<br />

Głównym źródłem zanieczyszczeń środowiska wodnego farmaceutykami są<br />

gospodarstwa domowe oraz szpitale. [6] Leki zażywane przez chorych nie<br />

ulegają całkowicie metabolizmowi w ich organizmach i wraz z moczem lub<br />

kałem trafiają do systemu kanalizacji, a stamtąd kierowane są do oczyszczalni<br />

ścieków. Oprócz gospodarstw i szpitali źródłami zanieczyszczeń są<br />

również zakłady farmaceutyczne, a także farmy zwierząt hodowlanych,<br />

gdzie profilaktycznie podaje się w paszy antybiotyki i bakteriostatyki (sulfonamidy),<br />

aby uchronić zwierzęta hodowlane przed ewentualnymi infekcjami.<br />

[3] Farmaceutyki, które wraz ze ściekami przedostają się do miejskich<br />

oczyszczalni ścieków, nie są całkowicie usuwane w procesach biologicznego<br />

oczyszczania. [2], [4]<br />

Ze względu na swoje właściwości farmaceutyki nie są eliminowane<br />

z wód w procesach samooczyszczania, a dodatkowo mają zdolności do kumulacji<br />

w tkankach organizmów wyższych, przez co stanowić mogą bezpośrednie<br />

zagrożenie dla ich zdrowia lub życia. Szerokie, wręcz nadmierne<br />

stosowanie leków przeciwbólowych z grupy fenoksykwasów np. ibuprofenu,<br />

potęgowane jeszcze nachalną reklamą w mediach prowadzi do wzrostu ich<br />

stężenia we wszystkich elementach środowiska.<br />

MIGRACJA LEKÓW W ŚRODOWISKU<br />

Leki odznaczają się dużą polarnością i niską adsorpcją w mule i glebie,<br />

co jest przyczyną coraz większego zanieczyszczenia wód powierzchniowych<br />

i gruntowych. Oczyszczalnie ścieków nie dysponują technologią<br />

umożliwiającą wyeliminowanie zanieczyszczeń tego typu. Każdy środek zanieczyszczający<br />

środowisko musi być sklasyfikowany i umieszczony w normach.<br />

Jest to jeden z powodów rozwoju coraz to czulszych metod analitycz-<br />

67


nych umożliwiających oznaczanie farmaceutyków w wodnych matrycach [8].<br />

Drogi migracji leków w środowisku przedstawia rysunek 1.<br />

Rys. 1. Drogi migracji leków w środowisku [7]<br />

Przedmiotem badań było oznaczanie leków kwaśnych i neutralnych w wodach<br />

powierzchniowych w rzekach zlewni górnej Wisły i górnej Odry, płynących<br />

na obszarze Górnego Śląska.<br />

Ibuprofen<br />

CH 3<br />

OH<br />

CH 3<br />

O<br />

H 3<br />

C<br />

68


Ketoprofen<br />

O<br />

O<br />

OH<br />

CH 3<br />

Naproksen<br />

CH 3<br />

H 3<br />

C<br />

O<br />

OH<br />

O<br />

Karbamazepina i metabolit imminostilben<br />

N H 2<br />

N<br />

O<br />

H<br />

N<br />

Diklofenaki jego metabolit 1,3-dihydro-1-(2,6 dichlorofenylo)indol-2-on<br />

OH<br />

Cl<br />

H<br />

N<br />

Cl<br />

O<br />

Cl<br />

N<br />

O<br />

Cl<br />

W trakcie prowadzonych badań oznaczano także niektóre pestycydy,<br />

które izolowano wraz z oznaczanymi lekami. Były to: triazyny: atrazyna i symazyna,<br />

chlorofenoksykwasy: 2,4-D, MCPA i mekoprop oraz pyretroidy: cypermetryna<br />

i lambdacyhalotryna.<br />

69


W monitoringu wód powierzchniowych, których poziom w punktach poboru<br />

próbek jest zmienny często w szerokim zakresie, konieczna jest znajomość<br />

ilości przepływającej wody lub posiadanie innego punktu odniesienia.<br />

W czasie monitoringu oczyszczalni ścieków stwierdzono, że w wodach zrzutowych<br />

z tych instalacji najbardziej stabilnym zanieczyszczeniem i możliwym<br />

do oznaczania w tej samej procedurze analitycznej, jest kofeina.<br />

RUDA Śl. SIEMIANOWICE PANEWNIKI ŻORY GLIWICE<br />

10000<br />

9000<br />

8000<br />

7000<br />

6000<br />

ng/l<br />

5000<br />

4000<br />

3000<br />

2000<br />

1000<br />

0<br />

I/02<br />

V/02<br />

IX/02<br />

XI/02<br />

I/03<br />

III/03<br />

V/03<br />

VII/03<br />

IX/03<br />

XI/03<br />

I/04<br />

III/04<br />

V/04<br />

VII/04<br />

IX/04<br />

XI/04<br />

I/05<br />

III/05<br />

V/05<br />

VII/05<br />

IX/05<br />

Date<br />

Rys. 2. Zawartość kofeiny w wodach zrzutowych (oczyszczonych) wybranych oczyszczalni<br />

ścieków w latach 2002-2005<br />

Śląsk jest regionem silnie zurbanizowanym i większość ścieków komunalnych<br />

jest oczyszczana. Można więc przyjąć, że ilość kofeiny wprowadzanej<br />

do wód powierzchniowych jest w przybliżeniu stała. Jako wartość odnośnikową<br />

zawartości kofeiny w punkcie poboru przyjęto średnią z 12 oznaczeń<br />

z próbek pobieranych co miesiąc. Wartość ta jest na pewno obarczona<br />

znacznym błędem, ale pozwala na porównanie zawartości leków w wodzie<br />

w wybranych przedziałach czasowych.<br />

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY<br />

Próbki wody pobierano co miesiąc do butelek z ciemnego szkła. Do<br />

próbek dodawano 15 izopropanolu. Następnie próbki sączono i przy użyciu<br />

HCl wyrównywano pH do wartości pH = 4. Wprawdzie najlepsza efektywność<br />

ekstrakcji leków do fazy stałej jest przy pH = 2 (około 88-94%), ale ilość<br />

ekstrahowanej kofeiny jest rzędu zaledwie kilku procent. Przy pH = 4 efektywność<br />

ekstrakcji kofeiny jest 33-35%.<br />

Do ekstrakcji do fazy stałej używano kolumienek 6 ml/100 mg BakerBond<br />

spe C18 Polar Plus (J.T. Baker) kondycjonowanych heksanem 3x3 ml, acetonem<br />

1x3 ml, metanolem 2x3 ml i dejonizowaną wodą 2x3 ml. Ekstrakcję<br />

próbek wody (500-1000 ml) prowadzono pod próżnią z prędkością<br />

8-10 ml/min. Następnie kolumienki przemywano wodą (2x1 ml) i suszono<br />

70


w strumieniu azotu. Anality eluowano mieszaniną metanolu i acetonu (1:1)<br />

– 4x0,5 ml.<br />

Uzyskany ekstrakt odparowywano azotem do sucha i substancje kwaśne estryfikowano<br />

metanolowym roztworem HCl (temp. 60 0 C). W późniejszych badaniach<br />

stosowano silylowanie tych związków odczynnikiem sililującym<br />

BESTFA + TMCS w pirydynie (temp. 60 0 C).<br />

Po przereagowaniu uzupełniano objętość próbki do 0,5 ml i analizowano<br />

chromatograficznie.<br />

WARUNKI ANALIZY CHROMATOGRAFICZNEJ<br />

Analizy prowadzono w chromatografie GC Trace z detektorem masowym<br />

MS Trace Finnigan (ThermoQuest) and autosamplerem CombiPAL (CTC).<br />

Kolumny kapilarne: MDN – 5S 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (Supelco)<br />

DB – 5ms 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm (J&W)<br />

Prekolumna: 3 m x 0.32 mm,Injector: 280 0 C splitless,<br />

Objętość dozowanej próbki: 1 µl. Gaz nośny: hel p = 100 kPa.<br />

Termostat: izotermicznie – 100 0 C (3 min), program: 100 0 C – 280 0 C<br />

(15 0 /min), 280 0 C – 15 min.<br />

Detektor MS: Interface – 280 0 C. Źródło jonów EI: 250 0 C. Energia jonizacji:<br />

70eV,<br />

Analizę ilościową prowadzono z wykorzystaniem techniki pojedynczego jonu<br />

(SIM) charakterystycznego dla oznaczanego związku, pozwalającej na<br />

oznaczenie ich stężenia rzędu kilku ng/l.<br />

WYNIKI BADAŃ<br />

W wynikach przedstawiono jedynie część wyników ilustrujących podstawowe<br />

zaobserwowane prawidłowości. Analizę ilościową prowadzono<br />

w oparciu o kalibrację wykonaną dla wybranych jonów (SIM), charakterystycznych<br />

dla oznaczanego leku czy pestycydu. Na rysunku 3 przedstawiono<br />

chromatogram (TIC) ekstraktu próbki wody i chromatogramy SIM wybranych<br />

jonów ibuprofenu.<br />

71


RT: 4.01 - 19.97<br />

Intensity<br />

Intensity<br />

100<br />

50<br />

0<br />

80000<br />

60000<br />

40000<br />

20000<br />

0<br />

30000<br />

20000<br />

10000<br />

0<br />

4.26 5.25 6.65 7.52<br />

4.26 5.95<br />

4.54 5.83<br />

8.37<br />

8.37<br />

11.59<br />

12.79 16.14 16.55<br />

9.83 11.18<br />

16.75<br />

13.54 15.55<br />

17.87<br />

10.72<br />

8.94<br />

7.52<br />

14.61<br />

6.66 8.84 9.86 11.59 13.36 16.65 17.31 18.37<br />

8.37<br />

7.14<br />

8.73 9.05 11.59 12.41 14.84 15.56 16.67 16.97 19.35<br />

6 8 10 12 14 16 18<br />

Time (min)<br />

NL:<br />

1.05E6<br />

TIC MS<br />

GCZAG02<br />

NL:<br />

8.56E4<br />

m/z=<br />

160.5-161.5<br />

MS GCZAG02<br />

NL:<br />

3.52E4<br />

m/z=<br />

205.5-206.5<br />

MS GCZAG02<br />

Rys. 3. Chromatogram (TIC) próbki wody pobranej z Wisły na wlocie do jeziora Goczałkowickiego<br />

(styczeń 2005), oraz chromatogramy pojedynczych jonów (SIM) m/z=161 i m/z=206,<br />

charakterystycznych dla ibuprofenu<br />

Na wykresach (rysunek 4) przedstawiono wyniki uzyskane w przeciągu czterech<br />

lat dla ibuprofenu, ketoprofenu, diklofenaku i karbamazepiny w wybranych<br />

punktach poboru próbek na Wiśle i jej dopływach. W Największych<br />

ilościach w wodach powierzchniowych występuje ibuprofen – lek przeciwbólowy<br />

dostępny bez recepty i szeroko stosowany. Najistotniejszy jest jednak<br />

fakt, że jego ilość w wodach powierzchniowych wykazuje ciągły wzrost. Największe<br />

przyrosty procentowe obserwowano jednak w przypadku ketoprofenu.<br />

Podobną prawidłowość wykazuje też diklofenak. Karbamazepina jest lekiem<br />

stosowanym pomocniczo w wielu chorobach i jego ilości – najniższe,<br />

nie wykazuje tendencji wzrostu.<br />

72


73


Rys. 4. Maksymalne stężenia wybranych leków w latach 2002-2005 w wybranych punktach poboru<br />

w zlewni rzeki Wisły. Punkty poboru: 1 - Rzeka WISŁA (Strumień), 2 - Rzeka WISŁA<br />

(Goczałkowice), 3 - Rzeka PSZCZYNKA, 4 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Siewierz), 5 - Rzeka<br />

CZ. PRZEMSZA (Przeczyce), 6 - Rzeka CZ. PRZEMSZA (Sosnowiec), 7 - Rzeka RAWA<br />

(ujście), 8 - Rzeka BRYNICA (ujście), 9 - Rzeka B. Przemsza (ujście), 10 - Rzeka<br />

CZ. PRZEMSZA (ujście), 11 - Rzeka WISŁA (Babice)<br />

74


Ciekawą rolę pełnią zbiorniki wodne na rzekach. Stężenie leków na wlocie<br />

rzeki do jeziora jest zdecydowanie wyższe niż na wylocie z jeziora. Następuje<br />

więc istotny spadek stężenia leków w zbiornikach wodnych, choć nie jest<br />

pewne, że ulegają one w nich przemianom chemicznym, czy też jest to efekt<br />

sorpcji na osadach dennych. Na rysunku 5 przedstawiono ten efekt dla ibuprofenu.<br />

Rys. 5. Zawartość ibuprofenu na wlocie i wylocie do jeziora Goczałkowickiego i jeziora<br />

w Przeczycach<br />

Oznaczane pestycydy występują w wodach powierzchniowych okresowo, co<br />

wiąże się z cyklem prac polowych i intensywnością opadów. Na rysunku 6<br />

przedstawiono wyniki monitoringu triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboru<br />

w zlewni Odry. Są to wyniki maksymalne pojawiające się zwykle na<br />

przełomie lata i jesieni. W punktach poboru 7 i 8 widoczny jest efekt znacznego<br />

spadku stężenia oznaczanych pestycydów w wodzie na wylocie z jeziora<br />

Dzierżno. Efekt ten opisano wcześniej także w przypadku oznaczanych<br />

leków. Co charakterystyczne, atrazyna i inne triazyny od wielu lat są wycofane<br />

z użycia w rolnictwie. Ich ciągłą obecność w wodach powierzchniowych<br />

można tłumaczyć trwałością triazyn w środowisku lub, co nie wykluczone,<br />

wykorzystywaniem starych zapasów.<br />

75


Rys. 6. Maksymalne stężenia pestycydów – sumy triazyn i 2,4-D w wybranych punktach poboru<br />

zlewni rzeki Odry. Punkt poboru próbki: 1 - ODRA(granica), 2 - Rzeka RUDA (Żory), 3 - Rzeka<br />

RUDA (ujście do Odry), 4 - Rzeka BIERAWKA (ujście), 5 - Rzeka KLODNICA (Ligota),<br />

6 - Rzeka KŁODNICA (Bielszowice), 7 - Jezioro DZIERZNO (wlot), 8 - Jezioro DZIERZNO<br />

(wylot), 9 - ODRA (Kanał Gliwicki)<br />

76


Stosowana w badaniach procedura analityczna jest pracochłonna, ale pozwoliła<br />

na uzyskanie wiarygodnych wyników. Nie sprawdziły się w badaniach<br />

ekstrakcji do fazy stałej SPE tzw. speediski, pozwalające wprawdzie<br />

na duże skrócenie czasu ekstrakcji spe, ale powodujące duży rozrzut wyników.<br />

Uzyskiwane chromatogramy ekstraktów były często bardzo bogate<br />

i nastręczały kłopoty z pełnym rozdziałem oznaczanych analitów od obecnych<br />

w ekstrakcie zanieczyszczeń. Dlatego zastosowanie detektora masowego<br />

i analiza z wykorzystaniem monitorowania pojedynczego jonu (SIM)<br />

pozwoliła na ominięcie problemów z niecałkowitym rozdziałem składników<br />

próbki.<br />

LITERATURA<br />

1. Rodriguez I., Quintana J.B., Carpinteiro J., Carro A.M., Lorenzo R.A., Cela<br />

R.: „Determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography-mass<br />

spectrometry as tert.-butyldimethylsilyl derivatives”, 2002,<br />

265-274.<br />

2. F. Sacher, F.T. Lange, H.-J. Brauch, J. Blankenhorn, 2001; “Pharmaceuticals<br />

in groundwaters. Analitical methods and results of a monitoring<br />

program in Boden – Württemberg, Germany”; Journal of Chromatography<br />

A, Vol. 938, pp. 199-210.<br />

3. V.Koutsouba, Th. Heberer, B. Fuhrmann, K. Schmidt-Baumler, D. Tsipi,<br />

A. Hiskia, 2003; “Determination of polar pharmaceuticals in sewage water<br />

of Greece by gas – chromatography – mass spectrometry”; Chemosphere,<br />

Vol. 51, pp. 69-75.<br />

4. M. Stumpf, T. Ternes, R.-D. Wilken, S.V. Rodrigues, W. Bauman, 1999;<br />

“Polar drug residues in sewage I natural waters in the state of Rio dr Janerio,<br />

Brazil”; Science of Total Environment, Vol. 225, pp. 135-141.<br />

5. M.A. Soliman, J.A. Pedersen, J.H. Suffet, 2004; “Rapid gas chromatography<br />

– mass spectrometry screening method for human pharmaceuticals,<br />

hormones, antioxidants and plasticizers in water”; Journal of Chromatography<br />

A, Vol. 1029, pp. 223-237.<br />

6. S. Weigel, U. Berger, E. Jensen, R. Kallenborn, H. Thoresen, H. Hühnerfuss,<br />

2004; “Determination of selected pharmaceuticals and caffeine in<br />

sewage and seawater from Tromsø/Norway with emphasis on ibuprofen<br />

and its metabolites”; Chemosphere, Vol. 56, pp 583-592.<br />

7. Ternes Th.A., Occurrence of drugs in German sewage treatment plants<br />

and rivers. Water research. 1998, 32, 3245-3260.<br />

77


78


Marian KAMIŃSKI<br />

Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny, 80-233 Gdańsk, ul. Narutowicza 11/12,<br />

e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl.; tel: 601-40-18-24, (058) 347-17-29<br />

PREPARATYWNA I PROCESOWA<br />

CHROMATOGRAFIA CIECZOWA<br />

WPROWADZENIE<br />

Niniejszy artykuł monograficzny został pomyślany jako swego rodzaju<br />

podręcznik i przewodnik optymalnego stosowania kolumnowej elucyjnej<br />

chromatografii cieczowej w skali preparatywnej lub procesowej do rozdzielania<br />

mieszanin substancji, lub grup substancji. Może też być pomocny w pracach<br />

nad optymalizacją warunków preparatywnego stosowania kolumnowej<br />

elucyjnej chromatografii gazowej oraz z eluentem nadkrytycznym, ponieważ<br />

wiele ogólnych reguł jest wspólnych dla optymalnego stosowania wszystkich<br />

technik chromatografii w skali preparatywnej. Oczywiście, chromatografia<br />

gazowa, lub z eluentem nadkrytycznym, tak w skali analitycznej, jak i preparatywnej<br />

posiada wiele specyficznych cech i właściwości. Stąd tylko niektóre<br />

z opisanych dalej zasad optymalnego stosowania preparatywnej i procesowej<br />

chromatografii cieczowej jest wspólnych dla innych technik preparatywnego<br />

stosowania chromatografii.<br />

Chromatografia w sprzężeniu z detekcją to niezastąpione techniki<br />

analityczne o ogromnym i ciągle rosnącym zakresie zastosowań. Przede<br />

wszystkim, jednak, jest to ważna grupa technik rozdzielania, które mogą służyć<br />

do otrzymywania użytkowych ilości czystych substancji ze złożonych<br />

mieszanin. Istnieją takie problemy separacyjne, których rozwiązanie jest dotychczas<br />

możliwe tylko z wykorzystaniem chromatografii. Wówczas chromatografia<br />

jest niezastąpiona. Istnieje wiele innych problemów rozdzielczych,<br />

które można „rozwiązać” innymi technikami rozdzielania, takimi jak, ekstrakcja<br />

przeciwprądowa, metody strącania, membranowe i inne oraz ich kombinacje.<br />

Często okazuje się, że chromatografia jest bardziej efektywną od innych,<br />

techniką uzyskania użytkowych ilości substancji. Jest tak nie tylko<br />

wtedy, gdy można zastosować warunki symulacji przemieszczania złoża<br />

(Simulated Moving Bed) i otrzymywać produkt w sposób ciągły, ale także,<br />

w przypadku periodycznego wykorzystywania tej techniki rozdzielania.<br />

Należy na wstępie podkreślić, że proces rozdzielania i otrzymywania<br />

substancji czystych, z wykorzystaniem chromatografii, jest tym bardziej efektywny,<br />

im wyższa jest selektywność zastosowanego układu rozdzielczego,<br />

a w przypadku chromatografii cieczowej, im mniejsze zapewni się straty eluentu,<br />

tzn., im większy będzie stopień zawracanie eluentu do ponownego<br />

rozdzielania. Stąd, m.in., należy unikać stosowania warunków elucji gradientowej<br />

w przypadku wykorzystywania chromatografii cieczowej do otrzymy-<br />

79


wania substancji, zwłaszcza, w skali procesowej, ponieważ to zawsze podraża<br />

łączne koszty.<br />

Warto też zwrócić uwagę, że doświadczenia ostatnich lat wykazały, iż<br />

szczególnie efektywną ekonomicznie techniką rozdzielania i otrzymywania<br />

substancji w skali preparatywnej i procesowej jest chromatografia z eluentem<br />

nadkrytycznym (P-SFC). Jednakże, można tą techniką rozdzielać tylko<br />

substancje trwałe termicznie oraz nisko i średnio polarne. Rozdzielanie substancji<br />

wysoko polarnych napotyka na trudności związane z koniecznością<br />

stosowania polarnego modyfikatora cieczy nadkrytycznej.<br />

W konsekwencji chromatografia cieczowa w skali preparatywnej lub<br />

procesowej (P-LC, albo P-HPLC) jest obecnie powszechnie i szeroko stosowaną<br />

techniką rozdzielania i otrzymywania czystych substancji i to nie tylko<br />

w laboratoriach, do uzyskiwania wzorców i niewielkich ilości określonych<br />

związków chemicznych dla mikrosyntez, czy zbadania właściwości nowo odkrytych<br />

lub zsyntetyzowanych indywiduów chemicznych, ale także w skali<br />

procesowej, do produkcji, np., insuliny, antybiotyków peptydowych, hormonów,<br />

glikozydów i innych substancji aktywnych biologicznie, w tym, leków itp.<br />

GŁÓWNE OBSZARY ZASTOSOWAŃ CHROMATOGRAFII W SKALI<br />

PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />

Chromatografia w zastosowaniu do otrzymywania czystych substancji<br />

ma dwie nazwy:<br />

- chromatografia preparatywna, gdy ilości otrzymywanych substancji są<br />

niewielkie i otrzymywanie ma charakter sporadyczny;<br />

- chromatografia procesowa (produkcyjna, przemysłowa), gdy proces prowadzony<br />

jest systematycznie, w sposób cykliczny lub ciągły, a ilość produktu<br />

jest znacznie większa (np. otrzymywanie leku, produktu handlowego itp.).<br />

Od początku stosowania chromatografii technika ta była wykorzystywana<br />

dwukierunkowo: jako technika analityczna i jako sposób na wydzielenie<br />

z mieszaniny interesującego składnika (lub składników) mieszaniny.<br />

Przez wiele lat, w okresie poprzedzającym automatyzację i mikroprocesory,<br />

detekcja, analityka ilościowa, a także preparatyka, z zastosowaniem chromatografii<br />

cieczowej, opierała się na stosowaniu szklanej kolumny, wypełnionej<br />

sorbentem i zbieraniu kolejnych frakcji eluatu, ich analizie typowymi<br />

technikami analitycznymi, np. spektrofotometrycznie, czy refraktometrią.<br />

Analityk musiał często użyć do analizy całą ilość wydzielonej substancji,<br />

szczególnie, w przypadku wykonywania analizy śladowej, albo wydzielania<br />

składników występujących w bardzo niskich zawartościach. Im lepsze uzyskiwał<br />

rozdzielenie od składników towarzyszących, tym wynik był bardziej<br />

rzetelny. Na tym etapie rozwoju chromatografii granica pomiędzy chromatografią,<br />

jako techniką analityczną, czy służącą do otrzymywania czystych<br />

substancji nie była wyraźna. Wprowadzenie detektorów przepływowych i rejestratorów,<br />

a później komputerów, wyraźnie rozdzieliło te dwa obszary zastosowań<br />

chromatografii.<br />

80


W chromatografii analitycznej celem jest uzyskanie rozdzielenia interesujących<br />

(czasem wszystkich) substancji w jak najkrótszym czasie, z rozdzielczością<br />

R = ok. 1. Dąży się do zmniejszenia skali procesu i oszczędności<br />

drogich składników eluentu przez zmniejszenie wymiarów kolumny,<br />

zwłaszcza średnicy, dbając równocześnie o jak najwyższą sprawność rozdzielania.<br />

Stosuje się niewielkie objętości roztworu dozowanej mieszaniny,<br />

by obniżyć do minimum tzw. rozmycie poza-kolumnowe. Ze względu na wysoką<br />

czułość współczesnych detektorów ilość dozowanej próbki może być<br />

bardzo mała (poza przypadkami analityki śladowej) i eluat traktowany jest<br />

jako ściek, który zostaje poddany utylizacji.<br />

W skali preparatywnej, lub procesowej stosuje się, natomiast, kolumny<br />

o dużych średnicach i wysokie natężenia przepływu eluentu.<br />

Chromatografia w zastosowaniu preparatywnym jest powszechnie<br />

uważana za szczególnie efektywną technikę rozdzielania wieloskładnikowych<br />

mieszanin w celu otrzymywanie czystych substancji do zastosowań<br />

badawczych lub mikrosyntez, gdy problem rozdzielczy należy do trudnych,<br />

lub bardzo trudnych, gdy możliwy do osiągnięcia współczynnik rozdzielenia<br />

interesującej nas substancji i pasm towarzyszących jest niższy od 1.05.<br />

Również, w skali procesowej znajduje coraz więcej zastosowań do otrzymywania<br />

substancji w ilości nawet do kilkudziesięciu kilogramów na dobę.<br />

Szczególnie, w nowoczesnym przemyśle farmaceutycznym można dzisiaj<br />

spotkać hale produkcyjne, gdzie znajdują się, wyłącznie, kolumny chromatograficzne<br />

i ich oprzyrządowanie w postaci pomp eluentu, pomp dozujących<br />

wsad, zbiorników, kolektorów frakcji, urządzeń do wzbogacania frakcji eluatu<br />

w postaci odparowywaczy próżniowych, lub membranowych wymienników<br />

masy oraz urządzeń do izolacji substancji w postaci krystalicznej z frakcji<br />

eluatu.<br />

Najważniejsze dziedziny preparatywnych i procesowych zastosowań<br />

chromatografii to:<br />

- izolacja produktów biotechnologii, szczególnie białek i enzymów, polisacharydów,<br />

fosfolipidów, określonych fragmentów DNA, lub RNA itp.;<br />

- izolacja produktów naturalnych pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego,<br />

- izolacja produktów oraz zanieczyszczeń powstałych podczas syntezy leków<br />

(farmaceutyków, składników kosmetyków itp.),<br />

- izolacja lantanowców i transuranowców,<br />

- izolacja użytkowych ilości substancji do badań i mikrosyntez w zakresie<br />

chemii organicznej, biochemii, mikrobiologii itp.,<br />

- izolacja izomerów optycznych.<br />

TECHNIKI I MECHANIZMY CHROMATOGRAFII UŻYWANE<br />

W ZASTOSOWANIACH PREPARATYWNYCH ORAZ NAJWAŻNIEJSZE<br />

ZASADY POWIĘKSZANIA SKALI ROZDZIELANIA<br />

Techniki chromatograficzne stosowane w skali preparatywnej i procesowej to:<br />

- Kolumnowa, elucyjna chromatografia cieczowa (P-LC, lub P-HPLC) – największy<br />

zakres preparatywnych i procesowych zastosowań chromatografii,<br />

81


- Kolumnowa, elucyjna chromatografia gazowa (P-GC) – zastosowania<br />

głównie do izolacji substancji zapachowych i składników olejków eterycznych,<br />

- Kolumnowa, elucyjna chromatografia z fazą ruchomą w stanie nadkrytycznym<br />

(P-SFC), najbardziej efektywna ekonomicznie domena zastosowań<br />

chromatografii preparatywnej i procesowej, ale wiąże sie z wieloma<br />

trudnościami metodycznymi i technicznymi,<br />

- „Flush Chromatography” (F-LC) – technika podobna do cienkowarstwowej,<br />

ale realizowana w kolumnie, wypełnionej niezwilżonym sorbentem,<br />

z wykorzystaniem wymuszonego, albo niewymuszonego przepływu eluentu,<br />

- Planarna (cienkowarstwowa) preparatywna chromatografia cieczowa<br />

(P-TLC), przydatna do otrzymywania bardzo niewielkich ilości substancji.<br />

Do celów preparatywnych wykorzystywane są wszystkie poznane<br />

chromatograficzne mechanizmy rozdzielcze i wszystkie znane układy chromatograficzne.<br />

Wykorzystuje się chromatografię adsorpcyjną w układzie faz<br />

normalnych (NP) i odwróconych (RP), chromatografię oddziaływań hydrofilowych<br />

(HILIC), chromatografię jonowymienną (IEC), mechanizmy sita molekularnego<br />

i sączenia molekularnego (GPC/SEC), chromatografię powinowactwa<br />

(AC), mechanizm oddziaływań hydrofobowych (HIC) itd.<br />

Wykorzystuje się te same rodzaje wypełnienia kolumny, jak w chromatografii<br />

analitycznej, ale najczęściej o nieco większych ziarnach oraz jednorazowo<br />

dozuje możliwie jak największą ilość mieszaniny komponentów do<br />

kolumny, w przeliczeniu na masę wypełnienia, tzn., dąży się do uzyskiwania<br />

maksymalnego, możliwy do zastosowania stopnia przeładowania kolumny<br />

(sorbentu). To warunkuje jak najwyższą wydajność otrzymywania substancji.<br />

Na rys. 1 zamieszczono przykłady chromatogramów, uzyskanych<br />

z zastosowaniem kolumn analitycznych, pełniących w tym przypadku funkcję<br />

kolumn modelowych, otrzymane, w warunkach braku przeładowania kolumny<br />

oraz w warunkach różnego stopnia przeładowania stężeniowego, albo<br />

objętościowego, w układach faz odwróconych i normalnych. Warunki rozdzielania<br />

oraz masy substancji w roztworach dozowanych do kolumny<br />

podano w opisie rysunku.<br />

W komentarzu do tego rysunku warto dodać, że szczególne korzyści w zastosowaniach<br />

preparatywnych, daje stosowanie warunków dynamicznie generowanej<br />

fazy stacjonarnej w układach faz normalnych, tzn., z zastosowanie<br />

np. porowatego żelu krzemionkowego, jako sorbentu i mieszaniny<br />

nierozpuszczalnego w wodzie nisko polarnego rozpuszczalnika organicznego<br />

(chlorku metylenu, etylenu, chloroformu, eteru di-etylowego, MTBE, octanu<br />

metylu, etylu itp.), w mieszaninie z niewielką ilością rozpuszczalnika polarnego,<br />

rozpuszczalnego w wodzie (metanolu, etanolu, acetonitrylu,<br />

dioksanu itp.) oraz z niewielkim dodatkiem wody do eluentu - o stężeniu bliskim<br />

stężeniu nasycenia, ale nieco niższym. Takie warunki są bardzo przydatne<br />

do rozdzielania glikozydów, alkaloidów itp. substancji (patrz chromatogramy<br />

na rys. 1 a i a’) i są szczególnie korzystne, pod względem<br />

maksymalizacji produktywności kolumny.<br />

82


Rys. 1. Zestawienie typowych chromatogramów, ilustrujących różne warunki rozdzielania mieszanin tych samych substancji bez i w warunkach<br />

przeładowania kolumny, otrzymane z zastosowaniem kolumnowej elucyjnej chromatografii cieczowej w skali modelowej oraz<br />

w warunkach liniowej odpowiedzi detektora – praca nad doborem optymalnych warunków rozdzielania. Szczegółowy opis rysunku na kolejnej<br />

stronie<br />

83


Przykłady a, a’, b, b’, c, c’ dotyczą optymalnych warunków rozdzielania z przeładowaniem stężeniowym,<br />

natomiast, przykłady d – f dotyczą rozdzielania substancji w niekorzystnych układach<br />

chromatograficznych lub w warunkach znikomej rozpuszczalności w eluencie (konieczne<br />

stosowanie przeładowania objętościowego).<br />

a, a’ – rozdzielanie lanatozydów A (LA), B (LB), C (LC) z odpadu poprodukcyjnego, powstałego<br />

podczas otrzymywania lanatozydu C z zastosowaniem ekstrakcji p-prądowej. Przykład wykorzystywania<br />

chromatografii podziałowej z dynamicznie generowaną fazą stacjonarną dla rutynowego<br />

otrzymywania substancji. a: ⎯⎯ warunki przeładowania (2·10 -3 g mix /g morb ); - - - warunki<br />

braku przeładowania („analityczne”); a’: warunki dolnej granicy przeładowania stężeniowego<br />

(2·10 -3 g mix /g morb );<br />

Warunki chromatogr.: kolumna 800x6 mm i.d., Kieselgel SI 60 40-63 um (Merck), eluent:<br />

CH 2 Cl 2 :CH 3 OH:H 2 O 92:8:0,2 V/V, w = 5 ml/min, detektor UV-254 (KABiD), czułość –<br />

1,28 AU/FS (oprócz - - -: 0,08 AU/FS).<br />

b, b’ – rozdzielanie „modelowej” mieszaniny o (oNA), m (mNA), p (pNA)-nitroaniliny w warunkach<br />

chromatografii adsorpcyjnej; b: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego<br />

(6·10 -3 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (6·10 -3 g mix /g morb ), b’: warunki dolnej granicy przeładowania<br />

(2·10 -3 g mix /g morb );<br />

Warunki chromatograficzne: kolumna 100x4 mm i.d., Lichrosorb SI 60 5 um, eluent: n-heptan –<br />

dioksan 8:2 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm (Knauer), długość drogi optycznej 0,4 mm, czułość<br />

– b: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, b’: 0,16 AU/FS.<br />

c, c’: rozdzielanie modelowej mieszaniny estrów CH 3 -, C 2 H 5 -, C 3 H 7 -kwasu 40H benzoesowego<br />

w układzie faz odwróconych (RP18); c: ⎯⎯ warunki przeładowania stężeniowego<br />

(10 -2 g mix /g morb ), - - - warunki „analityczne” (10 -5 g mix /g morb ); c’: warunki dolnej granicy przeładowania<br />

stężeniowego (2x10 -4<br />

g mix /g morb ); Warunki chromatograficzne: kolumna 120x4 mm i.d.,<br />

Nucleosil RP18 7 um, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 1 ml/min, detektor UV 280 nm, długość<br />

drogi opt. 0,4 mm (Knauer), czułość - c: ⎯⎯ 2,56 AU/FS, - - - 0,08 AU/FS, c’: 0,32 AU/FS.<br />

d – rozdzielanie estrów kwasu 4-OH benzoesowego: C 3 H 7 - (1), C 2 H 5 - (2), CH 3 - (3) w układzie<br />

faz normalnych na żelu krzemionkowym Lichrosorb SI 60 5 um – kolumna 250x4 mm i.d., eluent:<br />

heptan – dioksan 8:2 V/V, 2 ml/min, 256 nm; ⎯⎯ warunki granicy przeładowania stężeniowego,<br />

- - - warunki „analityczne”;<br />

e, f – rozdzielanie o, m, p – nitroaniliny (patrz rys. 1b, b’) w układzie faz odwróconych: Nucleosil<br />

C18 7 μm, kolumna 120x4 mm, eluent: CH 3 OH - H 2 O 1:1 V/V, 2 ml/min, e – warunki granicy<br />

przeładowania stężeniowego, f – warunki „analityczne”;<br />

g – rozdzielanie benzenu (c i = 2 mg/ml, pik 1) i naftalenu (c i = 0,2 mg/ml, pik 2) w warunkach<br />

znikomej rozpuszczalności substancji w eluencie: ⎯⎯ obj. dozowania 2 ml, warunki typowego<br />

przeładowania objętościowego, - - - obj. dozow. 20 μm warunki „analityczne”; kolumna: Nucleosil<br />

C18 7 μm, 250x4 mm i.d., 1 ml/min; W przypadku chromatogramów d-f detektor UV<br />

254 nm, droga opt. 0,4 mm.<br />

Najczęściej optymalne warunki rozdzielania w skali preparatywnej,<br />

a szczególnie w skali procesowej dobiera się z zastosowaniem kolumny<br />

modelowej. Dotyczy to doboru selektywności układu chromatograficznego,<br />

sprawności rozdzielania - wielkość ziaren wypełnienia, długości kolumny,<br />

prędkości przepływu eluentu, możliwego do osiągnięcia stopnia przeładowania<br />

sorbentu oraz położenia na chromatogramie punktów zbierania frakcji<br />

itp. parametrów decydujących o efektywności rozdzielania i zbierania frakcji<br />

eluatu oraz o czystości otrzymywanego produktu. Funkcję kolumny modelowej<br />

pełni często kolumna analityczna, albo semi-preparatywna o średnicy<br />

dc = 4 - 8 mm, jednak, nie jest to optymalne, ponieważ kolumna modelowa<br />

powinna być wypełniona nie tylko tego samego typu sorbentem, jak preparatywna,<br />

ale tym samym sorbentem, także w zakresie wielkości ziaren oraz<br />

powinna być tej samej długości, jak kolumna preparatywna, albo procesowa.<br />

Następnie można w sposób bardzo prosty dokonać powiększenia skali roz-<br />

84


dzielania, przechodząc do stosowania kolumny o odpowiednio większej<br />

średnicy, nie zmieniając ani sorbentu, ani długości kolumny. Średnicę kolumny<br />

preparatywnej, konieczną do uzyskania potrzebnej wydajności rozdzielania,<br />

oblicza się wówczas, zakładając odpowiednie zwiększenie objętości<br />

dozowanej mieszaniny substancji rozdzielanych oraz natężenia<br />

przepływu eluentu, proporcjonalnie do stopnia zwiększenia pola przekroju<br />

poprzecznego wypełnienia kolumny preparatywnej lub procesowej i modelowej.<br />

Na rys. 2 naszkicowano schematycznie opisaną powyżej zasadę postępowania<br />

w związku z doborem optymalnych warunków rozdzielania substancji<br />

w skali preparatywnej, albo procesowej.<br />

Rys. 2. Ilustracja dwuetapowego postępowania podczas powiększania skali procesu rozdzielania<br />

w celu otrzymywania substancji metodami chromatografii w skali preparatywnej lub procesowej.<br />

M – skala modelowa rozdzielania, P – skala preparatywna i procesowa rozdzielania<br />

Warto też zwrócić uwagę, że w prawie wszystkich w/w domenach zastosowań<br />

chromatografii - szczególnie, gdy trzeba rozdzielać tylko dwie<br />

substancje i gdy nie jest konieczne stosowanie elucji gradientowej - jest<br />

możliwe wykonywanie rozdzielania w warunkach procesu ciągłego (SMB).<br />

Polega on na równoczesnej pracy ośmiu do kilkunastu kolumn, z odpowiednim<br />

przesunięciem fazy rozdzielania w każdej z nich. Roztwór rozdzielanych<br />

substancji („wsad”) i eluent („ekstrahent”), wprowadza się w sposób ciągły<br />

oraz w sposób ciągły odbiera się składnik A (o niższej retencji – „ekstrakt)<br />

i składnik B (o wyższej retencji – „rafinat”). Odpowiednie miejsca doprowadzania<br />

/ odbioru w/w strumieni są okresowo zmieniane przez odpowiedni<br />

system sterowania komputerowego. W konsekwencji frakcje eluentu, zawierające<br />

poszczególne rozdzielane substancje są zbierane bez przerwy. W takich<br />

przypadkach okazuje się, że chromatografia może być najbardziej opłacalna<br />

ekonomicznie ze wszystkich technik rozdzielania, możliwych<br />

potencjalnie do stosowania.<br />

85


ZJAWISKA PRZEŁADOWANIA KOLUMNY (POWIERZCHNI<br />

SORPCYJNEJ) I ICH EFEKTYWNE WYKORZYSTANIE W WARUNKACH<br />

CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />

Różnica warunków preparatywnych, w porównaniu do warunków<br />

chromatografii analitycznej, polega na konieczności wykorzystania w maksymalnym<br />

stopniu powierzchni sorpcyjnej, lub fazy stacjonarnej. Im wyższy<br />

udaje się osiągnąć stopień przeładowania kolumny, tym bardziej efektywny<br />

ekonomicznie jest proces rozdzielczy. Przy czym, rozdzielanie jest szczególnie<br />

efektywne, gdy można uzyskać warunki silnego przeładowania stężeniowego<br />

kolumny. Istnieje wówczas możliwość rozdzielania jednorazowo do<br />

ok. 10 -2 g mieszaniny rozdzielanych substancji / g sorbentu typu żel krzemionkowy<br />

lub chemicznie modyfikowany żel krzemionkowy i uzyskiwanie<br />

produktu o czystości powyżej 99.99 %. Może to, jednak, mieć miejsce tylko<br />

wtedy, gdy rozpuszczalność rozdzielanych substancji w eluencie jest dostatecznie<br />

wysoka oraz, gdy kolumna o wysokiej sprawności (wysokiej liczbie<br />

półek teoretycznych), wypełniona techniką zawiesinową na mokro, albo na<br />

mokro - techniką dynamicznej kompresji aksjalnej (DAC), jest wykorzystywana<br />

w warunkach „niekończonej średnicy). Wówczas piki chromatograficzne<br />

są kształtu zbliżonego do trójkąta prostokątnego, którego prawy dolny<br />

wierzchołek leży w punkcie retencji, jaka by została uzyskana w warunkach<br />

braku przeładowania (analitycznych - patrz rys. 1 a, b, c).<br />

W przypadku niskiej rozpuszczalności rozdzielanych substancji w eluencie<br />

możliwe jest uzyskanie jedynie przeładowania objętościowego. Nie<br />

można wówczas osiągnąć tak wysokiej efektywności ekonomicznej rozdzielania<br />

– teoretycznie, nawet 50 razy mniejszą, niż w warunkach przeładowania<br />

stężeniowego. Piki chromatograficzne mają, wówczas, kształt zbliżony<br />

do prostokąta, co jest spowodowane koniecznością dozowania dużych objętości<br />

roztworu substancji rozdzielanych o stosunkowo niskim stężeniu (patrz<br />

rys. 1g).<br />

W przypadku trudnych, lub bardzo trudnych problemów separacyjnych<br />

(współczynnik selektywności α zbliżony do 1.01), Dąży się również do prowadzenia<br />

rozdzielania w warunkach przeładowania kolumny, lecz w praktyce<br />

konieczne jest poprzestanie na dozowaniu jednorazowo do kolumny tylko<br />

takiej ilości mieszaniny substancji rozdzielanych, aby nie przekraczać granicy<br />

liniowości odpowiedniej izotermy sorpcji (w praktyce do ok. 5.10 -4 g/g sorbentu<br />

typu żel krzemionkowy i fazy stacjonarne związane do powierzchni żelu<br />

krzemionkowego). W przeciwnym razie strefy rozdzielanych substancji<br />

nakładają się na siebie wzajemnie i czystość rozdzielanych substancji będzie<br />

niewielka. Wówczas efektywność ekonomiczna separacji też pozostaje<br />

niewielka (patrz rys. 1 d, e).<br />

Opisane powyżej reguły mają bezpośredni związek ze zjawiskami<br />

sorpcji substancji rozdzielanych na powierzchni wypełnienia kolumny i z rodzajem<br />

izotermy sorpcji. Najczęściej izoterma sorpcji ma w warunkach<br />

chromatografii, w tym, cieczowej - charakter izotermy Langmuira, Zdarzają<br />

się też bardzo korzystne dla wydajności rozdzielania, przypadki, sorpcji wie-<br />

86


lowarstwowej, gdy charakter izotermy sorpcji jest wklęsły (typu „S”). Na<br />

rys. 3. zamieszczono zestawienie różnych warunków rozdzielania, wykorzystywanych<br />

w chromatografii preparatywnej przy niewielkim i znacznym stopniu<br />

przeładowania kolumny oraz rodzaje spotykanych izoterm sorpcji i związek<br />

zakresu stężenia w roztworze dozowanym do kolumny z zakresem<br />

izotermy sorpcji oraz kształtem pików i zmianą retencji substancji w porównaniu<br />

do warunków braku przeładowania (warunków „analitycznych”).<br />

W podpisie pod rysunkiem zamieszczono dodatkowe wyjaśnienia.<br />

Rys. 3.<br />

Część I: Zestawienie form pików chromatograficznych dla pojedynczej substancji eluowanej<br />

w kolumnie chromatograficznej, w zależności od typu przeładowania kolumny (po lewej stronie<br />

cyfr odniesienia naszkicowano profile stężenia w chwili dozowania roztworu substancji eluowanej<br />

do kolumny).<br />

Oznaczenia: 1 – brak przeładowania kolumny, 2 – dolna granica przeładowania danego typu,<br />

3 – typowy przykład przeładowania danego typu;<br />

Część II: Kształty i zakresy izoterm sorpcji odpowiednie dla pików chromatograficznych zamieszczonych<br />

powyżej (linią pogrubioną zaznaczono zakresy izoterm sorpcji charakterystyczne<br />

dla danego typu przeładowania kolumny);<br />

Część III: Zestawienie charakteru typowych chromatogramów otrzymanych w przypadku rozdzielania<br />

dwóch substancji w warunkach danego typu przeładowania kolumny, odpowiednio:<br />

z zachowaniem warunku Rs=1 (środka części fragmentu III – piki rozdzielane praktycznie do<br />

poziomu linii bazowej) i po zwiększeniu ilości substancji wprowadzonej do kolumny (piki częściowo<br />

„nałożone” wzajemnie). W górnym fragmencie cz.III naszkicowano odpowiednie chromatogramy<br />

otrzymane w warunkach braku przeładowania (tzw. „warunkach analitycznych”);<br />

87


ZASADY OPTYMALNEGO STOSOWANIA PREPARATYWNEJ<br />

I PROCESOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ<br />

Parametry opisujące wydajność i produktywność kolumny<br />

Wydajność kolumny definiuje się jako masę interesującej nas substancji,<br />

otrzymywaną w jednostce czasu (1):<br />

R h = Q r / t c (1)<br />

Produktywność kolumny w chromatografii preparatywnej i procesowej<br />

jest definiowana najogólniej w ten sposób, że jest obliczana da jednostki<br />

przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny (2). To pozwala porównywać<br />

efektywność rozdzielania tych samych substancji z zastosowaniem kolumn<br />

o różnych wymiarach, a wartość maksymalna oznacza optimum generalne.<br />

W każdym przypadku obliczenia oraz porównywanie wyników jest wykonywane<br />

dla warunków otrzymywania produktu o takiej samej czystości:<br />

P t<br />

Q<br />

Q<br />

r<br />

*<br />

i<br />

Qi<br />

t A<br />

= [<br />

c<br />

kg<br />

2<br />

h * m<br />

] (2)<br />

P t - wydajność wyrażona jako masa substancji otrzymana w ciągu jednostki<br />

czasu i dla<br />

jednostki powierzchni przekroju kolumny;<br />

Q i - masa substancji wprowadzona do kolumny;<br />

Q r - masa substancji o czystości (p) , otrzymana z kolumny;<br />

t c - czas trwania procesu rozdzielania (w warunkach repetycyjnego dozowania<br />

– czas trwania jednego etapu rozdzielania);<br />

A - powierzchnia przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny A = Πd c 2 /4 ;<br />

Wyrażenie<br />

Q<br />

Q<br />

r<br />

i<br />

nazwane jest stopniem odzysku.<br />

Przedstawione wyrażenia uwzględnia stronę „korzyści”. Do strony<br />

„koszty”, należą koszty związane ze bezpowrotnym zużyciem składników<br />

eluentu (jeśli ma miejsce), usuwaniem składników eluentu z frakcji eluatu<br />

i odzyskiem eluentu, cena kolumny i urządzeń pomocniczych, koszty robocizny<br />

itd.<br />

Optymalne przeładowanie kolumny w warunkach pracy preparatywnej<br />

jest najczęściej takie, aby wartość R między izolowaną substancją, a najbliższymi<br />

„zanieczyszczeniami”, widocznymi na chromatogramie wynosiła ok. 1.<br />

W warunkach rozdzielania procesowego korzystne jest stosowanie wyższego<br />

stopnia przeładowania, utrzymując R na optymalnym poziomie (często<br />

ok. 0.75) i „wycinając” oraz zawracając do ponownego rozdzielania, odpo-<br />

88


wiednie między-frakcje. Trzeba dodać, że eksperymentalne określenie<br />

optymalnej wartości R oraz punktów zbierania frakcji, zapewniających<br />

otrzymanie maksymalnej produktywności kolumny i wymaganej czystości<br />

produktu jest bardzo pracochłonne. Jeżeli nie dysponujemy odpowiednim<br />

poprawnym komputerowym modelem rozdzielania, warto to wykonać doświadczalne<br />

tylko wtedy, gdy optymalizuje się przeładowanie kolumny i zbieranie<br />

frakcji dla warunków procesowego rozdzielania i dla produkcji substancji.<br />

Dla sporadycznego wykonywania rozdzielania preparatywnego,<br />

znacznie bardziej celowe jest jednorazowe dozowanie takiej objętości możliwie<br />

stężonej mieszaniny substancji, by otrzymywać R ok. 1 i zbierać cały<br />

zakres pików interesujących nas substancji widocznych na chromatogramie.<br />

Zasadę doboru optymalnej ilości jednorazowo dozowanej do kolumny<br />

mieszaniny substancji w warunkach chromatografii preparatywnej, albo procesowej<br />

zilustrowano na rys. 4.<br />

Do parametrów, które mają istotny wpływ na wydajność preparatywnego,<br />

albo procesowego rozdzielania należą: ilość dozowanej substancji<br />

(Vi * Ci), średnica kolumny (dc), długość wypełnienia kolumny (Lc), natężenie<br />

przepływu eluentu (w), powierzchnia właściwa materiału stanowiącego<br />

wypełnienie kolumny (F), wielkość ziaren wypełnienia (dp), wartość współczynnika<br />

retencji substancji izolowanej (ki) i współczynnika retencji ostatniego<br />

piku (kn). Wpływ każdego z tych parametrów na wydajność rozdzielania<br />

wymaga oddzielnego omówienia.<br />

Ilość dozowanej substancji<br />

Ilość dozowanej substancji (m i ) określona jest iloczynem objętości (V i )<br />

i stężenia izolowanej substancji (c i ):<br />

m i = V i * c i (3)<br />

Rys. 4. Ilustracja zasady określania ilości substancji dozowanych jednorazowo do kolumny oraz<br />

wyznaczania punktów zbierania frakcji w warunkach chromatografii procesowej<br />

89


- przeładowanie objętościowe<br />

W chromatografii analitycznej próbka jest dozowana w taki sposób,<br />

aby ze wzrostem dozowanej ilości m i rosła tylko wysokość piku. Aby spełnić<br />

ten warunek objętość próbki nie powinna przekroczyć około ¼ szerokości<br />

piku (wyrażonej w jednostkach objętości), mierzonej przy podstawie piku,<br />

a stężenie nie powinno być większe niż 10 -4 g substancji na g wypełnienia<br />

kolumny.<br />

Zwiększenie objętości dozowania (bez wzrostu stężenia – warunki<br />

przeładowania objętościowego), powoduje wzrost wysokości i szerokości piku.<br />

Jeżeli objętość przekroczy graniczną wartość, dalszy wzrost powoduje<br />

wyłącznie poszerzenia pasm. W takim przypadku stężenie substancji w eluacie<br />

obserwowane jako wysokość piku nie zmienia się (pojawi się „odcinek”<br />

piku o stałej wysokości). Objętość, od której obserwuje się pik z plateau wynosi<br />

około 6 odchyleń standardowych piku otrzymanego po dozowaniu<br />

próbki analitycznej, tj. o znikomej objętości i niskim stężeniu.<br />

Wzrost szerokości piku będący wynikiem dużej objętości dozowania<br />

odbywa się poprzez wzrost objętości elucji opadającej części piku, podczas<br />

gdy położenie frontu piku nie ulega zmianie i odpowiada położeniu piku<br />

w warunkach chromatografii analitycznej i nie zależy od retencji substancji<br />

ani jej rodzaju. Maksymalną objętość, którą można dozować w celu zwiększenia<br />

wydajności procesu można oszacować z chromatogramu, otrzymanego<br />

dla próbki analitycznej. Jest to, zmierzona na poziomie linii podstawowej<br />

i wyrażona w jednostkach objętości - odległość pomiędzy pikami<br />

substancji, które są celem rozdzielania.<br />

- przeładowanie stężeniowe<br />

Wzrost stężenia substancji w próbce dozowanej do kolumny (przy zachowaniu<br />

małej objętości dozowania (V i )), powoduje poszerzenie pasma,<br />

a kształt pików zależy od rodzaju izotermy sorpcji (patrz rys. 3 oraz 1 i 4), ale<br />

także od stopnia nieliniowości odpowiedzi detektora. Zależności retencji od<br />

kształtu izotermy sorpcji przedstawiono schematycznie na rys 3, a dla pików<br />

otrzymywanych w praktyce, na rys. 1.<br />

Adsorpcja substancji z roztworów w układach ciecz - ciało stałe najczęściej<br />

przebiega wg izotermy Langmuira. W nieliniowym zakresie tej izotermy,<br />

dla wysokiego stężenia substancji, wartość współczynnika retencji (k)<br />

maleje ze wzrostem stężenia, tzn., że ta część pasma, gdzie jest wyższe<br />

stężenie wędruje szybciej. Pasmo staje się niesymetryczne, w kształcie trójkąta,<br />

ze stromym frontem. Wzrost stężenia próbki powoduje wzrost wysokości<br />

maksimum piku i poszerzenie pasma przez zmniejszenie objętość elucji<br />

frontu. Tył piku pozostaje w przybliżeniu w tym samym miejscu, jak dla piku<br />

analitycznego.<br />

Zwiększanie wydajności procesu rozdzielania preparatywnego poprzez<br />

wzrost stężenia roztworu dozowanego jest bardziej korzystne, niż zachowywanie<br />

przeładowania objętościowego (ze względu na większe stęże-<br />

90


nie substancji w eluacie, można uzyskać ponad 50-cio krotny wzrost wydajności<br />

kolumny). Ograniczeniem jest rozpuszczalność składników<br />

rozdzielanej mieszaniny w eluencie, która z reguły maleje ze wzrostem retencji<br />

rozdzielanego składnika.<br />

Powyższe stwierdzenia są poprawne, przy założeniu, że rozpuszczalnikiem<br />

roztworu dozowanego do kolumny jest eluent (albo ciecz o początkowym<br />

składzie, w przypadku elucji gradientowej) oraz gdy lepkość roztworu<br />

dozowanego jest niewiele wyższa od lepkości eluentu. Gdy rozpuszczalnikiem<br />

jest ciecz o wyższej sile elucyjnej niż eluent i/albo roztwór dozowany<br />

jest bardzo lepki, to ze wzrostem stężenia roztworu dozowanego do kolumny<br />

chromatograficznej mogą być związane dodatkowe problemy, powodujące<br />

w konsekwencji różnego typu zniekształcenia pików chromatograficznych.<br />

Efekty te zilustrowano na rys. 5.<br />

Rys. 5. Zestawienie zaobserwowanych w praktyce rodzajów zniekształceń pików<br />

chromatograficznych w warunkach chromatografii preparatywnej z uwzględnieniem warunków,<br />

gdy inna ciecz niż faza ruchoma pełni rolę rozpuszczalnika dla sporządzenia roztworu<br />

dozowanego do kolumny<br />

Oznaczenia:<br />

a – kształt piku w warunkach górnej granicy braku przeładowania<br />

a 1 – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania objętościowego<br />

b – naturalny kształt piku w warunkach przeładowania stężeniowego<br />

b 1 – zniekształcenie piku spowodowane zbyt wysoką różnicą lepkości i napięć powierzchniowych<br />

między roztworem dozowanym do kolumn i eluentem<br />

b 2 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonej<br />

w eluencie – przypadek „wypadania oleju” podczas dozowania<br />

b 3 – zniekształcenie piku w sytuacji niedostatecznej rozpuszczalności substancji rozdzielonej<br />

w eluencie – przypadek „wypadania kryształów” podczas dozowania<br />

- kształt piku bez przeładowania, lub w warunkach górnej granicy braku przeładowania oraz<br />

usytuowanie piku w tych warunkach<br />

c – naturalny kształt piku w warunkach izotermy sorpcji typu „s” (dość rzadki, lecz korzystny<br />

przypadek w praktyce)<br />

c s , c m – stężenia substancji rozdzielanej odpowiednio: w fazie stacjonarnej (s) i ruchomej (m) jako<br />

oznaczenia osi odpowiednich izoterm sorpcji naszkicowanych w pobliżu odpowiadającym im<br />

pikom chromatograficznym<br />

91


Średnica kolumny<br />

Najbardziej celowe jest powiększanie skali rozdzielania substancji z zastosowaniem<br />

kolumn tej samej długości, wypełnionych tym samym sorbentem,<br />

z zachowaniem tego samego układu chromatograficznego i warunków pełnego<br />

podobieństwa fizycznego. Zwiększeniu powinna, więc, ulec tylko średnica<br />

kolumny. Wydajność otrzymywania produktu wzrośnie proporcjonalnie<br />

do zmiany powierzchni przekroju poprzecznego kolumny, a więc proporcjonalnie<br />

do drugiej potęgi zmiany średnicy kolumny z modelowej do preparatywnej.<br />

d<br />

m<br />

2<br />

= m1<br />

*<br />

(4)<br />

d<br />

2<br />

c2<br />

2<br />

c1<br />

m<br />

2<br />

, m<br />

1<br />

- masy substancji, dozowanych, odpowiednio, do kolumny o średnicy<br />

d<br />

c2<br />

i d<br />

c1<br />

;<br />

Według tej samej proporcji należy również zwiększyć natężenie przepływu<br />

eluentu, a więc, odpowiednio wzrośnie zużycie eluentu. Natomiast, liniowa<br />

prędkość przepływu eluentu powinna być zachowana bez zmiany. Nie powinien<br />

też zmienić się czas rozdzielania, położenie punktów zbierania frakcji<br />

na chromatogramie, sprawność kolumny, ani ciśnienie pompowania eluentu.<br />

Pod warunkiem, jednak, opanowania umiejętności uzyskiwania takiej samej<br />

sprawności kolumny modelowej i preparatywnej lub procesowej, co nie zawsze<br />

jest łatwe do osiągnięcia, choć z pewnością możliwe. Zależność wydajności<br />

i niektórych innych parametrów procesu rozdzielania w funkcji średnicy<br />

kolumny, pozostają wtedy zgodne z wyrażeniem (4). Zależność (4) dotyczy<br />

także zmiany wydajności otrzymywania substancji (R i ), objętości dozowania<br />

(Vi) i natężenia przepływu eluentu (w).<br />

Długość kolumny<br />

Wraz z długością kolumny (L c ) proporcjonalnie rośnie masa wypełnienia,<br />

lecz liczba półek teoretycznych jest proporcjonalna do L<br />

c<br />

, stąd<br />

w dłuższej kolumnie pasma substancji są bezwzględnie bardziej rozmyte,<br />

ale względnie - mniej. Wzrost długości kolumny powoduje też zwiększenie<br />

oporów przepływu (ΔP), co, w przypadku ograniczenia maksymalnego ciśnienia<br />

pracy aparatury preparatywnej lub procesowej może uniemożliwić<br />

uzyskanie optymalnego natężenia przepływu eluentu.<br />

Istnieje najmniejsza, krytyczna długość kolumny (Lc min ), wypełnionej<br />

określonym sorbentem, a w istocie najmniejsza liczba tzw. półek teoretycznych<br />

kolumny (N min ), która warunkuje minimalny konieczny stopień rozdzielenia<br />

interesujących nas substancji, wzajemnie od siebie, albo od niepożą-<br />

92


danych składników. Zwiększenie długości kolumny, powyżej tej krytycznej,<br />

minimalnej długości, jest bardzo korzystne i celowe, zwłaszcza, gdy jednocześnie<br />

można zwiększać wartość liniowej prędkości przepływu eluentu (u).<br />

Umożliwia to znaczne zwiększenie wydajności rozdzielania. Zależność produktywności<br />

kolumny (P t ) od jej długości (Lc), otrzymana w warunkach stałej<br />

prędkości liniowej eluentu (u) jest, jednak, nieliniowa. Osiąga się optymalną<br />

długość kolumny - znacznie większą, niż potrzebna do rozdzielania analitycznego,<br />

w warunkach bez przeładowania, jednak dalsze zwiększanie długości<br />

kolumny jest już niecelowe. Dla warunków zachowania stałej wartości<br />

prędkości przepływu eluentu zilustrowano to na rys. 6, pokazującym u góry<br />

wykresy zależności produktywności kolumny od długości wypełnienia,<br />

otrzymane na podstawie równań uzyskanych teoretycznie przez Hupe i Lauera,<br />

oraz poniżej, wykresy uzyskane doświadczalne, podczas pracy nad<br />

optymalizacją warunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszu<br />

z brunatnicy wełnistej.<br />

Rys. 6. Zależność produktywności czasowej (P t ) kolumny chromatograficznej od długości (Lc)<br />

kolumny w warunkach stałej prędkości przepływu eluentu. Krzywe a, b, c, d, zostały uzyskane<br />

w wyniku obliczeń teoretycznych przez Hupe i Lauera, odpowiednio, dla wypełnień o wielkości<br />

ziaren dp = 5, 7, 10, 32.5 μm, a krzywe 1, 2, 3, podczas badań nad optymalizacją warunków<br />

otrzymywania lanatozydu C z ekstraktu suszu z brunatnicy wełnistej dla kolumn wypełnionych<br />

żelem krzemionkowym o średnich wielkościach ziaren, odpowiednio: 10, 45, i 102 μm<br />

93


Średnica ziaren wypełnienia kolumny<br />

Średnica ziaren wypełnienia ma zasadniczy wpływ na sprawność kolumny.<br />

Krytyczną, minimalną liczbę półek teoretycznych, niezbędną do preparatywnego<br />

rozdzielenia mieszaniny substancji można osiągnąć zmieniając<br />

długość kolumny, albo / i średnicę ziaren wypełnienia kolumny. Przy zmianie<br />

skali procesu rozdzielania w warunkach przeładowania objętościowego,<br />

L c<br />

ważna jest nie tyle sama długość kolumny L c , lecz stosunek<br />

d 2p , tj. proporcja<br />

długości kolumny do kwadratu średnicy ziaren wypełnienia. W warunkach<br />

przeładowania stężeniowego korzystne jest jednoczesne zmniejszanie wielkości<br />

ziaren wypełnienia oraz długości kolumny, jednak, zachowanie stałej<br />

Lc<br />

wartości proporcji nie jest wówczas optymalną regułą. Bardziej korzystne<br />

jest zastosowanie o ok. 30% dłuższej kolumny, niż to wynika z obliczenia<br />

2<br />

dp<br />

otrzymanego na podstawie tej reguły. Zachowując te proporcje oraz zwiększając<br />

jednocześnie prędkość przepływu eluentu, można uzyskać znaczący<br />

wzrost wydajności rozdzielania preparatywnego lub procesowego, z zachowaniem<br />

stałej czystości produktu.<br />

Można generalnie stwierdzić, że zmniejszanie wielkości ziaren wypełnienia<br />

kolumny preparatywnej (dp) jest zawsze bardzo korzystne dla uzyskiwania<br />

wzrostu wydajności procesu rozdzielania oraz czystości otrzymywanych<br />

substancji i jest tym bardziej celowe, im trudniejszy jest problem<br />

rozdzielczy (im mniejsze wartości α). Ograniczeniem może być, jednak,<br />

maksymalna wartość ciśnienia (ΔP max ), jakie można zastosować do rozdzielania.<br />

Optymalną wielkość ziaren wypełnienia kolumny preparatywnej lub<br />

procesowej można określić jako wartość w zakresie 10-25 mikrometrów i jest<br />

ona tym niższa, im trudniejszy jest problem rozdzielczy (im niższa wartość α<br />

w warunkach bez przeładowania kolumny).<br />

W przypadku rozdzielania substancji makromolekularnych, ich bardzo<br />

niekorzystna kinetyka dyfuzji (niskie wartości współczynników dyfuzji) powodują,<br />

że zwiększanie liniowej prędkości przepływu jest niekorzystne i prowadzi<br />

do znacznego względnego poszerzenia pików. Wówczas zmniejszanie<br />

wielkości ziaren wypełnienia i, jeśli to możliwe z jednoczesnym zwiększaniem<br />

temperatury pracy kolumny, w zasadniczym stopniu poprawia rozdzielczość<br />

R i umożliwia zwiększanie przeładowania, a stąd i wydajności oraz<br />

produktywności kolumny.<br />

Prędkość przepływu fazy ruchomej<br />

Wzrost prędkości przepływu fazy ruchomej powyżej prędkości optymalnej<br />

dla zależności H=f(u), powoduje zmniejszenie czasu trwania rozdzielania<br />

i tym samym wzrost wydajności kolumny. Wpływa, jednak, ujemnie na<br />

sprawność rozdzielania, powodując poszerzenie pasm. To, przy założonej<br />

czystości wydzielanej substancji, wymusza konieczność zmniejszenia masy<br />

94


dozowanej próbki albo zmniejszenie objętości zbieranych frakcji. Spadek<br />

sprawności kolumny powoduje też zmniejszenie stężenia substancji w eluacie<br />

wypływającym z kolumny. Należy, jednocześnie, brać pod uwagę ograniczenia,<br />

wynikające z możliwości uzyskana odpowiednio wysokiego ciśnienia<br />

pompowania eluentu na wlocie do kolumny oraz ograniczoną<br />

wytrzymałość mechaniczną kolumny i jej wypełnienia.<br />

Bez uwzględniania ograniczeń wytrzymałościowych, zależność produktywności<br />

kolumny (P t ) od szybkości przepływu eluentu (u) nie jest liniowa<br />

i posiada maksimum, którego wartość jest tym wyższa im mniejsze są ziarna<br />

wypełnienia kolumny (dp). Dalsze zwiększanie prędkości eluentu jest nieopłacalne<br />

i z wielu powodów niekorzystne. Zilustrowano to na rys. 7 pokazującym<br />

u góry wykresy zależności, otrzymanych na podstawie równań otrzymanych<br />

teoretycznie przez Hupe i Lauera oraz poniżej - krzywe, otrzymane<br />

na podstawie wyników uzyskanych doświadczalne podczas pracy nad optymalizacją<br />

warunków otrzymywania lantozydu C z ekstraktów suszu brunatnicy<br />

wełnistej.<br />

Rys. 7. Zależność produktywności czasowej kolumn chromatograficznych wypełnionych<br />

sorbentem o różnych wielkościach ziaren od prędkości przepływu eluentu. Krzywe teoretyczne<br />

wzięto z pracy Hupe i Lauera Krzywe eksperymentalne otrzymano podczas badań<br />

nad doborem optymalnych warunków procesu otrzymywania lanatozydu C.<br />

Oznaczenia: a, b – dp = 102 μm, Lc odpowiednio: 800 mm (a) i 1600 mm (b);<br />

c, d, e – dp = 50 μm, Lc odpowiednio: 400, 800 i 1200 mm; f – dp = 10 μm, Lc = 250 mm<br />

95


Retencja<br />

Silna retencja składników mieszaniny jest niekorzystna ze względu na<br />

nadmierne zużycie eluentu, a przede wszystkim wzrost czasu rozdzielania.<br />

Jednakże, dla dwóch substancji o różnej retencji, względnie wolniej rośnie<br />

szerokość pasma wraz z ilością dozowanej substancji dla pików o większej<br />

retencji, niż dla substancji o niższej wartości k. Optymalna wartość współczynnika<br />

retencji (k) dla pierwszego rozdzielanego składnika mieszaniny<br />

dwóch substancji nie powinna przekraczać 2-3, a dla ostatniego powinna<br />

być większa od 2-3, ale nie wyższa niż ok. 12 [3].<br />

Maksymalizacja selektywności, czyli wartości α, ma najważniejsze<br />

znaczenie dla maksymalizacji wydajności rozdzielnia substancji w chromatografii<br />

preparatywnej lub procesowej, niezależnie od stosowanej techniki<br />

chromatograficznej.<br />

Korzystne jest stosowanie sorbentów o dużej powierzchni właściwej<br />

(o ziarnach wypełnienia całkowicie porowatych, albo posiadających nieporowate<br />

„jądro”, o bardzo niewielkiej średnicy.<br />

Odkrycie ostatnio technologii otrzymywania, tzw., monolitycznych wypełnień<br />

kolumn HPLC o bardzo niskiej wartości impedancji rozdzielania jest<br />

szczególnie ważne dla rozwoju wykorzystania chromatografii cieczowej<br />

w skali preparatywnej i procesowej. Tego typu kolumny umożliwiają otrzymywanie<br />

zasadniczo wyższych wydajności preparatywnego rozdzielania<br />

substancji o niewysokich masach cząsteczkowych, niż kolumny „klasyczne”,<br />

wypełnione ziarnistym sorbentem.<br />

Optymalne warunki preparatywnego albo procesowego otrzymywania<br />

substancji<br />

Podsumowując przedstawione powyżej reguły optymalizacji warunków<br />

preparatywnego lub procesowego rozdzielania substancji z wykorzystaniem<br />

chromatografii cieczowej, można podać następujące ogólne zasady<br />

maksymalizacji wydajności:<br />

- W przypadku rozdzielania substancji o niskich masach cząsteczkowych,<br />

w układach chromatograficznych, charakteryzujących się dobrą kinetyką zjawisk<br />

sorpcji – desorpcji oraz, gdy ograniczeniem nie jest dopuszczalne ciśnienie<br />

pompowania eluentu, najbardziej korzystne jest stosowanie stosunkowo<br />

wysokosprawnych kolumn preparatywnych o optymalnej długości, tym<br />

wyższej im większa jest wielkość ziaren wypełnienia kolumny oraz zasadniczo<br />

dłuższych, niż wynosiłaby konieczna długość kolumny analitycznej, wypełnionych<br />

sorbentem typu HPLC, o małych ziarnach wypełnienia. Jeśli to<br />

możliwe, należy stosować wysokosprawne kolumny monolityczne. Jednocześnie<br />

należy stosować stosunkowo wysoką, prędkość przepływu eluentu,<br />

której optymalna wartość zależy od wielkości ziaren wypełnienia kolumny<br />

(dp), znacznie wyższą od prędkości optymalnej dla zależności H=f(u).<br />

96


- W przypadku rozdzielania substancji o wysokich masach molekularnych,<br />

albo w przypadku bardzo trudnych problemów rozdzielczych, należy stosować<br />

kolumny o maksymalnej możliwej do osiągnięcia sprawności, jednak liniowa<br />

prędkość przepływu eluentu, szczególnie dla rozdzielania substancji<br />

makromolekularnych powinna być zbliżona do optymalnej dla zależności<br />

H=f(u), a więc stosunkowo bardzo niska i w tych warunkach produktywność<br />

kolumny jest też względnie niska.<br />

- Gdy kinetyka zjawisk sorpcji – desorpcji jest niekorzystna, np. w warunkach<br />

chromatografii jonowymiennej, celowe jest stosowanie kolumn, wypełnionych<br />

sorbentem o większych ziarnach (25-40 mikrometrów). Konieczne jest<br />

wówczas również stosowanie stosunkowo niskich, optymalnych, prędkości<br />

przepływu eluentu, jednak wyższych od prędkości optymalnych wg zależności<br />

H=f(u). Wówczas nie jest możliwe otrzymanie tak wysokiej produktywności<br />

kolumny, jak w warunkach opisanych na początku.<br />

- W każdym przypadku, korzystne jest stosowanie dla celów preparatywnych<br />

sorbentów o wysokiej powierzchni właściwej oraz zachowanie niezbyt wysokich<br />

wartości k, pierwszej z rozdzielanych substancji i wartości k poniżej<br />

ok. 12 dla ostatniej substancji eluowanej z kolumny.<br />

- Stosowanie elucji stopniowej, w celu skrócenia ogólnego czasu elucji (czasu<br />

jednego etapu rozdzielania), bywa niezbędne. Należy, jednak, wówczas<br />

wykonywać reaktywację powierzchni wypełnienia kolumny, co najczęściej<br />

wymaga zastosowania eluentu o początkowym składzie w ilości co najmniej<br />

7 objętości martwych kolumny. Bardziej korzystne, niż elucja skokowa, jest<br />

stosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie preparatywnej, albo<br />

procesowej. Zapewnia to długotrwałe utrzymywanie stałej aktywności powierzchni<br />

sorpcyjnej oraz produktywności kolumny, przy minimalnym zużyciu<br />

eluentu.<br />

- Stosowanie elucji gradientowej nie jest korzystne. W przypadku rozdzielania<br />

peptydów i białek, albo w warunkach chromatografii oddziaływań hydrofobowych,<br />

jest jednak, konieczne. Powoduje, w porównaniu do warunków<br />

elucji izokratycznej, obniżenie efektywności procesu otrzymywania substancji<br />

z powodu zwiększenia czasu trwania jednego etapu rozdzielania o czas<br />

reaktywacji kolumny/ Powoduje istotny wzrost kosztów repetycyjnego otrzymywania<br />

substancji, tym większy im wyższa jest cena eluentu, wyższy koszt<br />

odzysku eluentu i im większa część eluentu ulega utracie (nie może zostać<br />

zawrócona do procesu).<br />

97


OPERACJE JEDNOSTKOWE I TECHNOLOGIA ROZDZIELANIA<br />

I OTRZYMYWANIA SUBSTANCJI Z ZASTOSOWANIEM<br />

PREPARATYWNEJ LUB PROCESOWEJ CHROMATOGRAFII<br />

CIECZOWEJ<br />

Na rys. 8 przedstawiono operacje jednostkowe, z których składa się technologia<br />

otrzymywania substancji z zastosowaniem chromatografii cieczowej.<br />

Rys. 8. Schemat technologiczny procesu otrzymywania substancji z wykorzystaniem<br />

chromatografii cieczowej procesowej lub preparatywnej<br />

98


Na rys. 9 i 10 pokazano przykłady schematów ideowych układu aparatów,<br />

odpowiednio: do chromatografii preparatywnej (rys. 9) i do chromatografii<br />

w skali procesowej (rys. 10).<br />

Rys. 9. Schemat ideowy i funkcjonalny układu zautomatyzowanego – sterowanego komputerem<br />

– gradientowego chromatografu preparatywnego z zaworami dwustanowymi (Z 1 ... Z 24 ), z możliwością<br />

recyrkulacji części eluentu oraz z podwójnym systemem automatycznie kontrolowanego<br />

dozowania roztworu substancji rozdzielanych (dozownik pętlicowy z samoczynnym repetycyjnym<br />

napełnianiem pętli z regulowaną objętością cieczy lub dozowanie dużych objętości<br />

poprzez zawory Z 2 i Z 3 ), oraz z systemem samoczynnego wykrywania ewentualnych przecieków<br />

eluentu. Znaczenie symboli (które nie zostały wyjaśnione na rysunku lub powyżej):<br />

P – pompa ssąco-tłocząca o małej objętości skokowej, Z – zawory (A – D: programowanie składu<br />

eluenta, 1 – 10: sterowania przebiegiem procesu separacji, 11 – 24: kolekcji frakcji);<br />

MSP – moduł sterowania pompą, MSWE – moduł sterowania „niskociśnieniowym” systemem<br />

gradientowym, MSZ – moduł sterowania zaworami, MK – moduł komunikacji z użytkownikiem<br />

i wzajemnej koordynacji programów, obsługi awarii oraz kontroli warunków pracy kolumn (moduł<br />

o nadrzędnych priorytetach, może umożliwiać wykorzystywanie komputera do innych zadań<br />

w przypadku bezawaryjnej pracy aparatu, a w przyszłości ewentualne wyeliminowanie konieczności<br />

stosowania komputera) – obecnie część funkcji tego modułu powierzono nadrzędnemu<br />

komputerowi<br />

99


Rys. 10. Schemat ideowy chromatografu preparatywnego w dużej skali separacji lub chromatografu<br />

procesowego. Oznaczenia: A, B, C – składniki eluentu i odpowiednie zbiorniki;<br />

SR – roztwór rozdzielonych i odpowiedni zbiornik; P1 – pompa główna z programowaniem<br />

składu eluentu; P2 – pompa dozująca roztwór substancji rozdzielonych (P1 i P2 włączona<br />

alternatywa); Gr – programator i sterownik programu elucji, K – kolumna PLC, D – detektor;<br />

R – „restryktor”, K.Fr – sterownik kolektora frakcji, ZA, ZB, ZC – zawory proporcjonujące,<br />

1, 2, 3, 4 – zawory kolektora frakcji, F – filtry ssawne, Śc – ściek<br />

100


Rys. 11. Schematy ideowe różnych rozwiązań technicznych dozowania wsadu w chromatografii<br />

preparatywnej lub procesowej<br />

Na rys. 12 zamieszczono przykład chromatogramu otrzymanego w czasie<br />

jednego etapu repetycyjnego rozdzielania zanieczyszczonej mieszaniny lanatozydów<br />

A, B, i C w warunkach chromatografii procesowej – produkcja lanatozydu<br />

C (LC) z metanolowego ekstraktu z suszu zioła - brunatnica wełnista<br />

(digitalis lanata), z wykorzystaniem kolumny chromatograficznej<br />

o średnicy wypełnienia: 150 mm.<br />

Z<br />

LA<br />

LB<br />

LC<br />

∼<br />

0 10 20 30<br />

5 1 2 3 4 5 1<br />

[min]<br />

Rys. 12. Przykład chromatogramu uzyskanego w czasie trwania jednego etapu cyklicznej izolacji<br />

lanatozydu C z odpadu produkcyjnego z wykorzystaniem kolumny 800x150 mm, wypełnionej<br />

żelem krzemionkowym 60A d p =50μm (N o =1600); Warunki: Eluent – CH 2 Cl 2 / CH 3 OH / H 2 O<br />

92:8:0,2 v/v, natężenie przepływu 2200 ml/min, ciśn. 26 bar, temperatura pokojowa, detektor<br />

UV 254nm. Poniżej osi czasu podano numery zbiorników, gdzie zostają kierowane frakcje<br />

101


Na rys. 13 pokazano kilka chromatogramów otrzymanych bez przeładowania<br />

kolumny (w warunkach „analitycznych – piki gaussowskie) i w warunkach<br />

przeładowania stężeniowego (piki pozostałe), otrzymane z przekroczeniem<br />

liniowości zakresu odpowiedzi detektora UV, jak i zastosowaniem<br />

kilku sposobów postępowania dla uniknięcia przekroczenia liniowego zakresu<br />

wskazań detektora - bardzo mała droga optyczna – 2 mm, a nawet<br />

0.5 mm, i / albo wybór długości fali o niskich wartościach absorbancji molowej<br />

rozdzielanych substancji – 220 nm, albo 290 nm, zamiast 250 nm.<br />

Rys. 13 Przykłady kilku chromatogramów uzyskanych dla tych samych ilości estrów kwasu<br />

4OH benzoesowego rozdzielanych w warunkach typowego przeładowania stężenia kolumny,<br />

z wyjątkiem gaussowskich pików narysowanych linią cienką ciągłą, które dotyczą braku przeładowania;<br />

W warunkach przeładowania stężenia zastosowano następujące warunki detekcji:<br />

280 nm, 2,56 AU/FS, kuweta 10 mm<br />

280 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mm<br />

254 nm, 1.28 AU/FS, kuweta 0,5 mm<br />

Zamieszczone ilustracje i podpisy pod nimi, umożliwiają uzyskanie<br />

ogólnej orientacji w zakresie stosowanych operacji jednostkowych i alternatywnych<br />

sposobów ich realizacji w praktyce w chromatografii cieczowej<br />

w skali preparatywnej lub procesowej. Opis bardziej szczegółowy przekracza<br />

ramy tego opracowania. Zainteresowany czytelnik powinien skorzystać ze<br />

specjalistycznej literatury, albo z bardziej obszernego podręcznika na temat<br />

preparatywnej i procesowej chromatografii cieczowej.<br />

KOLUMNY DO CHROMATOGRAFII PREPARATYWNEJ I PROCESOWEJ<br />

– WYMAGANIA I ZASADY ICH SPEŁNIENIA W PRAKTYCE<br />

Kolumny do chromatografii preparatywnej są zawsze bardziej skomplikowanej<br />

konstrukcji, niż do kolumny do chromatografii analitycznej. Jed-<br />

102


nakże, w kolumnach preparatywnych zachodzą takie same zjawiska fizykochemiczne<br />

i hydrodynamiczne jak w kolumnach analitycznych. Dotyczy to<br />

zasad opisu retencji i selektywności układu chromatograficznego, a także<br />

zjawisk decydujących o sprawności rozdzielania i wpływających na liczbę<br />

półek teoretycznych kolumny, z zastrzeżeniem, konieczności rozpatrywania,<br />

w obu wypadkach, warunków przekroczenia zakresu liniowości izotermy<br />

sorpcji, tzn. rozpatrywania warunków przeładowania kolumny.<br />

W związku z wykorzystywaniem do celów preparatywnych i procesowych<br />

kolumn o znacznie większej średnicy niż kolumny analityczne pojawiają<br />

się dodatkowe trudności oraz problemy. Jednym z nich jest konieczność<br />

zapewnienia równomiernego rozprowadzenia roztworu rozdzielanych substancji<br />

oraz eluentu na całym przekroju poprzecznym wypełnienia kolumny<br />

i takiego samego odbierania eluatu opuszczającego kolumnę. Musi to zapewnić<br />

optymalna konstrukcja głowic - rozprowadzających eluent na powierzchni<br />

warstwy wypełnienia kolumny i zbierających eluat z powierzchni<br />

złoża kolumny.<br />

Istnieje wiele konstrukcji preparatywnych kolumn chromatograficznych,<br />

w których powyższe wymagania zostały w różny sposób - najczęściej<br />

poprawnie - rozwiązane. Na rys. 14 zamieszczono kilka przykładów schematów<br />

budowy kolumn chromatograficznych, stosowanych do preparatywnego,<br />

albo procesowego rozdzielania substancji, a w opisie rysunku zamieszczono<br />

potrzebne wyjaśnienia.<br />

Ważny problem, to zapewnienie długookresowej stabilności wypełnienia<br />

kolumny, gdy stosunek średnicy kolumny i średnicy ziarna wypełnienia<br />

często jest większy od 1000, a nawet 10000, a ziarna wypełnienia są wyjątkowo<br />

małych rozmiarów. W tych warunkach oddziaływania ścian - stabilizujące<br />

strukturę złoża w kolumnie, tak ważne w reaktorach chemicznych z wypełnieniem,<br />

albo także w kolumnach analitycznych - w kolumnach<br />

procesowych i preparatywnych praktycznie nie ma miejsca. W tej sytuacji<br />

szczególne znaczenie ma poprawne, równomierne i zwarte (ale nie nadmiernie<br />

zwarte) upakowanie kolumny. Wykorzystywane są też dodatkowo,<br />

specjalne sposoby stabilizacji struktury złoża w czasie rozdzielania, takie jak<br />

tzw. „dynamiczna kompresja aksjalna” (DAC), lub kompresja „aksjalno-<br />

-radialna”, lub ma miejsce kompresja złoża w kolumnie za pomocą mechanizmu<br />

śrubowego, niekiedy z zastosowaniem sprężyn regulujących siłę docisku<br />

przesuwnej głowicy (patrz rys. 14).<br />

Poprawne działanie głowicy wlotowej - wprowadzającej ciecz do kolumny<br />

i wylotowej, wyprowadzającej eluat z kolumny oraz charakter profilu<br />

przepływu cieczy w warstwie wypełnienia kolumny preparatywnej, lub procesowej,<br />

zależny od właściwości złoża (promieniowego rozkładu porowatości<br />

między-ziarnowej i promieniowego rozkładu ziaren pod względem wielkości,<br />

i ma decydujący wpływ na szerokość i kształt pików chromatograficznych<br />

otrzymywanych z zastosowaniem kolumny preparatywnej, bądź procesowej,<br />

niezależnie od stopnia przeładowania kolumny. Sprawność kolumny mierzona<br />

liczbą półek teoretycznych (N), nie powinna zależeć od średnicy kolumny.<br />

Tylko wówczas może mieć miejsce całkowite podobieństwo warunków<br />

103


fizycznych i hydrodynamicznych w kolumnie modelowej i preparatywnej lub<br />

procesowej. Na wlocie do obu kolumn i na wylocie i na wylocie z nich, powinno<br />

mieć miejsce, odpowiednio, równomierne rozprowadzanie cieczy na<br />

cały przekrój poprzeczny wypełnienia / równomierne zbieranie z całego<br />

przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny. Zasadnicze znaczenie ma taki<br />

sposób wypełniania kolumny, aby profil prędkości przepływu cieczy w całym<br />

przekroju poprzecznym kolumny i wzdłuż całej długości wypełnienia, był<br />

płaski, tzn. „tłokowy”, a także taki sposób wprowadzania strefy dozowanej do<br />

kolumny, aby już na początku nie było zniekształcenia, którego nie można<br />

zmienić w czasie trwania elucji.<br />

A. B. C.<br />

D.<br />

E. F.<br />

Rys. 14. Zasady budowy i działania ważniejszych typów kolumn i głowic dystrybucyjnych<br />

do preparatywnej i procesowej chromatografii cieczowej<br />

Typy kolumn (ciąg dalszy opisu rys. 14.): A – kolumna z nieruchomymi głowicami; B – kolumna<br />

z co najmniej jedną głowicą przesuwną, dociskaną śrubami lub poprzez połączenie gwintowe<br />

nakrętki (10) z korpusem (7); C – kolumna z co najmniej jedną głowicą dociskaną do złoża<br />

z wykorzystaniem siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, tzn. kolumna wyposażona<br />

w tzw. „system dynamicznej kompresji aksjalnej złoża (DAC)”; D – kolumna o elastycznych ścianach<br />

wyposażona w system promieniowej kompresji złoża (patent f-my Waters); F – kolumna<br />

o radialno-aksjalnej kompresji złoża,<br />

Typy głowic dystrybucyjnych: A, B, C – głowice z wolną przestrzenią dystrybucyjną w formie<br />

stożka o kącie wierzchołkowym 140-165 o (patent f-my Amicon); E – jedna z uproszczonych<br />

form typoszeregu głowic dystrybucyjnych opracowanych w Politechnice Gdańskiej,<br />

Oznaczenia: 1 – przewód doprowadzający eluent lub roztwór dozowany, 2 – korpus głowicy,<br />

3- uszczelka główna, 4 – przestrzeń dystrybucyjna, 4’ – wkładka dystrybucyjna z systemem<br />

rowków poziomych i poprzecznych otworków, 5 – spiek porowaty lub „tkanina” z drutu kwasoodpornego,<br />

6 – materiał wypełnienia kolumny, 7, 7’ – korpus kolumny, odpowiednio: rura kwasoodporna<br />

lub z elastycznego chemoodpornego tworzywa sztucznego, 8 – siatka tkana ze stosunkowo<br />

grubego drutu (0,3-1,0 mm) lub wkładka z rowkami zapewniającymi promieniowy<br />

rozpływ cieczy w głowicy, 9 – tuleja dystansowa, 10 – nakrętka lub pokrywa dociskana śrubami,<br />

11 – korpus siłownika hydraulicznego lub pneumatycznego, 12 – trzpień tłoczyska, 13 – tłoczysko,<br />

14 – płyn tłoczący<br />

104


Można stwierdzić, że w praktyce, większość niepowodzeń preparatywnego<br />

stosowania chromatografii cieczowej jest spowodowane nieumiejętnością<br />

zapewnienia tłokowego profilu przepływu eluentu w kolumnie oraz<br />

wystarczającej stabilności mechanicznej wypełnienia kolumny. Na rysunku<br />

15 pokazano związek kształtu pików chromatograficznych z profilem przepływu<br />

eluentu w kolumnie. Strefy substancji są w każdym przypadku rozdzielne<br />

w przestrzeni wypełnienia kolumny. Jednakże na wylocie z kolumny<br />

tylko tłokowy profil przepływu zapewnia całkowite rozdzielenie. W przypadku<br />

profilu nie tłokowego, dowolnego typu, na wylocie z kolumny następuje<br />

„wtórne” wymieszanie stref rozdzielonych w kolumnie.<br />

Rys. 15. Ilustracja uzasadniająca konieczność istnienia tłokowego (płaskiego) profilu przepływu<br />

cieczy w przestrzeni wypełnienia kolumny preparatywnej oraz pokazująca niekorzystny wpływ<br />

zniekształcenia stref w kolumnie z p-tu widzenia wymagań, co do czystości substancji:<br />

a) Kolumna charakteryzująca się tłokowym profilem przepływu eluentu;<br />

b) Kolumna o niższej przepuszczalności w rejonie przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrój;<br />

c) Kolumna o wyższej przepuszczalności w rejonie w przyściennym niż w pobliżu osi – półprzekrój<br />

Rys. 16. Zestawienie odpowiadających sobie chromatogramów otrzymanych w warunkach braku<br />

przeładowania – a, b, c oraz w warunkach typowego przeładowania stężeniowego – a’, b’, c’<br />

z wykorzystaniem kolumny analitycznej (120x4 mm i.d.) – a, a’ oraz preparatywnej<br />

(120x32 mm i.d.) – b, b’; c, c’<br />

105


Nie opanowany do końca problem stanowi też występowanie nie wyjaśnionego<br />

dotychczas w pełni, efektu tzw. „ogonowania” pików przy linii bazowej<br />

- przy „podstawie” pików po stronie zstępującej - w przypadku większości<br />

komercyjnych kolumn preparatywnych HPLC, wypełnionych<br />

metodami „na mokro”. Tego typu zniekształcenie pików skutkuje otrzymywaniem<br />

mniej czystych substancji, jak by to było możliwe, gdyby efektu tego<br />

nie było. Na rys. 16 i 17 zilustrowano ten problem oraz pokazano, że najbardziej<br />

efektywnym sposobem uniknięcia jego skutków, jest stosowanie kolumny<br />

preparatywnej HPLC, w warunkach tzw. nieskończonej średnicy. Takie<br />

rozwiązanie zaproponowanych przed laty Knox dla kolumn analitycznych<br />

i semi-preparatywnych, charakteryzujących się niekorzystnym profilem przepływu<br />

eluentu w rejonie przyściennym wypełnienia kolumny. Stosowanie warunków<br />

nieskończonej średnicy wiąże się ze zmniejszeniem wydajności kolumny,<br />

ale jest ono, tym mniejsze, im większa jest średnica kolumny i im<br />

mniejsza jest wielkość ziaren wypełnienia.<br />

Eluent<br />

w<br />

Eluent<br />

lub próbka<br />

w<br />

2 1<br />

d l<br />

i<br />

w = w 1 + w2<br />

w 1<br />

w 2<br />

= const.<br />

[ ]<br />

ml<br />

min<br />

S =<br />

2<br />

w<br />

1<br />

d<br />

1<br />

≅ 2<br />

w + w d<br />

1 2 c<br />

d c<br />

w<br />

d-2i<br />

c<br />

Rys. 17. Model optymalnego wykorzystania kolumny preparatywnej w warunkach nieskończonej<br />

średnicy z ograniczeniem penetracji przez substancje eluowane strefy przyściennej<br />

w kolumnie o grubości „i”<br />

Wypełnienie kolumn: Nucleosil C18 7 μm; Kolumny wypełnianie na mokro<br />

sposobami stosowanymi dla kolumn komercyjnych; b, b’ - kolumna preparatywna<br />

była eksploatowana w sposób „klasyczny”, tzn. z wykorzystaniem całej<br />

powierzchni przekroju poprzecznego dla rozdzielania; c, c’ – ta sama kolumna<br />

stosowana w optymalnym wykorzystaniem warunków nieskończonej<br />

106


średnicy (s=76%). Na chromatogramach b’ i c’ oznaczono zakresy zbierania<br />

frakcji eluentu, poddanych następnie analizie. Substancje rozdzielane: estry<br />

kwasu 4 OH benzoesowego, masa substancji dozowanych do kolumny<br />

w warunkach przeładowania stężeniowego: ester etylowy – 95 mg, ester etylowy<br />

120 mg, ester propylowy 137 mg, masa substancji dozowanych do kolumny<br />

analitycznej ok. 60 razy mniejsza niż do kolumny preparatywnej; eluent:<br />

CH 3 OH – H 2 O 1:1 V/V, w=0,97 ml/min (d c =4 mm) oraz w=58 ml/min<br />

(d c =32 mm) (74 bar), detektor UV 280 nm, czułość 1,28 AU/FS, kuweta<br />

o drodze optycznej 0,5 mm.<br />

W przypadku wypełnień o wielkości ziaren ponad ok. 25 mikrometrów,<br />

kolumny można napełniać na sucho, stosując, np. metodę udarową (udarowanie<br />

kolumny w pionie, przy bardzo niewielkiej intensywności, jest bardziej<br />

korzystne od udarów intensywnych). W przypadku stosowania wypełnień<br />

o ziarnach poniżej ok. 25 mikrometrów, nie można w sposób zadowalający<br />

wypełnić kolumn chromatograficznych metodami „na sucho” i konieczne jest<br />

stosowanie metod „na mokro” z wykorzystaniem zawiesiny wypełnienia<br />

w odpowiednio dobranej cieczy. Często stosuje się pompowanie cieczy, albo<br />

jej wytłaczanie za pomocą tłoka, tworząc wypełnienie kolumny w czasie filtracji<br />

złoża, narastającego na powierzchni głowicy odbiorczej kolumny, albo<br />

pompując zawiesinę z zastosowaniem jednej z głowic umieszczonych w kolumnie.<br />

Na rys. 18 przedstawiono przykłady wyników badania związku między<br />

profilem przepływu cieczy w preparatywnej kolumnie do chromatografii cieczowej,<br />

warunkami wypełniania kolumny i występowaniem tzw. efektu autosegregacji<br />

ziaren wypełnienia kolumny pod względem wielkości. Widać, że<br />

także wówczas, gdy nie występuje auto-segregacja ziaren pod względem<br />

wielkości, może mieć miejsce nie-tłokowy profil przepływu cieczy w kolumnie<br />

i zniekształcenie pików chromatograficznych, a w konsekwencji zmniejszenie<br />

wydajności kolumny i czystości otrzymywanych substancji. Widać też, że<br />

przyczyną efektu „ogonowania” pików w przypadku kolumn preparatywnych<br />

HPLC, wypełnionych „na mokro” nie jest zjawisko „auto-segregacji” ziaren<br />

wypełnienia w kolumnie. Widać również, że stosowanie warunków nieskończonej<br />

średnicy może skutkować otrzymywaniem czystych substancji tylko<br />

wtedy, gdy przyczyną problemu jest „ogonowanie” pików.<br />

107


Rys. 18. Przykłady reprezentowanych rezultatów uzyskanych podczas doboru optymalnych warunków<br />

wypełnienia kolumn preparatywnych o średnicy 32-52 mm, wykonanych z zastosowaniem<br />

mieszaniny dwóch różnobarwnych frakcji żelu krzemionkowego o zakresie wielkości ziaren<br />

22 do 45 μm (frakcja bezbarwna: 22 do 35 μm i frakcja zabarwiona: 30 do 45 μm)<br />

z uwzględnieniem kształtów stref barwnika Sudan I „zatrzymanego” w przekroju poprzecznym<br />

wypełnienia kolumny oraz odpowiadające tym kolumnom kształty pików chromatograficznych<br />

na chromatogramach testowych.<br />

Warunki wypełniania kolumn: A, B, C – wypełnianie na sucho metodą udarową z równomiernym<br />

doprowadzeniem sorbentu do kolumny podczas wypełniania w warunkach, odpowiednio:<br />

A – optymalnych (prędkość narostu złoża podczas wypełniania (u ι - ok. 1 cm/min) – cyfrą „1”<br />

oznaczono wygląd przekroju wypełnienia obserwowany również niekiedy w optymalnie wypełnionej<br />

kolumnie),<br />

B – przy zbyt szybkim doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 3 cm/min),<br />

C – przy zbyt powolnym doprowadzaniu sorbentu do kolumny (u ι - ok. 0,22 cm/min),<br />

D, D’, E – wypełnianie kolumny na mokro, odpowiednio: metodą filtracyjną lub tłokową w warunkach<br />

optymalnych (przykłady D, D’) i sedymentacyjno-wibracyjną (przykład E), (w przypadku<br />

D’ zastosowano głowicę dystrybucyjną zapewniającą realizację warunków nieskończonej średnicy<br />

w kolumnie (S=50%) wypełnionej w tych samych warunkach jak w przykładzie D). Długości<br />

warstwy wypełnienia w kolumnach: 15-25 cm<br />

Na rys. 19 pokazano schematycznie kilka alternatywnych sposobów<br />

wypełniania „na mokro” kolumn preparatywnych HPLC. Warto zwrócić uwagę<br />

na metodę pokazaną na rys. 19b, nie tyle dlatego, że jest oryginalna i autor<br />

nie spotkał w literaturze propozycji jej stosowania, ale przede wszystkim<br />

dlatego, że jest prosta w realizacji, bardzo skuteczna w praktyce i może zostać<br />

zastosowana w każdym laboratorium, które ma możliwość wykonania<br />

w warsztacie mechanicznym kilku prostych metalowych elementów oraz po-<br />

108


siada jakąkolwiek pompę, mającą ograniczenie maksymalnego ciśnienia<br />

pompowania. Schemat a dotyczy procedur postępowania realizowanych<br />

najczęściej przez producentów kolumn. Schemat b, to stosowanie „tłoka”<br />

uszczelnionego względem ściany kolumny, oddzielającego zawiesinę wypełnienia<br />

od medium tłoczącego, którym może być sprężone powietrze<br />

(w istocie pompa stało-ciśnieniowa). Schemat c dotyczy metodyki zalecanej<br />

do wypełniania na mokro kolumn preparatywnych sorbentami o wielkości<br />

ziaren powyżej 20 mikrometrów, z zastosowaniem zasysania cieczy tworzącej<br />

zawiesinę.<br />

Rys. 19. Zestawienie schematów instalacji do badań „kombinowanych” metod wypełnienia kolumn<br />

preparatywnych HPLC i MPLC na mokro,<br />

a) Kombinacja metody zawiesinowej z wibracjami lub udarowaniem zespołu kolumna – zbiornik<br />

z zawiesiną<br />

b) Kombinacja metody dynamicznej kompresji aksjalnej z zastosowaniem „pływającego” tłoka<br />

z wibracjami lub udarowaniem<br />

c) Udarowanie albo wibrowanie zespołu kolumn – zbiornik z zawiesiną, albo wykorzystanie wibratora<br />

pogrążalnego – z jednoczesnym zasysaniem cieczy tworzącej zawiesinę<br />

Elementy 1-13 powtarzają się na rysunku b w całości, natomiast na rysunku c nie stosowano<br />

elementów 1-4 oraz 10 i głowicy górnej 11.<br />

Oznaczenia:<br />

1 – zbiornik z cieczą konsolidującą „L”, 2 – pompa wodna tłokowa, (w=const = 0-1 l/min lub<br />

P=const: 0-300 bar), 3 – zawiesina „s”, 6 – kolumna, 7- uchwyt suwliwy, 8 – łącznik i uszczelnienie,<br />

9 – kabel uziemiający, 10 – post-kolumna wstępnie częściowo wypełniona na sucho<br />

(dp=60 μm), 11, 11’ – głowice wylotowa i wlotowa, 12 – przewód wlotowy (rurka), 13, 13’ – cylinder<br />

miarowy lub zbiornik próżniowy, 14 – „pływający tłok”<br />

W – wzbudnik wibracji wraz z czujnikiem wibracji i oscyloskopem, T - urządzenie udarowania<br />

kolumn [31], B – łaźnia ultradźwiękowa, WP – pogrążalny wzbudnik ultradźwiękowy<br />

109


LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA (pozycje w posiadaniu Biblioteki Wydziału<br />

Chemicznego PG, w przypadku niektórych pozycji - istnieją na rynku nowsze<br />

wydania)<br />

w języku angielskim<br />

1. L.R Snyder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, “Practical HPLC Method Development”,<br />

Willey, New York, NY, 1998.,<br />

2. J. Cazes (ed), “Encyclopedia of Chromatography”, Marcel Dekker, New,<br />

York, 2001.,<br />

3. P. Jandera, J. Churacek, “Gradient Elution in Column Liquid Chromatography”,<br />

Elsevier, Amsterdam, 1985.,<br />

4. O. Mikes, “HPLC, of Biopolimers and Biooligomers”, Elsevier, Amsterdam,<br />

1988.,<br />

5. J.W. Dolan, L.R. Snyder, “Troubleshooting LC Systems”, Humana<br />

Press, Clifton, New York, 1989.,<br />

6. K. Hostettman, A. Morston, “Preparative Chromatography – Techniques,<br />

Applications“, Springer Verlag, 1998.,<br />

7. H. Jork, W. Funk, W. Fischer, H. Wimmer, “Thin-Layer Chromatography<br />

– Reagents and Detection Methods”, vol. 1a – Physical and Chemical<br />

Detection Methods: Fundamentals, Reagents, VCH Publishers, Weinheim,<br />

1990.,<br />

8. D. M. Ruthven, “Encyclopedia of Separation Technology”, vol. 1-2,<br />

J. Willey. 1997.,<br />

9. A.S. Grandisson (ed), M.J. Lewis (ed), “Separation Processes in the<br />

Food and Biotechnology Industries – Principles and Applications”,<br />

Woodhoed Publ. Ltd., Camridge, England, 1998,<br />

10. V. R. Mayer, “Practical High-Performace Liquid Chromatography”, John<br />

Wiley and Sons, Chichester, 1994<br />

w języku polskim<br />

1. Z. Witkiewicz, „Podstawy chromatografii”, wyd. II, a szczególnie III,<br />

WNT, Warszawa, odpowiednio: 1992, 2000, 2005.<br />

2. D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka. „Chromatografia żelowa”,<br />

PWN, Warszawa, 1989.<br />

3. R. Rosset, H. Kołodziejczyk, “Współczesna chromatografia cieczowa -<br />

ćwiczenia i zadania”, PWN, Warszawa 2001.<br />

4. B. Walczak, J, Śliwiok, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa<br />

(HPLC)”, Skrypty Uniwersytetu Śląskiego, skrypt nr 429, Uniwersytet<br />

Śląski, Katowice 1989.<br />

5. Z. Witkiewicz, „Nowe kierunki w chromatografii”, WNT, Warszawa 1988.<br />

6. M. Kamiński, „Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowej,<br />

jako metody otrzymywania substancji”, rozprawa habilitacyjna, Politechnika<br />

Gdańska, Gdańsk, 1992.<br />

110


Pozycje o znaczeniu historycznym, ale opisane zasady teoretyczne są nadal<br />

aktualne i przydatne dla zrozumienia zjawisk:<br />

7. R.J. Hamilton, P.A. Sewell, „Wysokosprawna chromatografia cieczowa”,<br />

PWN, 1982.<br />

8. J.S. Kowalczyk (ed.), „Podstawy podziałowej i adsorpcyjnej chromatografii<br />

cieczowej”, Wrocław, Warszawa, Kraków, Gdańsk, Zakład Narodowy<br />

im. Ossolińskich, Wydawnictwo Polskiej Akademii Nauk, Ossolineum,<br />

1973.<br />

9. A. Zlatkis (ed), V. Pretorius, (ed), „Preparatywna chromatografia gazowa”,<br />

WNT, Warszawa 1975.<br />

10. L. R. Snyder, “Prioncipless of Adsorpition Chromatography”, Mercel<br />

Dekker, Nowy York, 1968<br />

11. E. Stahl, “Thin-Layer Chromatography – A Laboratory Handbook”,<br />

Springer, Berlin, wydanie drugie 1969.<br />

12. J.J. Kirkland (praca zbiorowa), „Współczesna chromatografia cieczowa”,<br />

PWN, Warszawa, 1976<br />

LITERATURA ŹRÓDŁOWA<br />

1. Bildingmayer B.A., Preparative Liquid Cromatography , (P.D. McDonald<br />

Ed), Elsevier, Amsterdam, 1987.<br />

2. Hostettman K., Preparative Chromatographic Technics: Applications in<br />

Natural Product Isolation, Springer - Verlag, 1986.<br />

3. Scaven M.D. and Hammond P.M., J.Chem. Tech. Biotechnol. 46, 85<br />

(1989).<br />

4. Jones K., Chromatographia, 25, 437, 443, 547, 577 (1988).<br />

5. Kamiński M., Rozprawa habilitacyjna, Politechnika Gdańska, Wydział<br />

Chemiczny,Gdańsk 1992.<br />

6. Knox J.H., Pyper H. M., J. Chromatogr. 363 , 1 (1986).<br />

7. Cox G.B., Snyder L.R. and Dolan L.W., J. Chromatogr., 484, 409, 425,<br />

483, (1989).<br />

8. Wawrzynowicz T., Soczewiński E. and Czapińska K., Chromatographia,<br />

20, 223 (1985).<br />

9. Soczewiński E, Czapińska K. and Wawrzynowicz T., Separ. Sci., 22,<br />

210 (1987),<br />

10. Verzele M., de Conink M., Vinderogel J. and Develee C., J. Chromatogr.,<br />

450, 47 (1988).<br />

11. Katti A. and Guiochon G., Anal. Chem. 61, 982 (1989).<br />

12. Proceedings of the 9th International Symposium “Preparative and Industrial<br />

Chromatography” PREP-92, 6-8 April, 1992 Nancy, France.,<br />

13. Kamiński M., Śledzińska B. and J. Klawiter., J. Chromatogr., 367, 45<br />

(1986).<br />

111


14. Hupe K.P. and Lauer H.H., J. Chromatogr., 203, 41 (1981).<br />

15. Guiochon G., J.Chromatogr., 185, 3 (1979).<br />

16. Klawiter J., Kamiński M. and Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 207<br />

(1982).<br />

17. Leutert Th. von Arx E., J. Chromatogr., 292, 33 (1984).<br />

18. Kamiński M., Reusch J.F., Preparative Chromatography, 1(4), 367<br />

(1992).<br />

19. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 356, 47 (1986).<br />

20. Coq B., Cretier G., Rocca J.L. and Portlhault M., J. Chromatogr. Sci.,<br />

19, 1 (1981).<br />

21. Martin C.W., Shalon Y., LC-GC 5, 23 (1985).<br />

22. M. Kamiński, Proceedengs of the 17 th International Symposium on<br />

“Column Liquid Chromatography - HPLC’93”, GDCh, Hamburg, May<br />

9-14, 1993, vol. 1,2.<br />

23. Snyder L.R., Cox G.B and Antle P.E., Chromatographia, 24, 82 (1987).<br />

24. Kamiński M., J. Chromatogr., 589, 61 (1991).<br />

25. Goddings J.C., Dynamics of Chromatography, Marcel Dekker, New<br />

York, 1965.<br />

26. Wroński S., Molga E., Chem. Eng. Process, 22, 123 (1987).<br />

27. Knox J.H., J. Chromatogr. Sci., 15, 352 (1977).<br />

28. Carbonell R.D. and Mc Coy B.L., Chem. Eng. J., 9, 115 (1975).<br />

29. Francotte E., Junker-Buchheit A., J. Chromatogr., 576, 1 (1992).<br />

30. Unger K.K., Proceedings of “HPLC’93”, Hamburg May 1993,<br />

31. Godbille E., Devaux P., J. Chromatogr., 122, 317 (1976).<br />

32. Collin H., Hilaireau P., de Tounemire J., LC-GC, 3, 40 (1990).<br />

33. Kamiński M. , Klawiter J., Kowalczyk J.S., J. Chromatogr., 243, 225<br />

(1982).,<br />

34. Kozak M.W., Davis E.J., Jour. Coll Interface Sci., 127, 497 (1989), 129,<br />

166 (1989).<br />

35. Głód B., Thesis, IChF Wa-wa 1985.<br />

36. Kamiński M., Reusch J.F., J. Chromatogr., 436, 367 (1988).<br />

112


Daniel JASTRZĘBSKI 1,2 , Grażyna ROMANIK 1 , Marcin M. KAMIŃSKI 3 ,<br />

Maciej TRZNADEL 1 , Anita SKRZYPCZAK 1 , Aleksandra KRÓLICKA 4 ,<br />

Marian KAMIŃSKI 1<br />

1)<br />

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Katedra Chemii Analitycznej, 80-954 Gdańsk<br />

2)<br />

Zakłady Farmaceutyczne „POLPHARMA” S.A., Kontrola Jakości JB Pharma,<br />

83-200 Starogard Gdański<br />

3)<br />

Tumor Immunology Program, German Cancer Research Center (DKFZ), Immunogenetics<br />

Division (D030), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany<br />

4)<br />

Intercollegiate Faculty of Biotechnology, University of Gdańsk and Medical University<br />

of Gdańsk, Kładki 24, 80-822 Gdańsk, Poland<br />

KOLUMNOWA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA<br />

W ROZDZIELANIU I ANALIZIE PEPTYDÓW<br />

I BIAŁEK<br />

Szybka ekspansja zastosowań peptydów i białek w biochemii i w medycynie,<br />

stymuluje ogromny wzrost zainteresowania metodami rozdzielania peptydów. Elektroforeza<br />

żelowa i kapilarna to najczęściej dotychczas wykorzystywane metody rozdzielania<br />

peptydów i białek, w celach identyfikacyjnych i analitycznych. Metody te nie<br />

są jednak przydatne do otrzymywania użytkowych ilości tych substancji. Obecnie<br />

HPLC jest najistotniejszą metodą oczyszczania i otrzymywania peptydów i białek.<br />

Ponadto techniki HPLC znajdują coraz większe zastosowanie w rozwijającej się proteomice.<br />

W pracy dokonano przeglądu najważniejszych technik chromatografii cieczowej,<br />

metod oraz procedur stosowanych do rozdzielania peptydów i białek jak<br />

również obecnych trendów w tym obszarze<br />

Słowa kluczowe<br />

Peptydy, białka, proteomika, chromatografia cieczowa, rozdzielanie<br />

WPROWADZENIE<br />

Peptydy i białka mają ogromne znaczenie w organizmach żywych jako<br />

enzymy, hormony, przeciwciała i inne składniki komórek, tkanek i płynów fizjologicznych.<br />

Niektóre peptydy wykazują także aktywność antybiotyczną<br />

oraz jako źródło antybiotyków peptydowych znajdują się w obszarze zainteresowań<br />

badaczy w ostatnich latach [1-4].<br />

Potrzeba uzupełniania braków określonych peptydów i białek w organizmie,<br />

albo stosowania antybiotyków lub innych leków peptydowych, pociąga<br />

za sobą konieczność otrzymywania tych substancji w formie biologicznie<br />

aktywnej. Najczęściej, wymagana jest równocześnie, bardzo wysoka czy-<br />

113


stość izolowanych substancji. Peptydy i białka można otrzymać w sposób<br />

tradycyjny, wyodrębniając je z tkanek zwierzęcych (w tym ludzkich), a niekiedy<br />

z roślin. W ostatnich latach rośnie znaczenie chemicznych, a szczególnie<br />

biotechnologicznych metod syntezy peptydów i białek.<br />

Dobór metody rozdzielania peptydów i białek od zanieczyszczeń,<br />

a następnie takich warunków wyodrębniania, które zapewniają otrzymanie<br />

produktu o najwyższej aktywności biologicznej, stanowi z reguły trudny problem<br />

rozdzielczy i technologiczny. Najczęściej łatwiejsze jest opracowanie<br />

metodyki oznaczania zawartości izolowanych substancji w poszczególnych<br />

etapach syntezy, czy biosyntezy. Jednak, rozwiązanie każdego z tych problemów<br />

wymaga z reguły znacznego nakładu pracy eksperymentalnej.<br />

Wśród różnych metod rozdzielania peptydów i białek, dominujące<br />

znaczenie identyfikacyjne oraz analityczne posiadają metody elektroforetyczne<br />

[5]. Ważne i rosnące znaczenie posiada też wysokosprawna chromatografia<br />

cieczowa (HPLC). Dla przykładu kolumnowa chromatografia cieczowa<br />

bardzo często stosowana jest w przemyśle farmaceutycznym do<br />

izolowania peptydów i białek na dużą skale.<br />

Obecnie, do rozdzielania białek i peptydów metodami chromatografii<br />

cieczowej wykorzystywane są praktycznie wszystkie układy chromatograficzne.<br />

Stosowana jest chromatografia żelowa (GPC - gel permeation chromatography,<br />

albo SEC – size exclusion chromatography) [6,7], chromatografia<br />

jonowymienna (IEC – ion exchange chromatography) [8,9], z chromatografią<br />

wykluczania jonowego (ion exclusion chromatography), włącznie.<br />

Chromatografia w układzie faz odwróconych (RP-HPLC) jak i chromatografia<br />

oddziaływań hydrofobowych (HIC) są bardzo często stosowane do rozdzielania<br />

białek o wysokiej masie molekularnej. Nawet chromatografia adsorpcyjna<br />

w układzie faz normalnych (NP-HPLC – normal phase high performance<br />

chromatography), szczególnie, z chemicznie związaną fazą<br />

stacjonarną w układzie oddziaływań hydrofilowych (HILIC). W dodatku, szerokie<br />

zastosowanie znajdują metody chromatografii powinowactwa (Affinity<br />

Chromatography – AC), jako odrębna grupa metod separacyjnych o szczególnie<br />

wysokiej selektywności i specyficzności [10,11].<br />

W literaturze można znaleźć wiele procedur dotyczących rozdzielania<br />

konkretnych peptydów, białek i innych substancji, stanowiących zanieczyszczenia.<br />

Nie opracowano, jednak, dotąd takich uogólnionych reguł, które<br />

umożliwiałyby dobór optymalnych warunków rozdzielania zależnie od pierwszo-<br />

i wyżej - rzędowej struktury peptydów i białek. Analiza literatury, prezentującej<br />

procedury rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem chromatografii<br />

cieczowej, pozwala zauważyć pewne dominujące kierunki<br />

postępowania i uogólnione zasady doboru najkorzystniejszych warunków<br />

rozdzielania tych substancji.<br />

W pracy przedstawiono najczęściej stosowane sposoby wpływania na<br />

selektywność i sprawność układu w przypadku najważniejszych metod rozdzielania<br />

peptydów i białek z wykorzystaniem elucyjnej chromatografii cieczowej.<br />

114


Publikacja opisuje zjawiska, efekty oraz oddziaływania towarzyszące procesom<br />

chromatografii cieczowej oraz możliwości wpływania na retencje peptydów<br />

i białek, jak również na selektywność rozdzielania. Przedstawiono również<br />

odpowiednie przykłady procedur rozdzielania.<br />

Peptydy i białka są, jak wiadomo, kwasami i zasadami. W strukturze<br />

cząsteczki złożonej z ‘n’ aminokwasów występuje n-1 wiązań peptydowych.<br />

Często w cząsteczkach tych substancji występują też często tzw. mostki disiarczkowe<br />

oraz wewnętrzne wiązania wodorowe, determinujących drugoi<br />

trzecio- rzędową strukturę molekuły. Obecność aminokwasów zawierających<br />

hydrofobowe fragmenty wpływa na wzrost ogólnej hydrofobowości cząsteczki<br />

peptydu lub białka. W zależności od pH rozpuszczalnika cząsteczki<br />

peptydów i białek mogą ulegać kilku ważnym procesom. W pH wyższym od<br />

punktu izoelektrycznego może mieć miejsce dysocjacja protonu od zewnętrznej<br />

grupy karboksylowej. Co więcej, w pH poniżej punktu izoelektrycznego<br />

może mieć miejsce protonowanie n-terminalnej grupy aminowej.<br />

Przy pH bliskim punktowi izoelektrycznemu następuje szczególnie silne obniżenie<br />

rozpuszczalności peptydu.<br />

W zależności od pH eluentu i jego kompozycji (np. modyfikatory eluentu<br />

powodujące powstanie par jonowych, sole, modyfikatory) peptydy<br />

i białka podlegać następującym procesom:<br />

- dysocjacji elektrolitycznej,<br />

- tworzeniu par jonowych z innymi peptydami oraz z jonowymi<br />

dodatkami do eluentu,<br />

- pozornemu spadkowi hydrofobowości peptydów i białek na części<br />

powierzchni przy stężeniu soli bliskiemu „punktu wysolenia”,<br />

- solwatacji przez akceptory protonów lub kwasy,<br />

- formowaniu się agregatów białek (dimerów i trimerów).<br />

Wszystkie te zjawiska mają wpływ na zachowanie się cząsteczek peptydów<br />

i białek w roztworach oraz na ich oddziaływania z fazą stacjonarną<br />

w różnych układach chromatograficznych.<br />

Na retencję i stopień rozdzielenia peptydów i białek ma wpływ szereg<br />

parametrów układu chromatograficznego, takich, jak: typ powierzchni sorpcyjnej<br />

i uboczne oddziaływania na powierzchni sorbentu, rodzaj ligandu<br />

związanego z sorbentem, powierzchnia właściwa fazy stacjonarnej, wielkość<br />

i porowatość ziaren wypełnienia kolumny, a także, skład, pH, temperatura,<br />

prędkość przepływu eluentu, oddziaływania dodatkowych składników eluentu<br />

np. stężenie soli w eluencie, przebieg programu elucji i inne parametry,<br />

w tym nawet ciśnienie podczas rozdzielania [12].<br />

W tabeli 1 przedstawiono przykłady często wykorzystywanych warunków<br />

stosowania chromatografii cieczowej do rozdzielania peptydów / białek<br />

w różnych układach chromatograficznych. Dane te mogą być przydatne dla<br />

wstępnego doboru warunków przy rozwiązywaniu problemów rozdzielczych,<br />

dotyczących peptydów i białek.<br />

Najczęściej stosowane są układy faz odwróconych oraz chromatografia<br />

jonowymienna. Jednakże, wstępna separacja wykonywana jest z wykorzystaniem<br />

chromatografii żelowej (GPC) lub chromatografia wykluczania<br />

115


(SEC). Ostatnio, do tego celu wykorzystuje się „twarde” sorbenty typu DIOL,<br />

szczególnie te, których struktura porowata bazuje ma „matrycy” z porowatego<br />

di-tlenku cyrkonu, albo di-tlenku tytanu. Ponadto, HIC a w szczególności<br />

AC stosowane są do rozdzielania i izolowania peptydów i białek.<br />

Dodatkowo, w przypadku rozdzielania białek o dużej masie molekularnej<br />

Janzen et al. [13] wprowadzili do użytku sorbenty typu tentacle. Takie sorbenty<br />

chronią przed zbytnim zaburzeniem struktury rozdzielanych białek<br />

i obniżeniem aktywności (trwała, nieodwracalna denaturacja)<br />

Tabela 1. Przykłady praktycznego zastosowania HPLC do rozdzielania peptydów<br />

i białek wraz z warunkami chromatograficznymi<br />

116


ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK W UKŁADACH<br />

FAZ ODWRÓCONYCH<br />

Metody RP-HPLC są powszechnie stosowane do rozdzielania peptydów<br />

i białek w szczególności do celów analitycznych, a także w proteomice.<br />

Rozdzielanie peptydów i białek w układach faz odwróconych odbywa się na<br />

powierzchni fazy stacjonarnej o określonym stopniu hydrofobowości [18],<br />

z zastosowaniem sorbentów typu C18, C8, C4 (C5, C6), C2, fenyl, alkilofenyl,<br />

alkilonitryl i inne. Z reguły rozdzielanie peptydów i białek przeprowadza<br />

się w warunkach elucji gradientowej. Faza ruchoma bardzo często zawiera<br />

wodę i acetonitryl z dodatekiem kwasu trifluorooctowego (TFA), zarówno<br />

w eluencie A (niższe stężenie acetonitrylu 5 – 25%) jak i w eluencie B (wyższe<br />

stężenie acetonitrylu 75 – 95%).<br />

Rozdzielane cząsteczki peptydów i białek są złożone z różnych aminokwasów<br />

(hydrofobowych lub hydrofilowych), ułożonych w zróżnicowanej<br />

kombinacji. Retencja zależy od wynikowej hydrofobowości rozdzielanych<br />

cząsteczek, albo ich solwatów, tzn. zarówno od struktury i rozkładu hydrofobowości<br />

w cząsteczkach, jak i od hydrofobowości solwatów istniejących<br />

w równowadze ze składnikami eluentu.<br />

Podczas rozdzielania dużych cząsteczek polipeptydów i białek<br />

w układach faz odwróconych dość często obserwowane są niekorzystne<br />

przypadki zmian konformacyjnych łańcucha aminokwasowego [24] i w konsekwencji<br />

denaturacja produktu [25]. Nie polarna faza stacjonarna, organiczna<br />

faza ruchoma i kwaśne, albo alkaliczne dodatki do fazy ruchomej<br />

(kwas trifluorooctowy (TFA) lub inny, albo amina) – to czynniki mające potencjalne<br />

działanie denaturujące, a nawet hydrolityczne. Denaturacja objawia<br />

się najczęściej zmianą, retencji substancji, a hydroliza - zwiększeniem<br />

ilości pików. Aby uniknąć hydrolizy trzeba kontrolować pH i temperaturę rozdzielania<br />

[26]. Denaturacji można, także uniknąć przez dodatek do eluentu<br />

soli stabilizujących strukturę białka (np. NaCl, AcNa, (NH 4 ) 2 SO 4 ). Trzeba się,<br />

jednak, liczyć się z tym, że taki dodatek często modyfikuje retencję substancji<br />

[15].<br />

Najczęściej do rozdzielania peptydów i białek w układach faz odwróconych<br />

są stosowane sorbenty siloksanowe modyfikowane grupami alkilowymi,<br />

fenylowymi i difenylowymi Wśród grup alkilowych najczęściej wykorzystuje<br />

się grupę butylową (C4), kolejno pentylową (C5) i oktylową (C8).<br />

Wiele jest też zastosowań oktadecylowych (C18) faz stacjonarnych. Rys. 1<br />

przedstawia przykład rozdzielania 9 białek w kolumnie wypełnionej sorbentem<br />

typu C5, [27], a chromatogram na rys. 2 to przykład rozdzielania 8 peptydów<br />

i białek z wykorzystaniem kolumny C8.<br />

117


5<br />

1<br />

2<br />

4<br />

3<br />

6<br />

7<br />

8 9<br />

0 2 4 6 8 10 12 14 16<br />

Rys. 1. Rezultat rozdzielania mieszaniny peptydów z zastosowaniem kolumny C5 Discovery ®<br />

BIO Wide Pore, 150x4,6 mm(5μm). Eluenty: A-H 2 O :AcCN :PFPA (kwas penta fluoropropionowy)<br />

81 :19 :0,1, B-H 2 O :AcCN :PFPA 62 :38 :0,1. Program elucji: 0-19 min 0-100% B,<br />

v=1,0 ml/min, T=30 0 C. Detekcja UV 215 nm; 1 - Arg8-Vassopressin, 2 - Bradykinin fragment 1-5,<br />

3 - Oxytocin, 4 - Met-Enkephalin, 5 - Luteinizing Hormone, 6 - Leu-Enkephalin, 7 - Bradykinin,<br />

8 - Bombesin, 9 - Substancja P [34]<br />

Rys. 2. Przykład rozdzielania peptydów i białek z zastosowaniem kolumny C8. Kolumna: YMC8<br />

Octyl S-5 120A column, 250x4,6 mm (5μm); Eluent: A-0,1% TFA, B-AcCN; Program elucji:<br />

0-30 min 20-50% B, v=1,0 ml/min; Detekcja UV 200 nm; Rozdzielane substancje: 1 - Bradykinin,<br />

2 - Met-Enkephalin, 3 - Angiotensin I, 4 - Leu-Enkephalin, 5 - Substance P, 6 - Insulin,<br />

7 - Lysozome, 8 - Myoglobin [35]<br />

118


Głównym ograniczeniem stosowania kolumn z chemicznie modyfikowanym<br />

wypełnieniem siloksanowym jest ograniczone pH fazy ruchomej.<br />

Stosowane pH powinno być bezpieczne dla wiązań grup funkcyjnych z żelem<br />

krzemionkowym i nie powodać ich hydrolizy (typowo 2 - 8.5, a skrajnie<br />

1,5-10, w przypadku specjalnie opracowanych faz stacjonarnych [28]).<br />

Okazjonalnie stosowane są wypełnienia polimerowe oparte o kopolimer<br />

styrenu-diwinylobenzenu, albo poli-metakrylan alkilu. Do powierzchni<br />

sorpcyjnej najczęściej dodatkowo związane są cząsteczki oktadekanu (C18)<br />

[29, 30]. Ostatnio, mimo wysokiej ceny, rośnie znaczenie polimerowych sorbentów.<br />

Powodem jest ich trwałość w szerokim zakresie pH od 0,8 – 13,5.<br />

Brak wolnych grup siloksanowych poprawia symetrię pików i w konsekwencji<br />

sprawność rozdzielania [29, 30]. Wadą kolumn wypełnionych polimerowymi<br />

sorbentami są niskie prędkości przepływu, jakie powinno się stosować podczas<br />

rozdzielania substancji o wysokich masach cząsteczkowych. Zbyt duże<br />

prędkości przepływu prowadzą do otrzymywania nadmiernie poszerzonych<br />

pików, szczególnie, pików substancji silnie hydrofobowych i w szczególności<br />

o wysokiej masie molekularnej. Jest to wynikiem niekorzystnej kinetyki procesów<br />

sorpcji / desorpcji spowodowanej tendencją do rozpuszczania się<br />

cząsteczek rozdzielanych substancji w powierzchniowej warstwie niepolarnego<br />

sorbentu i bardzo małej dyfuzji dużych molekuł.<br />

Sporadycznie stosowane są inne wypełnienia, np. sorbenty siloksanowe<br />

modyfikowane równocześnie grupami C8 i hydrofilowymi grupami –<br />

COOH, pochodzącymi z nienasyconych kwasów karboksylowych, albo specyficznie<br />

modyfikowane sorbenty siloksanowe o podwyższonej stabilności<br />

mechanicznej i chemicznej [31].<br />

Długość łańcucha alkilowego ma istotny wpływ na selektywność rozdzielania<br />

peptydów i białek. Z jednej strony River i współpracownicy [32]<br />

stwierdzili, że krótkie kolumny wypełnione polisiloksanem modyfikowanym<br />

C4 sprawdzają się najlepiej w rozdzielaniu dużych peptydów i białek. Natomiast<br />

Hartman i współpracownicy [33] udowodnili przydatność kolumn siloksanowych<br />

modyfikowanych C8 do rozdzielania naturalnych i syntetycznych<br />

peptydów oraz niewielkich białek posiadających charakter hydrofilowy.<br />

W przypadku polipeptydów, szczególnie, jeśli zawierają w łańcuchu pierścienie<br />

aromatyczne, skuteczne okazują się kolumny siloksanowe modyfikowane<br />

grupami difenylowymi [32].<br />

Kolumny siloksanowe modyfikowane grupami oktadecylowymi (C18),<br />

o małych średnicach porów, są najskuteczniejsze do rozdzielania małych,<br />

hydrofilowych peptydów i fragmentów białek złożonych z 2-10 aminokwasów<br />

[32]. Przy czym do rozdzielania peptydów w zastosowaniu do proteomiki<br />

stosuje się, coraz częściej, tzw. kolumny mikropakowane (o średnicy<br />

1-1,5 mm) lub sorbent typu CSP (Core Surface Particles) jak również często<br />

stosowane są kolumny monolityczne. Kolumny te zapewniają bardzo wysoką<br />

sprawność i szybkość rozdzielania (do 350 tys. półek teoretycznych na<br />

metr długości wypełnienia kolumny).<br />

Fazy stacjonarne, zawierające krótkie alifatyczne łańcuchy, umożliwiają<br />

skuteczne rozdzielanie silnie hydrofobowych peptydów i białek, a posiada-<br />

119


jące długie łańcuchy alkilowe, są odpowiedniejsze do rozdzielania cząstek<br />

o charakterze mniej hydrofobowym [34].<br />

Wskazane jest, aby sorbenty o modyfikowanej chemicznie powierzchni<br />

sorpcyjnej były zabezpieczone przed oddziaływaniem resztkowych grup<br />

hydroksylowych z fazą ruchomą, tzn. aby miały tzw. „end-capping” - zastąpienie<br />

wolnych grup OH grupami OCH 3 , albo poprzez silanizację. Polepsza<br />

to symetrię pików, a stąd stopień rozdzielenia w przypadku mniejszych peptydów<br />

i umożliwia wysoki stopień odzysku w przypadku białek [35].<br />

Szeroko badany był wpływ rozkładu wielkości ziaren i porowatości<br />

wypełnienia kolumny na rozdzielanie peptydów i białek [36]. Stwierdzono<br />

wpływ takich parametrów jak rozmiar i kształt ziaren, średnica i kształt porów<br />

oraz powierzchnia wymiany masy. W zależności od wielkości rozdzielanych<br />

peptydów i białek, dobiera się złoże o odpowiednich średnicach porów. I tak,<br />

dla małych peptydów (do 10 aminokwasów) Krstulovic i Brown [37] zalecają<br />

kolumny z wypełnieniem o średnicy porów do 60Å. Dla średnich peptydów<br />

(10-30 aminokwasów) i małych białek najskuteczniejsze są kolumny o średnicy<br />

porów 100Å, 120Å i 150Å. Natomiast dla większych peptydów (ponad<br />

30 aminokwasów) i dla białek polecają sorbenty o porach 300Å i większych.<br />

Tweeten i Tweeten [29] stwierdzili w przypadku kolumn wypełnionych<br />

makroporowatym poli -styrenem-diwinylobenzenem, że dalszy wzrost wielkości<br />

porów (do 1000Å) nie wpływa na polepszenie retencji białek o dużej<br />

masie cząsteczkowej (do 335 kD). W celu maksymalizacji sprawności kolumny<br />

do zastosowań analitycznych wykorzystuje się sorbenty o małych<br />

ziarnach (o średnicy 5 i 3 μm), a nawet coraz częściej, wspomniane wyżej,<br />

nieporowate sorbenty o średnicy ziarna 1 μm. Wtedy stosowane kolumny<br />

mogą mieć nawet tylko 10 mm długości [21]. Jednakże, najczęściej stosuje<br />

się kolumny o długościach 125, 150 i 250 mm. Przy czym, im mniejsza wielkość<br />

ziaren sorbentu, tym krótsza może być kolumna. Obecnie duże zainteresowanie<br />

budzą tzw. monolityczne kolumny o porowatym wypełnieniu zajmujących<br />

całą objętość kolumny. Charakteryzują się one szczególnie niskimi<br />

wartościami tzw. impedancji rozdzielania [38]. Bez wątpienia w najbliższym<br />

czasie kolumny monolityczne będą powszechnie stosowane.<br />

ELUENTY, MODYFIKATORY ELUENTU I PROGRAMY ELUCJI<br />

STOSOWANE W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH<br />

W układach faz odwróconych głównym czynnikiem wpływającym na<br />

retencję jest zawartość organicznych składników w eluencie, takich jak acetonitryl<br />

(AcCN), metanol (MeOH), etanol (EtOH), izopropanol (iPrOH), tetrahydrofuran<br />

(THF), czy dioxan (DX) [39]. Dodatkowo, w celu optymalizacji<br />

warunków rozdzielania należy wpływać na retencję substancji o charakterze<br />

zarówno kwaśnym jak i zasadowym, do których należą peptydy i białka, poprzez<br />

dodatek kwaśnego lub zasadowego modyfikatora do eluentu.<br />

Rozdzielanie peptydów i białek najczęściej przeprowadza się w warunkach<br />

elucji gradientowej. Program zmian stężenia organicznego składni-<br />

120


ka eluentu (AcCN, MeOH) ustala się w zakresie od 10-25% v/v do 75-90% v/v,<br />

dodając do eluentu A i B modyfikatora zmieniającego pH eluentu i cofającego<br />

dysocjację kwasowo-zasadową, w konsekwencji modyfikującego hydrofobowość<br />

i polarność cząsteczek peptydów / białek.<br />

Najczęściej wykorzystywanym organicznym składnikiem eluentu jest<br />

acetonitryl. Powodem tego jest jego wysoka transparentność przy niskich<br />

długościach fali w zakresie UV. Ponadto jego niska lepkość oraz wysoka lotność,<br />

która ułatwia dalszą izolację produktu [40]. Rozpuszczalność peptydów<br />

i białek jest, także lepsza w acetonitrylu niż w innych organicznych<br />

składnikach eluentu, stosowanych w RP-HPLC.<br />

Znacznie rzadziej wykorzystywane są alkohole. Niekiedy stosuje się<br />

izopropanol, aby zwiększyć rozpuszczalność w fazie ruchomej solwatów dużych<br />

peptydów i białek [41]. Użycie izopropanolu lub jego mieszaniny z acetonitrylem<br />

(w proporcji od 1:2 do 2:1) jest uzasadnione w przypadku rozdzielania<br />

peptydów i białek stosunkowo bardzo hydrofobowych. Izopropanol,<br />

jako rozpuszczalnik o wyższej sile elucyjnej w układach faz odwróconych od<br />

AcCN, silniej oddziałuje z centrami alkilo - siloksanowymi sorbentu [42] niż<br />

np. metanol.<br />

Najczęściej stosowaną szybkością narostu objętościowego udziału<br />

składnika organicznego do rozdzielania peptydów i białek jest 2-5%/min.<br />

Zbyt wolny narost stężenia hydrofobowego składnika eluentu może powodować<br />

zbytnie rozcieńczenie otrzymywanych frakcji eluatu [43]. Końcowe<br />

stężenie rozpuszczalnika organicznego w programie elucji nie powinno prowadzić<br />

do całkowitego usunięcia wody z kolumny. Utrudniałoby to doprowadzanie<br />

fazy stacjonarnej do równowagi z początkowym eluentem. To może<br />

prowadzić do braku powtarzalności retencji peptydów i białek, szczególnie<br />

wcześnie eluowanych substancji. Najczęściej nie przekracza się 95% substancji<br />

organicznej w eluencie.<br />

Natężenie przepływu fazy ruchomej przez kolumnę klasycznie pakowaną<br />

o średnicy 4-4,6 mm jest rzędu 0,8-2,0 ml/min oraz dla kolumny monolitycznej<br />

aż do 5 ml/min. Od natężenia przepływu zależy sprawność rozdzielania<br />

oraz ciśnienie na wlocie do kolumny. Bylina i współpracownicy<br />

zauważyli wpływ ciśnienia panującego w kolumnie na retencję podczas rozdzielania<br />

insuliny w warunkach izokratycznych [12]. Wzrost ciśnienia w kolumnie<br />

o 1 bar powodował wzrost czasu retencji białka o 1-5 s. Ostatnio Guiochon<br />

i współpracownicy [44] potwierdzili występowanie tych efektów<br />

i podjęli próby ich wyjaśnienia. Najważniejsze modyfikatory fazy ruchomej,<br />

stosowane w układach faz odwróconych, zestawiono w tabeli 2.<br />

121


Tabela 2. Modyfikatory fazy ruchomej najczęściej stosowane w układach faz<br />

odwróconych<br />

H 3 PO 4 i jego sole<br />

(np.<br />

(NH 4 ) 3 PO 4 )<br />

HFBA (kwas<br />

heksa fluoro butyrowy)<br />

HCOOH,<br />

CH 3 COOH,<br />

HCl<br />

Modyfikator Działanie (korzystne i niekorzystne) Literatura<br />

Kwaśne<br />

Kwas trójchlorooctowy<br />

(TFA)<br />

- Eliminuje jonizację ewentualnych wolnych grup siloksanowych;<br />

- Cofa dysocjację grupy karboksylowej na „C-końcu” aminokwasu,<br />

co zwiększa hydrofobowość tej części peptydu;<br />

- Powoduje wzrost polarności cząsteczki przez tworzenie<br />

kationu R-NH + 3 na „N-końcu” peptydu [52];<br />

- Dostarcza anionów CF 3 COO - , które stanowią przeciwjon<br />

dla „N-końcowego” kationu amoniowego tworząc z nim parę<br />

jonową;<br />

- Powoduje solwatację wiązań peptydowych, co ma znaczenie<br />

szczególnie przy dużych peptydach i białkach;<br />

- Podwyższa absorpcję światła przez eluent przy niskich<br />

długościach fali światła w przypadku detekcji UV [53] - pogarsza<br />

granicę oznaczalności związku;<br />

- Najczęściej stosowane stężenie 0,05 - 0,13% (v/v), stężenie<br />

poniżej 0,075% może prowadzić do poszerzenia pików i<br />

obniżonej retencji peptydów, a powyżej 0,1% do hydrolizy<br />

wiązań fazy stacjonarnej z powierzchnią żelu krzemionko-<br />

[44-46]<br />

wego;<br />

- Obniżenie retencji peptydów (w porównaniu do dodatku<br />

TFA, czy do braku H 3 PO 4 lub jego soli);<br />

[40]<br />

- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne; [41], [47]<br />

- Działanie podobne do TFA, jednak mniej selektywne;<br />

- Kwas solny powoduje jedynie protonowanie grupy karboksylowej<br />

„C-końca” peptydu bez tworzenia pary jonowej na<br />

„N-końcu” związku;<br />

- Pewne podwyższenie retencji, ale wpływ na retencję<br />

mniejszy niż H 3 PO 4 ;<br />

Zasadowe<br />

NH 4 HCO 3 - Podwyższa pH i zmienia nieco hydrofobowość peptydu /<br />

białka;<br />

CH 3 COONH 4 - Działanie podobne do NH 4 HCO 3 [50, 51]<br />

Trójetyloamina<br />

(TEA)<br />

- Dodawana jednocześnie z H 3 PO 4 lub HCOOH w celu [52, 53]<br />

zmiany pH;<br />

- Blokuje wolne grupy hydroksylowe sorbentu, co może<br />

przyczynić się do polepszenia kształtu pików;<br />

[46]<br />

[41]<br />

Wszystkie modyfikatory wymienione w tabeli 2 zmieniają pH eluentu<br />

i hydrofobowość cząsteczek rozdzielanych substancji przez solwatacje i tworzenie<br />

par jonowych. Modyfikatory kwaśne mają na celu zmniejszenie stopnia<br />

kwaśnej dysocjacji peptydu, a dodatki zasadowe eliminują protonowanie<br />

terminalnych grup NH 2 i powodują dysocjację grupy karboksylowej.<br />

122


ROZDZIELANIE PEPTYDÓW I BIAŁEK<br />

W UKŁADACH JONOWYMIENNYCH<br />

W chromatografii jonowymiennej jest zasadą, że substancje posiadające<br />

ładunek elektryczny są rozdzielane na kolumnie, która ma na powierzchni<br />

sorpcyjnej odwrotny ładunek elektryczny do substancji rozdzielanych.<br />

Grupy jonowe wymieniacza jonowego są kowalencyjnie wiązane<br />

z powierzchnią sorbentu i ich ładunki elektryczne są kompensowane przez<br />

jony obecne w eluencie (buforze). Po wprowadzeniu próbki do kolumny centra<br />

jonowe słabo związane z eluentem, ulegają wymianie na jony substancji<br />

rozdzielanych. Wykorzystuje się okoliczność, że peptydy i białka mogą posiadać<br />

zarówno ładunek dodatni, jak ujemny w zależności od pH buforu.<br />

Podczas stosowania buforów o charakterze kwaśnym, peptydy występują<br />

w postaci kationów (zahamowanie dysocjacji grup karboksylowych i sprotonowanie<br />

grup aminowych oraz najbardziej polarnych grup NH 2 w połączeniach<br />

peptydowych). W przypadku stosowania buforów zasadowych, peptydy<br />

i białka występują w postaci anionów (sprotonowane grupy aminowe są<br />

zasadami wiążącymi grupy hydroksylowe, a grupy karboksylowe są zdysocjowane,<br />

albo tworzą pary jonowe ze sprotonowanymi kationami zasadowych<br />

dodatków). Netto dodatni lub ujemny elektryczny ładunek peptydu /<br />

białka umożliwia jego związanie z odpowiednimi centrami fazy stacjonarnej.<br />

Z zastosowaniem gradientu soli lub niekiedy, dodatkowo zmiany pH buforu,<br />

powoduje się stopniową elucję substancji związanych z powierzchnią wymieniacza<br />

jonowego.<br />

Na retencję peptydów i białek w warunkach chromatografii jonowymiennej<br />

wpływają głównie cztery czynniki: siła jonowa eluentu, jego pH i powierzchnia<br />

właściwa wymieniacza jonowego (gęstość obsadzenia molekułami<br />

wymieniacza jonowego), a także rozkład wielkości porów adsorbentu.<br />

Zwiększając siłę jonową eluentu obniżamy retencję peptydów i białek<br />

w przypadku obu wymieniaczy, kationowych i anionowych. Zwiększając pH<br />

buforu obniżamy retencję na kationitach, a podwyższamy na anionitach<br />

i odwrotnie - zmniejszając pH buforu podwyższamy retencje na kationitach,<br />

a obniżamy na anionitach. Poszerzenie zakresu średnic porów w stosunku<br />

do hydrodynamicznej średnicy cząsteczek rozdzielanych białek przyczynia<br />

się do podwyższenia retencji w przypadku stosowania kationitów [19]<br />

i prawdopodobnie także w przypadku anionitów.<br />

Wzrost stopnia obsadzenia powierzchni jonitu grupami jonowymiennymi<br />

wpływa, oczywiście, na wzrost retencji w konkretnych warunkach rozdzielania.<br />

Jednak, do rozdzielania peptydów i białek w warunkach chromatografii<br />

elucyjnej nie są zalecane wymieniacze jonowe o bardzo wysokim<br />

stopniu nasycenia powierzchni sorpcyjnej grupami jonowymiennymi, w przeciwieństwie<br />

do chromatografii jonowymiennej w warunkach selektywnej<br />

sorpcji – desorpcji jonowymiennej, gdy pojemność jonowa wymieniacza jonowego<br />

powinna być możliwie jak najwyższa.<br />

W zależności od właściwości rozdzielanych peptydów / białek, dobiera<br />

się odpowiedni wymieniacz jonowy. Stosuje się wiele rodzajów kolumn jo-<br />

123


nowymiennych, równorzędnie kationowymienne i anionowymienne. Oba<br />

wymieniacze jonowe mogą być stosowane w wariantach słabym i mocnym.<br />

W przypadku mocnych wymieniaczy jonowych wszystkie grupy funkcyjne są<br />

w szerokim zakresie pH w postaci zjonizowanej i powinowactwo jonowe kolumny<br />

jest mało zależne od pH eluentu, ale retencja peptydów od pH eluentu<br />

zależy silnie, ponieważ w zależności od pH ich cząsteczki są w różnym<br />

stopniu zjonizowane.<br />

Jako kationity stosowane są kolumny ze związanymi na powierzchni<br />

sorpcyjnej ligandami alkilo-, albo arylo- sulfonowymi: R-SO 3 - (mocne wymieniacze,<br />

np. Fractogel SO 3 , Cellufine sulfate, SP), karboksylowymi R-COO -<br />

(słabe wymieniacze, np. Fractogel COO, Toyopearl), a także inne polimery<br />

o słabo kwaśnych grupach funkcyjnych, takie, jak Sepharoza czy Spherodex<br />

[19,55,56]. Na rys. 3 przedstawiono przykład rozdzielania 6 peptydów z zastosowaniem<br />

kolumny kationowymiennej.<br />

Rys. 3. Przykład rozdzielania małych peptydów z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej.<br />

Kolumna: Vydac 400VHP5410, 100x4,6 mm (5 μm); Eluenty: A – 20 mM TEAP in 50%<br />

AcCN, pH 2; B - 100 mM NaClO 4 in A; Program elucji: 0 - 50 min, 0 - 100% B, v=1,0 ml/min,<br />

Detekcja: UV 220 nm; 1 - Oxytocin, 2 - Eledoisin related peptide, 3 - Neurotensin,<br />

4 - Angiotensin II, 5 - Bradykinin, 6 - Angiotensin I [56]<br />

Jako anionity stosowane są kolumny o ligandach w postaci grup alkilo-,<br />

albo arylo- amoniowych, np. mocny wymieniacz z grupami trimetyloaminoetylowymi<br />

(TMAE), średnio mocny wymieniacz z grupami dietyloaminoetylowymi<br />

(DEAE), oraz słaby wymieniacz z grupami dimetyloaminoetylowymi<br />

(DMAE) [55,57]. Ligandy jonowymienne najczęściej osadzone są na matrycy,<br />

którą może być kopolimer styrenu-divinylobenzenu, żywica syntetyczna,<br />

poliwęglowodany, poliamidy, a niekiedy polimery nieorganiczne. Na rys. 4<br />

zamieszczono przykład wyników rozdzielania czterech białek w kolumnie<br />

anionowymiennej.<br />

124


Rys. 4. Przykład rozdzielania białek za pomocą chromatografii anionowymiennej Kolumna:<br />

Vydac 300VHP575, 50x7,5 mm (5 μm); Eluenty: A- 10 mM kwas CHES-2-(-cykloheksyloamino)<br />

etanosulfonowy / TEA, pH 9,53; B- 0,5 M NaCl w A; Program elucji: 0 - 20 min, 0 - 100% B,<br />

1 - Bovine carbonic anhydrase (pl 7,3), 2 - Conalbumin (pl 6; 6,3; 6,6), 3 - Ovalbumin (pl 4,7),<br />

4 - Soybean trypsin inhibitor (pl 4,5) [56]<br />

W przypadku większości komercyjnie stosowanych kolumn jonowymiennych,<br />

stosunkowo małe grupy jonowymienne znajdują się na powierzchni<br />

sorbentu. W takim przypadku tylko pojedyncze, ewentualnie kilka<br />

jonowych grup peptydu / białka zostaje związane ze złożem, z powodu<br />

ograniczeń przestrzennych. W wymieniaczach jonowych o ruchomych ligandach<br />

(tzw. „tentacle”), łańcuchy cząsteczek wymieniacza jonowego są kowalencyjnie<br />

związane z matrycą. Są to liniowe łańcuchy polimerowe z rozłożonymi<br />

wzdłuż łańcucha grupami jonowymiennymi. Ilość grup jonowymiennych<br />

jest znacznie większa niż na powierzchni „klasycznego” wymieniacza<br />

i w konsekwencji znacząco wzrasta pojemność takich wymieniaczy wobec<br />

peptydów i białek. Elastyczność ruchomych ligandów wymieniacza powoduje<br />

dodatkowo, że mogą się one wiązać do cząsteczek białek bez odkształcenia<br />

cząsteczek tych ostatnich. Ma to szczególne znaczenie dla uniknięcia<br />

denaturacji w trakcie rozdzielania białek o dużych masach molekularnych.<br />

Podczas rozdzielania peptydów i białek z użyciem chromatografii jonowymiennej<br />

regułą jest stosowanie krótkich kolumn o dużych średnicach.<br />

Zalecane są kolumny o długościach od 5 cm (szczególnie w metodach sorpcyjno<br />

- desorpcyjnych) do 25 cm (dla warunków jonowymiennej chromatografii<br />

elucyjnej) i o średnicach 5-26 mm lub wyższych.<br />

125


UKŁADY ADSORPCYJNE I ADSORPCYJNO-JONOWYMIENNE<br />

FAZ NORMALNYCH<br />

Układy chromatograficzne faz normalnych nie znajdują tak szerokiego<br />

zastosowania do rozdzielania peptydów i białek jak układy faz odwróconych<br />

i jonowymienne. Yoshida i Okada [23] wykonali badania przydatności do<br />

rozdzielania peptydów kilku różnych wypełnień w układach faz normalnych.<br />

Stwierdzili przydatność kolumn wypełnionych związanym z żelem krzemionkowym<br />

sorbentem amidowym i diolem w warunkach elucji gradientowej<br />

AcCN – H 2 O, z rosnącym udziałem wody w trakcie programu elucji i z zastosowaniem<br />

kwaśnych modyfikatorów fazy ruchomej (TFA albo TFA+TEA),<br />

zwiększających retencję peptydów (rys. 5 – porównanie rozdzielania 10 peptydów<br />

na kolumnie amidowej i diolowej z różnymi dodatkami do eluentu)<br />

[23]. Odrzucili kolumny napełnione sorbentem aminowym (NH 2 ) i nitrylowym<br />

(CN) jako nieprzydatne do rozdzielania peptydów oraz kolumny z żelem<br />

krzemionkowym jako powodujące obniżenie stopnia odzysku peptydów [23].<br />

Jednakże, należy zaznaczyć, że zastosowane warunki rozdzielania<br />

w wyżej wymienionych badaniach uniemożliwiają przeważanie efektu adsorpcyjnego<br />

mechanizmu charakterystycznego dla NP-HPLC. Zastosowanie<br />

bardzo polarnego eluentu prowadzi do mechanizmu rozdzielania charakterystycznego<br />

dla Chromatografii Oddziaływań Hydrofilowych (HILIC).<br />

Do rozdzielania białek i peptydów zastosowano też z powodzeniem<br />

kolumny wypełnione hydroksyapatytem, wykorzystując jednocześnie adsorpcyjne<br />

i słabe jonowymienne oddziaływania.<br />

126


Rys. 5. Porównanie rozdzielania peptydów na kolumnie aminowej (I) i DIOL (II) z innymi dodatkami<br />

do eluentów [23] Kolumna I - TSK gel Amide-80 250x4.6 mm, Kolumna II – TSK gel OH-<br />

120 250x4,6 mm; Eluent: (A) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0,1% TFA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1%<br />

TFA (B) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.1% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.1% TFA+TEA;<br />

(C) A - AcCN-H 2 O 97:3 + 0.2% TFA+TEA, B – AcCN-H 2 O 55:45 + 0.2% TFA+TEA; Program<br />

elucji: 70 min liniowo gradient H 2 O od 3 to 45% (0.6% H 2 O/min), T=40 0 C, v=1.0 ml/min.<br />

Detekcja UV 215 nm; 1 - FY, 2-FGGF, 3 - FLEEI, 4 - DYMGWMDP-NH 2 , 5 - NFTYGGF,<br />

6 - AGSE, 7 - WAGGDASGE, 8 - YGGFMTSQKSQTPLVT, 9 - ASTTTNYT,<br />

10 - VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILI-RLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEM *)<br />

( * )M-homoserine)<br />

127


CHROMATOGRAFIA ŻELOWA<br />

Chromatografia wykluczania (SEC), zwana również chromatografią<br />

żelową (GPC), znajduje ogromne zastosowanie w separacji peptydów<br />

i białek oraz do odsalania. Bazuje na wykorzystaniu różnicy wielkości<br />

i kształtu, a w konsekwencji różnic w wartości efektywnego promienia hydrodynamicznego<br />

rozdzielanych substancji. Molekuły o różnych rozmiarach<br />

w różnym stopniu penetrują pory sorbentu. Małe cząsteczki są w większym<br />

stopniu zatrzymywane w kolumnie, a duże są szybciej eluowane. SEC ma<br />

zastosowanie do rozdzielania peptydów i białek o masie molowej w zakresie<br />

2 do 1000 kDa. Technika ta może być stosowana do wyznaczania masy molowej<br />

białek. Jednak nie tylko masa cząsteczkowa, ale również kształt cząsteczki<br />

białka oraz oddziaływania sorpcyjne, trudne do całkowitego wyeliminowania<br />

mają wpływ na retencję, dlatego też konieczna jest staranna<br />

kalibracja przy użyciu odpowiednich białek kalibracyjnych.<br />

Dużego znaczenia nabierają, ostatnio, złoża SEC wykonane w technologii<br />

ruchomych ligandów, „tentacle” (podobnie jak w przypadku złóż jonowymiennych).<br />

Rozmiary porów i ich rozkład gwarantują rozdzielenie białek<br />

zgodnie z wielkością i kształtem cząsteczek. „Dynamiczne” ligandy uniemożliwiają<br />

małym cząsteczkom wniknięcie wewnątrz porów, a większe molekuły<br />

mają utrudnioną głębszą penetrację [57].<br />

SEC jest szczególnie użyteczna jako początkowy etap frakcjonowania,<br />

do izolacji dużych ilości zanieczyszczeń, lub jako końcowy etap rozdzielania<br />

oczyszczonych białek, tzw. „polishing step”.<br />

Należy też zwrócić uwagę na szczególną przydatność chromatografii<br />

żelowej do odsalania peptydów i białek. Do tego celu stosuje się często, ciągle<br />

jeszcze, tzw. miękkie sita molekularne. Coraz większe znaczenie mają<br />

„twarde” wypełnienia kolumn w tych zastosowaniach, takie jak DIOL [58],<br />

a także szkła porowate o zdezaktywowanej powierzchni (rys. 6 – przykład<br />

analizy mieszaniny białek z wykorzystaniem GPC-DIOL).<br />

128


Rys 6. A. Przykład rozdzielania białek na kolumnie DIOL. Kolumna: BioGPC - DIOL 250, 300x10 mm (5μm); Eluent: 10 mM<br />

NaH2PO4 + 300 mM NaCl, pH 7,2; w=0,5 ml/min, Detekcja UV 280 nm. B. Krzywa kalibracyjna białek na kolumnie GF450 [56]<br />

129


CHROMATOGRAFIA ODDZIAŁYWAŃ HYDROFOBOWYCH<br />

(HIC – HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY)<br />

Należy zwrócić też uwagę na duże znaczenie chromatografii oddziaływań<br />

hydrofobowych (HIC), zarówno do wstępnego monitorowania składu<br />

białkowego badanego materiału biologicznego, jak i do zastosowań preparatywnych<br />

[59,60]. Proces rozdzielania opiera się na hydrofobowych oddziaływaniach<br />

pomiędzy hydrofobowym ligandem związanym z fazą stacjonarną<br />

a niepolarnym regionem na powierzchni biomolekuły. Te hydrofobowe oddziaływania<br />

są zwiększane przez obecność soli w eluencie, powoduje ona<br />

odsłonięcie hydrofobowej części białka przez zakłócenie ułożenia cząsteczek<br />

wody wokół białka [61].<br />

Fazy stacjonarne stosowane w chromatografii oddziaływań hydrofobowych<br />

to sorbenty typu C3-, C4-, C5-, albo C6- wiązane najczęściej z sieciowaną<br />

agarozą lub syntetycznym kopolimerem o odpowiednim zakresie<br />

wielkości porów (300 A, albo większe). Proces rozdzielania wykonuje się<br />

przy malejącym gradiencie stężenia soli podczas elucji (rys. 7). Rodzaj soli<br />

i jej stężenie znacząco wpływa na oddziaływania hydrofobowe pomiędzy<br />

białkiem a hydrofobowym adsorbentem.<br />

Jednakże, stężenie soli stosowane podczas rozdzielenia powinno być<br />

nieznacznie niższe od „punktu wysalania” cząsteczki białka. Co więcej szereg<br />

Hofmeistera zestawia sole według zdolności wysalania białka:<br />

(NH 4 ) 2 SO 4 > KH 2 PO 4 > Na 2 HPO 4 > Na 2 SO 4 > CH 3 COOK> CH 3 COONa> NaCl.<br />

Rys. 7. Rozdzielanie 1. Cytochromu c, 2. Mioglobiny, 3. β-Laktoglobuliny, 4. Rybonukleazy A,<br />

5. Lizozymu, 6. α-Chymotrypsyny, 7. Chymotrypsynogenu A; na kolumnie YMC-Pack HIC<br />

4,6x250 mm; Eluent: A – 2.0 M (NH 4 ) 2 SO 4 + 0.1 M KH 2 PO 4 pH 6,8; B – 0.1 M KH 2 PO 4<br />

pH 6,8; Program elucji: 0-100% B w 30 min; v=1.0 ml/min. Detekcja UV 254 nm; [60]<br />

Temperatura i pH buforu również wpływają na oddziaływania białek<br />

z fazą stacjonarną. Ze wzrostem temperatury wzrasta retencja białka [63],<br />

wpływ pH na białko jest bardziej złożony. Przypuszczalnie oddziaływania<br />

130


hydrofobowe są silniejsze, gdy pH buforu znajduje się blisko punktu izoelektrycznego<br />

białka [64]. Główną zaletą chromatografii oddziaływań hydrofobowych<br />

(HIC) do rozdzielania białek i peptydów jest zachowanie aktywności<br />

biologicznej cząsteczek przez co rozdzielanie jest mniej destrukcyjne niż<br />

w przypadku układu faz odwróconych (RP-HPLC). Jednakże, nie wszystkie<br />

białka obecne w badanej próbce zawsze zostają rozdzielone, zatem nie<br />

można metody HIC traktować jako „panaceum separacyjne”. Należy zawsze<br />

ją brać pod uwagę, gdy konieczne jest rozdzielanie białek i peptydów o wysokich<br />

masach molekularnych (powyżej 50 tys. Daltonów).<br />

CHROMATOGRAFIA WIELOWYMIAROWA<br />

Obecnie, identyfikacja i oznaczanie białek w złożonych mieszaninach<br />

białkowych jak w przypadku analizy proteomu komórkowego jest często<br />

osiągana poprzez połączenie różnych metod separacyjnych takich jak SEC,<br />

IEC, RP-HLC lub innych technik chromatograficznych [65, 66]. Wykorzystanie<br />

jednego mechanizmu separacji jest bardzo często niewystarczające.<br />

Sprawność separacji może zostać polepszona poprzez połączenie różnych<br />

rodzajów kolumn chromatograficznych bądź poprzez wykorzystanie różnych<br />

konfiguracji analitycznych. Najczęściej wielowymiarowa separacja obejmuje<br />

dwie bądź więcej techniki rozdzielania podczas jednej analizy.<br />

Podstawowe wymagania zostały początkowo zasugerowane w pracy<br />

Giddings’a na temat wielowymiarowej separacji białek [67]. Dla dwuwymiarowej<br />

separacji można zastosować chromatografię jonowymienną (zazwyczaj<br />

kationowymienną) [68, 69], SEC lub chromatografię powinowactwa [70,<br />

71] w połączeniu z RP-HPLC. Opiteck i inni [72,73] połączyli chromatografię<br />

z silnym wymieniaczem kationowym lub SEC z RP-HPLC by frakcjonować<br />

całkowite lizaty bakterii Escherichia coli. W przybliżeniu wyizolowano 450<br />

białek. Identyfikacja 14 z nich była przeprowadzona przy użyciu spektrometrii<br />

mas (MS) i sekwencjonowania Edmana.<br />

PROTEOMIKA<br />

Proteomika jest nowo powstającą dziedziną naukową. Jej celem są<br />

badania w dużej skali nad składem białek, ich charakterystyką (na przykład<br />

modyfikacje posttranslacyjne) i oddziaływania pomiędzy białkami (również<br />

z innymi biomolekułami takimi jak lipidy bądź kwasy nukleinowe) w żywych<br />

komórkach bądź całych organizmach. W proteomice podczas badań złożona<br />

mieszanina białkowa musi zostać rozdzielona na pojedyncze białka (lub<br />

określone grupy białek) zanim zostanie strawiona do formy peptydów w celu<br />

umożliwienia identyfikacji MS (ryc. 8).<br />

W badaniach w proteomice często stosowana jest dwuwymiarowa<br />

elektroforeza żelowa jako wstępna technika do frakcjonowania, jak również<br />

do określania masy molekularnej i punktu izoelektrycznego rozdzielonych<br />

131


związków. Połączenie elektroforezy kapilarnej z chromatografią w układzie<br />

faz odwróconych jest również ważne. Chromatografia cieczowa jest używana<br />

głównie w celu identyfikacji i oznaczania peptydów o małej masie, które<br />

bardzo trudno rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej. Co więcej do rozdzielania<br />

peptydów i białek za pomocą HPLC często wykorzystuje się połączenie<br />

z spektrometrem mas (HPLC-MS) bądź z tandemowym spektrometrem<br />

mas (HPLC-MS/MS). Techniki te są wykorzystywane w proteomice do<br />

identyfikacji białek i oznaczania ich struktury. Określenie struktury bądź identyfikacja<br />

danego białka jest osiągana poprzez trawienie trypsyną w dokładnie<br />

kontrolowanych warunkach (tworzenie map peptydowych po trawieniu<br />

trypsyną), a następnie przez ustalanie rodzaju wygenerowanych w ten sposób<br />

peptydów i ich wzajemnych proporcji.<br />

Rys. 8. Ogólny schemat przedstawiający przebieg procesu analizy<br />

w proteomice materiału biologicznego<br />

132


Rozdzielanie chromatograficzne strawionych peptydów jest prowadzone<br />

z zastosowaniem kolumnowej chromatografii cieczowej w warunkach<br />

elucji gradientowej. Tak zwane wielowymiarowe układy chromatograficzne<br />

z systemem przełączania kolumn są często wykorzystywane. Na rysunku 9<br />

chromatogram obrazuje przykład rozdzielania peptydów uzyskanych z kazeiny<br />

po trawieniu trypsyną [74]. Produkty strawienia służą jako „odcisk palca”<br />

analizowanego białka.<br />

Poprzez połączenie stworzonych map peptydowych po trawieniu<br />

trypsyną z odpowiednimi bazami danych biolodzy i biotechnolodzy niedawno<br />

uzyskali bardzo skuteczne narzędzie identyfikacji oparte na technikach<br />

HPLC i MS.<br />

Rys. 9. Przykład rozdzielania peptydów powstałych po trawieniu trypsyną kazeiny na kolumnie<br />

Jupiter proteo 90 Å column [72]<br />

CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA<br />

(AFFINITY CHROMATOGRAPHY)<br />

Bardzo szerokie zastosowanie do rozdzielania białek znajdują szczególnie<br />

selektywne metody chromatografii powinowactwa (Affinity Chromatography).<br />

Ta technika jest przede wszystkim wykorzystywana do specyficznych<br />

zastosowań i do białek o konkretnych właściwościach. Jedynie tzw.<br />

chromatografia metalopowinowactwa [10,75] ma dość ogólne zastosowanie<br />

do rozdzielania białek i peptydów posiadających atomy siarki w cząsteczce.<br />

W innych zastosowaniach chromatografii powinowactwa metody postępowania<br />

są często zależne od enzymatycznych lub koenzymatycznych właściwości<br />

wyodrębnianych białek. Mimo stosowania nazwy „chromatografia powinowactwa”,<br />

metody powinowactwa winny być raczej zaliczane do grupy<br />

metod selektywnej chemisorpcji niż do metod chromatograficznych. Chromatografia<br />

powinowactwa zostanie szerzej omówiona w następnej pracy.<br />

133


METODY DETEKCJI W CHROMATOGRAFII PEPTYDÓW I BIAŁEK<br />

Do oznaczania obecności i stężenia peptydów i białek w eluacie wypływającym<br />

z kolumny chromatograficznej wykorzystywane są najczęściej<br />

detektory spektrofotometryczne w zakresie nadfioletu UV, albo w zakresie<br />

widzialnym VIS. Oznaczenie białek i peptydów może zostać ułatwione po<br />

zastosowaniu tzw. derywatyzacji postkolumnowej ninhydryną. Detektory UV<br />

stosuje się w zakresie 215 nm, gdy rozdzielane peptydy zawierają jedynie<br />

chromofory pochodzące od wiązań peptydowych. Gdy w cząsteczkach peptydów<br />

zwarte są struktury aromatyczne, albo mostki disiarczkowe, wykorzystuje<br />

się wyższe długości fali (260-280 nm).<br />

Gdy rozdzielane peptydy / białka występują w śladowych stężeniach<br />

wykorzystuje się fluorescencję stosując detektor fluoroescencyjny FLD. Zjawisko<br />

fluorescencji może zostać wykorzystane do oznaczania i identyfikacji<br />

peptydów i białek dzięki postkolumnowemu, albo prekolumnowemu zastosowaniu<br />

odczynnika derywatyzującego). Jako odczynniki derywatyzujące<br />

stosuje się różne związki lub mieszaniny związków, np. kwas jodooctowy<br />

z aldehydem o-ftalowym i 2-merkaptoetanolem [76], 6-aminoquinolyl-N-<br />

-hydroksysuccinimidyl carbamate, czy dialdehyd o-ftalowy [16]. Detektory<br />

fluorescencyjne są bardzo specyficzne wiele razy czulsze od detektorów<br />

spektrofotometrycznych.<br />

Coraz powszechniej wykorzystywane są spektrometry mas w połączeniu<br />

z kolumnową chromatografią cieczową (LC-MS lub przeważnie<br />

z tandemowym spektrometrem mas LC-MS-MS) szczególnie do detekcji<br />

i oznaczenia masy molekularnej małych peptydów i fragmentów białek o niskim<br />

stężeniu w badanej próbce [77], szczególnie w burzliwie rozwijającej<br />

się proteomice. Zastosowanie w analityce śladowych zawartości peptydów<br />

znajdują też detektory elektrochemiczne [78].<br />

PODSUMOWANIE<br />

Przez wiele lat wykorzystywania chromatografii cieczowej do rozdzielania<br />

peptydów i białek udało się opracować szereg metod rozdzielania tych<br />

substancji i różnych sposobów wpływania na ich retencję. Dotychczas nie<br />

sformułowano ogólnych reguł racjonalnego doboru warunków rozdzielania<br />

w zależności od struktury cząsteczek rozdzielanych peptydów i białek. Elektroforeza<br />

żelowa nie jest odpowiednią techniką do separacji peptydów o niskich<br />

masach molekularnych, a elektroforeza kapilarna nie jest do końca<br />

wdrożona do zastosowań dla peptydów i białek, a szczególnie nie jest przydatna<br />

do zastosowań preparatywnych.<br />

W konsekwencji metody chromatografii cieczowej pozostają jedyną<br />

uniwersalną metodą rozdzielania wszystkich mieszanin peptydów i białek.<br />

Metody chromatografii cieczowej są szczególnie przydatnymi narzędziami<br />

do rozdzielania i oznaczania peptydów i białek, a szczególnie peptydów<br />

o niskich masach cząsteczkowych, co więcej są nieocenione w procesie roz-<br />

134


dzielania tych substancji w skali preparatywnej i przy ich przemysłowej produkcji.<br />

Jednakże z powodu skomplikowanej budowy białek, ich zachowanie<br />

podczas procesu rozdzielania bywa często dalekie od reguł i poglądów.<br />

Próba opracowania ogólnych reguł zależności retencji tych substancji<br />

od warunków rozdzielania w wybranych układach chromatograficznych jest<br />

przedmiotem aktualnie prowadzonych badań autorów niniejszej pracy.<br />

LITERATURA<br />

[1] M. Zasloff, Nature, 415 (2002) 389.<br />

[2] T. Ganz, R.I. Lehrer, Curr Opin Hematol., 9 (2002) 18.<br />

[3] W. Kamysz, M. Okrój and J. Łukasiak, Acta Biochim. Pol., 50 (2003) 461.<br />

[4] K. Conceicao, K. Konno, M. Richardson, M.M. Antoniazzi, C. Jared,<br />

S. Daffre, A.C.M. Camargo, D.C. Pimenta, Peptides, 27 (2006) 3092.<br />

[5] T.V. Popa, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1111 (2006) 192.<br />

[6] J. Amiot, L. Germain, S. Turgeon, M. Lemay, C. Ory-Salam, F.A. Auger,<br />

Int. Dairy J., 14 (2004) 619.<br />

[7] G.B. Irvine, J. Biochem. Bioph. Meth., 56 (2003) 233.<br />

[8] W. Warren, N.E. Astephen, T.E. Wheat, J. Chromatogr. A, 512 (1990) 13.<br />

[9] X. Chen, L. Hu, X. Su, L. Kong, M. Ye, H. Zou, J. Pharmaceut. Biomed.,<br />

40 (2006) 559.<br />

[10] W.-C. Lee, K.H. Lee, Anal. Biochem., 324 (2004) 1.<br />

[11] A. Cecilia A. Roque, C. R. Lowe, Biotechnol. Adv., 24 (2006) 17.<br />

[12] A. Bylina, M. Ulanowicz, Chem. Anal.-Warsaw, 43 (1998) 955.<br />

[13] R. Janzen, K.K. Unger, W. Müller, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 522<br />

(1990) 77.<br />

[14] B. De Collongue-Poyet, C. Vidal-Madjar, B. Sebille, K.K. Unger,<br />

J. Chromatogr. B, 664 (1995) 155.<br />

[15] J.L.M. McNay, J.P. O’Connell, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng.,<br />

76 (3) (2001) 233.<br />

[16] A.B.P. Van Kuilenburg, A.E.M. Stroomer, G.J. Peters, A.H. Van Gennip,<br />

J. Chromatogr. B, 759 (2001) 51.<br />

[17] F. Moffat, P. Senkans, D. Ricketts, J. Chromatogr. A, 891 (2000) 235.<br />

[18] G. Bordin, F. Cordeiro Raposo, B. De la Calle, A.R. Rodriguez,<br />

J. Chromatogr. A, 928 (2001) 63.<br />

[19] P. DePhillips, A.M. Lenhoff, J. Chromatogr. A, 933 (2001) 57.<br />

[20] F. Lesignoli, A. Germini, R. Carradini, S. Sforza, G. Galaverna, A. Dossena,<br />

R. Marchelli, J. Chromatogr. A, 922 (2001) 177.<br />

[21] D. Josić, H. Horn, P. Schulz, H. Schwinn, L. Britsch, J. Chromatogr.<br />

A, 796 (1998) 289.<br />

[22] G. Iberer, H. Schwinn, D. Josić, A. Jungbauer, A. Buchacher, J. Chromatogr.<br />

A, 921 (2001) 15.<br />

[23] T. Yoshida, T. Okada, J. Chromatogr. A, 840 (1999) 1.<br />

[24] J.L.M. McNay, E.J. Fernandez, Biotechnol. Bioeng., 76 (3) (2001) 224.<br />

135


[25] S.U. Sane, S.M. Cramer, T.M. Przybycien, J. Chromatogr. A, 849<br />

(1999) 149.<br />

[26] V. Sanz-Nebot, I. Toro, J. Barbosa, J. Chromatogr. A, 870 (2000) 335;<br />

[27] the Reporter – Discovery BIO.<br />

[28] YMC INC. – “Liquid Chromatography Product Guide”.<br />

[29] K.A. Tweeten, T.N. Tweeten, J. Chromatogr., 359 (1986) 111.<br />

[30] J.K. Swadesh, J. Chromatogr., 512 (1990) 315.<br />

[31] Y. Shen, X. Shao, K. O’Neill, J.S. Bradshaw, M.L.Lee, J. Chromatogr.<br />

A, 866 (2000) 1.<br />

[32] J. River, R. McClintock, R. Galyean, H. Anderson, J. Chromatogr., 288<br />

(1984) 303.<br />

[33] P.A. Hartman, J.D. Stodola, G.C. Harbour, J.G. Hoodegheide, J. Chromatogr.,<br />

360 (1986) 385.<br />

[34] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,<br />

255 (1983) 115.<br />

[35] G.B. Cox, J. Chromatogr. A, 656 (1993) 353.<br />

[36] W.S. Hancock (Editor), “Handbook of HPLC for the Separation of Amino<br />

Acids, Peptides and Proteins”, Vol. II, CRC Press, Boca Raton, Florida,<br />

1986.<br />

[37] A.M. Krstulovic, P.R. Brown, “RP HPLC. Theory, Practice and Biomedical<br />

Applications”, John Wiley and Sons, New York, 1982.<br />

[38] N. Ishizuka, H. Kobayashi, H. Minakuchi, K. Nakanishi, K. Hirao, K. Hosoya,<br />

T. Ikegami, N. Tanaka, J. Chromatogr. A, 960 (2002) 85.<br />

[39] J.P. Boissel, H. Wajcman, H. Fabritius, R. Cabanes, D. Labie, Biochim.<br />

Biophys. Acta., 670 (1981) 203.<br />

[40] D. Corradini, LC-GC int., 9 (1996) 732.<br />

[41] J. Sugihara, T. Imamura, T. Imoto, T.H.J. Huisman, Biochim. Biophys.<br />

Acta., 669 (1981) 105.<br />

[42] N.H.C. Cooke, B.G. Archer, M.J. O’Hare, E.C. Nice, M. Capp, J. Chromatogr.,<br />

255 (1983) 115.<br />

[43] C.A. Bishop, W.S. Hancock, S.O. Brennan, R.W. Carrel, M.T.W. Hearn,<br />

J. Liq. Chromatogr., 599 (1981) 4.<br />

[44] P. Szabelski, A. Cavazzani, K. Kaczmarski, X. Liu, J. Van Horn, G. Guiochon,<br />

J. Chromatogr. A, 950 (2002) 41.<br />

[45] C.L. Stevenson, M.M. Tan, J. Pept. Res., 55 (2000) 129.<br />

[46] Y. Chen, A.R. Mehok, C.T. Mant, R.S. Hodges, J. Chromatogr. A, 1043<br />

(2004) 9.<br />

[47] W.S. Hancock, C.A. Bishop, R.L. Prestidge, M.T. Hearn, Anal. Biochem.,<br />

89 (1978) 203.<br />

[48] D.M. Abercrombie, Anal. Biochem., 125 (1982) 395.<br />

[49] J.L. Glajch, J.J. Kirkland, J. Kohler, J. Chromatorgr., 384 (1987) 81.<br />

[50] B. Grego, F. Lambrou, M.T.W. Hearn, J. Chromatogr., 266 (1983) 89.<br />

[51] H. Ishikawa, H. Tamaoki, J. Ferment. Bioeng., 82 (1996) 140.<br />

[52] K. Stachowiak, J. Am. Chem. Soc., 110 (1988) 1758.<br />

[53] K. Larsson, W. Hermann, P. Moller, D. Sanchez, J. Chromatogr., 450<br />

(1988) 71.<br />

136


[54] W.S. Hancock, J.T. Sparrow, J. Chromatogr., 206 (1981) 71.<br />

[55] M.A. Stadalius, L.R. Snyder, J. Berus, LC-GC, 6(6) (1988) 494.<br />

[56] Vydac – “2000/2001 HPLC Columns and Bulk Media”.<br />

[57] S-I. Wu, J. Frenz, LC GC, 6 (11) (1993) 684.<br />

[58] Aglient – “ZORBAX BioSeries GF-450 column”.<br />

[59] M.E. Lienqueo, A. Mahn, J.C. Salgado, J.A. Asenjo, J. Chromatogr. B,<br />

849 (2007) 53.<br />

[60] J.A. Queiroz , C.T. Tomaz, J.M.S. Cabral, J. Biotechnol., 87 (2001) 143.<br />

[61] A. Mahn, J.A. Asenjo, Biotechnol. Adv., 23 (2005) 359.<br />

[62] YMC INC. – “Pack HIC Columns”.<br />

[63] J.Chen, Y. Sun, J. Chromatogr. A, 992 (2003) 29.<br />

[64] S. Hjerten, J. Rosengren, S. Pahlman, J. Chromatogr., 101 (1974) 281.<br />

[65] C.T. Tomaz, J.A. Queiroz, Biotechnol. Lett., 26 (2004) 223.<br />

[66] I. Neverova, J.E. Van Eyk, J. Chromatogr. B, 815 (2005) 51.<br />

[67] A.J. Link, Trends Biotechnol., 20 (2002) 12.<br />

[68] J.C. Giddings, Anal. Chem., 56 (1984) 1258A.<br />

[69] D. Wall, M. Kachman, S. Gong, R. Hinderer, S. Pavus, D. Misek,<br />

S. Hauash, D. Lubman, Anal. Chem., 72 (2000) 1099.<br />

[70] D. Wolter, M.P. Washburn, J.R. Yates III, Anal. Chem., 73 (2001) 5683.<br />

[71] L. Giggs, C. Sioma, F.E, Reginier, J. Chromatogr. A, 924 (2001) 359.<br />

[72] G.J. Opiteck, K.C. Lewis, J.W. Jorgenson, R.J. Anderegg, Anal. Chem.,<br />

69 (1997) 1518.<br />

[73] G.J. Opiteck, S.M. Ramirez, J.W. Jorgenson, M.A. Moseley III, Anal.<br />

Biochem., 258 (1998) 349.<br />

[74] Jupiter – “HPLC columns for the proteomic era”.<br />

[75] C. Roesli, G. Elia, D. Neri, Clin. Biochem., 37 (2004) 579.<br />

[76] N.E. Labrou, J. Chromatogr. B, 790 (2003) 67.<br />

[77] Y.V. Tcherkas, A.D. Denisenko, J. Chromatogr. A, 913 (2001) 309.<br />

[78] W.A. Kleinman, J.P. Richie Jr., Biochem. Pharmacol., 60 (2000) 19.<br />

137

Hooray! Your file is uploaded and ready to be published.

Saved successfully!

Ooh no, something went wrong!